刺激応答性ヒドロゲル
本発明は、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルであって、ポリペプチド結合パートナーが、第二ポリペプチド、核酸または小分子であり、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用が、ヒドロゲルを安定化し、そして、調節化合物の添加により調節される、ヒドロゲルに関する。薬物はこのヒドロゲルに物理的に捕捉され、またはヒドロゲル構造を形成するポリマーに結合し、または、第一ポリペプチドもしくはポリペプチド結合パートナーに結合することができ、その後、調節化合物の添加時に放出され得る。薬物を含むこのようなヒドロゲルを患者に注射し、調節化合物を経口投与することにより、薬物の放出を調節することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー、ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含み、当該ポリペプチドとその結合パートナーの間の相互作用が第三の化合物により調節され得る、ヒドロゲルに関する。このヒドロゲルは、薬物デリバリーにおいて特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
温度、光、カルシウム、抗原、ＤＮＡおよび特異的酵素に応答する刺激感知性ヒドロゲルは、体内の薬物デリバリーのためのスマート材料として（Kopecek J., Eur J Pharm Sci 20, 1-16, 2003に論評されている）、または組織工学のために（Lutolf M. P. and Hubbell J. A., Nat Biotechnol 23, 47-55, 2005）、または、微小流体への応用における（ナノ）バルブとして（Beebe D. J. et al., Nature 404, 588-90, 000）有望である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような材料は一般にトリガーに応答するが、物理的刺激（例えば、光、温度）または分子ベースの刺激の場合には、生理的バックグラウンドでは殆ど達成不能な刺激濃度であるため（例えば、ｇ／ｌ領域の抗体濃度）、患者のバックグラウンドにおける適用が困難である。対照的に、医薬用物質の作用様式は生理的限界内で起こるように設計されており、故に、薬理学的作用様式に基づくヒドロゲルは、将来の治療応用に対して高いコンプライアンスを示すと予想される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ポリマー、第一のポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルに関し、ここでこのポリペプチド結合パートナーは、第二のポリペプチド、核酸または小分子であり、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用は、非共有結合性であり、調節化合物の添加または除去により調節される。
【０００５】
特に本発明は、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーがポリマーに結合し、そして第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用がヒドロゲルを安定化させるようなヒドロゲルに関するものである。
【０００６】
特に本発明は、第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーがポリマーに共有結合している、または、強い特異的な非共有結合によりポリマーに結合しているヒドロゲルに関する。
【０００７】
第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合でき、そして対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが各々目的化合物、例えば薬物に結合することができる。あるいは、目的化合物がヒドロゲルに物理的に捕捉され、またはポリマーに結合してヒドロゲルを形成することもある。
【０００８】
第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用は、調節化合物の添加または除去により切断される。
【０００９】
さらに本発明は、ヒドロゲル［ここで、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合し、そして対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが各々薬物に結合している］を含み、そしてさらに、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物を含む、薬物デリバリー系に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、ヒドロゲル［ここで、第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーは、ポリマーに結合しており、そして、薬物は、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化されたヒドロゲル構造に物理的に捕捉されている］を含み、そしてさらに、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断し、それによりヒドロゲル構造を緩め、前記薬物を放出させる化合物を含む、薬物デリバリー系に関する。この原則のバリエーションでは、薬物はポリマーに結合してヒドロゲルを形成できる。第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物を添加すると、ヒドロゲルは崩壊し、薬物−ポリマー複合体が放出される。
【００１１】
したがって、本発明はさらに、それを必要とする患者に薬物をデリバリーする方法に関し、ヒドロゲルが患者に投与され［ここで、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合し、対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが各々該薬物に結合している］、そして、ヒドロゲルが目的の作用部位に到達した後に、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物が投与される。
【００１２】
さらに、本発明は、それを必要とする患者に薬物をデリバリーする方法に関し、この方法においては、ヒドロゲルが患者に投与され［ここで、第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーがポリマーに結合し、薬物がヒドロゲル構造に物理的に捕捉され、またはポリマーに結合して、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化されたヒドロゲル構造を形成している］、そして、ヒドロゲルが目的の作用部位に到達した後に、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物が投与され、それによりヒドロゲル構造が緩み、該薬物、またはポリマーに結合した薬物がそれぞれ放出される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】薬理学的に誘発されるヒドロゲル：（ａ）ポリアクリルアミド骨格にカップリングさせた細菌性ジャイレースサブユニットＢ（ＧｙｒＢ）をクーママイシン（＋Ｃ）により二量体化して、ヒドロゲルのゲル化を導く。ノボビオシン（＋Ｎ）の存在下でＧｙｒＢが解離し、ヒドロゲルの溶解が導かれる。（ｂ）ポリアクリルアミド骨格への蛋白のカップリング。Ｎｉ２＋イオンをキレート化するニトリロ三酢酸でポリアクリルアミドを官能化し、これにヘキサヒスチジン配列を介してＧｙｒＢが結合できる。
【図２】薬理学的に調節されるヒドロゲルの設計：（ａ）抗生物質依存性ヒドロゲルの生成。ヘキサヒスチジンで標識されたＧｙｒＢを、クーママイシン（＋Ｃ、ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１、mol/mol）、ノボビオシン（＋Ｎ、ＧｙｒＢ：ノボビオシン＝１：１０、mol/mol）の存在下で、または抗生物質不在下で（ｗ／ｏ）インキュベートする。ＧｙｒＢ複合体をＮｉ２＋−帯電したポリ（ＡＡＭ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）と混合し、得られた粘稠な構造をＰＢＳ中で１２時間インキュベートした後、緩衝液中に放出されたＧｙｒＢ蛋白を定量する。（ｂ）ＧｙｒＢ二量体化特異的ヒドロゲル。ＧｙｒＢをクーママイシン（ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１）で二量体化し、ＧｙｒＢ二量体を共有結合的に安定化させるためのアミン特異的二官能性架橋剤スベルイミド酸ジメチルの存在下（＋ＤＭＳ）または不在下（−ＤＭＳ）で、さらにインキュベートする。ＧｙｒＢ二量体をＮｉ２＋−帯電したポリ（ＡＡＭ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）と混合し、ヒドロゲルの生成を導く。ＰＢＳ中で一夜膨潤させた後、このヒドロゲルを、ノボビオシン１mMを含有するＰＢＳに入れ、緩衝液中に放出されたＧｙｒＢ蛋白を定量することによりポリマーの溶解を監視する。
【図３】調節可能な、薬理学的に誘発されるヒドロゲルの崩壊：異なる濃度のノボビオシン（０〜１mM）の存在下でヒドロゲルをＰＢＳ中でインキュベートし、ヒドロゲルの崩壊を、緩衝液中に放出されるＧｙｒＢの定量によって測定する。
【図４】ヒト血管内皮成長因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）の放出：ＶＥＧＦ１２１をヒドロゲルに組み込み、漸増濃度のノボビオシン存在下にインキュベートする。緩衝液中へのＶＥＧＦ１２１の放出を経時的に追跡する。
【図５】ノボビオシンの誘発するヒドロゲルの膨潤：ポリマーサイズの変化を監視しながら、部分的に化学的に架橋したＧｙｒＢ単位を組み込んだヒドロゲルをノボビオシン１mMの存在下または不在下にインキュベートする。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルに関し、ここで、このポリペプチド結合パートナーは、第二のポリペプチド、核酸または小分子であり、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用は、非共有結合性であり、調節化合物の添加または除去により調節される。
【００１５】
好適なポリマーは、例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリ−ジメチル−ジアリル−アンモニウムクロリドおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミドのようなポリビニル型ポリマー、フィブリン、コラーゲンおよびポリ−Ｌ−リジンのようなポリペプチド、ならびに、アルギン酸塩、場合により修飾されていてもよいセルロース類、例えばセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デキストランおよびデンプンのようなポリ炭水化物である。好ましいポリマーは、例えばポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドおよびフィブリンである。ポリマーとして最も好ましいのはポリエチレングリコールである。好適なポリマーは、例えば溶解性を微調整するために、さらなるポリマー化合物との反応により修飾することができる。
【００１６】
本明細書で使用する「調節化合物」とは、生理的条件下で第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の非共有結合性相互作用を壊すまたは惹起する化合物である。ポリペプチドの三次および二次構造を破壊する蛋白変性化合物、例えば、無機塩および酸、有機溶媒、例えばメタノール、エタノールまたはアセトン、有機酸、例えば酢酸、トリクロロ酢酸、ピクリン酸またはスルホサリチル酸、カオトロピック剤、例えば尿素またはグアニジニウム塩、ジスルフィド結合還元剤、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトールまたはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ならびに関連化合物は、本発明の意義における調節化合物とはみなさないと理解される。本発明の意義における「生理的条件」下において、この化合物は、１mg/mlを下回る濃度で第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の非共有結合性相互作用を壊すまたは惹起すると理解される。
【００１７】
ポリペプチド結合パートナーが第二のポリペプチドである場合、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの対は、例えば、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ（ジャイレースサブユニットＢ）、ＦＫＢＰ−ＦＲＢ（ＦＫ結合蛋白−脂質キナーゼ蛋白類似体ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ−ラパマイシン関連蛋白）のドメイン（ＦＲＢ））、ＦＭ−ＦＭ（ＦＫ結合蛋白のＦ３６Ｍ突然変異）、ＴｏｘＴ−ＴｏｘＴ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＴｏｘＴ蛋白）、ＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＦＫＢＰ−ＦＫＢＰ（ＦＫ結合蛋白）、ＦＫＢＰ−Ｃｙｐ（ＦＫ結合蛋白−シクロフィリン）およびＣｙｐ−Ｃｙｐ（シクロフィリン）である。第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーは、上記ポリペプチドのホモ多量体または上記ポリペプチドのうち少なくとも２つの間のヘテロ多量体であってもよい。第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーはまた、溶解性に影響を与え、凝集を防止するために、さらなるポリマー、例えばポリエチレングリコールまたはポリアクリルアミドと共有結合していてもよい。添加または除去のいずれかによってポリペプチド間の相互作用に影響を与える、対応する調節化合物は、例えば、クマリン抗生物質（ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢに対して）、ラパマイシンまたはＦＫ５０６および誘導体（例えばラパログ類、ｍＴＯＲインヒビター）（ＦＫＢＰ−ＦＲＢおよびＦＭに対して）、シクロスポリンおよび誘導体（Ｃｙｐに対して）、ＦＫ５０６（ＦＫＢＰ−ＦＲＢおよびＦＭに対して）、ヴィルトスタチン（ＴｏｘＴに対して）、ならびにメトトレキサートおよびその誘導体（例えば抗葉酸剤）（ＤＨＦＲ−ＤＨＦＲに対して）である。調節化合物として好ましいのは、小有機化合物、例えば分子量が１００〜５０００、特に１００〜２０００の化合物である。
【００１８】
特別な例において、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーは、二量体を形成する傾向がある同一化合物である。このような二量体形成ポリペプチドの具体例は、ＧｙｒＢ、ＦＭ、ＴｏｘＴ、ＦＫＢＰおよびＤＨＦＲである。こうした二量体形成ポリペプチドを含むヒドロゲルは、二量体形成を誘導する化合物をさらに含むことがある。例えば、そのような二量体化を誘導する化合物は、クマリン抗生物質、ラパマイシンおよび誘導体、ヴィルトスタチン、ＦＫ１０１２、ならびにメトトレキサートおよびその誘導体である。この二量体形成化合物は、上記または下記に開示する調節化合物の定義に該当し得る。あるいは、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用に影響を与える調節化合物は、二量体形成化合物の活性を中和する調節化合物であってもよく、この中和によって二量体形成ポリペプチドの相互作用の実質的低下が導かれる。二量体形成効果を中和する化合物は、例えば、実質的に過剰に使用された場合の、二量体形成化合物として上述したものと同じ化合物、または、好ましくは同じクラスの二量体形成化合物のうちでも別の異なる代表化合物、例えば、クマリン抗生物質、ラパマイシンおよび誘導体、ならびにメトトレキサート、抗葉酸剤およびその誘導体のクラス、ならびにＦＫ５０６である。
【００１９】
ポリペプチド結合パートナーが核酸である場合、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの対は、例えば、Ｅ−ＥＴＲ（Ｅ．ｃｏｌｉのＭｐｈＲ（Ａ）蛋白およびそのオペレーターＥＴＲ）、ＰＩＰ−ＰＩＲ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓのＰＩＰ蛋白およびそのオペレーターＰＩＲ）、ＴｅｔＲ−ｔｅｔＯ（Ｔｎ１０から誘導されるテトラサイクリンリプレッサーＴｅｔＲおよびそのオペレーターｔｅｔＯ）、ＡｒｇＲ−ａｒｇＯ（アルギニン応答性リプレッサーおよびそのオペレーターａｒｇＯ）、ＡｒｓＲ−ａｒｓＯ（砒素応答性リプレッサーおよびそのオペレーターａｒｓＯ）、およびＨｕｃＲ−ｈｕｃＯ（尿酸応答性リプレッサーおよびそのオペレーターｈｕｃＯ）である。その他のこのような対は、Ramos J. L.等（Microbiol Mol Biol Rev 69, 326-56, 2005）、Martinez-Bueno M.等（Bioinformatics 20, 2787-91, 2004）の記載したもの、およびデータベースＢａｃＴレギュレーター（http://www.bactregulators,org/）に列挙されたものである。添加または除去のいずれかによってポリペプチド間相互作用に影響を与える、対応する調節化合物は、例えば、マクロライド抗生物質（Ｅ−ＥＴＲに対して）、ストレプトグラミン抗生物質（ＰＩＰ−ＰＩＲに対して）、テトラサイクリン抗生物質（ＴｅｔＲ−ｔｅｔＯに対して）、アルギニン（ＡｒｇＲ−ａｒｇＯに対して）、重金属（ＡｒｓＲ−ａｒｓＯに対して）、および尿酸（ＨｕｃＲ−ｈｕｃＯに対して）である。
【００２０】
ポリペプチド結合パートナーが小分子である場合、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの対は、例えば、ＧｙｒＢ−クマリン抗生物質、ＦＫＢＰ−ｍＴＯＲインヒビター、ＦＲＢ−ｍＴＯＲインヒビター、ＦＭ−ｍＴＯＲインヒビター、Ｃｙｐ−シクロスポリン、Ｃｙｐ−アスコマイシン、ＤＨＦＲ−抗葉酸剤、ストレプトアビジン−ビオチンアナログ、アビジン−ビオチンアナログ、ニュートラアビジン−ビオチンアナログ、ステロイドホルモンレセプター−ステロイドホルモンおよびそのアナログ、ならびにＴｏｘＴ−ヴィルスタチンである。
【００２１】
ポリペプチド結合パートナーが小分子である場合、そのポリペプチド結合パートナーは好ましくは＜５０００g/mol、特に１００〜５０００g/molの分子量を有する。
【００２２】
クマリンおよびアミノクマリン抗生物質には、例えばノボビオシン、クロロビオシン、クーママイシンおよびジヒドロノボビオシンがある。
