分析物の検出
分析物を検出するためのキットおよび製造物が開示される。キットは、（ｉ）検出可能な作用因と、（ｉｉ）液体およびナノ構造を有する液体組成物とを含み、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。製造物は、包装材と、その中に含有される検出可能な成分の検出を高めるために特定される液体組成物とを含み、液体組成物は液体およびナノ構造を有し、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物の検出を強化するために使用することができるキットおよび製造物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子（例えば、タンパク質）の検出は疾患または医学的状態の診断において非常に有益であり得る。特定のタンパク質の存在または特定のタンパク質に関する性質を明らかにすることによって、研究者は、疾患状態に関係するウイルス、細菌、遺伝子変異または他の状態の存在を確認することができる。さらには、患者のプロテオーム、すなわち、患者特有の一組の発現タンパク質を分析することによって、個体が特定の医薬品または治療法を必要とすることに関する有用な情報を明らかにすることができ、その結果、一連の治療または予防的治療法を調節することができる。タンパク質およびペプチドを検出するための現在の方法には、様々な簡便な方法が含まれ、例えば、ウエスタンブロット分析、免疫化学的アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などが含まれる。
【０００３】
放射性医薬品の使用は一般に、生体分子を検出するための最も一般的な方法である。しかしながら、放射免疫アッセイの非常に成功した広範囲に及ぶ使用はいくつかの問題を生じさせており、そのような問題には、（１）放射能標識された化合物の貯蔵寿命および安定性、（２）放射性廃棄物処分の費用が大きいこと、および、（３）放射性物質の使用だけでなく、同様に液体シンチレーション計測のために必要な溶媒の使用にさらされる結果としての健康被害が含まれる。
【０００４】
蛍光を発する化合物が多くの用途で使用されており、また、入射波長および観測波長が異なるので、蛍光が本質的には吸収よりも高感度である生物学的適用のために特に好適であることが知られている。蛍光を、細胞全体、細胞成分および細胞機能の検出のために使用することができる。例えば、多くの診断技術および分析技術では、サンプルを、サンプルが検出され得るように蛍光標識することが要求される。これは、例えば、細胞、組織、タンパク質、抗体、酵素、薬物、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、核酸、炭水化物、あるいは、天然ポリマーまたは合成ポリマーなど、広範囲の様々な物質と相互作用して、蛍光性コンンジュゲートを作製する蛍光性の色素またはプローブを使用することによって達成される。
【０００５】
合成された蛍光性プローブの場合、リガンドが、観測されることになる生化学反応に対する特異性を与えるためにしばしば使用され、蛍光性色素により、その相互作用を検出または定量するための手段が提供される。これらの適用には、とりわけ、タンパク質の検出（例えば、ゲル内、表面または水溶液におけるタンパク質の検出）、細胞追跡、酵素活性の評価、および、核酸または他の生体ポリマーを染色することが含まれる。
【０００６】
化学発光、すなわち、化学反応による光の生成、および、生物発光、すなわち、一部の生物によって生成される光が、タンパク質の検出においてだけでなく、ＤＮＡ配列決定および他の関連した研究においても、放射性標識に取って代わる可能性のある代替物として試験されている。化学発光は、放射能標識化を上回る大きな利点を提供する。これは、化学発光により、冷光が生じるからであり、すなわち、その生じた光が、反応に関与する原子および／または分子の振動によってではなく、電子エネルギーへの化学物質の直接的な変換によって引き起こされるからである。したがって、有機化合物の化学発光に関する研究は、現在行われている重点領域の１つである。ちなみに、化学発光はまた、微量元素および汚染物質を環境規制のために検出および測定するためにも好都合である。
【０００７】
最も良く知られている化学発光反応は、安定化された酵素誘発可能な１，２−ジオキセタン系化合物、アクリダン系化合物、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノールおよびその誘導体、または、ルシゲニンのいずれかを、化学的作用因、反応剤または基質として用いる化学発光反応である。
【０００８】
西洋ワサビペルオキシダーゼが、使用するために広範囲に入手可能であり、かつ、安価であるので、様々なアッセイのために広く使用される。西洋ワサビペルオキシダーゼは、環状ヒドラジド、フェノール誘導体、アクリダン誘導体および生物発光系の成分を含めて、広範囲の基質の発光性酸化を触媒する。他の好適な基質にはまた、（ａ）ルミノールおよび関連化合物、（ｂ）ピロガロールおよびプルプロガリン、（ｃ）アクリダンカルボン酸誘導体、（ｄ）ヒカリカモメガイ（Ｐｈｏｌａｓ ｄａｃｔｌｕｓ）およびホタル（キタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ））またはウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）から単離される各種ルシフェリンが含まれる。これらの光生成反応は、それらの検出限界、特異性、試薬の入手性、ならびに、光放射の大きさおよび速度論において広範囲に異なる。このことは、当然のことながら、それらの適用性を制限する。
【０００９】
数多くの蛍光性基質および化学発光基質がこの技術分野では知られている一方で、それらのシグナル強度、それらのシグナル対バックグラウンド比および／またはそれらの安定性を改善することが依然として求められている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの局面によれば、（ｉ）検出可能な作用因と、（ｉｉ）液体およびナノ構造を有する液体組成物とを含む、分析物を検出するためのキットが提供され、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１１】
本発明の別の局面によれば、包装材と、包装材の中に含有される、検出可能な成分の検出を高めるために特定される液体組成物とを含む製造物が提供され、この場合、液体組成物は液体およびナノ構造を有し、ただし、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供され、この場合、前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、整列した流体分子の前記エンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１３】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分析物は生体分子である。
【００１４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、生体分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な作用因は非直接的に検出可能である。
【００１６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、非直接的に検出可能な作用因は、検出可能な生成物を生じさせることができる酵素反応のための基質である。
【００１７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な作用因は直接的に検出可能である。
【００１８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な作用因は親和性認識成分を含む。
【００１９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、親和性認識成分は、アビジン誘導体、ポリヌクレオチドおよび抗体からなる群から選択される。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、直接的に検出可能な作用因は、リン光性作用因、化学発光性作用因および蛍光性作用因からなる群から選択される。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、酵素反応のエンハンサーを含む。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、エンハンサーは、ｐ−ヨードフェノール、３，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１，２，４−トリアゾール、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、フェノール、２−ナフトール、１０−メチルフェノチアジン、セチルトリメチルアンモニウム臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに酸化作用因を含む。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酸化作用因は、過酸化水素、尿素過酸化水素、炭酸ナトリウム過酸化水素、過ホウ酸塩、フェリシアン化カリウムおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）からなる群から選択される。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、酵素反応のための酵素を含む。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群から選択される。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素は抗体またはアビジン誘導体にコンジュゲート化される。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、酵素反応の阻害剤を含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な生成物は、蛍光性生成物、化学発光性生成物、リン光性生成物および発色性生成物からなる群から選択される。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、蛍光性生成物を生じさせることができる基質は蛍光団を含む。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、蛍光団は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびＤＤＡＯからなる群から選択される分子に由来する。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、蛍光性生成物を生じさせることができる基質は、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＤＤＡＯガラクトシド、β−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−カルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＥＬＦ９７ホスファート、５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＦＤＧ）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロニド、ＰＦＢアミノフルオレセインジグルクロニド、ＥＬＦ９７−β−Ｄ−グルクロニド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬクロラムフェニコール基質（商標）および１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンからなる群から選択される。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、発色性生成物を生じさせることができる基質は、ＢＣＩＰ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧｌｃＵ）および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）からなる群から選択される。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化学発光性生成物を生じさせることができる基質は、ルシフェリン、ルミノール、イソルミノール、アクリダン、フェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、２，４，６−トリクロロフェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、ピロガロール、フロログルシノールおよびレゾルシノールからなる群から選択される。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部がガス状状態である。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はナノ構造のクラスターを形成することができる。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はヒドロキシアパタイトから作製される。
【００４２】
本発明は、分析物を検出する能力が高められた組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００４３】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照として援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４４】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、ナノ構造を含む水を使用するＥＣＬ反応の感度における増大を例示するオートラジオグラフの写真である。Ｊｕｒｋａｔ細胞株の７．５μｇストリップ（図１Ａ、図１Ｃおよび図１Ｅ）および１５μｇストリップ（図１Ｂ、図１Ｄおよび図１Ｆ）に等しい細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、ニトロセルロースメンブランへのタンパク質ブロッティングを行った。ＺＡＰ７０に対して惹起されたポリクローナル抗体とのインキュベーションの後、免疫反応性タンパク質のバンドをＨＲＰコンジュゲート化二次Ａｂとの反応および免疫ペルオキシダーゼＥＣＬ検出システムによる現像によって可視化した。レーン１−標準反応試薬；レーン２−全試薬＋ナノ構造を含む水を使用する緩衝液；レーン３−ナノ構造を含む水を用いて作製される反応体積。
【図２】図２は、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの様々な水組成物の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図５Ａ】図５Ａは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図６】図６は、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図７Ａ】図７Ａは、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、ＲＯの塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図８Ａ）、および、ナノ構造を含む水の塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図８Ｂ）である。それぞれのキュベットは１μｌの塩酸の添加を例示する。
【図９Ａ】図９Ａは、ＲＦ水の塩酸滴定を例示するグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＲＦ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。矢印は２回目の照射を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。
【図１０】図１０は、ＲＯ水と比較したときの、ＦＲ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。実験を３回繰り返した。３回の実験のすべてについての平均値がＲＯ水についてプロットされた。
【図１１Ａ−１１Ｃ．１１Ｆ−１１Ｈ】図１１Ａ〜Ｃおよび図１１Ｆ〜Ｈは、粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。図１１Ａ〜図１１Ｅは、実施例６のパートＣからの、右側：試験チューブＣ（５０％ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、および、左側：試験チューブＢ（脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標））を例示する。図１１Ｇ〜図１１Ｊは、赤色粉末の一晩の破砕、および、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の滴定の後での溶液を例示する。
【図１１Ｄ−１１Ｅ．１１Ｉ−１１Ｊ】図１１Ｄ〜Ｅおよび図１１Ｉ〜Ｊは、粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。図１１Ａ〜図１１Ｅは、実施例６のパートＣからの、右側：試験チューブＣ（５０％ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、および、左側：試験チューブＢ（脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標））を例示する。図１１Ｇ〜図１１Ｊは、赤色粉末の一晩の破砕、および、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の滴定の後での溶液を例示する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ナノドロップで測定されたときの、一晩の粉砕の後での赤色粉末＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒの溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ナノドロップで測定されたときの、１００％の脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた後での赤色粉末の溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ナノドロップで測定されたときの、ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）を加えた後での赤色粉末の溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。
【図１３】図１３は、バイアル＃１（ＣＤ−Ｄａｕ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、バイアル＃４（ＣＤ−Ｄａｕ＋１０％ＰＥＧ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））およびバイアル＃５（ＣＤ−Ｄａｕ＋５０％アセトン＋５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））の分光光度計測定のグラフである。
【図１４】図１４は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）、および、微量の溶媒（アセトン）を伴う溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。
【図１５】図１５は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）および、アセトンにおける溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。淡青色および黄色の線はアセトン蒸発の異なる割合を表し、紫色線はアセトン非含有溶液である。
【図１６】図１６は、ＣＤ−Ｄａｕの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。
【図１７】図１７は、ｔ−ｂｏｃの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発直後のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ｂの、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、エタノール蒸発後２４時間のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ｂの、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、エタノール蒸発直後のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ａの、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発後２４時間のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ａの、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。
【図１９】図１９は、エタノール蒸発後２４時間でのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ１４Ｂの懸濁物の写真である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドＸの分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＸ−５ＦＵの分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−Ｅの分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）の分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２の分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨの分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｇ】図２０Ｇは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫの分光光度計測定のグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドＸの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＸ−５ＦＵの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−Ｅの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）の細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２の細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｆ】図２１Ｆは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｇ】図２１Ｇは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２２】図２２は、エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。
【図２３】図２３は、ろ過後の、エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、試験チューブ（左側はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および物質「Ｘ」を含有し、右側はＤＭＳＯおよび物質「Ｘ」を含有する）の写真である。図２４Ａは、２４時間放置された試験チューブを例示し、図２４Ｂは、４８時間放置された試験チューブを例示する。
【図２５】図２５Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った直後における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２５Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２５Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２５Ｃ）の写真である。
【図２６】図２６Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後６０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２６Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２６Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２６Ｃ）の写真である。
【図２７】図２７Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後１２０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２７Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２７Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２７Ｃ）の写真である。
【図２８】図２８Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後２４時間における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２８Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２８Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２８Ｃ）の写真である。
【図２９】図２９Ａ〜Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および低下した濃度のＤＭＳＯを含む溶媒に物質「Ｘ」を含むガラス製ボトルの振とう直後の写真（図２９Ａ）、振とう後３０分の写真（図２９Ｂ）、振とう後６０分の写真（図２９Ｃ）および振とう後１２０分の写真（図２９Ｄ）である。
【図３０】図３０は、分光光度計によって測定されたときの、ボルテックス後６時間のＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における物質「Ｘ」の吸収特徴を例示するグラフである。
【図３１】図３１Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、エタノールにおけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図３１Ａ）、および、アセトンにおけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図３１Ｂ）である。
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図３２Ａ）、および、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図３２Ｂ）である。
【図３３】図３３Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図３３Ａ）、および、ＤＭＳＯにおけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図３３Ｂ）である。
【図３４】図３４は、２９３Ｔ細胞に対する異なる溶剤におけるタキソールの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。コントロールＲＯ＝ＲＯ水により構成される培地；コントロールＮｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）により構成される培地；コントロールＤＭＳＯ ＲＯ＝ＲＯ水＋１０μｌのＤＭＳＯにより構成される培地；コントロールＮｅｏ ＲＯ＝ＲＯ水＋１０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）により構成される培地；タキソールＤＭＳＯ ＲＯ＝ＲＯ水と、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＤＭＳＯ Ｎｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＮＷ ＲＯ＝ＲＯ水と、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＮＷ Ｎｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソールとにより構成される培地。
【図３５】図３５Ａ〜Ｂは、２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例１４に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および非存在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【図３６】図３６は、２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例１５に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および非存在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【図３７Ａ】図３７Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＤＭＳＯにおける０．５ｍＭタキソールの分光光度法による読み取りを例示するグラフである。
【図３７Ｂ−３７Ｃ】図３７Ｂ〜Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＤＭＳＯにおけるタキソールのＨＰＬＣによる読み取りである。図３７Ｂは、タキソールの新たに調製された標準（ＤＭＳＯ）配合物のＨＰＬＣによる読み取りを例示する。図３７Ｃは、−２０℃での６ヶ月の貯蔵の後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散されたタキソールのＨＰＬＣによる読み取りを例示する。
【図３８】図３８は、ＤＭＳＯ配合物またはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）配合物における様々なタキソール濃度のＰＣ３細胞生存性を例示する棒グラフである。それぞれの点が８個の反復実験からの平均＋／−標準偏差を表す。
【図３９】図３９は、１００％のアセトンに溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【図４０】図４０は、ろ過前およびろ過後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【図４１】図４１Ａ〜Ｂは、セファロスポリン濃度が異なるＬＢにおけるＤＨ５αの増殖曲線である。細菌を２回別々に３７℃および２２０ｒｐｍで増殖させた。
【図４２】図４２Ａ〜Ｂは、２回別々に接種後７時間における、コントロールでの増殖（セファロスポリン非添加）に対する参照での２つの異なるセファロスポリン濃度によるＤＨ５αの生存性を例示する棒グラフである（コントロール群は１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含有する）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、分析物の検出を強化するために使用することができるキットおよび製造物に関する。
【００４７】
本発明によるキットおよび製造物の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
【００４８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載において示されるか、または、実施例において例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定するものとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
【００４９】
医療検査企業および診断検査企業は、生体分子を検出するためのより高感度な方法を絶えず求めている。例えば、医療は、ウイルスを検出する非常に高感度な方法を明らかに必要としている。化学物質または他の物質を検出するためのより高感度なアッセイはまた、広範囲の環境領域において有用であると考えられ、この場合、早期の検出が行われれば、災害を阻止するために十分に早期の是正活動を開始することができる。非常に高感度な検出技術はまた、半導体製造の最適化された制御のためにも有用であり得る。
【００５０】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ナノ構造（例えば、米国特許出願第６０／５４５９５５号および同第１０／８６５９５５号、ならびに、国際特許出願公開番号ＷＯ２００５／０７９１５３に記載されるナノ構造など）を含む組成物が分析物の検出を高めることを発見している。
