前立腺の光学映像プローブ
【課題】分子映像技術を用いて前立腺ガンを診断するための光学映像ペプチドプローブの提供。
【解決手段】前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の酵素に対して特異性を有する下式で示されるペプチド。
該ペプチド基質の両端をそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に統合することで、前立腺の光学映像プローブを得ることができる。
【解決手段】前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の酵素に対して特異性を有する下式で示されるペプチド。
該ペプチド基質の両端をそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に統合することで、前立腺の光学映像プローブを得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明はグラフト共重合体がポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）及びメトキシエチレングリコール(ＭＰＥＧ）により組成され、そしてペプチド基質の両端がそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に結合する前立腺光学プローブのペプチド化合物に関し、特に、前立腺ペプチド基質を利用して光学映像のプローブとする発明に関する。
【従来の技術】
【０００２】
引例には特殊のペプチド基質の両端をそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）及び蛍光色素に接触させ、又はペプチド基質の両端をそれぞれ蛍光色素及び蛍光色素の抑制剤に結合させる方法が開示されている。
【０００３】
近年、光学映像ソフト・ハードウエアの発展により、映像学の診断が飛躍的に進化してきている。そして、更に一歩進んで光学映像の診断の感度及び精度を向上させるために、安全で安定的な標的光学映像プローブを開発することが光学映像研究における重要な方向性の一つとなっている。一般の光学映像プローブではペプチド基質の両端がそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に結合されている。
【発明の開示】
【０００４】
生物の分子映像／分子イメージング（molecular imaging）には、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、核医学及び光学映像の利用が包括され、磁気共鳴像、核医学及び光学インビボ映像技術の発展により、過去１０年においてインビボ分子映像の研究及び応用が迅速に発展してきた。そして、インビボ分子映像が、正常及び異常細胞プロセスを含む分子のインビボ生物システム及び遺伝子機能レベルの観察及び情報を提供したことにより、これをヒト疾病の早期の正確な診断と遺伝子医学及び新薬の加速的な開発に応用することが可能となり、この三種の造影機器の利用に必要な薬物は、主として生物活性及びターゲティング能を有する。一般的伝統的な医学結像技術は、腫瘍サイズ等の疾病後期の状況しか反応しない。これに対し、分子映像技術は、がん直前の分子改変、がん早期の転移及び心血管初期繊維の形成等の早期疾病の生物特性変異を検出することができ、腫瘍、冠状心臓病及び胸部疾病等、ヒトの生命を脅かす疾病の最適な早期診断方法である。インビボ分子映像分野には、分子生物学、化学、物理学、放射線医学及びコンピューター科学等の研究分野が包括される。インビボ映像は各分野の中枢技術の共同的貢献によらなければならないので、インビボによる特定の分子映像は、近年の発展において一般的伝統的な医学映像と比べて分子映像に顕著な優越性が認められる。多くの研究もまた、疾病分子の反応機構及び細胞組成に向っているが、主要な努力の方向は非侵略性、高解析度及びインビボにおける映像技術に向けられている。この他、現今では分子映像は、人体解剖学及び病理学を基礎とする核医学結像技術、磁気共鳴結像技術及び光学結像に比べ、既にナノメータを単位とする生物分子レベルの研究に入っているので、疾病の早期診断及び観測を遺伝子レベルで行い、その研究の成果及び技術は広く生物学及び疾病の研究に応用されることが期待されている。
【０００５】
典型的な蛍光色素は、可視光線（４００〜６００ｎｍ）の範囲内で蛍光を発し、分光光度計又は蛍光顕微鏡により極めて容易にその蛍光信号を見ることができるが、この波長範囲内の光子をインビボ内又はインビボ外で適用するのは理想的でない。なぜならば、組織及び血液がこの波長の光子を吸収するからである。近年、蛍光は、標識抗体、ＤＮＡプローブ、生化学的類似体、脂質、薬物、細胞組成及び高分子に多分に応用されており、蛍光の輝度を増強、光安定性を向上、及び毒性を低下させることで、比較的低い非特異的結合を有すると共に比較的好適な励起及び放射波長を具備させて、光源及び検出器に適用することができる。
【０００６】
分子映像の研究及び応用における主たる発展の方向及び分野には、小動物の映像技術の研究及び新規な分子プローブの発展が包含され、インビボにおける細胞挙動性及び動物形態の研究及び探索には、遺伝子発現、受容体及び輸送体、血管新生、薬物耐性、薬物乱用(drug abuse)、及び標的放射性核種治療（targeted radionuclide therapy）等の造影が含まれる。
【０００７】
我々が探索するのは、酵素により活性化した後、生物相溶性、光学抑制作用及び赤外線蛍光映像プローブが比較的強い信号を生じ得ることであり、このプローブは蛍光供与体を有し、且つ消光体（quencher）が直接ペプチド基質の両端に結合するように設計され（Ｇ．Zlokarnikらは１９９８年Science．第２７９巻第８４頁に掲示し、Ｓ．Ｖ．Gulnikらは１９９７年ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ・第４１３巻第３７９頁に掲示した）、あたかも保護グラフトコポリマーを使用したのと同様に赤外線蛍光プローブの腫瘍転移の制御を助けることができ、且つ最近では既に臨床試験に応用されている（Ｒ．Callahanらは１９９８年Ａｍ．Ｊ．Roentgenol．第１７１巻１３７頁に掲示し、Ｃ．Ｈ．Tung．らは２０００年Cancer Research．第６０巻第４９５３頁に掲示した）。
【０００８】
一種の新規な近赤外線蛍光(near-infrared fluorescence，ＮＩＲＦ）プローブは、酵素によって活性化され、且つインビボにおいて映像を生じ得ることが必要である。酵素で活性化されていないと、このプローブは自己消光作用(self-quench effect)があるために近赤外光線を発することができない。これに対し、酵素が活性化されると、自己消光作用が消失し、光によって活性化されて蛍光を生ずる。
【０００９】
一般的なプローブ設計は、例えば比較的長い循環時間を有することと、比較的高い腫瘍蓄積を有することと、酵素活性化後、赤外線に蛍光を生じ得ることとの特性を有することが必要である。そのプローブの組成は、メトキシポリエチレングリコール(ＭＰＥＧ）をポリ−Ｌ−リジン(ＰＬ)上部分のアミノ基に結合させた後、アミノ酸系列を前記ポリ−Ｌ−リジン(ＰＬ)のその他の部分のアミノ基に結合させ、しかる後、前記アミノ酸系列の他端にＣｙ５．５色素(ｄｙｅ)を結合させることによって達成される。これが近赤外線蛍光プローブである（Ｕ．Mahmoodらは１９９９年Radiology．第２１３巻第８６６頁に掲示した）。光学映像を利用して生物分子造影部分に応用されるのに必要な赤外線蛍光プローブは、酵素で切断された後、光で活性化された時に近赤外線蛍光（ＮＩＲ，λ＝６８０〜９００ｎｍ）を生じ、酵素で切断される前、このプローブは自己消光作用があるために近赤外光線を発することができない。インビボ映像において、このプローブは近赤外線領域範囲（７００〜１，０００ｎｍ）で相当な優越性を有している。例えば、水及び大部分の現存の蛍光色素は近赤外線範囲の光エネルギーを吸収する。従って、赤外線範囲内の近赤外線の放射は可視光線又は光子に比べてより効果的に組織を透過する。インビボ映像における理想的な近赤外線蛍光色素は、（１）ウェーブ・ピークの蛍光が７００〜９００ｎｍの間にある必要があり、（２）量子収量が高く、（３）励起及び放射スペクトラムが狭く、（４）化学的及び光安定性を有し、（５）毒性が低く、（６）生物相溶性、生物分解性及び排出能力を有し、（７）一部の単官能基誘導体を得ることができ、及び（８）商品化の可能性を有する、等の特徴を具備する。
【００１０】
従来技術として、プローブは既に異なるプロテイナーゼの映像に設計されており、例えばＲ．Weisslederらが２００１年Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第７巻第７４０頁及びアメリカ特許ＵＳ２００３／０２１９３８３Ａ１に掲示したように、基質−金属プロテイナーゼ(matrix metallo proteinase ２， ＭＭＰ−２)に対して二種の異なるペプチドを合成するように設計されている。このプローブペプチド構造中、一つはペプチド基質「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＨＮ2 」であり、他の一つは対照ペプチド「Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＮＨ2 」である。アメリカ特許２００３／０２１９３８３Ａ１に記載されている酵素の切断位置は、１）Ｌｙｓ・Ｌｙｓ、２）ＰＩＣ（Ｅｔ）Ｐｈｅ・Ｐｈｅ、３）Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ・、４）Ｐｒｏ（Ｌｅｕ／Ｇｌｎ）Ｇｌｙ・（Ｉｌｅ／Ｌｙｓ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ、５）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ・Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａである。
【００１１】
高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ）を利用することにより、基質−金属プロテイナーゼ(ＭＭＰ−２)の酵素はＧｌｙ−Ｖａｌ残留物を切断する能力を有するものの、この酵素によって対照ペプチドを切断できないことが確認された。ここで、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ）を添加する目的は、主としてその蛍光のタグを定量するためにある他、ペプチド基質のシステインのチオール基(thio group)をポリ−Ｌ−リジン(ＰＬ)のアミノ基及び蛍光色素に結合させて、基質−金属プロテイナーゼ(ＭＭＰ−２)のプローブとすることにある。
