効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
本発明は、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、人工多能性幹（以下、iPSという）細胞の樹立効率の改善方法に関する。より詳細には、本発明は、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、iPS細胞の樹立効率の改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
近年、マウスおよびヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。Yamanakaらは、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した（1, 2）。Okitaら（3）は、Fbx15よりも多能性細胞に発現が限局しているNanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来の線維芽細胞で上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾プロファイルが胚性幹（ES）細胞とほぼ同等のiPS細胞（Nanog iPS細胞）を樹立することに成功した。同様の結果が他のグループによっても再現された（4, 5）。その後、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることが明らかとなった（6）。
【０００３】
さらに、Yamanakaらは、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した（1, 7）。一方、Thomsonらのグループは、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した（8, 9）。また、Parkら（10）は、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの4因子に加えて、ヒト細胞不死化遺伝子として知られるTERTとSV40ラージT抗原を用いて、ヒトiPS細胞を作製した。このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。
【０００４】
しかし、iPS細胞の樹立効率は1%以下と低く、特に、iPS細胞から分化した組織や個体において腫瘍化が懸念されるc-Mycを除く3因子（Oct3/4, Sox2, Klf4）を体細胞に導入してiPS細胞を作製した場合、その樹立効率が極めて低いという問題点がある。
【０００５】
ところで、細胞の未分化状態や多能性の維持と低酸素条件との関連性に関する報告が幾つかなされている。Ezashiら（11）は、ヒトのES（hES）細胞を低酸素条件下で培養したところ、分化が抑制されたことから、hES細胞の十分な多能性維持のためには、低酸素条件での培養が必要であることを示唆している。Covelloら（12）は、低酸素条件下で初期に誘導される転写調節因子（HIF-2α）は、Oct3/4の発現を誘導し、幹細胞の機能や分化を調節し得ることを示している。さらにGraysonら（13,14）は、低酸素条件がヒト間葉系幹細胞（hMSC)の未分化状態や多能性の維持に関与することを示している。しかしながら、いったん分化が進んだ体細胞における核初期化プロセスと低酸素状態との間の関連性については、何ら報告されていない。
【０００６】
引用文献：
1. WO 2007/069666 A1
2. Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
3. Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)
4. Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007)
5. Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007)
6. Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)
7. Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
8. WO 2008/118820 A2
9. Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
10. Park, I.H. et al., Nature, 451: 141-146 (2008)
11. Ezashi, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 4783-4788 (2005)
12. Covello, K.L. et al., Genes & Dev., 20: 557-570 (2006)
13. Grayson, W.L. et al., J. Cell. Physiol., 207: 331-339 (2006)
14. Grayson, W.L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 358: 948-953 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要約
本発明の目的は、iPS細胞の樹立効率を改善する手段を提供することであり、それを用いた効率的なiPS細胞の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、iPS細胞の樹立効率を格段に向上させることに成功して、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りのものである：
[1] iPS細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、方法。
[2] 雰囲気中の酸素濃度が1-10%の範囲内である、上記[1]記載の方法。
[3] 雰囲気中の酸素濃度が1-5%の範囲内である、上記[2]記載の方法。
[4] 核初期化物質が、以下の物質、あるいはそれらをコードする核酸である、上記[1]-[3]のいずれかに記載の方法；
(i) Oct3/4及びKlf4、又は
(ii) Oct3/4及びc-Myc、又は
(iii) Oct3/4、Klf4及びSox2、又は
(iv) Oct3/4、Klf4及びc-Myc、又は
(v) Oct3/4、Klf4、Sox2及びc-Myc。
[5]核初期化工程において効率改善物質としてバルプロ酸が使用されるさらなる工程を含む、上記[1]-[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 低酸素条件下における体細胞の培養が、核初期化物質を接触させた後3日以上行われる、上記[1]-[5]のいずれかに記載の方法。
【００１０】
核初期化工程における低酸素状態はiPS細胞の樹立効率を顕著に増大させることができるので、従来きわめて樹立効率の低かったc-MycもしくはSox2を除く3因子によるiPS細胞誘導に特に有用である。また2因子（例えばOct3/4とKlf4；Oct3/4とc-Myc）によるiPS細胞誘導にも有用である。とりわけc-Mycは再活性化による腫瘍発生が危惧されることから、2もしくは3因子によるiPS細胞樹立効率の改善を実現したことは、iPS細胞の再生医療への応用において極めて有用である。また、かかる低酸素状態は、酸素濃度を調節可能な汎用のCO2インキュベーターを用いて極めて容易に創出することができるので、煩雑な工程や熟練の技術等を要することなく、効率的なiPS細胞の作製が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、Oct3/4およびKlf4の2遺伝子をMEFに導入して樹立したiPSコロニー（GFP陽性コロニー）の数を、正常酸素濃度（20％）および低酸素濃度（5％）で比較したグラフである（*p<0.05）。
【図２】図2は、Oct3/4およびc-Mycの2遺伝子をMEFに導入して樹立したiPSコロニー（GFP陽性コロニー）のコロニー像を示す[a)位相差像；b)GFP陽性コロニー像]。
【図３】図3は、低酸素濃度下で樹立したiPS細胞由来のRNAを用いて、RT-PCRを行った結果を示した写真である。未分化マーカーであるOct3/4(end)、Sox2(end)、Klf4(end)、c-Myc(end)、Nanog、Rex1、ECAT1の発現、および導入した外来性Oct3/4(Tg)の発現を調べた。各レーンのサンプルは以下のとおりである：・521AH5-1および535AH5-2：4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し；細胞を酸素濃度5％にて培養した。・535AH1-1：4遺伝子を導入し；細胞を酸素濃度1％にて培養した。・535BH5-1および521BH5-3：3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）を導入し；細胞を酸素濃度5％にて培養した。・527CH5-1、527CH5-2および547CH5-1：2遺伝子（Oct3/4, Klf4）を導入し；細胞を酸素濃度5％にて培養した。・RF8：コントロールのES細胞。・20D17：コントロールのNanog-iPS細胞[Nature,448,313-317(2007)]。各パネル右側の数字はPCRのサイクル数を指す。
【図４】図4上は、低酸素濃度下（5％）、Oct3/4およびKlf4で樹立したマウスiPS細胞(527CH5-2)を免疫不全マウスの皮下に注射し、形成させたテラトーマの写真である。また図4下は、得られたテラトーマの組織染色像（ヘマトキシリン・エオシン染色）である[a)：軟骨組織、b)：内胚葉性上皮組織、c)：筋肉組織、d)：角化上皮組織]。
【図５】図5は、低酸素濃度下（5％）、2遺伝子、3遺伝子または4遺伝子導入により樹立したiPS細胞をICRマウス由来の胚盤胞にマイクロインジェクションすることにより作出したアダルトキメラの、生後2週間目の写真である。a)：4遺伝子導入で樹立したiPS細胞（521AH5-1）由来のキメラマウス（オス）。b)：3遺伝子導入で樹立したiPS細胞（535BH5-1）由来のキメラマウス（オス）。c)：3遺伝子導入で樹立したiPS細胞（535BH5-1）由来のキメラマウス（メス）。d)：2遺伝子導入で樹立したiPS細胞（527CH5-1）由来のキメラマウス（オス）。e)：2遺伝子導入で樹立したiPS細胞（527CH5-2）由来のキメラマウス（オス）。
【図６】図6は、実施例7のタイムスケジュールを示した図である。
【図７】図7は、実施例7の種々の培養条件で樹立したiPSコロニー数を示すグラフである。「Pre」は低酸素条件下での前培養有りの結果を示す。「4F」、「3F」および「Mock」はそれぞれ、4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）導入、3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）導入および空ベクター導入の結果を示す。
【図８】図8は、実施例7で4遺伝子導入した場合における、感染後40日目のiPSコロニーの形態を示した写真である。上段、下段はそれぞれ、低酸素条件下での前培養なし、低酸素条件下での前培養ありの場合のコロニー像を示す。
【図９】図9は、4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し、5％酸素濃度下で、感染後7日目から1週間、2週間、3週間、または感染後40日目まで培養を行い、得られたiPSコロニーの数を、正常酸素濃度（20％）と比較した結果を示すグラフである。3回の独立した実験結果をまとめて示す。
【図１０】図10は、低酸素濃度下で樹立したiPS細胞由来のRNAを用いて、RT-PCRを行った結果を示した写真である。未分化マーカーであるOct3/4(end)、Sox2(end)、Klf4(end)、c-Myc(end)、Nanog、Rex1、GDF1、ESG1の発現を調べた。各レーンのサンプルは以下のとおりである：・96AH5-2および96AH5-3：4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し；細胞を、酸素濃度5％で感染後7日目から40日目まで培養した。・96AH5W3-4、96AH5W3-5、96AH5W3-6：4遺伝子を導入し；細胞を、酸素濃度5％で感染後7日目から3週間培養した。・96BH5-1：3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）を導入し；細胞を、酸素濃度5％で前培養した。・201B2：コントロールのiPS細胞（Cell,131,861-872(2007)）。各パネル右側の数字はPCRのサイクル数を指す。
【図１１】図11は、5％酸素濃度下で作製した、ヒトES様コロニーの代表的な位相差像（a）および樹立iPSクローンのアルカリホスファターゼ染色（b）を示す。5％酸素濃度下で作製した未分化のヒトiPS細胞の免疫組織化学的染色。Nanog（c）、SSEA3（d）、SSEA4（e）。
【図１２】図12は、4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し、5％酸素濃度下で培養して樹立したヒトiPS細胞(70AH5-2、70AH5-6)が、三胚葉系への分化能を有することを、α-fetoprotein、smooth muscle actin、βIII-tubulin、GFAP、DesminおよびVimentin抗体を用いた染色により確認した結果を示す写真である[左側：位相差像、右側：免疫染色像]。
【図１３】図13は、4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し、5％酸素濃度下で培養して樹立したヒトiPS細胞(70AH5-2)をSCIDマウスの精巣内に注射して得られたテラトーマの組織染色像（ヘマトキシリン・エオシン染色）を示す[a) 神経上皮組織、b) 網膜上皮組織、c) 骨様組織、d) 平滑筋組織、e) 内胚葉性上皮組織]。
【図１４】図14（a）から（d）は、21日目（a）及び28日目（b）における、4因子を導入したMEF由来のNanog-GFP陽性コロニーのカウント数、21日目（c）及び28日目（d）における3因子を導入したMEF由来のカウント数の比較を示すグラフである。図14（e）及び（f）は、4因子を導入したMEF（e）、及び3因子を導入したMEF（f）由来の全コロニーにおける、21日目のGFP陽性コロニーの割合の比較を示すグラフである。
【図１５】図15（a）は、バルプロ酸（VPA）あり及びなしの場合に、低酸素及び正常酸素条件下で培養した、4因子を導入したMEF由来の9日目におけるGFP陽性細胞の割合を比較しているグラフ表示を示す。図15（b）から（e）は、VPAなしにて20％酸素下（b）及びVPAなしにて5％酸素下（c）、並びにVPAありにて20％酸素下（d）及びVPAありにて5％酸素下（e）における、4因子を導入したMEFの代表的なフローサイトメトリー解析を示す。
【図１６】図16は、導入後21日目の、20％酸素下（（a）；位相差、（b）；GFP）及び5％酸素下（（c）；位相差、（d）；GFP）での代表的なGFP陽性コロニー像を示す。スケールバーは、200μmを意味する。
【図１７】図17は、4因子を感染させたMEFの、20％酸素下（a）及び5％酸素下（b）における21日目の代表的な像、3因子を感染させたMEFの、20％酸素下（c）及び5％酸素下（d）における28日目の代表的な像を示す。
【図１８】図18は、527CH5-1の核型解析を示す。
【図１９】図19は、ES細胞（RF8）（a）及び4因子を導入したMEF（b）のアポトーシスを起こした細胞の割合を比較しているグラフ表示を示す。ES細胞を、1x105細胞／ウェルの密度にてSTO細胞のフィーダー層上にまき、1日目から3日目まで、正常酸素又は低酸素下にて培養した。3日目に、細胞をannexin V-FITCにて処理して、フローサイトメトリー解析を行った。棒グラフは、アポトーシスを起こした細胞（annexin V-FITC陽性）の割合を表す。4因子を導入したMEFを導入後4日目にSTO細胞上にまき、5日目から9日目まで、低酸素及び正常酸素下にて培養して、annexin V親和性アッセイを行った。棒グラフは、アポトーシスを起こした細胞の割合を表す。3回の実験の平均値及び標準偏差を示す。
【図２０】図20は、ES細胞（RF8）（a）並びに4因子及びmockを導入したMEF（b）の細胞数を比較しているグラフ表示を示す。ES細胞を、1x105細胞／ウェルの密度にてSTO細胞のフィーダー層上にまき、1日目から3日目まで、正常酸素又は低酸素下にて培養した。3日目に、細胞数をカウントした。棒グラフは、ES細胞の細胞計数を示す。3回の実験の平均値及び標準偏差を示す。4因子及びmockを導入したMEFを、それぞれ1日目から4日目まで、低酸素又は正常酸素下にて培養して、細胞数をカウントした。棒グラフは、細胞計数を示す。4回の実験の平均値及び標準偏差を示す。＊p＞0.05
【図２１】図21は、ES細胞特異的遺伝子（a）及びMEF特異的遺伝子（b）の発現パターンについて、5％酸素下の4因子を導入したMEFと、20％酸素下のそれを比較した、スキャタープロットを示す。ES細胞及びMEFで特異的に発現する遺伝子を選択した（10倍以上の相違）。低酸素処理をして、4因子を導入したMEFにおいて上方制御及び下方制御された遺伝子を、それぞれ赤及び青にて示す。緑色の線は、遺伝子発現レベルが5倍変化していることを示す。
【図２２】図22は、定量的リアルタイムRT-PCRによる、内在性のOct3/4及びNanogの相対的な発現を示す。
【図２３】図23（a）は、21日目のNanog-GFP陽性コロニーのカウント数を比較しているグラフ表示を示す。3回の実験の平均値及び標準偏差を示す。スケールバー、200μm。＊は、p＞0.05を意味する。図23（b）から（e）は、20％酸素下（（b）；位相差、（c）；GFP）及び5％酸素下（（d）；位相差、（e）；GFP）由来の代表的なGFP陽性コロニー像を示す。
【図２４】図24（a）は、piggybac転位によって初期化したMEF由来の、12日目のNanog-GFP陽性コロニーの各カウント数を比較しているグラフ表示を示す。3回の実験の平均値及び標準偏差を示す。＊及び＊＊は、それぞれp＜0.01及びp＜0.001を意味する。図24（b）から（e）は、20％酸素下（（b）；位相差、（c）；GFP）及び5％酸素下（（d）；位相差、（e）；GFP）由来の代表的なGFP陽性コロニー像を示す。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、iPS細胞の樹立効率の改善方法を提供する。
【００１３】
（ａ）低酸素条件
本明細書において用語「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下（例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など）、10%以下（例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など）、または5%以下（例、4%以下、3%以下、2%以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上（例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など）、0.5%以上（例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.9%以上など）、または1%以上（例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など）である。