【００２３】
シクロスポリンまたはアスコマイシンは、例えば、シクロスポリンＡ（NEORAL(登録商標)）、ＩＳＡｔｘ−２４７、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ＦＫ７７８、ＡＢＴ−２８１またはＡＳＭ９８１であってよい。
【００２４】
ｍＴＯＲインヒビターは、例えば、ラパマイシンまたはその誘導体、例えばシロリムス（RAPAMUNE(登録商標)）、デフォロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス、エベロリムス（Certican(登録商標)）、ＣＣ１７７９、ＡＢＴ５７８、バイオリムス−７、バイオリムス−９、ラパログ、例えばＡＰ２３５７３、アザチオプリン、カンプト１Ｈ、Ｓ１Ｐレセプターモジュレーター、例えばＦＴＹ７２０、またはその類似体であってよい。
【００２５】
ラパログは、特に、ラパマイシンに関する以下の修飾のうち１以上を有するラパマイシンの変異体を包含している：Ｃ７、Ｃ４２および／またはＣ２９位のメトキシ基の脱メチル化、脱離もしくは置換；Ｃ１３、Ｃ４３および／またはＣ２８位のヒドロキシ基の脱離、誘導体化もしくは置換；Ｃ１４、Ｃ２４および／またはＣ３０位のケトン官能基の還元、脱離もしくは誘導体化；六員ピペコラート環の五員プロリニル環による置換；ならびにシクロヘキシル環上の別の置換基による置換またはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環による置換。考え得るさらなる修飾は、米国特許第５５２５６１０；５３１０９０３および５３６２７１８号ならびに米国特許第５５２７９０７号の、背景技術の項に提示されている。さらにＣ２８ヒドロキシ基の選択的エピマー化が考えられている（ＷＯ０１／１４３８７）。ＷＯ０３／０６４３８３号およびＷＯ０５／１６２５２号に記載されるような、種々のリン含有部分を含むラパマイシン類似体の使用がさらに考えられる。考えられるその他のラパログは、米国特許第６９８４６３５号、米国特許第６６４９５９５号および米国特許第７０９１２１３号に記載されている。
【００２６】
抗葉酸剤には例えば、メトトレキサート、トリメトプリムのようなＤＨＦＲに結合する化合物、ブロジモプリムおよびエピロプリム、またはイクラプリムのようなジアミノピリミジン類がある。考えられるその他のＤＨＦＲインヒビターは、Hawser S. et al., Biochemical Pharmacology 71, 941-948, 2006に記載されているインヒビターである。
【００２７】
ビオチンアナログには、例えばストレプトアビジン、ニュートラアビジンもしくはアビジンに結合する化合物、例えばビオチン、ＨＡＢＡ、デスチオビオチン、イミノビオチンまたはジアミノビオチンがある。
【００２８】
上記の小分子ポリペプチド結合パートナーは、ポリマーまたはその他の目的化合物との結合に好適な誘導体化に付すことができる。そのような誘導体化には、アミン、アミド、チオール、ヒドロキシ、アルデヒド、アジド、アルキン、ケトン、エポキシドまたはカルボキシ官能性の導入がある。
【００２９】
特に好ましい第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの対は、対応する調節化合物アミノクマリン抗生物質（例えばＧｙｒＢ−ＧｙｒＢに対するクーママイシンおよびノボビオシン）、ラパマイシン、ＦＫ５０６およびその誘導体ＡＰ２１９９８およびＡＰ２２５４２（ＦＭ−ＦＭおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢに対して）と共に、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ、ＦＭ−ＦＭおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢの組み合わせである。
【００３０】
最も好ましいのはＧｙｒＢ−ＧｙｒＢおよびＦＭ−ＦＭである。
【００３１】
特に本発明は、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーがポリマーに結合しており、そして、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用がヒドロゲルを安定化するようなヒドロゲルに関する。例えば、ＧｙｒＢおよびクーママイシンの組み合わせは、ポリマーの安定化のために特に有用である。
【００３２】
特に本発明は、第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーがポリマーに共有結合している、または、強い特異的な非共有結合によりポリマーに結合している、ヒドロゲルに関する。本発明の意義における強い非共有結合とは、生理的条件下で１０−５Ｍを下回る解離定数を有する結合である。ポリペプチドおよびその結合パートナーは、特異的リンカーによって、例えばＮＴＡのようなキレート形成物質および多価金属イオンとのポリヒスチジン結合、ペプチド結合、マレイミドまたはビニルスルホンに結合したチオール、ハロタグ（Los G. V. et al., Methods Mol Biol. 356, 195-208, 2007）、ＳＮＡＰ−タグまたはＣＬＩＰ−タグ（Gautier A. et al., Chem Biol. 15, 128-36, 2008）によって、または、トランスグルタミナーゼ反応結合（Ehrbar M. et al., Biomaterials 29, 1720-9, 2008）によってポリマーに結合できる。このようなヒドロゲルは通常、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーをポリマー骨格に結合させ、両方の反応生成物を混合し、そして第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーが互いに相互作用するように調節化合物の濃度を変化させ、それによりヒドロゲルを形成させることによって製造する。調節化合物の濃度を変化させるか、または第一調節化合物の効果を中和する第二調節化合物を添加すると、その剛直な構造が壊れ、ヒドロゲルは実質的により剛直でない構造、例えばヒドロゾルに戻る。
【００３３】
ヒドロゲルをさらに安定化するため、ポリマー骨格を化学的に架橋することにより、またはポリペプチド結合パートナーで第一ポリペプチドを架橋することにより、さらなる架橋を導入することができる。好適な架橋剤はBioconjugate Techniques（2nd Edition by Greg T. Hermanson, Academic Press, 2008）に記載のような、別の分子に結合するための少なくとも２個の部位を示す任意のホモまたはヘテロ官能性化合物である。
【００３４】
加えて、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含む半相互侵入網目構造ポリマーネットワーク（セミ−ＩＰＮ。少なくとも１つのポリマーが架橋し、少なくとも１つのポリマーが架橋していない、２以上のポリマーのポリマーネットワークの意。例えばMiyata T. et al., Nature 399, 766-769, 1999に記載されている）もまた同様に本発明の範囲内にある。
【００３５】
第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれがポリマーに結合してもよく、それぞれ対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが、目的化合物、例えば薬物に結合できる。
【００３６】
目的化合物は、ヒドロゲルが埋め込まれた宿主に有益な効果をもたらす任意の物質である。
【００３７】
薬物は、細胞増殖抑制性および細胞毒性薬物、抗生物質、抗ウイルス薬、抗炎症薬、生長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、鎮痛薬、ｓｉＲＮＡのようなポリ核酸、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡおよびウイルス粒子といったクラスから選択される任意の薬物であってよい。好ましい薬物は、ポリペプチド型薬物のような経口投与できない薬物である。
【００３８】
特に該薬物は、その可能性を十分に発揮するために、まず作用部位に運搬されねばならない。例にはモノクローナル抗体、生長因子およびサイトカインがある。
【００３９】
該薬物は、ヒドロゲル構造に物理的に捕捉されるか、またはヒドロゲルを形成するポリマーに結合でき、調節化合物の添加または除去によりヒドロゲルの溶解または膨潤が誘発され、ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化されたヒドロゲル構造が壊されることにより、薬物がそれぞれ遊離薬物または薬物−ポリマー複合体として放出され得る。あるいは、該薬物がポリペプチド結合パートナーに結合し、一方このポリペプチド結合パートナーはヒドロゲル内で第一ポリペプチドに結合する。調節化合物の添加または除去が第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断し、それにより、ポリペプチド結合パートナーに結合した薬物を遊離させる。薬物が第一ポリペプチドに結合し、ポリペプチド結合パートナーがヒドロゲルに固定化されている逆の形態もまた本発明の範囲内にある。
【００４０】
さらに本発明は、ヒドロゲル［ここで、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合し、対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが各々薬物に結合している］を含み、そしてさらに、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物をも含む、薬物デリバリー系に関する。
【００４１】
こうした薬物デリバリー系の好ましい構成要素は、好ましいものとして上に述べたヒドロゲル、例えば、好ましいポリマー、第一ポリペプチドおよびそのポリペプチド結合パートナーの好ましい組み合わせ、そしてさらに、適切に適合させた好ましい調節化合物を含むヒドロゲルである。このようなヒドロゲルが好ましく使用される特別の状況は、例えばその薬物が反復して、または長期間投与されねばならない場合である。例えば、ヒドロゲルを特定の作用部位に注射で適用し、調節化合物を経口適用すると、ヒドロゲルが注射された部位に調節化合物が拡散し、その結果、調節化合物がヒドロゲルの性質（膨潤または溶解）および薬物の遊離を調節する。あるいは、ヒドロゲルを、尿酸のような内因性調節化合物に応答するように設計すると、その結果、一定の生理的濃度の前記内因性化合物がゲルの性質を改変し、内蔵された薬物の遊離を調節するであろう。
【００４２】
したがって本発明はさらに、それを必要とする患者に薬物をデリバリーする方法に関し、この場合、ヒドロゲルが患者に投与され、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合し、各々対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが該薬物に結合し、そしてヒドロゲルが目的の作用部位に到達した後に、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物が投与される。
【００４３】
さらに、本発明は、それを必要とする患者に薬物をデリバリーする方法に関し、この場合、ヒドロゲルが患者に投与され、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーがポリマーに結合し、薬物がヒドロゲル構造に物理的に捕捉され、またはポリマーに結合して、ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化されるヒドロゲル構造を形成し、そして、ヒドロゲルが目的の作用部位に到達した後に、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物が投与され、それによりヒドロゲル構造が緩み、該薬物または薬物−ポリマー複合体がそれぞれ放出される。
【００４４】
患者への通常の薬物の適用と比較して、本方法は遙かに簡便である。何故なら、薬物を含むヒドロゲルは患者に一回注射で投与すればよく、経口投与可能な調節化合物を服用することにより、該薬物を必要に応じて放出させることができるからである。このようにして、反復注射が、一回の注射と、錠剤、カプセル剤、丸剤などの形態を持つ何らかの経口活性化合物に置き換えられる。
【００４５】
本発明に係る特別のヒドロゲルは、細菌性ジャイレースサブユニットＢ（ＧｙｒＢ）をグラフトさせたポリアクリルアミドを基礎とする抗生物質応答性ゲルであって、ＧｙｒＢがアミノクマリン抗生物質クーママイシンにより二量体化し、それによってヒドロゲルのゲル化および三次元的安定化がもたらされる（図１ａ）。アミノクマリン ノボビオシン（Albamacin(登録商標)）を添加すると、ＧｙｒＢおよびクーママイシンの間の相互作用が競合阻害され、三次元構造が緩み、ヒドロゲルがゾル状態に変化する（図１ａ）。特別な例では、ポリマー骨格は、ヘキサヒスチジン標識（Ｈｉｓ６）を付けたＧｙｒＢを結合させるためのＮｉ２＋イオンをキレート化するため、ニトリロ三酢酸で官能化したポリアクリルアミドである（図１ｂ）。ポリマー骨格を構築するため、２，２’−（５−アクリルアミド−１−カルボキシペンチルアザンジイル）二酢酸（ＮＴＴ−ＡＡｍ）を合成し、アクリルアミド（ＡＡｍ）と共重合させ、ＮＴＡ基をＮｉ２＋で帯電させる。得られたポリマー ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）は、サイズ排除クロマトグラフィーで判定された分子量４２kDaを有し、１Ｈ ＮＭＲ分析と合成における化学量論を反映することから推定されるように、４個のアクリルアミドモノマーあたり１個のＮＴＡ−ＡＡｍ基を有する。
【００４６】
Ｅ．ｃｏｌｉジャイレースサブユニットＢの遺伝子（ｇｙｒＢ）を、６個のヒスチジン残基のコード配列で標識する。このコード領域を、ファージＴ７から誘導されるプロモーターの調節下に置き、可溶性細胞質蛋白としてＥ．ｃｏｌｉで発現させる。ＧｙｒＢを、Ｎｉ２＋型アフィニティークロマトグラフィーを用いてヘキサヒスチジンタグにより精製する。蛋白を、クーママイシン（ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１。mol/mol）の存在下または不在下でインキュベートし、その後アミン特異的二官能性架橋剤スベルイミド酸ジメチル（ＤＭＳ）を添加し、この複合体を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析することにより、遺伝子工学により生成されたＧｙｒＢのクーママイシンにより誘発される二量体化を評価する。クーママイシン不在下では、ＧｙｒＢは専ら予想サイズ２７kDaの位置に移動し、一方、二量体化抗生物質を添加すると実質的な二量体の形成が起こり、予想サイズ５４kDaの位置に移動する。クーママイシン存在下で２７kDaに移動する残存バンドは、抗生物質により仲介されるＧｙｒＢの非効率的な二量体化に起因するが、むしろ不完全なＤＭＳ仲介性共有結合的架橋に起因する、ということを排除するため、限外濾過実験を実施する。ＧｙｒＢをクーママイシンの存在下または不在下でインキュベートし、５０kDa分子量カットオフフィルターを用いる限外濾過に付す。クーママイシン不在下のＧｙｒＢは効率的にフィルターを通過する（濾液中の蛋白５４％）が、クーママイシンで二量体化されたＧｙｒＢがロードされた場合、濾液中にはバックグラウンドレベルのＧｙｒＢが検出できるに過ぎず（濾液中の蛋白２．８％）、これは、クーママイシンにより仲介されるＧｙｒＢ二量体化が定量的であることを示すものである。
【００４７】
クーママイシン架橋ヒドロゲルの合成を、クーママイシンの存在下もしくは不在下、または１０倍モル過剰のノボビオシンと共に、ヘキサヒスチジンで標識したＧｙｒＢをインキュベートすることにより検証する。続いてこの蛋白を、ポリマー骨格においてキレート化した１１のＮｉ２＋イオンにつき１のＧｙｒＢの割合で、ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）と混合する。全てが粘稠となったこの溶液をＰＢＳ中で１２時間インキュベートした後、緩衝液中に放出されたＧｙｒＢ−ポリマー複合体の定量を行う（図２ａ）。クーママイシンの不在下またはノボビオシンの存在下で、この粘性構造物は完全に溶解し、ＧｙｒＢが定量的に緩衝液に回収される。しかしながらクーママイシンの存在下では、ＧｙｒＢ−ポリマーの放出は有意に低下してヒドロゲルが観察でき、このことによってこの二量体化抗生物質のゲル化作用が示される（図２ａ）。ヒドロゲルの生成が事実上クーママイシンにより仲介されるＧｙｒＢ二量体化に起因することを説明するため、上記のようにクーママイシンにより二量体化されたＧｙｒＢを用いたヒドロゲル、またはＤＭＳによりさらに共有結合的に架橋しておいたクーママイシン二量体化Ｇｙｒを合成する。ＰＢＳ中で１２時間膨潤させた後、ノボビオシン１mMを含有するＰＢＳ中でこのヒドロゲルをインキュベートし、緩衝液中へのＧｙｒＢ−ポリマー複合体の放出によってヒドロゲルの溶解を監視する（図２ｂ）。クーママイシン架橋ヒドロゲルがノボビオシンの存在下で１１時間後に溶解する一方で、ＤＭＳ架橋ＧｙｒＢ（＋ＤＭＳ）を伴うヒドロゲルは、３１時間の観察時間の間安定である（図２ｂ）。この知見は、クーママイシンにより仲介されるＧｙｒＢの二量体化によってヒドロゲルが効果的に生成し、それが過剰のノボビオシンにより逆転し得ることを裏付けるものである。他のクラスの抗生物質（例えば、β−ラクタム、マクロライド）の添加により特異性がさらに説明され、その場合、ゲルの溶解に及ぼす影響は観察できない。
【００４８】
ヒドロゲルの溶解速度および生物薬剤の放出特性を最適に調節して治療域内にすることができるならば、薬理学的に誘発されるヒドロゲルの生成および溶解は、体内における蛋白性医薬の最適なデリバリーのための新たな展望を開く。調節可能なヒドロゲル特性を研究するため、クーママイシン二量体化ヒドロゲルを、漸増濃度のノボビオシン存在下でインキュベートし、ゲルの溶解を、放出されたＧｙｒＢ−ポリマー複合体の定量によって追跡する（図３）。ノボビオシン１mMの存在下ではヒドロゲルは速やかに溶解し、一方、より低濃度のノボビオシンは、より緩やかなヒドロゲルの溶解およびより緩やかなＧｙｒＢ放出と相関し、これは、調節可能な溶解および放出速度を説明している（図３）。ヒドロゲルはノボビオシン不在下で２４日間安定である。２４日目にノボビオシン１mMを添加すると、２６日目までヒドロゲルの溶解がもたらされるが、これはヒドロゲルの長期機能性を説明している。
【００４９】
刺激感知性ヒドロゲルからの治療用蛋白の薬理学的に誘発される放出を説明するため、ヒト血管内皮生長因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）をヒドロゲル内に組み込み（ＧｙｒＢ：ＶＥＧＦ１２１＝１０００：１、mol/mol）、漸増濃度のノボビオシン存在下でインキュベートする（図４）。ノボビオシン１mMの存在下ではＶＥＧＦ１２１は１０時間以内に完全に放出されるが、刺激不在下ではバックグラウンドレベルのＶＥＧＦ１２１が観察されるに過ぎない。中程度のノボビオシン濃度（０．２５mM）ではＶＤＧＦ１２１放出速度はより緩やかであり、これにより、トリガーにより調節可能な生長因子の放出特性が説明される。
【００５０】
