副作用が軽減された治療抗体
治療標的へのタンパク質の結合を阻害するペプチドで修飾され、それによってタンパク質に起因する副作用を軽減する、治療抗体等の治療タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療抗体及びその副作用（特に、サイトカイン放出に起因するもの）を軽減する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体治療等のタンパク質治療において、抗体の使用は、望まれない副作用（例えば、サイトカイン放出に起因するもの）を生じる。結果として、副作用が軽減された治療タンパク質が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本出願は、２００２年７月２３日に出願された、仮出願であるシリアル番号６０／３９７，９３４に基づく優先権を主張するものであり、その内容は、全体的に参考のために援用される。
【０００４】
本発明の１つの側面によれば、修飾されていない抗体に比べて、修飾された治療抗体が、その標的抗原に対する制限され減弱された結合（ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）を有し、減弱された結合がサイトカインの放出に起因する様な、その副作用を軽減する、修飾された治療抗体が提供される。好ましい実施態様において、減弱された結合は、時間と共に、標的に対する抗体の結合が増加されるようになっている。
【０００５】
１つの側面によると、本発明は、特定の治療的効果を有する治療抗体を含み、ここで、該抗体が、天然の標的に対する抗体の結合を減弱する抗体結合部位（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）の制限された妨害を受け、後の宿主への抗体の投与が、前記治療的効果を達成することが可能であり、それによって、天然の標的に対する抗体の結合の減弱が抗体の副作用を軽減する、治療抗体に関する。
【０００６】
従って、本発明の１つの側面によれば、治療抗体が治療標的に対する抗体結合部位（ＡＣＳ）を含み、抗体が、制限された様式において、治療標的に対する治療抗体の結合を阻害する化合物で修飾された治療抗体の形態である医薬が提供される。
【０００７】
１つのそのような実施態様において、抗体の抗体結合部位に可逆的に結合する化合物を含むように、抗体の投与の際にＡＣＳに結合する化合物と競合する標的抗原で修飾され、又は、そうでなければ該化合物によって抗原の結合が阻害され、それによって、標的に対する抗体の結合が阻害される、治療抗体が提供される。この様式において、投与後の初期期間において標的抗原に結合するようになる修飾抗体の量は、該抗体が非修飾の形態で投与された場合に起こるであろう結合よりも小さい。競合的結合の結果、該化合物がＡＣＳから置換される（ｄｉｓｐｌａｃｅ）につれて、又は、そうでなければ該化合物阻害作用が減弱され、標的抗原に結合するようになる抗体の量は増加する。抗体の結合を阻害することによって、時間と共に増加する標的に結合された抗体の量を伴い、修飾された抗体は、サイトカイン放出に起因するような副作用を軽減及び／又は本質的に排除することができ、また、所望の治療的効果を達成することもできる。
【０００８】
１つの実施態様において、修飾された抗体は、修飾されていない抗体の標的に対するアビディティよりも弱い、標的に対するアビディティを有する。このアビディティは、治療抗体に対する副作用を軽減及び／又は排除する一方、治療標的に結合することによって所望の治療的効果を生み出すために有効な量において、減弱される。
【０００９】
ここで使用される用語“治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）”は、存在する疾患、病気又は障害を処置すること、ならびに疾患、病気又は障害の重症度を予防及び／又は軽減することの両方を含む。
【００１０】
治療標的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ）は、抗体が結合する抗原であり、抗原は、組織又は細胞上に存在するかもしれないし、存在しないかもしれない。標的への結合を阻害するための治療抗体に結合される化合物は、ＡＣＳへの結合によって及び／又はＡＣＳへの結合又はＡＣＳへの接近を阻害することによって（例、立体障害によって）、そのような結合を阻害し得る。
【００１１】
この化合物は、抗体に化合物を連結することによって及び／又はＡＣＳへの化合物の結合によって、抗体と結合され得る。１つの実施態様において、該化合物は、抗体に連結又は固定され、また、ＡＣＳにも結合する。他の実施態様において、化合物は、ＡＣＳに結合することなく抗体に連結され、ＡＣＳへの接近を阻害することによって（例、立体障害によって）標的への抗体の結合を阻害する。１つの限定されない実施態様において、該化合物は、抗体の鎖の１つにのみ連結される。結合を阻害するために使用される化合物は、リンカーが、標的抗原への抗体の結合を最初に阻害する場合、ＡＣＳに結合する化合物を含まないリンカー化合物であり得る。
【００１２】
治療抗体は、ヒトにおいて治療剤として使用され得、非ヒト抗体（例、齧歯類において惹起されたもの）であり得る。
【００１３】
この化合物は、標的への抗体の結合を阻害するように機能し、それによって、投与後すぐに、該化合物の存在なしに結合するであろう抗体の量に比べて、標的に結合する抗体の量の制限された減少が起こる。標的に結合するようになる抗体の量は、時間と共に増加し、それによって、実質的に、標的に結合する抗体の量を阻害するＡＣＳの一時的な遮断が起こる。
【００１４】
ＡＣＳの一時的な遮断（時間と共に増加する標的に結合する抗体の量を、最初に減少する遮断）は、以下；
（ｉ）結合定数及び解離定数が、“妨害的な”因子と比べて有利である場合、細胞結合又は他の“標的”抗原上に徐々に抗体が蓄積するように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて徐々に解離し得る、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプレインキュベーションによる、規定された抗原又はそのドメイン、低親和性抗原性ペプチド又はミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）等の分子による、一時的な占有；又は
（ｉｉ）フレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）によって結合され得る、規定された抗原又はそのドメイン、低親和性抗原性ペプチド又はミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）等の分子による一時的な占有。いったんｉｎ ｖｉｖｏに投与されれば、結合定数及び解離定数が、“妨害的な”因子と比べて有利である場合、抗体は、徐々に細胞結合又は他の“標的”抗原上に蓄積するであろう；又は
（ｉｉｉ）ＡＣＳにおいて非共有的に結合し得、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて解離することが可能である化学的薬剤；又は
（ｉｖ）一時的にＡＣＳを妨害し得る他の変化；例えば、ＡＣＳに結合する化合物なしに、ＡＣＳへの接近を一次的にブロッキングすること
によって、影響され得る。
【００１５】
そのような修飾は、制限された期間の間、標的抗原上への抗体蓄積を妨げ、それは、投与された治療抗体が、軽減された副作用を有する一方、該抗体が所望の治療的効果を達成することを可能にする（すなわち、そのような効果を生み出す量において標的抗原上に蓄積する）ことを確実にするために充分であろう。修飾の除去は、ｐＨ変化、宿主内での酵素切断（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）、細胞に結合する宿主抗原との天然の競合（ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）等の宿主自身の生理学的及び生化学的プロセスによっても起こり得る。例えば、ペプチドミモトープは、例えば、白血球エステラーゼ等のｉｎ ｖｉｖｏでの宿主酵素による切断をうけやすい酵素分解モチーフを有するリンカーによって、抗体のＨ鎖又はＬ鎖に連結され得る。
【００１６】
本発明の１つの特に有利な実施態様によれば、リンカーは、酵素によって切断され、これは、治療抗体の所望の作用部位においてのみ又は優先的に起こり、それによって、所望の作用部位に治療抗体の選択的送達を提供する。例えば、白血球エステラーゼによって切断されるリンカーは、その目的とする作用部位が炎症を起こした関節である抗体に対して適当であろう。或いは、可溶性抗原又はミモトープが、腫瘍部位内の低いｐＨにおいて、より容易に解離し得、これは所望の作用部位への抗体の選択的送達をも提供し得る。或いは、不活性リンカーによって結合された低親和性ミモトープは、ｉｎ ｖｉｖｏにて自然に解離し得、再結合（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、宿主細胞上の天然抗原と相互作用するＡＣＳによって抑制され得る。
【００１７】