【００１４】
細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
【００１５】
低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、体細胞への核初期化物質の接触より前であっても、該接触と同時であっても、該接触より後であってもよいが、例えば、体細胞に核初期化物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2,3,4,5,6,7,8または9）日）おいた後に低酸素条件下で培養を開始することが好ましい。
【００１６】
低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上または10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下または30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。例えば、好ましい期間は、低酸素条件での初期化した細胞におけるES細胞特異的遺伝子の発現と、正常酸素条件でのそれを比較して、決定される。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
【００１７】
さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期および好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の選択、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率、及び他の要素によっても変動する。例えば、Oct3/4, Klf4, 及びSox2の3因子をヒト体細胞に導入する場合、核初期化物質との接触後比較的早い時期（例えば、0ないし3（例、1,2）日後）から、3ないし10（例、4,5,6,7,8,9）日間低酸素条件下で培養することが、好ましい。
【００１８】
(b) 体細胞ソース
哺乳動物由来（例、マウス、ヒト）の生殖細胞以外のいかなる細胞も、本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることができる。例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。未分化な前駆細胞の例としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００１９】
体細胞のソースとなる哺乳動物の選択は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、体細胞は、患者本人の細胞、又は患者のHLA型と同一か実質的に同一のHLA型を有する他人（提供者）から採取した細胞であることが特に好ましい。本明細書中にて使用する「実質的に同一のHLA型」は、提供者の体細胞由来のiPS細胞の分化を誘導することによって得られた移植細胞が、患者に移植されるときに免疫抑制剤などの使用とともに移植され得る程度に、提供者のHLA型が患者のHLA型と適合していることを意味する。例えば、実質的に同一のHLA型は、3つの主要なHLAである、HLA-A、HLA-B及びHLA-DRが受容者と一致するようなHLA型を含む（以下において、同一の意味が適用されるであろう）。また、ヒトに投与（移植）しない場合でも、例えば、患者の薬剤感受性や副作用を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとして得られたiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取する必要がある。
【００２０】
(c) 核初期化物質
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる任意の物質（単数又は複数）を指し、タンパク質性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク質性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク質性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmi1
[上記因子についてのさらなる情報については、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換の情報については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。]
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2 [Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照]
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28 [Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照]
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40 Large T （Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28 [Cell Research (2008) 600-603を参照]
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T （Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Oct3/4, Klf4 [Nature, 454, 646-650 (2008)；Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008）も参照]
(15) Oct3/4, c-Myc [Nature, 454, 646-650 (2008)を参照]
(16) Oct3/4, Sox2 [Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照]
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19)Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgと置換可能である; Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009)を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT (Science, 324: 797-801 (2009) を参照)
【００２１】
上記(1)〜(24)において、Oct3/4の代わりに、Octファミリーの他のメンバー（例えば、Oct1A、Oct6など）もまた使用され得る。Sox2 (又はSox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18)の代わりに、Soxファミリーの他のメンバー（例えば、Sox7など）もまた使用され得る。c-Mycの代わりに、Mycファミリーの他のメンバー（例えば、L-Mycなど）もまた使用され得る。Lin28の代わりに、Linファミリーの他のメンバー（例えば、Lin28bなど）もまた使用され得る。
【００２２】
上記(1)〜(24)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)〜(24)のいずれかの1以上の構成要素を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該1以上の構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
【００２３】
これらの組み合わせの中で、好ましい核初期化物質の例としては、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28及びSV40 Large Tから選択される、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が挙げられ得る。
【００２４】
得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4, Sox2及びKlf4の3因子 [上記の組み合わせ(9)]が好ましく使用される。得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2及びLin28の5因子か、5因子及びNanogからなる6因子 [上記の組み合わせ(12)]が好ましい。これらの好ましい組み合わせにおいて、c-Mycの代わりにL-Mycを使用することもできる。
【００２５】
上記のタンパク質性因子のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができる（Nanogは当該公報中ではECAT4として記載されている）。尚、Lin28、Lin28b、Esrrb及びEsrrgdのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ以下のNCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
遺伝子の名前 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
【００２６】
核初期化物質としてタンパク質性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、培養細胞又はその馴化培地から組換えタンパク質性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク質性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
【００２７】
核初期化物質（単数又は複数）の体細胞への接触は、該物質がタンパク質性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）−又は細胞透過ペプチド（CPP）−融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Genlantis）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）、PULSinTM delivery reagent（Polyplus-transfection）及びProVectin（IMGENEX）；脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）;膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質（単数又は複数）を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて、混合物を室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した後に細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。タンパク質導入試薬を使用する具体的な手段は、WO 2009/073523又はWO 2009/032456に開示されている。
【００２８】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT (Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93 (1988)又はGreen, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynB1 (Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、及びHSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPは、11R (Cell Stem Cell, 4,381-384 (2009))及び9R (Cell Stem Cell, 4, 472-476 (2009))などのポリアルギニンを含む。核初期化物質のcDNAとPTD又はCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。CPPを使用する具体的な手段は、Cell Stem Cell, 4:472-6 (2009)又はCell Stem Cell, 4:381-4 (2009)に開示されている。
【００２９】
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
【００３０】
核初期化遺伝子の持続的な過剰発現は、潜在的に発癌のリスクを増大させるが、タンパク質性初期化因子は、導入した細胞のプロテアーゼによって分解がおこり、次第に消失するため、タンパク質性因子の使用は、得られたiPS細胞が治療目的のために利用される場合のような、高度な安全性が必要とされる場合に、適切であり得る。
【００３１】
しかし、体細胞への導入の容易さを考慮すると、核初期化物質は、タンパク質性因子自体としてよりも、好ましくは、それをコードする核酸の形態で用いられてもよい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
【００３２】
核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びセンダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターの例としては、EF-αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF-αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
【００３４】
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。有用な選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３５】
核初期化物質として2以上の核酸を細胞に導入する場合、核酸を別個のベクターに担持させてよく、複数の核酸をタンデムに連結されてポリシストロニックなベクターを得てもよい。後者の場合、効率的なポリシストロニックな発現を可能にするために、口蹄疫ウイルスの2A自己開裂ペプチド（Science, 322, 949-953, 2008などを参照)、IRES配列など、好ましくは2A配列を個々の核酸の間にライゲーションすることが望ましい。
【００３６】
核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や補完細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、レトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、レンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。また、アデノウイルスベクターを用いる場合については、Science, 322, 945-949 (2008) に開示されている。
【００３７】
上記に議論するように、iPS細胞が治療目的に利用される場合、核初期化遺伝子の持続的な過剰発現は、iPS細胞から分化した組織及び器官における発癌のリスクを増大させる可能性があるので、核初期化物質としての核酸は、細胞の染色体中に組み込まれずに、一過的に発現することが好ましい。この観点から見ると、染色体への組み込みがまれにしかおこらないアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段はScience, 322, 945-949 (2008)に開示されている。アデノ随伴ウイルスベクターもまた、染色体への組み込み頻度が低く、細胞毒性及び炎症誘発性についてはアデノウイルスベクターよりも低いことから、別の好ましいベクターと言うことができる。センダイウイルスベクターは、染色体外に安定に存在していることができて、必要に応じてsiRNAを使用して分解除去することが可能であることから、同様に好ましく利用される。センダイウイルスベクターに関しては、J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007)及びJP-3602058 Bに記載されているものが使用され得る。
【００３８】
レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを使用する場合、たとえ導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、再活性化される可能性があるので、例えば、不要になった時点で、核初期化物質である核酸をCre-loxPシステムを使用して切り出す方法が、好ましくは使用され得る。つまり、あらかじめ核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後、プラスミドベクター又はアデノウイルスベクターを使用してCreリコンビナーゼを細胞に作用させて、loxP配列ではさまれている領域を切り出すことができる。LTR U3領域のエンハンサー−プロモーター配列は、挿入変異によって、それに近接する宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、欠失させるか、SV40などのポリアデニル化配列に置換して調製した3’自己不活性化型(SIN) LTRを使用して、切り出されずにゲノム中に残存しているloxP配列の外側のLTRによる内在性遺伝子の発現制御を避けることがより好ましい。Cre-loxPシステム及びSIN LTRを使用する具体的手段は、Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009)に開示されている。
【００３９】
一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いてプラスミドベクターを細胞に導入することができる。プラスミドベクターを使用する場合にも、染色体への組み込みはまれであり、導入遺伝子は細胞内にてDNaseにより分解されて除去される。それゆえ、iPS細胞を治療目的に使用する場合には、プラスミドベクターの使用は、別の好ましい実施態様であり得る。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。
【００４０】
別の好ましい非組み込み型ベクターは、エピソーマルベクターであり、これは染色体外にて自己複製可能である。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Science, 324, 797-801(2009)に開示されている。
【００４１】