ＧｙｒＢに基づく系は、ノボビオシン存在下で膨潤するヒドロゲルの設計に利用することもできる。故に、クーママイシン二量体化ＧｙｒＢ分子を等モル量のスベルイミド酸ジメチルにより化学的に架橋するという改変を施したヒドロゲルが上記のように製造される。このようなゲルをノボビオシン存在下でインキュベートすると、膨潤が観察され得る（図５）。
【実施例】
【００５１】
［実施例１］ヘキサヒスチジン標識したＧｙｒＢの製造
細菌ジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）を、オリゴヌクレオチドＯＷＷ８６６(５’−ｇｇｔａｃｔｔｇｃａｃａｔａｔｇｔｃｇａａｔｔｃｔｔａｔｇａｃｔｃｃｔｃｃａｇｔａｔｃ−３’、配列番号１)およびＯＷＷ８６７（５’−ｃｃａｇｔｔａｃａａｇｃｔｔａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇｃｃｔｔｃａｔａｇｔｇ−３’、配列番号２）を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α染色体ＤＮＡから増幅し、ｐＷＷ３０１にライゲーションし（Ｎｄｅｌ／ＨｉｎｄIII）（Weber C. C. et al., Biotechnol Bioeng 89, 9-17, 2005）、それにより、ｇｙｒＢをファージＴ７プロモーターの調節下に置く。ｐＷＷ８７３をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＳＴＡＲ（登録商標）（ＤＥ３）中に形質転換し（Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. no. C601003）、１mMのＩＰＴＧによりＯＤ６００＝１において３７℃で３時間蛋白産生を誘導する。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し（始発培養容量１０００mlあたり４０ml・５０mM ＮａＨ２ＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ、１０mMイミダゾール、ｐＨ８．０）、フレンチプレス（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で破砕し、細胞残屑を１５０００ｘｇ２０分間の遠心分離により取り除く。清澄化した細胞溶解液をＮＴＡ−アガロース スーパーフローカラム（Qiagen, Hilden, Germany, cat. no. 30210）にロードし、続いてこれを１０カラム容量のＰＢＳ、１０カラム容量の洗浄緩衝液（５０mMＮａＨ２ＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ、２０mMイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄し、２カラム容量の溶離緩衝液（５０mMＮａＨ２ＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール、ｐＨ８．０）で溶出する。溶離緩衝液を限外濾過（１０kDa ＭＷカットオフ、Sartorius, Gottingen, Germany, cat. no. VS0202）によってＰＢＳに変換し、ＧｙｒＢを８０mg/mlに濃縮する。
【００５２】
［実施例２］ＶＥＧＦ１２１の製造
ヘキサヒスチジン標識したヒト血管内皮生長因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）のための発現ベクターｐＲＳＥＴ−ＶＥＧＦ１２１(Ehrbar M. et al., Circ Res 94, 1124-32, 2004) をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＳＴＡＲ（登録商標）（ＤＥ３）に形質転換し、１mMのＩＰＴＧ添加によりＯＤ６００＝０．８において３７℃で４時間蛋白産生を誘導する。細胞ペレットを５０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２mMＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に再懸濁し（始発培養容量１０００mlあたり１００ml）、フレンチプレスを使用して細胞を破砕し、４℃、１５０００ｘｇで２０分間の遠心分離により、封入体をペレット化する。封入体を、６Ｍ尿素、５００mMＮａＣｌ、５mMイミダゾール、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．９）中に４℃で一夜溶解し、遠心分離（１５０００ｘｇ、３０分間、４℃）して細胞残屑から分離する。この上清を、洗浄（１５カラム容量の６Ｍ尿素、５００mMＮａＣｌ、２０mMイミダゾール、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．９）および溶離（６Ｍ尿素、５００mMＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．９）の後、ＮＴＡ−アガローススーパーフローカラムにロードする。溶出液を２mMＤＴＴおよび２mMＥＤＴＡと共に２２℃で３０分間インキュベートしてジスルフィド結合を還元し、その後三段階透析を行う（（３．５kDaＭＷカットオフ、Pierce, Rockford, IL, cat. no. 68035）：４Ｍ尿素、１mMＥＤＴＡ、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２ｘ１時間；３Ｍ尿素、１mMＥＤＴＡ、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２ｘ１時間；２Ｍ尿素、１５０mMＮａＣｌ、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１時間、そして２Ｍ尿素、１５０mMＮａＣｌ、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で一夜）。精製されたＶＥＧＦ１２１を−８０℃で保存する。ＶＥＧＦ１２１をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Peprotech, Hamburg, Germany, cat. no. 900-K10）で定量する。
【００５３】
［実施例３］ＧｙｒＢの特性決定
ＢＳＡを標準として使用するブラッドフォード法（Biorad, Munich, Germany, cat. no. 500-0006）によってＧｙｒＢの濃度を分析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために１２％還元ゲルを使用し、その後クマシー染色する。ＧｙｒＢについて１０倍モル過剰のスベルイミド酸ジメチルｘ２ＨＣｌ（DMS, SigmaAldrich, St. Louis, MO, cat. no. 179523）を添加し室温で６０分間、二量体を共有結合的に架橋させた後、クーママイシンＡ１存在下にＧｙｒＢを室温で３０分間インキュベートする（ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１、mol/mol；Sigma, St. Louis, MO, cat. no. C9270）ことにより、抗生物質により誘発されるＧｙｒＢの二量体化を分析する。この二量体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。クーママイシンにより誘発される二量体化の限外濾過研究のため、１mlＰＢＳ中１００nmolＧｙｒＢを５０nmolクーママイシンの存在下または不在下に室温で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ ４mlの添加後、この溶液を５０００ｘｇで４５分間の限外濾過に付す（５０kDaＭＷカットオフ、Filtron, Northborough, MA, cat. no. OD050C36）。不透過物（１ml）を５mlＰＢＳで希釈し、再度限外濾過した後、プールした濾液および不透過物中のＧｙｒＢ濃度を定量する。
【００５４】
［実施例４］２，２’−（５−アクリルアミド−１−カルボキシペンチルアザンジイル）二酢酸（ＮＴＡ−ＡＡｍ）の合成
トルエン１５mlに溶解した塩化アクリロイル３．３mmol（ABCR, Karlsruhe, Germany, cat. no. AB172729）を、０．４４Ｍ ＮａＯＨ ２７mlに溶解した３mmolのＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジン（Fluka, Buchs, Switzerland, cat. no. 14580）の氷冷溶液に４時間かけて滴下する。トルエンを減圧留去し、Dowex（登録商標） 50WX8（Acros, Geel, Belgium, cat. no. 335351000）でナトリウムイオンを除去し、その後凍結乾燥すると、粘稠な油状物が生成する（収率：５０％）。
【００５５】
［実施例５］ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡｍ）の合成
１．５mmolのＮＴＡ−ＡＡｍおよび６．４mmolのアクリルアミド（AAm, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden, cat. no. 17-1300-01）を窒素雰囲気下で５０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ ４８ml（ｐＨ８．５）に溶解し、 ペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、１０％、ｗ／ｖ）１５０μlおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）２４μlの添加により室温で２０時間の重合を開始する。ポリマーを２０mlに減圧濃縮し、その後、２ＬのＨ２Ｏに対して１２時間、２回の透析（３．５kDaＭＷカットオフ、Pierce, Rockford, IL, cat. no. 68035）を実施して、塩類および残留アクリルアミドのような毒性低分子量化合物を取り除く。得られたＡＡｍ対ＮＴＡ−ＡＡｍのモル比は、１Ｈ ＮＭＲ（Avance 500 Bruker BioSpin AG Fallanden, Switzerland）で測定したところ４対１である。透析液に３．５mmolＮｉＳＯ４を添加し、０．５ｘＰＢＳ（１２時間）で２回、０．１ｘＰＢＳ（１２時間）で２回透析する。このＮｉ２＋−帯電したポリマーを１０倍に減圧濃縮すると６％（ｗ／ｖ）溶液が得られる。Ｎｉ２＋−帯電したポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡｍ）のサイズを、移動相としてＰＢＳを用いるShodex OHpak SB-806 HQ （８．０mm ｘ３００mm、昭和電工、川崎、日本国）カラム上のゲル透過クロマトグラフィーにより、流速０．５ml/分で分析する（Waters 2796 Alliance Bio, Waters AG, Baden, Switzerland）。検出は、Waters 2487のＵＶ検出機を用いて２８０nmおよび３９０nmで実施する。サイズ標準としてポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム塩）（Fluka, Buchs, Switzerland）を使用する。
【００５６】
［実施例６］ヒドロゲルの形成および特性決定
ＰＢＳ中の精製ＧｙｒＢ（８０mg/ml）を、ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１のモル比でクーママイシン（ＤＭＳＯ中５０mg/ml）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。続いてＧｙｒＢ１mgあたり４．５μlのポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）（ＰＢＳ中６％ｗ／ｖ溶液）に、二量体化したＧｙｒＢを加え、穏やかに撹拌して混合する。直ちにヒドロゲルが生成するのでこれを加湿雰囲気下に４℃で２０時間インキュベートし、その後このヒドロゲルをＰＢＳ中で１２時間インキュベートする。トリガーにより誘発され得るヒドロゲルの溶解を調べるため、異なる濃度のノボビオシン（Fluka, cat. no. 74675）存在下にＰＢＳ中でゲルをインキュベートし、溶解を、光学的に（GelJet Imager 2004, Intas, Gottingen, Germany）、そしてブラッドフォード法を用いる緩衝液中へのＧｙｒＢ放出の定量により、監視する。エラーバーは３回の実験から得られた標準偏差を表す。
【００５７】
［実施例７］さらなる架橋を伴うヒドロゲルの形成および特性決定
ＰＢＳ中の精製ＧｙｒＢ（８０mg/ml）を、ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１のモル比でクーママイシン（ＤＭＳＯ中５０mg/ml）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、二量体化したＧｙｒＢを等モル量のスベルイミド酸ジメチルと共にインキュベートし、室温で６０分間インキュベートする。続いてＧｙｒＢ１mgあたり４．５μlのポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）（ＰＢＳ中６％ｗ／ｖ溶液）に、二量体化および架橋したＧｙｒＢを加え、穏やかに撹拌して混合する。直ちにヒドロゲルが生成するがこれを加湿雰囲気下に４℃で２０時間インキュベートし、その後このヒドロゲルをＰＢＳまたは１mMノボビオシンを添加したＰＢＳ中で２０時間インキュベートする。ゲルの膨潤を光学的に監視する（図５）。エラーバーは３回の実験から得られた標準偏差を表す。
【００５８】
［実施例８］ポリペプチド結合パートナーが小分子である場合の、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルの構築
アミノ官能化ノボビオシンの合成。ＤＭＦに溶解したノボビオシンをＫ２ＣＯ３および２−（Ｂｏｃ−アミノ）エチルブロミドと還流下に一夜反応させることにより、ノボビオシンをアミノ基で官能化する。反応混合物を減圧濃縮し、残留物を酢酸を伴うジクロロメタンに溶解し、カラムクロマトグラフィーで精製する。アミノ基の脱保護のため、このＢｏｃ−保護化合物をジクロロメタン中の５０％ＴＦＡに溶解する。溶媒および酸を蒸発させる。
【００５９】
（アミノ反応性ポリマーの合成）レドックス開始剤としてＡＩＢＮを使用し、アクリルオキシスクシンイミドをＴＨＦ中のアクリルアミド（モル比１：４）で共重合させる。得られたポリマー（ｐＡＡｍ−スクシンイミド）を沈殿させ減圧乾燥する。
【００６０】
（ポリマーへのアミノ官能化ノボビオシンのカップリング）アミノ官能化ノボビオシンをＰＢＳ（ｐＨ８．０）中のｐＡＡｍ−スクシンイミド（ＮＨ２−ノボビオシン：スクシンイミド＝１．５：１、mol/mol）と混合し、室温で一夜反応させる。得られたポリマーを水に対して透析し（ＭＷカットオフ：３５００Da）、凍結乾燥する。
【００６１】
（ヒドロゲルの構築）ＰＢＳに溶解したノボビオシン官能化ポリアクリルアミドをヘキサヒスチジン標識したＧｙｒＢおよびポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）と混合し、ゲル化を導く。このポリマーをＰＢＳ中で一夜膨潤させる。このヒドロゲルに漸増濃度のノボビオシンを添加すると、ゲルの用量依存的溶解がもたらされる。
【００６２】
［実施例９］ポリペプチド結合パートナーが核酸である場合の、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルの構築
（ＤＮＡ官能化ポリマーの合成）センスおよびアンチセンスの向きのｔｅｔＯオペレーターをコードしているオリゴヌクレオチドを合成するが、ここでは、第一オリゴはその５’末端（ＮＨ２）にアミノ基をさらに含んでいる。両方のオリゴ鎖をアニーリングし、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に溶解し、スクシンイミド官能化ポリアクリルアミドと混合し（実施例８を参照されたい）、一夜インキュベートする。得られたＤＮＡ官能化ポリマーを限外濾過に付し（ＭＷカットオフ５０００Da）、最後にＰＢＳに溶解する。
【００６３】
（ヘキサヒスチジン標識したＴｅｔＲの生成）テトラサイクリンリプレッサーＴｅｔＲのコード配列をヘキサヒスチジンタグと融合させ、ＩＰＴＧ誘導によりＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳで発現させる。この蛋白をＮｉ２＋アフィニティクロマトグラフィーで精製する。
【００６４】
（ヒドロゲルの構築）ｔｅｔＯ官能化ポリマーをヘキサヒスチジン標識したＴｅｔＲと混合し、その後ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）を添加する。ヒドロゲルが生成するがこれは、Ｍｇ２＋の存在下でテトラサイクリン抗生物質の添加により溶解し得る。
【００６５】
［実施例１０］ポリペプチド結合パートナーが第二ポリペプチドである場合の、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルの構築
第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーはＦＭ（Ｆ３６Ｍ突然変異を有するＦＫＢＰ）である。ＦＭをコードしているポリ核酸の３’末端を、６個のヒスチジン残基をコードしているポリ核酸に融合させる。この構築物をＴ７プロモーターの調節下にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊で発現させる。細胞を遠心分離によって収穫し、フレンチプレス中で溶解し、細胞残屑を遠心分離で取り除く。清澄化した溶解液を、ヘキサヒスチジン標識したＦＭのアフィニティ精製のため、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムを通過させる。３００mMイミダゾール含有緩衝液を用いてＦＭを溶出させ、緩衝液を限外濾過によりＰＢＳに交換する。ＦＭを限外濾過により５０mg/mlに濃縮する。精製および濃縮したＦＭをポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）（ＰＢＳ中６％ｗ／ｖ溶液。ＦＭ ７５０μgあたりポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ ）１０μl）と混合する。直ちにヒドロゲルが生成するのでこれを加湿雰囲気下に４℃で２０時間インキュベートし、その後このヒドロゲルをＰＢＳ中で１２時間インキュベートする。トリガーにより誘発され得るヒドロゲルの溶解を調べるため、異なる濃度のＦＫ５０６またはラパログ存在下にＰＢＳ中でゲルをインキュベートし、溶解を、光学的に（GelJet Imager 2004, Intas, Gottingen, Germany）、そしてブラッドフォード法を用いる緩衝液中へのＦＭ放出の定量により、監視する。
【００６６】
［実施例１１］さらなる架橋を含む、ＦＭに基づくヒドロゲルの構築