【００５１】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、ナノ構造および液体がＥＣＬタンパク質検出システムの感度を増大させることを明らかにしている。
【００５２】
したがって、本発明の１つの局面によれば、包装材と、包装材の中に含有される、検出可能な成分の検出を高めるために特定される液体組成物とを含む製造物が提供され、この場合、液体組成物は液体およびナノ構造を有し、ただし、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「ナノ構造（ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」は、一つ以上の粒子を含むサブマイクロメートルスケールの構造を指し、それらの粒子の各々はナノメートルまたはサブナノメートルスケールであり、一般に「ナノ粒子」と略される。構造の異なる要素（例えばナノ粒子、分子）の間の距離は、数十ピコメートルまたはそれ未満のオーダであることができ（その場合においてナノ構造は「連続ナノ構造」と称される）、または数百ピコメートルから数百ナノメートルのオーダであることができる（その場合においてナノ構造は「不連続ナノ構造」と称される）。従って、本実施形態のナノ構造は、ナノ粒子、ナノ粒子の配置、または一つ以上のナノ粒子および一つ以上の分子のいかなる配置も含むことができる。
【００５４】
上記組成物の液体は水性液体、例えば水であることが好ましい。
【００５５】
本発明のこの局面による一つの好ましい実施形態によれば、液体組成物のナノ構造は、整列した流体分子によって包囲されたナノメートルサイズのコア材料を含み、これらの流体分子はコア材料と、そして互いに定常的な物理的状態にある。このような液体組成物は、本発明者の米国特許出願第６０／５４５９５５号および第１０／８６５９５５号、並びに国際特許出願公開ＷＯ ２００５／０７９１５３に記載されており、それらの内容は参考としてここに組み入れられる。
【００５６】
このようなコア材料の例は、限定されないが、強誘電性物質、強磁性物質および圧電性物質を含む。強誘電性物質は、電場を加えることによって逆転または再配向させることができる永続的な電気的分極をある温度範囲にわたって維持する物質である。強磁性物質は、磁場を加えることによって逆転できる永続的な磁化を維持する物質である。好ましくは、ナノ構造は、コア材料の強誘電性または強磁性を保持し、それによってマクロスケールの物理的特性がナノスケール環境にもたらされる特別な特徴を有する。
【００５７】
コア材料はまた、結晶構造を持ってもよい。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「整列した流体分子」は、相互関係を有する、例えば流体分子間の相関を有する流体分子の組織化された配置を示す。例えば、一つの流体分子の即座の変位は、コア材料を包囲する一つ以上の他の流体分子の即座の変位と相互に関係されることができる。
【００５９】
本明細書中で使用される用語「定常的な物理状態」は、物体または分子が、少なくとも局所的な最小値を有する何らかのポテンシャルによって結びついている状況を示す。そのようなポテンシャルについての代表的な例には、限定されないが、ファンデルワールスポテンシャル、湯川ポテンシャル、およびレナード・ジョーンズポテンシャルなどが含まれる。他の形態のポテンシャルもまた、考えられる。
【００６０】
好ましくは、エンベロープの流体分子は液体組成物の液体分子と同一である。エンベロープの流体分子は、液体組成物の液体分子と同一でない追加の流体を含んでもよく、従ってエンベロープは不均一流体組成物を含んでもよい。
【００６１】
整列した流体分子のエンベロープの形成のため、本実施形態のナノ構造は、液体の比重より低いかまたはそれに等しい比重を有することが好ましい。
【００６２】
流体分子は液体状態またはガス状状態またはそれらの二つの混合状態のいずれかであってもよい。
【００６３】
ナノ構造の好ましい濃度は１リットルあたり１０２０個未満のナノ構造、より好ましくは１リットルあたり１０１５個未満のナノ構造である。好ましくは、液体中のナノ構造は、それらの間で引きつける静電力によって少なくとも一つの追加のナノ構造とクラスター形成することができる。好ましくは、ナノ構造間の距離がクラスター形成（約０．５〜１０μｍ）を防止するとき、ナノ構造は長距離の相互作用を維持することができる。
【００６４】
理論にとらわれることはないが、ナノ構造間の長距離相互作用が液体組成物の特有の特徴に役立ち、その結果、液体組成物が検出システムの感度を高めていると考えられる。例えば、本発明者らは、本発明の組成物がタンパク質を熱の影響から保護し、タンパク質を安定化すること（実施例１４および実施例１５）、および、高まった緩衝能力（すなわち、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力）を含むこと（実施例２〜実施例５）を示している。これらの要因はともに、検出システムにおけるタンパク質の状態に寄与することができ、したがって、検出システムの全体的な感度を高めることができる。
【００６５】
本明細書中で使用される表現「緩衝能力」は、酸または塩基が添加されたとき、安定なｐＨを維持する組成物の能力を示す。
【００６６】
さらに、本発明者らは、本発明の組成物により、様々な作用因の溶解性が高まることを示している（実施例６〜実施例１３および実施例１５〜実施例１７）。このことが結果的には、検出システムの高まった感度につながるかもしれない。
【００６７】
本発明のこの局面に従ったナノ構造の製造は、「トップダウン」プロセスを使用して行うことができる。このプロセスは、固体粉末（例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末または合成ポリマー）が、十分に高い温度に、好ましくは約７００℃を越えて加熱される下記の方法工程を含む。
【００６８】
意図される固体粉末の例には、ＢａＴｉＯ３、ＷＯ３およびＢａ２Ｆ９Ｏ１２が含まれるが、これらに限定されない。驚いたことに、本発明者はまた、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）もまた本発明の液体組成物を生成するために加熱されてもよいことを示した。ハイドロキシアパタイトは、それが非毒性によって特徴づけられ、一般に人の治療のためにＦＤＡ承認されているので、特に好ましい。
【００６９】
多くのハイドロキシアパタイト粉末がＳｉｇｍａ，ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌａｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（例えばカタログＮｏ．１３０６−０６−５）のような多数の製造業者から入手可能であることが認識されるだろう。
【００７０】
表１に示されるように、ＨＡに基づく液体組成物は全て、水と比較すると高い緩衝能力を持つ。
【００７１】
加熱された粉末は次いで、冷たい液体（水）に、その密度異常温度以下で、例えば３℃または２℃で浸漬される。同時に、冷たい液体および粉末は、電磁ＲＦ放射線、好ましくは５００ＭＨｚ以上、７００ＭＨｚより高いものによって照射され、それは連続波ＲＦ放射線または変調ＲＦ放射線のいずれであってもよい。
【００７２】
本発明者らは、ナノ構造および液体を含む組成物が、検出可能なシグナルの強化によって、および／または、そのようなシグナルの生成に関わる酵素の活性を増大させることによってそのどちらかで検出システムの感度を増大させ得るのではないかと推測している。
【００７３】
本明細書中上記で記載されるナノ構造および液体を含む組成物はキットの一部を形成し得ることが理解される。
【００７４】
したがって、本発明の別の局面によれば、
（ｉ）検出可能な作用因と、
（ｉｉ）液体およびナノ構造を有する液体組成物と
を含む、分析物を検出するためのキットが提供され、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００７５】
本発明のキットは、所望されるならば、本発明のキットの１つまたは複数のユニットを含有し得るパックで提示され得る。そのようなパックには、キットを使用するための説明書が付随し得る。パックはまた、実験室補助品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められる形式で容器に関連する通知によって適用させられることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態の当局による承認を反映する。
【００７６】
本明細書中で使用される用語「分析物」は、検出されるべき分子または化合物を示す。好適な分析物には、生体分子を含めて、様々な有機分子および無機分子が含まれる。分析物は、環境または臨床での化学物質または汚染物質または生体分子である場合があり、これらには、農薬、殺虫剤、毒素、治療用薬物および乱用薬物、ホルモン、抗生物質、有機物および溶媒が含まれるが、これらに限定されない。好適な生体分子には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、ステロイド、細胞そのもの［原核生物細胞（例えば、病原性細菌など）および真核生物細胞（哺乳動物の腫瘍細胞を含む）を含む］、ウイルス、胞子などが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい分析物は、タンパク質（酵素を含む）；薬物、抗体；抗原；細胞膜抗原および受容体（神経受容体、ホルモン受容体、栄養素受容体および細胞表面受容体）またはそのリガンドである。
【００７７】
本発明の検出キットは、液体およびナノ構造を含む液体組成物に基づく高まった感度を示す。
【００７８】
本発明では、液体およびナノ構造を含む組成物における検出のために、および／または、検出アッセイを行うために要求される少なくとも１つの成分を可溶化することが想定され、この場合、水成分は、少なくとも一部が、液体およびナノ構造を含む組成物に交換される。検出アッセイの液体部分は、５％、より好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは４０％、より好ましくは６０％、より好ましくは８０％、一層より好ましくは１００％の本発明の液体組成物を含むことができる。
【００７９】
液体およびナノ構造を含む組成物を含むのと同様に、本発明のキットはまた、検出可能な作用因を含む。
【００８０】
本発明のこの局面の一実施形態によれば、検出可能な作用因は、典型的には特定の波長の放射線を放出することに基づいて直接的に検出可能である（例えば、蛍光性作用因、リン光性作用因または化学発光性作用因である）。
【００８１】
特定の分析物を検出するために、典型的には、そのような検出可能な作用因は、標的分析物に結合する親和性認識成分を含む。親和性認識成分の例には、アビジン誘導体（例えば、アビジン、ストレプトアビジンおよびヌトラビジン）、抗体およびポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
アビジンは、等電点が約１０．５である多カチオン性の６６０００ダルトンの糖タンパク質である。ストレプトアビジンは、ほぼ中性の等電点を有するグリコシル化されていない５２８００ダルトンのタンパク質である。ヌトラビジンはアビジンの脱グリコシル化形態である。これらのタンパク質のすべてが、ビオチンに対する非常に大きい親和性および選択性を有しており、それぞれが分子あたり４個のビオチンと結合することができる。アビジン認識成分を含む検出可能な作用因を、天然に存在するビオチン化された生体分子、または、ビオチンを含むように人為的に操作されている生体分子を検出するために使用することができる。
【００８３】
本発明において使用される用語「抗体」は、特定のタンパク質またはポリペプチドに結合することができる無傷の分子、ならびに、その機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなど）を包含する。
【００８４】
本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣体の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを示す。この用語には、天然に存在する塩基、糖および共有結合のヌクレオチド間連結（例えば、骨格）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、天然に存在するそれぞれの部分と類似して機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。標識されたポリヌクレオチドを、標識されたポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることができるサンプル中のポリヌクレオチドを検出するために使用することができる。
【００８５】
本明細書中で使用される表現「ハイブリダイゼーションすることができる」は、塩基対形成することを示し、この場合、核酸作用因の少なくとも一方の鎖は少なくとも一部が、Ｈ１９ ｍＲＮＡに対して相同的である。
【００８６】
本発明のこの局面の別の実施形態によれば、本発明のキットの検出可能な作用因はまた、非直接的に検出可能である。例えば、検出可能な作用因は、検出可能な生成物を生じさせることができる酵素反応のための基質である場合がある。
【００８７】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質は典型的には、蛍光団を含む。そのような蛍光団は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびＤＤＡＯ（これらに限定されない）を含めて、多くの分子に由来することができる。
【００８８】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質の例には、可溶性の蛍光性生成物を生じさせる基質（例えば、水溶性のクマリン系化合物に由来する基質、緑色〜黄色の水溶性蛍光団に由来する基質、水溶性の赤色蛍光団に由来する基質、チオール反応性の蛍光発生基質、親油性蛍光団、ペンタフルオロベンゾイル蛍光発生酵素基質）、不溶性の蛍光性生成物を生じさせる基質、励起状態のエネルギー転移に基づく基質、および、不連続な酵素アッセイのための蛍光性の誘導体化試薬が含まれるが、これらに限定されない。そのような基質に関する詳細をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのウエブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｂｅｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／１００１．ｈｔｍｌ）において見出すことができる。
【００８９】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質の具体的な例には、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＤＤＡＯガラクトシド、β−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−カルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＥＬＦ９７ホスファート、５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＦＤＧ）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロニド、ＰＦＢアミノフルオレセインジグルクロニド、ＥＬＦ９７−β−Ｄ−グルクロニド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬクロラムフェニコール基質（商標）および１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
化学発光性生成物を生じさせることができる基質の例には、ルシフェリン、ルミノール、イソルミノール、アクリダン、フェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、２，４，６−トリクロロフェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、ピロガロール、フロログルシノールおよびレゾルシノールが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
発色性生成物を生じさせることができる基質の例には、ＢＣＩＰ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧｌｃＵ）および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
キットは、種々の検出アッセイにおいて有用でありうる。
【００９３】
下記は、本発明のキットを使用して行うことができる、ポリヌクレオチドを検出するためのアッセイの列挙である。
【００９４】
ノーザンブロット分析：この方法は、ＲＮＡの混合物において特定のＲＮＡを検出することを伴う。ＲＮＡサンプルが、塩基対間の水素結合の形成を妨げ、これにより、ＲＮＡ分子のすべてが、折り畳まれていない線状の立体配座を有することを保証する作用因（例えば、ホルムアルデヒド）による処理によって変性させられる。その後、個々のＲＮＡ分子がゲル電気泳動によってサイズに従って分離され、変性したＲＮＡが付着するニトロセルロースメンブランまたはナイロン系メンブランに転写される。その後、メンブランは、標識されたＤＮＡプローブにさらされる。プローブを、酵素連結されたヌクレオチドを使用して標識することができる。検出を、比色反応または化学発光を使用して行うことができる。この方法は、特定のＲＮＡ分子の量を定量すること、および、電気泳動期間中のゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によってその同一性を明らかにすることの両方を可能にする。
【００９５】
ＲＮＡインシトゥーハイブリダイゼーション染色：この方法では、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブが、細胞に存在するＲＮＡ分子に結合させられる。一般には、細胞が最初に、細胞構造を失わないようにするために、また、ＲＮＡ分子が分解されないようにするために顕微鏡スライドガラスに固定され、その後、標識されたプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液に供される。ハイブリダイゼーション緩衝液には、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブが、プローブの非特異的な結合を避けながら、その標的ｍＲＮＡ分子とその場において特異的にハイブリダイゼーションすることを可能にするホルムアミドおよび塩（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム）などの試薬が含まれる。当業者は、ハイブリダイゼーション条件（すなわち、温度、塩およびホルムアミドの濃度およびその他）を特定のプローブおよび細胞タイプに対して調節することができる。ハイブリダイゼーション後、何らかの結合していないプローブが洗い流され、スライドガラスが、化学発光を伴うプローブを使用して生じさせられるシグナルを明らかにする写真乳剤、または、酵素連結の標識されたプローブを使用して生じさせられるシグナルを明らかにする比色反応のいずれかに供される。
【００９６】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ：この方法では、本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドプローブが固体表面（例えば、ガラスウエハー）に結合させられる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは長さがおよそ２０個〜２５個の核酸である。特定の細胞サンプル（例えば、血液細胞）における本発明のポリヌクレオチドの発現パターンを検出するために、ＲＮＡが、この技術分野で知られている方法を使用して（例えば、ＴＲＩＺＯＬ溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国）を使用して）細胞サンプルから抽出される。ハイブリダイゼーションを、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、５’−ビオチン化プローブ）、または、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）もしくは相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の標識されたフラグメントのいずれかを使用して行うことができる。簡単に記載すると、二本鎖のｃＤＮＡが、逆転写酵素（ＲＴ）（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ）、ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩを使用してＲＮＡから調製される（すべてが製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、米国）に従って使用される）。標識されたｃＲＮＡを調製するために、二本鎖ｃＤＮＡが、例えば、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｆｆｙｍｅｔｉｘ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用してビオチン化ヌクレオチドの存在下でのインビトロ転写反応に供される。効率的なハイブリダイゼーションのために、標識されたｃＲＮＡは、ＲＮＡを、４０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸塩（ｐＨ８．１）、１００ｍＭの酢酸カリウムおよび３０ｍＭの酢酸マグネシウムにおいて９４℃で３５分間インキュベーションすることによってフラグメント化することができる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイは洗浄され、ハイブリダイゼーションシグナルが、プローブアレイに結合した標識されているｃＲＮＡによって放出される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光スキャナを使用して走査される。
【００９７】
例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）では、アレイ上のそれぞれの遺伝子が一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって表される。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの各プローブ対が完全一致のオリゴヌクレオチドおよびミスマッチのオリゴヌクレオチドからなる。完全一致のプローブは、特定の遺伝子に対して正確に相補的な配列を有しており、したがって、特定の遺伝子の発現レベルの測定を可能にする一方で、ミスマッチのプローブは、中心の塩基位置での一塩基置換によって完全一致のプローブとは異なる。ハイブリダイゼーションシグナルが、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナを使用して走査され、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウエアにより、ミスマッチのプローブに由来する非特異的なシグナルが、完全一致のプローブに由来するシグナルから引かれる。
【００９８】
下記は、本発明のキットを使用して行うことができる、ポリペプチドを検出するためのアッセイの列挙である。
【００９９】
ウエスタンブロット：この方法は、基質をアクリルアミドゲルによって他のタンパク質から分離すること、その後、基質をメンブラン（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に転写することを伴う。その後、基質の存在が、基質に対して特異的な抗体によって検出され、次に、この抗体が抗体結合試薬によって検出される。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡまたは他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、本明細書中上記で記載されるように放射能標識することができ、または、酵素連結することができる。検出を、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行うことができる。この方法は、基質の量を定量すること、および、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によってその同一性を明らかにすることの両方を可能にする。
【０１００】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質を基質特異的な抗体によって細胞においてその場で検出することを伴う。基質特異的な抗体が蛍光団に連結される。検出が、細胞が光ビームを通過するときにそれぞれの細胞から放出される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法は２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【０１０１】
免疫組織化学分析：この方法は、基質を、基質特異的な抗体によって、固定処理された細胞においてその場で検出することを伴う。基質特異的な抗体は酵素に連結され得るか、または、蛍光団に連結され得る。検出が、顕微鏡、および、主観的評価または自動的評価によって行われる。酵素連結抗体が用いられるならば、比色反応が必要とされる場合がある。免疫組織化学では、多くの場合、細胞の核を、例えば、ヘマトキシリン染色またはギムザ染色を使用して対比染色することが続いて行われることが理解される。
【０１０２】
インシトゥー活性アッセイ：この方法によれば、発色性基質が、活性な酵素を含有する細胞に適用され、その酵素により、基質が分解されて、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡によって視認され得る発色性生成物を生じさせる反応が触媒される。
【０１０３】
本発明の１つの局面によれば、キットは、固定化されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、化学発光検出アッセイを使用して検出するために使用することができる。
【０１０４】
このアッセイでは、標的分析物が、化学発光性基質の酸化を酸化作用因の存在下で触媒することができる酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）に直接的または間接的のいずれかで結合させられる。酸化後、基質は励起状態にあり、検出可能な光波を放出する。光放出の強い強化をエンハンサーによって生じさせることができる。
【０１０５】
したがって、そのようなキットは、本発明の液体組成物および検出可能な作用因（すなわち、化学発光性化合物、例えば、ルミノール、および、本明細書中上記で記載される化学発光性化合物など）に加えて、化学発光性基質を酸化することができる酵素を含むことができる。典型的には、酵素は、抗体またはアビジン誘導体（例えば、ストレプトアビジンなど）にコンジュゲート化される。そのような酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびカタラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本発明のこの局面によるキットはまた、酸化剤を含むことができる。例示的な酸化作用因には、過酸化水素、尿素過酸化水素、炭酸ナトリウム過酸化水素または過ホウ酸塩が含まれる。当業者に知られている他の酸化剤または酸化作用因を本明細書中で使用することができる。好ましい酸化剤は、過酸化水素または尿素過酸化水素のいずれか、および、それらの混合物である。
【０１０７】
上述されるように、本発明のこの局面のキットはまた、化学発光エンハンサーを含むことができる。一般に、本明細書中で使用されるエンハンサーは、有機溶媒または緩衝液に可溶性である有機化合物で、化学発光性有機化合物と、酸化剤と、酵素または他の生物学的分子との間における発光反応を強化する有機化合物を含む。好適なエンハンサーには、例えば、ハロゲン化フェノール類（例えば、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、４−ブロモ−２−クロロフェノール、３，４−ジクロロフェノールなど）、アルキル化フェノール類（例えば、４−メチルフェノールおよび４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールなど）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオナートおよび同様な化合物、４−ベンジルフェノール、４−（２’，４’−ジニトロスチリル）フェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−フルオロケイ皮酸、ｐ−ニトロケイ皮酸、ｐ−アミノケイ皮酸、ｍ−ヒドロキシケイ皮酸、ｏ−ヒドロキシケイ皮酸、４−フェノキシフェノール、４−（４−ヒドロキシフェノキシ）フェノール、ｐ−フェニルフェノール、２−クロロ−４−フェニルフェノール、４’−（４’−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン、４−（フェニルアゾ）フェノール、４−（２’−カルボキシフェニルアゾ）フェノール、１，６−ジブロモナフト−２−オール、１−ブロモナフト−２−オール、２−ナフトール、６−ブロモナフト−２−オール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−アミノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２，６−ジヒドロキシベンゾチアゾール、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、デヒドロルシフェリン、ホタルルシフェリン、フェノールインドフェノール、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，６−ジクロロフェノール−ｏ−クレゾール、フェノールインドアニリン、Ｎ−アルキルフェノキサジンまたは置換Ｎ−アルキルフェノキサジン、Ｎ−アルキルフェノチアジンまたは置換Ｎ−アルキルフェノチアジン、Ｎ−アルキルピリミジルフェノキサジンまたは置換Ｎ−アルキルピリミジルフェノキサジン、Ｎ−アルキルピリジルフェノキサジン、２−ヒドロキシ−９−フルオレノンまたは置換２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、６−ヒドロキシベンゾオキサゾールまたは置換６−ヒドロキシベンゾオキサゾールが含まれる。さらに他の有用な化合物には、酵素によって切断され得る保護されたエンハンサー、例えば、ｐ−フェニルフェノールホスファートまたはｐ−ヨードフェノールホスファート、あるいは、他の酵素切断可能な基を有する他のフェノールホスファート、ならびに、ｐ−フェニレンジアミンおよびテトラメチルベンジジンなどが含まれる。他の有用なエンハンサーには、フルオレセイン、例えば、５−（ｎ−テトラデカニル）アミノフルオレセインなどが含まれる。
【０１０８】
本発明の別の局面によれば、キットは、固定化されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、蛍光または発色による検出アッセイを使用して検出するために使用することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはその誘導体を含む代わりに、そのようなキットは、典型的には、アルカリホスファターゼと、蛍光性基質または発色性基質とを含む。発色性生成物を生じさせるための酸化作用因もまた、キットに含めることができる（例えば、フェリシアン化カリウムおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）など）。
【０１０９】
本発明のキットはまた、細胞および細胞抽出物におけるいくつかの一般的なレポーター遺伝子の発現を検出するために使用することができる。したがって、キットは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびルシフェラーゼのための基質を含むことができる。
【０１１０】
本発明のキットはさらに、酵素反応のための阻害剤を含むことができる。そのような阻害剤の例には、レバミゾール、Ｌ−ｐ−ブロモテトラミゾール、テトラミゾールおよび５，６−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−［２，１−ｂ］チアゾールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明の別の局面によれば、セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供され、この場合、ナノ構造は、液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【０１１２】
セファロスポリンは、可溶化プロセスを助けるために本発明の液体組成物を加える前の溶媒、または、加えた後の溶媒に溶解することができる。本発明では、この物質の溶解性をさらに増大させるために、極性、非極性、有機（例えば、エタノールまたはアセトンなど）または非有機を含む任意の溶媒の使用が意図されることが理解される。
【０１１３】
溶媒は、物質が本発明の液体組成物に溶解／分散されたままであるように可溶化プロセスの期間中の任意のときに（完全または部分的に）除くことができる。溶媒を除く様々な方法がこの技術分野では知られている（例えば、エバポレーション（すなわち、加熱、または、圧力を加えることによるエバポレーション）、または、任意の他の方法など）。
【０１１４】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１１５】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１１６】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他著「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１１７】