【００１２】
Ｃ．Ｈ．Tungらは、２００２年Chem Bio Chem．第３巻第２０７頁にトロンビン・プローブについての設計を掲示した。このプローブ構造中、一つは凝血ペプチド基質「Ｇｌｙ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＮＨ2 」であり、他の一つは対照ペプチド「Ｇｌｙ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＮＨ2 」である。高速液体クロマトグラフィーを利用することにより、このトロンビンの酵素はＡｒｇ−Ｓｅｒ残留物上で活性化する能力を有するものの、対照ペプチドはトロンビンにおいて活性化作用がないことが確認された。
【００１３】
Ｃ．Ｈ．Tungらは、２００２年Angew．Chem．第１１４巻第３８１１頁に、主としてアズレン二量体の近赤外線蛍光（ＮＩＲ）抑制剤を合成して、カルボキシル基末端をペプチド配列、即ちＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓに結合し、且つ、他のＣｙｓ末端を蛍光色素に結合することにより近赤外線蛍光を放射させ、ペプチドはカパーゼ−３(capase-3)を利用してＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ残留物を切断できることを掲示した。
【００１４】
Ｃ．Ｈ．Tungらは、２００３年Tetrahedron Letters．第４４巻第３９７５頁に、主として単一官能基アズレニルスクアレン色素の近赤外線蛍光消光剤（Near Infrared Quencher，ＮＩＲＱ７００）を合成し、波長吸収範囲が６００〜７００ｎｍにあることでこのプローブが効果的に６００〜７５０ｎｍの蛍光色素に抑制され得るのを表示することを掲示した。
【００１５】
Ｋ．Lichaらは、２００１年Bioconjugate Chem．第１２巻第４４頁に、成長ホルモン抑制物質（somatostatine）受容体が診断及び治療上に応用されることについて掲示した。成長ホルモン抑制物質（somatostatine）受容体特異性のペプチドＮ終端アミノ官能基を、インドジカルボシアニン（ＩＤＣＣ）及びインドトリカルボシアニン（ＩＴＣＣ）に結合した結果、このプローブが比較的高いモル吸光係数及び蛍光量子収率を有し、且つ近赤外線蛍光範囲を発射でき、受容体−標的分子光学映像のプローブとするのに適することが確認された。
【００１６】
Ａ．Beckeらは、２００１年Nature Biotehnology．第１９巻第３２７頁に、シアニン色素誘導体を成長ホルモン受容体拮抗剤（octreotate）ペプチド誘導体に結合して、光学映像のプローブとすることを掲示した。それのインビボ内における映像の結果から、インドジカルボシアニン（ＩＤＣＣ）を成長ホルモン受体拮抗剤ペプチドに結合する効果が最適であることを示した。
【００１７】
Ｃ．Ｈ．Tungらは、２０００年Chem Bio Chem第８巻第７８４頁において、小分子プローブが蛍光分子映像の標的化合物、特にペプチドと蛍光色素との結合において、近赤外線蛍光区域範囲（ＮＩＲＦ：７００〜９００ｎｍ）を放射することができ、結果インビボ光学映像中において葉酸受容体にしてから、初めて多くの腫瘍形式、特に卵巣がんを検出できることが確認された。これはこの小分子プローブが比較的良好な薬物速度論及び非免疫性質を有していることによる。
【００１８】
以上、上記文献の結果が示すように、プローブは異なるプロテイナーゼに使用されるように設計されている。本発明は、近赤外線蛍光色素の光学映像プローブを使用し、且つ、ペプチドと近赤外線蛍光色素（Ｃｙ５．５）との結合により得られた生物結合物（bioconjugate）を利用することで、光学映像に要するプローブとすることができる。本研究において、前立腺特異的抗原酵素について設計された前立腺ペプチド基質は、「Ｇｌｙ−Ｈｙｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＮＨ2 」である。我々は先ず、メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）をポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基に接し、さらに上記において設計されたアミノ酸系列両端をポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）及びＣｙ５．５色素に結合して近赤外線蛍光プローブとし、前立腺特異的抗原酵素が有する特異性について研究を行った。
【００１９】
シクロヘキシルグリシン（cyclohexyl-gly，Ｃｈｇ）はアミノ酸の一種であり、次の構造を有する。
【化３】
【００２０】
本発明は、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）と、メトキシポリエチレングリコールとにより組成されたグラフト共重合体（ＰＧＣ）に関し、ペプチド基質の両端がそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に結合している。本発明は特に、前立腺ペプチド基質を利用して光学映像のプローブとすることに関する。
【００２１】
本発明の主たる目的は、前立腺ペプチド基質を提供することと、前立腺がんの光学映像プローブの診断に供することにある。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前立腺光学プローブとして使用されるペプチド化合物及びその製造方法を提供することにある。
【００２３】
要するに、生物活性を具備し、且つ高安定性を有するペプチド化合物の提供は近年の研究の重点となっており、目前に至るまで各界ではなおより良い光学映像プローブの開発に力を尽している。従って、本発明の主旨は、潜在力を有し、且つ安定性の高い生物活性を有するペプチド化合物を合成して光学映像プローブとすることにある。上記の目的を達成するために、本発明は、次の化学式（Ｉ）で示される前立腺ペプチド基質を合成した。
【化４】
【００２４】
本発明により提供される新規なプローブには、前立腺ペプチド基質（Ｉ）が使用され、この一組のペプチドは１１個のアミノ酸により組成され、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の酵素に対して特異性を有する。これについて、Ｄ．Ａ．Armbrusterらは１９６６年Clin.Chem．第７１巻第３２８頁に、Ｂ．Ｋ．Wongらは２００１年Phamacol第２９巻第３１３頁に、Ｒ．Ｓ．Dipaolaらは２００２年Journalof Clinlcal Oncology第２０巻第１８７４頁に、Ｖ．Ｍ．Garskyらは２０００年Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第６巻第１２４８頁に、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ残留物に対して特異性があることを掲示している。この種のペプチド基質は、既に前立腺がんに応用されている。
【００２５】
本発明はまた前立腺がん症状の検出用とする光学映像プローブを提供する。
【化５】
【００２６】
グラフト共重合体（ＰＧＣ）は、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）及びメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）により組成されてなり、そしてペプチド基質の両端はそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に結合して光学映像近赤外線蛍光プローブとすることができる。
【００２７】
式中、
ｄｙｅ＝Ｃｙ５．５，Ｃｙ５，Ｃｙ７，Ａｌｅｘａ７５０，Ａｌｅｘａ６６０，Ａｌｅｘａ６８０，ＩＲ８００，ランタノイド金属錯化合物及び近赤外線色素（Ａｌｅｘａ及びＩＲは商標である）。
【００２８】
Ｐ＝多糖類、ポリリジン、ポリエチレンイミン及び合成ポリマー。
【００２９】
以下、本発明の実施例に記載されるように、本発明により式（Ｉ）に示す前立腺光学映像プローブ化合物を合成した（チャート１）。
【化６】
【００３０】
本発明により合成された光学映像プローブは、以下の特性を有することが期待される。
【００３１】
１．光学映像ペプチド基質に対して比較的高選択性を有する。
【００３２】
２．酵素を利用することによりペプチドを活性化してプローブの標的性を増加させる。
【００３３】
３．ペプチドを含有することにより、標的性を有するプローブを達成する。
【００３４】
本発明の前立腺ペプチド基質化合物は光学映像プローブとすることができ、上記（Ｉ）に示した化学式を有する。
【００３５】
メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミディルプロピオン酸（ＭＰＥＧ−ＳＰＡ）（５）を調製する合成方法は、アメリカ特許第５，６７２，６６２号のＰＥＧ−ＳＰＡを調製する方法を参考にしたものである。
【化７】
【００３６】
スキーム１ メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミディルプロピオン酸（ＭＰＥＧ−ＳＰＡ）の合成。前立腺（ＰＰ）ペプチド基質及びその対照ペプチドの合成はスキーム２に示す通りである。
【化８】
【００３７】
Ｒ＝Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）は前立腺ペプチド基質である
Ｒ＝Ｄ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）は対照ペプチド(control peptide)である
スキーム２ 前立腺基質及び対照ペプチドの合成図
【化９】
【００３８】
スキーム３ 前立腺ペプチド基質光学映像プローブ（Ｃｙ−prostate−ＰＧＣ）及び前立腺ペプチドプローブの合成図
生物活性光学映像プローブの評価
本発明の前立腺ペプチド基質の両端はそれぞれポリ−Ｌ−リジン及び蛍光色素に結合し、光学映像プローブとする生物活性化合物を形成する。
【００３９】
このプローブはＵＶ／Ｖｉｓスペクトログラフで分析され、その結果を図１に示す。そのＦＩＴＣ及びＣｙ５．５の最大吸収波長はそれぞれ４９４及び６７４ｎｍであり、図２に蛍光スペクトログラフの分析結果が示される。そのＦＩＴＣ及びＣｙ５．５の最大励起／放射波長はそれぞれ４８５／５１７及び６５０／６８６ｎｍである。
【００４０】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）酵素のペプチドに対する特異性の探究