ＦＭ蛋白を共有結合によりさらに安定化する以外は実施例１０の記載に従ってヒドロゲルを構築する。したがって、濃縮したＦＭ溶液をＦＭ１モルあたりスベルイミド酸ジメチル４モルの存在下に室温で３０分間インキュベートし、その後ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）と混合する。このヒドロゲルは細胞培養基中で増大した安定性を示す。
【００６７】
［実施例１２］ポリエチレングリコールおよびＧｙｒＢに基づくヒドロゲルの構築
このヒドロゲルは、クーママイシンにより二量体化されたＧｙｒＢとカップリングさせた８腕（eight-arm）ポリエチレングリコールからなる。場合により、ＧｙｒＢをスベルイミド酸ジメチルによりさらに架橋することができる。したがって、プライマー５’−ｇｇｔａｃｔｔｇｃａｃａｔａｔｇｔｃｇａａｔｔｃｔｔａｔｇａｃｔｃｃｔｃｃａｇｔａｔｃ−３’および５’−ｃｃａｇｔｔａｃａａｇｃｔｔＴＣＡＧＣＡａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇＧＣＣＴＴＣＡＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＣＴＴＣ−３’を用いてｇｙｒＢ遺伝子を増幅し、それをＮｄｅｌ／ＨｉｎｄIIIでｐＷＷ３０１中にクローニングすることにより、Ｃ末端システインを組み込んだＧｙｒＢを構築する。ＧｙｒＢ−Ｃｙｓ蛋白を、実施例１に記載のＧｙｒＢの手順に従って産生させる。先の手順に従い、ＴＣＥＰ（トリスカルボキシエチルホスフィン）を用いてＧｙｒＢ−Ｃｙｓを還元し、８個の末端ビニルスルホン基を有する８腕（8-arm）ＰＥＧにカップリングさせる（Rizzi S.C. and Hubbell J.A., Biomacromolecules 6, 1226-1238, 2005）。ＰＥＧ−カップリングしたＧｙｒＢを、非結合ＧｙｒＢ−Ｃｙｓを取り除くため１００kDa分子量カットオフを用いて還元条件（１mM ＤＴＴ）下にＰＢＳに対して透析する。ＰＥＧ−カップリングしたＧｙｒＢ−Ｃｙｓを８０mg/mlに濃縮し、クーママイシン（ＤＭＳＯ中５０mg/ml保存溶液。１molクーママイシン／２mol ＧｙｒＢ）と混合する。生成するヒドロゲルを湿潤雰囲気下で２４時間インキュベートする。
【００６８】
［実施例１３］さらなる架橋を含むＰＥＧに基づくヒドロゲルの構築
ＰＥＧ−カップリングしたＧｙｒＢ溶液をスベルイミド酸ジメチル（ＤＭＳ、ＧｙｒＢ１molあたりＤＭＳ３mol）と共に室温で３０分間インキュベートし、その後クーママイシンを添加する以外は実施例１２の記載と同様にしてヒドロゲルを構築する。得られたヒドロゲルは、緩衝液中で実施例１２由来のヒドロゲルよりも高い安定性を示す。ブラッドフォード法を用いて膨潤緩衝液中に放出される蛋白を測定することにより定量すると、ノボビオシンの添加はヒドロゲルの溶解を誘発する。
【００６９】
［実施例１４］ＶＥＧＦを組み込んだ、ＰＥＧに基づくヒドロゲル
ＧｙｒＢにＶＥＧＦ（実施例２に従って生成）を添加した後８腕ＰＥＧ（モル比ＶＥＧＦ：ＧｙｒＢ＝１：２４）にカップリングさせる以外は実施例１３の記載と同様にしてヒドロゲルを構築する。ＥＬＩＳＡで定量したところ、ヒドロゲルへのノボビオシン添加は緩衝液中へのＶＥＧＦの用量依存的放出をもたらす。
【００７０】
［実施例１５］ポリアクリルアミドに共有結合させたＦＭに基づくヒドロゲルの構築
実施例１０の記載に従いＦＭ蛋白を生成し、５０mg/mlに濃縮する。モル比ＦＭ：ＰＥＧ＝２：１のスクシンミド官能化線状ＰＥＧ（ＭＷ＝５０００g/mol）を用いて室温で３０分間ＦＭをペグ化する。続いてペグ化ＦＭをアクリルオキシスクシンイミド（モル比：アクリルオキシスクシンイミド：ＦＭ＝２：１）にカップリングし、アクリルアミド（モル比：ＦＭ：アクリルアミド＝１：１００）と混合し、ＡＰＳ（３．６μg/mg ＦＭ）およびＴＥＭＥＤ（０．０２μl/mg ＦＭ）を添加して室温で一夜重合する。得られたヒドロゲルをＰＢＳ中で平衡化する。重量分析および光学的分析により監視したところ、ＦＫ５０６の添加はヒドロゲルの膨潤をもたらす。
【００７１】
［実施例１６］ポリペプチド結合パートナーが小分子である場合の、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルの構築
（ＦＫＢＰ結合分子の合成）（Ｓ）−ペンチルオキシ−５−（Ｎ’−［４−（２−フェノキシ−エチルアミン）］−ベンズアミジル）−Ｎ−［２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル］］プロリンを、Siegal G., Overhand M. et al., Chem Med Chem 2, 1054-1070, 2007の手順を以下のように適合させて合成する：
【００７２】
（４−アセトキシ−Ｎ−［４−（ヒドロキシ）フェニル］ベンズアミド（１））ｐ−アセトキシ安息香酸（１当量）の塩化チオニル（５当量）溶液に触媒量（数滴）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加え、溶液を９０分間加熱還流する。混合物を室温に冷却し、過剰の塩化チオニルを減圧下に除去して、淡黄色油状物の酸塩化物を得る。この酸塩化物をＤＭＦに溶解し、ＤＭＦ中のｐ−アミノフェノール（３当量）および触媒量の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の溶液に０℃で徐々に加える。撹拌を１時間継続し、その後溶液を、ＥｔＯＡｃと共に２Ｌの分液漏斗に移す。混合物を２Ｍ ＨＣｌで３回、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３で１回、そしてブラインで１回洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮する。白色固体の化合物１が得られる。
【００７３】
（４−アセトキシ−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド（２））ＤＭＦ中の化合物１およびＫ２ＣＯ３（２当量）の溶液にＢｏｃ−アミノエチルブロミド（１．２５当量）を加える。反応混合物を１２０℃で一夜撹拌する。溶媒を減圧留去し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｍ ＫＨＳＯ４およびブラインで洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００７４】
（４−ヒドロキシ−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド（３））ＮａＯＥｔ（１当量）を２（１当量）のエタノール溶液に室温で添加し、この溶液を、ＴＬＣがアセチル基の完全除去を示すまで（〜１時間）撹拌する。溶液を２Ｍ ＨＣｌを添加して中和し、エタノールを減圧留去する。得られた懸濁液をＥｔＯＡｃおよび水（４：１ｖ／ｖ）に溶解し、分液漏斗に移す。有機層を分離し、２Ｍ ＨＣｌで１回、１Ｍ ＮａＨＣＯ３で２回、そしてブラインで１回洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製すると化合物３が得られる。
【００７５】
（４−（５−（ベンジルオキシ）ペンチルオキシ）−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド（４））ＴＨＦ中の化合物３（１当量）、５−（ベンジルオキシ）ペンタン−１−オール（２当量）、およびＰＰｈ３（２当量）の溶液に、アゾジカルボン酸ジエチル（２当量、トルエン中４０％）を０℃で１０分間かけて添加する。３０分後に冷却浴を取り除き、溶液を室温で１６時間攪拌する。溶媒を減圧濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００７６】
（４−（５−（ヒドロキシ）ペンチルオキシ）−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド（５））化合物４をＥｔＯＡｃおよびＥｔＯＨ（１：１ｖ／ｖ）の混合液に溶解し、アルゴン気流を２分間通気することによりこの溶液を脱気する。次いでＰｄ／Ｃ（活性炭上１０ｗｔ％Ｐｄ）を加え、フラスコに二重マントル水素バルーンを取り付け、懸濁液を室温で１６時間攪拌する。ハイフロで濾過することにより触媒を除去し、混合物を減圧濃縮すると、脱保護された化合物が高純度で得られる。
【００７７】
（（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル）プロリン（６））ジクロロメタン中の、２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）酢酸（１．５当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（２当量）、ＤＩＰＥＡ（３mmol）および触媒量のＤＭＡＰの溶液に、Ｌ−プロリンｔｅｒｔ−ブチルエステル（１当量）を０℃で加える。３０分後、混合物を室温まで温め、撹拌を１６時間継続する。混合物を減圧濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して６を得る。
【００７８】
（Ｎ−（２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル）プロリン（７））６のジクロロメタン溶液に室温でＴＦＡを加える。この溶液を、ＴＬＣがｔｅｒｔ−ブチル基の完全除去を示すまで（〜８時間）撹拌する。１Ｍ ＮａＨＣＯ３を１０分間かけて室温で徐々に加える。気体の発生が止んだ後、混合物をＥｔＯＡｃと共に分液漏斗に移す。有機層を廃棄し、水層を２Ｍ ＨＣｌで注意深く酸性化する。水層をＥｔＯＡｃで２回抽出し、続いて有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮する。カラムクロマトグラフィーにより７が得られる。
【００７９】
（（Ｓ）−ペンチルオキシ−５−（Ｎ’−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミジル）−Ｎ−［２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル）］プロリン（８））無水ジクロロメタン中の、酸７（１．２当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１．５当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．２当量）および触媒量のＤＭＡＰの溶液に、４−（５−（ヒドロキシ）ペンチルオキシ）−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド ５（１当量）を０℃で加える。３０分後、混合物を室温まで温め、撹拌を１６時間継続する。混合物を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製すると化合物８が得られる。
【００８０】
（（Ｓ）−ペンチルオキシ−５−（Ｎ’−［４−（２−フェノキシ−エチルアミン）］ベンズアミジル）−Ｎ−［２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル）］プロリン（９））脱保護しようとする化合物８のジクロロメタン溶液に、ＴＦＡ（１０mmol）を室温で加え、溶液を２時間攪拌する（ＴＬＣ調節）。１Ｍ ＮａＨＣＯ３を１０分間かけて室温で徐々に加える。気体の発生が止んだ後、混合物をＥｔＯＡｃと共に分液漏斗に移す。有機層を１Ｍ ＮａＨＣＯ３で１回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。有機層を減圧濃縮する。所望化合物９をカラムクロマトグラフィーにより精製する。
【００８１】
（アミン反応性ポリマーの合成）レドックス開始剤としてＡＩＢＮを使用し、アクリルオキシスクシンイミドをＴＨＦ中のアクリルアミド（モル比１：４）で共重合させる。得られたポリマー（ｐＡＡｍ−スクシンイミド）を沈殿させ減圧乾燥する。
【００８２】
（ポリマーへのアミノ含有ＦＫＢＰ結合分子のカップリング）化合物９をＰＢＳ（ｐＨ８．０）中のｐＡＡＭ−スクシンイミド（化合物９：スクシンイミド＝１．５：１、mol/mol）と混合し、室温で一夜反応させる。得られたポリマーを水に対して透析し（ＭＷカットオフ：３５００Da）、凍結乾燥する。
【００８３】
（ヒドロゲルの構築）ＰＢＳに溶解したＦＫ５０６アナログ官能化ポリアクリルアミドをヘキサヒスチジン標識したＦＫＢＰおよびポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）と混合し、ゲル化を導く。ポリマーをＰＢＳ中で一夜膨潤させる。このヒドロゲルに漸増濃度のＦＫ５０６を添加すると、ゲルの用量依存的溶解がもたらされる。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【図２（ａ）】
【図２（ｂ）】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー、ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含み、当該ポリペプチドとその結合パートナーの間の相互作用が第三の化合物により調節され得る、ヒドロゲルに関する。このヒドロゲルは、薬物デリバリーにおいて特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
温度、光、カルシウム、抗原、ＤＮＡおよび特異的酵素に応答する刺激感知性ヒドロゲルは、体内の薬物デリバリーのためのスマート材料として（Kopecek J., Eur J Pharm Sci 20, 1-16, 2003に論評されている）、または組織工学のために（Lutolf M. P. and Hubbell J. A., Nat Biotechnol 23, 47-55, 2005）、または、微小流体への応用における（ナノ）バルブとして（Beebe D. J. et al., Nature 404, 588-90, 000）有望である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような材料は一般にトリガーに応答するが、物理的刺激（例えば、光、温度）または分子ベースの刺激の場合には、生理的バックグラウンドでは殆ど達成不能な刺激濃度であるため（例えば、ｇ／ｌ領域の抗体濃度）、患者のバックグラウンドにおける適用が困難である。対照的に、医薬用物質の作用様式は生理的限界内で起こるように設計されており、故に、薬理学的作用様式に基づくヒドロゲルは、将来の治療応用に対して高いコンプライアンスを示すと予想される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ポリマー、第一のポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルに関し、ここでこのポリペプチド結合パートナーは、第二のポリペプチド、核酸または小分子であり、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用は、非共有結合性であり、調節化合物の添加または除去により調節される。
【０００５】
特に本発明は、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーがポリマーに結合し、そして第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用がヒドロゲルを安定化させるようなヒドロゲルに関するものである。
【０００６】
特に本発明は、第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーがポリマーに共有結合している、または、強い特異的な非共有結合によりポリマーに結合しているヒドロゲルに関する。
【０００７】
第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合でき、そして対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが各々目的化合物、例えば薬物に結合することができる。あるいは、目的化合物がヒドロゲルに物理的に捕捉され、またはポリマーに結合してヒドロゲルを形成することもある。
【０００８】
第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用は、調節化合物の添加または除去により切断される。
【０００９】
さらに本発明は、ヒドロゲル［ここで、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合し、そして対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが各々薬物に結合している］を含み、そしてさらに、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物を含む、薬物デリバリー系に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、ヒドロゲル［ここで、第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーは、ポリマーに結合しており、そして、薬物は、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化されたヒドロゲル構造に物理的に捕捉されている］を含み、そしてさらに、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断し、それによりヒドロゲル構造を緩め、前記薬物を放出させる化合物を含む、薬物デリバリー系に関する。この原則のバリエーションでは、薬物はポリマーに結合してヒドロゲルを形成できる。第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物を添加すると、ヒドロゲルは崩壊し、薬物−ポリマー複合体が放出される。
【００１１】
したがって、本発明はさらに、それを必要とする患者に薬物をデリバリーする方法に関し、ヒドロゲルが患者に投与され［ここで、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合し、対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが各々該薬物に結合している］、そして、ヒドロゲルが目的の作用部位に到達した後に、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物が投与される。
【００１２】
さらに、本発明は、それを必要とする患者に薬物をデリバリーする方法に関し、この方法においては、ヒドロゲルが患者に投与され［ここで、第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーがポリマーに結合し、薬物がヒドロゲル構造に物理的に捕捉され、またはポリマーに結合して、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化されたヒドロゲル構造を形成している］、そして、ヒドロゲルが目的の作用部位に到達した後に、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物が投与され、それによりヒドロゲル構造が緩み、該薬物、またはポリマーに結合した薬物がそれぞれ放出される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】薬理学的に誘発されるヒドロゲル：（ａ）ポリアクリルアミド骨格にカップリングさせた細菌性ジャイレースサブユニットＢ（ＧｙｒＢ）をクーママイシン（＋Ｃ）により二量体化して、ヒドロゲルのゲル化を導く。ノボビオシン（＋Ｎ）の存在下でＧｙｒＢが解離し、ヒドロゲルの溶解が導かれる。（ｂ）ポリアクリルアミド骨格への蛋白のカップリング。Ｎｉ２＋イオンをキレート化するニトリロ三酢酸でポリアクリルアミドを官能化し、これにヘキサヒスチジン配列を介してＧｙｒＢが結合できる。