実施例１
ＥＣＬ検出システムに対する、ナノ構造を含む水の影響
電気化学発光反応の感度が、ナノ構造を含む水によって影響されるかどうかを明らかにするために、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を、免疫ペルオキシダーゼＥＣＬ検出システムを上記水の存在下および非存在下で使用して検出した。
【０１１８】
材料および方法
ＥＣＬ試薬の調製：ストックＡ
ａ）ＤＭＳＯ（Ｆｌｕｃａ、０−９２５３）における２５０ｍＭのルミノール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−９００８）の５０μｌ。
ｂ）ＤＭＳＯにおける９０ｍＭのｐ−クマル酸（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−９００８）の２２μｌ。
ｃ）０．５ｍｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．５）。
ｄ）４．４２８ｍｌのＨ２Ｏ（合計で５ｍｌ）。
【０１１９】
ストックＢ
ａ）３μｌのＨ２Ｏ２。
ｂ）０．５ｍｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．５）。
ｃ）４．５ｍｌのＨ２Ｏ（合計で５ｍｌ）。
【０１２０】
ＥＣＬ試薬の３つの異なる供給源を使用した。
１．標準。自家製
２．Ｖｅｒ１．０−ｄＨ２Ｏを、試薬および緩衝液のすべてについて、ナノ構造を含む水で置き換えた。
３．Ｖｅｒ１．１−反応体積のｄＨ２Ｏを、ナノ構造を含む水で置き換えた。
【０１２１】
全細胞タンパク質抽出物をＪｕｒｋａｔ細胞から作製した。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、ニトロセルロースメンブランへのタンパク質ブロッティングを行った。ＺＡＰ７０タンパク質について特異的な抗体（自家製ポリクローナル血清Ａｂ）を１：３００００の希釈度でメンブランとインキュベーションした（通常の作業希釈度は１：３０００である）。抗体による免疫反応性タンパク質のバンドを、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体と反応し、その後、免疫ペルオキシダーゼＥＣＬ検出システムにより現像することによって可視化した。本質的には、等体積のストックＡおよびストックＢを一緒にし、検出ミックスを５分間平衡化した。この検出ミックスを（タンパク質側を上側にした）ブロットに直接に加え、室温で３分間インキュベーションした。その後、ｘ線フィルムを、ニトロセルロースメンブランに対して、１分間、５分間および１０分間感光させた。
【０１２２】
結果
図１に例示されるように、水を、ナノ構造を含む水で置き換えることにより、ＥＣＬ反応の感度が増大する。
【０１２３】
明確化のために別々の実施形態の状況において記載される本発明のいくつかの特徴が、１つの実施形態において組合せでも提供され得ることが理解される。逆に、簡略化のために１つの実施形態の状況において記載される本発明の様々な特徴がまた、別々に提供され得るか、または、任意の好適な部分組合せで提供され得る。
【０１２４】
実施例２
ナノ構造を含む組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む組成物の影響を調べた。
【０１２５】
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。２９０μｌを、１３ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）の様々なバッチに加えた。それぞれの水が、フェノールレッド溶液が加えられた後でのそれらの黄色または明るいオレンジ色により、それらのすべてが酸性であったが、異なる開始ｐＨを有したことが認められた。２．５ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムの増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
【０１２６】
結果
表１には、水酸化ナトリウム滴定の後でのそれぞれの水の溶液の５５７ｎｍにおける吸光度がまとめられる。
【０１２７】
図２および表２に例示されるように、ＲＯ水は、水酸化ナトリウムを加えたとき、ｐＨにおけるより大きい変化を示す。ＲＯ水はわずかな緩衝作用を有するが、吸光度が０．０９Ａに達したとき、緩衝作用が「破れ」、ｐＨ変化が、より多くの水酸化ナトリウムを加えた後ではより大きくなる。ＨＡ−９９水はＲＯと類似している。ＮＭ（＃１５０９０５−１０６）（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、ＡＢ水Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＡＢ１−２２−１ ＨＡ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）は若干の緩衝作用を有する。ＨＡＰおよびＨＡ−１８はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも一層大きい緩衝作用を示す。
【０１２８】
まとめると、この実験から、ＨＡ−９９−Ｘを除いて、試験されたナノ構造を含むすべての新しい水タイプ（ＨＡＰ、ＡＢ１−２−３、ＨＡ−１８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と類似した特性を示す。
【０１２９】
実施例３
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
【０１３０】
材料および方法
水酸化ナトリウムおよび塩酸を、５０ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加え、ｐＨを測定した。実験を三連で行った。すべてにおいて、３回の実験を行った。
【０１３１】
水酸化ナトリウム滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを加えた。
【０１３２】
塩酸滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ塩酸を加えた。
【０１３３】
結果
水酸化ナトリウム滴定についての結果を図３Ａ〜Ｃおよび図４Ａ〜Ｃに示す。塩酸滴定についての結果を図５Ａ〜Ｃおよび図６に示す。
【０１３４】
ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の水酸化ナトリウムを要求するので、ナノ構造を含む水は緩衝能力を有する。この特徴は７．６〜１０．５のｐＨ範囲においてより著しい。加えて、ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の塩酸を必要とする。この作用は、アルカリ範囲よりも、酸性ｐＨ範囲での方が大きい。例えば、１０μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５６から１０．３に増大する。ナノ構造を含む水のｐＨは７．６２から９．３３に増大した。１０μｌの塩酸（０．５Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５２から４．３１に低下した。ナノ構造を含む水のｐＨは７．７１から６．６５に低下した。この特徴は７．７〜３のｐＨ範囲においてより著しい。
【０１３５】
実施例４
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
【０１３６】
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。１ｍｌを、４５ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加えた。ｐＨを測定し、必要ならば、滴定した。３ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムまたは塩酸の増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
【０１３７】
塩酸滴定：
ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．８５
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０９０５−１０６）：４５ｍｌ ｐＨ６．３
１ｍｌのフェノールレッドおよび４μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．１９
【０１３８】
水酸化ナトリウム滴定：
Ｉ．ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッド、６μｌの塩酸（０．２５Ｍ）および４μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０６０４−１０９）：４５ｍｌ ｐＨ８．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび４５μｌの塩酸（０．２５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
ＩＩ．ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．４６
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１２０１０４−１０７）：４５ｍｌ ｐＨ８．６８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの塩酸（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．９１
【０１３９】
結果
図７Ａ〜Ｃおよび図８Ａ〜Ｂに例示されるように、ナノ構造を含む水の緩衝能力はＲＯ水の緩衝能力よりも大きかった。
【０１４０】
実施例５
ＲＦ水の緩衝能力
緩衝能力に対するＲＦ水の影響を調べた。
【０１４１】
材料および方法
水酸化ナトリウム（１Ｍ）の数μｌの液滴を加えて、１５０ｍｌのＲＯ水のｐＨ（ｐＨ＝５．８）を上げた。この水の５０ｍｌを３つのボトルに等分した。３つの処理を行った：
ボトル１：非処理（ＲＯ水）
ボトル２：３０Ｗにより３０分間照射されたＲＯ水。このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された（ＲＦ水）。
ボトル３：ｐＨが５に達したとき、２回目の照射に供されたＲＦ水。照射後、このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された。
【０１４２】
１μｌの０．５Ｍ塩酸を５０ｍｌの水に加えることによって滴定を行った。ｐＨ値が４．２未満に達したときに滴定を終えた。
【０１４３】
実験を三連で行った。
【０１４４】
結果
図９Ａ〜Ｃおよび図１０から理解され得るように、ＲＦ水およびＲＦ２水は、ナノ構造を含む担体組成物の緩衝特性と類似する緩衝特性を含む。
【０１４５】
実施例６
ナノ構造を含む液体組成物の溶媒能力
下記の実験を、ナノ構造を含む液体組成物が、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことがともに知られている２つの材料を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
【０１４６】
Ａ．エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
５回の試みを、粉末を様々な組成で溶解することを目指して行った。
組成は下記の通りであった：
Ａ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
Ｂ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（９０分間脱水されたもの）。
Ｃ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋４９５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋４９５μｌのＥｔＯＨ（５０％−５０％）。
Ｄ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋９０μｌのＥｔＯＨ（９０％−１０％）。
Ｅ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋８２０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋１７０μｌのＥｔＯＨ（８０％−２０％）。
【０１４７】
これらのチューブをボルテックスし、６０℃に１時間加熱した。
【０１４８】
結果
１．白色粉末は５個すべての試験チューブにおいて溶解しなかった。
２．赤色粉末は溶解したが、しばらくして沈降した。
色がわずかに黄色に変化したので、試験チューブＣは粉末をより良好に溶解したかのようであった。
【０１４９】
Ｂ．粉砕後の、エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
粉砕後、赤色粉末を４つの組成で溶解した：
Ａ．１／２ｍｇの赤色粉末＋４９．５μｌのＲＯ。
Ｂ．１／２ｍｇの赤色粉末＋４９．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
Ｃ．１／２ｍｇの赤色粉末＋９．９μｌのＥｔＯＨ→３９．６５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２０％−８０％）。
Ｄ．１／２ｍｇの赤色粉末＋２４．７５μｌのＥｔＯＨ→２４．７５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）。
総反応体積：５０μｌ。
【０１５０】
これらのチューブをボルテックスし、６０℃に１時間加熱した。
【０１５１】
結果
粉砕後、赤色粉末を溶解するために、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）との組合せにおいて、わずかに２０％のエタノールだけが必要であった。
【０１５２】
Ｃ．徹底的な粉砕の後における、エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
２つの粉砕プロトコルを行った。第１は粉末単独に対してであり（バイアル１）、第２は、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（１％）に分散された粉末に対してあった（バイアル２）。
【０１５３】
これら２つの組成物を２つのバイアルに入れ、攪拌機上に置いて、材料を一晩粉砕した。
【０１５４】
１５時間後、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を数分毎に１０μｌの滴定によって１ｍｇの赤色粉末（バイアル１）に加えた。
【０１５５】
変化を、試験チューブの写真を０時間〜２４時間の間で撮影することによってモニタリングした（図１４Ｆ〜Ｊ）。
【０１５６】
比較として、２つのチューブを観察した。２つのうちの一方が、９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（９０分間脱水されたもの）に分散された赤色粉末（１％溶液）を含み、他方が、５０％エタノール／５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液に分散された赤色粉末（１％溶液）を含んだ。チューブを６０℃で１時間加熱した。これらのチューブが図１４Ａ〜Ｅに例示される。２４時間の期間の後、それぞれの溶液からの２μｌを採取し、その吸光度をｎａｎｏｄｒｏｐで測定した（図１５Ａ〜Ｃ）。
【０１５７】
結果
図１１Ａ〜Ｊは、徹底的な粉砕の後では、赤色材料が２４時間にわたって安定であり続け、沈下しないように、赤色材料を溶解することが可能であることを例示する。しかしながら、図１１Ａ〜Ｅは、時間が経過するとき、該材料は色が変化すること（安定でないこと）を示す。
【０１５８】
バイアル１はほとんど吸収しなかった（図１２Ａ）；溶液Ｂの吸光度ピークは、左側（２２０ｎｍ）への変化を伴って２２０ｎｍ〜２７０ｎｍの間にあり（図１２Ｂ）、溶液Ｃの吸光度ピークは２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの間にあった（図１２Ｃ）。
【０１５９】
結論
赤色材料を粉砕することにより、該材料をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散させることがもたらされた。この分散物は２４時間にわたって持続した。該材料をガラス製バイアルにおいて維持することにより、溶液は、１００％の脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＥｔＯＨ−Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方において、その後７２時間安定に保たれた。
【０１６０】
実施例７
ダイゼイン、ダウノルビシンおよびｔ−ｂｏｃ誘導体を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が３つの材料（ダイゼイン−ダウノマイシンコンジュゲート（ＣＤ−Ｄａｕ）；ダウノルビシン（セルビジン塩酸塩）；ダイゼインのｔ−ｂｏｃ誘導体（ｔｂｏｃ−Ｄａｉｄ）、これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０１６１】
材料および方法
Ａ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート１：
要求濃度：３ｍｇ／ｍｌ（Ｎｅｏｗａｔｅｒ）
属性：この材料を、ＤＭＳＯ、アセトン、アセトニトリルに溶解した。
属性：この材料をＥｔＯＨに溶解した。
【０１６２】
５個の異なるガラス製バイアルを調製した：
１．５ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１．２ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
２．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン。
３．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１５０μｌのアセトン＋４５０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２５％アセトン）。
４．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌの１０％＊ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）。
５．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン＋６００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
【０１６３】
これらのサンプルをボルテックスし、分光光度計での測定を、バイアル＃１、バイアル＃４およびバイアル＃５に対して行った。
【０１６４】
バイアルを、アセトンを蒸発させるために開けたままにした（バイアル＃２、バイアル＃３およびバイアル＃５）。
【０１６５】
結果
バイアル＃１（１００％のＮｅｏｗａｔｅｒ）：ＣＤ−Ｄａｕが数時間後に沈降した。
バイアル＃２（１００％のアセトン）：ＣＤ−Ｄａｕがアセトン内に懸濁されたが、４８時間後には、アセトンが材料を溶解したので、材料が部分的に沈降した。
バイアル＃３（２５％のアセトン）：ＣＤ−Ｄａｕがあまり良好に溶解せず、材料が溶液内部に漂った（溶液は濁っているようであった）。
バイアル＃４（１０％ＰＥＧ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ）：ＣＤ−Ｄａｕが、バイアル＃１におけるＣＤ−Ｄａｕよりも良好に溶解したが、ＣＤ−Ｄａｕは、１００％アセトンとの混合物の場合ほど良好に溶解しなかった。
バイアル＃５：ＣＤ−Ｄａｕが最初、アセトン内に懸濁され、ＣＤ−Ｄａｕが完全に溶解した後で、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を、アセトンを交換するために加えた。最初、アセトンは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在にもかかわらず、この材料を溶解した。しかしながら、アセトンが蒸発するにつれ、材料は一部がバイアルの底に沈降した。しかしながら、材料は懸濁されたままであった。
【０１６６】
分光光度計での測定（図１３）は、アセトンの存在下および非存在下の両方における材料の挙動を例示する。アセトンがある場合、水または１０％ＰＥＧにより懸濁される材料（両方の場合に、これらは１つだけのピークを示すだけである）との比較において、２つのピークが存在する。
【０１６７】
Ｂ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート２：
アセトンが、溶液＃２、溶液＃４および溶液＃５から蒸発するとすぐに、材料はわずかに沈降した。さらなる量のアセトンをこれらのバイアルに加えた。このプロトコルは、材料をアセトンおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下で溶解することを可能にし、一方で、同時に、その後の、溶液からのアセトンの蒸発を可能にする（この処置を２回行った）。２回目のサイクルの後で、液相をバイアルから取り出し、さらなる量のアセトンを沈降した材料に加えた。沈降した材料が溶解すると、それを以前に取り出された液相と一緒にした。一緒にした溶液を再び蒸発させた。材料が全く溶解しなかったので、バイアル＃１からの溶液を取り出し、代わりに、１．２ｍｌのアセトンを沈降物に加えて、材料を溶解した。その後、１．２ｍｌの１０％ＰＥＧ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）もまた加え、しばらくした後で、アセトンを溶液から蒸発させた。これらの処置を終了したとき、これらのバイアルを一緒にして１つのバイアルにした（３ｍｌの総体積）。この最終的な体積の上に、３ｍｌのアセトンを、材料を溶解し且つ透明な液化溶液を収容するために加え、その後、この溶液を５０℃で再び蒸発させた。溶液は平衡に達しなかった。これは、そのような状態に一旦達すると、溶液は分離してしまうであろうという事実のためである。平衡を避けることによって、材料の水和状態が維持され、液体として保たれた。溶媒を蒸発させた後、材料を清浄なバイアルに移し、真空条件下で閉じた。
【０１６８】
Ｃ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート３：
別の３ｍｌの材料（６ｍｌの総体積）を、２ｍｌのアセトン溶解材料と、以前の実験から残った１ｍｌの残留材料とを加えることにより作製した。
【０１６９】
１．９ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を、アセトンを含有するバイアルに加えた。
【０１７０】
１００μｌのアセトン＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を残留材料に加えた。
【０１７１】
蒸発を、５０℃に調節されたホットプレート上で行った。
【０１７２】
この処置を、溶液が安定になるまで３回繰り返した（アセトンの添加およびその蒸発）。
【０１７３】
これら２つのバイアルをまとめて一緒にした。
【０１７４】
これら２つの溶液を一緒にした後、材料がわずかに沈降した。アセトンを加え、溶媒の蒸発を繰り返した。
【０１７５】
バイアル（３ｍｌ＋２ｍｌ）を混合する前に、本明細書中上記のパート２に記載されるような実験で調製された第１の溶液を９℃で一晩インキュベーションして、その結果、溶液が平衡に達し、平衡を維持することを確実にした。そうすることによって、既に溶解している材料は沈降しないはずである。翌朝、溶液の吸収を明らかにし、差グラフを得た（図１４）。これら２つのバイアルを一緒にした後、材料がわずかに沈降するので、吸収測定を再び行った。一部の沈降の結果として、溶液をアセトン（５ｍｌ）の添加によって１：１で希釈し、続いて、溶液の蒸発をホットプレートにて５０℃で行った。蒸発処置を行いながらでの溶液の分光光度計での読み取りはアセトンの存在のために変化した（図１５）。これらの実験から、微量のアセトンが存在するとき、アセトンは、もたらされる吸収読み取りに影響を及ぼし得ることが暗示される。
【０１７６】
Ｂ．ダウノルビシン（セルビジン塩酸塩）の可溶化
要求濃度：２ｍｇ／ｍｌ
【０１７７】
材料および方法
２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を１つのバイアルにおいて調製し、２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＲＯを第２のバイアルにおいて調製した。
【０１７８】
結果
この材料は、分光光度計での測定（図１６）によって例示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水の両方において容易に溶解した。
【０１７９】
結論
ダウノルビシンは難なくＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水に溶解する。
【０１８０】
Ｃ．ｔ−ｂｏｃの可溶化
要求濃度：４ｍｇ／ｍｌ
【０１８１】
材料および方法
１．１４ｍｌのＥｔＯＨを、１８．５ｍｇのｔ−ｂｏｃ（油状材料）を含有する１つのガラス製バイアルに加えた。その後、これを２つのバイアルに分け、１．７４ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＲＯ水を、溶液が２５％のＥｔＯＨを含むようにバイアルに加えた。分光光度計での測定の後、溶媒を溶液から蒸発させ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を両方のバイアルに加えてそれぞれのバイアルにおいて２．３１ｍｌの最終体積にした。これら２つのバイアルにおける溶液を１つの清浄なバイアルに一緒にし、真空条件下での輸送のためにパッケージングした。
【０１８２】
結果
分光光度計での測定が図１７に例示される。この材料はエタノールに溶解した。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加え、その後、溶媒を熱（５０℃）により蒸発させた後、この材料はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解することができた。
【０１８３】
結論
材料を溶解するための最適な方法は、最初、材料を溶媒（アセトン、酢酸またはエタノール）とともに溶解し、その後、親水性流体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））を加え、続いて、その溶媒を、溶液を加熱し、溶媒を蒸発させることによって除くことである。
【０１８４】
実施例８
ＡＧ−１４ａおよびＡＧ−１４ｂを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が２つの薬草材料（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ、これらはともに、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０１８５】
パート１
材料および方法
２．５ｍｇのそれぞれの材料（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ）を、４つのチューブのそれぞれにおける粉末の最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌであるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）単独、または、７５％のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および２５％のエタノールを含む溶液のいずれかで希釈した。これらのチューブをボルテックスし、５０℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
【０１８６】
結果
エタノールの存在下および非存在下でのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における２つの薬草材料の分光光学的測定を図１８Ａ〜Ｄに示す。
【０１８７】
結論
ＲＯにおける懸濁はＡＧ−１４Ｂを溶解しなかった。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＡＧ−１４Ｂの懸濁は凝集せず、これに対して、ＲＯでは、ＡＧ−１４Ｂが凝集した。
【０１８８】
ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４ＢはＮｅｏｗａｔｅｒ／ＲＯに溶解しなかった。
【０１８９】
パート２
材料および方法
５ｍｇのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂを６２．５μｌのＥｔＯＨ＋１８７．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈した。さらに６２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた。これらのチューブをボルテックスし、５０℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
【０１９０】
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加える前でのＥｔＯＨにおける溶解、その後、ＥｔＯＨの蒸発により、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂが溶解した。
【０１９１】
図１９に示されるように、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂは、４８時間を超えて懸濁状態で安定なままであった。
【０１９２】
実施例９
ペプチドを溶解する、ナノ構造を含む担体の能力
ナノ構造を含む担体組成物が７つの細胞傷害性ペプチド（これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。加えて、Ｓｋｏｖ−３細胞に対するこれらのペプチドの影響を、ナノ構造を含む担体組成物がペプチドの細胞傷害活性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために測定した。
【０１９３】
材料および方法
可溶化：７個すべてのペプチド（ペプチドＸ、Ｘ−５ＦＵ、ＮＬＳ−Ｅ、Ｐａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）、ＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２、ＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨおよびＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫ）を０．５ｍＭでＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した。分光光学的測定を行った。
【０１９４】
インビトロ実験：Ｓｋｏｖ−３細胞を９６ウエルプレートにおいてマッコイ５Ａ培地で増殖させ、１５００細胞／ウエルの濃度に希釈した。２４時間後、２μｌ（０．５ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．００５ｍＭ）のペプチド溶液を、１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍの最終濃度のために１ｍｌのマッコイ５Ａ培地でそれぞれ希釈した。９個の反復物をそれぞれの処理のために作製した。それぞれのプレートは、３つの濃度での２つのペプチド、および、コントロール処理の６つのウエルを含有した。９０μｌのマッコイ５Ａ培地＋ペプチドを細胞に加えた。１時間後、１０μｌのＦＢＳを（競合を防止するために）加えた。細胞を、クリスタルバイオレットに基づく生存性アッセイで２４時間後および４８時間後に定量した。このアッセイにおける色素はＤＮＡを染色する。可溶化したとき、単層により取り込まれた色素の量をプレート読取り機で定量した。
【０１９５】
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈された７個のペプチドの分光光学的測定を図２０Ａ〜Ｇに示す。図２１Ａ〜Ｇに示されるように、溶解されたペプチドのすべてが細胞傷害活性を含んでいた。
【０１９６】
実施例１０
レチノールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物がレチノールを溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０１９７】
材料および方法
レチノール（ビタミンＡ）をＳｉｇｍａ（Ｆｌｕｋａ、９９％ＨＰＬＣ）から購入した。レチノールを下記の条件下でＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において可溶化した。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における１％レチノール（１ｍｌに０．０１ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．５％レチノール（１ｍｌに０．００５ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．５％レチノール（２５ｍｌに０．１２５ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％レチノール（２５ｍｌに０．０６２５ｇｒ）。最終的なＥｔＯＨ濃度：１．５％
【０１９８】