アデノウイルス又はプラスミドを使用する場合にも、導入遺伝子は染色体に組み込まれ得るので、最終的には、サザンブロッティング又はPCRによって染色体中に遺伝子の挿入がないことを確定する必要がある。この理由から、上記のCre-loxPシステムと同様に、導入遺伝子が染色体に組み込まれた後で該遺伝子を除去するという手段を使用することは、有利であり得る。別の好ましい実施態様において、導入遺伝子をトランスポゾンを使用して染色体に組み込んだ後、プラスミドベクター又はアデノウイルスベクターを使用してトランスポゼースを細胞に作用させて、導入遺伝子を染色体から完全に除去するという方法が使用され得る。好ましいトランスポゾンの例としては、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBacなどが挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009)に開示されている。別の実施態様において、プロモーター領域のテトラサイクリン反応性エレメント(Tet-OnR & Tet-Off R Gene Expression Systems, Clontech)が、導入遺伝子の除去のために使用され得る。
【００４２】
アデノウイルス又は非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入するための操作を繰り返す回数は、特に限定されず、導入は１回以上の任意に選択した回数（例えば、1回から10回、1回から5回など)にて行われ得る。2種以上のアデノウイルス又は非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類のアデノウイルス又は非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合でも、導入は１回以上の任意に選択した回数（例えば、1回から10回、1回から5回など)にて行われ得、好ましくは、導入は2回以上(例えば、3回又は4回)繰り返して行われ得る。
【００４３】
核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への接触は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスなどの哺乳動物より単離した体細胞の培養に適した培地 [例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地、及びそれらの組み合わせなど] 中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
【００４４】
(d) iPS細胞の樹立効率改善物質
従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
【００４５】
iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例えば、HDAC1 siRNA SmartpoolO (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5’-azacytidine）[Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)等の低分子阻害剤］、G9aに対するsiRNAおよびshRNA [例えば、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等]等の核酸性発現阻害剤など、L-channel calcium agonist (例えば、Bayk8644) [Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)]、p53阻害剤 [例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1 [Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)]、Wnt シグナル誘導物質（例えばsoluble Wnt3a）[Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)]、2i/LIF [2iはmitogen-activated protein kinase signalingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008)]等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
【００４６】
前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須ではない補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質（単数又は複数）およびiPS細胞の樹立効率改善物質（単数又は複数）の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
【００４７】
iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク質性因子である場合、(b) 該タンパク質性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である3つの場合に応じてそれぞれ上記したように、実施することができる。
【００４８】
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク質性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク質性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターや非ウイルスベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
【００４９】
マウスまたはヒトなどの哺乳動物から分離した体細胞は、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地及びそれらの組み合わせなどが挙げられるが、それらに限定されない。5％以下の低血清濃度にて前培養を行うと、iPS細胞の樹立効率が改善されるという報告がある（例えば、WO 2009/006997）。核初期化物質（単数又は複数）及びiPS細胞の樹立効率改善物質（単数又は複数）と細胞との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、あらかじめ無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化物質（単数又は複数）（及びiPS細胞の樹立効率改善物質（単数又は複数））を細胞に接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞[McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)]等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
【００５０】
iPS細胞の候補コロニーは、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法及び目視による形態観察による方法によっても選択され得る。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF [Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)]、Nanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF [Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)]等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3/4、Klf4及びSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
【００５１】
選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4、Fbx15）レポーターに対する陽性反応(GFP陽性、β-ガラクトシダーゼ陽性など)、及び選択マーカーに対する陽性反応(ピューロマイシン耐性、G418耐性など)、並びに目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
【００５２】
このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。また、患者本人でなくても、患者とHLAの型が同一であるか実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導し、そこから所望の細胞へ分化させ、これを患者への移植に用いることもできる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
【００５３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【００５４】
実施例１：iPS細胞樹立に対する低酸素培養法の効果(1)
実験系としてNanogレポーターを持つマウスを使用した。NanogレポーターはBACPAC Resourcesより購入したBAC(bacterial artificial chromosome)のNanog遺伝子座に緑色蛍光蛋白質(EGFP)とピューロマイシン耐性遺伝子がくみこまれたもの [Okita K. et al., Nature 448, 313-317(2007)]を使用した。マウスNanog遺伝子はES細胞や初期胚といった分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。また、このレポーターが陽性となったマウスiPS細胞はES細胞とほぼ同等の分化能力を持つことがわかっている。このNanogレポーターを有するNanogレポーターマウス [Okita K. et al., Nature 448, 313-317(2007)]から得られたマウス胎仔線維芽細胞(MEF)および尾部線維芽細胞(TTF)に対して、レトロウィルスにより遺伝子導入を行うことでiPS細胞を樹立し、NanogレポーターによりEGFPが発現しているコロニー数を計測することによりiPS細胞樹立効率を評価した。
【００５５】
初期化に使用するレトロウイルスは、前日に100mm培養ディッシュ(Falcon)の１枚当り2 x 106で播種したPlat-E細胞 (Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066）にレトロウイルス発現ベクター [pMXs-Oct3/4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4, pMXs-cMyc：Cell, 126, 663-676 (2006)]を個々に導入して作製した。培養液はDMEM/10% FCS [DMEM (Nacalai tesque)にウシ胎仔血清を10%加えたもの]を使用し、37℃、5%CO2で培養した。ベクターの導入のためにFuGene6 transfection reagent (Roche) 27μLをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 300μLに入れ、室温で5分間静置した。その後、各発現ベクターを9 μg加え、さらに室温で15分静置してからPlat-Eの培養液に加えた。2日目にPlat-Eの培養上清を新しい培地に換え、3日目に培養上清を回収して0.45μm sterile filter (Whatman)で濾過し、polybrene (Nacalai Tesque)を濃度4μg/mLとなるように加えてウイルス液とした。
【００５６】
マウス胎仔線維芽細胞(MEF)はNanogレポーターマウスの受精後13.5日の胎仔から単離し、培地（DMEM/10% FCS）にて培養した。また尾部線維芽細胞(TTF)はNanogレポーターマウスの尾部を細切しゼラチンコート6ウェルデッシュ上に静置し初代細胞スターティング培地(東洋紡ライフサイエンス事業部)にて5日間培養を行い、尾部組織からディッシュ上に遊走してくる線維芽細胞を、さらに培地DMEM/10% FCSにて培養することにより得られたものを使用した。
【００５７】
MEFおよびTTFはNanog遺伝子を発現しないため、EGFPを発現せず、緑色蛍光を示さない。また、ピューロマイシン耐性遺伝子も発現しないため、抗生物質であるピューロマイシンに感受性である。このMEFおよびTTFを0.1%ゼラチン(Sigma)でコートした6ウェル培養プレート(Falcon)に１ウェル当り1 x 105細胞で播種した。培養液はDMEM/10% FCSを使用し、37℃、5%CO2で培養した。翌日、各レトロウイルス液を加え、一晩感染させて遺伝子を導入した。
【００５８】
ウイルス感染後3日目からはLIFを加えたES細胞用培地 [DMEM (Nacarai tesque)に15%ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミン(Invitrogen)、100 μM 非必須アミノ酸(Invitrogen)、100μM 2−メルカプトエタノール(Invitrogen)、50 U/mL ペニシリン(Invitrogen)と50 mg/mL ストレプトマイシン(Invitrogen)を加えたもの]を用いて培養した。感染後4日目にMEFおよびTTFの培地を除き、PBS 1 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/ 1 mM EDTA (Invitrogen)を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらES細胞用培地を加えて懸濁し、（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの4因子を導入した場合は）1 x 104個のMEF細胞を、また（Oct3/4, Sox2, Klf4の3因子を導入した場合は）1 x 105個のMEF細胞を、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100 mmディッシュに播いた。またTTFにおいては、前記4因子を導入した場合は）2 x 104個のTTF細胞を、（前記3因子を導入した場合は）1 x 105個のTTF細胞を、また（Oct3/4, Klf4, c-Mycの3因子を導入した場合は）1.5 x 105個のTTF細胞を同様に播いた。なおフィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞 [McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)]を用いた。以後コロニーが観察できるようになるまで2日ごとにES細胞用培地の交換を行った。
【００５９】
感染後5日目より14日目まで、正常酸素濃度(20%)又は低酸素濃度(5%、1%)に設定したインキュベーター（Thermo scientific）において細胞を培養した。4因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を感染させた細胞は14日目から、3因子(Oct3/4, Sox2, Klf4またはOct3/4, Klf4, c-Myc)を感染させた細胞は21日目からピューロマイシン (1.5 μg/mL)で選択を行った。コロニーは4因子では10日目、3因子では20日目ごろから見え始め、徐々にGFP陽性となった。
【００６０】
感染後21日目および28日目にGFP陽性コロニーを数え、正常酸素濃度(20%)および低酸素濃度下(5%、1%)において培養した細胞の比較を行った。MEFの結果を表1に、またTTFの結果を表2および3に示す。これらの結果から低酸素条件下での細胞培養によりiPS細胞の樹立効率が上昇することが明らかとなった。特に酸素濃度5％の場合に良好な結果が得られた（表1-3）。また3因子導入の場合、Oct3/4, Sox2, Klf4のみならずOct3/4, Klf4, c-Mycであっても、iPS細胞が樹立できることが明らかとなった（表2）。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
まとめると、5％酸素下にて、4因子を導入したMEF由来のGFP陽性コロニー数は、正常酸素条件下のものよりも、21日目に7.4倍、28日目に3.1倍に増加し、3因子を導入したMEF由来のGFP陽性コロニー数は同様に、5％酸素下にて21日目に20倍、28日目に7.6倍に増加した(図14 a), b), c)及びd))。さらに、低酸素処理をすると、4因子又は3因子を導入したMEFの全コロニー中のGFP陽性コロニーの割合が増加した(図14 e) 及びf))。低酸素処理後に由来するGFP陽性コロニーは、正常酸素条件に由来するGFP陽性コロニーと、形態及び大きさにおいて遜色がなかった(図16)。アルカリホスファターゼ染色により、5％酸素下での培養は、アルカリホスファターゼ活性に陽性のコロニー数を増加させることが示された(図17)。
【００６５】
GFP陽性コロニーがより早期に検出されるか否かを調べるために、4因子を導入したMEFを20％酸素下又は5％酸素下にて、2mM バルプロ酸 (VPA)あり又はなしにて、導入後5日目から9日目まで培養し、9日目にフローサイトメトリー解析を行った。4因子をレトロウイルス発現すると、0.01％の細胞が導入後9日目にGFP陽性となった。4因子を導入したMEFを、低酸素又はVPAとともに4日間処理すると、GFP陽性細胞の割合は、それぞれ0.40％及び0.48％にまで増加した。さらに、低酸素とVPAとで同時に処理すると、GFP陽性細胞の割合が2.28％に増加した。これらのデータは、GFP陽性細胞がより早期に検出可能であり、低酸素培養は、VPAと相乗効果を有することを示唆している(図15 a), b), c), d)及び e))。
【００６６】
次に、成人皮膚由来線維芽細胞（HDF）を用いて低酸素培養の効果を検討した。Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、全てヒト由来の4因子(OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC) または3因子 (OCT3/4, SOX2, KLF4) をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から6日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞[McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)]を用いた。翌日から霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。
【００６７】
感染後7日目よりコロニーをカウントするまで（感染後24日目及び32日目）、正常酸素濃度（20%）又は低酸素濃度（5%、1%）に設定したインキュベーター中で細胞を培養した。結果を表4に示す。4因子を導入した場合、正常酸素濃度に比べて、酸素濃度5%の場合に、iPS細胞の樹立効率が上昇した。一方、酸素濃度1%の場合や3因子を導入した場合、今回実施したような、細胞を長期低酸素状態で維持する培養条件ではiPS細胞が得られなかった。このことから、酸素濃度1%といったよりシビアな低酸素状態を用いる場合や、もともと4因子に比べて樹立効率が低い3因子導入の場合には、低酸素条件下での培養期間をより短く設定する必要性が示唆された。
