動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、並びに、ハイブリドーマの製造方法
【課題】遺伝子免疫によって抗原タンパク質に対する抗体を作製する際に、より短期間かつ高効率で体液性免疫の応答を誘導することができる方法を提供する。
【解決手段】非ヒト動物を抗原で免疫することにより、前記非ヒト動物に所望の膜タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法であって、前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を非ヒト動物に投与することにより、当該非ヒト動物内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質に対する体液性免疫を誘導する動物の免疫方法が提供される。当該方法に用いる免疫用組成物、当該方法を利用した抗体の製造方法とハイブリドーマの製造方法も提供される。
【解決手段】非ヒト動物を抗原で免疫することにより、前記非ヒト動物に所望の膜タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法であって、前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を非ヒト動物に投与することにより、当該非ヒト動物内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質に対する体液性免疫を誘導する動物の免疫方法が提供される。当該方法に用いる免疫用組成物、当該方法を利用した抗体の製造方法とハイブリドーマの製造方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、並びに、ハイブリドーマの製造方法に関し、さらに詳細には、膜タンパク質をコードする遺伝子とフラジェリンをコードする遺伝子との融合遺伝子を非ヒト動物に投与して体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法、当該免疫方法に使用するための免疫用組成物、当該免疫方法を用いた抗体の製造方法、当該免疫方法により免疫された非ヒト動物のＢリンパ球とミエローマとを細胞融合するハイブリドーマの製造方法、並びに、当該ハイブリドーマを用いた抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は体液性免疫の主役であり、感作リンパ球とともに生体防御機構の重要な役割を担っている。一方で、抗体は、その抗原との特異的親和性を利用した各種の技術、例えば、アフィニティクロマトグラフィーや免疫測定法等にも頻繁に利用されている。すなわち、抗体は特定の抗原に対して特異的に強く結合するので、特定の抗原を同定・定量したり、さらには機能未知なタンパク質に対する解析ツールとして有用である。このような目的で、抗体は臨床検査やバイオテクノロジーの分野において幅広く用いられている。
【０００３】
特定の抗原に対する抗体を作製する代表的な方法は、抗原となる所望のタンパク質を動物に投与して体液性免疫を誘導し、当該動物の体液から抗血清を採取することである。すなわち、動物に投与する（免疫する）免疫原として、抗原タンパク質そのものを使用する。この際に免疫原として使用する抗原タンパク質としては、例えば、生体試料等から単離・精製されたものを使用する。また、組換えＤＮＡ技術を用いて取得した組換え型の抗原タンパク質や、抗原タンパク質の一部に対応するペプチドを化学的に合成し、それを免疫原として動物に投与することも行われている。
【０００４】
一方、抗原タンパク質そのものではなく、その抗原タンパク質をコードする遺伝子を免疫原として使用する遺伝子免疫と呼ばれる技術がある。遺伝子免疫を行う場合は、例えば、抗原タンパク質をコードする遺伝子を適宜の発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを動物に接種する。すると、発現ベクターに組み込まれた遺伝子が動物体内で発現し、抗原タンパク質が合成される。その結果、動物体内で合成された抗原タンパク質により免疫応答が誘導される。
【０００５】
上記のように、特定の抗原に対する抗体を作製する技術は多様であり、目的に応じて選択することができる。例えば、以下のような場合には遺伝子免疫が適当である。