ＥｔＯＨにおけるレチノールの吸光度スペクトル：レチノール溶液を、校正用グラフを作製するために、種々のレチノール濃度とともに無水ＥｔＯＨにおいて作製した。吸光度スペクトルを分光光度計で検出した。
【０１９９】
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％および０．５％のレチノールを有し、ＥｔＯＨの濃度が不明である２つの溶液を分光光度計で検出した。数滴の油滴が水に溶解されないので、レチノールの実際の濃度もまた不明である。
【０２００】
ろ過：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％のレチノールを有し、ＥｔＯＨの最終濃度が１．５％である２つの溶液を調製した。これらの溶液を０．４４μｌおよび０．２μｌのフィルターでろ過した。
【０２０１】
結果
レチノールは、アルカリ性のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において、酸性のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも容易に可溶化した。溶液の色は黄色であり、この色は時間とともに退色した。吸光度実験において、０．５％のレチノールは、０．１２５％のレチノールと類似するパターンを示し、０．２５％のレチノールは、０．０３１２５％のレチノールと類似するパターンを示した（図２２を参照のこと）。レチノールは熱において不安定であるので、（その融点は６３℃であり）、レチノールはオートクレーブ処理することができない。ろ過は、レチノールが（ＥｔＯＨに）完全に溶解されたときに可能であった。図２３に示されるように、ろ過後の溶液におけるレチノールは０．０３１２５％未満である。両方のろ液は、類似した結果を与えた。
【０２０２】
実施例１１
材料Ｘを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料Ｘを４０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２０３】
パート１−水およびＤＭＳＯにおける溶解性
材料および方法
第１の試験チューブにおいて、２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を１ｍｇの材料「Ｘ」に加えた。第２の試験チューブにおいて、２５μｌのＤＭＳＯを１ｍｇの材料「Ｘ」に加えた。両方の試験チューブをボルテックスし、６０℃に加熱し、振とう機で１時間振とうした。
【０２０４】
結果
この材料はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に全く溶解しなかった（試験チューブ１）。この材料はＤＭＳＯに溶解し、黄褐色の色を与えた。これらの溶液を２４時間〜４８時間放置し、それらの安定性を経時的に分析した（図２４Ａ〜Ｂ）。
【０２０５】
結論
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は材料「Ｘ」を溶解せず、材料が沈降し、これに対して、ＤＭＳＯは材料「Ｘ」をほぼ完全に溶解した。
【０２０６】
パート２−ＤＭＳＯの削減および異なる溶媒における材料の安定性／速度論の経時的な試験
材料および方法
それぞれが２５μｌの総反応体積を含有する６個の異なる試験チューブを分析した：
１．１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（１００％）。
２．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ→１２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％）。
３．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％）。
４．１ｍｇの「Ｘ」＋６．２５μｌのＤＭＳＯ＋１８．７５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２５％）。
５．１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋スクロース＊（１０％）。
６．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌの脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）＊＊（５０％）。
＊０．１ｇのスクロース＋１ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＝１０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋スクロース
＊＊脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を６０℃で９０分間脱水することによって得た。
【０２０７】
すべての試験チューブをボルテックスし、６０℃に加熱し、１時間振とうした。
【０２０８】
結果
６つの溶媒および材料Ｘを含む、時間０での試験チューブを図２５Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後６０分での試験チューブを図２６Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後１２０分での試験チューブを図２７Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後２４時間での試験チューブを図２８Ａ〜Ｃに示す。
【０２０９】
結論
すべての試験チューブにおいて、材料が２４時間後に沈降したので、材料「Ｘ」は期間中を通して安定なままではなかった。
【０２１０】
試験チューブ２の溶媒と、試験チューブ６の溶媒との間には、同じ割合の溶媒を含有するにもかかわらず、違いが認められる。これは、試験チューブ６が、非脱水のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）より疎水性である脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含有するためである。
【０２１１】
パート３ ＤＭＳＯのさらなる削減および異なる溶媒における材料の安定性／速度論の経時的な試験
材料および方法
１ｍｇの材料「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯをガラス製チューブに入れた。５０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）をチューブに少しずつ加え（数秒毎に、５μｌ）、その後、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の溶液（９％ＤＭＳＯ＋９１％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））５００μｌを加えた。
【０２１２】
第２のガラス製チューブにおいて、１ｍｇの材料「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯを加えた。５０μｌのＲＯをチューブに少しずつ加え（数秒毎に、５μｌ）、その後、ＲＯの溶液（９％ＤＭＳＯ＋９１％ＲＯ）５００μｌを加えた。
【０２１３】
結果
図２９Ａ〜Ｄに例示されるように、材料「Ｘ」は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液に分散されたままであったが、ＲＯ水を含む溶液では、チューブの底に沈降した。図３０は、ボルテックス後６時間での、ＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびアセトンに分散された材料の吸収特徴を示す。
【０２１４】
結論
材料「Ｘ」が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と比較したとき、ＲＯに異なって溶解すること、および、材料「Ｘ」は、ＲＯと比較したとき、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）においてより安定であることが明らかである。分光光度計での測定（図３０）からは、グラフ下面積がＲＯの場合よりも大きいので、材料「Ｘ」が、５時間後でさえ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）にはより良好に溶解していたことが明らかである。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は材料「Ｘ」を水和することが明らかである。ＤＭＳＯの量を２０％〜８０％減らすことができ、また、材料「Ｘ」を水和し、材料「Ｘ」をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散する、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく溶液を得ることができる。
【０２１５】
実施例１２
ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を３０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２１６】
材料および方法
ＳＰＬ２１０１をその最適な溶媒（エタノール）に溶解し（図３１Ａ）、ＳＰＬ５２１７をその最適な溶媒（アセトン）に溶解した（図３１Ｂ）。これら２つの化合物をガラス製バイアルに入れ、冷暗所環境で保った。微量の溶媒が全く認められなくなるまで、溶媒の蒸発をデシケータにおいて長時間行い、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を溶液に加えた。
【０２１７】
結果
ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７は、図３２Ａ〜Ｂにおける分光光度計データによって示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した。
【０２１８】
実施例１３
タキソールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料タキソール（パクリタキセル）を０．５ｍＭの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２１９】
材料および方法
可溶化：０．５ｍＭのタキソール溶液を、ＤＭＳＯ、または、１７％のＥｔＯＨを伴うＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のいずれかで調製した（４ｍｌにおいて０．００１７ｇｒ）。吸光度を分光光度計により検出した。
細胞生存性アッセイ：１５００００個の２９３Ｔ細胞を３ｍｌのＤＭＥＭ培地とともに６ウエルプレートに播種した。それぞれの処理物を、ＲＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づくＤＭＥＭ培地で増殖させた。タキソール（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＤＭＳＯに溶解されたもの）を１．６６６μＭの最終濃度に加えた（３ｍｌの培地中１０μｌの０．５ｍＭタキソール）。細胞をタキソールによる２４時間処理の後で集め、死細胞を検出するためのトリパンブルー溶液を使用して計数した。
【０２２０】
結果
タキソールは、図３３Ａ〜Ｂに示されるように、ＤＭＳＯおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方に溶解した。タキソールの様々な溶液の後での２９３Ｔ細胞の生存性を図３４に示す。
【０２２１】
結論
タキソールは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶液の後で細胞傷害作用を含んでいた。
【０２２２】
実施例１４
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用
ナノ構造を含む液体組成物がタンパク質の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２２３】
材料および方法
２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）を、ｄｄＨ２Ｏ（ＲＯ）におけるそれらの活性、および、ナノ構造を含む担体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）におけるそれらの活性を求めるために、ＰＣＲ反応において調べた。酵素を１時間〜２．５時間までの種々の期間にわたって９５℃に加熱した。２つのタイプの反応液を作製した：
水のみ−酵素および水のみを煮沸した。
中味すべて−反応成分のすべてを煮沸した（酵素、水、緩衝液、ｄＮＴＰ類、ゲノムＤＮＡおよびプライマー）。
【０２２４】
煮沸後、必要とされる任意のさらなる反応成分をＰＣＲチューブに加え、通常のＰＣＲプログラムを３０サイクルに設定した。
【０２２５】
結果
図３５Ａ〜Ｂに示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件、および、酵素のみが熱ストレスに供された条件の両方の下で、酵素を加熱から保護した。対照的に、ＲＯ水は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件下で、酵素を加熱から保護しただけであった。
【０２２６】
実施例１５
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用のさらなる例示
ナノ構造を含む液体組成物が２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２２７】
材料および方法
ＰＣＲ反応を下記のように設定した：
Ｐｅｑ−ｌａｂサンプル：ナノ構造を含む液体組成物（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか２０．４μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｑ−ｌａｂ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０２２８】
３つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分および９０分であった。
【０２２９】
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌの１０Ｘ反応緩衝液Ｙ（Ｐｅｑ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー ＧＡＰＤＨミックス １０ｐｍｏｌ／μｌ
０．５μｌのゲノムＤＮＡ ３５μｇ／μｌ
【０２３０】
Ｂｉｏｌａｂサンプル
ナノ構造を含む液体組成物（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか１８．９μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｌａｂ、Ｔａｑポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０２３１】
５つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分、９０分、１２０分および１５０分であった。
【０２３２】
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌのＴＡＱ １０Ｘ緩衝液（Ｍｇ非含有）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー ＧＡＰＤＨミックス（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．５μｌのゲノムＤＮＡ（３５μｇ／μｌ）
【０２３３】
それぞれの処理（ＮｅｏｗａｔｅｒまたはＲＯ）のために、陽性コントロールおよび陰性コントロールを作製した。陽性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わないものであった。陰性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わず、かつ、ＤＮＡを反応において伴わないものであった。ＰＣＲミックスを、煮沸ｔａｑアッセイ、ならびに、コントロール反応のために作製した。
【０２３４】
サンプルをＰＣＲ装置に入れ、下記のように操作した：
ＰＣＲプログラム：
１．９４℃で２分間の変性
２．９４℃で３０秒間の変性
３．６０℃で３０秒間のアニーリング
４．７２℃で３０秒間の伸長
工程２〜４を３０回繰り返す
５．７２℃で１０分間の伸長
【０２３５】
結果
図３６に示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、１．５時間までの期間、両方の酵素を熱ストレスから保護した。
【０２３６】
実施例１６
ナノ構造を含む液体組成物はタキソールを溶解することができることのさらなる証拠
下記の実験を、ナノ構造を含むキャリア組成物が０．０８％のエタノールの存在下において０．５ｍＭの最終濃度で物質タキソール（パクリタキセル）を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
【０２３７】
材料および方法
可溶化：０．５ｍＭのタキソール溶液を調製した（４ｍｌにおいて０．００１７ｇｒ）。タキソールをエタノールに溶解し、２０日間に及んだＲＴ緩速溶媒交換手法を使用してＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に交換した。この手法が終了したとき、４０％未満のエタノールが溶液中に残存し、最終的な投与濃度において０．０８％のエタノールをもたらした。溶液を、０．２μｍのフィルターを使用して滅菌した。別途、タキソールをＤＭＳＯにおいて調製した（０．５ｍＭ）。両方の溶液を−２０℃で保った。吸光度を分光光度計により検出した。
【０２３８】
細胞生存性アッセイ：２０００個のＰＣ３細胞を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩに基づく培地の１００μｌとともに９６ウエルプレートの各ウエルに播種した。播種後２４時間で、０．５ｍＭタキソールの２μｌ、１μｌおよび０．５μｌを１ｍｌのＲＰＭＩ培地で希釈し、これにより、１μＭ、０．５μＭおよび０．２５μＭの最終濃度をそれぞれ得た。少なくとも８個の反復する反応を処理あたり行った。細胞増殖を、タキソール添加後２４時間で、クリスタルバイオレット比色アッセイを使用して細胞密度を定量することによって評価した。
【０２３９】
処理後２４時間で、細胞をＰＢＳにより洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより固定処理した。クリスタルバイオレットを加え、室温で１０分間インキュベーションした。細胞を３回洗浄した後、５０％エタノールにおいて１００Ｍクエン酸ナトリウムを含む溶液を使用して、色を細胞から溶出した。光学濃度の変化を、分光光度法によるプレートリーダーを使用して５７０ｎｍで読み取った。細胞生存性を、ブランクを引いた後、コントロールでの光学濃度（これは１００％であると見なされる）の百分率として表した。
【０２４０】
結果
ＤＭＳＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解された０．５ｍＭタキソールの分光光度法による吸光度が図３７Ａに例示される。図３７Ｂ〜図３７Ｃは両方の配合物についてのＨＰＬＣによる読み取りである。測定結果は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散されたタキソールの配合における構造的な変化が６ヶ月の貯蔵期間の後で何らないことを示した。細胞生存性のタキソール誘導による喪失の結果が、ＤＭＳＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した後において図３８に例示される。
【０２４１】
結論
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソール（０．０８％のエタノールを最終的な作業濃度において有する）は、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールと類似する、ヒト前立腺ガン細胞株に対するインビトロ細胞生存性／細胞毒性を示した。
【０２４２】
実施例１７
セファロスポリンの可溶化
下記実験の目的は、不溶性のセファロスポリンを、緩速溶媒交換手法を使用して３．６ｍｇ／ｍｌの濃度でＮｅｏｗａｔｅｒ（ＮＷ）に溶解すること、および、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性を保有するｐＵＣ１９プラスミドにより形質転換された大腸菌ＤＨ５α菌株に対するその生物活性を評価することであった。
【０２４３】
材料および方法
緩速溶媒交換：２５ｍｇのセファロスポリンを５ｍｌの有機溶媒（アセトン）に溶解した（５ｍｇ／ｍｌ）。ＮＷを添加する前に、この物質をＨｅλｉｏｓα分光光度計により分析した（図３９）。この物質はかろうじてアセトンに溶解した。この物質は最初、砂様の外見を伴って沈降した。有機溶媒をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）で交換する手順を、（３０℃で設定された）マルチブロックヒーターにおいて、また、デシケータおよびフードの中で行った。有機溶媒の濃度を、表２に示される式に従って計算した。
屈折計：ＲＩ：１．３３３９、式による計算に従って：１．８３３％。
分析天秤：平均：０．９９６２、式に従って：１．９４１％。
【０２４４】
溶液を、０．４５μｍのフィルターを使用して首尾良くろ過した。溶液の分光光度計による読み取りをろ過手法の前後で行った。
【０２４５】
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの生物活性の分析
ｐＵＣ１９プラスミド（アンピシリン耐性）を保有するＤＨ５α大腸菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充された液体ＬＢ培地において３７℃および２２０ｒｐｍ（回転／分）で一晩増殖させた。
【０２４６】
一晩（ＯＮ）のスターター培養物の１００μＬを下記のように新鮮な液体ＬＢに再接種した：
ａ．１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２回目の実験のみ）および抗生物質非添加（両方の実験）を有する３つのチューブ。
ｂ．セファロスポリンストック溶液（５０ｕｇ／ｍｌ）の１０μｌを有する３つのチューブ。
ｃ．セファロスポリンストック溶液（５ｕｇ／ｍｌ）の１００μｌを有する３つのチューブ。
【０２４７】
細菌を３７℃および２２０ｒｐｍでインキュベーションした。連続したＯＤ読み取りを、ＴＥＣＡＮ ＳＰＥＣＴＲＡＦｌｏｕｒ Ｐｌｕｓを使用して、５９０ｎｍのフィルターとともに９６ウエルの透明プレートを使用して１時間毎に行った。
【０２４８】
結果
図４０は、ろ過前およびろ過後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【０２４９】
図４１Ａ〜図４１Ｂおよび図４２Ａ〜図４２Ｂに例示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたとき、セファロスポリンは、大きく希釈されたときでさえ、細菌増殖阻害剤としての生物学的利用能および生物活性を有する。注目すべきことに、本実施例は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）自体は細菌の増殖阻害において何ら役割を有しないことを教示する。
【０２５０】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許および特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物の検出を強化するために使用することができるキットおよび製造物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子（例えば、タンパク質）の検出は疾患または医学的状態の診断において非常に有益であり得る。特定のタンパク質の存在または特定のタンパク質に関する性質を明らかにすることによって、研究者は、疾患状態に関係するウイルス、細菌、遺伝子変異または他の状態の存在を確認することができる。さらには、患者のプロテオーム、すなわち、患者特有の一組の発現タンパク質を分析することによって、個体が特定の医薬品または治療法を必要とすることに関する有用な情報を明らかにすることができ、その結果、一連の治療または予防的治療法を調節することができる。タンパク質およびペプチドを検出するための現在の方法には、様々な簡便な方法が含まれ、例えば、ウエスタンブロット分析、免疫化学的アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などが含まれる。
【０００３】
放射性医薬品の使用は一般に、生体分子を検出するための最も一般的な方法である。しかしながら、放射免疫アッセイの非常に成功した広範囲に及ぶ使用はいくつかの問題を生じさせており、そのような問題には、（１）放射能標識された化合物の貯蔵寿命および安定性、（２）放射性廃棄物処分の費用が大きいこと、および、（３）放射性物質の使用だけでなく、同様に液体シンチレーション計測のために必要な溶媒の使用にさらされる結果としての健康被害が含まれる。
【０００４】
蛍光を発する化合物が多くの用途で使用されており、また、入射波長および観測波長が異なるので、蛍光が本質的には吸収よりも高感度である生物学的適用のために特に好適であることが知られている。蛍光を、細胞全体、細胞成分および細胞機能の検出のために使用することができる。例えば、多くの診断技術および分析技術では、サンプルを、サンプルが検出され得るように蛍光標識することが要求される。これは、例えば、細胞、組織、タンパク質、抗体、酵素、薬物、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、核酸、炭水化物、あるいは、天然ポリマーまたは合成ポリマーなど、広範囲の様々な物質と相互作用して、蛍光性コンンジュゲートを作製する蛍光性の色素またはプローブを使用することによって達成される。
【０００５】
合成された蛍光性プローブの場合、リガンドが、観測されることになる生化学反応に対する特異性を与えるためにしばしば使用され、蛍光性色素により、その相互作用を検出または定量するための手段が提供される。これらの適用には、とりわけ、タンパク質の検出（例えば、ゲル内、表面または水溶液におけるタンパク質の検出）、細胞追跡、酵素活性の評価、および、核酸または他の生体ポリマーを染色することが含まれる。
【０００６】
化学発光、すなわち、化学反応による光の生成、および、生物発光、すなわち、一部の生物によって生成される光が、タンパク質の検出においてだけでなく、ＤＮＡ配列決定および他の関連した研究においても、放射性標識に取って代わる可能性のある代替物として試験されている。化学発光は、放射能標識化を上回る大きな利点を提供する。これは、化学発光により、冷光が生じるからであり、すなわち、その生じた光が、反応に関与する原子および／または分子の振動によってではなく、電子エネルギーへの化学物質の直接的な変換によって引き起こされるからである。したがって、有機化合物の化学発光に関する研究は、現在行われている重点領域の１つである。ちなみに、化学発光はまた、微量元素および汚染物質を環境規制のために検出および測定するためにも好都合である。
【０００７】
最も良く知られている化学発光反応は、安定化された酵素誘発可能な１，２−ジオキセタン系化合物、アクリダン系化合物、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノールおよびその誘導体、または、ルシゲニンのいずれかを、化学的作用因、反応剤または基質として用いる化学発光反応である。
【０００８】
西洋ワサビペルオキシダーゼが、使用するために広範囲に入手可能であり、かつ、安価であるので、様々なアッセイのために広く使用される。西洋ワサビペルオキシダーゼは、環状ヒドラジド、フェノール誘導体、アクリダン誘導体および生物発光系の成分を含めて、広範囲の基質の発光性酸化を触媒する。他の好適な基質にはまた、（ａ）ルミノールおよび関連化合物、（ｂ）ピロガロールおよびプルプロガリン、（ｃ）アクリダンカルボン酸誘導体、（ｄ）ヒカリカモメガイ（Ｐｈｏｌａｓ ｄａｃｔｌｕｓ）およびホタル（キタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ））またはウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）から単離される各種ルシフェリンが含まれる。これらの光生成反応は、それらの検出限界、特異性、試薬の入手性、ならびに、光放射の大きさおよび速度論において広範囲に異なる。このことは、当然のことながら、それらの適用性を制限する。
【０００９】
数多くの蛍光性基質および化学発光基質がこの技術分野では知られている一方で、それらのシグナル強度、それらのシグナル対バックグラウンド比および／またはそれらの安定性を改善することが依然として求められている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの局面によれば、（ｉ）検出可能な作用因と、（ｉｉ）液体およびナノ構造を有する液体組成物とを含む、分析物を検出するためのキットが提供され、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１１】
本発明の別の局面によれば、包装材と、包装材の中に含有される、検出可能な成分の検出を高めるために特定される液体組成物とを含む製造物が提供され、この場合、液体組成物は液体およびナノ構造を有し、ただし、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供され、この場合、前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、整列した流体分子の前記エンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１３】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分析物は生体分子である。
【００１４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、生体分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な作用因は非直接的に検出可能である。
【００１６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、非直接的に検出可能な作用因は、検出可能な生成物を生じさせることができる酵素反応のための基質である。
【００１７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な作用因は直接的に検出可能である。
【００１８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な作用因は親和性認識成分を含む。
【００１９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、親和性認識成分は、アビジン誘導体、ポリヌクレオチドおよび抗体からなる群から選択される。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、直接的に検出可能な作用因は、リン光性作用因、化学発光性作用因および蛍光性作用因からなる群から選択される。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、酵素反応のエンハンサーを含む。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、エンハンサーは、ｐ−ヨードフェノール、３，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１，２，４−トリアゾール、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、フェノール、２−ナフトール、１０−メチルフェノチアジン、セチルトリメチルアンモニウム臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに酸化作用因を含む。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酸化作用因は、過酸化水素、尿素過酸化水素、炭酸ナトリウム過酸化水素、過ホウ酸塩、フェリシアン化カリウムおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）からなる群から選択される。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、酵素反応のための酵素を含む。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群から選択される。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素は抗体またはアビジン誘導体にコンジュゲート化される。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、キットはさらに、酵素反応の阻害剤を含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、検出可能な生成物は、蛍光性生成物、化学発光性生成物、リン光性生成物および発色性生成物からなる群から選択される。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、蛍光性生成物を生じさせることができる基質は蛍光団を含む。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、蛍光団は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびＤＤＡＯからなる群から選択される分子に由来する。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、蛍光性生成物を生じさせることができる基質は、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＤＤＡＯガラクトシド、β−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−カルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＥＬＦ９７ホスファート、５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＦＤＧ）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロニド、ＰＦＢアミノフルオレセインジグルクロニド、ＥＬＦ９７−β−Ｄ−グルクロニド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬクロラムフェニコール基質（商標）および１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンからなる群から選択される。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、発色性生成物を生じさせることができる基質は、ＢＣＩＰ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧｌｃＵ）および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）からなる群から選択される。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、化学発光性生成物を生じさせることができる基質は、ルシフェリン、ルミノール、イソルミノール、アクリダン、フェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、２，４，６−トリクロロフェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、ピロガロール、フロログルシノールおよびレゾルシノールからなる群から選択される。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、流体分子の少なくとも一部がガス状状態である。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はナノ構造のクラスターを形成することができる。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ナノ構造はヒドロキシアパタイトから作製される。