【００６８】
【表４】
【００６９】
実施例2：iPS細胞樹立に対する低酸素培養法の効果(2)
Oct3/4とKlf4の2遺伝子導入のみでも低酸素培養法の効果が得られるかどうかを検討するための実験を行った。実験は、実施例1と同じNanogレポーターマウス由来のMEFを用いた。実施例1と同様にしてレトロウイルス発現ベクター（pMXs-Oct3/4, pMXs-Klf4）をMEFに感染させた。感染後4日目に、１x105個のMEFを、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100mmディッシュに播いた。以後2日ごとにES細胞用培地の交換を行った。
【００７０】
感染後5日目より14日目まで、細胞を、正常酸素濃度（20％）又は低酸素濃度（5％）に設定したインキュベーター（Thermo scientific）において培養した。薬剤選択は行わずに培養を続け、28日目にGFP陽性コロニーの数を数えた。結果を図１に示す。独立した4回の実験を行った。酸素濃度20％の場合は4回中1回しかコロニーが生じなかったが、5％の場合は4回の実験全てにおいてコロニーが生じた。図１に示したように、酸素濃度5％での培養により、20％の場合と比べてGFP陽性コロニー数が有意に増加しており（*p<0.05）、低酸素培養によるiPS細胞の樹立効率上昇効果が認められた。
【００７１】
さらに、Oct3/4とc-Mycの2遺伝子導入についても低酸素培養法の効果が得られるかどうかを決定するために、さらなる実験を行った。実験は、前記Oct3/4およびKlf4の場合と同様の手法で、Nanog-MEFを用いて行った。感染後5日目より14日目まで、細胞を、正常酸素濃度（20％）および低酸素濃度（5％）に設定したインキュベーター（Thermo scientific）において培養した。薬剤選択は行わずに培養を続け、42日目GFP陽性コロニーを観察した。その結果、正常酸素濃度（20％）で培養した場合はGFP陽性コロニーが生じなかったのに対して、低酸素濃度（5％）で培養することにより、コロニーが出現した（図2）。以上により、Oct3/4およびc-Mycの2遺伝子導入においても、低酸素条件下で培養することによりiPS細胞の樹立効率を改善できることが明らかとなった。
【００７２】
実施例3：マウスiPS細胞における未分化マーカーの発現
実施例1及び2で樹立したMEF由来のiPS細胞における未分化マーカーの発現を、Rever Tra Ace kit（Takara）を使用してRT-PCR解析を行うことにより調べた。使用した各プライマーの配列を配列番号：1〜18に示す。またRT-PCRの結果を図３に示す。4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）、3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）、または2遺伝子（Oct3/4, Klf4）を導入し、低酸素濃度下（5％、1％）で培養して樹立したiPS細胞は、いずれも、ES細胞特異的発現遺伝子であるOct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Rex1、ECAT1を発現しており、その発現量はマウスES細胞（RF8）や過去に4遺伝子で樹立したiPS細胞 [20D17: Nature, 448, 313-317 (2007)]と同等であることが示された。また、導入したOct3/4遺伝子（Oct3/4（Tg))の発現は認められなかったことから、サイレンシングが起こっていることが示された。以上の結果より、低酸素条件下で樹立した細胞はiPS細胞であることが確認された。
【００７３】
実施例4：樹立されたiPS細胞のテラトーマ形成能
低酸素濃度下（5％）、Oct3/4およびKlf4で樹立したマウスiPS細胞 (527CH5-2)を用いて、Cell, 126, 663-676 (2006) に記載の方法に従ってテラトーマを形成させた。具体的には1×106個のiPS細胞を免疫不全マウスの皮下に注射し、4週間後に出現したテラトーマを単離した（図4上）。各テラトーマを切り刻んで4％フォルムアルデヒドを含有するPBS(-)で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。結果を図4下に示す。組織学的に見ると、腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、軟骨組織、内胚葉性上皮組織、筋肉組織、角化上皮組織が認められたことから、iPS細胞の多能性が証明された。
【００７４】
実施例5：キメラマウスの作製
実施例1および2において、低酸素濃度下（5％）、2遺伝子、3遺伝子または4遺伝子導入により樹立したiPS細胞をICRマウス由来の胚盤胞にマイクロインジェクションした結果、アダルトキメラを作出した。結果を図5に示す。
【００７５】
実施例6：iPS細胞株の核型
iPS細胞株の核型は実施例１及び２における低酸素処理(521AH5-1及び527CH5-1)後のものであり、これらの細胞株は正常な核型を示した(図18)。
【００７６】
実施例7：低酸素での培養期間がヒトiPS細胞の樹立に及ぼす影響
低酸素条件下(5％)での細胞培養時期および細胞培養期間がヒトiPS細胞の樹立効率に及ぼす影響について検討した。体細胞として成人皮膚由来線維芽細胞（adult HDF）を用いた。低酸素培養のタイムスケジュールを図6に示す。まず、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルスを用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子をHDFに発現させた。これらの細胞(8×105個)に対して、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、全てヒト由来の4因子 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) または3因子 (Oct3/4, Sox2, Klf4) をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から6日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った （4遺伝子導入の場合は1 x 105 個、3遺伝子導入の場合は5 x 105個/100 mmディッシュ）。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞 [McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)]を用いた。翌日から霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。
【００７７】
細胞培養は、6つの条件下：(1)正常酸素濃度(20％)で感染後40日目までの間、または低酸素濃度(5％)で：(2)感染後7日目から1週間、(3)感染後7日目から1.5週間、(4)感染後7日目から2週間、(5)感染後7日目から3週間培養後、正常酸素濃度(20％)で感染後40日目までの間、並びに(6)低酸素濃度(5％)で感染後7日目から感染後40日目までの間、のいずれかで行った。感染翌日からフィーダー細胞上への蒔き直しまでの間、細胞を低酸素濃度（5％）で前培養した後、前記(1)〜(6)のいずれかの条件でさらに培養して得られた結果も検討した。感染から24日目、32日目および40日目に出現したiPSコロニー数をカウントした。これら3回のカウントの結果をまとめて図7に示す。
【００７８】
4遺伝子導入においては、前記(2)〜(6)のいずれの低酸素濃度条件下で培養した場合も、正常酸素濃度（20％）で培養した場合に比べてiPS細胞の樹立効率が上昇していた。さらに、低酸素濃度下での前培養を加えた場合も、iPS細胞の樹立効率上昇効果が認められた。4遺伝子導入における感染後40日目のコロニー像を、図8に示した。
【００７９】
3遺伝子導入においては、低酸素濃度下で前培養を行うことにより、正常酸素濃度で培養した場合に比べ多くのiPS細胞を樹立した（図７）。
【００８０】
4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し、前記（1）、（2）、（4）、（5）および（6）の条件下で、独立した3回の実験を行った。結果をまとめて図9に示す。正常酸素濃度（20％）の場合に比べて低酸素濃度（5％）で培養することにより、いずれの場合もiPS細胞の樹立効率が上昇した。特に、感染後7日目から2週間以上の期間、低酸素濃度下で培養することにより、顕著な効果が得られた。
【００８１】
実施例8：ヒトiPS細胞の未分化マーカーの発現
実施例7で樹立した成人HDF由来のiPS細胞における未分化マーカーの発現を、Rever Tra Ace kit（Takara）を使用してRT-PCR解析を行うことにより調べた。使用した各プライマーの配列を配列番号：19〜36に、またRT-PCRの結果を図10に示す。4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）または3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）を導入し、低酸素濃度下（5％）で培養して樹立したiPS細胞は、いずれも、ES細胞特異的発現遺伝子であるOct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Rex1、GDF3およびESG1を発現しており、その発現量は、過去に4遺伝子で樹立したiPS細胞 [201B2: Cell, 131, 861-872 (2007)]と同等であることが示された。以上の結果より、低酸素濃度下で樹立した細胞はiPS細胞であることが確認された。
【００８２】
さらに、これらのiPS細胞は、アルカリホスファターゼが強く陽性であり、免疫細胞学的染色により、全てのiPS細胞がNanog、SSEA3及びSSEA4を発現していることが示された（図11）。
【００８３】
実施例9：in vitro分化誘導
Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Mycの4遺伝子を導入し、5％酸素濃度下で感染後7日目から40日目まで培養して樹立したヒトiPS細胞（70AH5-2、70AH5-6）をlow-binding dishに播き、Cell, 131, 861-872 (2007)に記載のように8日間培養し、胚様体(embryoid body：EB)を形成させた（100mmディッシュ）。胚様体を8日間培養後、内胚葉系細胞の分化マーカーであるα-fetoprotein (R&D systems)、中胚葉系細胞の分化マーカーであるsmooth muscle actin (DAKO)、Desmin (NeoMarkers)、Vimentin （Santa Cruz）、外胚葉系の分化マーカーであるβIII-tubulin (Chemicon)、GFAP (DAKO)の各抗体を用いた染色を行った。結果を図12に示す。染色によりそれらの発現が確認され、樹立されたヒトiPS細胞は三胚葉系への分化能を有することが確認された。
【００８４】
実施例10：樹立されたiPS細胞のテラトーマ形成能
4遺伝子導入、5％酸素濃度下での培養により樹立したヒトiPS細胞（70AH5-2）を用いてテラトーマ形成能を調べた。ヒトiPS細胞（70AH5-2）を、リコンビナントヒトbFGF(4ng/ml)およびRhoキナーゼ阻害剤Y-27632(10μM)を含有する霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL)中で培養した。1時間後、collagen IVで処理して細胞を採取後、遠心・回収し、Y-27632（10μM）を含有するDMEM/F12中に浮遊させた。コンフルエントになった細胞(100mmディッシュ)の1/4量をSCIDマウスの精巣内に注射した。9週間後、腫瘍を切り刻んで4％フォルムアルデヒドを含有するPBS(-)で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。結果を図13に示す。組織学的に見ると腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、神経上皮組織、網膜上皮組織、骨様組織、平滑筋組織、及び内胚葉性上皮組織が認められたことから、iPS細胞の多能性が証明された。
【００８５】
実施例11：増殖、生存及び遺伝子発現に対する低酸素培養の効果
annexin Vを使用したフローサイトメトリー解析により、低酸素培養は、マウスES細胞又は4因子を導入したMEFに対して保護作用を有さないことが確認された（図19）。さらに、低酸素培養は、マウスES細胞の増殖に対して効果を示さなかった（図20 a))。導入後1日目から4日目まで低酸素でインキュベーションしても、mockを導入したMEFの増殖に対しては有意な効果を有さなかったが、4因子を導入したMEFに対しては有意な効果を有していた（図20 b)）。初期化プロセスにおける細胞の発現プロファイルを調べるために、マイクロアレイ解析及び定量的リアルタイムRT-PCRを行った。1日目から4日目まで低酸素及び正常酸素条件下にて培養した、4因子を導入したMEFのマイクロアレイ解析により、低酸素で処理した細胞では、ES細胞特異的遺伝子のうち73.2％（全1045遺伝子のうち765遺伝子）が上方制御されており、MEF特異的遺伝子のうち85.8％（全1142遺伝子のうち980遺伝子)が下方制御されていることが示された（図21 a)及びb))。さらに、定量的リアルタイムRT-PCR解析により、3日間低酸素処理すると、4因子を導入したMEFにおいて、内在性のOct3/4及びNanogの発現がそれぞれ、3.4倍及び2.1倍増加していることが確認された（図22 a)及びb))。
【００８６】
低酸素がSTO細胞を刺激することによってiPS細胞の生成を増強している可能性を除外するために、STO細胞のフィーダー層なしで低酸素培養条件下にて、iPS細胞の増殖状況について調べた。図23は、5％酸素下での培養が、GFP陽性コロニーの数を増加させることを示しており、低酸素による初期化の増強は、STO細胞を介しているのではないことが示唆された。
【００８７】
実施例12：低酸素培養下における、発現プラスミド（olasmid）ベクターの一時的な導入によるiPS細胞の樹立
プラスミド導入によるiPS細胞の作製を、先に記載されているように行った（Okita, K, et al. Science 322, 949-953, (2008))。簡潔には、Nanog-GFP-IRES-Purorレポーターを有するMEFを、6ウェルプレートに、1.0x105細胞/ウェルになるように蒔いた (0日目)。1、3、5及び7日目に、細胞をpCX-OKS-2A及びpCX-c-Mycで形質導入し、9日目に、細胞をトリプシンで回収して、STOフィーダー細胞を蒔いておいた100mmディッシュに蒔き直した。25日目に、GFP陽性コロニーの数を数えた。低酸素処理のために、細胞を10日目から24日目まで、5％酸素下にて培養した。
【００８８】
表5は、低酸素培養が、GFP陽性コロニーの数を2.0倍増加させることを示している。
【００８９】
【表５】
【００９０】
実施例13：低酸素培養下における、piggyback導入システムによるiPS細胞の樹立
いくつかの改変を加えて、先に記載されているように、piggyback (PB)転位による直接的な初期化を行った (Woltjen et al., Nature; 458:766-70, (2009))。簡潔には、Nanog-GFP-IRES-Purorレポーターを有するMEFを、6ウェルプレートに、1.0x105細胞/ウェルになるように蒔いた。24時間後、Fugene HD (Roche, Switzerland)を使用して、PB-TET-MKOS、PB-CA-rtTA Adv、及びPBトランスポゼース発現ベクターで細胞を形質導入した。24時間後、培地をドキシサイクリンを含む培地(1.5ug/ml)で置換した(0日目)。細胞を低酸素又は正常酸素条件下にて培養し、GFP陽性コロニーの数を12日目にカウントした。PB-TET-MKOS及びPB-CA-rtTA advは、Addgeneから得た(Addgeneプラスミド20910及び20959)。PBトランスポゼース構築物は、pBSII-IFP2-orf (Dr. Malcolm J. Fraser, Jr, University of Notre Dameから頂いた)からPCRで増幅し、CAGプロモーターで発現させる発現ベクター(pCX-EGFP)に挿入した。
【００９１】
図24は、5日及び10日間低酸素処理すると、GFP陽性コロニーの数が、それぞれ2.9倍及び4.0倍に増加することを示している。これらのデータは、低酸素が、piggybac転位システムなどの非ウイルスベクターによるiPS生成効率を増加させ得ることを示唆している。
【００９２】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の要旨および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
【００９３】
さらに、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００９４】
本出願は、米国仮出願番号61/084,842、61/141,177、及び61/203,931を基礎としており、その内容は、引用によって本明細書に組み込まれている。
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、人工多能性幹（以下、iPSという）細胞の樹立効率の改善方法に関する。より詳細には、本発明は、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、iPS細胞の樹立効率の改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
近年、マウスおよびヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。Yamanakaらは、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した（1, 2）。Okitaら（3）は、Fbx15よりも多能性細胞に発現が限局しているNanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来の線維芽細胞で上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾プロファイルが胚性幹（ES）細胞とほぼ同等のiPS細胞（Nanog iPS細胞）を樹立することに成功した。同様の結果が他のグループによっても再現された（4, 5）。その後、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることが明らかとなった（6）。
【０００３】
さらに、Yamanakaらは、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した（1, 7）。一方、Thomsonらのグループは、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した（8, 9）。また、Parkら（10）は、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの4因子に加えて、ヒト細胞不死化遺伝子として知られるTERTとSV40ラージT抗原を用いて、ヒトiPS細胞を作製した。このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。