リンカーは、治療酵素の投与によって切断可能な部位を含むようにも設計され得る。例えば、リンカーは、ＴＰＡ又はストレプトキナーゼに対して切断可能な部位含むように設計され得る。切断速度（ｒａｔｅ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ）（従って、細胞上への蓄積速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌｓ））は、ＴＰＡ又はストレプトキナーゼの量及び投与速度を制御することによって制御され得る。同じ方針で、リンカーが、ｉｎ ｖｉｖｏにて自然に生じる酵素によって切断される場合、同様の制御が、切断を阻害するであろう酵素阻害剤の投与によって達成され得る。
【００１８】
好ましくは、天然抗原、そのドメイン、及びペプチド断片又はミモトープが、ＡＣＳを修飾するために使用される。後者は、合成的に又は生物学的に誘導されたいずれかのペプチドライブラリーから産生され得る。非共有結合の化学物質は、その抗原又は等価なサロゲート（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）に結合する抗体を阻害する能力について、天然又は合成ライブラリー又は他の入手可能な製品からスクリーニングされ得る。使用され得るリンカーは、好ましくは、フレキシブル（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）であるが、身体（ｂｏｄｙ）によって又は設定された時間が経てば、酵素的に切断可能及び／又は分解可能であり得る。
【００１９】
本発明は、さらに、補体システム及び免疫グロブリンのＦｃ領域に対する特殊化された細胞受容体（ＦｃＲ受容体）との相互作用を減少するように設計されたＦｃ領域を含む、上記のような抗体にも関する。これは、ブロッキング抗体又はアゴニスト抗体等の細胞溶解が必須ではない、多くの抗体に対して有用であろう。
【００２０】
さらなる側面によれば、本発明は、治療における使用のための上記の抗体を提供する。
【００２１】
さらなる側面によれば、本発明は、前記治療効果を達成するために、哺乳類の処置での使用のための医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の製造における、上記抗体の使用を提供する。この処置は、所望の治療効果を達成するために充分な用量の医薬を投与することを含む。この処置は、抗体の反復的投与を含み得る。
【００２２】
さらなる側面によれば、本発明は、所望の治療効果を達成し、例えば即時の及び大規模な標的細胞上の抗体の蓄積；特に、サイトカイン放出に起因する副作用を軽減及び／又は排除するために充分な用量の上記抗体の投与を含む、ヒトの処置方法を提供する。この治療効果は、ガン、関節リウマチのような慢性炎症性疾患、糖尿病、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ）等の自己免疫疾患、喘息等のアレルギー性疾患、心筋梗塞、脳梗塞等の循環器疾患及び感染性疾患を含み得る疾患の緩和又は予防であり得る。実際に、治療抗体の継続的又は反復的投薬（ｄｏｓｅｓ）が行われるあらゆる疾患である。
【００２３】
上記のタイプの一時的な修飾は、抗体の他に、その活性が一時的に遮断され得、この部位の活性が免疫原性を決定する、生物学的に活性な部位に依存する治療タンパク質にも適用され得る。そのような治療タンパク質の例は、ホルモン、酵素、凝固因子、サイトカイン、ケモカイン及び免疫グロブリンに基づく（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｂａｓｅｄ）融合タンパク質を含む。
【００２４】
抗体に化合物を共有結合した場合、１つの実施態様において、この化合物は、好ましくは、抗体の２つのアームの１つのみに連結される。
【００２５】
ここで使用される用語“抗体”は、リコンビナント抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、モノクローナル抗体等の全ての形態の抗体を含む。本発明は、治療標的に結合することが可能な抗体断片にも適用することができる。
【００２６】
１つの実施態様において、化合物（該化合物は、抗体のＡＣＳに結合可能なペプチド又は他の分子であり得る）は、個人に投与される抗体の抗体結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）部位又は抗体結合（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位に可逆的に結合される。該化合物は、抗原に対する抗体の結合部位を占有し、それによって、抗原に対する抗体の結合を阻害する。該化合物は、抗体結合部位に可逆的に結合され、抗体結合において制限された減弱（ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を有するように選択されることから、該抗体は、この抗体が方向付けられた（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）抗原に対して結合することが可能である。
【００２７】
１つの実施態様において、抗体の抗体結合部位に結合するように選択される化合物は、それによって、抗体の化合物に対するアビディティが、抗原に対する抗体のアビディティよりも小さいものである。このように、抗体が最初に投与された場合には、該化合物が存在しない場合に起こるであろう結合に比べて、抗原に対する抗体の減弱された結合が生じ、そのような結合は時間と共に増加する。
【００２８】
本出願人は、抗体の投与のすぐあとの期間において、抗原に結合する抗体の量が減少され、そのような量が、時間と共に、減少された量から増加すれば、所望の治療効果を生み出す、抗原に有効に結合することができる抗体を投与することによって治療抗体に対する副作用（サイトカイン放出の結果によるもの等）の軽減が達成され得ることを見出した。
【００２９】
従って、従来技術とは異なり、本発明に従って、その治療的機能を示す抗体は、最初に抗原に結合する治療抗体の量を減少した後、治療抗体結合量を増加することによって、抗体により引き起こされるサイトカイン放出等の副作用をも軽減する
最初に抗原に結合する抗体の量を減少させるという態様における、抗体結合部位に結合するために使用される化合物は、ペプチドであり得る。該ペプチドは、治療抗体が結合する抗原の対応するペプチド部分と同一又は異なり得る。抗体に対する適切なペプチドは、抗体及びその抗原に関する結合阻害アッセイ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）においてペプチドのパネルを試験することによって選択され得る。これら及び他の手順は、本明細書の教示に基づいて、当業者にとって公知である。
【００３０】
１つの実施態様において、該化合物に結合される抗体は、標的抗原に対する非−修飾抗体のアビディティよりも低い、標的抗原に対するアビディティを有する。修飾抗体及び非修飾抗体の相対的アビディティは、終点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）として５０パーセント結合阻害を用いた結合阻害アッセイによって決定され得る。修飾抗体は、標的抗原に対する標識非修飾抗体の結合の５０パーセント阻害を生じるために必要な非修飾抗体の量に比べて、修飾抗体の量に増加があった場合、減弱したアビディティを有する。
【００３１】
修飾抗体のアビディティは、副作用（特にサイトカイン放出に起因するもの）を軽減及び／又は本質的に排除するために有効な量において、減弱され、修飾された抗体は、所望の治療効果を生み出すために有効な標的に対するアビディティを有する。一般に、アビディティは、少なくとも４倍、一般に、１００倍まで減弱される。より大きなアビディティの減少があり得ることが、理解される。従って、本発明の側面によれば、抗体は、副作用を軽減するために修飾され、軽減された副作用のみを所望される場合、結合における減弱は、そのような結果を達成するための量に制限される（すなわち、副作用軽減は、修飾抗体に対する抗体反応を減弱又は排除することなく、達成され得る）。
【００３２】
１つの限定されない実施態様において、該化合物は、非修飾抗体に比べて減弱した標的抗原に対する親和性を有する修飾抗体を提供することによって、修飾抗体の結合を阻害し得る。１つの限定されない実施態様において、修飾抗体は、非修飾抗体の親和性よりも少なくとも２倍又は少なくとも５倍小さい、結合される抗原に対する親和性を有し得る。本発明の１つの実施態様によれば、副作用は、制限された量における親和性を減弱することによって（例えば１００倍まで、修飾抗体に対する抗体反応を排除することなしに）軽減され得る。しかしながら、この親和性は、より多くの量において減弱され得るが、そのような大きな減弱は、サイトカイン放出によって引き起こされる副作用を軽減するために必要とされないことが理解される。
【００３３】
修飾抗体は、所望の治療効果を生み出すこと及び副作用の軽減の両方に有効な量において使用される。一般に、本発明を限定することなく、修飾抗体は、抗体が最初に投与された時から始まる２４時間の期間の間に、投与された抗体の量が、少なくとも５０ｍｇ及び一般的に少なくとも１００ｍｇ及びさらに一般的に少なくとも２００ｍｇであるような量で投与される。
【００３４】
治療抗体は、薬学的に許容される担体と組み合わせて使用され得る。好適な担体の使用は、本明細書中の教示から当業者の範囲内と考えられる。
【００３５】
本発明は、特定の治療効果を有するタンパク質を含む治療タンパク質にも関し、ここで、該タンパク質は、その天然の標的に対するタンパク質の結合を減少させる一時的な妨害を受ける生物学的活性部位を有し、続く宿主へのタンパク質の投与は、前記治療効果を達成し、それによって、その天然の標的に対するタンパク質結合の減少は、副作用を軽減する。
【００３６】