【００４２】
本発明は、分析物を検出する能力が高められた組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００４３】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照として援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４４】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、ナノ構造を含む水を使用するＥＣＬ反応の感度における増大を例示するオートラジオグラフの写真である。Ｊｕｒｋａｔ細胞株の７．５μｇストリップ（図１Ａ、図１Ｃおよび図１Ｅ）および１５μｇストリップ（図１Ｂ、図１Ｄおよび図１Ｆ）に等しい細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、ニトロセルロースメンブランへのタンパク質ブロッティングを行った。ＺＡＰ７０に対して惹起されたポリクローナル抗体とのインキュベーションの後、免疫反応性タンパク質のバンドをＨＲＰコンジュゲート化二次Ａｂとの反応および免疫ペルオキシダーゼＥＣＬ検出システムによる現像によって可視化した。レーン１−標準反応試薬；レーン２−全試薬＋ナノ構造を含む水を使用する緩衝液；レーン３−ナノ構造を含む水を用いて作製される反応体積。
【図２】図２は、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの様々な水組成物の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図５Ａ】図５Ａは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図６】図６は、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図７Ａ】図７Ａは、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、ＲＯの塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図８Ａ）、および、ナノ構造を含む水の塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図８Ｂ）である。それぞれのキュベットは１μｌの塩酸の添加を例示する。
【図９Ａ】図９Ａは、ＲＦ水の塩酸滴定を例示するグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＲＦ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。矢印は２回目の照射を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。
【図１０】図１０は、ＲＯ水と比較したときの、ＦＲ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。実験を３回繰り返した。３回の実験のすべてについての平均値がＲＯ水についてプロットされた。
【図１１Ａ−１１Ｃ．１１Ｆ−１１Ｈ】図１１Ａ〜Ｃおよび図１１Ｆ〜Ｈは、粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。図１１Ａ〜図１１Ｅは、実施例６のパートＣからの、右側：試験チューブＣ（５０％ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、および、左側：試験チューブＢ（脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標））を例示する。図１１Ｇ〜図１１Ｊは、赤色粉末の一晩の破砕、および、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の滴定の後での溶液を例示する。
【図１１Ｄ−１１Ｅ．１１Ｉ−１１Ｊ】図１１Ｄ〜Ｅおよび図１１Ｉ〜Ｊは、粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。図１１Ａ〜図１１Ｅは、実施例６のパートＣからの、右側：試験チューブＣ（５０％ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、および、左側：試験チューブＢ（脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標））を例示する。図１１Ｇ〜図１１Ｊは、赤色粉末の一晩の破砕、および、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の滴定の後での溶液を例示する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ナノドロップで測定されたときの、一晩の粉砕の後での赤色粉末＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒの溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ナノドロップで測定されたときの、１００％の脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた後での赤色粉末の溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ナノドロップで測定されたときの、ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）を加えた後での赤色粉末の溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。
【図１３】図１３は、バイアル＃１（ＣＤ−Ｄａｕ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、バイアル＃４（ＣＤ−Ｄａｕ＋１０％ＰＥＧ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））およびバイアル＃５（ＣＤ−Ｄａｕ＋５０％アセトン＋５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））の分光光度計測定のグラフである。
【図１４】図１４は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）、および、微量の溶媒（アセトン）を伴う溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。
【図１５】図１５は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）および、アセトンにおける溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。淡青色および黄色の線はアセトン蒸発の異なる割合を表し、紫色線はアセトン非含有溶液である。
【図１６】図１６は、ＣＤ−Ｄａｕの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。
【図１７】図１７は、ｔ−ｂｏｃの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発直後のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ｂの、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、エタノール蒸発後２４時間のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ｂの、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、エタノール蒸発直後のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ａの、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発後２４時間のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ａの、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。
【図１９】図１９は、エタノール蒸発後２４時間でのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ１４Ｂの懸濁物の写真である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドＸの分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＸ−５ＦＵの分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−Ｅの分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）の分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２の分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨの分光光度計測定のグラフである。
【図２０Ｇ】図２０Ｇは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫの分光光度計測定のグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドＸの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＸ−５ＦＵの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−Ｅの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）の細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２の細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｆ】図２１Ｆは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２１Ｇ】図２１Ｇは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。
【図２２】図２２は、エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。
【図２３】図２３は、ろ過後の、エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、試験チューブ（左側はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および物質「Ｘ」を含有し、右側はＤＭＳＯおよび物質「Ｘ」を含有する）の写真である。図２４Ａは、２４時間放置された試験チューブを例示し、図２４Ｂは、４８時間放置された試験チューブを例示する。
【図２５】図２５Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った直後における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２５Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２５Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２５Ｃ）の写真である。
【図２６】図２６Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後６０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２６Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２６Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２６Ｃ）の写真である。
【図２７】図２７Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後１２０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２７Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２７Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２７Ｃ）の写真である。
【図２８】図２８Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後２４時間における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２８Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２８Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２８Ｃ）の写真である。
【図２９】図２９Ａ〜Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および低下した濃度のＤＭＳＯを含む溶媒に物質「Ｘ」を含むガラス製ボトルの振とう直後の写真（図２９Ａ）、振とう後３０分の写真（図２９Ｂ）、振とう後６０分の写真（図２９Ｃ）および振とう後１２０分の写真（図２９Ｄ）である。
【図３０】図３０は、分光光度計によって測定されたときの、ボルテックス後６時間のＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における物質「Ｘ」の吸収特徴を例示するグラフである。
【図３１】図３１Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、エタノールにおけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図３１Ａ）、および、アセトンにおけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図３１Ｂ）である。
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図３２Ａ）、および、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図３２Ｂ）である。
【図３３】図３３Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図３３Ａ）、および、ＤＭＳＯにおけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図３３Ｂ）である。
【図３４】図３４は、２９３Ｔ細胞に対する異なる溶剤におけるタキソールの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。コントロールＲＯ＝ＲＯ水により構成される培地；コントロールＮｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）により構成される培地；コントロールＤＭＳＯ ＲＯ＝ＲＯ水＋１０μｌのＤＭＳＯにより構成される培地；コントロールＮｅｏ ＲＯ＝ＲＯ水＋１０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）により構成される培地；タキソールＤＭＳＯ ＲＯ＝ＲＯ水と、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＤＭＳＯ Ｎｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＮＷ ＲＯ＝ＲＯ水と、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＮＷ Ｎｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソールとにより構成される培地。
【図３５】図３５Ａ〜Ｂは、２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例１４に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および非存在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【図３６】図３６は、２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例１５に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および非存在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【図３７Ａ】図３７Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＤＭＳＯにおける０．５ｍＭタキソールの分光光度法による読み取りを例示するグラフである。
【図３７Ｂ−３７Ｃ】図３７Ｂ〜Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＤＭＳＯにおけるタキソールのＨＰＬＣによる読み取りである。図３７Ｂは、タキソールの新たに調製された標準（ＤＭＳＯ）配合物のＨＰＬＣによる読み取りを例示する。図３７Ｃは、−２０℃での６ヶ月の貯蔵の後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散されたタキソールのＨＰＬＣによる読み取りを例示する。
【図３８】図３８は、ＤＭＳＯ配合物またはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）配合物における様々なタキソール濃度のＰＣ３細胞生存性を例示する棒グラフである。それぞれの点が８個の反復実験からの平均＋／−標準偏差を表す。
【図３９】図３９は、１００％のアセトンに溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【図４０】図４０は、ろ過前およびろ過後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【図４１】図４１Ａ〜Ｂは、セファロスポリン濃度が異なるＬＢにおけるＤＨ５αの増殖曲線である。細菌を２回別々に３７℃および２２０ｒｐｍで増殖させた。
【図４２】図４２Ａ〜Ｂは、２回別々に接種後７時間における、コントロールでの増殖（セファロスポリン非添加）に対する参照での２つの異なるセファロスポリン濃度によるＤＨ５αの生存性を例示する棒グラフである（コントロール群は１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含有する）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、分析物の検出を強化するために使用することができるキットおよび製造物に関する。
【００４７】
本発明によるキットおよび製造物の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
【００４８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載において示されるか、または、実施例において例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定するものとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
【００４９】
医療検査企業および診断検査企業は、生体分子を検出するためのより高感度な方法を絶えず求めている。例えば、医療は、ウイルスを検出する非常に高感度な方法を明らかに必要としている。化学物質または他の物質を検出するためのより高感度なアッセイはまた、広範囲の環境領域において有用であると考えられ、この場合、早期の検出が行われれば、災害を阻止するために十分に早期の是正活動を開始することができる。非常に高感度な検出技術はまた、半導体製造の最適化された制御のためにも有用であり得る。
【００５０】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ナノ構造（例えば、米国特許出願第６０／５４５９５５号および同第１０／８６５９５５号、ならびに、国際特許出願公開番号ＷＯ２００５／０７９１５３に記載されるナノ構造など）を含む組成物が分析物の検出を高めることを発見している。
【００５１】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、ナノ構造および液体がＥＣＬタンパク質検出システムの感度を増大させることを明らかにしている。
【００５２】
したがって、本発明の１つの局面によれば、包装材と、包装材の中に含有される、検出可能な成分の検出を高めるために特定される液体組成物とを含む製造物が提供され、この場合、液体組成物は液体およびナノ構造を有し、ただし、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「ナノ構造（ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」は、一つ以上の粒子を含むサブマイクロメートルスケールの構造を指し、それらの粒子の各々はナノメートルまたはサブナノメートルスケールであり、一般に「ナノ粒子」と略される。構造の異なる要素（例えばナノ粒子、分子）の間の距離は、数十ピコメートルまたはそれ未満のオーダであることができ（その場合においてナノ構造は「連続ナノ構造」と称される）、または数百ピコメートルから数百ナノメートルのオーダであることができる（その場合においてナノ構造は「不連続ナノ構造」と称される）。従って、本実施形態のナノ構造は、ナノ粒子、ナノ粒子の配置、または一つ以上のナノ粒子および一つ以上の分子のいかなる配置も含むことができる。
【００５４】
上記組成物の液体は水性液体、例えば水であることが好ましい。
【００５５】
本発明のこの局面による一つの好ましい実施形態によれば、液体組成物のナノ構造は、整列した流体分子によって包囲されたナノメートルサイズのコア材料を含み、これらの流体分子はコア材料と、そして互いに定常的な物理的状態にある。このような液体組成物は、本発明者の米国特許出願第６０／５４５９５５号および第１０／８６５９５５号、並びに国際特許出願公開ＷＯ ２００５／０７９１５３に記載されており、それらの内容は参考としてここに組み入れられる。
【００５６】
このようなコア材料の例は、限定されないが、強誘電性物質、強磁性物質および圧電性物質を含む。強誘電性物質は、電場を加えることによって逆転または再配向させることができる永続的な電気的分極をある温度範囲にわたって維持する物質である。強磁性物質は、磁場を加えることによって逆転できる永続的な磁化を維持する物質である。好ましくは、ナノ構造は、コア材料の強誘電性または強磁性を保持し、それによってマクロスケールの物理的特性がナノスケール環境にもたらされる特別な特徴を有する。
【００５７】
コア材料はまた、結晶構造を持ってもよい。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「整列した流体分子」は、相互関係を有する、例えば流体分子間の相関を有する流体分子の組織化された配置を示す。例えば、一つの流体分子の即座の変位は、コア材料を包囲する一つ以上の他の流体分子の即座の変位と相互に関係されることができる。
【００５９】
本明細書中で使用される用語「定常的な物理状態」は、物体または分子が、少なくとも局所的な最小値を有する何らかのポテンシャルによって結びついている状況を示す。そのようなポテンシャルについての代表的な例には、限定されないが、ファンデルワールスポテンシャル、湯川ポテンシャル、およびレナード・ジョーンズポテンシャルなどが含まれる。他の形態のポテンシャルもまた、考えられる。
【００６０】
好ましくは、エンベロープの流体分子は液体組成物の液体分子と同一である。エンベロープの流体分子は、液体組成物の液体分子と同一でない追加の流体を含んでもよく、従ってエンベロープは不均一流体組成物を含んでもよい。
【００６１】
整列した流体分子のエンベロープの形成のため、本実施形態のナノ構造は、液体の比重より低いかまたはそれに等しい比重を有することが好ましい。
【００６２】
流体分子は液体状態またはガス状状態またはそれらの二つの混合状態のいずれかであってもよい。
【００６３】
ナノ構造の好ましい濃度は１リットルあたり１０２０個未満のナノ構造、より好ましくは１リットルあたり１０１５個未満のナノ構造である。好ましくは、液体中のナノ構造は、それらの間で引きつける静電力によって少なくとも一つの追加のナノ構造とクラスター形成することができる。好ましくは、ナノ構造間の距離がクラスター形成（約０．５〜１０μｍ）を防止するとき、ナノ構造は長距離の相互作用を維持することができる。
【００６４】
理論にとらわれることはないが、ナノ構造間の長距離相互作用が液体組成物の特有の特徴に役立ち、その結果、液体組成物が検出システムの感度を高めていると考えられる。例えば、本発明者らは、本発明の組成物がタンパク質を熱の影響から保護し、タンパク質を安定化すること（実施例１４および実施例１５）、および、高まった緩衝能力（すなわち、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力）を含むこと（実施例２〜実施例５）を示している。これらの要因はともに、検出システムにおけるタンパク質の状態に寄与することができ、したがって、検出システムの全体的な感度を高めることができる。
【００６５】
本明細書中で使用される表現「緩衝能力」は、酸または塩基が添加されたとき、安定なｐＨを維持する組成物の能力を示す。
【００６６】
さらに、本発明者らは、本発明の組成物により、様々な作用因の溶解性が高まることを示している（実施例６〜実施例１３および実施例１５〜実施例１７）。このことが結果的には、検出システムの高まった感度につながるかもしれない。
【００６７】
本発明のこの局面に従ったナノ構造の製造は、「トップダウン」プロセスを使用して行うことができる。このプロセスは、固体粉末（例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末または合成ポリマー）が、十分に高い温度に、好ましくは約７００℃を越えて加熱される下記の方法工程を含む。
【００６８】
意図される固体粉末の例には、ＢａＴｉＯ３、ＷＯ３およびＢａ２Ｆ９Ｏ１２が含まれるが、これらに限定されない。驚いたことに、本発明者はまた、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）もまた本発明の液体組成物を生成するために加熱されてもよいことを示した。ハイドロキシアパタイトは、それが非毒性によって特徴づけられ、一般に人の治療のためにＦＤＡ承認されているので、特に好ましい。
【００６９】
多くのハイドロキシアパタイト粉末がＳｉｇｍａ，ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌａｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（例えばカタログＮｏ．１３０６−０６−５）のような多数の製造業者から入手可能であることが認識されるだろう。
【００７０】
表１に示されるように、ＨＡに基づく液体組成物は全て、水と比較すると高い緩衝能力を持つ。
【００７１】
加熱された粉末は次いで、冷たい液体（水）に、その密度異常温度以下で、例えば３℃または２℃で浸漬される。同時に、冷たい液体および粉末は、電磁ＲＦ放射線、好ましくは５００ＭＨｚ以上、７００ＭＨｚより高いものによって照射され、それは連続波ＲＦ放射線または変調ＲＦ放射線のいずれであってもよい。
【００７２】
本発明者らは、ナノ構造および液体を含む組成物が、検出可能なシグナルの強化によって、および／または、そのようなシグナルの生成に関わる酵素の活性を増大させることによってそのどちらかで検出システムの感度を増大させ得るのではないかと推測している。
【００７３】
本明細書中上記で記載されるナノ構造および液体を含む組成物はキットの一部を形成し得ることが理解される。
【００７４】
したがって、本発明の別の局面によれば、
（ｉ）検出可能な作用因と、
（ｉｉ）液体およびナノ構造を有する液体組成物と
を含む、分析物を検出するためのキットが提供され、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００７５】
本発明のキットは、所望されるならば、本発明のキットの１つまたは複数のユニットを含有し得るパックで提示され得る。そのようなパックには、キットを使用するための説明書が付随し得る。パックはまた、実験室補助品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められる形式で容器に関連する通知によって適用させられることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態の当局による承認を反映する。
【００７６】
本明細書中で使用される用語「分析物」は、検出されるべき分子または化合物を示す。好適な分析物には、生体分子を含めて、様々な有機分子および無機分子が含まれる。分析物は、環境または臨床での化学物質または汚染物質または生体分子である場合があり、これらには、農薬、殺虫剤、毒素、治療用薬物および乱用薬物、ホルモン、抗生物質、有機物および溶媒が含まれるが、これらに限定されない。好適な生体分子には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、ステロイド、細胞そのもの［原核生物細胞（例えば、病原性細菌など）および真核生物細胞（哺乳動物の腫瘍細胞を含む）を含む］、ウイルス、胞子などが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい分析物は、タンパク質（酵素を含む）；薬物、抗体；抗原；細胞膜抗原および受容体（神経受容体、ホルモン受容体、栄養素受容体および細胞表面受容体）またはそのリガンドである。
【００７７】
本発明の検出キットは、液体およびナノ構造を含む液体組成物に基づく高まった感度を示す。
【００７８】
本発明では、液体およびナノ構造を含む組成物における検出のために、および／または、検出アッセイを行うために要求される少なくとも１つの成分を可溶化することが想定され、この場合、水成分は、少なくとも一部が、液体およびナノ構造を含む組成物に交換される。検出アッセイの液体部分は、５％、より好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは４０％、より好ましくは６０％、より好ましくは８０％、一層より好ましくは１００％の本発明の液体組成物を含むことができる。
【００７９】
液体およびナノ構造を含む組成物を含むのと同様に、本発明のキットはまた、検出可能な作用因を含む。
【００８０】
本発明のこの局面の一実施形態によれば、検出可能な作用因は、典型的には特定の波長の放射線を放出することに基づいて直接的に検出可能である（例えば、蛍光性作用因、リン光性作用因または化学発光性作用因である）。
【００８１】
特定の分析物を検出するために、典型的には、そのような検出可能な作用因は、標的分析物に結合する親和性認識成分を含む。親和性認識成分の例には、アビジン誘導体（例えば、アビジン、ストレプトアビジンおよびヌトラビジン）、抗体およびポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