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ペプチド分離、ペプチド純度分析及びペプチド基質が特定酵素により切断される特異性の探究に応用され、インビボ分子プローブ映像において、文献の研究によれば、ペプチドの純度が９９％以上に達してから始めて良好な光学映像が得られる。本研究は、前立腺ペプチド基質の開発及び酵素のインビトロの実験探究に関する。
【００４１】
前立腺ペプチド基質及び対照ペプチドと、酵素−前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）との特異性鑑定分析のクロマトグラムは図３及び図４に示す通りである。その高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件は逆方向Ｃ１８クロマトグラフ管柱を使用し、移動相はメチルアルコール：１％トリエチルアミン＝６０：４０（ｖ／ｖ）、流速は０．５ｍＬ／分であり、蛍光検出器により励起及び放射波長がそれぞれ４８０／５２５ｎｍである状態下で検出したところ、前立腺ペプチド基質はＰＳＡ酵素の存在下でＧｌｎ−Ｓｅｒの残留物上で切断され得ることが確認された。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のクロマトグラムにおいて、前立腺ペプチド基質の滞留時間は２．７分間と図３に示されており、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）酵素の存在下で二つのピークが発生し、図３に示すように滞留時間がそれぞれ２．７及び３．２分間である。そして、前立腺対照ペプチドでは、ＰＳＡ酵素が存在しない時と、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）酵素が存在している時、いずれにおいてもなお原始ピークを維持しており、その滞留時間は図４に示すように２．６分間である。
【００４２】
酵素の消光（quenching）及び非消光（nonquenching）の探究
異なる時間の下で、前立腺ペプチド基質及び前立腺対照ペプチドを、酵素−前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）と反応させ、その蛍光スペクトルを記録したところ、図５に示すように、最も原始的なプローブの蛍光強度は比較的低いことが発見された。前立腺ペプチド基質と前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）との反応時間が３５分間を経過した時点で、その信号強度は元来の５倍に増強した。注意すべきところは、前立腺対照ペプチドに前立腺特異的抗原の存在がある時、且つ反応条件が同一の場合、その蛍光強度の増加は１倍にも至らない。
【００４３】
光学映像の探究
ヒト前立腺がん細胞株を対照ペプチドプローブ及び前立腺ペプチド基質プローブとそれぞれ反応させた後、光学映像走査器を利用して造影したところ、図６に示すように、前立腺ペプチドプローブは明らかに対照ペプチドプローブよりも信号強度が増加していることが示され、前立腺ペプチド基質が明らかに細胞株のＰＳＡにより切断され、蛍光が増強した。
【００４４】
以下、実施例をあげてより詳細に本発明の方法、特徴及び方法を説明する。
【実施方式】
【００４５】
近赤外線蛍光色素プローブ（ＮＩＲＥ probe）の合成
実施例１：メトキシポリエチレングリコールニトリル（２）の合成方法
２５グラム（５ミリモル）のメトキシポリエチレングリコールを取り、２５ミリリットルの脱イオン水に溶解した後２５０ミリリットルのシングルネックフラスコ内に入れ、氷浴下（０−５℃）で水酸化カリウム０．５グラム（８．９ミリモル）を添加し、徐々にアセトニトリル４．３ミリリットルを添加して２．５時間反応した。しかる後、燐酸ナトリウムを反応後の溶液に添加してｐＨ値を７．０まで調整し、ジクロロメタン２００，７０及び５０ミリリットルで抽出を三回行い、有機層を収集した後硫酸マグネシウムで水を析出し、ろ過して液体を収集して、エチルエーテルで沈澱を行い、固体を析出した。そして、それをろ過した後真空下に置いて乾燥し白色固体２３．５グラムを得た。収率は９３％である。 1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２．１ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ2 ＣＮ），３．３ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ3 ），３．５ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ−）。13ＣＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２８．８，７０．５，１２８．２。ＩＲ：２３６０ｃｍ-1（−ＣＮ）。
【００４６】
実施例２：メトキシポリエチレングリコールアミド（３）の合成方法
２３．５グラム（４．７ミリモル）のメトキシポリエチレングリコールニトリル
を９８ミリリットルの濃塩酸に溶解し、室温下に置いて４８時間振盪攪拌した。反応終了後、この溶液を１０００ミリリットルの脱イオン水で希釈すると共に、ジクロロメタン２００，１５０及び１０００ミリリットルで抽出を３回行い、有機層を収集して更に脱イオン水で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで水を析出した後、ろ過して濾液を収集し、減圧濃縮機で抽出乾燥した。しかる後、真空下で抽出乾燥し、乾燥後２１．５グラムの生成物を得た。収率は９１．５％である。1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２．４７ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ2 −ＣＯＮＨ2 ），３．２ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ3 ），３．５ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ−）。ＩＲ：３４２４ｃｍ-1（−ＮＨ2 ），１６３８ｃｍ-1，（−ＣＯＮＨ2 ）。
【００４７】
実施例３：メトキシポリエチレングリコールプロピオール酸（４）の合成方法
１６グラム（３．２ミリモル）メトキシポリエチレングリコールアミドを１０００ミリリットルの脱イオン水に溶解し、室温下で水酸化カリウム１００グラム（１．７９モル）を添加して２４時間反応した。反応終了後、さらに塩化ナトリウム１５０グラム（１．９１モル）を添加し、この溶液をジクロロメタン１５０ミリリットルで３回抽出して有機層を収集した。そして有機層収集後さらに５％蓚酸及び脱イオン水で２回洗浄してから硫酸ナトリウムで水を析出した。濾過して濾液を収集した後エチルエーテルを添加して固体を析出し、それを濾過した後真空下に置いて抽出乾燥した結果、生成物１４グラムを得た。収率は８７．５％である。1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２．５ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ2 −ＣＯＯＨ），３．２ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ3 ），３．５ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ−）。13ＣＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：３０．７，３９．５，３９．７，６９．８，２０６．５。ＩＲ：３４５３ｃｍ-1（−ＯＨ）。
【００４８】
実施例４：メトキシ−ポリエチレングリコールサクシニミディルプロピオン酸（ＭＰＥＧ−ＳＰＡ）（５）の合成方法
３．４グラム（１ミリモル）のメトキシ−ポリエチレングリコールプロピオン酸をジクロロメタン２０ミリリットル及びＮ−ハイドロキシサクシニミド（２．１ミリモル）に溶解し、氷浴下（０℃）で反応して、この溶液及び徐々に添加したジシクロヘキシルカルボジイミド（２．１ミリモル）をジクロロメタン４ミリリットル中に溶解した。反応終了後、溶液を室温下で振盪攪拌して終夜反応し、エチルエーテルで沈澱を進行して固体を析出した。それをろ過した後、真空下で抽出乾燥し、生成物３．３グラムを得た。収率は９５％である。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２．８１ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＮＨ5 ），２．９２ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ2 −ＣＯＯ−），３．２ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ3 ），３．５ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ−）。13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２５．２，２５．３，３１．２，５８．８，６９．９，７１．１，７２．３，１６６．７，１６８．８，１６９．４。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．（ｆｏｕｎｄ）Ｃ16Ｈ29Ｎ3Ｏ9 （５１２２）：Ｃ，５５．２３（５４．４２）；Ｈ，９．１（９．１７）；Ｎ，１９．４３（１９．２５）。
【００４９】
実施例５：前立腺（ＰＰ）ペプチド基質及びその対照ペプチドの合成方法
ペプチド系列の調製（１）：