【図２】薬理学的に調節されるヒドロゲルの設計：（ａ）抗生物質依存性ヒドロゲルの生成。ヘキサヒスチジンで標識されたＧｙｒＢを、クーママイシン（＋Ｃ、ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１、mol/mol）、ノボビオシン（＋Ｎ、ＧｙｒＢ：ノボビオシン＝１：１０、mol/mol）の存在下で、または抗生物質不在下で（ｗ／ｏ）インキュベートする。ＧｙｒＢ複合体をＮｉ２＋−帯電したポリ（ＡＡＭ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）と混合し、得られた粘稠な構造をＰＢＳ中で１２時間インキュベートした後、緩衝液中に放出されたＧｙｒＢ蛋白を定量する。（ｂ）ＧｙｒＢ二量体化特異的ヒドロゲル。ＧｙｒＢをクーママイシン（ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１）で二量体化し、ＧｙｒＢ二量体を共有結合的に安定化させるためのアミン特異的二官能性架橋剤スベルイミド酸ジメチルの存在下（＋ＤＭＳ）または不在下（−ＤＭＳ）で、さらにインキュベートする。ＧｙｒＢ二量体をＮｉ２＋−帯電したポリ（ＡＡＭ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）と混合し、ヒドロゲルの生成を導く。ＰＢＳ中で一夜膨潤させた後、このヒドロゲルを、ノボビオシン１mMを含有するＰＢＳに入れ、緩衝液中に放出されたＧｙｒＢ蛋白を定量することによりポリマーの溶解を監視する。
【図３】調節可能な、薬理学的に誘発されるヒドロゲルの崩壊：異なる濃度のノボビオシン（０〜１mM）の存在下でヒドロゲルをＰＢＳ中でインキュベートし、ヒドロゲルの崩壊を、緩衝液中に放出されるＧｙｒＢの定量によって測定する。
【図４】ヒト血管内皮成長因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）の放出：ＶＥＧＦ１２１をヒドロゲルに組み込み、漸増濃度のノボビオシン存在下にインキュベートする。緩衝液中へのＶＥＧＦ１２１の放出を経時的に追跡する。
【図５】ノボビオシンの誘発するヒドロゲルの膨潤：ポリマーサイズの変化を監視しながら、部分的に化学的に架橋したＧｙｒＢ単位を組み込んだヒドロゲルをノボビオシン１mMの存在下または不在下にインキュベートする。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルに関し、ここで、このポリペプチド結合パートナーは、第二のポリペプチド、核酸または小分子であり、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用は、非共有結合性であり、調節化合物の添加または除去により調節される。
【００１５】
好適なポリマーは、例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリ−ジメチル−ジアリル−アンモニウムクロリドおよびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミドのようなポリビニル型ポリマー、フィブリン、コラーゲンおよびポリ−Ｌ−リジンのようなポリペプチド、ならびに、アルギン酸塩、場合により修飾されていてもよいセルロース類、例えばセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デキストランおよびデンプンのようなポリ炭水化物である。好ましいポリマーは、例えばポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドおよびフィブリンである。ポリマーとして最も好ましいのはポリエチレングリコールである。好適なポリマーは、例えば溶解性を微調整するために、さらなるポリマー化合物との反応により修飾することができる。
【００１６】
本明細書で使用する「調節化合物」とは、生理的条件下で第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の非共有結合性相互作用を壊すまたは惹起する化合物である。ポリペプチドの三次および二次構造を破壊する蛋白変性化合物、例えば、無機塩および酸、有機溶媒、例えばメタノール、エタノールまたはアセトン、有機酸、例えば酢酸、トリクロロ酢酸、ピクリン酸またはスルホサリチル酸、カオトロピック剤、例えば尿素またはグアニジニウム塩、ジスルフィド結合還元剤、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトールまたはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ならびに関連化合物は、本発明の意義における調節化合物とはみなさないと理解される。本発明の意義における「生理的条件」下において、この化合物は、１mg/mlを下回る濃度で第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の非共有結合性相互作用を壊すまたは惹起すると理解される。
【００１７】
ポリペプチド結合パートナーが第二のポリペプチドである場合、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの対は、例えば、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ（ジャイレースサブユニットＢ）、ＦＫＢＰ−ＦＲＢ（ＦＫ結合蛋白−脂質キナーゼ蛋白類似体ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ−ラパマイシン関連蛋白）のドメイン（ＦＲＢ））、ＦＭ−ＦＭ（ＦＫ結合蛋白のＦ３６Ｍ突然変異）、ＴｏｘＴ−ＴｏｘＴ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＴｏｘＴ蛋白）、ＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＦＫＢＰ−ＦＫＢＰ（ＦＫ結合蛋白）、ＦＫＢＰ−Ｃｙｐ（ＦＫ結合蛋白−シクロフィリン）およびＣｙｐ−Ｃｙｐ（シクロフィリン）である。第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーは、上記ポリペプチドのホモ多量体または上記ポリペプチドのうち少なくとも２つの間のヘテロ多量体であってもよい。第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーはまた、溶解性に影響を与え、凝集を防止するために、さらなるポリマー、例えばポリエチレングリコールまたはポリアクリルアミドと共有結合していてもよい。添加または除去のいずれかによってポリペプチド間の相互作用に影響を与える、対応する調節化合物は、例えば、クマリン抗生物質（ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢに対して）、ラパマイシンまたはＦＫ５０６および誘導体（例えばラパログ類、ｍＴＯＲインヒビター）（ＦＫＢＰ−ＦＲＢおよびＦＭに対して）、シクロスポリンおよび誘導体（Ｃｙｐに対して）、ＦＫ５０６（ＦＫＢＰ−ＦＲＢおよびＦＭに対して）、ヴィルトスタチン（ＴｏｘＴに対して）、ならびにメトトレキサートおよびその誘導体（例えば抗葉酸剤）（ＤＨＦＲ−ＤＨＦＲに対して）である。調節化合物として好ましいのは、小有機化合物、例えば分子量が１００〜５０００、特に１００〜２０００の化合物である。
【００１８】
特別な例において、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーは、二量体を形成する傾向がある同一化合物である。このような二量体形成ポリペプチドの具体例は、ＧｙｒＢ、ＦＭ、ＴｏｘＴ、ＦＫＢＰおよびＤＨＦＲである。こうした二量体形成ポリペプチドを含むヒドロゲルは、二量体形成を誘導する化合物をさらに含むことがある。例えば、そのような二量体化を誘導する化合物は、クマリン抗生物質、ラパマイシンおよび誘導体、ヴィルトスタチン、ＦＫ１０１２、ならびにメトトレキサートおよびその誘導体である。この二量体形成化合物は、上記または下記に開示する調節化合物の定義に該当し得る。あるいは、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用に影響を与える調節化合物は、二量体形成化合物の活性を中和する調節化合物であってもよく、この中和によって二量体形成ポリペプチドの相互作用の実質的低下が導かれる。二量体形成効果を中和する化合物は、例えば、実質的に過剰に使用された場合の、二量体形成化合物として上述したものと同じ化合物、または、好ましくは同じクラスの二量体形成化合物のうちでも別の異なる代表化合物、例えば、クマリン抗生物質、ラパマイシンおよび誘導体、ならびにメトトレキサート、抗葉酸剤およびその誘導体のクラス、ならびにＦＫ５０６である。
【００１９】
ポリペプチド結合パートナーが核酸である場合、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの対は、例えば、Ｅ−ＥＴＲ（Ｅ．ｃｏｌｉのＭｐｈＲ（Ａ）蛋白およびそのオペレーターＥＴＲ）、ＰＩＰ−ＰＩＲ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓのＰＩＰ蛋白およびそのオペレーターＰＩＲ）、ＴｅｔＲ−ｔｅｔＯ（Ｔｎ１０から誘導されるテトラサイクリンリプレッサーＴｅｔＲおよびそのオペレーターｔｅｔＯ）、ＡｒｇＲ−ａｒｇＯ（アルギニン応答性リプレッサーおよびそのオペレーターａｒｇＯ）、ＡｒｓＲ−ａｒｓＯ（砒素応答性リプレッサーおよびそのオペレーターａｒｓＯ）、およびＨｕｃＲ−ｈｕｃＯ（尿酸応答性リプレッサーおよびそのオペレーターｈｕｃＯ）である。その他のこのような対は、Ramos J. L.等（Microbiol Mol Biol Rev 69, 326-56, 2005）、Martinez-Bueno M.等（Bioinformatics 20, 2787-91, 2004）の記載したもの、およびデータベースＢａｃＴレギュレーター（http://www.bactregulators,org/）に列挙されたものである。添加または除去のいずれかによってポリペプチド間相互作用に影響を与える、対応する調節化合物は、例えば、マクロライド抗生物質（Ｅ−ＥＴＲに対して）、ストレプトグラミン抗生物質（ＰＩＰ−ＰＩＲに対して）、テトラサイクリン抗生物質（ＴｅｔＲ−ｔｅｔＯに対して）、アルギニン（ＡｒｇＲ−ａｒｇＯに対して）、重金属（ＡｒｓＲ−ａｒｓＯに対して）、および尿酸（ＨｕｃＲ−ｈｕｃＯに対して）である。
【００２０】
ポリペプチド結合パートナーが小分子である場合、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの対は、例えば、ＧｙｒＢ−クマリン抗生物質、ＦＫＢＰ−ｍＴＯＲインヒビター、ＦＲＢ−ｍＴＯＲインヒビター、ＦＭ−ｍＴＯＲインヒビター、Ｃｙｐ−シクロスポリン、Ｃｙｐ−アスコマイシン、ＤＨＦＲ−抗葉酸剤、ストレプトアビジン−ビオチンアナログ、アビジン−ビオチンアナログ、ニュートラアビジン−ビオチンアナログ、ステロイドホルモンレセプター−ステロイドホルモンおよびそのアナログ、ならびにＴｏｘＴ−ヴィルスタチンである。
【００２１】
ポリペプチド結合パートナーが小分子である場合、そのポリペプチド結合パートナーは好ましくは＜５０００g/mol、特に１００〜５０００g/molの分子量を有する。
【００２２】
クマリンおよびアミノクマリン抗生物質には、例えばノボビオシン、クロロビオシン、クーママイシンおよびジヒドロノボビオシンがある。
【００２３】
シクロスポリンまたはアスコマイシンは、例えば、シクロスポリンＡ（NEORAL(登録商標)）、ＩＳＡｔｘ−２４７、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ＦＫ７７８、ＡＢＴ−２８１またはＡＳＭ９８１であってよい。
【００２４】
ｍＴＯＲインヒビターは、例えば、ラパマイシンまたはその誘導体、例えばシロリムス（RAPAMUNE(登録商標)）、デフォロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス、エベロリムス（Certican(登録商標)）、ＣＣ１７７９、ＡＢＴ５７８、バイオリムス−７、バイオリムス−９、ラパログ、例えばＡＰ２３５７３、アザチオプリン、カンプト１Ｈ、Ｓ１Ｐレセプターモジュレーター、例えばＦＴＹ７２０、またはその類似体であってよい。
【００２５】
ラパログは、特に、ラパマイシンに関する以下の修飾のうち１以上を有するラパマイシンの変異体を包含している：Ｃ７、Ｃ４２および／またはＣ２９位のメトキシ基の脱メチル化、脱離もしくは置換；Ｃ１３、Ｃ４３および／またはＣ２８位のヒドロキシ基の脱離、誘導体化もしくは置換；Ｃ１４、Ｃ２４および／またはＣ３０位のケトン官能基の還元、脱離もしくは誘導体化；六員ピペコラート環の五員プロリニル環による置換；ならびにシクロヘキシル環上の別の置換基による置換またはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環による置換。考え得るさらなる修飾は、米国特許第５５２５６１０；５３１０９０３および５３６２７１８号ならびに米国特許第５５２７９０７号の、背景技術の項に提示されている。さらにＣ２８ヒドロキシ基の選択的エピマー化が考えられている（ＷＯ０１／１４３８７）。ＷＯ０３／０６４３８３号およびＷＯ０５／１６２５２号に記載されるような、種々のリン含有部分を含むラパマイシン類似体の使用がさらに考えられる。考えられるその他のラパログは、米国特許第６９８４６３５号、米国特許第６６４９５９５号および米国特許第７０９１２１３号に記載されている。
【００２６】
抗葉酸剤には例えば、メトトレキサート、トリメトプリムのようなＤＨＦＲに結合する化合物、ブロジモプリムおよびエピロプリム、またはイクラプリムのようなジアミノピリミジン類がある。考えられるその他のＤＨＦＲインヒビターは、Hawser S. et al., Biochemical Pharmacology 71, 941-948, 2006に記載されているインヒビターである。
【００２７】
ビオチンアナログには、例えばストレプトアビジン、ニュートラアビジンもしくはアビジンに結合する化合物、例えばビオチン、ＨＡＢＡ、デスチオビオチン、イミノビオチンまたはジアミノビオチンがある。
【００２８】
上記の小分子ポリペプチド結合パートナーは、ポリマーまたはその他の目的化合物との結合に好適な誘導体化に付すことができる。そのような誘導体化には、アミン、アミド、チオール、ヒドロキシ、アルデヒド、アジド、アルキン、ケトン、エポキシドまたはカルボキシ官能性の導入がある。
【００２９】
特に好ましい第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの対は、対応する調節化合物アミノクマリン抗生物質（例えばＧｙｒＢ−ＧｙｒＢに対するクーママイシンおよびノボビオシン）、ラパマイシン、ＦＫ５０６およびその誘導体ＡＰ２１９９８およびＡＰ２２５４２（ＦＭ−ＦＭおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢに対して）と共に、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ、ＦＭ−ＦＭおよびＦＫＢＰ−ＦＲＢの組み合わせである。
【００３０】
最も好ましいのはＧｙｒＢ−ＧｙｒＢおよびＦＭ−ＦＭである。
【００３１】
特に本発明は、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーがポリマーに結合しており、そして、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用がヒドロゲルを安定化するようなヒドロゲルに関する。例えば、ＧｙｒＢおよびクーママイシンの組み合わせは、ポリマーの安定化のために特に有用である。
【００３２】
特に本発明は、第一ポリペプチドおよび／またはポリペプチド結合パートナーがポリマーに共有結合している、または、強い特異的な非共有結合によりポリマーに結合している、ヒドロゲルに関する。本発明の意義における強い非共有結合とは、生理的条件下で１０−５Ｍを下回る解離定数を有する結合である。ポリペプチドおよびその結合パートナーは、特異的リンカーによって、例えばＮＴＡのようなキレート形成物質および多価金属イオンとのポリヒスチジン結合、ペプチド結合、マレイミドまたはビニルスルホンに結合したチオール、ハロタグ（Los G. V. et al., Methods Mol Biol. 356, 195-208, 2007）、ＳＮＡＰ−タグまたはＣＬＩＰ−タグ（Gautier A. et al., Chem Biol. 15, 128-36, 2008）によって、または、トランスグルタミナーゼ反応結合（Ehrbar M. et al., Biomaterials 29, 1720-9, 2008）によってポリマーに結合できる。このようなヒドロゲルは通常、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーをポリマー骨格に結合させ、両方の反応生成物を混合し、そして第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーが互いに相互作用するように調節化合物の濃度を変化させ、それによりヒドロゲルを形成させることによって製造する。調節化合物の濃度を変化させるか、または第一調節化合物の効果を中和する第二調節化合物を添加すると、その剛直な構造が壊れ、ヒドロゲルは実質的により剛直でない構造、例えばヒドロゾルに戻る。
【００３３】
ヒドロゲルをさらに安定化するため、ポリマー骨格を化学的に架橋することにより、またはポリペプチド結合パートナーで第一ポリペプチドを架橋することにより、さらなる架橋を導入することができる。好適な架橋剤はBioconjugate Techniques（2nd Edition by Greg T. Hermanson, Academic Press, 2008）に記載のような、別の分子に結合するための少なくとも２個の部位を示す任意のホモまたはヘテロ官能性化合物である。
【００３４】
加えて、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含む半相互侵入網目構造ポリマーネットワーク（セミ−ＩＰＮ。少なくとも１つのポリマーが架橋し、少なくとも１つのポリマーが架橋していない、２以上のポリマーのポリマーネットワークの意。例えばMiyata T. et al., Nature 399, 766-769, 1999に記載されている）もまた同様に本発明の範囲内にある。
【００３５】
第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれがポリマーに結合してもよく、それぞれ対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが、目的化合物、例えば薬物に結合できる。
【００３６】
目的化合物は、ヒドロゲルが埋め込まれた宿主に有益な効果をもたらす任意の物質である。