アビジンは、等電点が約１０．５である多カチオン性の６６０００ダルトンの糖タンパク質である。ストレプトアビジンは、ほぼ中性の等電点を有するグリコシル化されていない５２８００ダルトンのタンパク質である。ヌトラビジンはアビジンの脱グリコシル化形態である。これらのタンパク質のすべてが、ビオチンに対する非常に大きい親和性および選択性を有しており、それぞれが分子あたり４個のビオチンと結合することができる。アビジン認識成分を含む検出可能な作用因を、天然に存在するビオチン化された生体分子、または、ビオチンを含むように人為的に操作されている生体分子を検出するために使用することができる。
【００８３】
本発明において使用される用語「抗体」は、特定のタンパク質またはポリペプチドに結合することができる無傷の分子、ならびに、その機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなど）を包含する。
【００８４】
本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣体の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを示す。この用語には、天然に存在する塩基、糖および共有結合のヌクレオチド間連結（例えば、骨格）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、天然に存在するそれぞれの部分と類似して機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。標識されたポリヌクレオチドを、標識されたポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることができるサンプル中のポリヌクレオチドを検出するために使用することができる。
【００８５】
本明細書中で使用される表現「ハイブリダイゼーションすることができる」は、塩基対形成することを示し、この場合、核酸作用因の少なくとも一方の鎖は少なくとも一部が、Ｈ１９ ｍＲＮＡに対して相同的である。
【００８６】
本発明のこの局面の別の実施形態によれば、本発明のキットの検出可能な作用因はまた、非直接的に検出可能である。例えば、検出可能な作用因は、検出可能な生成物を生じさせることができる酵素反応のための基質である場合がある。
【００８７】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質は典型的には、蛍光団を含む。そのような蛍光団は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびＤＤＡＯ（これらに限定されない）を含めて、多くの分子に由来することができる。
【００８８】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質の例には、可溶性の蛍光性生成物を生じさせる基質（例えば、水溶性のクマリン系化合物に由来する基質、緑色〜黄色の水溶性蛍光団に由来する基質、水溶性の赤色蛍光団に由来する基質、チオール反応性の蛍光発生基質、親油性蛍光団、ペンタフルオロベンゾイル蛍光発生酵素基質）、不溶性の蛍光性生成物を生じさせる基質、励起状態のエネルギー転移に基づく基質、および、不連続な酵素アッセイのための蛍光性の誘導体化試薬が含まれるが、これらに限定されない。そのような基質に関する詳細をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのウエブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｂｅｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／１００１．ｈｔｍｌ）において見出すことができる。
【００８９】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質の具体的な例には、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＤＤＡＯガラクトシド、β−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−カルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＥＬＦ９７ホスファート、５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＦＤＧ）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロニド、ＰＦＢアミノフルオレセインジグルクロニド、ＥＬＦ９７−β−Ｄ−グルクロニド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬクロラムフェニコール基質（商標）および１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
化学発光性生成物を生じさせることができる基質の例には、ルシフェリン、ルミノール、イソルミノール、アクリダン、フェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、２，４，６−トリクロロフェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、ピロガロール、フロログルシノールおよびレゾルシノールが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
発色性生成物を生じさせることができる基質の例には、ＢＣＩＰ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧｌｃＵ）および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
キットは、種々の検出アッセイにおいて有用でありうる。
【００９３】
下記は、本発明のキットを使用して行うことができる、ポリヌクレオチドを検出するためのアッセイの列挙である。
【００９４】
ノーザンブロット分析：この方法は、ＲＮＡの混合物において特定のＲＮＡを検出することを伴う。ＲＮＡサンプルが、塩基対間の水素結合の形成を妨げ、これにより、ＲＮＡ分子のすべてが、折り畳まれていない線状の立体配座を有することを保証する作用因（例えば、ホルムアルデヒド）による処理によって変性させられる。その後、個々のＲＮＡ分子がゲル電気泳動によってサイズに従って分離され、変性したＲＮＡが付着するニトロセルロースメンブランまたはナイロン系メンブランに転写される。その後、メンブランは、標識されたＤＮＡプローブにさらされる。プローブを、酵素連結されたヌクレオチドを使用して標識することができる。検出を、比色反応または化学発光を使用して行うことができる。この方法は、特定のＲＮＡ分子の量を定量すること、および、電気泳動期間中のゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によってその同一性を明らかにすることの両方を可能にする。
【００９５】
ＲＮＡインシトゥーハイブリダイゼーション染色：この方法では、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブが、細胞に存在するＲＮＡ分子に結合させられる。一般には、細胞が最初に、細胞構造を失わないようにするために、また、ＲＮＡ分子が分解されないようにするために顕微鏡スライドガラスに固定され、その後、標識されたプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液に供される。ハイブリダイゼーション緩衝液には、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブが、プローブの非特異的な結合を避けながら、その標的ｍＲＮＡ分子とその場において特異的にハイブリダイゼーションすることを可能にするホルムアミドおよび塩（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム）などの試薬が含まれる。当業者は、ハイブリダイゼーション条件（すなわち、温度、塩およびホルムアミドの濃度およびその他）を特定のプローブおよび細胞タイプに対して調節することができる。ハイブリダイゼーション後、何らかの結合していないプローブが洗い流され、スライドガラスが、化学発光を伴うプローブを使用して生じさせられるシグナルを明らかにする写真乳剤、または、酵素連結の標識されたプローブを使用して生じさせられるシグナルを明らかにする比色反応のいずれかに供される。
【００９６】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ：この方法では、本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドプローブが固体表面（例えば、ガラスウエハー）に結合させられる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは長さがおよそ２０個〜２５個の核酸である。特定の細胞サンプル（例えば、血液細胞）における本発明のポリヌクレオチドの発現パターンを検出するために、ＲＮＡが、この技術分野で知られている方法を使用して（例えば、ＴＲＩＺＯＬ溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国）を使用して）細胞サンプルから抽出される。ハイブリダイゼーションを、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、５’−ビオチン化プローブ）、または、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）もしくは相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の標識されたフラグメントのいずれかを使用して行うことができる。簡単に記載すると、二本鎖のｃＤＮＡが、逆転写酵素（ＲＴ）（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ）、ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩを使用してＲＮＡから調製される（すべてが製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、米国）に従って使用される）。標識されたｃＲＮＡを調製するために、二本鎖ｃＤＮＡが、例えば、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｆｆｙｍｅｔｉｘ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用してビオチン化ヌクレオチドの存在下でのインビトロ転写反応に供される。効率的なハイブリダイゼーションのために、標識されたｃＲＮＡは、ＲＮＡを、４０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸塩（ｐＨ８．１）、１００ｍＭの酢酸カリウムおよび３０ｍＭの酢酸マグネシウムにおいて９４℃で３５分間インキュベーションすることによってフラグメント化することができる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイは洗浄され、ハイブリダイゼーションシグナルが、プローブアレイに結合した標識されているｃＲＮＡによって放出される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光スキャナを使用して走査される。
【００９７】
例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）では、アレイ上のそれぞれの遺伝子が一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって表される。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの各プローブ対が完全一致のオリゴヌクレオチドおよびミスマッチのオリゴヌクレオチドからなる。完全一致のプローブは、特定の遺伝子に対して正確に相補的な配列を有しており、したがって、特定の遺伝子の発現レベルの測定を可能にする一方で、ミスマッチのプローブは、中心の塩基位置での一塩基置換によって完全一致のプローブとは異なる。ハイブリダイゼーションシグナルが、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナを使用して走査され、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウエアにより、ミスマッチのプローブに由来する非特異的なシグナルが、完全一致のプローブに由来するシグナルから引かれる。
【００９８】
下記は、本発明のキットを使用して行うことができる、ポリペプチドを検出するためのアッセイの列挙である。
【００９９】
ウエスタンブロット：この方法は、基質をアクリルアミドゲルによって他のタンパク質から分離すること、その後、基質をメンブラン（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に転写することを伴う。その後、基質の存在が、基質に対して特異的な抗体によって検出され、次に、この抗体が抗体結合試薬によって検出される。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡまたは他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、本明細書中上記で記載されるように放射能標識することができ、または、酵素連結することができる。検出を、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行うことができる。この方法は、基質の量を定量すること、および、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によってその同一性を明らかにすることの両方を可能にする。
【０１００】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質を基質特異的な抗体によって細胞においてその場で検出することを伴う。基質特異的な抗体が蛍光団に連結される。検出が、細胞が光ビームを通過するときにそれぞれの細胞から放出される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法は２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【０１０１】
免疫組織化学分析：この方法は、基質を、基質特異的な抗体によって、固定処理された細胞においてその場で検出することを伴う。基質特異的な抗体は酵素に連結され得るか、または、蛍光団に連結され得る。検出が、顕微鏡、および、主観的評価または自動的評価によって行われる。酵素連結抗体が用いられるならば、比色反応が必要とされる場合がある。免疫組織化学では、多くの場合、細胞の核を、例えば、ヘマトキシリン染色またはギムザ染色を使用して対比染色することが続いて行われることが理解される。
【０１０２】
インシトゥー活性アッセイ：この方法によれば、発色性基質が、活性な酵素を含有する細胞に適用され、その酵素により、基質が分解されて、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡によって視認され得る発色性生成物を生じさせる反応が触媒される。
【０１０３】
本発明の１つの局面によれば、キットは、固定化されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、化学発光検出アッセイを使用して検出するために使用することができる。
【０１０４】
このアッセイでは、標的分析物が、化学発光性基質の酸化を酸化作用因の存在下で触媒することができる酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）に直接的または間接的のいずれかで結合させられる。酸化後、基質は励起状態にあり、検出可能な光波を放出する。光放出の強い強化をエンハンサーによって生じさせることができる。
【０１０５】
したがって、そのようなキットは、本発明の液体組成物および検出可能な作用因（すなわち、化学発光性化合物、例えば、ルミノール、および、本明細書中上記で記載される化学発光性化合物など）に加えて、化学発光性基質を酸化することができる酵素を含むことができる。典型的には、酵素は、抗体またはアビジン誘導体（例えば、ストレプトアビジンなど）にコンジュゲート化される。そのような酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびカタラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本発明のこの局面によるキットはまた、酸化剤を含むことができる。例示的な酸化作用因には、過酸化水素、尿素過酸化水素、炭酸ナトリウム過酸化水素または過ホウ酸塩が含まれる。当業者に知られている他の酸化剤または酸化作用因を本明細書中で使用することができる。好ましい酸化剤は、過酸化水素または尿素過酸化水素のいずれか、および、それらの混合物である。
【０１０７】
上述されるように、本発明のこの局面のキットはまた、化学発光エンハンサーを含むことができる。一般に、本明細書中で使用されるエンハンサーは、有機溶媒または緩衝液に可溶性である有機化合物で、化学発光性有機化合物と、酸化剤と、酵素または他の生物学的分子との間における発光反応を強化する有機化合物を含む。好適なエンハンサーには、例えば、ハロゲン化フェノール類（例えば、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、４−ブロモ−２−クロロフェノール、３，４−ジクロロフェノールなど）、アルキル化フェノール類（例えば、４−メチルフェノールおよび４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールなど）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオナートおよび同様な化合物、４−ベンジルフェノール、４−（２’，４’−ジニトロスチリル）フェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−フルオロケイ皮酸、ｐ−ニトロケイ皮酸、ｐ−アミノケイ皮酸、ｍ−ヒドロキシケイ皮酸、ｏ−ヒドロキシケイ皮酸、４−フェノキシフェノール、４−（４−ヒドロキシフェノキシ）フェノール、ｐ−フェニルフェノール、２−クロロ−４−フェニルフェノール、４’−（４’−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン、４−（フェニルアゾ）フェノール、４−（２’−カルボキシフェニルアゾ）フェノール、１，６−ジブロモナフト−２−オール、１−ブロモナフト−２−オール、２−ナフトール、６−ブロモナフト−２−オール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−アミノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２，６−ジヒドロキシベンゾチアゾール、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、デヒドロルシフェリン、ホタルルシフェリン、フェノールインドフェノール、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，６−ジクロロフェノール−ｏ−クレゾール、フェノールインドアニリン、Ｎ−アルキルフェノキサジンまたは置換Ｎ−アルキルフェノキサジン、Ｎ−アルキルフェノチアジンまたは置換Ｎ−アルキルフェノチアジン、Ｎ−アルキルピリミジルフェノキサジンまたは置換Ｎ−アルキルピリミジルフェノキサジン、Ｎ−アルキルピリジルフェノキサジン、２−ヒドロキシ−９−フルオレノンまたは置換２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、６−ヒドロキシベンゾオキサゾールまたは置換６−ヒドロキシベンゾオキサゾールが含まれる。さらに他の有用な化合物には、酵素によって切断され得る保護されたエンハンサー、例えば、ｐ−フェニルフェノールホスファートまたはｐ−ヨードフェノールホスファート、あるいは、他の酵素切断可能な基を有する他のフェノールホスファート、ならびに、ｐ−フェニレンジアミンおよびテトラメチルベンジジンなどが含まれる。他の有用なエンハンサーには、フルオレセイン、例えば、５−（ｎ−テトラデカニル）アミノフルオレセインなどが含まれる。
【０１０８】
本発明の別の局面によれば、キットは、固定化されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、蛍光または発色による検出アッセイを使用して検出するために使用することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはその誘導体を含む代わりに、そのようなキットは、典型的には、アルカリホスファターゼと、蛍光性基質または発色性基質とを含む。発色性生成物を生じさせるための酸化作用因もまた、キットに含めることができる（例えば、フェリシアン化カリウムおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）など）。
【０１０９】
本発明のキットはまた、細胞および細胞抽出物におけるいくつかの一般的なレポーター遺伝子の発現を検出するために使用することができる。したがって、キットは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびルシフェラーゼのための基質を含むことができる。
【０１１０】
本発明のキットはさらに、酵素反応のための阻害剤を含むことができる。そのような阻害剤の例には、レバミゾール、Ｌ−ｐ−ブロモテトラミゾール、テトラミゾールおよび５，６−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−［２，１−ｂ］チアゾールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明の別の局面によれば、セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供され、この場合、ナノ構造は、液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【０１１２】
セファロスポリンは、可溶化プロセスを助けるために本発明の液体組成物を加える前の溶媒、または、加えた後の溶媒に溶解することができる。本発明では、この物質の溶解性をさらに増大させるために、極性、非極性、有機（例えば、エタノールまたはアセトンなど）または非有機を含む任意の溶媒の使用が意図されることが理解される。
【０１１３】
溶媒は、物質が本発明の液体組成物に溶解／分散されたままであるように可溶化プロセスの期間中の任意のときに（完全または部分的に）除くことができる。溶媒を除く様々な方法がこの技術分野では知られている（例えば、エバポレーション（すなわち、加熱、または、圧力を加えることによるエバポレーション）、または、任意の他の方法など）。
【０１１４】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１１５】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１１６】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他著「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１１７】
実施例１
ＥＣＬ検出システムに対する、ナノ構造を含む水の影響
電気化学発光反応の感度が、ナノ構造を含む水によって影響されるかどうかを明らかにするために、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を、免疫ペルオキシダーゼＥＣＬ検出システムを上記水の存在下および非存在下で使用して検出した。
【０１１８】
材料および方法
ＥＣＬ試薬の調製：ストックＡ
ａ）ＤＭＳＯ（Ｆｌｕｃａ、０−９２５３）における２５０ｍＭのルミノール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−９００８）の５０μｌ。
ｂ）ＤＭＳＯにおける９０ｍＭのｐ−クマル酸（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−９００８）の２２μｌ。
ｃ）０．５ｍｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．５）。
ｄ）４．４２８ｍｌのＨ２Ｏ（合計で５ｍｌ）。
【０１１９】
ストックＢ
ａ）３μｌのＨ２Ｏ２。
ｂ）０．５ｍｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．５）。
ｃ）４．５ｍｌのＨ２Ｏ（合計で５ｍｌ）。
【０１２０】
ＥＣＬ試薬の３つの異なる供給源を使用した。
１．標準。自家製
２．Ｖｅｒ１．０−ｄＨ２Ｏを、試薬および緩衝液のすべてについて、ナノ構造を含む水で置き換えた。
３．Ｖｅｒ１．１−反応体積のｄＨ２Ｏを、ナノ構造を含む水で置き換えた。
【０１２１】
全細胞タンパク質抽出物をＪｕｒｋａｔ細胞から作製した。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、ニトロセルロースメンブランへのタンパク質ブロッティングを行った。ＺＡＰ７０タンパク質について特異的な抗体（自家製ポリクローナル血清Ａｂ）を１：３００００の希釈度でメンブランとインキュベーションした（通常の作業希釈度は１：３０００である）。抗体による免疫反応性タンパク質のバンドを、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体と反応し、その後、免疫ペルオキシダーゼＥＣＬ検出システムにより現像することによって可視化した。本質的には、等体積のストックＡおよびストックＢを一緒にし、検出ミックスを５分間平衡化した。この検出ミックスを（タンパク質側を上側にした）ブロットに直接に加え、室温で３分間インキュベーションした。その後、ｘ線フィルムを、ニトロセルロースメンブランに対して、１分間、５分間および１０分間感光させた。
【０１２２】
結果
図１に例示されるように、水を、ナノ構造を含む水で置き換えることにより、ＥＣＬ反応の感度が増大する。
【０１２３】
明確化のために別々の実施形態の状況において記載される本発明のいくつかの特徴が、１つの実施形態において組合せでも提供され得ることが理解される。逆に、簡略化のために１つの実施形態の状況において記載される本発明の様々な特徴がまた、別々に提供され得るか、または、任意の好適な部分組合せで提供され得る。
【０１２４】
実施例２
ナノ構造を含む組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む組成物の影響を調べた。
【０１２５】
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。２９０μｌを、１３ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）の様々なバッチに加えた。それぞれの水が、フェノールレッド溶液が加えられた後でのそれらの黄色または明るいオレンジ色により、それらのすべてが酸性であったが、異なる開始ｐＨを有したことが認められた。２．５ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムの増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
【０１２６】
結果
表１には、水酸化ナトリウム滴定の後でのそれぞれの水の溶液の５５７ｎｍにおける吸光度がまとめられる。
【０１２７】
図２および表２に例示されるように、ＲＯ水は、水酸化ナトリウムを加えたとき、ｐＨにおけるより大きい変化を示す。ＲＯ水はわずかな緩衝作用を有するが、吸光度が０．０９Ａに達したとき、緩衝作用が「破れ」、ｐＨ変化が、より多くの水酸化ナトリウムを加えた後ではより大きくなる。ＨＡ−９９水はＲＯと類似している。ＮＭ（＃１５０９０５−１０６）（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、ＡＢ水Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＡＢ１−２２−１ ＨＡ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）は若干の緩衝作用を有する。ＨＡＰおよびＨＡ−１８はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも一層大きい緩衝作用を示す。
【０１２８】
まとめると、この実験から、ＨＡ−９９−Ｘを除いて、試験されたナノ構造を含むすべての新しい水タイプ（ＨＡＰ、ＡＢ１−２−３、ＨＡ−１８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と類似した特性を示す。
【０１２９】
実施例３
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
【０１３０】
材料および方法
水酸化ナトリウムおよび塩酸を、５０ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加え、ｐＨを測定した。実験を三連で行った。すべてにおいて、３回の実験を行った。
【０１３１】
水酸化ナトリウム滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを加えた。
【０１３２】
塩酸滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ塩酸を加えた。
【０１３３】
結果
水酸化ナトリウム滴定についての結果を図３Ａ〜Ｃおよび図４Ａ〜Ｃに示す。塩酸滴定についての結果を図５Ａ〜Ｃおよび図６に示す。
【０１３４】
ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の水酸化ナトリウムを要求するので、ナノ構造を含む水は緩衝能力を有する。この特徴は７．６〜１０．５のｐＨ範囲においてより著しい。加えて、ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の塩酸を必要とする。この作用は、アルカリ範囲よりも、酸性ｐＨ範囲での方が大きい。例えば、１０μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５６から１０．３に増大する。ナノ構造を含む水のｐＨは７．６２から９．３３に増大した。１０μｌの塩酸（０．５Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５２から４．３１に低下した。ナノ構造を含む水のｐＨは７．７１から６．６５に低下した。この特徴は７．７〜３のｐＨ範囲においてより著しい。
【０１３５】
実施例４
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
【０１３６】
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。１ｍｌを、４５ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加えた。ｐＨを測定し、必要ならば、滴定した。３ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムまたは塩酸の増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
【０１３７】
塩酸滴定：
ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．８５
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０９０５−１０６）：４５ｍｌ ｐＨ６．３
１ｍｌのフェノールレッドおよび４μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．１９
【０１３８】
水酸化ナトリウム滴定：
Ｉ．ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッド、６μｌの塩酸（０．２５Ｍ）および４μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０６０４−１０９）：４５ｍｌ ｐＨ８．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび４５μｌの塩酸（０．２５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
ＩＩ．ＲＯ：４５ｍｌ ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．４６
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１２０１０４−１０７）：４５ｍｌ ｐＨ８．６８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの塩酸（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．９１
【０１３９】
結果
図７Ａ〜Ｃおよび図８Ａ〜Ｂに例示されるように、ナノ構造を含む水の緩衝能力はＲＯ水の緩衝能力よりも大きかった。
【０１４０】
実施例５
ＲＦ水の緩衝能力
緩衝能力に対するＲＦ水の影響を調べた。
【０１４１】
材料および方法
水酸化ナトリウム（１Ｍ）の数μｌの液滴を加えて、１５０ｍｌのＲＯ水のｐＨ（ｐＨ＝５．８）を上げた。この水の５０ｍｌを３つのボトルに等分した。３つの処理を行った：
ボトル１：非処理（ＲＯ水）
ボトル２：３０Ｗにより３０分間照射されたＲＯ水。このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された（ＲＦ水）。
ボトル３：ｐＨが５に達したとき、２回目の照射に供されたＲＦ水。照射後、このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された。
【０１４２】
１μｌの０．５Ｍ塩酸を５０ｍｌの水に加えることによって滴定を行った。ｐＨ値が４．２未満に達したときに滴定を終えた。
【０１４３】