【０００４】
しかし、iPS細胞の樹立効率は1%以下と低く、特に、iPS細胞から分化した組織や個体において腫瘍化が懸念されるc-Mycを除く3因子（Oct3/4, Sox2, Klf4）を体細胞に導入してiPS細胞を作製した場合、その樹立効率が極めて低いという問題点がある。
【０００５】
ところで、細胞の未分化状態や多能性の維持と低酸素条件との関連性に関する報告が幾つかなされている。Ezashiら（11）は、ヒトのES（hES）細胞を低酸素条件下で培養したところ、分化が抑制されたことから、hES細胞の十分な多能性維持のためには、低酸素条件での培養が必要であることを示唆している。Covelloら（12）は、低酸素条件下で初期に誘導される転写調節因子（HIF-2α）は、Oct3/4の発現を誘導し、幹細胞の機能や分化を調節し得ることを示している。さらにGraysonら（13,14）は、低酸素条件がヒト間葉系幹細胞（hMSC)の未分化状態や多能性の維持に関与することを示している。しかしながら、いったん分化が進んだ体細胞における核初期化プロセスと低酸素状態との間の関連性については、何ら報告されていない。
【０００６】
引用文献：
1. WO 2007/069666 A1
2. Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
3. Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)
4. Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007)
5. Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007)
6. Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)
7. Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
8. WO 2008/118820 A2
9. Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
10. Park, I.H. et al., Nature, 451: 141-146 (2008)
11. Ezashi, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 4783-4788 (2005)
12. Covello, K.L. et al., Genes & Dev., 20: 557-570 (2006)
13. Grayson, W.L. et al., J. Cell. Physiol., 207: 331-339 (2006)
14. Grayson, W.L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 358: 948-953 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要約
本発明の目的は、iPS細胞の樹立効率を改善する手段を提供することであり、それを用いた効率的なiPS細胞の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、iPS細胞の樹立効率を格段に向上させることに成功して、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りのものである：
[1] iPS細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、方法。
[2] 雰囲気中の酸素濃度が1-10%の範囲内である、上記[1]記載の方法。
[3] 雰囲気中の酸素濃度が1-5%の範囲内である、上記[2]記載の方法。
[4] 核初期化物質が、以下の物質、あるいはそれらをコードする核酸である、上記[1]-[3]のいずれかに記載の方法；
(i) Oct3/4及びKlf4、又は
(ii) Oct3/4及びc-Myc、又は
(iii) Oct3/4、Klf4及びSox2、又は
(iv) Oct3/4、Klf4及びc-Myc、又は
(v) Oct3/4、Klf4、Sox2及びc-Myc。
[5]核初期化工程において効率改善物質としてバルプロ酸が使用されるさらなる工程を含む、上記[1]-[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 低酸素条件下における体細胞の培養が、核初期化物質を接触させた後3日以上行われる、上記[1]-[5]のいずれかに記載の方法。
【００１０】
核初期化工程における低酸素状態はiPS細胞の樹立効率を顕著に増大させることができるので、従来きわめて樹立効率の低かったc-MycもしくはSox2を除く3因子によるiPS細胞誘導に特に有用である。また2因子（例えばOct3/4とKlf4；Oct3/4とc-Myc）によるiPS細胞誘導にも有用である。とりわけc-Mycは再活性化による腫瘍発生が危惧されることから、2もしくは3因子によるiPS細胞樹立効率の改善を実現したことは、iPS細胞の再生医療への応用において極めて有用である。また、かかる低酸素状態は、酸素濃度を調節可能な汎用のCO2インキュベーターを用いて極めて容易に創出することができるので、煩雑な工程や熟練の技術等を要することなく、効率的なiPS細胞の作製が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、Oct3/4およびKlf4の2遺伝子をMEFに導入して樹立したiPSコロニー（GFP陽性コロニー）の数を、正常酸素濃度（20％）および低酸素濃度（5％）で比較したグラフである（*p<0.05）。
【図２】図2は、Oct3/4およびc-Mycの2遺伝子をMEFに導入して樹立したiPSコロニー（GFP陽性コロニー）のコロニー像を示す[a)位相差像；b)GFP陽性コロニー像]。
【図３】図3は、低酸素濃度下で樹立したiPS細胞由来のRNAを用いて、RT-PCRを行った結果を示した写真である。未分化マーカーであるOct3/4(end)、Sox2(end)、Klf4(end)、c-Myc(end)、Nanog、Rex1、ECAT1の発現、および導入した外来性Oct3/4(Tg)の発現を調べた。各レーンのサンプルは以下のとおりである：・521AH5-1および535AH5-2：4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し；細胞を酸素濃度5％にて培養した。・535AH1-1：4遺伝子を導入し；細胞を酸素濃度1％にて培養した。・535BH5-1および521BH5-3：3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）を導入し；細胞を酸素濃度5％にて培養した。・527CH5-1、527CH5-2および547CH5-1：2遺伝子（Oct3/4, Klf4）を導入し；細胞を酸素濃度5％にて培養した。・RF8：コントロールのES細胞。・20D17：コントロールのNanog-iPS細胞[Nature,448,313-317(2007)]。各パネル右側の数字はPCRのサイクル数を指す。
【図４】図4上は、低酸素濃度下（5％）、Oct3/4およびKlf4で樹立したマウスiPS細胞(527CH5-2)を免疫不全マウスの皮下に注射し、形成させたテラトーマの写真である。また図4下は、得られたテラトーマの組織染色像（ヘマトキシリン・エオシン染色）である[a)：軟骨組織、b)：内胚葉性上皮組織、c)：筋肉組織、d)：角化上皮組織]。
【図５】図5は、低酸素濃度下（5％）、2遺伝子、3遺伝子または4遺伝子導入により樹立したiPS細胞をICRマウス由来の胚盤胞にマイクロインジェクションすることにより作出したアダルトキメラの、生後2週間目の写真である。a)：4遺伝子導入で樹立したiPS細胞（521AH5-1）由来のキメラマウス（オス）。b)：3遺伝子導入で樹立したiPS細胞（535BH5-1）由来のキメラマウス（オス）。c)：3遺伝子導入で樹立したiPS細胞（535BH5-1）由来のキメラマウス（メス）。d)：2遺伝子導入で樹立したiPS細胞（527CH5-1）由来のキメラマウス（オス）。e)：2遺伝子導入で樹立したiPS細胞（527CH5-2）由来のキメラマウス（オス）。
【図６】図6は、実施例7のタイムスケジュールを示した図である。
【図７】図7は、実施例7の種々の培養条件で樹立したiPSコロニー数を示すグラフである。「Pre」は低酸素条件下での前培養有りの結果を示す。「4F」、「3F」および「Mock」はそれぞれ、4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）導入、3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）導入および空ベクター導入の結果を示す。
【図８】図8は、実施例7で4遺伝子導入した場合における、感染後40日目のiPSコロニーの形態を示した写真である。上段、下段はそれぞれ、低酸素条件下での前培養なし、低酸素条件下での前培養ありの場合のコロニー像を示す。
【図９】図9は、4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し、5％酸素濃度下で、感染後7日目から1週間、2週間、3週間、または感染後40日目まで培養を行い、得られたiPSコロニーの数を、正常酸素濃度（20％）と比較した結果を示すグラフである。3回の独立した実験結果をまとめて示す。
【図１０】図10は、低酸素濃度下で樹立したiPS細胞由来のRNAを用いて、RT-PCRを行った結果を示した写真である。未分化マーカーであるOct3/4(end)、Sox2(end)、Klf4(end)、c-Myc(end)、Nanog、Rex1、GDF1、ESG1の発現を調べた。各レーンのサンプルは以下のとおりである：・96AH5-2および96AH5-3：4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し；細胞を、酸素濃度5％で感染後7日目から40日目まで培養した。・96AH5W3-4、96AH5W3-5、96AH5W3-6：4遺伝子を導入し；細胞を、酸素濃度5％で感染後7日目から3週間培養した。・96BH5-1：3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）を導入し；細胞を、酸素濃度5％で前培養した。・201B2：コントロールのiPS細胞（Cell,131,861-872(2007)）。各パネル右側の数字はPCRのサイクル数を指す。
【図１１】図11は、5％酸素濃度下で作製した、ヒトES様コロニーの代表的な位相差像（a）および樹立iPSクローンのアルカリホスファターゼ染色（b）を示す。5％酸素濃度下で作製した未分化のヒトiPS細胞の免疫組織化学的染色。Nanog（c）、SSEA3（d）、SSEA4（e）。
【図１２】図12は、4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し、5％酸素濃度下で培養して樹立したヒトiPS細胞(70AH5-2、70AH5-6)が、三胚葉系への分化能を有することを、α-fetoprotein、smooth muscle actin、βIII-tubulin、GFAP、DesminおよびVimentin抗体を用いた染色により確認した結果を示す写真である[左側：位相差像、右側：免疫染色像]。
【図１３】図13は、4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し、5％酸素濃度下で培養して樹立したヒトiPS細胞(70AH5-2)をSCIDマウスの精巣内に注射して得られたテラトーマの組織染色像（ヘマトキシリン・エオシン染色）を示す[a) 神経上皮組織、b) 網膜上皮組織、c) 骨様組織、d) 平滑筋組織、e) 内胚葉性上皮組織]。
【図１４】図14（a）から（d）は、21日目（a）及び28日目（b）における、4因子を導入したMEF由来のNanog-GFP陽性コロニーのカウント数、21日目（c）及び28日目（d）における3因子を導入したMEF由来のカウント数の比較を示すグラフである。図14（e）及び（f）は、4因子を導入したMEF（e）、及び3因子を導入したMEF（f）由来の全コロニーにおける、21日目のGFP陽性コロニーの割合の比較を示すグラフである。
【図１５】図15（a）は、バルプロ酸（VPA）あり及びなしの場合に、低酸素及び正常酸素条件下で培養した、4因子を導入したMEF由来の9日目におけるGFP陽性細胞の割合を比較しているグラフ表示を示す。図15（b）から（e）は、VPAなしにて20％酸素下（b）及びVPAなしにて5％酸素下（c）、並びにVPAありにて20％酸素下（d）及びVPAありにて5％酸素下（e）における、4因子を導入したMEFの代表的なフローサイトメトリー解析を示す。
【図１６】図16は、導入後21日目の、20％酸素下（（a）；位相差、（b）；GFP）及び5％酸素下（（c）；位相差、（d）；GFP）での代表的なGFP陽性コロニー像を示す。スケールバーは、200μmを意味する。
【図１７】図17は、4因子を感染させたMEFの、20％酸素下（a）及び5％酸素下（b）における21日目の代表的な像、3因子を感染させたMEFの、20％酸素下（c）及び5％酸素下（d）における28日目の代表的な像を示す。
【図１８】図18は、527CH5-1の核型解析を示す。
【図１９】図19は、ES細胞（RF8）（a）及び4因子を導入したMEF（b）のアポトーシスを起こした細胞の割合を比較しているグラフ表示を示す。ES細胞を、1x105細胞／ウェルの密度にてSTO細胞のフィーダー層上にまき、1日目から3日目まで、正常酸素又は低酸素下にて培養した。3日目に、細胞をannexin V-FITCにて処理して、フローサイトメトリー解析を行った。棒グラフは、アポトーシスを起こした細胞（annexin V-FITC陽性）の割合を表す。4因子を導入したMEFを導入後4日目にSTO細胞上にまき、5日目から9日目まで、低酸素及び正常酸素下にて培養して、annexin V親和性アッセイを行った。棒グラフは、アポトーシスを起こした細胞の割合を表す。3回の実験の平均値及び標準偏差を示す。
【図２０】図20は、ES細胞（RF8）（a）並びに4因子及びmockを導入したMEF（b）の細胞数を比較しているグラフ表示を示す。ES細胞を、1x105細胞／ウェルの密度にてSTO細胞のフィーダー層上にまき、1日目から3日目まで、正常酸素又は低酸素下にて培養した。3日目に、細胞数をカウントした。棒グラフは、ES細胞の細胞計数を示す。3回の実験の平均値及び標準偏差を示す。4因子及びmockを導入したMEFを、それぞれ1日目から4日目まで、低酸素又は正常酸素下にて培養して、細胞数をカウントした。棒グラフは、細胞計数を示す。4回の実験の平均値及び標準偏差を示す。＊p＞0.05
【図２１】図21は、ES細胞特異的遺伝子（a）及びMEF特異的遺伝子（b）の発現パターンについて、5％酸素下の4因子を導入したMEFと、20％酸素下のそれを比較した、スキャタープロットを示す。ES細胞及びMEFで特異的に発現する遺伝子を選択した（10倍以上の相違）。低酸素処理をして、4因子を導入したMEFにおいて上方制御及び下方制御された遺伝子を、それぞれ赤及び青にて示す。緑色の線は、遺伝子発現レベルが5倍変化していることを示す。
【図２２】図22は、定量的リアルタイムRT-PCRによる、内在性のOct3/4及びNanogの相対的な発現を示す。
【図２３】図23（a）は、21日目のNanog-GFP陽性コロニーのカウント数を比較しているグラフ表示を示す。3回の実験の平均値及び標準偏差を示す。スケールバー、200μm。＊は、p＞0.05を意味する。図23（b）から（e）は、20％酸素下（（b）；位相差、（c）；GFP）及び5％酸素下（（d）；位相差、（e）；GFP）由来の代表的なGFP陽性コロニー像を示す。
【図２４】図24（a）は、piggybac転位によって初期化したMEF由来の、12日目のNanog-GFP陽性コロニーの各カウント数を比較しているグラフ表示を示す。3回の実験の平均値及び標準偏差を示す。＊及び＊＊は、それぞれp＜0.01及びp＜0.001を意味する。図24（b）から（e）は、20％酸素下（（b）；位相差、（c）；GFP）及び5％酸素下（（d）；位相差、（e）；GFP）由来の代表的なGFP陽性コロニー像を示す。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、iPS細胞の樹立効率の改善方法を提供する。
【００１３】
（ａ）低酸素条件
本明細書において用語「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下（例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など）、10%以下（例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など）、または5%以下（例、4%以下、3%以下、2%以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上（例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など）、0.5%以上（例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.9%以上など）、または1%以上（例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など）である。
【００１４】
細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
【００１５】
低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、体細胞への核初期化物質の接触より前であっても、該接触と同時であっても、該接触より後であってもよいが、例えば、体細胞に核初期化物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2,3,4,5,6,7,8または9）日）おいた後に低酸素条件下で培養を開始することが好ましい。
【００１６】
低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上または10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下または30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。例えば、好ましい期間は、低酸素条件での初期化した細胞におけるES細胞特異的遺伝子の発現と、正常酸素条件でのそれを比較して、決定される。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
【００１７】
さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期および好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の選択、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率、及び他の要素によっても変動する。例えば、Oct3/4, Klf4, 及びSox2の3因子をヒト体細胞に導入する場合、核初期化物質との接触後比較的早い時期（例えば、0ないし3（例、1,2）日後）から、3ないし10（例、4,5,6,7,8,9）日間低酸素条件下で培養することが、好ましい。