【００３７】
薬物は、細胞増殖抑制性および細胞毒性薬物、抗生物質、抗ウイルス薬、抗炎症薬、生長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、鎮痛薬、ｓｉＲＮＡのようなポリ核酸、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡおよびウイルス粒子といったクラスから選択される任意の薬物であってよい。好ましい薬物は、ポリペプチド型薬物のような経口投与できない薬物である。
【００３８】
特に該薬物は、その可能性を十分に発揮するために、まず作用部位に運搬されねばならない。例にはモノクローナル抗体、生長因子およびサイトカインがある。
【００３９】
該薬物は、ヒドロゲル構造に物理的に捕捉されるか、またはヒドロゲルを形成するポリマーに結合でき、調節化合物の添加または除去によりヒドロゲルの溶解または膨潤が誘発され、ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化されたヒドロゲル構造が壊されることにより、薬物がそれぞれ遊離薬物または薬物−ポリマー複合体として放出され得る。あるいは、該薬物がポリペプチド結合パートナーに結合し、一方このポリペプチド結合パートナーはヒドロゲル内で第一ポリペプチドに結合する。調節化合物の添加または除去が第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断し、それにより、ポリペプチド結合パートナーに結合した薬物を遊離させる。薬物が第一ポリペプチドに結合し、ポリペプチド結合パートナーがヒドロゲルに固定化されている逆の形態もまた本発明の範囲内にある。
【００４０】
さらに本発明は、ヒドロゲル［ここで、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合し、対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが各々薬物に結合している］を含み、そしてさらに、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物をも含む、薬物デリバリー系に関する。
【００４１】
こうした薬物デリバリー系の好ましい構成要素は、好ましいものとして上に述べたヒドロゲル、例えば、好ましいポリマー、第一ポリペプチドおよびそのポリペプチド結合パートナーの好ましい組み合わせ、そしてさらに、適切に適合させた好ましい調節化合物を含むヒドロゲルである。このようなヒドロゲルが好ましく使用される特別の状況は、例えばその薬物が反復して、または長期間投与されねばならない場合である。例えば、ヒドロゲルを特定の作用部位に注射で適用し、調節化合物を経口適用すると、ヒドロゲルが注射された部位に調節化合物が拡散し、その結果、調節化合物がヒドロゲルの性質（膨潤または溶解）および薬物の遊離を調節する。あるいは、ヒドロゲルを、尿酸のような内因性調節化合物に応答するように設計すると、その結果、一定の生理的濃度の前記内因性化合物がゲルの性質を改変し、内蔵された薬物の遊離を調節するであろう。
【００４２】
したがって本発明はさらに、それを必要とする患者に薬物をデリバリーする方法に関し、この場合、ヒドロゲルが患者に投与され、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーのいずれかがポリマーに結合し、各々対応するポリペプチド結合パートナーまたは第一ポリペプチドが該薬物に結合し、そしてヒドロゲルが目的の作用部位に到達した後に、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物が投与される。
【００４３】
さらに、本発明は、それを必要とする患者に薬物をデリバリーする方法に関し、この場合、ヒドロゲルが患者に投与され、第一ポリペプチドまたはポリペプチド結合パートナーがポリマーに結合し、薬物がヒドロゲル構造に物理的に捕捉され、またはポリマーに結合して、ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化されるヒドロゲル構造を形成し、そして、ヒドロゲルが目的の作用部位に到達した後に、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物が投与され、それによりヒドロゲル構造が緩み、該薬物または薬物−ポリマー複合体がそれぞれ放出される。
【００４４】
患者への通常の薬物の適用と比較して、本方法は遙かに簡便である。何故なら、薬物を含むヒドロゲルは患者に一回注射で投与すればよく、経口投与可能な調節化合物を服用することにより、該薬物を必要に応じて放出させることができるからである。このようにして、反復注射が、一回の注射と、錠剤、カプセル剤、丸剤などの形態を持つ何らかの経口活性化合物に置き換えられる。
【００４５】
本発明に係る特別のヒドロゲルは、細菌性ジャイレースサブユニットＢ（ＧｙｒＢ）をグラフトさせたポリアクリルアミドを基礎とする抗生物質応答性ゲルであって、ＧｙｒＢがアミノクマリン抗生物質クーママイシンにより二量体化し、それによってヒドロゲルのゲル化および三次元的安定化がもたらされる（図１ａ）。アミノクマリン ノボビオシン（Albamacin(登録商標)）を添加すると、ＧｙｒＢおよびクーママイシンの間の相互作用が競合阻害され、三次元構造が緩み、ヒドロゲルがゾル状態に変化する（図１ａ）。特別な例では、ポリマー骨格は、ヘキサヒスチジン標識（Ｈｉｓ６）を付けたＧｙｒＢを結合させるためのＮｉ２＋イオンをキレート化するため、ニトリロ三酢酸で官能化したポリアクリルアミドである（図１ｂ）。ポリマー骨格を構築するため、２，２’−（５−アクリルアミド−１−カルボキシペンチルアザンジイル）二酢酸（ＮＴＴ−ＡＡｍ）を合成し、アクリルアミド（ＡＡｍ）と共重合させ、ＮＴＡ基をＮｉ２＋で帯電させる。得られたポリマー ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）は、サイズ排除クロマトグラフィーで判定された分子量４２kDaを有し、１Ｈ ＮＭＲ分析と合成における化学量論を反映することから推定されるように、４個のアクリルアミドモノマーあたり１個のＮＴＡ−ＡＡｍ基を有する。
【００４６】
Ｅ．ｃｏｌｉジャイレースサブユニットＢの遺伝子（ｇｙｒＢ）を、６個のヒスチジン残基のコード配列で標識する。このコード領域を、ファージＴ７から誘導されるプロモーターの調節下に置き、可溶性細胞質蛋白としてＥ．ｃｏｌｉで発現させる。ＧｙｒＢを、Ｎｉ２＋型アフィニティークロマトグラフィーを用いてヘキサヒスチジンタグにより精製する。蛋白を、クーママイシン（ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１。mol/mol）の存在下または不在下でインキュベートし、その後アミン特異的二官能性架橋剤スベルイミド酸ジメチル（ＤＭＳ）を添加し、この複合体を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析することにより、遺伝子工学により生成されたＧｙｒＢのクーママイシンにより誘発される二量体化を評価する。クーママイシン不在下では、ＧｙｒＢは専ら予想サイズ２７kDaの位置に移動し、一方、二量体化抗生物質を添加すると実質的な二量体の形成が起こり、予想サイズ５４kDaの位置に移動する。クーママイシン存在下で２７kDaに移動する残存バンドは、抗生物質により仲介されるＧｙｒＢの非効率的な二量体化に起因するが、むしろ不完全なＤＭＳ仲介性共有結合的架橋に起因する、ということを排除するため、限外濾過実験を実施する。ＧｙｒＢをクーママイシンの存在下または不在下でインキュベートし、５０kDa分子量カットオフフィルターを用いる限外濾過に付す。クーママイシン不在下のＧｙｒＢは効率的にフィルターを通過する（濾液中の蛋白５４％）が、クーママイシンで二量体化されたＧｙｒＢがロードされた場合、濾液中にはバックグラウンドレベルのＧｙｒＢが検出できるに過ぎず（濾液中の蛋白２．８％）、これは、クーママイシンにより仲介されるＧｙｒＢ二量体化が定量的であることを示すものである。
【００４７】
クーママイシン架橋ヒドロゲルの合成を、クーママイシンの存在下もしくは不在下、または１０倍モル過剰のノボビオシンと共に、ヘキサヒスチジンで標識したＧｙｒＢをインキュベートすることにより検証する。続いてこの蛋白を、ポリマー骨格においてキレート化した１１のＮｉ２＋イオンにつき１のＧｙｒＢの割合で、ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）と混合する。全てが粘稠となったこの溶液をＰＢＳ中で１２時間インキュベートした後、緩衝液中に放出されたＧｙｒＢ−ポリマー複合体の定量を行う（図２ａ）。クーママイシンの不在下またはノボビオシンの存在下で、この粘性構造物は完全に溶解し、ＧｙｒＢが定量的に緩衝液に回収される。しかしながらクーママイシンの存在下では、ＧｙｒＢ−ポリマーの放出は有意に低下してヒドロゲルが観察でき、このことによってこの二量体化抗生物質のゲル化作用が示される（図２ａ）。ヒドロゲルの生成が事実上クーママイシンにより仲介されるＧｙｒＢ二量体化に起因することを説明するため、上記のようにクーママイシンにより二量体化されたＧｙｒＢを用いたヒドロゲル、またはＤＭＳによりさらに共有結合的に架橋しておいたクーママイシン二量体化Ｇｙｒを合成する。ＰＢＳ中で１２時間膨潤させた後、ノボビオシン１mMを含有するＰＢＳ中でこのヒドロゲルをインキュベートし、緩衝液中へのＧｙｒＢ−ポリマー複合体の放出によってヒドロゲルの溶解を監視する（図２ｂ）。クーママイシン架橋ヒドロゲルがノボビオシンの存在下で１１時間後に溶解する一方で、ＤＭＳ架橋ＧｙｒＢ（＋ＤＭＳ）を伴うヒドロゲルは、３１時間の観察時間の間安定である（図２ｂ）。この知見は、クーママイシンにより仲介されるＧｙｒＢの二量体化によってヒドロゲルが効果的に生成し、それが過剰のノボビオシンにより逆転し得ることを裏付けるものである。他のクラスの抗生物質（例えば、β−ラクタム、マクロライド）の添加により特異性がさらに説明され、その場合、ゲルの溶解に及ぼす影響は観察できない。
【００４８】
ヒドロゲルの溶解速度および生物薬剤の放出特性を最適に調節して治療域内にすることができるならば、薬理学的に誘発されるヒドロゲルの生成および溶解は、体内における蛋白性医薬の最適なデリバリーのための新たな展望を開く。調節可能なヒドロゲル特性を研究するため、クーママイシン二量体化ヒドロゲルを、漸増濃度のノボビオシン存在下でインキュベートし、ゲルの溶解を、放出されたＧｙｒＢ−ポリマー複合体の定量によって追跡する（図３）。ノボビオシン１mMの存在下ではヒドロゲルは速やかに溶解し、一方、より低濃度のノボビオシンは、より緩やかなヒドロゲルの溶解およびより緩やかなＧｙｒＢ放出と相関し、これは、調節可能な溶解および放出速度を説明している（図３）。ヒドロゲルはノボビオシン不在下で２４日間安定である。２４日目にノボビオシン１mMを添加すると、２６日目までヒドロゲルの溶解がもたらされるが、これはヒドロゲルの長期機能性を説明している。
【００４９】
刺激感知性ヒドロゲルからの治療用蛋白の薬理学的に誘発される放出を説明するため、ヒト血管内皮生長因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）をヒドロゲル内に組み込み（ＧｙｒＢ：ＶＥＧＦ１２１＝１０００：１、mol/mol）、漸増濃度のノボビオシン存在下でインキュベートする（図４）。ノボビオシン１mMの存在下ではＶＥＧＦ１２１は１０時間以内に完全に放出されるが、刺激不在下ではバックグラウンドレベルのＶＥＧＦ１２１が観察されるに過ぎない。中程度のノボビオシン濃度（０．２５mM）ではＶＤＧＦ１２１放出速度はより緩やかであり、これにより、トリガーにより調節可能な生長因子の放出特性が説明される。
【００５０】
ＧｙｒＢに基づく系は、ノボビオシン存在下で膨潤するヒドロゲルの設計に利用することもできる。故に、クーママイシン二量体化ＧｙｒＢ分子を等モル量のスベルイミド酸ジメチルにより化学的に架橋するという改変を施したヒドロゲルが上記のように製造される。このようなゲルをノボビオシン存在下でインキュベートすると、膨潤が観察され得る（図５）。
【実施例】
【００５１】
［実施例１］ヘキサヒスチジン標識したＧｙｒＢの製造
細菌ジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）を、オリゴヌクレオチドＯＷＷ８６６(５’−ｇｇｔａｃｔｔｇｃａｃａｔａｔｇｔｃｇａａｔｔｃｔｔａｔｇａｃｔｃｃｔｃｃａｇｔａｔｃ−３’、配列番号１)およびＯＷＷ８６７（５’−ｃｃａｇｔｔａｃａａｇｃｔｔａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇｃｃｔｔｃａｔａｇｔｇ−３’、配列番号２）を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α染色体ＤＮＡから増幅し、ｐＷＷ３０１にライゲーションし（Ｎｄｅｌ／ＨｉｎｄIII）（Weber C. C. et al., Biotechnol Bioeng 89, 9-17, 2005）、それにより、ｇｙｒＢをファージＴ７プロモーターの調節下に置く。ｐＷＷ８７３をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＳＴＡＲ（登録商標）（ＤＥ３）中に形質転換し（Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. no. C601003）、１mMのＩＰＴＧによりＯＤ６００＝１において３７℃で３時間蛋白産生を誘導する。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し（始発培養容量１０００mlあたり４０ml・５０mM ＮａＨ２ＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ、１０mMイミダゾール、ｐＨ８．０）、フレンチプレス（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で破砕し、細胞残屑を１５０００ｘｇ２０分間の遠心分離により取り除く。清澄化した細胞溶解液をＮＴＡ−アガロース スーパーフローカラム（Qiagen, Hilden, Germany, cat. no. 30210）にロードし、続いてこれを１０カラム容量のＰＢＳ、１０カラム容量の洗浄緩衝液（５０mMＮａＨ２ＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ、２０mMイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄し、２カラム容量の溶離緩衝液（５０mMＮａＨ２ＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール、ｐＨ８．０）で溶出する。溶離緩衝液を限外濾過（１０kDa ＭＷカットオフ、Sartorius, Gottingen, Germany, cat. no. VS0202）によってＰＢＳに変換し、ＧｙｒＢを８０mg/mlに濃縮する。
【００５２】
［実施例２］ＶＥＧＦ１２１の製造
ヘキサヒスチジン標識したヒト血管内皮生長因子１２１（ＶＥＧＦ１２１）のための発現ベクターｐＲＳＥＴ−ＶＥＧＦ１２１(Ehrbar M. et al., Circ Res 94, 1124-32, 2004) をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＳＴＡＲ（登録商標）（ＤＥ３）に形質転換し、１mMのＩＰＴＧ添加によりＯＤ６００＝０．８において３７℃で４時間蛋白産生を誘導する。細胞ペレットを５０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２mMＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に再懸濁し（始発培養容量１０００mlあたり１００ml）、フレンチプレスを使用して細胞を破砕し、４℃、１５０００ｘｇで２０分間の遠心分離により、封入体をペレット化する。封入体を、６Ｍ尿素、５００mMＮａＣｌ、５mMイミダゾール、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．９）中に４℃で一夜溶解し、遠心分離（１５０００ｘｇ、３０分間、４℃）して細胞残屑から分離する。この上清を、洗浄（１５カラム容量の６Ｍ尿素、５００mMＮａＣｌ、２０mMイミダゾール、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．９）および溶離（６Ｍ尿素、５００mMＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．９）の後、ＮＴＡ−アガローススーパーフローカラムにロードする。溶出液を２mMＤＴＴおよび２mMＥＤＴＡと共に２２℃で３０分間インキュベートしてジスルフィド結合を還元し、その後三段階透析を行う（（３．５kDaＭＷカットオフ、Pierce, Rockford, IL, cat. no. 68035）：４Ｍ尿素、１mMＥＤＴＡ、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２ｘ１時間；３Ｍ尿素、１mMＥＤＴＡ、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２ｘ１時間；２Ｍ尿素、１５０mMＮａＣｌ、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１時間、そして２Ｍ尿素、１５０mMＮａＣｌ、２０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で一夜）。精製されたＶＥＧＦ１２１を−８０℃で保存する。ＶＥＧＦ１２１をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Peprotech, Hamburg, Germany, cat. no. 900-K10）で定量する。
【００５３】
［実施例３］ＧｙｒＢの特性決定
ＢＳＡを標準として使用するブラッドフォード法（Biorad, Munich, Germany, cat. no. 500-0006）によってＧｙｒＢの濃度を分析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために１２％還元ゲルを使用し、その後クマシー染色する。ＧｙｒＢについて１０倍モル過剰のスベルイミド酸ジメチルｘ２ＨＣｌ（DMS, SigmaAldrich, St. Louis, MO, cat. no. 179523）を添加し室温で６０分間、二量体を共有結合的に架橋させた後、クーママイシンＡ１存在下にＧｙｒＢを室温で３０分間インキュベートする（ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１、mol/mol；Sigma, St. Louis, MO, cat. no. C9270）ことにより、抗生物質により誘発されるＧｙｒＢの二量体化を分析する。この二量体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。クーママイシンにより誘発される二量体化の限外濾過研究のため、１mlＰＢＳ中１００nmolＧｙｒＢを５０nmolクーママイシンの存在下または不在下に室温で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ ４mlの添加後、この溶液を５０００ｘｇで４５分間の限外濾過に付す（５０kDaＭＷカットオフ、Filtron, Northborough, MA, cat. no. OD050C36）。不透過物（１ml）を５mlＰＢＳで希釈し、再度限外濾過した後、プールした濾液および不透過物中のＧｙｒＢ濃度を定量する。