ペプチド合成容器（PS3,Rainin Instrument Co.INC）を利用してペプチドを合成し、１５６ミリグラムのRink Amide樹脂（０．１ミリモル）を反応瓶中に置き、５ミリリットルのジメチルホルムアミドを注入して瓶底に集中させ、窒素ガスを設定して３０分間攪拌した。各種毎のアミノ酸が０．４ミリモルとなる量を秤量し、これを１１個アミノ酸小瓶に分けて置き、瓶外にそのアミノ酸の名称を標示した。各アミノ酸小瓶内には、更にそれぞれ同一当量のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサ−フルオロホスファイト（ＰｙＢＯＰ）２０８ミリグラム（０．４ミリモル）を添加した。小瓶をＣ端からＮ端の順序に従って回転板３ないし１３の位置に置いた。その前立腺基質及び対照ペプチドの各アミノ酸配列とその重量を実行した。以下３ないし１２に選用された保護基はいずれもＦｍｏｃであり、そしてＮ終端のみＢｏｃを保護基とした。ＰＳ３のメーンメニュー系統に進み、１を選んでＥＤＩＴ及びＲＵＮに入り、合成パラメータをＰＲＧ０３（単一カップリング、先ず保護基Ｆｍｏｃを除去する）に設定する。次に２０％ヘキサヒドロピリジンを用いてＮ端保護基（ＤＥＰ）を２回（５分間／１回）除去するように設定する。次にアミノ酸及びカップリング試剤ＮＭＭと溶解して活性化し、その混合時間は３０秒、樹脂と各アミノ酸とのカップリング攪拌（ＡＡ）時間は２時間であり、ＲＵＮキーを押して合成を開始した。しかる後、各反応の終了後、一部の樹脂を取出してKaiser test分析テストを行い、ヒドラジン７．５μｌ及びフェノール１０μｌを添加して、１１０〜１２０℃の温度下で３分間反応し、もし黄色を呈すれば保護基が存在していることを表わす。反応が最後１個のアミノ酸小瓶（回転板１３）に進行して合成が確定的に完了した時、ＰＡＵＳＥキーを２回押して反応をしばらく停止する。ＥＸＩＴを押してメーンメニュー（MAIN menu）まで戻し、２を選んで（MANUAL OPERATION）に進み、３を選んで（REACTION VESSEL CONTROL）に進入する。反応瓶を外し、アルコールで樹脂を洗浄してからジクロロメタンで再度洗浄し、それをろ過した後真空下で抽出乾燥した。
【００５０】
リジン上側鎖Ｄｄｅの保護基の除去（２）
０．２ミリリットルのジアミドを１０ミリリットルのジメチルホルムアミドに溶解して、その濃度を２％にさせると共に樹脂と３分間反応し、洗浄ステップを２回重複した。反応が終了した後、Kaiser test分析テストを行い、樹脂が青色を呈すれば保護が完全に除去されたことを表わすので再度樹脂を抽出器ろ過瓶下に置き、アルコールで洗浄した後、再度ジクロロメタンで洗浄し、それをろ過した後真空下において抽出乾燥した。
【００５１】
リジン側鎖のＦＩＴＣへの接合（３）
１５５．８ミリグラム（０．４ミリモル）のＦＩＴＣを取って樹脂と反応し、１ミリリットルのジメチルスルホキシド及びジイソプロピルエチルアミンに溶解した後、室温下で２４時間振盪攪拌した。反応終了後、Kaiser test分析テストを行い、樹脂が濃厚な黄色を呈すればＦＩＴＣが接合していることを表わす。次にアルコール及びジクロロメタンで樹脂を洗浄し、それをろ過した後、真空下に置いて抽出乾燥した。
【００５２】
アミノ酸系列上側鎖保護基の切断（４）
５ミリリットルの既に妥当に配置された切除試剤および脱保護基の溶剤トリフルオロ酢酸／水／エタンジサルファイド／トリエチルシリコン（９４．５／２．５／２．５／１）を取り、０．１グラムの樹脂と２．５時間十分に振盪攪拌反応し、アルコールで樹脂を洗浄した後、それをろ過して濾液を収集した。しかる後、濾液を減圧真空濃縮機に置いて微乾するまで抽出した。次に、氷浴下でゆっくり氷エチルエーテルを滴下して沈澱を行い、遠心機で約５分間遠心を進行し回転速度を６０００ｒｐｍまでに調整して固体及び液体に分離させ、以上のステップを重複してエチルエーテルで２回ないし５回洗浄した後、このエチルエーテルを抽出乾燥し、黄色固体、即ち前立腺ペプチド系列を得た。しかる後、真空下に置いて抽出乾燥し、１２９．４ミリグラムの生成物を得た。収率は８３％である。
【００５３】
ペプチド純度化鑑定（５）
得られたペプチド系列を１ミリグラム取り、１ミリリットルのメチルアルコール中に溶解して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で純度鑑定を行い、既に配置されている前立腺ペプチド基質の移動相を溶離溶液とした。そのＥＳＩ−ＭＳ（ＮＨ+ ）：前立腺ペプチド基質は１５６３．６６（calcd），１５６３．６２（found）であり、対照ペプチドは１５６３．６６（cacl），１５６３．６４（found）である。
【００５４】
実施例６：前立腺近赤外線蛍光色素プローブ（Prostate near-infrared fluorescence probe，NIRF Probe）（４）の合成方法
近赤外線蛍光色素プローブの合成はスキーム３に示す通りである。
【００５５】
保護グラフト共重合体（ＰＧＣ）の調製（１）
５０ミリグラム（３．４ミリモル）のポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）を１２．５ミリリットルの炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解し、ゆっくりＭＰＥＧ−ＳＰＡ３９７．５ミリグラム（７９．５ミリモル）を添加して均等に混合した後、水酸化ナトリウムでそれをｐＨ７．７までに調整して室温下で３時間振盪攪拌した。しかる後、ＹＭ−３の薄膜を利用して限外濾過（ultrafiltration）した後、上層液を取り出して冷凍乾燥（lyophilize）を行い、結果綿糸状のグラフト共重合体（ＰＧＣ，５０．８ミリグラム）を得た。そして、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で遊離アミノ数を分析した。
【００５６】
ヨードアセチル化保護グラフト共重合体（iodoacetytate protected graft copolymer，ＬＡ−ＰＧＣ）の調製（２）
７．５ミリグラムグラフト共重合体（ＰＧＣ，０．１ミリモル）を０．２ミリリットル炭酸水素ナトリウム（５０ミリモル濃度）に溶解し、過量のヨード酢酸無水物（２６．３ミリグラム，１０ミリモル）をジメチルホルムアミド０．１ミリリットル中に溶解して均等に混合した後ヨードアセチル作用を進行し、室温下で３時間反応して遠心後、ＹＭ−３の薄膜を利用して限外濾過を行った後上層液を取り、冷凍乾燥を行ったところ、綿糸状のヨードアセチル化保護グラフト共重合体（ＬＡ−ＰＧＣ，７ミリグラム）を得た。そして、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で分析を行い、測定結果が無色であるので遊離アミノ基の存在が無いことを示した。
【００５７】
実施例７：
ペプチド保護グラフト共重合体（peptide protected graft copolymer，Ｐ−ＰＧＣ）の調製（３）
５ミリグラムのヨードアセチル化保護グラフト共重合体（ＬＡ−ＰＧＣ）を取り、それにペプチド基質３．２ミリグラム（２ミリモル）及び対照ペプチド３．２ミリグラム（２ミリモル）を添加して、０．２ミリリットルのアセトニトリル及び０．２ミリリットルの酢酸ナトリウム（０．１Ｍ，pH６．５）緩衝溶液中に溶解し、３時間反応を行った。次にSephadex Ｇ−２５（２０ｃｍ×１ｃｍ）を利用して精製を行った。この時の溶離液は燐酸塩緩衝溶液（１０ｍＭ，ｐＨ７．０）である。次に、分別収集器（tractional collector）を利用して、各試験管内に２ミリリットル収集された液体を収集し、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトログラフで波長が４９４ｎｍ下の各試験管の吸収度を測定した。試験管数を横座標、吸収値を縦座標とした図を作り、第１個の吸収ピーク即ち大分子量のペプチド保護グラフト共重合体を得た。すべての液体を収集して冷凍乾燥を行った結果、針状のペプチド基質及び対照ペプチドの保護グラフト共重合体（５７ミリグラム及び２７．６ミリグラム）を得た。
【００５８】
前立腺近赤外線蛍光色素プローブ（prostate near-infrared fluorescence NIRF Prob）の調製（４）
０．５ミリグラムのペプチド保護グラフト共重合体（Ｐ−ＰＧＣ）を０．２ミリリットルの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムに溶解した後、１ミリグラムのＣｙ５．５色素（１μｍｏｌ）を添加して反応を進行し、均等に混合した後、室温下で１時間振盪攪拌して遠心した。遠心後、ＹＭ−３の薄膜を利用して限外濾過を行い、上層液を取って冷凍乾燥を行った結果、青色の固体プローブ（０．７ミリグラム）を得た。そして蛍光スペクトログラフでその激発及び放射波長範囲を測量した。
【００５９】
上記に記載した実施の方式は本発明の技術的手段をより具体的に説明するためにあり、当然本発明の技術的思想はこれに限定されず、添付のクレームの範囲を逸脱しない限り当業者による単純な設計変更、付加、修飾等はいずれも本発明の技術的範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、ＦＩＴＣ（灰色線）、Ｃｙ５．５（点線）及び前立腺プローブＣｙ５．５−prostate-ＰＧＣ（黒色線）のＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す図である。
【図２】図２は、前立腺プローブＣｙ５．５−prostate-ＰＧＣ蛍光のスペクトログラムである。
【図３】図３は、（Ａ）前立腺ペプチド基質（０．６４μｍｏｌ）の高速液体クロマトグラム（黒色線）、 （Ｂ）前立腺ペプチド基質の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の存在下におけるクロマトグラム（灰色線）である。
【図４】図４は、（Ａ）前立腺対照ペプチド（０．６４μｍｏｌ）の高速液体クロマトグラム（黒色線）、 （Ｂ）前立腺対照ペプチドのＰＳＡ存在下におけるクロマトグラム（灰色線）である。
【図５】図５は、前立腺基質プローブＣｙ−prostate−ＰＧＣ（■）、対照ペプチドプローブ（△）及びＰＳＡ存在下の前立腺生態ペプチドプローブ（◆）について、対照ペプチド（×）の異なる時間における蛍光強度を示す図である。
【図６】図６は、ヒト前立腺がん細胞株が対照ペプチドプローブ及び前立腺基質プローブとそれぞれ反応して得た光学映像（光学映像系統は６１０〜６６０ｎｍろ過器及び６２５〜７００ｎｍの放射ろ過器である）を示す図である。
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明はグラフト共重合体がポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）及びメトキシエチレングリコール(ＭＰＥＧ）により組成され、そしてペプチド基質の両端がそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に結合する前立腺光学プローブのペプチド化合物に関し、特に、前立腺ペプチド基質を利用して光学映像のプローブとする発明に関する。
【従来の技術】
【０００２】
引例には特殊のペプチド基質の両端をそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）及び蛍光色素に接触させ、又はペプチド基質の両端をそれぞれ蛍光色素及び蛍光色素の抑制剤に結合させる方法が開示されている。
【０００３】