本発明は、以下：
（ａ）治療標的に結合する治療タンパク質（前記タンパク質が治療標的への該タンパク質の結合を阻害する化合物で修飾されており、前記修飾タンパク質が該タンパク質によって引き起こされる副作用を軽減すること及び治療標的に結合することによって治療効果を生み出すために有効である）；ならびに
（ｂ）薬学的担体
を含む医薬をも提供する。
【００３７】
好ましくは、治療タンパク質は、治療標的に結合する抗体結合部位を含む抗体である。より好ましくは、該化合物は、抗体の抗体結合部位に結合される。さらに好ましくは、該化合物はまた、抗体に連結される。
【００３８】
該化合物が、ペプチドであることも想定される。このペプチドと結合された修飾抗体のアビディティは、非修飾抗体のアビディティよりも少なくとも４倍少なく及び１００倍まで少ないことが好ましい。好ましくは、該抗体は、アグリコシル化抗体（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。さらに好ましくは、抗体の鎖の１つのみが、それに連結した、抗体結合部位に結合するペプチドを有する。
【００３９】
また、該化合物は、可逆的に抗体結合部位に結合し、それによって、標的に結合する抗体の量は、化合物が抗体結合部位から置換されるにつれて、増加することが好ましい。好ましくは、抗体結合部位に結合された該化合物はまた、抗体に連結される。さらに好ましくは、該化合物は、ペプチドである。抗体のＦｃ部分は、アグリコシル化されていて、さらに好ましくは、Ｆｃ受容体への抗体の結合が本質的に排除されていることが好ましい。
【００４０】
好ましくは、該抗体は、非ヒト抗体である。また、該抗体は、キメラ抗体であることが好ましい。
【００４１】
さらに、本発明は、哺乳類を処置するため及びタンパク質に対する副作用を軽減するための両方に有効な量の上記の医薬を哺乳類に投与することを含む、哺乳類を処置する方法をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下の限定されない実施例は、本発明を説明する。
【００４３】
ヒト化抗−ＣＤ５２抗体、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈを、以下の試験に用いた。様々なコンストラクトを、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体及び以下の方法を用いて作製した。
【００４４】
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの減弱された結合変異体の生成：
ヒトＣＤ５２抗原に対して特異的なヒト化抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１ＨのＶ領域のクローニングを、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６２：３３６６３−３６７１に記載のように行う。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．１９８９ ＰＮＡＳ ８６：３８３３のものに基づく。野生型ヒト化ＣＡＭＰＡＴＨ−１軽鎖を、ベクターｐＧＥＭ９（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングし、部位指定変異導入（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のためのＰＣＲテンプレートとして使用した。
【００４５】
フレキシブルリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒｘ２）を、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈのリーダー配列及びＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ ＶＬ配列間の軽鎖のアミノ末端に、オリゴヌクレオチドプライマーＰＵＣＳＥ２及びＬｉｎｋ Ｌ−３‘＋Ｌｉｎｋ−Ｌ−５’ならびにＰＵＣＳＥ ＲＥＶを用いて付加した。結果として得られた断片を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片として発現ベクター中にクローニングされ得る、全長Ｌｉｎｋｅｒ−ＣＰ−１Ｈ軽鎖を得るため、プライマーＰＵＣＳＥ２＋ＰＵＣＳＥ ＲＥＶを用いてＰＣＲ会合した（ＰＣＲ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）。
【００４６】
その後、Ｌｉｎｋｅｒ−ＣＰ−１Ｈ軽鎖コンストラクトを、ＣＤ５２ミモトープ（ＱＴＳＳＰＳＡＤ）及びＣＤ５２ミモトープ突然変異体９（ＱＴＳＡＡＡＶＤ）コンストラクトを生成するためにＰＣＲテンプレートとして使用した。プライマーＰＵＣＳＥ２及びＣＤ５２ＭＩＭ−３’＋ＣＤ５２ＭＩＭ−５’ならびにＰＵＣＳＥ ＲＥＶを、ミモトープ−ＣＰ−１Ｈ軽鎖コンストラクトを得るために使用した。プライマーＰＵＣＳＥ２及びＭＩＭＭｕｔ９−３’＋ＭＩＭＭｕｔ９−５’ならびにＰＵＣＳＥ ＲＥＶを、ミモトープ突然変異体９−ＣＰ−１Ｈ軽鎖コンストラクトを得るために使用した。
【００４７】
Ｌｉｎｋｅｒ−Ｏｎｌｙ−ＣＰ−１Ｈ、ミモトープ−ＣＰ−１Ｈ及びＭｉｍＭｕｔ９−ＣＰ−１Ｈ突然変異体を、ｐＢＡＮ−２、ネオマイシン選択を含むｐＮＨ３１６哺乳類発現ベクター（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８）及び選択のためグルタミン合成酵素遺伝子を含む哺乳類発現ベクターであるＰＥＥ１２（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５）に移した（ｔｒａｎｓｆｅｒ）。
【００４８】
サブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ｄｈｆｒ-チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８）又はＮＳＯマウスミエローマ細胞（ＥＣＡＣＣ ｃａｔ ｎｏ ８５１１５０３， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８１，７３Ｂ，３）を、軽鎖突然変異体及びＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖コンストラクト ヒトＩｇＧ１不変領域と共にコトランスフェクションを行った。
【００４９】
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖コンストラクトを、ｄｈｆｒ選択可能なマーカーを有するｐＬＤ９哺乳類発現ベクターの変異体である、ｐＲＤＮ−１（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８）及びＰＥＥ１２中に発現させた。トランスフェクションを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、取り扱い説明書に従って行った。
【００５０】
ヒトＩｇＧ１不変領域を、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９８２ Ｃｅｌｌ ２９：６７１−６７９によって記載される野生型Ｇ１ｍ（１，１７）遺伝子から誘導した。
【００５１】
重鎖及び軽鎖トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８＋５％（ｖ／ｖ）透析されたウシ胎児血清を含む、ヒポキサンチン−フリーＩＭＤＭ中で選択した。結果として選択された細胞を、ＥＬＩＳＡによって抗体産生について、ならびにヒトＴ細胞クローンＨＵＴ７８（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＥ ｅｔ ａｌ． １９８１ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：１４０３−１４１８）及びＣＤ５２トランスジェニックマウスに対して結合する抗原についてスクリーニングした。
【００５２】
抗体を産生する細胞を、限外希釈によってクローニングし、その後、ローラーボトル培養（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）に拡大した。各細胞株由来のおよそ１５リットルの組織培養上清からの免疫グロブリンを、プロテインＡ上で精製し、ＰＢＳで透析し、そして定量化した。
【００５３】
使用されたプライマーのリスト
【００５４】
【化１】
【００５５】
産生されたコンストラクト及び細胞株
ＴＦ ＣＨＯ／ＣＰ−１Ｈ ＩｇＧ１／ＭＩＭ及びＴＦ ＮＳＯ／ＣＰ−１Ｈ ＩｇＧ１／ＭＩＭ（ＭＩＭ ＩｇＧ１）
フレキシブルグリシン４セリンｘ２リンカ−＋野生型ヒトＩｇＧ１不変領域を有するＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ重鎖によって、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖Ｖ領域につながれたＣＤ５２ミモトープＱＴＳＳＰＳＡＤ。ＮＳＯ−産生抗体についての発現ベクターＰＥＥ１２（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ならびにＣＨＯ−産生抗体についてのｐＲＤＮ−１及びｐＢＡＮ−２発現ベクターＷｅｌｌｃｏｍｅ中へのクローニング。
【００５６】