【００５４】
［実施例４］２，２’−（５−アクリルアミド−１−カルボキシペンチルアザンジイル）二酢酸（ＮＴＡ−ＡＡｍ）の合成
トルエン１５mlに溶解した塩化アクリロイル３．３mmol（ABCR, Karlsruhe, Germany, cat. no. AB172729）を、０．４４Ｍ ＮａＯＨ ２７mlに溶解した３mmolのＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジン（Fluka, Buchs, Switzerland, cat. no. 14580）の氷冷溶液に４時間かけて滴下する。トルエンを減圧留去し、Dowex（登録商標） 50WX8（Acros, Geel, Belgium, cat. no. 335351000）でナトリウムイオンを除去し、その後凍結乾燥すると、粘稠な油状物が生成する（収率：５０％）。
【００５５】
［実施例５］ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡｍ）の合成
１．５mmolのＮＴＡ−ＡＡｍおよび６．４mmolのアクリルアミド（AAm, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden, cat. no. 17-1300-01）を窒素雰囲気下で５０mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ ４８ml（ｐＨ８．５）に溶解し、 ペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、１０％、ｗ／ｖ）１５０μlおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）２４μlの添加により室温で２０時間の重合を開始する。ポリマーを２０mlに減圧濃縮し、その後、２ＬのＨ２Ｏに対して１２時間、２回の透析（３．５kDaＭＷカットオフ、Pierce, Rockford, IL, cat. no. 68035）を実施して、塩類および残留アクリルアミドのような毒性低分子量化合物を取り除く。得られたＡＡｍ対ＮＴＡ−ＡＡｍのモル比は、１Ｈ ＮＭＲ（Avance 500 Bruker BioSpin AG Fallanden, Switzerland）で測定したところ４対１である。透析液に３．５mmolＮｉＳＯ４を添加し、０．５ｘＰＢＳ（１２時間）で２回、０．１ｘＰＢＳ（１２時間）で２回透析する。このＮｉ２＋−帯電したポリマーを１０倍に減圧濃縮すると６％（ｗ／ｖ）溶液が得られる。Ｎｉ２＋−帯電したポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡｍ）のサイズを、移動相としてＰＢＳを用いるShodex OHpak SB-806 HQ （８．０mm ｘ３００mm、昭和電工、川崎、日本国）カラム上のゲル透過クロマトグラフィーにより、流速０．５ml/分で分析する（Waters 2796 Alliance Bio, Waters AG, Baden, Switzerland）。検出は、Waters 2487のＵＶ検出機を用いて２８０nmおよび３９０nmで実施する。サイズ標準としてポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム塩）（Fluka, Buchs, Switzerland）を使用する。
【００５６】
［実施例６］ヒドロゲルの形成および特性決定
ＰＢＳ中の精製ＧｙｒＢ（８０mg/ml）を、ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１のモル比でクーママイシン（ＤＭＳＯ中５０mg/ml）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。続いてＧｙｒＢ１mgあたり４．５μlのポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）（ＰＢＳ中６％ｗ／ｖ溶液）に、二量体化したＧｙｒＢを加え、穏やかに撹拌して混合する。直ちにヒドロゲルが生成するのでこれを加湿雰囲気下に４℃で２０時間インキュベートし、その後このヒドロゲルをＰＢＳ中で１２時間インキュベートする。トリガーにより誘発され得るヒドロゲルの溶解を調べるため、異なる濃度のノボビオシン（Fluka, cat. no. 74675）存在下にＰＢＳ中でゲルをインキュベートし、溶解を、光学的に（GelJet Imager 2004, Intas, Gottingen, Germany）、そしてブラッドフォード法を用いる緩衝液中へのＧｙｒＢ放出の定量により、監視する。エラーバーは３回の実験から得られた標準偏差を表す。
【００５７】
［実施例７］さらなる架橋を伴うヒドロゲルの形成および特性決定
ＰＢＳ中の精製ＧｙｒＢ（８０mg/ml）を、ＧｙｒＢ：クーママイシン＝２：１のモル比でクーママイシン（ＤＭＳＯ中５０mg/ml）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、二量体化したＧｙｒＢを等モル量のスベルイミド酸ジメチルと共にインキュベートし、室温で６０分間インキュベートする。続いてＧｙｒＢ１mgあたり４．５μlのポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）（ＰＢＳ中６％ｗ／ｖ溶液）に、二量体化および架橋したＧｙｒＢを加え、穏やかに撹拌して混合する。直ちにヒドロゲルが生成するがこれを加湿雰囲気下に４℃で２０時間インキュベートし、その後このヒドロゲルをＰＢＳまたは１mMノボビオシンを添加したＰＢＳ中で２０時間インキュベートする。ゲルの膨潤を光学的に監視する（図５）。エラーバーは３回の実験から得られた標準偏差を表す。
【００５８】
［実施例８］ポリペプチド結合パートナーが小分子である場合の、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルの構築
アミノ官能化ノボビオシンの合成。ＤＭＦに溶解したノボビオシンをＫ２ＣＯ３および２−（Ｂｏｃ−アミノ）エチルブロミドと還流下に一夜反応させることにより、ノボビオシンをアミノ基で官能化する。反応混合物を減圧濃縮し、残留物を酢酸を伴うジクロロメタンに溶解し、カラムクロマトグラフィーで精製する。アミノ基の脱保護のため、このＢｏｃ−保護化合物をジクロロメタン中の５０％ＴＦＡに溶解する。溶媒および酸を蒸発させる。
【００５９】
（アミノ反応性ポリマーの合成）レドックス開始剤としてＡＩＢＮを使用し、アクリルオキシスクシンイミドをＴＨＦ中のアクリルアミド（モル比１：４）で共重合させる。得られたポリマー（ｐＡＡｍ−スクシンイミド）を沈殿させ減圧乾燥する。
【００６０】
（ポリマーへのアミノ官能化ノボビオシンのカップリング）アミノ官能化ノボビオシンをＰＢＳ（ｐＨ８．０）中のｐＡＡｍ−スクシンイミド（ＮＨ２−ノボビオシン：スクシンイミド＝１．５：１、mol/mol）と混合し、室温で一夜反応させる。得られたポリマーを水に対して透析し（ＭＷカットオフ：３５００Da）、凍結乾燥する。
【００６１】
（ヒドロゲルの構築）ＰＢＳに溶解したノボビオシン官能化ポリアクリルアミドをヘキサヒスチジン標識したＧｙｒＢおよびポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）と混合し、ゲル化を導く。このポリマーをＰＢＳ中で一夜膨潤させる。このヒドロゲルに漸増濃度のノボビオシンを添加すると、ゲルの用量依存的溶解がもたらされる。
【００６２】
［実施例９］ポリペプチド結合パートナーが核酸である場合の、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルの構築
（ＤＮＡ官能化ポリマーの合成）センスおよびアンチセンスの向きのｔｅｔＯオペレーターをコードしているオリゴヌクレオチドを合成するが、ここでは、第一オリゴはその５’末端（ＮＨ２）にアミノ基をさらに含んでいる。両方のオリゴ鎖をアニーリングし、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に溶解し、スクシンイミド官能化ポリアクリルアミドと混合し（実施例８を参照されたい）、一夜インキュベートする。得られたＤＮＡ官能化ポリマーを限外濾過に付し（ＭＷカットオフ５０００Da）、最後にＰＢＳに溶解する。
【００６３】
（ヘキサヒスチジン標識したＴｅｔＲの生成）テトラサイクリンリプレッサーＴｅｔＲのコード配列をヘキサヒスチジンタグと融合させ、ＩＰＴＧ誘導によりＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳで発現させる。この蛋白をＮｉ２＋アフィニティクロマトグラフィーで精製する。
【００６４】
（ヒドロゲルの構築）ｔｅｔＯ官能化ポリマーをヘキサヒスチジン標識したＴｅｔＲと混合し、その後ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）を添加する。ヒドロゲルが生成するがこれは、Ｍｇ２＋の存在下でテトラサイクリン抗生物質の添加により溶解し得る。
【００６５】
［実施例１０］ポリペプチド結合パートナーが第二ポリペプチドである場合の、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルの構築
第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーはＦＭ（Ｆ３６Ｍ突然変異を有するＦＫＢＰ）である。ＦＭをコードしているポリ核酸の３’末端を、６個のヒスチジン残基をコードしているポリ核酸に融合させる。この構築物をＴ７プロモーターの調節下にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１＊で発現させる。細胞を遠心分離によって収穫し、フレンチプレス中で溶解し、細胞残屑を遠心分離で取り除く。清澄化した溶解液を、ヘキサヒスチジン標識したＦＭのアフィニティ精製のため、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムを通過させる。３００mMイミダゾール含有緩衝液を用いてＦＭを溶出させ、緩衝液を限外濾過によりＰＢＳに交換する。ＦＭを限外濾過により５０mg/mlに濃縮する。精製および濃縮したＦＭをポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）（ＰＢＳ中６％ｗ／ｖ溶液。ＦＭ ７５０μgあたりポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ ）１０μl）と混合する。直ちにヒドロゲルが生成するのでこれを加湿雰囲気下に４℃で２０時間インキュベートし、その後このヒドロゲルをＰＢＳ中で１２時間インキュベートする。トリガーにより誘発され得るヒドロゲルの溶解を調べるため、異なる濃度のＦＫ５０６またはラパログ存在下にＰＢＳ中でゲルをインキュベートし、溶解を、光学的に（GelJet Imager 2004, Intas, Gottingen, Germany）、そしてブラッドフォード法を用いる緩衝液中へのＦＭ放出の定量により、監視する。
【００６６】
［実施例１１］さらなる架橋を含む、ＦＭに基づくヒドロゲルの構築
ＦＭ蛋白を共有結合によりさらに安定化する以外は実施例１０の記載に従ってヒドロゲルを構築する。したがって、濃縮したＦＭ溶液をＦＭ１モルあたりスベルイミド酸ジメチル４モルの存在下に室温で３０分間インキュベートし、その後ポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−ＮＴＡ−ＡＡＭ）と混合する。このヒドロゲルは細胞培養基中で増大した安定性を示す。
【００６７】
［実施例１２］ポリエチレングリコールおよびＧｙｒＢに基づくヒドロゲルの構築
このヒドロゲルは、クーママイシンにより二量体化されたＧｙｒＢとカップリングさせた８腕（eight-arm）ポリエチレングリコールからなる。場合により、ＧｙｒＢをスベルイミド酸ジメチルによりさらに架橋することができる。したがって、プライマー５’−ｇｇｔａｃｔｔｇｃａｃａｔａｔｇｔｃｇａａｔｔｃｔｔａｔｇａｃｔｃｃｔｃｃａｇｔａｔｃ−３’および５’−ｃｃａｇｔｔａｃａａｇｃｔｔＴＣＡＧＣＡａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇＧＣＣＴＴＣＡＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＣＴＴＣ−３’を用いてｇｙｒＢ遺伝子を増幅し、それをＮｄｅｌ／ＨｉｎｄIIIでｐＷＷ３０１中にクローニングすることにより、Ｃ末端システインを組み込んだＧｙｒＢを構築する。ＧｙｒＢ−Ｃｙｓ蛋白を、実施例１に記載のＧｙｒＢの手順に従って産生させる。先の手順に従い、ＴＣＥＰ（トリスカルボキシエチルホスフィン）を用いてＧｙｒＢ−Ｃｙｓを還元し、８個の末端ビニルスルホン基を有する８腕（8-arm）ＰＥＧにカップリングさせる（Rizzi S.C. and Hubbell J.A., Biomacromolecules 6, 1226-1238, 2005）。ＰＥＧ−カップリングしたＧｙｒＢを、非結合ＧｙｒＢ−Ｃｙｓを取り除くため１００kDa分子量カットオフを用いて還元条件（１mM ＤＴＴ）下にＰＢＳに対して透析する。ＰＥＧ−カップリングしたＧｙｒＢ−Ｃｙｓを８０mg/mlに濃縮し、クーママイシン（ＤＭＳＯ中５０mg/ml保存溶液。１molクーママイシン／２mol ＧｙｒＢ）と混合する。生成するヒドロゲルを湿潤雰囲気下で２４時間インキュベートする。
【００６８】
［実施例１３］さらなる架橋を含むＰＥＧに基づくヒドロゲルの構築
ＰＥＧ−カップリングしたＧｙｒＢ溶液をスベルイミド酸ジメチル（ＤＭＳ、ＧｙｒＢ１molあたりＤＭＳ３mol）と共に室温で３０分間インキュベートし、その後クーママイシンを添加する以外は実施例１２の記載と同様にしてヒドロゲルを構築する。得られたヒドロゲルは、緩衝液中で実施例１２由来のヒドロゲルよりも高い安定性を示す。ブラッドフォード法を用いて膨潤緩衝液中に放出される蛋白を測定することにより定量すると、ノボビオシンの添加はヒドロゲルの溶解を誘発する。
【００６９】
［実施例１４］ＶＥＧＦを組み込んだ、ＰＥＧに基づくヒドロゲル
ＧｙｒＢにＶＥＧＦ（実施例２に従って生成）を添加した後８腕ＰＥＧ（モル比ＶＥＧＦ：ＧｙｒＢ＝１：２４）にカップリングさせる以外は実施例１３の記載と同様にしてヒドロゲルを構築する。ＥＬＩＳＡで定量したところ、ヒドロゲルへのノボビオシン添加は緩衝液中へのＶＥＧＦの用量依存的放出をもたらす。
【００７０】
［実施例１５］ポリアクリルアミドに共有結合させたＦＭに基づくヒドロゲルの構築
実施例１０の記載に従いＦＭ蛋白を生成し、５０mg/mlに濃縮する。モル比ＦＭ：ＰＥＧ＝２：１のスクシンミド官能化線状ＰＥＧ（ＭＷ＝５０００g/mol）を用いて室温で３０分間ＦＭをペグ化する。続いてペグ化ＦＭをアクリルオキシスクシンイミド（モル比：アクリルオキシスクシンイミド：ＦＭ＝２：１）にカップリングし、アクリルアミド（モル比：ＦＭ：アクリルアミド＝１：１００）と混合し、ＡＰＳ（３．６μg/mg ＦＭ）およびＴＥＭＥＤ（０．０２μl/mg ＦＭ）を添加して室温で一夜重合する。得られたヒドロゲルをＰＢＳ中で平衡化する。重量分析および光学的分析により監視したところ、ＦＫ５０６の添加はヒドロゲルの膨潤をもたらす。
【００７１】
［実施例１６］ポリペプチド結合パートナーが小分子である場合の、ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルの構築
（ＦＫＢＰ結合分子の合成）（Ｓ）−ペンチルオキシ−５−（Ｎ’−［４−（２−フェノキシ−エチルアミン）］−ベンズアミジル）−Ｎ−［２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル］］プロリンを、Siegal G., Overhand M. et al., Chem Med Chem 2, 1054-1070, 2007の手順を以下のように適合させて合成する：
【００７２】
（４−アセトキシ−Ｎ−［４−（ヒドロキシ）フェニル］ベンズアミド（１））ｐ−アセトキシ安息香酸（１当量）の塩化チオニル（５当量）溶液に触媒量（数滴）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加え、溶液を９０分間加熱還流する。混合物を室温に冷却し、過剰の塩化チオニルを減圧下に除去して、淡黄色油状物の酸塩化物を得る。この酸塩化物をＤＭＦに溶解し、ＤＭＦ中のｐ−アミノフェノール（３当量）および触媒量の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の溶液に０℃で徐々に加える。撹拌を１時間継続し、その後溶液を、ＥｔＯＡｃと共に２Ｌの分液漏斗に移す。混合物を２Ｍ ＨＣｌで３回、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３で１回、そしてブラインで１回洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮する。白色固体の化合物１が得られる。
【００７３】
（４−アセトキシ−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド（２））ＤＭＦ中の化合物１およびＫ２ＣＯ３（２当量）の溶液にＢｏｃ−アミノエチルブロミド（１．２５当量）を加える。反応混合物を１２０℃で一夜撹拌する。溶媒を減圧留去し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｍ ＫＨＳＯ４およびブラインで洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００７４】
（４−ヒドロキシ−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド（３））ＮａＯＥｔ（１当量）を２（１当量）のエタノール溶液に室温で添加し、この溶液を、ＴＬＣがアセチル基の完全除去を示すまで（〜１時間）撹拌する。溶液を２Ｍ ＨＣｌを添加して中和し、エタノールを減圧留去する。得られた懸濁液をＥｔＯＡｃおよび水（４：１ｖ／ｖ）に溶解し、分液漏斗に移す。有機層を分離し、２Ｍ ＨＣｌで１回、１Ｍ ＮａＨＣＯ３で２回、そしてブラインで１回洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製すると化合物３が得られる。
【００７５】
（４−（５−（ベンジルオキシ）ペンチルオキシ）−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド（４））ＴＨＦ中の化合物３（１当量）、５−（ベンジルオキシ）ペンタン−１−オール（２当量）、およびＰＰｈ３（２当量）の溶液に、アゾジカルボン酸ジエチル（２当量、トルエン中４０％）を０℃で１０分間かけて添加する。３０分後に冷却浴を取り除き、溶液を室温で１６時間攪拌する。溶媒を減圧濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製する。
【００７６】