【００１８】
(b) 体細胞ソース
哺乳動物由来（例、マウス、ヒト）の生殖細胞以外のいかなる細胞も、本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることができる。例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。未分化な前駆細胞の例としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００１９】
体細胞のソースとなる哺乳動物の選択は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、体細胞は、患者本人の細胞、又は患者のHLA型と同一か実質的に同一のHLA型を有する他人（提供者）から採取した細胞であることが特に好ましい。本明細書中にて使用する「実質的に同一のHLA型」は、提供者の体細胞由来のiPS細胞の分化を誘導することによって得られた移植細胞が、患者に移植されるときに免疫抑制剤などの使用とともに移植され得る程度に、提供者のHLA型が患者のHLA型と適合していることを意味する。例えば、実質的に同一のHLA型は、3つの主要なHLAである、HLA-A、HLA-B及びHLA-DRが受容者と一致するようなHLA型を含む（以下において、同一の意味が適用されるであろう）。また、ヒトに投与（移植）しない場合でも、例えば、患者の薬剤感受性や副作用を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとして得られたiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取する必要がある。
【００２０】
(c) 核初期化物質
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる任意の物質（単数又は複数）を指し、タンパク質性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク質性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク質性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmi1
[上記因子についてのさらなる情報については、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換の情報については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。]
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2 [Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照]
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28 [Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照]
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40 Large T （Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28 [Cell Research (2008) 600-603を参照]
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T （Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Oct3/4, Klf4 [Nature, 454, 646-650 (2008)；Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008）も参照]
(15) Oct3/4, c-Myc [Nature, 454, 646-650 (2008)を参照]
(16) Oct3/4, Sox2 [Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照]
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19)Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgと置換可能である; Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009)を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT (Science, 324: 797-801 (2009) を参照)
【００２１】
上記(1)〜(24)において、Oct3/4の代わりに、Octファミリーの他のメンバー（例えば、Oct1A、Oct6など）もまた使用され得る。Sox2 (又はSox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18)の代わりに、Soxファミリーの他のメンバー（例えば、Sox7など）もまた使用され得る。c-Mycの代わりに、Mycファミリーの他のメンバー（例えば、L-Mycなど）もまた使用され得る。Lin28の代わりに、Linファミリーの他のメンバー（例えば、Lin28bなど）もまた使用され得る。
【００２２】
上記(1)〜(24)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)〜(24)のいずれかの1以上の構成要素を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該1以上の構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
【００２３】
これらの組み合わせの中で、好ましい核初期化物質の例としては、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28及びSV40 Large Tから選択される、少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が挙げられ得る。
【００２４】
得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4, Sox2及びKlf4の3因子 [上記の組み合わせ(9)]が好ましく使用される。得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2及びLin28の5因子か、5因子及びNanogからなる6因子 [上記の組み合わせ(12)]が好ましい。これらの好ましい組み合わせにおいて、c-Mycの代わりにL-Mycを使用することもできる。
【００２５】
上記のタンパク質性因子のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができる（Nanogは当該公報中ではECAT4として記載されている）。尚、Lin28、Lin28b、Esrrb及びEsrrgdのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ以下のNCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
遺伝子の名前 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
【００２６】
核初期化物質としてタンパク質性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、培養細胞又はその馴化培地から組換えタンパク質性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク質性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
【００２７】
核初期化物質（単数又は複数）の体細胞への接触は、該物質がタンパク質性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）−又は細胞透過ペプチド（CPP）−融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Genlantis）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）、PULSinTM delivery reagent（Polyplus-transfection）及びProVectin（IMGENEX）；脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）;膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質（単数又は複数）を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて、混合物を室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した後に細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。タンパク質導入試薬を使用する具体的な手段は、WO 2009/073523又はWO 2009/032456に開示されている。
【００２８】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT (Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93 (1988)又はGreen, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynB1 (Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、及びHSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPは、11R (Cell Stem Cell, 4,381-384 (2009))及び9R (Cell Stem Cell, 4, 472-476 (2009))などのポリアルギニンを含む。核初期化物質のcDNAとPTD又はCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。CPPを使用する具体的な手段は、Cell Stem Cell, 4:472-6 (2009)又はCell Stem Cell, 4:381-4 (2009)に開示されている。
【００２９】
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
【００３０】
核初期化遺伝子の持続的な過剰発現は、潜在的に発癌のリスクを増大させるが、タンパク質性初期化因子は、導入した細胞のプロテアーゼによって分解がおこり、次第に消失するため、タンパク質性因子の使用は、得られたiPS細胞が治療目的のために利用される場合のような、高度な安全性が必要とされる場合に、適切であり得る。
【００３１】
しかし、体細胞への導入の容易さを考慮すると、核初期化物質は、タンパク質性因子自体としてよりも、好ましくは、それをコードする核酸の形態で用いられてもよい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
【００３２】
核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びセンダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターの例としては、EF-αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF-αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
【００３４】
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。有用な選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３５】
核初期化物質として2以上の核酸を細胞に導入する場合、核酸を別個のベクターに担持させてよく、複数の核酸をタンデムに連結されてポリシストロニックなベクターを得てもよい。後者の場合、効率的なポリシストロニックな発現を可能にするために、口蹄疫ウイルスの2A自己開裂ペプチド（Science, 322, 949-953, 2008などを参照)、IRES配列など、好ましくは2A配列を個々の核酸の間にライゲーションすることが望ましい。
【００３６】
核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や補完細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、レトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、レンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。また、アデノウイルスベクターを用いる場合については、Science, 322, 945-949 (2008) に開示されている。
【００３７】
上記に議論するように、iPS細胞が治療目的に利用される場合、核初期化遺伝子の持続的な過剰発現は、iPS細胞から分化した組織及び器官における発癌のリスクを増大させる可能性があるので、核初期化物質としての核酸は、細胞の染色体中に組み込まれずに、一過的に発現することが好ましい。この観点から見ると、染色体への組み込みがまれにしかおこらないアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段はScience, 322, 945-949 (2008)に開示されている。アデノ随伴ウイルスベクターもまた、染色体への組み込み頻度が低く、細胞毒性及び炎症誘発性についてはアデノウイルスベクターよりも低いことから、別の好ましいベクターと言うことができる。センダイウイルスベクターは、染色体外に安定に存在していることができて、必要に応じてsiRNAを使用して分解除去することが可能であることから、同様に好ましく利用される。センダイウイルスベクターに関しては、J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007)及びJP-3602058 Bに記載されているものが使用され得る。
【００３８】
レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを使用する場合、たとえ導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、再活性化される可能性があるので、例えば、不要になった時点で、核初期化物質である核酸をCre-loxPシステムを使用して切り出す方法が、好ましくは使用され得る。つまり、あらかじめ核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後、プラスミドベクター又はアデノウイルスベクターを使用してCreリコンビナーゼを細胞に作用させて、loxP配列ではさまれている領域を切り出すことができる。LTR U3領域のエンハンサー−プロモーター配列は、挿入変異によって、それに近接する宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、欠失させるか、SV40などのポリアデニル化配列に置換して調製した3’自己不活性化型(SIN) LTRを使用して、切り出されずにゲノム中に残存しているloxP配列の外側のLTRによる内在性遺伝子の発現制御を避けることがより好ましい。Cre-loxPシステム及びSIN LTRを使用する具体的手段は、Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009)に開示されている。
【００３９】
一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いてプラスミドベクターを細胞に導入することができる。プラスミドベクターを使用する場合にも、染色体への組み込みはまれであり、導入遺伝子は細胞内にてDNaseにより分解されて除去される。それゆえ、iPS細胞を治療目的に使用する場合には、プラスミドベクターの使用は、別の好ましい実施態様であり得る。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。
【００４０】
別の好ましい非組み込み型ベクターは、エピソーマルベクターであり、これは染色体外にて自己複製可能である。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Science, 324, 797-801(2009)に開示されている。
【００４１】
アデノウイルス又はプラスミドを使用する場合にも、導入遺伝子は染色体に組み込まれ得るので、最終的には、サザンブロッティング又はPCRによって染色体中に遺伝子の挿入がないことを確定する必要がある。この理由から、上記のCre-loxPシステムと同様に、導入遺伝子が染色体に組み込まれた後で該遺伝子を除去するという手段を使用することは、有利であり得る。別の好ましい実施態様において、導入遺伝子をトランスポゾンを使用して染色体に組み込んだ後、プラスミドベクター又はアデノウイルスベクターを使用してトランスポゼースを細胞に作用させて、導入遺伝子を染色体から完全に除去するという方法が使用され得る。好ましいトランスポゾンの例としては、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBacなどが挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009)に開示されている。別の実施態様において、プロモーター領域のテトラサイクリン反応性エレメント(Tet-OnR & Tet-Off R Gene Expression Systems, Clontech)が、導入遺伝子の除去のために使用され得る。
【００４２】
アデノウイルス又は非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入するための操作を繰り返す回数は、特に限定されず、導入は１回以上の任意に選択した回数（例えば、1回から10回、1回から5回など)にて行われ得る。2種以上のアデノウイルス又は非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類のアデノウイルス又は非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合でも、導入は１回以上の任意に選択した回数（例えば、1回から10回、1回から5回など)にて行われ得、好ましくは、導入は2回以上(例えば、3回又は4回)繰り返して行われ得る。
【００４３】