近年、光学映像ソフト・ハードウエアの発展により、映像学の診断が飛躍的に進化してきている。そして、更に一歩進んで光学映像の診断の感度及び精度を向上させるために、安全で安定的な標的光学映像プローブを開発することが光学映像研究における重要な方向性の一つとなっている。一般の光学映像プローブではペプチド基質の両端がそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に結合されている。
【発明の開示】
【０００４】
生物の分子映像／分子イメージング（molecular imaging）には、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、核医学及び光学映像の利用が包括され、磁気共鳴像、核医学及び光学インビボ映像技術の発展により、過去１０年においてインビボ分子映像の研究及び応用が迅速に発展してきた。そして、インビボ分子映像が、正常及び異常細胞プロセスを含む分子のインビボ生物システム及び遺伝子機能レベルの観察及び情報を提供したことにより、これをヒト疾病の早期の正確な診断と遺伝子医学及び新薬の加速的な開発に応用することが可能となり、この三種の造影機器の利用に必要な薬物は、主として生物活性及びターゲティング能を有する。一般的伝統的な医学結像技術は、腫瘍サイズ等の疾病後期の状況しか反応しない。これに対し、分子映像技術は、がん直前の分子改変、がん早期の転移及び心血管初期繊維の形成等の早期疾病の生物特性変異を検出することができ、腫瘍、冠状心臓病及び胸部疾病等、ヒトの生命を脅かす疾病の最適な早期診断方法である。インビボ分子映像分野には、分子生物学、化学、物理学、放射線医学及びコンピューター科学等の研究分野が包括される。インビボ映像は各分野の中枢技術の共同的貢献によらなければならないので、インビボによる特定の分子映像は、近年の発展において一般的伝統的な医学映像と比べて分子映像に顕著な優越性が認められる。多くの研究もまた、疾病分子の反応機構及び細胞組成に向っているが、主要な努力の方向は非侵略性、高解析度及びインビボにおける映像技術に向けられている。この他、現今では分子映像は、人体解剖学及び病理学を基礎とする核医学結像技術、磁気共鳴結像技術及び光学結像に比べ、既にナノメータを単位とする生物分子レベルの研究に入っているので、疾病の早期診断及び観測を遺伝子レベルで行い、その研究の成果及び技術は広く生物学及び疾病の研究に応用されることが期待されている。
【０００５】
典型的な蛍光色素は、可視光線（４００〜６００ｎｍ）の範囲内で蛍光を発し、分光光度計又は蛍光顕微鏡により極めて容易にその蛍光信号を見ることができるが、この波長範囲内の光子をインビボ内又はインビボ外で適用するのは理想的でない。なぜならば、組織及び血液がこの波長の光子を吸収するからである。近年、蛍光は、標識抗体、ＤＮＡプローブ、生化学的類似体、脂質、薬物、細胞組成及び高分子に多分に応用されており、蛍光の輝度を増強、光安定性を向上、及び毒性を低下させることで、比較的低い非特異的結合を有すると共に比較的好適な励起及び放射波長を具備させて、光源及び検出器に適用することができる。
【０００６】
分子映像の研究及び応用における主たる発展の方向及び分野には、小動物の映像技術の研究及び新規な分子プローブの発展が包含され、インビボにおける細胞挙動性及び動物形態の研究及び探索には、遺伝子発現、受容体及び輸送体、血管新生、薬物耐性、薬物乱用(drug abuse)、及び標的放射性核種治療（targeted radionuclide therapy）等の造影が含まれる。
【０００７】
我々が探索するのは、酵素により活性化した後、生物相溶性、光学抑制作用及び赤外線蛍光映像プローブが比較的強い信号を生じ得ることであり、このプローブは蛍光供与体を有し、且つ消光体（quencher）が直接ペプチド基質の両端に結合するように設計され（Ｇ．Zlokarnikらは１９９８年Science．第２７９巻第８４頁に掲示し、Ｓ．Ｖ．Gulnikらは１９９７年ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ・第４１３巻第３７９頁に掲示した）、あたかも保護グラフトコポリマーを使用したのと同様に赤外線蛍光プローブの腫瘍転移の制御を助けることができ、且つ最近では既に臨床試験に応用されている（Ｒ．Callahanらは１９９８年Ａｍ．Ｊ．Roentgenol．第１７１巻１３７頁に掲示し、Ｃ．Ｈ．Tung．らは２０００年Cancer Research．第６０巻第４９５３頁に掲示した）。
【０００８】
一種の新規な近赤外線蛍光(near-infrared fluorescence，ＮＩＲＦ）プローブは、酵素によって活性化され、且つインビボにおいて映像を生じ得ることが必要である。酵素で活性化されていないと、このプローブは自己消光作用(self-quench effect)があるために近赤外光線を発することができない。これに対し、酵素が活性化されると、自己消光作用が消失し、光によって活性化されて蛍光を生ずる。
【０００９】
一般的なプローブ設計は、例えば比較的長い循環時間を有することと、比較的高い腫瘍蓄積を有することと、酵素活性化後、赤外線に蛍光を生じ得ることとの特性を有することが必要である。そのプローブの組成は、メトキシポリエチレングリコール(ＭＰＥＧ）をポリ−Ｌ−リジン(ＰＬ)上部分のアミノ基に結合させた後、アミノ酸系列を前記ポリ−Ｌ−リジン(ＰＬ)のその他の部分のアミノ基に結合させ、しかる後、前記アミノ酸系列の他端にＣｙ５．５色素(ｄｙｅ)を結合させることによって達成される。これが近赤外線蛍光プローブである（Ｕ．Mahmoodらは１９９９年Radiology．第２１３巻第８６６頁に掲示した）。光学映像を利用して生物分子造影部分に応用されるのに必要な赤外線蛍光プローブは、酵素で切断された後、光で活性化された時に近赤外線蛍光（ＮＩＲ，λ＝６８０〜９００ｎｍ）を生じ、酵素で切断される前、このプローブは自己消光作用があるために近赤外光線を発することができない。インビボ映像において、このプローブは近赤外線領域範囲（７００〜１，０００ｎｍ）で相当な優越性を有している。例えば、水及び大部分の現存の蛍光色素は近赤外線範囲の光エネルギーを吸収する。従って、赤外線範囲内の近赤外線の放射は可視光線又は光子に比べてより効果的に組織を透過する。インビボ映像における理想的な近赤外線蛍光色素は、（１）ウェーブ・ピークの蛍光が７００〜９００ｎｍの間にある必要があり、（２）量子収量が高く、（３）励起及び放射スペクトラムが狭く、（４）化学的及び光安定性を有し、（５）毒性が低く、（６）生物相溶性、生物分解性及び排出能力を有し、（７）一部の単官能基誘導体を得ることができ、及び（８）商品化の可能性を有する、等の特徴を具備する。
【００１０】
従来技術として、プローブは既に異なるプロテイナーゼの映像に設計されており、例えばＲ．Weisslederらが２００１年Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第７巻第７４０頁及びアメリカ特許ＵＳ２００３／０２１９３８３Ａ１に掲示したように、基質−金属プロテイナーゼ(matrix metallo proteinase ２， ＭＭＰ−２)に対して二種の異なるペプチドを合成するように設計されている。このプローブペプチド構造中、一つはペプチド基質「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＨＮ2 」であり、他の一つは対照ペプチド「Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＮＨ2 」である。アメリカ特許２００３／０２１９３８３Ａ１に記載されている酵素の切断位置は、１）Ｌｙｓ・Ｌｙｓ、２）ＰＩＣ（Ｅｔ）Ｐｈｅ・Ｐｈｅ、３）Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ・、４）Ｐｒｏ（Ｌｅｕ／Ｇｌｎ）Ｇｌｙ・（Ｉｌｅ／Ｌｙｓ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ、５）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ・Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａである。
【００１１】
高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ）を利用することにより、基質−金属プロテイナーゼ(ＭＭＰ−２)の酵素はＧｌｙ−Ｖａｌ残留物を切断する能力を有するものの、この酵素によって対照ペプチドを切断できないことが確認された。ここで、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ）を添加する目的は、主としてその蛍光のタグを定量するためにある他、ペプチド基質のシステインのチオール基(thio group)をポリ−Ｌ−リジン(ＰＬ)のアミノ基及び蛍光色素に結合させて、基質−金属プロテイナーゼ(ＭＭＰ−２)のプローブとすることにある。
【００１２】
Ｃ．Ｈ．Tungらは、２００２年Chem Bio Chem．第３巻第２０７頁にトロンビン・プローブについての設計を掲示した。このプローブ構造中、一つは凝血ペプチド基質「Ｇｌｙ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＮＨ2 」であり、他の一つは対照ペプチド「Ｇｌｙ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＮＨ2 」である。高速液体クロマトグラフィーを利用することにより、このトロンビンの酵素はＡｒｇ−Ｓｅｒ残留物上で活性化する能力を有するものの、対照ペプチドはトロンビンにおいて活性化作用がないことが確認された。
【００１３】
Ｃ．Ｈ．Tungらは、２００２年Angew．Chem．第１１４巻第３８１１頁に、主としてアズレン二量体の近赤外線蛍光（ＮＩＲ）抑制剤を合成して、カルボキシル基末端をペプチド配列、即ちＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓに結合し、且つ、他のＣｙｓ末端を蛍光色素に結合することにより近赤外線蛍光を放射させ、ペプチドはカパーゼ−３(capase-3)を利用してＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ残留物を切断できることを掲示した。
【００１４】
Ｃ．Ｈ．Tungらは、２００３年Tetrahedron Letters．第４４巻第３９７５頁に、主として単一官能基アズレニルスクアレン色素の近赤外線蛍光消光剤（Near Infrared Quencher，ＮＩＲＱ７００）を合成し、波長吸収範囲が６００〜７００ｎｍにあることでこのプローブが効果的に６００〜７５０ｎｍの蛍光色素に抑制され得るのを表示することを掲示した。