ＴＦ ＣＨＯ／ＣＰ−１Ｈ ＩｇＧ１／Ｌｉｎｋ（リンカー）
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖Ｖ領域上のフレキシブルグリシン４セリンｘ２リンカー＋野生型ヒトＩｇＧ１不変領域を有するＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖。ＣＨＯ−産生抗体についての、ｐＲＤＮ−１及びｐＢＡＮ−２発現ベクタ−（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）中へのクローニング。
【００５７】
ＴＦ ＣＨＯ／ＣＰ−１Ｈ ＩｇＧ１／ＭＩＭ−ＭＵＴＡＮＴ９（ＭＩＭ−ＭＵＴＡＮＴ９−ＩｇＧ１）
野生型ヒトＩｇＧ１不変領域を有するＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖＋フレキシブルグリシン４セリンｘ２リンカーによって、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖Ｖ領域につながれたＣＤ５２ミモトープ突然変異体９（ＱＴＳＡＡＡＶＤ）。ＣＨＯ−産生抗体についての発現ベクタ−ｐＲＤＮ−１及びｐＢＡＮ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）中へのクローニング。
【００５８】
ＴＦ ＣＨＯ／ＣＯ−１Ｈ ＩｇＧ１（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）
野生型ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖Ｖ領域＋野生型ヒトＩｇＧ１不変領域を有するＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖。ＣＨＯ−産生抗体についての発現ベクターｐＲＤＮ−１及びｐＢＡＮ−２（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）中へのクローニング。
【００５９】
図１は、ＣＤ５２を有するＨＵＴ細胞に対する様々な抗体コンストラクトの結合能力を示す。ＣＰ−１Ｈ野生型は、ＣＰ−１Ｈリンカーのみの結合よりもおよそ５倍大きく、ＣＰ−ＭＩＭｍｕｔ９よりもおよそ１００倍大きく、及びＣＰ−ＣＤ５２ＭＩＭよりもおよそ１０，０００倍大きい結合能力（ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を有する。
【００６０】
エフェクター機能評価
ＣＰ−１Ｈ ＭＩＭｍｕｔ９エフェクター機能を、補体溶血によるＣＤ５２保有Ｔ細胞株ＨＵＴ７８を殺す能力を試験することにより、評価した。ＣＰ−１Ｈ野生型を、陽性コントロールとして用いた。１０6細胞／ｍｌのＨＵＴ７８細胞１００μｌを、０．４ｕｇ／ｍｌ〜３００ｕｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度の各抗体と混合した。この後、補体の供給源（ｓｏｕｒｃｅ）としての新鮮な、不希釈（ニート（ｎｅａｔ））ヒト血清１００μｌを添加した。３７℃にて４５分間インキュベーションした後、プロピジウムアイオダイドを、混合物に加え、フローサイトメトリーによって細胞を解析した。ＰＩ染色（溶解した）細胞のパーセンテージを、各条件について測定した。図２に示される結果は、ＣＰ−１Ｈ ＭＩＭｍｕｔ９が、抗体エフェクター機能を媒介（ｍｅｄｉａｔｅ）する能力を維持することを示す。
【００６１】
修飾及び非修飾抗体を、以下のように、サイトカインの誘導を測定するために試験した：
サイトカイン計測
精製抗体を、エンドトキシンを除去するためにＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に通した。その後、全ての抗体のバッチを、ＱＣＬ １０００ ＬＡＬアッセイ（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いて、エンドトキシンについて試験した。
【００６２】
Ｅｘ−Ｖｉｖｏ全血アッセイ
健康な研究者からの血液を、新鮮なまま（ｆｒｅｓｈｌｙ）ヘパリン中に導かれた（ｄａｒｗｎ ｉｎｔｏ）。全血試料を、１００、１０又は１μｇ／ｍｌの治療抗体と共に、３７℃にて５時間、激しく振とうしながらインキュベーションを行った。その後、血漿及び細胞を、遠心分離によって分離した。
【００６３】
血漿ＴＮＦ−αレベルをヒトＴＮＦ−αイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定し、血漿ＩＦＮ−γレベルをヒトＩＦＮ−γＥｌｉｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定し、そして、血漿ＩＬ−６レベルをヒトＩＬ−６Ｅｌｉｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。
【００６４】
以下の表１及び２は、サイトカインの放出を減少する修飾抗体を用いた、そのような試験の結果を報告する。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
ここに記載される実施態様の多くの修飾及び変化が、この中の教示に基づいて可能である；従って、本発明の範囲は、そのような実施態様に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ＣＤ５２を有するＨＵＴ細胞に対する様々な抗体コンストラクトの結合能力を示す。
【図２】ＰＩ染色（溶解した）細胞のパーセンテージを、各条件について測定した。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１〜７は、ＰＣＲプライマーである。
【００７０】
配列番号８は、ＰＣＴプライマーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療抗体及びその副作用（特に、サイトカイン放出に起因するもの）を軽減する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体治療等のタンパク質治療において、抗体の使用は、望まれない副作用（例えば、サイトカイン放出に起因するもの）を生じる。結果として、副作用が軽減された治療タンパク質が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本出願は、２００２年７月２３日に出願された、仮出願であるシリアル番号６０／３９７，９３４に基づく優先権を主張するものであり、その内容は、全体的に参考のために援用される。
【０００４】
本発明の１つの側面によれば、修飾されていない抗体に比べて、修飾された治療抗体が、その標的抗原に対する制限され減弱された結合（ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）を有し、減弱された結合がサイトカインの放出に起因する様な、その副作用を軽減する、修飾された治療抗体が提供される。好ましい実施態様において、減弱された結合は、時間と共に、標的に対する抗体の結合が増加されるようになっている。
【０００５】
１つの側面によると、本発明は、特定の治療的効果を有する治療抗体を含み、ここで、該抗体が、天然の標的に対する抗体の結合を減弱する抗体結合部位（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）の制限された妨害を受け、後の宿主への抗体の投与が、前記治療的効果を達成することが可能であり、それによって、天然の標的に対する抗体の結合の減弱が抗体の副作用を軽減する、治療抗体に関する。
【０００６】
従って、本発明の１つの側面によれば、治療抗体が治療標的に対する抗体結合部位（ＡＣＳ）を含み、抗体が、制限された様式において、治療標的に対する治療抗体の結合を阻害する化合物で修飾された治療抗体の形態である医薬が提供される。
【０００７】
１つのそのような実施態様において、抗体の抗体結合部位に可逆的に結合する化合物を含むように、抗体の投与の際にＡＣＳに結合する化合物と競合する標的抗原で修飾され、又は、そうでなければ該化合物によって抗原の結合が阻害され、それによって、標的に対する抗体の結合が阻害される、治療抗体が提供される。この様式において、投与後の初期期間において標的抗原に結合するようになる修飾抗体の量は、該抗体が非修飾の形態で投与された場合に起こるであろう結合よりも小さい。競合的結合の結果、該化合物がＡＣＳから置換される（ｄｉｓｐｌａｃｅ）につれて、又は、そうでなければ該化合物阻害作用が減弱され、標的抗原に結合するようになる抗体の量は増加する。抗体の結合を阻害することによって、時間と共に増加する標的に結合された抗体の量を伴い、修飾された抗体は、サイトカイン放出に起因するような副作用を軽減及び／又は本質的に排除することができ、また、所望の治療的効果を達成することもできる。
【０００８】
１つの実施態様において、修飾された抗体は、修飾されていない抗体の標的に対するアビディティよりも弱い、標的に対するアビディティを有する。このアビディティは、治療抗体に対する副作用を軽減及び／又は排除する一方、治療標的に結合することによって所望の治療的効果を生み出すために有効な量において、減弱される。
【０００９】
ここで使用される用語“治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）”は、存在する疾患、病気又は障害を処置すること、ならびに疾患、病気又は障害の重症度を予防及び／又は軽減することの両方を含む。