核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への接触は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスなどの哺乳動物より単離した体細胞の培養に適した培地 [例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地、及びそれらの組み合わせなど] 中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
【００４４】
(d) iPS細胞の樹立効率改善物質
従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
【００４５】
iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例えば、HDAC1 siRNA SmartpoolO (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5’-azacytidine）[Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)等の低分子阻害剤］、G9aに対するsiRNAおよびshRNA [例えば、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等]等の核酸性発現阻害剤など、L-channel calcium agonist (例えば、Bayk8644) [Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)]、p53阻害剤 [例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1 [Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)]、Wnt シグナル誘導物質（例えばsoluble Wnt3a）[Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)]、2i/LIF [2iはmitogen-activated protein kinase signalingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008)]等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
【００４６】
前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須ではない補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質（単数又は複数）およびiPS細胞の樹立効率改善物質（単数又は複数）の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
【００４７】
iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク質性因子である場合、(b) 該タンパク質性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である3つの場合に応じてそれぞれ上記したように、実施することができる。
【００４８】
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク質性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク質性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターや非ウイルスベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
【００４９】
マウスまたはヒトなどの哺乳動物から分離した体細胞は、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地及びそれらの組み合わせなどが挙げられるが、それらに限定されない。5％以下の低血清濃度にて前培養を行うと、iPS細胞の樹立効率が改善されるという報告がある（例えば、WO 2009/006997）。核初期化物質（単数又は複数）及びiPS細胞の樹立効率改善物質（単数又は複数）と細胞との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、あらかじめ無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化物質（単数又は複数）（及びiPS細胞の樹立効率改善物質（単数又は複数））を細胞に接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞[McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)]等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
【００５０】
iPS細胞の候補コロニーは、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法及び目視による形態観察による方法によっても選択され得る。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF [Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)]、Nanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF [Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)]等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3/4、Klf4及びSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
【００５１】
選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4、Fbx15）レポーターに対する陽性反応(GFP陽性、β-ガラクトシダーゼ陽性など)、及び選択マーカーに対する陽性反応(ピューロマイシン耐性、G418耐性など)、並びに目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
【００５２】
このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。また、患者本人でなくても、患者とHLAの型が同一であるか実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導し、そこから所望の細胞へ分化させ、これを患者への移植に用いることもできる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
【００５３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【００５４】
実施例１：iPS細胞樹立に対する低酸素培養法の効果(1)
実験系としてNanogレポーターを持つマウスを使用した。NanogレポーターはBACPAC Resourcesより購入したBAC(bacterial artificial chromosome)のNanog遺伝子座に緑色蛍光蛋白質(EGFP)とピューロマイシン耐性遺伝子がくみこまれたもの [Okita K. et al., Nature 448, 313-317(2007)]を使用した。マウスNanog遺伝子はES細胞や初期胚といった分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。また、このレポーターが陽性となったマウスiPS細胞はES細胞とほぼ同等の分化能力を持つことがわかっている。このNanogレポーターを有するNanogレポーターマウス [Okita K. et al., Nature 448, 313-317(2007)]から得られたマウス胎仔線維芽細胞(MEF)および尾部線維芽細胞(TTF)に対して、レトロウィルスにより遺伝子導入を行うことでiPS細胞を樹立し、NanogレポーターによりEGFPが発現しているコロニー数を計測することによりiPS細胞樹立効率を評価した。
【００５５】
初期化に使用するレトロウイルスは、前日に100mm培養ディッシュ(Falcon)の１枚当り2 x 106で播種したPlat-E細胞 (Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066）にレトロウイルス発現ベクター [pMXs-Oct3/4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4, pMXs-cMyc：Cell, 126, 663-676 (2006)]を個々に導入して作製した。培養液はDMEM/10% FCS [DMEM (Nacalai tesque)にウシ胎仔血清を10%加えたもの]を使用し、37℃、5%CO2で培養した。ベクターの導入のためにFuGene6 transfection reagent (Roche) 27μLをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 300μLに入れ、室温で5分間静置した。その後、各発現ベクターを9 μg加え、さらに室温で15分静置してからPlat-Eの培養液に加えた。2日目にPlat-Eの培養上清を新しい培地に換え、3日目に培養上清を回収して0.45μm sterile filter (Whatman)で濾過し、polybrene (Nacalai Tesque)を濃度4μg/mLとなるように加えてウイルス液とした。
【００５６】
マウス胎仔線維芽細胞(MEF)はNanogレポーターマウスの受精後13.5日の胎仔から単離し、培地（DMEM/10% FCS）にて培養した。また尾部線維芽細胞(TTF)はNanogレポーターマウスの尾部を細切しゼラチンコート6ウェルデッシュ上に静置し初代細胞スターティング培地(東洋紡ライフサイエンス事業部)にて5日間培養を行い、尾部組織からディッシュ上に遊走してくる線維芽細胞を、さらに培地DMEM/10% FCSにて培養することにより得られたものを使用した。
【００５７】
MEFおよびTTFはNanog遺伝子を発現しないため、EGFPを発現せず、緑色蛍光を示さない。また、ピューロマイシン耐性遺伝子も発現しないため、抗生物質であるピューロマイシンに感受性である。このMEFおよびTTFを0.1%ゼラチン(Sigma)でコートした6ウェル培養プレート(Falcon)に１ウェル当り1 x 105細胞で播種した。培養液はDMEM/10% FCSを使用し、37℃、5%CO2で培養した。翌日、各レトロウイルス液を加え、一晩感染させて遺伝子を導入した。
【００５８】
ウイルス感染後3日目からはLIFを加えたES細胞用培地 [DMEM (Nacarai tesque)に15%ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミン(Invitrogen)、100 μM 非必須アミノ酸(Invitrogen)、100μM 2−メルカプトエタノール(Invitrogen)、50 U/mL ペニシリン(Invitrogen)と50 mg/mL ストレプトマイシン(Invitrogen)を加えたもの]を用いて培養した。感染後4日目にMEFおよびTTFの培地を除き、PBS 1 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/ 1 mM EDTA (Invitrogen)を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらES細胞用培地を加えて懸濁し、（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの4因子を導入した場合は）1 x 104個のMEF細胞を、また（Oct3/4, Sox2, Klf4の3因子を導入した場合は）1 x 105個のMEF細胞を、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100 mmディッシュに播いた。またTTFにおいては、前記4因子を導入した場合は）2 x 104個のTTF細胞を、（前記3因子を導入した場合は）1 x 105個のTTF細胞を、また（Oct3/4, Klf4, c-Mycの3因子を導入した場合は）1.5 x 105個のTTF細胞を同様に播いた。なおフィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞 [McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)]を用いた。以後コロニーが観察できるようになるまで2日ごとにES細胞用培地の交換を行った。
【００５９】
感染後5日目より14日目まで、正常酸素濃度(20%)又は低酸素濃度(5%、1%)に設定したインキュベーター（Thermo scientific）において細胞を培養した。4因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を感染させた細胞は14日目から、3因子(Oct3/4, Sox2, Klf4またはOct3/4, Klf4, c-Myc)を感染させた細胞は21日目からピューロマイシン (1.5 μg/mL)で選択を行った。コロニーは4因子では10日目、3因子では20日目ごろから見え始め、徐々にGFP陽性となった。
【００６０】
感染後21日目および28日目にGFP陽性コロニーを数え、正常酸素濃度(20%)および低酸素濃度下(5%、1%)において培養した細胞の比較を行った。MEFの結果を表1に、またTTFの結果を表2および3に示す。これらの結果から低酸素条件下での細胞培養によりiPS細胞の樹立効率が上昇することが明らかとなった。特に酸素濃度5％の場合に良好な結果が得られた（表1-3）。また3因子導入の場合、Oct3/4, Sox2, Klf4のみならずOct3/4, Klf4, c-Mycであっても、iPS細胞が樹立できることが明らかとなった（表2）。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
まとめると、5％酸素下にて、4因子を導入したMEF由来のGFP陽性コロニー数は、正常酸素条件下のものよりも、21日目に7.4倍、28日目に3.1倍に増加し、3因子を導入したMEF由来のGFP陽性コロニー数は同様に、5％酸素下にて21日目に20倍、28日目に7.6倍に増加した(図14 a), b), c)及びd))。さらに、低酸素処理をすると、4因子又は3因子を導入したMEFの全コロニー中のGFP陽性コロニーの割合が増加した(図14 e) 及びf))。低酸素処理後に由来するGFP陽性コロニーは、正常酸素条件に由来するGFP陽性コロニーと、形態及び大きさにおいて遜色がなかった(図16)。アルカリホスファターゼ染色により、5％酸素下での培養は、アルカリホスファターゼ活性に陽性のコロニー数を増加させることが示された(図17)。
【００６５】
GFP陽性コロニーがより早期に検出されるか否かを調べるために、4因子を導入したMEFを20％酸素下又は5％酸素下にて、2mM バルプロ酸 (VPA)あり又はなしにて、導入後5日目から9日目まで培養し、9日目にフローサイトメトリー解析を行った。4因子をレトロウイルス発現すると、0.01％の細胞が導入後9日目にGFP陽性となった。4因子を導入したMEFを、低酸素又はVPAとともに4日間処理すると、GFP陽性細胞の割合は、それぞれ0.40％及び0.48％にまで増加した。さらに、低酸素とVPAとで同時に処理すると、GFP陽性細胞の割合が2.28％に増加した。これらのデータは、GFP陽性細胞がより早期に検出可能であり、低酸素培養は、VPAと相乗効果を有することを示唆している(図15 a), b), c), d)及び e))。
【００６６】
次に、成人皮膚由来線維芽細胞（HDF）を用いて低酸素培養の効果を検討した。Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、全てヒト由来の4因子(OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC) または3因子 (OCT3/4, SOX2, KLF4) をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から6日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞[McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)]を用いた。翌日から霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。
【００６７】
感染後7日目よりコロニーをカウントするまで（感染後24日目及び32日目）、正常酸素濃度（20%）又は低酸素濃度（5%、1%）に設定したインキュベーター中で細胞を培養した。結果を表4に示す。4因子を導入した場合、正常酸素濃度に比べて、酸素濃度5%の場合に、iPS細胞の樹立効率が上昇した。一方、酸素濃度1%の場合や3因子を導入した場合、今回実施したような、細胞を長期低酸素状態で維持する培養条件ではiPS細胞が得られなかった。このことから、酸素濃度1%といったよりシビアな低酸素状態を用いる場合や、もともと4因子に比べて樹立効率が低い3因子導入の場合には、低酸素条件下での培養期間をより短く設定する必要性が示唆された。
【００６８】
【表４】
【００６９】
実施例2：iPS細胞樹立に対する低酸素培養法の効果(2)
Oct3/4とKlf4の2遺伝子導入のみでも低酸素培養法の効果が得られるかどうかを検討するための実験を行った。実験は、実施例1と同じNanogレポーターマウス由来のMEFを用いた。実施例1と同様にしてレトロウイルス発現ベクター（pMXs-Oct3/4, pMXs-Klf4）をMEFに感染させた。感染後4日目に、１x105個のMEFを、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100mmディッシュに播いた。以後2日ごとにES細胞用培地の交換を行った。
【００７０】
感染後5日目より14日目まで、細胞を、正常酸素濃度（20％）又は低酸素濃度（5％）に設定したインキュベーター（Thermo scientific）において培養した。薬剤選択は行わずに培養を続け、28日目にGFP陽性コロニーの数を数えた。結果を図１に示す。独立した4回の実験を行った。酸素濃度20％の場合は4回中1回しかコロニーが生じなかったが、5％の場合は4回の実験全てにおいてコロニーが生じた。図１に示したように、酸素濃度5％での培養により、20％の場合と比べてGFP陽性コロニー数が有意に増加しており（*p<0.05）、低酸素培養によるiPS細胞の樹立効率上昇効果が認められた。
【００７１】
さらに、Oct3/4とc-Mycの2遺伝子導入についても低酸素培養法の効果が得られるかどうかを決定するために、さらなる実験を行った。実験は、前記Oct3/4およびKlf4の場合と同様の手法で、Nanog-MEFを用いて行った。感染後5日目より14日目まで、細胞を、正常酸素濃度（20％）および低酸素濃度（5％）に設定したインキュベーター（Thermo scientific）において培養した。薬剤選択は行わずに培養を続け、42日目GFP陽性コロニーを観察した。その結果、正常酸素濃度（20％）で培養した場合はGFP陽性コロニーが生じなかったのに対して、低酸素濃度（5％）で培養することにより、コロニーが出現した（図2）。以上により、Oct3/4およびc-Mycの2遺伝子導入においても、低酸素条件下で培養することによりiPS細胞の樹立効率を改善できることが明らかとなった。