【００１５】
Ｋ．Lichaらは、２００１年Bioconjugate Chem．第１２巻第４４頁に、成長ホルモン抑制物質（somatostatine）受容体が診断及び治療上に応用されることについて掲示した。成長ホルモン抑制物質（somatostatine）受容体特異性のペプチドＮ終端アミノ官能基を、インドジカルボシアニン（ＩＤＣＣ）及びインドトリカルボシアニン（ＩＴＣＣ）に結合した結果、このプローブが比較的高いモル吸光係数及び蛍光量子収率を有し、且つ近赤外線蛍光範囲を発射でき、受容体−標的分子光学映像のプローブとするのに適することが確認された。
【００１６】
Ａ．Beckeらは、２００１年Nature Biotehnology．第１９巻第３２７頁に、シアニン色素誘導体を成長ホルモン受容体拮抗剤（octreotate）ペプチド誘導体に結合して、光学映像のプローブとすることを掲示した。それのインビボ内における映像の結果から、インドジカルボシアニン（ＩＤＣＣ）を成長ホルモン受体拮抗剤ペプチドに結合する効果が最適であることを示した。
【００１７】
Ｃ．Ｈ．Tungらは、２０００年Chem Bio Chem第８巻第７８４頁において、小分子プローブが蛍光分子映像の標的化合物、特にペプチドと蛍光色素との結合において、近赤外線蛍光区域範囲（ＮＩＲＦ：７００〜９００ｎｍ）を放射することができ、結果インビボ光学映像中において葉酸受容体にしてから、初めて多くの腫瘍形式、特に卵巣がんを検出できることが確認された。これはこの小分子プローブが比較的良好な薬物速度論及び非免疫性質を有していることによる。
【００１８】
以上、上記文献の結果が示すように、プローブは異なるプロテイナーゼに使用されるように設計されている。本発明は、近赤外線蛍光色素の光学映像プローブを使用し、且つ、ペプチドと近赤外線蛍光色素（Ｃｙ５．５）との結合により得られた生物結合物（bioconjugate）を利用することで、光学映像に要するプローブとすることができる。本研究において、前立腺特異的抗原酵素について設計された前立腺ペプチド基質は、「Ｇｌｙ−Ｈｙｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）−Ｃｙｓ−ＮＨ2 」である。我々は先ず、メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）をポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基に接し、さらに上記において設計されたアミノ酸系列両端をポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）及びＣｙ５．５色素に結合して近赤外線蛍光プローブとし、前立腺特異的抗原酵素が有する特異性について研究を行った。
【００１９】
シクロヘキシルグリシン（cyclohexyl-gly，Ｃｈｇ）はアミノ酸の一種であり、次の構造を有する。
【化３】
【００２０】
本発明は、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）と、メトキシポリエチレングリコールとにより組成されたグラフト共重合体（ＰＧＣ）に関し、ペプチド基質の両端がそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に結合している。本発明は特に、前立腺ペプチド基質を利用して光学映像のプローブとすることに関する。
【００２１】
本発明の主たる目的は、前立腺ペプチド基質を提供することと、前立腺がんの光学映像プローブの診断に供することにある。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前立腺光学プローブとして使用されるペプチド化合物及びその製造方法を提供することにある。
【００２３】
要するに、生物活性を具備し、且つ高安定性を有するペプチド化合物の提供は近年の研究の重点となっており、目前に至るまで各界ではなおより良い光学映像プローブの開発に力を尽している。従って、本発明の主旨は、潜在力を有し、且つ安定性の高い生物活性を有するペプチド化合物を合成して光学映像プローブとすることにある。上記の目的を達成するために、本発明は、次の化学式（Ｉ）で示される前立腺ペプチド基質を合成した。
【化４】
【００２４】
本発明により提供される新規なプローブには、前立腺ペプチド基質（Ｉ）が使用され、この一組のペプチドは１１個のアミノ酸により組成され、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の酵素に対して特異性を有する。これについて、Ｄ．Ａ．Armbrusterらは１９６６年Clin.Chem．第７１巻第３２８頁に、Ｂ．Ｋ．Wongらは２００１年Phamacol第２９巻第３１３頁に、Ｒ．Ｓ．Dipaolaらは２００２年Journalof Clinlcal Oncology第２０巻第１８７４頁に、Ｖ．Ｍ．Garskyらは２０００年Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第６巻第１２４８頁に、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ残留物に対して特異性があることを掲示している。この種のペプチド基質は、既に前立腺がんに応用されている。
【００２５】
本発明はまた前立腺がん症状の検出用とする光学映像プローブを提供する。
【化５】
【００２６】
グラフト共重合体（ＰＧＣ）は、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）及びメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）により組成されてなり、そしてペプチド基質の両端はそれぞれポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）上部分のアミノ基及び蛍光色素Ｃｙ５．５に結合して光学映像近赤外線蛍光プローブとすることができる。
【００２７】
式中、
ｄｙｅ＝Ｃｙ５．５，Ｃｙ５，Ｃｙ７，Ａｌｅｘａ７５０，Ａｌｅｘａ６６０，Ａｌｅｘａ６８０，ＩＲ８００，ランタノイド金属錯化合物及び近赤外線色素（Ａｌｅｘａ及びＩＲは商標である）。
【００２８】
Ｐ＝多糖類、ポリリジン、ポリエチレンイミン及び合成ポリマー。
【００２９】
以下、本発明の実施例に記載されるように、本発明により式（Ｉ）に示す前立腺光学映像プローブ化合物を合成した（チャート１）。
【化６】
【００３０】
本発明により合成された光学映像プローブは、以下の特性を有することが期待される。
【００３１】
１．光学映像ペプチド基質に対して比較的高選択性を有する。
【００３２】
２．酵素を利用することによりペプチドを活性化してプローブの標的性を増加させる。
【００３３】
３．ペプチドを含有することにより、標的性を有するプローブを達成する。
【００３４】
本発明の前立腺ペプチド基質化合物は光学映像プローブとすることができ、上記（Ｉ）に示した化学式を有する。
【００３５】
メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミディルプロピオン酸（ＭＰＥＧ−ＳＰＡ）（５）を調製する合成方法は、アメリカ特許第５，６７２，６６２号のＰＥＧ−ＳＰＡを調製する方法を参考にしたものである。
【化７】
【００３６】
スキーム１ メトキシポリエチレングリコール−スクシンイミディルプロピオン酸（ＭＰＥＧ−ＳＰＡ）の合成。前立腺（ＰＰ）ペプチド基質及びその対照ペプチドの合成はスキーム２に示す通りである。
【化８】
【００３７】
Ｒ＝Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）は前立腺ペプチド基質である
Ｒ＝Ｄ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）は対照ペプチド(control peptide)である
スキーム２ 前立腺基質及び対照ペプチドの合成図
【化９】
【００３８】
スキーム３ 前立腺ペプチド基質光学映像プローブ（Ｃｙ−prostate−ＰＧＣ）及び前立腺ペプチドプローブの合成図
生物活性光学映像プローブの評価
本発明の前立腺ペプチド基質の両端はそれぞれポリ−Ｌ−リジン及び蛍光色素に結合し、光学映像プローブとする生物活性化合物を形成する。
【００３９】
このプローブはＵＶ／Ｖｉｓスペクトログラフで分析され、その結果を図１に示す。そのＦＩＴＣ及びＣｙ５．５の最大吸収波長はそれぞれ４９４及び６７４ｎｍであり、図２に蛍光スペクトログラフの分析結果が示される。そのＦＩＴＣ及びＣｙ５．５の最大励起／放射波長はそれぞれ４８５／５１７及び６５０／６８６ｎｍである。
【００４０】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）酵素のペプチドに対する特異性の探究
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ペプチド分離、ペプチド純度分析及びペプチド基質が特定酵素により切断される特異性の探究に応用され、インビボ分子プローブ映像において、文献の研究によれば、ペプチドの純度が９９％以上に達してから始めて良好な光学映像が得られる。本研究は、前立腺ペプチド基質の開発及び酵素のインビトロの実験探究に関する。
【００４１】
前立腺ペプチド基質及び対照ペプチドと、酵素−前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）との特異性鑑定分析のクロマトグラムは図３及び図４に示す通りである。その高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件は逆方向Ｃ１８クロマトグラフ管柱を使用し、移動相はメチルアルコール：１％トリエチルアミン＝６０：４０（ｖ／ｖ）、流速は０．５ｍＬ／分であり、蛍光検出器により励起及び放射波長がそれぞれ４８０／５２５ｎｍである状態下で検出したところ、前立腺ペプチド基質はＰＳＡ酵素の存在下でＧｌｎ−Ｓｅｒの残留物上で切断され得ることが確認された。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のクロマトグラムにおいて、前立腺ペプチド基質の滞留時間は２．７分間と図３に示されており、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）酵素の存在下で二つのピークが発生し、図３に示すように滞留時間がそれぞれ２．７及び３．２分間である。そして、前立腺対照ペプチドでは、ＰＳＡ酵素が存在しない時と、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）酵素が存在している時、いずれにおいてもなお原始ピークを維持しており、その滞留時間は図４に示すように２．６分間である。