【００１０】
治療標的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ）は、抗体が結合する抗原であり、抗原は、組織又は細胞上に存在するかもしれないし、存在しないかもしれない。標的への結合を阻害するための治療抗体に結合される化合物は、ＡＣＳへの結合によって及び／又はＡＣＳへの結合又はＡＣＳへの接近を阻害することによって（例、立体障害によって）、そのような結合を阻害し得る。
【００１１】
この化合物は、抗体に化合物を連結することによって及び／又はＡＣＳへの化合物の結合によって、抗体と結合され得る。１つの実施態様において、該化合物は、抗体に連結又は固定され、また、ＡＣＳにも結合する。他の実施態様において、化合物は、ＡＣＳに結合することなく抗体に連結され、ＡＣＳへの接近を阻害することによって（例、立体障害によって）標的への抗体の結合を阻害する。１つの限定されない実施態様において、該化合物は、抗体の鎖の１つにのみ連結される。結合を阻害するために使用される化合物は、リンカーが、標的抗原への抗体の結合を最初に阻害する場合、ＡＣＳに結合する化合物を含まないリンカー化合物であり得る。
【００１２】
治療抗体は、ヒトにおいて治療剤として使用され得、非ヒト抗体（例、齧歯類において惹起されたもの）であり得る。
【００１３】
この化合物は、標的への抗体の結合を阻害するように機能し、それによって、投与後すぐに、該化合物の存在なしに結合するであろう抗体の量に比べて、標的に結合する抗体の量の制限された減少が起こる。標的に結合するようになる抗体の量は、時間と共に増加し、それによって、実質的に、標的に結合する抗体の量を阻害するＡＣＳの一時的な遮断が起こる。
【００１４】
ＡＣＳの一時的な遮断（時間と共に増加する標的に結合する抗体の量を、最初に減少する遮断）は、以下；
（ｉ）結合定数及び解離定数が、“妨害的な”因子と比べて有利である場合、細胞結合又は他の“標的”抗原上に徐々に抗体が蓄積するように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて徐々に解離し得る、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプレインキュベーションによる、規定された抗原又はそのドメイン、低親和性抗原性ペプチド又はミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）等の分子による、一時的な占有；又は
（ｉｉ）フレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）によって結合され得る、規定された抗原又はそのドメイン、低親和性抗原性ペプチド又はミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）等の分子による一時的な占有。いったんｉｎ ｖｉｖｏに投与されれば、結合定数及び解離定数が、“妨害的な”因子と比べて有利である場合、抗体は、徐々に細胞結合又は他の“標的”抗原上に蓄積するであろう；又は
（ｉｉｉ）ＡＣＳにおいて非共有的に結合し得、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて解離することが可能である化学的薬剤；又は
（ｉｖ）一時的にＡＣＳを妨害し得る他の変化；例えば、ＡＣＳに結合する化合物なしに、ＡＣＳへの接近を一次的にブロッキングすること
によって、影響され得る。
【００１５】
そのような修飾は、制限された期間の間、標的抗原上への抗体蓄積を妨げ、それは、投与された治療抗体が、軽減された副作用を有する一方、該抗体が所望の治療的効果を達成することを可能にする（すなわち、そのような効果を生み出す量において標的抗原上に蓄積する）ことを確実にするために充分であろう。修飾の除去は、ｐＨ変化、宿主内での酵素切断（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）、細胞に結合する宿主抗原との天然の競合（ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）等の宿主自身の生理学的及び生化学的プロセスによっても起こり得る。例えば、ペプチドミモトープは、例えば、白血球エステラーゼ等のｉｎ ｖｉｖｏでの宿主酵素による切断をうけやすい酵素分解モチーフを有するリンカーによって、抗体のＨ鎖又はＬ鎖に連結され得る。
【００１６】
本発明の１つの特に有利な実施態様によれば、リンカーは、酵素によって切断され、これは、治療抗体の所望の作用部位においてのみ又は優先的に起こり、それによって、所望の作用部位に治療抗体の選択的送達を提供する。例えば、白血球エステラーゼによって切断されるリンカーは、その目的とする作用部位が炎症を起こした関節である抗体に対して適当であろう。或いは、可溶性抗原又はミモトープが、腫瘍部位内の低いｐＨにおいて、より容易に解離し得、これは所望の作用部位への抗体の選択的送達をも提供し得る。或いは、不活性リンカーによって結合された低親和性ミモトープは、ｉｎ ｖｉｖｏにて自然に解離し得、再結合（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、宿主細胞上の天然抗原と相互作用するＡＣＳによって抑制され得る。
【００１７】
リンカーは、治療酵素の投与によって切断可能な部位を含むようにも設計され得る。例えば、リンカーは、ＴＰＡ又はストレプトキナーゼに対して切断可能な部位含むように設計され得る。切断速度（ｒａｔｅ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ）（従って、細胞上への蓄積速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌｓ））は、ＴＰＡ又はストレプトキナーゼの量及び投与速度を制御することによって制御され得る。同じ方針で、リンカーが、ｉｎ ｖｉｖｏにて自然に生じる酵素によって切断される場合、同様の制御が、切断を阻害するであろう酵素阻害剤の投与によって達成され得る。
【００１８】
好ましくは、天然抗原、そのドメイン、及びペプチド断片又はミモトープが、ＡＣＳを修飾するために使用される。後者は、合成的に又は生物学的に誘導されたいずれかのペプチドライブラリーから産生され得る。非共有結合の化学物質は、その抗原又は等価なサロゲート（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）に結合する抗体を阻害する能力について、天然又は合成ライブラリー又は他の入手可能な製品からスクリーニングされ得る。使用され得るリンカーは、好ましくは、フレキシブル（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）であるが、身体（ｂｏｄｙ）によって又は設定された時間が経てば、酵素的に切断可能及び／又は分解可能であり得る。
【００１９】
本発明は、さらに、補体システム及び免疫グロブリンのＦｃ領域に対する特殊化された細胞受容体（ＦｃＲ受容体）との相互作用を減少するように設計されたＦｃ領域を含む、上記のような抗体にも関する。これは、ブロッキング抗体又はアゴニスト抗体等の細胞溶解が必須ではない、多くの抗体に対して有用であろう。
【００２０】
さらなる側面によれば、本発明は、治療における使用のための上記の抗体を提供する。
【００２１】
さらなる側面によれば、本発明は、前記治療効果を達成するために、哺乳類の処置での使用のための医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の製造における、上記抗体の使用を提供する。この処置は、所望の治療効果を達成するために充分な用量の医薬を投与することを含む。この処置は、抗体の反復的投与を含み得る。
【００２２】
さらなる側面によれば、本発明は、所望の治療効果を達成し、例えば即時の及び大規模な標的細胞上の抗体の蓄積；特に、サイトカイン放出に起因する副作用を軽減及び／又は排除するために充分な用量の上記抗体の投与を含む、ヒトの処置方法を提供する。この治療効果は、ガン、関節リウマチのような慢性炎症性疾患、糖尿病、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ）等の自己免疫疾患、喘息等のアレルギー性疾患、心筋梗塞、脳梗塞等の循環器疾患及び感染性疾患を含み得る疾患の緩和又は予防であり得る。実際に、治療抗体の継続的又は反復的投薬（ｄｏｓｅｓ）が行われるあらゆる疾患である。
【００２３】
上記のタイプの一時的な修飾は、抗体の他に、その活性が一時的に遮断され得、この部位の活性が免疫原性を決定する、生物学的に活性な部位に依存する治療タンパク質にも適用され得る。そのような治療タンパク質の例は、ホルモン、酵素、凝固因子、サイトカイン、ケモカイン及び免疫グロブリンに基づく（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｂａｓｅｄ）融合タンパク質を含む。
【００２４】
抗体に化合物を共有結合した場合、１つの実施態様において、この化合物は、好ましくは、抗体の２つのアームの１つのみに連結される。
【００２５】
ここで使用される用語“抗体”は、リコンビナント抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、モノクローナル抗体等の全ての形態の抗体を含む。本発明は、治療標的に結合することが可能な抗体断片にも適用することができる。
【００２６】