実験を三連で行った。
【０１４４】
結果
図９Ａ〜Ｃおよび図１０から理解され得るように、ＲＦ水およびＲＦ２水は、ナノ構造を含む担体組成物の緩衝特性と類似する緩衝特性を含む。
【０１４５】
実施例６
ナノ構造を含む液体組成物の溶媒能力
下記の実験を、ナノ構造を含む液体組成物が、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことがともに知られている２つの材料を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
【０１４６】
Ａ．エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
５回の試みを、粉末を様々な組成で溶解することを目指して行った。
組成は下記の通りであった：
Ａ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
Ｂ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（９０分間脱水されたもの）。
Ｃ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋４９５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋４９５μｌのＥｔＯＨ（５０％−５０％）。
Ｄ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋９０μｌのＥｔＯＨ（９０％−１０％）。
Ｅ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋８２０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋１７０μｌのＥｔＯＨ（８０％−２０％）。
【０１４７】
これらのチューブをボルテックスし、６０℃に１時間加熱した。
【０１４８】
結果
１．白色粉末は５個すべての試験チューブにおいて溶解しなかった。
２．赤色粉末は溶解したが、しばらくして沈降した。
色がわずかに黄色に変化したので、試験チューブＣは粉末をより良好に溶解したかのようであった。
【０１４９】
Ｂ．粉砕後の、エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
粉砕後、赤色粉末を４つの組成で溶解した：
Ａ．１／２ｍｇの赤色粉末＋４９．５μｌのＲＯ。
Ｂ．１／２ｍｇの赤色粉末＋４９．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
Ｃ．１／２ｍｇの赤色粉末＋９．９μｌのＥｔＯＨ→３９．６５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２０％−８０％）。
Ｄ．１／２ｍｇの赤色粉末＋２４．７５μｌのＥｔＯＨ→２４．７５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）。
総反応体積：５０μｌ。
【０１５０】
これらのチューブをボルテックスし、６０℃に１時間加熱した。
【０１５１】
結果
粉砕後、赤色粉末を溶解するために、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）との組合せにおいて、わずかに２０％のエタノールだけが必要であった。
【０１５２】
Ｃ．徹底的な粉砕の後における、エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
２つの粉砕プロトコルを行った。第１は粉末単独に対してであり（バイアル１）、第２は、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（１％）に分散された粉末に対してあった（バイアル２）。
【０１５３】
これら２つの組成物を２つのバイアルに入れ、攪拌機上に置いて、材料を一晩粉砕した。
【０１５４】
１５時間後、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を数分毎に１０μｌの滴定によって１ｍｇの赤色粉末（バイアル１）に加えた。
【０１５５】
変化を、試験チューブの写真を０時間〜２４時間の間で撮影することによってモニタリングした（図１４Ｆ〜Ｊ）。
【０１５６】
比較として、２つのチューブを観察した。２つのうちの一方が、９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（９０分間脱水されたもの）に分散された赤色粉末（１％溶液）を含み、他方が、５０％エタノール／５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液に分散された赤色粉末（１％溶液）を含んだ。チューブを６０℃で１時間加熱した。これらのチューブが図１４Ａ〜Ｅに例示される。２４時間の期間の後、それぞれの溶液からの２μｌを採取し、その吸光度をｎａｎｏｄｒｏｐで測定した（図１５Ａ〜Ｃ）。
【０１５７】
結果
図１１Ａ〜Ｊは、徹底的な粉砕の後では、赤色材料が２４時間にわたって安定であり続け、沈下しないように、赤色材料を溶解することが可能であることを例示する。しかしながら、図１１Ａ〜Ｅは、時間が経過するとき、該材料は色が変化すること（安定でないこと）を示す。
【０１５８】
バイアル１はほとんど吸収しなかった（図１２Ａ）；溶液Ｂの吸光度ピークは、左側（２２０ｎｍ）への変化を伴って２２０ｎｍ〜２７０ｎｍの間にあり（図１２Ｂ）、溶液Ｃの吸光度ピークは２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの間にあった（図１２Ｃ）。
【０１５９】
結論
赤色材料を粉砕することにより、該材料をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散させることがもたらされた。この分散物は２４時間にわたって持続した。該材料をガラス製バイアルにおいて維持することにより、溶液は、１００％の脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＥｔＯＨ−Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方において、その後７２時間安定に保たれた。
【０１６０】
実施例７
ダイゼイン、ダウノルビシンおよびｔ−ｂｏｃ誘導体を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が３つの材料（ダイゼイン−ダウノマイシンコンジュゲート（ＣＤ−Ｄａｕ）；ダウノルビシン（セルビジン塩酸塩）；ダイゼインのｔ−ｂｏｃ誘導体（ｔｂｏｃ−Ｄａｉｄ）、これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０１６１】
材料および方法
Ａ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート１：
要求濃度：３ｍｇ／ｍｌ（Ｎｅｏｗａｔｅｒ）
属性：この材料を、ＤＭＳＯ、アセトン、アセトニトリルに溶解した。
属性：この材料をＥｔＯＨに溶解した。
【０１６２】
５個の異なるガラス製バイアルを調製した：
１．５ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１．２ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
２．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン。
３．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１５０μｌのアセトン＋４５０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２５％アセトン）。
４．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌの１０％＊ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）。
５．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン＋６００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
【０１６３】
これらのサンプルをボルテックスし、分光光度計での測定を、バイアル＃１、バイアル＃４およびバイアル＃５に対して行った。
【０１６４】
バイアルを、アセトンを蒸発させるために開けたままにした（バイアル＃２、バイアル＃３およびバイアル＃５）。
【０１６５】
結果
バイアル＃１（１００％のＮｅｏｗａｔｅｒ）：ＣＤ−Ｄａｕが数時間後に沈降した。
バイアル＃２（１００％のアセトン）：ＣＤ−Ｄａｕがアセトン内に懸濁されたが、４８時間後には、アセトンが材料を溶解したので、材料が部分的に沈降した。
バイアル＃３（２５％のアセトン）：ＣＤ−Ｄａｕがあまり良好に溶解せず、材料が溶液内部に漂った（溶液は濁っているようであった）。
バイアル＃４（１０％ＰＥＧ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ）：ＣＤ−Ｄａｕが、バイアル＃１におけるＣＤ−Ｄａｕよりも良好に溶解したが、ＣＤ−Ｄａｕは、１００％アセトンとの混合物の場合ほど良好に溶解しなかった。
バイアル＃５：ＣＤ−Ｄａｕが最初、アセトン内に懸濁され、ＣＤ−Ｄａｕが完全に溶解した後で、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を、アセトンを交換するために加えた。最初、アセトンは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在にもかかわらず、この材料を溶解した。しかしながら、アセトンが蒸発するにつれ、材料は一部がバイアルの底に沈降した。しかしながら、材料は懸濁されたままであった。
【０１６６】
分光光度計での測定（図１３）は、アセトンの存在下および非存在下の両方における材料の挙動を例示する。アセトンがある場合、水または１０％ＰＥＧにより懸濁される材料（両方の場合に、これらは１つだけのピークを示すだけである）との比較において、２つのピークが存在する。
【０１６７】
Ｂ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート２：
アセトンが、溶液＃２、溶液＃４および溶液＃５から蒸発するとすぐに、材料はわずかに沈降した。さらなる量のアセトンをこれらのバイアルに加えた。このプロトコルは、材料をアセトンおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下で溶解することを可能にし、一方で、同時に、その後の、溶液からのアセトンの蒸発を可能にする（この処置を２回行った）。２回目のサイクルの後で、液相をバイアルから取り出し、さらなる量のアセトンを沈降した材料に加えた。沈降した材料が溶解すると、それを以前に取り出された液相と一緒にした。一緒にした溶液を再び蒸発させた。材料が全く溶解しなかったので、バイアル＃１からの溶液を取り出し、代わりに、１．２ｍｌのアセトンを沈降物に加えて、材料を溶解した。その後、１．２ｍｌの１０％ＰＥＧ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）もまた加え、しばらくした後で、アセトンを溶液から蒸発させた。これらの処置を終了したとき、これらのバイアルを一緒にして１つのバイアルにした（３ｍｌの総体積）。この最終的な体積の上に、３ｍｌのアセトンを、材料を溶解し且つ透明な液化溶液を収容するために加え、その後、この溶液を５０℃で再び蒸発させた。溶液は平衡に達しなかった。これは、そのような状態に一旦達すると、溶液は分離してしまうであろうという事実のためである。平衡を避けることによって、材料の水和状態が維持され、液体として保たれた。溶媒を蒸発させた後、材料を清浄なバイアルに移し、真空条件下で閉じた。
【０１６８】
Ｃ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート３：
別の３ｍｌの材料（６ｍｌの総体積）を、２ｍｌのアセトン溶解材料と、以前の実験から残った１ｍｌの残留材料とを加えることにより作製した。
【０１６９】
１．９ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を、アセトンを含有するバイアルに加えた。
【０１７０】
１００μｌのアセトン＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を残留材料に加えた。
【０１７１】
蒸発を、５０℃に調節されたホットプレート上で行った。
【０１７２】
この処置を、溶液が安定になるまで３回繰り返した（アセトンの添加およびその蒸発）。
【０１７３】
これら２つのバイアルをまとめて一緒にした。
【０１７４】
これら２つの溶液を一緒にした後、材料がわずかに沈降した。アセトンを加え、溶媒の蒸発を繰り返した。
【０１７５】
バイアル（３ｍｌ＋２ｍｌ）を混合する前に、本明細書中上記のパート２に記載されるような実験で調製された第１の溶液を９℃で一晩インキュベーションして、その結果、溶液が平衡に達し、平衡を維持することを確実にした。そうすることによって、既に溶解している材料は沈降しないはずである。翌朝、溶液の吸収を明らかにし、差グラフを得た（図１４）。これら２つのバイアルを一緒にした後、材料がわずかに沈降するので、吸収測定を再び行った。一部の沈降の結果として、溶液をアセトン（５ｍｌ）の添加によって１：１で希釈し、続いて、溶液の蒸発をホットプレートにて５０℃で行った。蒸発処置を行いながらでの溶液の分光光度計での読み取りはアセトンの存在のために変化した（図１５）。これらの実験から、微量のアセトンが存在するとき、アセトンは、もたらされる吸収読み取りに影響を及ぼし得ることが暗示される。
【０１７６】
Ｂ．ダウノルビシン（セルビジン塩酸塩）の可溶化
要求濃度：２ｍｇ／ｍｌ
【０１７７】
材料および方法
２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を１つのバイアルにおいて調製し、２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＲＯを第２のバイアルにおいて調製した。
【０１７８】
結果
この材料は、分光光度計での測定（図１６）によって例示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水の両方において容易に溶解した。
【０１７９】
結論
ダウノルビシンは難なくＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水に溶解する。
【０１８０】
Ｃ．ｔ−ｂｏｃの可溶化
要求濃度：４ｍｇ／ｍｌ
【０１８１】
材料および方法
１．１４ｍｌのＥｔＯＨを、１８．５ｍｇのｔ−ｂｏｃ（油状材料）を含有する１つのガラス製バイアルに加えた。その後、これを２つのバイアルに分け、１．７４ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＲＯ水を、溶液が２５％のＥｔＯＨを含むようにバイアルに加えた。分光光度計での測定の後、溶媒を溶液から蒸発させ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を両方のバイアルに加えてそれぞれのバイアルにおいて２．３１ｍｌの最終体積にした。これら２つのバイアルにおける溶液を１つの清浄なバイアルに一緒にし、真空条件下での輸送のためにパッケージングした。
【０１８２】
結果
分光光度計での測定が図１７に例示される。この材料はエタノールに溶解した。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加え、その後、溶媒を熱（５０℃）により蒸発させた後、この材料はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解することができた。
【０１８３】
結論
材料を溶解するための最適な方法は、最初、材料を溶媒（アセトン、酢酸またはエタノール）とともに溶解し、その後、親水性流体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））を加え、続いて、その溶媒を、溶液を加熱し、溶媒を蒸発させることによって除くことである。
【０１８４】
実施例８
ＡＧ−１４ａおよびＡＧ−１４ｂを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が２つの薬草材料（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ、これらはともに、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０１８５】
パート１
材料および方法
２．５ｍｇのそれぞれの材料（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ）を、４つのチューブのそれぞれにおける粉末の最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌであるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）単独、または、７５％のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および２５％のエタノールを含む溶液のいずれかで希釈した。これらのチューブをボルテックスし、５０℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
【０１８６】
結果
エタノールの存在下および非存在下でのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における２つの薬草材料の分光光学的測定を図１８Ａ〜Ｄに示す。
【０１８７】
結論
ＲＯにおける懸濁はＡＧ−１４Ｂを溶解しなかった。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＡＧ−１４Ｂの懸濁は凝集せず、これに対して、ＲＯでは、ＡＧ−１４Ｂが凝集した。
【０１８８】
ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４ＢはＮｅｏｗａｔｅｒ／ＲＯに溶解しなかった。
【０１８９】
パート２
材料および方法
５ｍｇのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂを６２．５μｌのＥｔＯＨ＋１８７．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈した。さらに６２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた。これらのチューブをボルテックスし、５０℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
【０１９０】
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加える前でのＥｔＯＨにおける溶解、その後、ＥｔＯＨの蒸発により、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂが溶解した。
【０１９１】
図１９に示されるように、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂは、４８時間を超えて懸濁状態で安定なままであった。
【０１９２】
実施例９
ペプチドを溶解する、ナノ構造を含む担体の能力
ナノ構造を含む担体組成物が７つの細胞傷害性ペプチド（これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。加えて、Ｓｋｏｖ−３細胞に対するこれらのペプチドの影響を、ナノ構造を含む担体組成物がペプチドの細胞傷害活性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために測定した。
【０１９３】
材料および方法
可溶化：７個すべてのペプチド（ペプチドＸ、Ｘ−５ＦＵ、ＮＬＳ−Ｅ、Ｐａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）、ＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２、ＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨおよびＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ ｋＧＦＰＳＫ）を０．５ｍＭでＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した。分光光学的測定を行った。
【０１９４】
インビトロ実験：Ｓｋｏｖ−３細胞を９６ウエルプレートにおいてマッコイ５Ａ培地で増殖させ、１５００細胞／ウエルの濃度に希釈した。２４時間後、２μｌ（０．５ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．００５ｍＭ）のペプチド溶液を、１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍの最終濃度のために１ｍｌのマッコイ５Ａ培地でそれぞれ希釈した。９個の反復物をそれぞれの処理のために作製した。それぞれのプレートは、３つの濃度での２つのペプチド、および、コントロール処理の６つのウエルを含有した。９０μｌのマッコイ５Ａ培地＋ペプチドを細胞に加えた。１時間後、１０μｌのＦＢＳを（競合を防止するために）加えた。細胞を、クリスタルバイオレットに基づく生存性アッセイで２４時間後および４８時間後に定量した。このアッセイにおける色素はＤＮＡを染色する。可溶化したとき、単層により取り込まれた色素の量をプレート読取り機で定量した。
【０１９５】
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈された７個のペプチドの分光光学的測定を図２０Ａ〜Ｇに示す。図２１Ａ〜Ｇに示されるように、溶解されたペプチドのすべてが細胞傷害活性を含んでいた。
【０１９６】
実施例１０
レチノールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物がレチノールを溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０１９７】
材料および方法
レチノール（ビタミンＡ）をＳｉｇｍａ（Ｆｌｕｋａ、９９％ＨＰＬＣ）から購入した。レチノールを下記の条件下でＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において可溶化した。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における１％レチノール（１ｍｌに０．０１ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．５％レチノール（１ｍｌに０．００５ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．５％レチノール（２５ｍｌに０．１２５ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％レチノール（２５ｍｌに０．０６２５ｇｒ）。最終的なＥｔＯＨ濃度：１．５％
【０１９８】
ＥｔＯＨにおけるレチノールの吸光度スペクトル：レチノール溶液を、校正用グラフを作製するために、種々のレチノール濃度とともに無水ＥｔＯＨにおいて作製した。吸光度スペクトルを分光光度計で検出した。
【０１９９】
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％および０．５％のレチノールを有し、ＥｔＯＨの濃度が不明である２つの溶液を分光光度計で検出した。数滴の油滴が水に溶解されないので、レチノールの実際の濃度もまた不明である。
【０２００】
ろ過：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％のレチノールを有し、ＥｔＯＨの最終濃度が１．５％である２つの溶液を調製した。これらの溶液を０．４４μｌおよび０．２μｌのフィルターでろ過した。
【０２０１】
結果
レチノールは、アルカリ性のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において、酸性のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも容易に可溶化した。溶液の色は黄色であり、この色は時間とともに退色した。吸光度実験において、０．５％のレチノールは、０．１２５％のレチノールと類似するパターンを示し、０．２５％のレチノールは、０．０３１２５％のレチノールと類似するパターンを示した（図２２を参照のこと）。レチノールは熱において不安定であるので、（その融点は６３℃であり）、レチノールはオートクレーブ処理することができない。ろ過は、レチノールが（ＥｔＯＨに）完全に溶解されたときに可能であった。図２３に示されるように、ろ過後の溶液におけるレチノールは０．０３１２５％未満である。両方のろ液は、類似した結果を与えた。
【０２０２】
実施例１１
材料Ｘを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料Ｘを４０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２０３】
パート１−水およびＤＭＳＯにおける溶解性
材料および方法
第１の試験チューブにおいて、２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を１ｍｇの材料「Ｘ」に加えた。第２の試験チューブにおいて、２５μｌのＤＭＳＯを１ｍｇの材料「Ｘ」に加えた。両方の試験チューブをボルテックスし、６０℃に加熱し、振とう機で１時間振とうした。
【０２０４】
結果
この材料はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に全く溶解しなかった（試験チューブ１）。この材料はＤＭＳＯに溶解し、黄褐色の色を与えた。これらの溶液を２４時間〜４８時間放置し、それらの安定性を経時的に分析した（図２４Ａ〜Ｂ）。
【０２０５】
結論
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は材料「Ｘ」を溶解せず、材料が沈降し、これに対して、ＤＭＳＯは材料「Ｘ」をほぼ完全に溶解した。
【０２０６】
パート２−ＤＭＳＯの削減および異なる溶媒における材料の安定性／速度論の経時的な試験
材料および方法
それぞれが２５μｌの総反応体積を含有する６個の異なる試験チューブを分析した：
１．１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（１００％）。
２．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ→１２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％）。
３．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％）。
４．１ｍｇの「Ｘ」＋６．２５μｌのＤＭＳＯ＋１８．７５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２５％）。
５．１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋スクロース＊（１０％）。
６．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌの脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）＊＊（５０％）。
＊０．１ｇのスクロース＋１ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＝１０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋スクロース
＊＊脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を６０℃で９０分間脱水することによって得た。
【０２０７】
すべての試験チューブをボルテックスし、６０℃に加熱し、１時間振とうした。
【０２０８】
結果
６つの溶媒および材料Ｘを含む、時間０での試験チューブを図２５Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後６０分での試験チューブを図２６Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後１２０分での試験チューブを図２７Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後２４時間での試験チューブを図２８Ａ〜Ｃに示す。
【０２０９】
結論
すべての試験チューブにおいて、材料が２４時間後に沈降したので、材料「Ｘ」は期間中を通して安定なままではなかった。
【０２１０】
試験チューブ２の溶媒と、試験チューブ６の溶媒との間には、同じ割合の溶媒を含有するにもかかわらず、違いが認められる。これは、試験チューブ６が、非脱水のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）より疎水性である脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含有するためである。
【０２１１】
パート３ ＤＭＳＯのさらなる削減および異なる溶媒における材料の安定性／速度論の経時的な試験
材料および方法
１ｍｇの材料「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯをガラス製チューブに入れた。５０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）をチューブに少しずつ加え（数秒毎に、５μｌ）、その後、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の溶液（９％ＤＭＳＯ＋９１％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））５００μｌを加えた。
【０２１２】
第２のガラス製チューブにおいて、１ｍｇの材料「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯを加えた。５０μｌのＲＯをチューブに少しずつ加え（数秒毎に、５μｌ）、その後、ＲＯの溶液（９％ＤＭＳＯ＋９１％ＲＯ）５００μｌを加えた。
【０２１３】
結果
図２９Ａ〜Ｄに例示されるように、材料「Ｘ」は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液に分散されたままであったが、ＲＯ水を含む溶液では、チューブの底に沈降した。図３０は、ボルテックス後６時間での、ＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびアセトンに分散された材料の吸収特徴を示す。
【０２１４】
結論
材料「Ｘ」が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と比較したとき、ＲＯに異なって溶解すること、および、材料「Ｘ」は、ＲＯと比較したとき、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）においてより安定であることが明らかである。分光光度計での測定（図３０）からは、グラフ下面積がＲＯの場合よりも大きいので、材料「Ｘ」が、５時間後でさえ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）にはより良好に溶解していたことが明らかである。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は材料「Ｘ」を水和することが明らかである。ＤＭＳＯの量を２０％〜８０％減らすことができ、また、材料「Ｘ」を水和し、材料「Ｘ」をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散する、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく溶液を得ることができる。
【０２１５】
実施例１２
ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を３０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２１６】
材料および方法
ＳＰＬ２１０１をその最適な溶媒（エタノール）に溶解し（図３１Ａ）、ＳＰＬ５２１７をその最適な溶媒（アセトン）に溶解した（図３１Ｂ）。これら２つの化合物をガラス製バイアルに入れ、冷暗所環境で保った。微量の溶媒が全く認められなくなるまで、溶媒の蒸発をデシケータにおいて長時間行い、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を溶液に加えた。
【０２１７】
結果
ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７は、図３２Ａ〜Ｂにおける分光光度計データによって示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した。
【０２１８】
実施例１３
タキソールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料タキソール（パクリタキセル）を０．５ｍＭの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２１９】
材料および方法
可溶化：０．５ｍＭのタキソール溶液を、ＤＭＳＯ、または、１７％のＥｔＯＨを伴うＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のいずれかで調製した（４ｍｌにおいて０．００１７ｇｒ）。吸光度を分光光度計により検出した。