【００４２】
酵素の消光（quenching）及び非消光（nonquenching）の探究
異なる時間の下で、前立腺ペプチド基質及び前立腺対照ペプチドを、酵素−前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）と反応させ、その蛍光スペクトルを記録したところ、図５に示すように、最も原始的なプローブの蛍光強度は比較的低いことが発見された。前立腺ペプチド基質と前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）との反応時間が３５分間を経過した時点で、その信号強度は元来の５倍に増強した。注意すべきところは、前立腺対照ペプチドに前立腺特異的抗原の存在がある時、且つ反応条件が同一の場合、その蛍光強度の増加は１倍にも至らない。
【００４３】
光学映像の探究
ヒト前立腺がん細胞株を対照ペプチドプローブ及び前立腺ペプチド基質プローブとそれぞれ反応させた後、光学映像走査器を利用して造影したところ、図６に示すように、前立腺ペプチドプローブは明らかに対照ペプチドプローブよりも信号強度が増加していることが示され、前立腺ペプチド基質が明らかに細胞株のＰＳＡにより切断され、蛍光が増強した。
【００４４】
以下、実施例をあげてより詳細に本発明の方法、特徴及び方法を説明する。
【実施方式】
【００４５】
近赤外線蛍光色素プローブ（ＮＩＲＥ probe）の合成
実施例１：メトキシポリエチレングリコールニトリル（２）の合成方法
２５グラム（５ミリモル）のメトキシポリエチレングリコールを取り、２５ミリリットルの脱イオン水に溶解した後２５０ミリリットルのシングルネックフラスコ内に入れ、氷浴下（０−５℃）で水酸化カリウム０．５グラム（８．９ミリモル）を添加し、徐々にアセトニトリル４．３ミリリットルを添加して２．５時間反応した。しかる後、燐酸ナトリウムを反応後の溶液に添加してｐＨ値を７．０まで調整し、ジクロロメタン２００，７０及び５０ミリリットルで抽出を三回行い、有機層を収集した後硫酸マグネシウムで水を析出し、ろ過して液体を収集して、エチルエーテルで沈澱を行い、固体を析出した。そして、それをろ過した後真空下に置いて乾燥し白色固体２３．５グラムを得た。収率は９３％である。 1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２．１ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ2 ＣＮ），３．３ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ3 ），３．５ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ−）。13ＣＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２８．８，７０．５，１２８．２。ＩＲ：２３６０ｃｍ-1（−ＣＮ）。
【００４６】
実施例２：メトキシポリエチレングリコールアミド（３）の合成方法
２３．５グラム（４．７ミリモル）のメトキシポリエチレングリコールニトリル
を９８ミリリットルの濃塩酸に溶解し、室温下に置いて４８時間振盪攪拌した。反応終了後、この溶液を１０００ミリリットルの脱イオン水で希釈すると共に、ジクロロメタン２００，１５０及び１０００ミリリットルで抽出を３回行い、有機層を収集して更に脱イオン水で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで水を析出した後、ろ過して濾液を収集し、減圧濃縮機で抽出乾燥した。しかる後、真空下で抽出乾燥し、乾燥後２１．５グラムの生成物を得た。収率は９１．５％である。1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２．４７ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ2 −ＣＯＮＨ2 ），３．２ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ3 ），３．５ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ−）。ＩＲ：３４２４ｃｍ-1（−ＮＨ2 ），１６３８ｃｍ-1，（−ＣＯＮＨ2 ）。
【００４７】
実施例３：メトキシポリエチレングリコールプロピオール酸（４）の合成方法
１６グラム（３．２ミリモル）メトキシポリエチレングリコールアミドを１０００ミリリットルの脱イオン水に溶解し、室温下で水酸化カリウム１００グラム（１．７９モル）を添加して２４時間反応した。反応終了後、さらに塩化ナトリウム１５０グラム（１．９１モル）を添加し、この溶液をジクロロメタン１５０ミリリットルで３回抽出して有機層を収集した。そして有機層収集後さらに５％蓚酸及び脱イオン水で２回洗浄してから硫酸ナトリウムで水を析出した。濾過して濾液を収集した後エチルエーテルを添加して固体を析出し、それを濾過した後真空下に置いて抽出乾燥した結果、生成物１４グラムを得た。収率は８７．５％である。1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２．５ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ2 −ＣＯＯＨ），３．２ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ3 ），３．５ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ−）。13ＣＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：３０．７，３９．５，３９．７，６９．８，２０６．５。ＩＲ：３４５３ｃｍ-1（−ＯＨ）。
【００４８】
実施例４：メトキシ−ポリエチレングリコールサクシニミディルプロピオン酸（ＭＰＥＧ−ＳＰＡ）（５）の合成方法
３．４グラム（１ミリモル）のメトキシ−ポリエチレングリコールプロピオン酸をジクロロメタン２０ミリリットル及びＮ−ハイドロキシサクシニミド（２．１ミリモル）に溶解し、氷浴下（０℃）で反応して、この溶液及び徐々に添加したジシクロヘキシルカルボジイミド（２．１ミリモル）をジクロロメタン４ミリリットル中に溶解した。反応終了後、溶液を室温下で振盪攪拌して終夜反応し、エチルエーテルで沈澱を進行して固体を析出した。それをろ過した後、真空下で抽出乾燥し、生成物３．３グラムを得た。収率は９５％である。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２．８１ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＮＨ5 ），２．９２ｐｐｍ（ｔ，４Ｈ，−ＣＨ2 −ＣＯＯ−），３．２ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ3 ），３．５ｐｐｍ（ｓ，−ＯＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ−）。13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ），δ（ｐｐｍ）：２５．２，２５．３，３１．２，５８．８，６９．９，７１．１，７２．３，１６６．７，１６８．８，１６９．４。Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．（ｆｏｕｎｄ）Ｃ16Ｈ29Ｎ3Ｏ9 （５１２２）：Ｃ，５５．２３（５４．４２）；Ｈ，９．１（９．１７）；Ｎ，１９．４３（１９．２５）。
【００４９】
実施例５：前立腺（ＰＰ）ペプチド基質及びその対照ペプチドの合成方法
ペプチド系列の調製（１）：
ペプチド合成容器（PS3,Rainin Instrument Co.INC）を利用してペプチドを合成し、１５６ミリグラムのRink Amide樹脂（０．１ミリモル）を反応瓶中に置き、５ミリリットルのジメチルホルムアミドを注入して瓶底に集中させ、窒素ガスを設定して３０分間攪拌した。各種毎のアミノ酸が０．４ミリモルとなる量を秤量し、これを１１個アミノ酸小瓶に分けて置き、瓶外にそのアミノ酸の名称を標示した。各アミノ酸小瓶内には、更にそれぞれ同一当量のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサ−フルオロホスファイト（ＰｙＢＯＰ）２０８ミリグラム（０．４ミリモル）を添加した。小瓶をＣ端からＮ端の順序に従って回転板３ないし１３の位置に置いた。その前立腺基質及び対照ペプチドの各アミノ酸配列とその重量を実行した。以下３ないし１２に選用された保護基はいずれもＦｍｏｃであり、そしてＮ終端のみＢｏｃを保護基とした。ＰＳ３のメーンメニュー系統に進み、１を選んでＥＤＩＴ及びＲＵＮに入り、合成パラメータをＰＲＧ０３（単一カップリング、先ず保護基Ｆｍｏｃを除去する）に設定する。次に２０％ヘキサヒドロピリジンを用いてＮ端保護基（ＤＥＰ）を２回（５分間／１回）除去するように設定する。次にアミノ酸及びカップリング試剤ＮＭＭと溶解して活性化し、その混合時間は３０秒、樹脂と各アミノ酸とのカップリング攪拌（ＡＡ）時間は２時間であり、ＲＵＮキーを押して合成を開始した。しかる後、各反応の終了後、一部の樹脂を取出してKaiser test分析テストを行い、ヒドラジン７．５μｌ及びフェノール１０μｌを添加して、１１０〜１２０℃の温度下で３分間反応し、もし黄色を呈すれば保護基が存在していることを表わす。反応が最後１個のアミノ酸小瓶（回転板１３）に進行して合成が確定的に完了した時、ＰＡＵＳＥキーを２回押して反応をしばらく停止する。ＥＸＩＴを押してメーンメニュー（MAIN menu）まで戻し、２を選んで（MANUAL OPERATION）に進み、３を選んで（REACTION VESSEL CONTROL）に進入する。反応瓶を外し、アルコールで樹脂を洗浄してからジクロロメタンで再度洗浄し、それをろ過した後真空下で抽出乾燥した。
【００５０】
リジン上側鎖Ｄｄｅの保護基の除去（２）
０．２ミリリットルのジアミドを１０ミリリットルのジメチルホルムアミドに溶解して、その濃度を２％にさせると共に樹脂と３分間反応し、洗浄ステップを２回重複した。反応が終了した後、Kaiser test分析テストを行い、樹脂が青色を呈すれば保護が完全に除去されたことを表わすので再度樹脂を抽出器ろ過瓶下に置き、アルコールで洗浄した後、再度ジクロロメタンで洗浄し、それをろ過した後真空下において抽出乾燥した。
【００５１】
リジン側鎖のＦＩＴＣへの接合（３）