【００７２】
実施例3：マウスiPS細胞における未分化マーカーの発現
実施例1及び2で樹立したMEF由来のiPS細胞における未分化マーカーの発現を、Rever Tra Ace kit（Takara）を使用してRT-PCR解析を行うことにより調べた。使用した各プライマーの配列を配列番号：1〜18に示す。またRT-PCRの結果を図３に示す。4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）、3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）、または2遺伝子（Oct3/4, Klf4）を導入し、低酸素濃度下（5％、1％）で培養して樹立したiPS細胞は、いずれも、ES細胞特異的発現遺伝子であるOct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Rex1、ECAT1を発現しており、その発現量はマウスES細胞（RF8）や過去に4遺伝子で樹立したiPS細胞 [20D17: Nature, 448, 313-317 (2007)]と同等であることが示された。また、導入したOct3/4遺伝子（Oct3/4（Tg))の発現は認められなかったことから、サイレンシングが起こっていることが示された。以上の結果より、低酸素条件下で樹立した細胞はiPS細胞であることが確認された。
【００７３】
実施例4：樹立されたiPS細胞のテラトーマ形成能
低酸素濃度下（5％）、Oct3/4およびKlf4で樹立したマウスiPS細胞 (527CH5-2)を用いて、Cell, 126, 663-676 (2006) に記載の方法に従ってテラトーマを形成させた。具体的には1×106個のiPS細胞を免疫不全マウスの皮下に注射し、4週間後に出現したテラトーマを単離した（図4上）。各テラトーマを切り刻んで4％フォルムアルデヒドを含有するPBS(-)で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。結果を図4下に示す。組織学的に見ると、腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、軟骨組織、内胚葉性上皮組織、筋肉組織、角化上皮組織が認められたことから、iPS細胞の多能性が証明された。
【００７４】
実施例5：キメラマウスの作製
実施例1および2において、低酸素濃度下（5％）、2遺伝子、3遺伝子または4遺伝子導入により樹立したiPS細胞をICRマウス由来の胚盤胞にマイクロインジェクションした結果、アダルトキメラを作出した。結果を図5に示す。
【００７５】
実施例6：iPS細胞株の核型
iPS細胞株の核型は実施例１及び２における低酸素処理(521AH5-1及び527CH5-1)後のものであり、これらの細胞株は正常な核型を示した(図18)。
【００７６】
実施例7：低酸素での培養期間がヒトiPS細胞の樹立に及ぼす影響
低酸素条件下(5％)での細胞培養時期および細胞培養期間がヒトiPS細胞の樹立効率に及ぼす影響について検討した。体細胞として成人皮膚由来線維芽細胞（adult HDF）を用いた。低酸素培養のタイムスケジュールを図6に示す。まず、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルスを用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子をHDFに発現させた。これらの細胞(8×105個)に対して、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、全てヒト由来の4因子 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) または3因子 (Oct3/4, Sox2, Klf4) をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から6日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った （4遺伝子導入の場合は1 x 105 個、3遺伝子導入の場合は5 x 105個/100 mmディッシュ）。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞 [McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)]を用いた。翌日から霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。
【００７７】
細胞培養は、6つの条件下：(1)正常酸素濃度(20％)で感染後40日目までの間、または低酸素濃度(5％)で：(2)感染後7日目から1週間、(3)感染後7日目から1.5週間、(4)感染後7日目から2週間、(5)感染後7日目から3週間培養後、正常酸素濃度(20％)で感染後40日目までの間、並びに(6)低酸素濃度(5％)で感染後7日目から感染後40日目までの間、のいずれかで行った。感染翌日からフィーダー細胞上への蒔き直しまでの間、細胞を低酸素濃度（5％）で前培養した後、前記(1)〜(6)のいずれかの条件でさらに培養して得られた結果も検討した。感染から24日目、32日目および40日目に出現したiPSコロニー数をカウントした。これら3回のカウントの結果をまとめて図7に示す。
【００７８】
4遺伝子導入においては、前記(2)〜(6)のいずれの低酸素濃度条件下で培養した場合も、正常酸素濃度（20％）で培養した場合に比べてiPS細胞の樹立効率が上昇していた。さらに、低酸素濃度下での前培養を加えた場合も、iPS細胞の樹立効率上昇効果が認められた。4遺伝子導入における感染後40日目のコロニー像を、図8に示した。
【００７９】
3遺伝子導入においては、低酸素濃度下で前培養を行うことにより、正常酸素濃度で培養した場合に比べ多くのiPS細胞を樹立した（図７）。
【００８０】
4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）を導入し、前記（1）、（2）、（4）、（5）および（6）の条件下で、独立した3回の実験を行った。結果をまとめて図9に示す。正常酸素濃度（20％）の場合に比べて低酸素濃度（5％）で培養することにより、いずれの場合もiPS細胞の樹立効率が上昇した。特に、感染後7日目から2週間以上の期間、低酸素濃度下で培養することにより、顕著な効果が得られた。
【００８１】
実施例8：ヒトiPS細胞の未分化マーカーの発現
実施例7で樹立した成人HDF由来のiPS細胞における未分化マーカーの発現を、Rever Tra Ace kit（Takara）を使用してRT-PCR解析を行うことにより調べた。使用した各プライマーの配列を配列番号：19〜36に、またRT-PCRの結果を図10に示す。4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）または3遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2）を導入し、低酸素濃度下（5％）で培養して樹立したiPS細胞は、いずれも、ES細胞特異的発現遺伝子であるOct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Rex1、GDF3およびESG1を発現しており、その発現量は、過去に4遺伝子で樹立したiPS細胞 [201B2: Cell, 131, 861-872 (2007)]と同等であることが示された。以上の結果より、低酸素濃度下で樹立した細胞はiPS細胞であることが確認された。
【００８２】
さらに、これらのiPS細胞は、アルカリホスファターゼが強く陽性であり、免疫細胞学的染色により、全てのiPS細胞がNanog、SSEA3及びSSEA4を発現していることが示された（図11）。
【００８３】
実施例9：in vitro分化誘導
Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Mycの4遺伝子を導入し、5％酸素濃度下で感染後7日目から40日目まで培養して樹立したヒトiPS細胞（70AH5-2、70AH5-6）をlow-binding dishに播き、Cell, 131, 861-872 (2007)に記載のように8日間培養し、胚様体(embryoid body：EB)を形成させた（100mmディッシュ）。胚様体を8日間培養後、内胚葉系細胞の分化マーカーであるα-fetoprotein (R&D systems)、中胚葉系細胞の分化マーカーであるsmooth muscle actin (DAKO)、Desmin (NeoMarkers)、Vimentin （Santa Cruz）、外胚葉系の分化マーカーであるβIII-tubulin (Chemicon)、GFAP (DAKO)の各抗体を用いた染色を行った。結果を図12に示す。染色によりそれらの発現が確認され、樹立されたヒトiPS細胞は三胚葉系への分化能を有することが確認された。
【００８４】
実施例10：樹立されたiPS細胞のテラトーマ形成能
4遺伝子導入、5％酸素濃度下での培養により樹立したヒトiPS細胞（70AH5-2）を用いてテラトーマ形成能を調べた。ヒトiPS細胞（70AH5-2）を、リコンビナントヒトbFGF(4ng/ml)およびRhoキナーゼ阻害剤Y-27632(10μM)を含有する霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL)中で培養した。1時間後、collagen IVで処理して細胞を採取後、遠心・回収し、Y-27632（10μM）を含有するDMEM/F12中に浮遊させた。コンフルエントになった細胞(100mmディッシュ)の1/4量をSCIDマウスの精巣内に注射した。9週間後、腫瘍を切り刻んで4％フォルムアルデヒドを含有するPBS(-)で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。結果を図13に示す。組織学的に見ると腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、神経上皮組織、網膜上皮組織、骨様組織、平滑筋組織、及び内胚葉性上皮組織が認められたことから、iPS細胞の多能性が証明された。
【００８５】
実施例11：増殖、生存及び遺伝子発現に対する低酸素培養の効果
annexin Vを使用したフローサイトメトリー解析により、低酸素培養は、マウスES細胞又は4因子を導入したMEFに対して保護作用を有さないことが確認された（図19）。さらに、低酸素培養は、マウスES細胞の増殖に対して効果を示さなかった（図20 a))。導入後1日目から4日目まで低酸素でインキュベーションしても、mockを導入したMEFの増殖に対しては有意な効果を有さなかったが、4因子を導入したMEFに対しては有意な効果を有していた（図20 b)）。初期化プロセスにおける細胞の発現プロファイルを調べるために、マイクロアレイ解析及び定量的リアルタイムRT-PCRを行った。1日目から4日目まで低酸素及び正常酸素条件下にて培養した、4因子を導入したMEFのマイクロアレイ解析により、低酸素で処理した細胞では、ES細胞特異的遺伝子のうち73.2％（全1045遺伝子のうち765遺伝子）が上方制御されており、MEF特異的遺伝子のうち85.8％（全1142遺伝子のうち980遺伝子)が下方制御されていることが示された（図21 a)及びb))。さらに、定量的リアルタイムRT-PCR解析により、3日間低酸素処理すると、4因子を導入したMEFにおいて、内在性のOct3/4及びNanogの発現がそれぞれ、3.4倍及び2.1倍増加していることが確認された（図22 a)及びb))。
【００８６】
低酸素がSTO細胞を刺激することによってiPS細胞の生成を増強している可能性を除外するために、STO細胞のフィーダー層なしで低酸素培養条件下にて、iPS細胞の増殖状況について調べた。図23は、5％酸素下での培養が、GFP陽性コロニーの数を増加させることを示しており、低酸素による初期化の増強は、STO細胞を介しているのではないことが示唆された。
【００８７】
実施例12：低酸素培養下における、発現プラスミド（olasmid）ベクターの一時的な導入によるiPS細胞の樹立
プラスミド導入によるiPS細胞の作製を、先に記載されているように行った（Okita, K, et al. Science 322, 949-953, (2008))。簡潔には、Nanog-GFP-IRES-Purorレポーターを有するMEFを、6ウェルプレートに、1.0x105細胞/ウェルになるように蒔いた (0日目)。1、3、5及び7日目に、細胞をpCX-OKS-2A及びpCX-c-Mycで形質導入し、9日目に、細胞をトリプシンで回収して、STOフィーダー細胞を蒔いておいた100mmディッシュに蒔き直した。25日目に、GFP陽性コロニーの数を数えた。低酸素処理のために、細胞を10日目から24日目まで、5％酸素下にて培養した。
【００８８】
表5は、低酸素培養が、GFP陽性コロニーの数を2.0倍増加させることを示している。
【００８９】
【表５】
【００９０】
実施例13：低酸素培養下における、piggyback導入システムによるiPS細胞の樹立
いくつかの改変を加えて、先に記載されているように、piggyback (PB)転位による直接的な初期化を行った (Woltjen et al., Nature; 458:766-70, (2009))。簡潔には、Nanog-GFP-IRES-Purorレポーターを有するMEFを、6ウェルプレートに、1.0x105細胞/ウェルになるように蒔いた。24時間後、Fugene HD (Roche, Switzerland)を使用して、PB-TET-MKOS、PB-CA-rtTA Adv、及びPBトランスポゼース発現ベクターで細胞を形質導入した。24時間後、培地をドキシサイクリンを含む培地(1.5ug/ml)で置換した(0日目)。細胞を低酸素又は正常酸素条件下にて培養し、GFP陽性コロニーの数を12日目にカウントした。PB-TET-MKOS及びPB-CA-rtTA advは、Addgeneから得た(Addgeneプラスミド20910及び20959)。PBトランスポゼース構築物は、pBSII-IFP2-orf (Dr. Malcolm J. Fraser, Jr, University of Notre Dameから頂いた)からPCRで増幅し、CAGプロモーターで発現させる発現ベクター(pCX-EGFP)に挿入した。
【００９１】
図24は、5日及び10日間低酸素処理すると、GFP陽性コロニーの数が、それぞれ2.9倍及び4.0倍に増加することを示している。これらのデータは、低酸素が、piggybac転位システムなどの非ウイルスベクターによるiPS生成効率を増加させ得ることを示唆している。
【００９２】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の要旨および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
【００９３】
さらに、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００９４】
本出願は、米国仮出願番号61/084,842、61/141,177、及び61/203,931を基礎としており、その内容は、引用によって本明細書に組み込まれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２】
雰囲気中の酸素濃度が1-10%の範囲内である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
雰囲気中の酸素濃度が1-5%の範囲内である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
核初期化物質が、以下の物質、あるいはそれらをコードする核酸である、請求項1から3のいずれかに記載の方法；(i) Oct3/4及びKlf4、又は
(ii) Oct3/4及びc-Myc、又は
(iii) Oct3/4、Klf4及びSox2、又は
(iv) Oct3/4、Klf4及びc-Myc、又は
(v) Oct3/4、Klf4、Sox2及びc-Myc。
【請求項５】
核初期化工程において効率改善物質としてバルプロ酸が使用されるさらなる工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
低酸素条件下における体細胞の培養が、核初期化物質を接触させた後3日以上行われる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２】
雰囲気中の酸素濃度が1-10%の範囲内である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
雰囲気中の酸素濃度が1-5%の範囲内である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
核初期化物質が、以下の物質、あるいはそれらをコードする核酸である、請求項1から3のいずれかに記載の方法；(i) Oct3/4及びKlf4、又は
(ii) Oct3/4及びc-Myc、又は
(iii) Oct3/4、Klf4及びSox2、又は
(iv) Oct3/4、Klf4及びc-Myc、又は
(v) Oct3/4、Klf4、Sox2及びc-Myc。
【請求項５】
核初期化工程において効率改善物質としてバルプロ酸が使用されるさらなる工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
低酸素条件下における体細胞の培養が、核初期化物質を接触させた後3日以上行われる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【図６】
【図１４】
【図１５】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２３】
【図２４】
【図１４】
【図１５】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２０１１−５２９３２９（Ｐ２０１１−５２９３２９Ａ）
【公表日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６４７６（Ｐ２０１０−５０６４７６）
【出願日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６３９０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１３８４５
【国際公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度文部科学省、「科学技術試験研究委託事業」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６３９０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１３８４５
【国際公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度文部科学省、「科学技術試験研究委託事業」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]