【課題】加ピロリン酸分解活性化重合（PAP）の新規方法を提供する。
【解決手段】相補的な活性化可能オリゴヌクレオチドP＊を、テンプレート鎖にアニーリングさせる工程。アニーリングした活性化可能オリゴヌクレオチドP＊を加ピロリン酸分解する工程。活性化されたオリゴヌクレオチドP＊を伸長することによって重合させ、所望の核酸鎖を合成する工程。テンプレート鎖から所望の核酸鎖を分離する工程。所望の核酸鎖の所望の増幅レベルが達成されるまで、前記工程を反復する工程。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸検出法であって：
（a）核酸からテンプレート核酸を合成し、ここで前記テンプレート核酸は以下の：
（i）1つの核酸鎖に、配列特異的である第一の相補オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、そして核酸ポリメラーゼを用いて、該核酸鎖上で、前記の第一の相補オリゴヌクレオチドを伸長して、伸長された第一のオリゴヌクレオチドを産生する；そして
（ii）伸長された第一の相補オリゴヌクレオチドの3'末端に第二のオリゴヌクレオチドを付加してテンプレート核酸を産生する；
ことにより合成する；
（b）テンプレート核酸に、伸長不能3'端を有する第一のオリゴヌクレオチドP^＊および第二のオリゴヌクレオチドP^＊をアニーリングさせ、ここでそれぞれの3'伸長不能末端は加ピロリン酸分解によって除去可能である；
（c）加ピロリン酸分解によって、テンプレート核酸にアニーリングした第一のオリゴヌクレオチドP^＊および第二のオリゴヌクレオチドP^＊のそれぞれの3'伸長不能末端を除去して、ブロッキングされていない第一のオリゴヌクレオチドおよびブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドを産生し；そして
（d）ブロッキングされていない第一のオリゴヌクレオチドおよびブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドを伸長する；
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
連結によって、伸長された第一の相補オリゴヌクレオチドに第二のオリゴヌクレオチドを付加する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ターミナルトランスフェラーゼ伸長によって、伸長された第一の相補オリゴヌクレオチドに第二のオリゴヌクレオチドを付加する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
テンプレート核酸を増幅する工程（a1）をさらに含んでなる、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項1〜3の記載の方法。
【請求項６】
増幅が加ピロリン酸分解活性化重合による、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
テンプレート核酸が、核酸のコピーを合成する反応により合成される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
核酸ポリメラーゼを用いて加ピロリン酸分解を行う、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
核酸ポリメラーゼを用いて伸長を行う、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
伸長工程で存在するヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が標識を含有し、そして伸長されたオリゴヌクレオチド中の標識の存在が検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
工程（a）〜（d）を反復する、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
核酸が、切断されている核酸である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸が損傷又はニックを有する二本鎖核酸である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
それぞれのオリゴヌクレオチドP^＊の3'伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が、3'デオキシヌクレオチド、2',3'-ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、3'-デオキシアデノシン（コルジセピン）、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデオキシ-3'-チアシチジン（3TC）及び2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン（d4T）からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
核酸を検出する方法であって：
（a）核酸に2つのオリゴヌクレオチドP^＊をアニーリングさせ、ここで各オリゴヌクレオチドP^＊は伸長不能3'端を有し、各オリゴヌクレオチドP^＊の3'伸長不能末端は加ピロリン酸分解によって除去可能であり、一方のオリゴヌクレオチドP^＊ともう一方のオリゴヌクレオチドP^＊は、それぞれの3'端で、少なくとも1ヌクレオチド重複し、そして一方のオリゴヌクレオチドP^＊は第一の核酸鎖にアニーリングし、そしてもう一方のオリゴヌクレオチドP^＊は、第一の核酸鎖の相補体である核酸鎖にアニーリングする；
（b）加ピロリン酸分解によって、アニーリングした第一及び第二のオリゴヌクレオチドP^＊の3'伸長不能末端を除去して、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを産生し；そして
（c）オリゴヌクレオチドP^＊の3'伸長不能末端の除去を検出する；
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドP^＊の3'伸長不能末端を標識し、そしてオリゴヌクレオチドP^＊の3'伸長不能末端の除去の検出を、オリゴヌクレオチドP^＊の標識化の減少を検出することにより行う、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
（a）1またはそれ以上のヌクレオチドおよび核酸ハイブリッド中へのヌクレオチドの導入を触媒する酵素を使用して、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを伸長する工程；そして（b）伸長されたオリゴヌクレオチドを検出することにより核酸の存在を検出する工程；により、オリゴヌクレオチドP^＊の3'伸長不能末端の除去の検出を行う、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
2つの反応、すなわち、活性化されていない場合にはオリゴヌクレオチドが核酸テンプレート上で伸長することを阻害する不活性オリゴヌクレオチドを活性化する反応である第一の反応、そして活性化オリゴヌクレオチドを核酸テンプレート上で伸長する反応である第二の反応、を連続的に組み合わせて含むプロセスであって、ここで不活性オリゴヌクレオチドは、核酸テンプレートと3'側適合を有し、そして不活性オリゴヌクレオチドが核酸代謝酵素により活性化される、前記プロセス。
【請求項２０】
不活性オリゴヌクレオチドが、3'末端ブロッキングされている、請求項19に記載のプロセス。
【請求項２１】
核酸代謝酵素が、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、RNase H、テロメラーゼ、または逆転写酵素である、請求項19に記載のプロセス。
【請求項２２】
4種のヌクレオチド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下にて、伸長を行う、請求項19に記載のプロセス。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドが、第一の反応の前およびその間にテンプレートに対して少なくとも部分的にハイブリダイズする、請求項19に記載のプロセス。
【請求項２４】
伸長が、核酸テンプレートの増幅の一部である、請求項19に記載のプロセス。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２−１】

【図１２−２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８−１】

【図１８−２】

【図１９】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１−１】

【図２１−２】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２５】

【図２６】

【公開番号】特開２０１０−１４２２３２（Ｐ２０１０−１４２２３２Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９７３３９（Ｐ２００９−２９７３３９）
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【分割の表示】特願２００４−５０３６５４（Ｐ２００４−５０３６５４）の分割
【原出願日】平成１５年５月９日（２００３．５．９）
【出願人】（５９８００４４２４）シティ・オブ・ホープ (15)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｏｐｅ
【住所又は居所原語表記】１５００　Ｅａｓｔ，Ｄｕａｒｔｅ　Ｒｏａｄ，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　９１０１０−０２６９，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】