１５５．８ミリグラム（０．４ミリモル）のＦＩＴＣを取って樹脂と反応し、１ミリリットルのジメチルスルホキシド及びジイソプロピルエチルアミンに溶解した後、室温下で２４時間振盪攪拌した。反応終了後、Kaiser test分析テストを行い、樹脂が濃厚な黄色を呈すればＦＩＴＣが接合していることを表わす。次にアルコール及びジクロロメタンで樹脂を洗浄し、それをろ過した後、真空下に置いて抽出乾燥した。
【００５２】
アミノ酸系列上側鎖保護基の切断（４）
５ミリリットルの既に妥当に配置された切除試剤および脱保護基の溶剤トリフルオロ酢酸／水／エタンジサルファイド／トリエチルシリコン（９４．５／２．５／２．５／１）を取り、０．１グラムの樹脂と２．５時間十分に振盪攪拌反応し、アルコールで樹脂を洗浄した後、それをろ過して濾液を収集した。しかる後、濾液を減圧真空濃縮機に置いて微乾するまで抽出した。次に、氷浴下でゆっくり氷エチルエーテルを滴下して沈澱を行い、遠心機で約５分間遠心を進行し回転速度を６０００ｒｐｍまでに調整して固体及び液体に分離させ、以上のステップを重複してエチルエーテルで２回ないし５回洗浄した後、このエチルエーテルを抽出乾燥し、黄色固体、即ち前立腺ペプチド系列を得た。しかる後、真空下に置いて抽出乾燥し、１２９．４ミリグラムの生成物を得た。収率は８３％である。
【００５３】
ペプチド純度化鑑定（５）
得られたペプチド系列を１ミリグラム取り、１ミリリットルのメチルアルコール中に溶解して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で純度鑑定を行い、既に配置されている前立腺ペプチド基質の移動相を溶離溶液とした。そのＥＳＩ−ＭＳ（ＮＨ+ ）：前立腺ペプチド基質は１５６３．６６（calcd），１５６３．６２（found）であり、対照ペプチドは１５６３．６６（cacl），１５６３．６４（found）である。
【００５４】
実施例６：前立腺近赤外線蛍光色素プローブ（Prostate near-infrared fluorescence probe，NIRF Probe）（４）の合成方法
近赤外線蛍光色素プローブの合成はスキーム３に示す通りである。
【００５５】
保護グラフト共重合体（ＰＧＣ）の調製（１）
５０ミリグラム（３．４ミリモル）のポリ−Ｌ−リジン（ＰＬ）を１２．５ミリリットルの炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解し、ゆっくりＭＰＥＧ−ＳＰＡ３９７．５ミリグラム（７９．５ミリモル）を添加して均等に混合した後、水酸化ナトリウムでそれをｐＨ７．７までに調整して室温下で３時間振盪攪拌した。しかる後、ＹＭ−３の薄膜を利用して限外濾過（ultrafiltration）した後、上層液を取り出して冷凍乾燥（lyophilize）を行い、結果綿糸状のグラフト共重合体（ＰＧＣ，５０．８ミリグラム）を得た。そして、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で遊離アミノ数を分析した。
【００５６】
ヨードアセチル化保護グラフト共重合体（iodoacetytate protected graft copolymer，ＬＡ−ＰＧＣ）の調製（２）
７．５ミリグラムグラフト共重合体（ＰＧＣ，０．１ミリモル）を０．２ミリリットル炭酸水素ナトリウム（５０ミリモル濃度）に溶解し、過量のヨード酢酸無水物（２６．３ミリグラム，１０ミリモル）をジメチルホルムアミド０．１ミリリットル中に溶解して均等に混合した後ヨードアセチル作用を進行し、室温下で３時間反応して遠心後、ＹＭ−３の薄膜を利用して限外濾過を行った後上層液を取り、冷凍乾燥を行ったところ、綿糸状のヨードアセチル化保護グラフト共重合体（ＬＡ−ＰＧＣ，７ミリグラム）を得た。そして、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で分析を行い、測定結果が無色であるので遊離アミノ基の存在が無いことを示した。
【００５７】
実施例７：
ペプチド保護グラフト共重合体（peptide protected graft copolymer，Ｐ−ＰＧＣ）の調製（３）
５ミリグラムのヨードアセチル化保護グラフト共重合体（ＬＡ−ＰＧＣ）を取り、それにペプチド基質３．２ミリグラム（２ミリモル）及び対照ペプチド３．２ミリグラム（２ミリモル）を添加して、０．２ミリリットルのアセトニトリル及び０．２ミリリットルの酢酸ナトリウム（０．１Ｍ，pH６．５）緩衝溶液中に溶解し、３時間反応を行った。次にSephadex Ｇ−２５（２０ｃｍ×１ｃｍ）を利用して精製を行った。この時の溶離液は燐酸塩緩衝溶液（１０ｍＭ，ｐＨ７．０）である。次に、分別収集器（tractional collector）を利用して、各試験管内に２ミリリットル収集された液体を収集し、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトログラフで波長が４９４ｎｍ下の各試験管の吸収度を測定した。試験管数を横座標、吸収値を縦座標とした図を作り、第１個の吸収ピーク即ち大分子量のペプチド保護グラフト共重合体を得た。すべての液体を収集して冷凍乾燥を行った結果、針状のペプチド基質及び対照ペプチドの保護グラフト共重合体（５７ミリグラム及び２７．６ミリグラム）を得た。
【００５８】
前立腺近赤外線蛍光色素プローブ（prostate near-infrared fluorescence NIRF Prob）の調製（４）
０．５ミリグラムのペプチド保護グラフト共重合体（Ｐ−ＰＧＣ）を０．２ミリリットルの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムに溶解した後、１ミリグラムのＣｙ５．５色素（１μｍｏｌ）を添加して反応を進行し、均等に混合した後、室温下で１時間振盪攪拌して遠心した。遠心後、ＹＭ−３の薄膜を利用して限外濾過を行い、上層液を取って冷凍乾燥を行った結果、青色の固体プローブ（０．７ミリグラム）を得た。そして蛍光スペクトログラフでその激発及び放射波長範囲を測量した。
【００５９】
上記に記載した実施の方式は本発明の技術的手段をより具体的に説明するためにあり、当然本発明の技術的思想はこれに限定されず、添付のクレームの範囲を逸脱しない限り当業者による単純な設計変更、付加、修飾等はいずれも本発明の技術的範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、ＦＩＴＣ（灰色線）、Ｃｙ５．５（点線）及び前立腺プローブＣｙ５．５−prostate-ＰＧＣ（黒色線）のＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す図である。
【図２】図２は、前立腺プローブＣｙ５．５−prostate-ＰＧＣ蛍光のスペクトログラムである。
【図３】図３は、（Ａ）前立腺ペプチド基質（０．６４μｍｏｌ）の高速液体クロマトグラム（黒色線）、 （Ｂ）前立腺ペプチド基質の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の存在下におけるクロマトグラム（灰色線）である。
【図４】図４は、（Ａ）前立腺対照ペプチド（０．６４μｍｏｌ）の高速液体クロマトグラム（黒色線）、 （Ｂ）前立腺対照ペプチドのＰＳＡ存在下におけるクロマトグラム（灰色線）である。
【図５】図５は、前立腺基質プローブＣｙ−prostate−ＰＧＣ（■）、対照ペプチドプローブ（△）及びＰＳＡ存在下の前立腺生態ペプチドプローブ（◆）について、対照ペプチド（×）の異なる時間における蛍光強度を示す図である。
【図６】図６は、ヒト前立腺がん細胞株が対照ペプチドプローブ及び前立腺基質プローブとそれぞれ反応して得た光学映像（光学映像系統は６１０〜６６０ｎｍろ過器及び６２５〜７００ｎｍの放射ろ過器である）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下に示す前立腺ペプチド基質化合物。
【化１】
【請求項２】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に切断されて、前立腺がんを診断する光学映像プローブとすることが可能な、下式（Ｉ）に示す化合物。
【化２】
式中、ｄｙｅ＝Ｃｙ５．５，Ｃｙ５，Ｃｙ７，Ａｌｅｘａ７５０，Ａｌｅｘａ６６０，Ａｌｅｘａ６８０，ＩＲ８００，ランタノイド金属錯化合物及び近赤外線色素（Ａｌｅｘａ及びＩＲは商標である）。
Ｐ＝多糖類（polysaccharide）、ポリリジン、ポリエチレンイミン及び合成ポリマー。
【請求項３】
前立腺プローブを調製し且つ光学映像系統を利用して体内に対して前立腺がんを診断する方法であって、
前立腺ペプチド基質及び対照ペプチド(control peptide)の合成と、前立腺ペプチド基質光学映像プローブ（Ｃｙ−prostate−ＰＧＣ）及び前立腺対照ペプチドプローブの合成とを備えてなることを特徴とする方法。
【請求項４】
前立腺ペプチド基質化合物を使用して、光学映像系統により体内の前立腺がんに対して診断を行うことを特徴とする前立腺がんプローブ。
【請求項１】
下に示す前立腺ペプチド基質化合物。
【化１】
【請求項２】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に切断されて、前立腺がんを診断する光学映像プローブとすることが可能な、下式（Ｉ）に示す化合物。
【化２】
式中、ｄｙｅ＝Ｃｙ５．５，Ｃｙ５，Ｃｙ７，Ａｌｅｘａ７５０，Ａｌｅｘａ６６０，Ａｌｅｘａ６８０，ＩＲ８００，ランタノイド金属錯化合物及び近赤外線色素（Ａｌｅｘａ及びＩＲは商標である）。
Ｐ＝多糖類（polysaccharide）、ポリリジン、ポリエチレンイミン及び合成ポリマー。
【請求項３】
前立腺プローブを調製し且つ光学映像系統を利用して体内に対して前立腺がんを診断する方法であって、
前立腺ペプチド基質及び対照ペプチド(control peptide)の合成と、前立腺ペプチド基質光学映像プローブ（Ｃｙ−prostate−ＰＧＣ）及び前立腺対照ペプチドプローブの合成とを備えてなることを特徴とする方法。
【請求項４】
前立腺ペプチド基質化合物を使用して、光学映像系統により体内の前立腺がんに対して診断を行うことを特徴とする前立腺がんプローブ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２１３７０５（Ｐ２００６−２１３７０５Ａ）
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２０４（Ｐ２００６−１２０４）
【出願日】平成１８年１月６日（２００６．１．６）
【出願人】（５０５３０２３６２）高雄醫學大學 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月６日（２００６．１．６）
【出願人】（５０５３０２３６２）高雄醫學大學 (11)
【Ｆターム（参考）】
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