１つの実施態様において、化合物（該化合物は、抗体のＡＣＳに結合可能なペプチド又は他の分子であり得る）は、個人に投与される抗体の抗体結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）部位又は抗体結合（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位に可逆的に結合される。該化合物は、抗原に対する抗体の結合部位を占有し、それによって、抗原に対する抗体の結合を阻害する。該化合物は、抗体結合部位に可逆的に結合され、抗体結合において制限された減弱（ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を有するように選択されることから、該抗体は、この抗体が方向付けられた（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）抗原に対して結合することが可能である。
【００２７】
１つの実施態様において、抗体の抗体結合部位に結合するように選択される化合物は、それによって、抗体の化合物に対するアビディティが、抗原に対する抗体のアビディティよりも小さいものである。このように、抗体が最初に投与された場合には、該化合物が存在しない場合に起こるであろう結合に比べて、抗原に対する抗体の減弱された結合が生じ、そのような結合は時間と共に増加する。
【００２８】
本出願人は、抗体の投与のすぐあとの期間において、抗原に結合する抗体の量が減少され、そのような量が、時間と共に、減少された量から増加すれば、所望の治療効果を生み出す、抗原に有効に結合することができる抗体を投与することによって治療抗体に対する副作用（サイトカイン放出の結果によるもの等）の軽減が達成され得ることを見出した。
【００２９】
従って、従来技術とは異なり、本発明に従って、その治療的機能を示す抗体は、最初に抗原に結合する治療抗体の量を減少した後、治療抗体結合量を増加することによって、抗体により引き起こされるサイトカイン放出等の副作用をも軽減する
最初に抗原に結合する抗体の量を減少させるという態様における、抗体結合部位に結合するために使用される化合物は、ペプチドであり得る。該ペプチドは、治療抗体が結合する抗原の対応するペプチド部分と同一又は異なり得る。抗体に対する適切なペプチドは、抗体及びその抗原に関する結合阻害アッセイ（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）においてペプチドのパネルを試験することによって選択され得る。これら及び他の手順は、本明細書の教示に基づいて、当業者にとって公知である。
【００３０】
１つの実施態様において、該化合物に結合される抗体は、標的抗原に対する非−修飾抗体のアビディティよりも低い、標的抗原に対するアビディティを有する。修飾抗体及び非修飾抗体の相対的アビディティは、終点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）として５０パーセント結合阻害を用いた結合阻害アッセイによって決定され得る。修飾抗体は、標的抗原に対する標識非修飾抗体の結合の５０パーセント阻害を生じるために必要な非修飾抗体の量に比べて、修飾抗体の量に増加があった場合、減弱したアビディティを有する。
【００３１】
修飾抗体のアビディティは、副作用（特にサイトカイン放出に起因するもの）を軽減及び／又は本質的に排除するために有効な量において、減弱され、修飾された抗体は、所望の治療効果を生み出すために有効な標的に対するアビディティを有する。一般に、アビディティは、少なくとも４倍、一般に、１００倍まで減弱される。より大きなアビディティの減少があり得ることが、理解される。従って、本発明の側面によれば、抗体は、副作用を軽減するために修飾され、軽減された副作用のみを所望される場合、結合における減弱は、そのような結果を達成するための量に制限される（すなわち、副作用軽減は、修飾抗体に対する抗体反応を減弱又は排除することなく、達成され得る）。
【００３２】
１つの限定されない実施態様において、該化合物は、非修飾抗体に比べて減弱した標的抗原に対する親和性を有する修飾抗体を提供することによって、修飾抗体の結合を阻害し得る。１つの限定されない実施態様において、修飾抗体は、非修飾抗体の親和性よりも少なくとも２倍又は少なくとも５倍小さい、結合される抗原に対する親和性を有し得る。本発明の１つの実施態様によれば、副作用は、制限された量における親和性を減弱することによって（例えば１００倍まで、修飾抗体に対する抗体反応を排除することなしに）軽減され得る。しかしながら、この親和性は、より多くの量において減弱され得るが、そのような大きな減弱は、サイトカイン放出によって引き起こされる副作用を軽減するために必要とされないことが理解される。
【００３３】
修飾抗体は、所望の治療効果を生み出すこと及び副作用の軽減の両方に有効な量において使用される。一般に、本発明を限定することなく、修飾抗体は、抗体が最初に投与された時から始まる２４時間の期間の間に、投与された抗体の量が、少なくとも５０ｍｇ及び一般的に少なくとも１００ｍｇ及びさらに一般的に少なくとも２００ｍｇであるような量で投与される。
【００３４】
治療抗体は、薬学的に許容される担体と組み合わせて使用され得る。好適な担体の使用は、本明細書中の教示から当業者の範囲内と考えられる。
【００３５】
本発明は、特定の治療効果を有するタンパク質を含む治療タンパク質にも関し、ここで、該タンパク質は、その天然の標的に対するタンパク質の結合を減少させる一時的な妨害を受ける生物学的活性部位を有し、続く宿主へのタンパク質の投与は、前記治療効果を達成し、それによって、その天然の標的に対するタンパク質結合の減少は、副作用を軽減する。
【００３６】
本発明は、以下：
（ａ）治療標的に結合する治療タンパク質（前記タンパク質が治療標的への該タンパク質の結合を阻害する化合物で修飾されており、前記修飾タンパク質が該タンパク質によって引き起こされる副作用を軽減すること及び治療標的に結合することによって治療効果を生み出すために有効である）；ならびに
（ｂ）薬学的担体
を含む医薬をも提供する。
【００３７】
好ましくは、治療タンパク質は、治療標的に結合する抗体結合部位を含む抗体である。より好ましくは、該化合物は、抗体の抗体結合部位に結合される。さらに好ましくは、該化合物はまた、抗体に連結される。
【００３８】
該化合物が、ペプチドであることも想定される。このペプチドと結合された修飾抗体のアビディティは、非修飾抗体のアビディティよりも少なくとも４倍少なく及び１００倍まで少ないことが好ましい。好ましくは、該抗体は、アグリコシル化抗体（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。さらに好ましくは、抗体の鎖の１つのみが、それに連結した、抗体結合部位に結合するペプチドを有する。
【００３９】
また、該化合物は、可逆的に抗体結合部位に結合し、それによって、標的に結合する抗体の量は、化合物が抗体結合部位から置換されるにつれて、増加することが好ましい。好ましくは、抗体結合部位に結合された該化合物はまた、抗体に連結される。さらに好ましくは、該化合物は、ペプチドである。抗体のＦｃ部分は、アグリコシル化されていて、さらに好ましくは、Ｆｃ受容体への抗体の結合が本質的に排除されていることが好ましい。
【００４０】
好ましくは、該抗体は、非ヒト抗体である。また、該抗体は、キメラ抗体であることが好ましい。
【００４１】
さらに、本発明は、哺乳類を処置するため及びタンパク質に対する副作用を軽減するための両方に有効な量の上記の医薬を哺乳類に投与することを含む、哺乳類を処置する方法をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下の限定されない実施例は、本発明を説明する。
【００４３】
ヒト化抗−ＣＤ５２抗体、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈを、以下の試験に用いた。様々なコンストラクトを、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体及び以下の方法を用いて作製した。
【００４４】
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの減弱された結合変異体の生成：
ヒトＣＤ５２抗原に対して特異的なヒト化抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１ＨのＶ領域のクローニングを、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６２：３３６６３−３６７１に記載のように行う。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．１９８９ ＰＮＡＳ ８６：３８３３のものに基づく。野生型ヒト化ＣＡＭＰＡＴＨ−１軽鎖を、ベクターｐＧＥＭ９（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングし、部位指定変異導入（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のためのＰＣＲテンプレートとして使用した。
【００４５】
フレキシブルリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒｘ２）を、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈのリーダー配列及びＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ ＶＬ配列間の軽鎖のアミノ末端に、オリゴヌクレオチドプライマーＰＵＣＳＥ２及びＬｉｎｋ Ｌ−３‘＋Ｌｉｎｋ−Ｌ−５’ならびにＰＵＣＳＥ ＲＥＶを用いて付加した。結果として得られた断片を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片として発現ベクター中にクローニングされ得る、全長Ｌｉｎｋｅｒ−ＣＰ−１Ｈ軽鎖を得るため、プライマーＰＵＣＳＥ２＋ＰＵＣＳＥ ＲＥＶを用いてＰＣＲ会合した（ＰＣＲ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）。
【００４６】
その後、Ｌｉｎｋｅｒ−ＣＰ−１Ｈ軽鎖コンストラクトを、ＣＤ５２ミモトープ（ＱＴＳＳＰＳＡＤ）及びＣＤ５２ミモトープ突然変異体９（ＱＴＳＡＡＡＶＤ）コンストラクトを生成するためにＰＣＲテンプレートとして使用した。プライマーＰＵＣＳＥ２及びＣＤ５２ＭＩＭ−３’＋ＣＤ５２ＭＩＭ−５’ならびにＰＵＣＳＥ ＲＥＶを、ミモトープ−ＣＰ−１Ｈ軽鎖コンストラクトを得るために使用した。プライマーＰＵＣＳＥ２及びＭＩＭＭｕｔ９−３’＋ＭＩＭＭｕｔ９−５’ならびにＰＵＣＳＥ ＲＥＶを、ミモトープ突然変異体９−ＣＰ−１Ｈ軽鎖コンストラクトを得るために使用した。
【００４７】
Ｌｉｎｋｅｒ−Ｏｎｌｙ−ＣＰ−１Ｈ、ミモトープ−ＣＰ−１Ｈ及びＭｉｍＭｕｔ９−ＣＰ−１Ｈ突然変異体を、ｐＢＡＮ−２、ネオマイシン選択を含むｐＮＨ３１６哺乳類発現ベクター（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８）及び選択のためグルタミン合成酵素遺伝子を含む哺乳類発現ベクターであるＰＥＥ１２（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５）に移した（ｔｒａｎｓｆｅｒ）。
【００４８】
サブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ｄｈｆｒ-チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８）又はＮＳＯマウスミエローマ細胞（ＥＣＡＣＣ ｃａｔ ｎｏ ８５１１５０３， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８１，７３Ｂ，３）を、軽鎖突然変異体及びＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖コンストラクト ヒトＩｇＧ１不変領域と共にコトランスフェクションを行った。
【００４９】
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖コンストラクトを、ｄｈｆｒ選択可能なマーカーを有するｐＬＤ９哺乳類発現ベクターの変異体である、ｐＲＤＮ−１（Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８）及びＰＥＥ１２中に発現させた。トランスフェクションを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、取り扱い説明書に従って行った。
【００５０】
ヒトＩｇＧ１不変領域を、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９８２ Ｃｅｌｌ ２９：６７１−６７９によって記載される野生型Ｇ１ｍ（１，１７）遺伝子から誘導した。
【００５１】
重鎖及び軽鎖トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８＋５％（ｖ／ｖ）透析されたウシ胎児血清を含む、ヒポキサンチン−フリーＩＭＤＭ中で選択した。結果として選択された細胞を、ＥＬＩＳＡによって抗体産生について、ならびにヒトＴ細胞クローンＨＵＴ７８（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＥ ｅｔ ａｌ． １９８１ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：１４０３−１４１８）及びＣＤ５２トランスジェニックマウスに対して結合する抗原についてスクリーニングした。
【００５２】
抗体を産生する細胞を、限外希釈によってクローニングし、その後、ローラーボトル培養（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）に拡大した。各細胞株由来のおよそ１５リットルの組織培養上清からの免疫グロブリンを、プロテインＡ上で精製し、ＰＢＳで透析し、そして定量化した。
【００５３】
使用されたプライマーのリスト
【００５４】
【化１】
【００５５】
産生されたコンストラクト及び細胞株
ＴＦ ＣＨＯ／ＣＰ−１Ｈ ＩｇＧ１／ＭＩＭ及びＴＦ ＮＳＯ／ＣＰ−１Ｈ ＩｇＧ１／ＭＩＭ（ＭＩＭ ＩｇＧ１）
フレキシブルグリシン４セリンｘ２リンカ−＋野生型ヒトＩｇＧ１不変領域を有するＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ重鎖によって、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖Ｖ領域につながれたＣＤ５２ミモトープＱＴＳＳＰＳＡＤ。ＮＳＯ−産生抗体についての発現ベクターＰＥＥ１２（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ならびにＣＨＯ−産生抗体についてのｐＲＤＮ−１及びｐＢＡＮ−２発現ベクターＷｅｌｌｃｏｍｅ中へのクローニング。
【００５６】
ＴＦ ＣＨＯ／ＣＰ−１Ｈ ＩｇＧ１／Ｌｉｎｋ（リンカー）
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖Ｖ領域上のフレキシブルグリシン４セリンｘ２リンカー＋野生型ヒトＩｇＧ１不変領域を有するＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖。ＣＨＯ−産生抗体についての、ｐＲＤＮ−１及びｐＢＡＮ−２発現ベクタ−（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）中へのクローニング。
【００５７】
ＴＦ ＣＨＯ／ＣＰ−１Ｈ ＩｇＧ１／ＭＩＭ−ＭＵＴＡＮＴ９（ＭＩＭ−ＭＵＴＡＮＴ９−ＩｇＧ１）
野生型ヒトＩｇＧ１不変領域を有するＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖＋フレキシブルグリシン４セリンｘ２リンカーによって、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖Ｖ領域につながれたＣＤ５２ミモトープ突然変異体９（ＱＴＳＡＡＡＶＤ）。ＣＨＯ−産生抗体についての発現ベクタ−ｐＲＤＮ−１及びｐＢＡＮ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）中へのクローニング。
【００５８】
ＴＦ ＣＨＯ／ＣＯ−１Ｈ ＩｇＧ１（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）
野生型ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖Ｖ領域＋野生型ヒトＩｇＧ１不変領域を有するＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖。ＣＨＯ−産生抗体についての発現ベクターｐＲＤＮ−１及びｐＢＡＮ−２（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）中へのクローニング。
【００５９】
図１は、ＣＤ５２を有するＨＵＴ細胞に対する様々な抗体コンストラクトの結合能力を示す。ＣＰ−１Ｈ野生型は、ＣＰ−１Ｈリンカーのみの結合よりもおよそ５倍大きく、ＣＰ−ＭＩＭｍｕｔ９よりもおよそ１００倍大きく、及びＣＰ−ＣＤ５２ＭＩＭよりもおよそ１０，０００倍大きい結合能力（ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を有する。
【００６０】
エフェクター機能評価
ＣＰ−１Ｈ ＭＩＭｍｕｔ９エフェクター機能を、補体溶血によるＣＤ５２保有Ｔ細胞株ＨＵＴ７８を殺す能力を試験することにより、評価した。ＣＰ−１Ｈ野生型を、陽性コントロールとして用いた。１０6細胞／ｍｌのＨＵＴ７８細胞１００μｌを、０．４ｕｇ／ｍｌ〜３００ｕｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度の各抗体と混合した。この後、補体の供給源（ｓｏｕｒｃｅ）としての新鮮な、不希釈（ニート（ｎｅａｔ））ヒト血清１００μｌを添加した。３７℃にて４５分間インキュベーションした後、プロピジウムアイオダイドを、混合物に加え、フローサイトメトリーによって細胞を解析した。ＰＩ染色（溶解した）細胞のパーセンテージを、各条件について測定した。図２に示される結果は、ＣＰ−１Ｈ ＭＩＭｍｕｔ９が、抗体エフェクター機能を媒介（ｍｅｄｉａｔｅ）する能力を維持することを示す。
【００６１】
修飾及び非修飾抗体を、以下のように、サイトカインの誘導を測定するために試験した：
サイトカイン計測
精製抗体を、エンドトキシンを除去するためにＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に通した。その後、全ての抗体のバッチを、ＱＣＬ １０００ ＬＡＬアッセイ（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いて、エンドトキシンについて試験した。