細胞生存性アッセイ：１５００００個の２９３Ｔ細胞を３ｍｌのＤＭＥＭ培地とともに６ウエルプレートに播種した。それぞれの処理物を、ＲＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づくＤＭＥＭ培地で増殖させた。タキソール（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＤＭＳＯに溶解されたもの）を１．６６６μＭの最終濃度に加えた（３ｍｌの培地中１０μｌの０．５ｍＭタキソール）。細胞をタキソールによる２４時間処理の後で集め、死細胞を検出するためのトリパンブルー溶液を使用して計数した。
【０２２０】
結果
タキソールは、図３３Ａ〜Ｂに示されるように、ＤＭＳＯおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方に溶解した。タキソールの様々な溶液の後での２９３Ｔ細胞の生存性を図３４に示す。
【０２２１】
結論
タキソールは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶液の後で細胞傷害作用を含んでいた。
【０２２２】
実施例１４
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用
ナノ構造を含む液体組成物がタンパク質の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２２３】
材料および方法
２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）を、ｄｄＨ２Ｏ（ＲＯ）におけるそれらの活性、および、ナノ構造を含む担体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）におけるそれらの活性を求めるために、ＰＣＲ反応において調べた。酵素を１時間〜２．５時間までの種々の期間にわたって９５℃に加熱した。２つのタイプの反応液を作製した：
水のみ−酵素および水のみを煮沸した。
中味すべて−反応成分のすべてを煮沸した（酵素、水、緩衝液、ｄＮＴＰ類、ゲノムＤＮＡおよびプライマー）。
【０２２４】
煮沸後、必要とされる任意のさらなる反応成分をＰＣＲチューブに加え、通常のＰＣＲプログラムを３０サイクルに設定した。
【０２２５】
結果
図３５Ａ〜Ｂに示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件、および、酵素のみが熱ストレスに供された条件の両方の下で、酵素を加熱から保護した。対照的に、ＲＯ水は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件下で、酵素を加熱から保護しただけであった。
【０２２６】
実施例１５
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用のさらなる例示
ナノ構造を含む液体組成物が２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２２７】
材料および方法
ＰＣＲ反応を下記のように設定した：
Ｐｅｑ−ｌａｂサンプル：ナノ構造を含む液体組成物（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか２０．４μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｑ−ｌａｂ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０２２８】
３つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分および９０分であった。
【０２２９】
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌの１０Ｘ反応緩衝液Ｙ（Ｐｅｑ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー ＧＡＰＤＨミックス １０ｐｍｏｌ／μｌ
０．５μｌのゲノムＤＮＡ ３５μｇ／μｌ
【０２３０】
Ｂｉｏｌａｂサンプル
ナノ構造を含む液体組成物（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか１８．９μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｌａｂ、Ｔａｑポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０２３１】
５つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分、９０分、１２０分および１５０分であった。
【０２３２】
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌのＴＡＱ １０Ｘ緩衝液（Ｍｇ非含有）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー ＧＡＰＤＨミックス（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．５μｌのゲノムＤＮＡ（３５μｇ／μｌ）
【０２３３】
それぞれの処理（ＮｅｏｗａｔｅｒまたはＲＯ）のために、陽性コントロールおよび陰性コントロールを作製した。陽性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わないものであった。陰性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わず、かつ、ＤＮＡを反応において伴わないものであった。ＰＣＲミックスを、煮沸ｔａｑアッセイ、ならびに、コントロール反応のために作製した。
【０２３４】
サンプルをＰＣＲ装置に入れ、下記のように操作した：
ＰＣＲプログラム：
１．９４℃で２分間の変性
２．９４℃で３０秒間の変性
３．６０℃で３０秒間のアニーリング
４．７２℃で３０秒間の伸長
工程２〜４を３０回繰り返す
５．７２℃で１０分間の伸長
【０２３５】
結果
図３６に示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、１．５時間までの期間、両方の酵素を熱ストレスから保護した。
【０２３６】
実施例１６
ナノ構造を含む液体組成物はタキソールを溶解することができることのさらなる証拠
下記の実験を、ナノ構造を含むキャリア組成物が０．０８％のエタノールの存在下において０．５ｍＭの最終濃度で物質タキソール（パクリタキセル）を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
【０２３７】
材料および方法
可溶化：０．５ｍＭのタキソール溶液を調製した（４ｍｌにおいて０．００１７ｇｒ）。タキソールをエタノールに溶解し、２０日間に及んだＲＴ緩速溶媒交換手法を使用してＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に交換した。この手法が終了したとき、４０％未満のエタノールが溶液中に残存し、最終的な投与濃度において０．０８％のエタノールをもたらした。溶液を、０．２μｍのフィルターを使用して滅菌した。別途、タキソールをＤＭＳＯにおいて調製した（０．５ｍＭ）。両方の溶液を−２０℃で保った。吸光度を分光光度計により検出した。
【０２３８】
細胞生存性アッセイ：２０００個のＰＣ３細胞を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩに基づく培地の１００μｌとともに９６ウエルプレートの各ウエルに播種した。播種後２４時間で、０．５ｍＭタキソールの２μｌ、１μｌおよび０．５μｌを１ｍｌのＲＰＭＩ培地で希釈し、これにより、１μＭ、０．５μＭおよび０．２５μＭの最終濃度をそれぞれ得た。少なくとも８個の反復する反応を処理あたり行った。細胞増殖を、タキソール添加後２４時間で、クリスタルバイオレット比色アッセイを使用して細胞密度を定量することによって評価した。
【０２３９】
処理後２４時間で、細胞をＰＢＳにより洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより固定処理した。クリスタルバイオレットを加え、室温で１０分間インキュベーションした。細胞を３回洗浄した後、５０％エタノールにおいて１００Ｍクエン酸ナトリウムを含む溶液を使用して、色を細胞から溶出した。光学濃度の変化を、分光光度法によるプレートリーダーを使用して５７０ｎｍで読み取った。細胞生存性を、ブランクを引いた後、コントロールでの光学濃度（これは１００％であると見なされる）の百分率として表した。
【０２４０】
結果
ＤＭＳＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解された０．５ｍＭタキソールの分光光度法による吸光度が図３７Ａに例示される。図３７Ｂ〜図３７Ｃは両方の配合物についてのＨＰＬＣによる読み取りである。測定結果は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散されたタキソールの配合における構造的な変化が６ヶ月の貯蔵期間の後で何らないことを示した。細胞生存性のタキソール誘導による喪失の結果が、ＤＭＳＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した後において図３８に例示される。
【０２４１】
結論
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソール（０．０８％のエタノールを最終的な作業濃度において有する）は、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールと類似する、ヒト前立腺ガン細胞株に対するインビトロ細胞生存性／細胞毒性を示した。
【０２４２】
実施例１７
セファロスポリンの可溶化
下記実験の目的は、不溶性のセファロスポリンを、緩速溶媒交換手法を使用して３．６ｍｇ／ｍｌの濃度でＮｅｏｗａｔｅｒ（ＮＷ）に溶解すること、および、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性を保有するｐＵＣ１９プラスミドにより形質転換された大腸菌ＤＨ５α菌株に対するその生物活性を評価することであった。
【０２４３】
材料および方法
緩速溶媒交換：２５ｍｇのセファロスポリンを５ｍｌの有機溶媒（アセトン）に溶解した（５ｍｇ／ｍｌ）。ＮＷを添加する前に、この物質をＨｅλｉｏｓα分光光度計により分析した（図３９）。この物質はかろうじてアセトンに溶解した。この物質は最初、砂様の外見を伴って沈降した。有機溶媒をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）で交換する手順を、（３０℃で設定された）マルチブロックヒーターにおいて、また、デシケータおよびフードの中で行った。有機溶媒の濃度を、表２に示される式に従って計算した。
屈折計：ＲＩ：１．３３３９、式による計算に従って：１．８３３％。
分析天秤：平均：０．９９６２、式に従って：１．９４１％。
【０２４４】
溶液を、０．４５μｍのフィルターを使用して首尾良くろ過した。溶液の分光光度計による読み取りをろ過手法の前後で行った。
【０２４５】
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの生物活性の分析
ｐＵＣ１９プラスミド（アンピシリン耐性）を保有するＤＨ５α大腸菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充された液体ＬＢ培地において３７℃および２２０ｒｐｍ（回転／分）で一晩増殖させた。
【０２４６】
一晩（ＯＮ）のスターター培養物の１００μＬを下記のように新鮮な液体ＬＢに再接種した：
ａ．１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２回目の実験のみ）および抗生物質非添加（両方の実験）を有する３つのチューブ。
ｂ．セファロスポリンストック溶液（５０ｕｇ／ｍｌ）の１０μｌを有する３つのチューブ。
ｃ．セファロスポリンストック溶液（５ｕｇ／ｍｌ）の１００μｌを有する３つのチューブ。
【０２４７】
細菌を３７℃および２２０ｒｐｍでインキュベーションした。連続したＯＤ読み取りを、ＴＥＣＡＮ ＳＰＥＣＴＲＡＦｌｏｕｒ Ｐｌｕｓを使用して、５９０ｎｍのフィルターとともに９６ウエルの透明プレートを使用して１時間毎に行った。
【０２４８】
結果
図４０は、ろ過前およびろ過後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【０２４９】
図４１Ａ〜図４１Ｂおよび図４２Ａ〜図４２Ｂに例示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたとき、セファロスポリンは、大きく希釈されたときでさえ、細菌増殖阻害剤としての生物学的利用能および生物活性を有する。注目すべきことに、本実施例は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）自体は細菌の増殖阻害において何ら役割を有しないことを教示する。
【０２５０】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許および特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）検出可能な作用因と、
（ｉｉ）液体およびナノ構造を有する液体組成物と
を含む、分析物を検出するためのキットであって、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にあるキット。
【請求項２】
分析物は生体分子である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記生体分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記検出可能な作用因は非直接的に検出可能である、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記非直接的に検出可能な作用因は、検出可能な生成物を生じさせることができる酵素反応のための基質である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記検出可能な作用因は直接的に検出可能である、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記検出可能な作用因は親和性認識成分を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記親和性認識成分は、アビジン誘導体、ポリヌクレオチドおよび抗体からなる群から選択される、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記直接的に検出可能な作用因は、リン光性作用因、化学発光性作用因および蛍光性作用因からなる群から選択される、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
前記酵素反応のエンハンサーをさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１１】
前記エンハンサーは、ｐ−ヨードフェノール、３，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１，２，４−トリアゾール、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、フェノール、２−ナフトール、１０−メチルフェノチアジン、セチルトリメチルアンモニウム臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
酸化作用因をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１３】
前記酸化作用因は、過酸化水素、尿素過酸化水素、炭酸ナトリウム過酸化水素、過ホウ酸塩、フェリシアン化カリウムおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）からなる群から選択される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記酵素反応のための酵素をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１５】
前記酵素は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群から選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記酵素は抗体またはアビジン誘導体にコンジュゲート化される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記酵素反応の阻害剤をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１８】
前記検出可能な生成物は、蛍光性生成物、化学発光性生成物、リン光性生成物および発色性生成物からなる群から選択される、請求項５に記載のキット。
【請求項１９】
前記蛍光性生成物を生じさせることができる基質は蛍光団を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記蛍光団は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびＤＤＡＯからなる群から選択される分子に由来する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記蛍光性生成物を生じさせることができる基質は、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＤＤＡＯガラクトシド、β−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−カルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＥＬＦ９７ホスファート、５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＦＤＧ）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロニド、ＰＦＢアミノフルオレセインジグルクロニド、ＥＬＦ９７−β−Ｄ−グルクロニド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬクロラムフェニコール基質（商標）および１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンからなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記発色性生成物を生じさせることができる基質は、ＢＣＩＰ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧｌｃＵ）および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
前記化学発光性生成物を生じさせることができる基質は、ルシフェリン、ルミノール、イソルミノール、アクリダン、フェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、２，４，６−トリクロロフェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、ピロガロール、フロログルシノールおよびレゾルシノールからなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２４】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項１に記載のキット。
【請求項２５】
前記流体分子の少なくとも一部がガス状状態である、請求項１に記載のキット。
【請求項２６】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項１に記載のキット。
【請求項２７】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項１に記載のキット。
【請求項２８】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項１に記載のキット。
【請求項２９】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３０】
前記ナノ構造はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項１に記載のキット。
【請求項３１】
包装材と、前記包装材の中に含有される、検出可能な成分の検出を高めるために特定される液体組成物とを含む製造物であって、前記液体組成物は液体およびナノ構造を有し、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある製造物。
【請求項３２】
前記検出可能な成分は、蛍光性成分、化学発光性成分、およびリン光性成分からなる群から選択される、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３３】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３４】
前記流体分子の少なくとも一部がガス状状態である、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３５】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３６】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３７】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３８】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３９】
前記ナノ構造はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項３１に記載の製造物。
【請求項４０】
セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法であって、前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子の前記エンベロープとが定常的な物理的状態にある方法。
【請求項１】
（ｉ）検出可能な作用因と、
（ｉｉ）液体およびナノ構造を有する液体組成物と
を含む、分析物を検出するためのキットであって、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にあるキット。
【請求項２】
分析物は生体分子である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記生体分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記検出可能な作用因は非直接的に検出可能である、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記非直接的に検出可能な作用因は、検出可能な生成物を生じさせることができる酵素反応のための基質である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記検出可能な作用因は直接的に検出可能である、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記検出可能な作用因は親和性認識成分を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記親和性認識成分は、アビジン誘導体、ポリヌクレオチドおよび抗体からなる群から選択される、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記直接的に検出可能な作用因は、リン光性作用因、化学発光性作用因および蛍光性作用因からなる群から選択される、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
前記酵素反応のエンハンサーをさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１１】
前記エンハンサーは、ｐ−ヨードフェノール、３，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１，２，４−トリアゾール、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、フェノール、２−ナフトール、１０−メチルフェノチアジン、セチルトリメチルアンモニウム臭化物およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
酸化作用因をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１３】
前記酸化作用因は、過酸化水素、尿素過酸化水素、炭酸ナトリウム過酸化水素、過ホウ酸塩、フェリシアン化カリウムおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）からなる群から選択される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記酵素反応のための酵素をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１５】
前記酵素は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群から選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記酵素は抗体またはアビジン誘導体にコンジュゲート化される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記酵素反応の阻害剤をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１８】
前記検出可能な生成物は、蛍光性生成物、化学発光性生成物、リン光性生成物および発色性生成物からなる群から選択される、請求項５に記載のキット。
【請求項１９】
前記蛍光性生成物を生じさせることができる基質は蛍光団を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記蛍光団は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびＤＤＡＯからなる群から選択される分子に由来する、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記蛍光性生成物を生じさせることができる基質は、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＤＤＡＯガラクトシド、β−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−カルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＥＬＦ９７ホスファート、５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＦＤＧ）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロニド、ＰＦＢアミノフルオレセインジグルクロニド、ＥＬＦ９７−β−Ｄ−グルクロニド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬクロラムフェニコール基質（商標）および１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンからなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記発色性生成物を生じさせることができる基質は、ＢＣＩＰ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧｌｃＵ）および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
前記化学発光性生成物を生じさせることができる基質は、ルシフェリン、ルミノール、イソルミノール、アクリダン、フェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、２，４，６−トリクロロフェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、ピロガロール、フロログルシノールおよびレゾルシノールからなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２４】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項１に記載のキット。
【請求項２５】
前記流体分子の少なくとも一部がガス状状態である、請求項１に記載のキット。
【請求項２６】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項１に記載のキット。
【請求項２７】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項１に記載のキット。
【請求項２８】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項１に記載のキット。
【請求項２９】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３０】
前記ナノ構造はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項１に記載のキット。
【請求項３１】
包装材と、前記包装材の中に含有される、検出可能な成分の検出を高めるために特定される液体組成物とを含む製造物であって、前記液体組成物は液体およびナノ構造を有し、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある製造物。
【請求項３２】
前記検出可能な成分は、蛍光性成分、化学発光性成分、およびリン光性成分からなる群から選択される、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３３】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３４】
前記流体分子の少なくとも一部がガス状状態である、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３５】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３６】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３７】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３８】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項３１に記載の製造物。
【請求項３９】
前記ナノ構造はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項３１に記載の製造物。
【請求項４０】
セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法であって、前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子の前記エンベロープとが定常的な物理的状態にある方法。
【図３７Ｂ−３７Ｃ】
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１Ａ−１１Ｃ．１１Ｆ−１１Ｈ】
【図１１Ｄ−１１Ｅ．１１Ｉ−１１Ｊ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２０Ｄ】
【図２０Ｅ】
【図２０Ｆ】
【図２０Ｇ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２１Ｅ】
【図２１Ｆ】
【図２１Ｇ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７Ａ】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１Ａ−１１Ｃ．１１Ｆ−１１Ｈ】
【図１１Ｄ−１１Ｅ．１１Ｉ−１１Ｊ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２０Ｄ】
【図２０Ｅ】
【図２０Ｆ】
【図２０Ｇ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２１Ｅ】
【図２１Ｆ】
【図２１Ｇ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７Ａ】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【公表番号】特表２０１０−５２８２５６（Ｐ２０１０−５２８２５６Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４４４９１（Ｐ２００９−５４４４９１）
【出願日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００８／００００２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８１４５５
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０８２０３４９３）ドゥ−コープ テクノロジーズ リミテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００８／００００２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８１４５５
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０８２０３４９３）ドゥ−コープ テクノロジーズ リミテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
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