（４−（５−（ヒドロキシ）ペンチルオキシ）−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド（５））化合物４をＥｔＯＡｃおよびＥｔＯＨ（１：１ｖ／ｖ）の混合液に溶解し、アルゴン気流を２分間通気することによりこの溶液を脱気する。次いでＰｄ／Ｃ（活性炭上１０ｗｔ％Ｐｄ）を加え、フラスコに二重マントル水素バルーンを取り付け、懸濁液を室温で１６時間攪拌する。ハイフロで濾過することにより触媒を除去し、混合物を減圧濃縮すると、脱保護された化合物が高純度で得られる。
【００７７】
（（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル）プロリン（６））ジクロロメタン中の、２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）酢酸（１．５当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（２当量）、ＤＩＰＥＡ（３mmol）および触媒量のＤＭＡＰの溶液に、Ｌ−プロリンｔｅｒｔ−ブチルエステル（１当量）を０℃で加える。３０分後、混合物を室温まで温め、撹拌を１６時間継続する。混合物を減圧濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して６を得る。
【００７８】
（Ｎ−（２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル）プロリン（７））６のジクロロメタン溶液に室温でＴＦＡを加える。この溶液を、ＴＬＣがｔｅｒｔ−ブチル基の完全除去を示すまで（〜８時間）撹拌する。１Ｍ ＮａＨＣＯ３を１０分間かけて室温で徐々に加える。気体の発生が止んだ後、混合物をＥｔＯＡｃと共に分液漏斗に移す。有機層を廃棄し、水層を２Ｍ ＨＣｌで注意深く酸性化する。水層をＥｔＯＡｃで２回抽出し、続いて有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮する。カラムクロマトグラフィーにより７が得られる。
【００７９】
（（Ｓ）−ペンチルオキシ−５−（Ｎ’−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミジル）−Ｎ−［２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル）］プロリン（８））無水ジクロロメタン中の、酸７（１．２当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１．５当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．２当量）および触媒量のＤＭＡＰの溶液に、４−（５−（ヒドロキシ）ペンチルオキシ）−Ｎ−［４−（２−フェノキシ−（Ｂｏｃ−エチルアミン）］ベンズアミド ５（１当量）を０℃で加える。３０分後、混合物を室温まで温め、撹拌を１６時間継続する。混合物を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製すると化合物８が得られる。
【００８０】
（（Ｓ）−ペンチルオキシ−５−（Ｎ’−［４−（２−フェノキシ−エチルアミン）］ベンズアミジル）−Ｎ−［２−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル）］プロリン（９））脱保護しようとする化合物８のジクロロメタン溶液に、ＴＦＡ（１０mmol）を室温で加え、溶液を２時間攪拌する（ＴＬＣ調節）。１Ｍ ＮａＨＣＯ３を１０分間かけて室温で徐々に加える。気体の発生が止んだ後、混合物をＥｔＯＡｃと共に分液漏斗に移す。有機層を１Ｍ ＮａＨＣＯ３で１回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。有機層を減圧濃縮する。所望化合物９をカラムクロマトグラフィーにより精製する。
【００８１】
（アミン反応性ポリマーの合成）レドックス開始剤としてＡＩＢＮを使用し、アクリルオキシスクシンイミドをＴＨＦ中のアクリルアミド（モル比１：４）で共重合させる。得られたポリマー（ｐＡＡｍ−スクシンイミド）を沈殿させ減圧乾燥する。
【００８２】
（ポリマーへのアミノ含有ＦＫＢＰ結合分子のカップリング）化合物９をＰＢＳ（ｐＨ８．０）中のｐＡＡＭ−スクシンイミド（化合物９：スクシンイミド＝１．５：１、mol/mol）と混合し、室温で一夜反応させる。得られたポリマーを水に対して透析し（ＭＷカットオフ：３５００Da）、凍結乾燥する。
【００８３】
（ヒドロゲルの構築）ＰＢＳに溶解したＦＫ５０６アナログ官能化ポリアクリルアミドをヘキサヒスチジン標識したＦＫＢＰおよびポリ（ＡＡｍ−ｃｏ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−ＡＡｍ）と混合し、ゲル化を導く。ポリマーをＰＢＳ中で一夜膨潤させる。このヒドロゲルに漸増濃度のＦＫ５０６を添加すると、ゲルの用量依存的溶解がもたらされる。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【図２（ａ）】
【図２（ｂ）】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルであって、前記ポリペプチド結合パートナーが、第二ポリペプチド、核酸または小分子であり、前記第一ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド結合パートナーが前記ポリマーに共有結合し、または、強い特異的な非共有結合により前記ポリマーに結合し、そして、前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーの間の相互作用が、非共有結合性であり、前記ヒドロゲルを安定化し、そして、調節化合物の添加または除去により切断される、ヒドロゲル。
【請求項２】
前記第一ポリペプチドが前記ポリマーに結合し、前記ポリペプチド結合パートナーが目的化合物に結合している、請求項１に記載のヒドロゲル。
【請求項３】
前記第一ポリペプチドが目的化合物に結合し、前記ポリペプチド結合パートナーが前記ポリマーに結合している、請求項１に記載のヒドロゲル。
【請求項４】
前記ヒドロゲルに物理的に捕捉されまたは前記ポリマーに結合している目的化合物をさらに含む、請求項１に記載のヒドロゲル。
【請求項５】
前記目的化合物が薬物である、請求項２、３または４に記載のヒドロゲル。
【請求項６】
前記ポリマーが、ポリビニルに基づくポリマー、ポリペプチドおよびポリ炭水化物から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項７】
前記ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリ−ジメチル−ジアリル−アンモニウムクロリド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、フィブリン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−リジン、アルギン酸塩、セルロース類、デキストランおよびデンプンから選ばれる、請求項６に記載のヒドロゲル。
【請求項８】
前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーが、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ、ＦＫＢＰ−ＦＲＢ、ＦＭ−ＦＭ、ＴｏｘＴ−ＴｏｘＴ、ＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−Ｃｙｐ、Ｃｙｐ−Ｃｙｐ、Ｅ−ＥＴＲ、ＰＩＰ−ＰＩＲ、ＴｅｔＲ−ｔｅｔＯ、ＡｒｇＲ−ａｒｇＯ、ＡｒｓＲ−ａｒｓＯ、ＨｕｃＲ−ｈｕｃＯ、ＧｙｒＢ−アミノクマリン抗生物質、ＦＫＢＰ−ｍＴＯＲインヒビター、ＦＲＢ−ｍＴＯＲインヒビター、ＦＭ−ｍＴＯＲインヒビター、Ｃｙｐ−シクロスポリン、Ｃｙｐ−アスコマイシン、ＤＨＦＲ−抗葉酸剤、ストレプトアビジン−ビオチンアナログ、アビジン−ビオチンアナログ、ニュートラアビジン−ビオチンアナログ、ステロイドホルモンレセプター−ステロイドホルモン、またはＴｏｘＴ−ヴィルスタチンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項９】
前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーが、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ、ＦＫＢＰ−ＦＲＢ、ＦＭ−ＦＭ、ＴｏｘＴ−ＴｏｘＴ、ＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−Ｃｙｐ、Ｃｙｐ−Ｃｙｐ、Ｅ−ＥＴＲ、ＰＩＰ−ＰＩＲ、ＴｅｔＲ−ｔｅｔＯ、ＡｒｇＲ−ａｒｇＯ、ＡｒｓＲ−ａｒｓＯ、またはＨｕｃＲ−ｈｕｃＯである、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１０】
前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーが、前記調節化合物の添加または除去により二量体化する傾向を有する１個のポリペプチドである、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１１】
二量体化する傾向を有する前記ポリペプチドが、ＧｙｒＢ、ＦＭ、ＴｏｘＴ、ＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、またはＣｙｐである、請求項１０に記載のヒドロゲル。
【請求項１２】
前記第一ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド結合パートナーが、溶解性に影響を及ぼすさらなるポリマーに共有結合している、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１３】
前記第一ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド結合パートナーが、ホモ多量体または他のポリペプチドもしくはポリペプチド結合パートナーとのヘテロ二量体である、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１４】
請求項１に記載のヒドロゲルを含む薬物デリバリー系であって、前記第一ポリペプチドまたは前記ポリペプチド結合パートナーのいずれかが前記ポリマーに結合し、そして前記対応するポリペプチド結合パートナーまたは前記第一ポリペプチドが各々薬物に結合しており、そしてさらに、前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物を含む薬物デリバリー系。
【請求項１５】
請求項１に記載のヒドロゲルを含む薬物デリバリー系であって、前記第一ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド結合パートナーが前記ポリマーに結合し、そして、薬物が、前記ヒドロゲル構造に物理的に捕捉されるか、またはポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化された前記ポリマーに結合しており、そしてさらに、前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーの間の前記相互作用を切断する化合物を含む、薬物デリバリー系。
【請求項１６】
二量体化の傾向を有する前記ポリペプチドが、ポリエチレングリコールまたはポリアクリルアミドに共有結合したＦＭである、請求項１０に記載のヒドロゲル。
【請求項１】
ポリマー、第一ポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーを含むヒドロゲルであって、前記ポリペプチド結合パートナーが、第二ポリペプチド、核酸または小分子であり、前記第一ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド結合パートナーが前記ポリマーに共有結合し、または、強い特異的な非共有結合により前記ポリマーに結合し、そして、前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーの間の相互作用が、非共有結合性であり、前記ヒドロゲルを安定化し、そして、調節化合物の添加または除去により切断される、ヒドロゲル。
【請求項２】
前記第一ポリペプチドが前記ポリマーに結合し、前記ポリペプチド結合パートナーが目的化合物に結合している、請求項１に記載のヒドロゲル。
【請求項３】
前記第一ポリペプチドが目的化合物に結合し、前記ポリペプチド結合パートナーが前記ポリマーに結合している、請求項１に記載のヒドロゲル。
【請求項４】
前記ヒドロゲルに物理的に捕捉されまたは前記ポリマーに結合している目的化合物をさらに含む、請求項１に記載のヒドロゲル。
【請求項５】
前記目的化合物が薬物である、請求項２、３または４に記載のヒドロゲル。
【請求項６】
前記ポリマーが、ポリビニルに基づくポリマー、ポリペプチドおよびポリ炭水化物から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項７】
前記ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリ−ジメチル−ジアリル−アンモニウムクロリド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、フィブリン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−リジン、アルギン酸塩、セルロース類、デキストランおよびデンプンから選ばれる、請求項６に記載のヒドロゲル。
【請求項８】
前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーが、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ、ＦＫＢＰ−ＦＲＢ、ＦＭ−ＦＭ、ＴｏｘＴ−ＴｏｘＴ、ＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−Ｃｙｐ、Ｃｙｐ−Ｃｙｐ、Ｅ−ＥＴＲ、ＰＩＰ−ＰＩＲ、ＴｅｔＲ−ｔｅｔＯ、ＡｒｇＲ−ａｒｇＯ、ＡｒｓＲ−ａｒｓＯ、ＨｕｃＲ−ｈｕｃＯ、ＧｙｒＢ−アミノクマリン抗生物質、ＦＫＢＰ−ｍＴＯＲインヒビター、ＦＲＢ−ｍＴＯＲインヒビター、ＦＭ−ｍＴＯＲインヒビター、Ｃｙｐ−シクロスポリン、Ｃｙｐ−アスコマイシン、ＤＨＦＲ−抗葉酸剤、ストレプトアビジン−ビオチンアナログ、アビジン−ビオチンアナログ、ニュートラアビジン−ビオチンアナログ、ステロイドホルモンレセプター−ステロイドホルモン、またはＴｏｘＴ−ヴィルスタチンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項９】
前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーが、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ、ＦＫＢＰ−ＦＲＢ、ＦＭ−ＦＭ、ＴｏｘＴ−ＴｏｘＴ、ＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−Ｃｙｐ、Ｃｙｐ−Ｃｙｐ、Ｅ−ＥＴＲ、ＰＩＰ−ＰＩＲ、ＴｅｔＲ−ｔｅｔＯ、ＡｒｇＲ−ａｒｇＯ、ＡｒｓＲ−ａｒｓＯ、またはＨｕｃＲ−ｈｕｃＯである、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１０】
前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーが、前記調節化合物の添加または除去により二量体化する傾向を有する１個のポリペプチドである、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１１】
二量体化する傾向を有する前記ポリペプチドが、ＧｙｒＢ、ＦＭ、ＴｏｘＴ、ＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、またはＣｙｐである、請求項１０に記載のヒドロゲル。
【請求項１２】
前記第一ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド結合パートナーが、溶解性に影響を及ぼすさらなるポリマーに共有結合している、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１３】
前記第一ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド結合パートナーが、ホモ多量体または他のポリペプチドもしくはポリペプチド結合パートナーとのヘテロ二量体である、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１４】
請求項１に記載のヒドロゲルを含む薬物デリバリー系であって、前記第一ポリペプチドまたは前記ポリペプチド結合パートナーのいずれかが前記ポリマーに結合し、そして前記対応するポリペプチド結合パートナーまたは前記第一ポリペプチドが各々薬物に結合しており、そしてさらに、前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーの間の相互作用を切断する化合物を含む薬物デリバリー系。
【請求項１５】
請求項１に記載のヒドロゲルを含む薬物デリバリー系であって、前記第一ポリペプチドおよび／または前記ポリペプチド結合パートナーが前記ポリマーに結合し、そして、薬物が、前記ヒドロゲル構造に物理的に捕捉されるか、またはポリペプチドおよびポリペプチド結合パートナーの間の相互作用により安定化された前記ポリマーに結合しており、そしてさらに、前記第一ポリペプチドおよび前記ポリペプチド結合パートナーの間の前記相互作用を切断する化合物を含む、薬物デリバリー系。
【請求項１６】
二量体化の傾向を有する前記ポリペプチドが、ポリエチレングリコールまたはポリアクリルアミドに共有結合したＦＭである、請求項１０に記載のヒドロゲル。
【図３】
【図４】
【図５】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５２１９８７（Ｐ２０１１−５２１９８７Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２０３０（Ｐ２０１１−５１２０３０）
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００４０５０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６９２９
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０８１３９０００）
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨ Ｚｕｒｉｃｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００４０５０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６９２９
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０８１３９０００）
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨ Ｚｕｒｉｃｈ
【Ｆターム（参考）】
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