【００６２】
Ｅｘ−Ｖｉｖｏ全血アッセイ
健康な研究者からの血液を、新鮮なまま（ｆｒｅｓｈｌｙ）ヘパリン中に導かれた（ｄａｒｗｎ ｉｎｔｏ）。全血試料を、１００、１０又は１μｇ／ｍｌの治療抗体と共に、３７℃にて５時間、激しく振とうしながらインキュベーションを行った。その後、血漿及び細胞を、遠心分離によって分離した。
【００６３】
血漿ＴＮＦ−αレベルをヒトＴＮＦ−αイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定し、血漿ＩＦＮ−γレベルをヒトＩＦＮ−γＥｌｉｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定し、そして、血漿ＩＬ−６レベルをヒトＩＬ−６Ｅｌｉｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。
【００６４】
以下の表１及び２は、サイトカインの放出を減少する修飾抗体を用いた、そのような試験の結果を報告する。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
ここに記載される実施態様の多くの修飾及び変化が、この中の教示に基づいて可能である；従って、本発明の範囲は、そのような実施態様に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ＣＤ５２を有するＨＵＴ細胞に対する様々な抗体コンストラクトの結合能力を示す。
【図２】ＰＩ染色（溶解した）細胞のパーセンテージを、各条件について測定した。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１〜７は、ＰＣＲプライマーである。
【００７０】
配列番号８は、ＰＣＴプライマーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）治療標的に結合する治療タンパク質（前記タンパク質が治療標的への該タンパク質の結合を阻害する化合物で修飾されており、前記修飾タンパク質が該タンパク質によって引き起こされる副作用を軽減すること及び治療標的への結合により治療効果を生み出すために有効である）；ならびに
（ｂ）薬学的担体
を含む医薬。
【請求項２】
治療タンパク質が、治療標的に結合する抗体結合部位を含む抗体である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
該化合物が抗体の抗体結合部位に結合する、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
該化合物はまた抗体に連結される、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
該化合物がペプチドである、請求項３に記載の医薬。
【請求項６】
ペプチドと結合した、修飾された抗体のアビディティが、修飾されていない抗体のアビディティよりも少なくとも４倍小さく、１００倍まで小さい、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
抗体がアグリコシル化抗体である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
抗体の鎖の１つのみが、抗体結合部位に結合する、そこに連結されたペプチドを有する、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
該化合物が抗体結合部位に可逆的に結合され、それによって標的に結合する抗体の量が、該化合物が抗体結合部位から置換（ｄｉｓｐｌａｃｅ）されるにつれて増加する、請求項３に記載の医薬。
【請求項１０】
抗体結合部位に結合する化合物はまた、抗体に連結される、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
該化合物がペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体のＦｃ部分がアグリコシル化されている、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
Ｆｃ受容体への抗体の結合が本質的に排除されている、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１４】
抗体が非ヒト抗体である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１５】
抗体がキメラ抗体である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１６】
哺乳類を処置すること及びタンパク質に対する副作用を軽減することの両方に対する有効量の請求項１に記載の医薬を哺乳類に投与することを含む、哺乳類を処置する方法。
【請求項１】
以下：
（ａ）治療標的に結合する治療タンパク質（前記タンパク質が治療標的への該タンパク質の結合を阻害する化合物で修飾されており、前記修飾タンパク質が該タンパク質によって引き起こされる副作用を軽減すること及び治療標的への結合により治療効果を生み出すために有効である）；ならびに
（ｂ）薬学的担体
を含む医薬。
【請求項２】
治療タンパク質が、治療標的に結合する抗体結合部位を含む抗体である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
該化合物が抗体の抗体結合部位に結合する、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
該化合物はまた抗体に連結される、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
該化合物がペプチドである、請求項３に記載の医薬。
【請求項６】
ペプチドと結合した、修飾された抗体のアビディティが、修飾されていない抗体のアビディティよりも少なくとも４倍小さく、１００倍まで小さい、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
抗体がアグリコシル化抗体である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
抗体の鎖の１つのみが、抗体結合部位に結合する、そこに連結されたペプチドを有する、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
該化合物が抗体結合部位に可逆的に結合され、それによって標的に結合する抗体の量が、該化合物が抗体結合部位から置換（ｄｉｓｐｌａｃｅ）されるにつれて増加する、請求項３に記載の医薬。
【請求項１０】
抗体結合部位に結合する化合物はまた、抗体に連結される、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
該化合物がペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体のＦｃ部分がアグリコシル化されている、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
Ｆｃ受容体への抗体の結合が本質的に排除されている、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１４】
抗体が非ヒト抗体である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１５】
抗体がキメラ抗体である、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１６】
哺乳類を処置すること及びタンパク質に対する副作用を軽減することの両方に対する有効量の請求項１に記載の医薬を哺乳類に投与することを含む、哺乳類を処置する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５０６３３３（Ｐ２００６−５０６３３３Ａ）
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２２３３５（Ｐ２００４−５２２３３５）
【出願日】平成１５年７月２３日（２００３．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００３１５６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００９６３８
【国際公開日】平成１６年１月２９日（２００４．１．２９）
【出願人】（５０３４５５５５８）イシス イノベーション リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月２３日（２００３．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００３１５６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００９６３８
【国際公開日】平成１６年１月２９日（２００４．１．２９）
【出願人】（５０３４５５５５８）イシス イノベーション リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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