まず、遺伝子免疫によれば、抗原タンパク質をコードする遺伝子さえ単離されておれば免疫を行うことができ、抗原タンパク質を単離・精製する必要がない。したがって遺伝子免疫は、抗原タンパク質の調製作業を省略して工程を簡略化したい場合や、精製法が確立されていない抗原タンパク質、精製が困難な抗原タンパク質、遺伝子のみ知られている未知の抗原タンパク質などに対する抗体を作製したい場合に適している。
また、タンパク質が生体内で機能を発揮するためには正しい立体構造を形成することが必要であるが、遺伝子免疫は、タンパク質における正しい立体構造を認識する抗体を取得したい場合に適している。すなわち遺伝子免疫では、動物に投与された遺伝子が生体内にて転写・翻訳されるので、高次構造をもつ抗原タンパク質に対する抗体を取得するのに有用である。
さらに、遺伝子免疫の場合は、動物体内で遺伝子が発現して合成される抗原タンパク質の量が、抗原タンパク質を直接投与する場合に必要な量と比較して格段に少なくても免疫応答を誘導できるという利点もある。さらに、組換えＤＮＡ技術によって抗原タンパク質を調製することが困難な場合等であっても、従来の方法のようにペプチド抗原を別途化学合成する必要がなく、遺伝子の全長を動物に導入するだけでよいという利点もある。
【０００６】
上記のように、遺伝子免疫は従来の方法にはない利点を有するが、抗原タンパク質の種類によっては体液性免疫の応答が誘導されず、抗体が産生されない場合がある。
例えば、抗原タンパク質が、免疫した動物が内在的に有するタンパク質と極めて相同性が高いものである場合は、動物体内でその抗原タンパク質が合成されても異物として認識されないため、体液性免疫の応答が誘導されないことがある。
また、抗原タンパク質がその動物体内で不安定なものである場合、動物体内における抗原タンパク質の量が少なくなり、体液性免疫の応答が誘導されないことがある。また、抗原タンパク質が主として細胞性免疫を誘導するものである場合は、体液性免疫が誘導されにくくなる。
さらに、遺伝子免疫特有の問題点として、抗原タンパク質の遺伝子が動物への導入効率が悪いものである場合や、抗原タンパク質の遺伝子が動物体内での発現量が低いものである場合にも、抗原タンパク質の量が少なくなり、体液性免疫の応答が誘導されないことがある。
【０００７】
上記した遺伝子免疫の問題点を解決するために、各種の工夫が提案されている。例えば、ウロキナーゼに対する免疫応答を誘導する際に、ウロキナーゼ遺伝子を単独で投与するのではなく、膜貫通ドメインの遺伝子との融合遺伝子の形で投与することにより、ウロキナーゼに対する高い免疫応答を誘導し、ウロキナーゼに対する抗体を取得した例がある（特許文献１）。ここで得られた高い免疫応答は、融合遺伝子の発現産物である融合タンパク質において、ウロキナーゼ部分が強制的に細胞表面に配置されるために起こったと考えられる。
【０００８】
また、ワクチンの分野において、ヒートショックプロテインであるＨＳＰ７０をコードする遺伝子と抗原タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子（キメラ核酸）をＤＮＡワクチンとして使用した例がある（特許文献２）。この例では、結核菌由来ＨＳＰ７０をコードする遺伝子を使用している。しかしながら、この技術では、抗原特異的細胞性免疫（キラーＴ細胞）を誘導することはできたが、体液性免疫すなわち抗体産生は誘導されていない。一方で、結核菌由来ＨＳＰ７０と抗原タンパク質との融合タンパク質を免疫原として用いると、ＨＳＰ７０が好適なアジュバントとして機能し、抗原タンパク質に対する抗体産生が誘導されたという報告がある（特許文献３）。
これらのことは、ＨＳＰ７０と抗原タンパク質との融合タンパク質による免疫応答と、ＨＳＰ７０遺伝子と抗原タンパク質遺伝子との融合遺伝子による免疫応答とでは、抗原提示細胞での免疫応答機構が異なることを意味している。このように、ある抗原タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導したい場合に、その抗原タンパク質の遺伝子を用いて免疫しても、所望の免疫応答が誘導されるとは限らない。むしろ、抗原タンパク質に対する所望の免疫応答を誘導できない可能性の方が高いと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０２／０８４１６号
【特許文献２】国際公開第０１／２９２３３号
【特許文献３】国際公開第９４／２９４５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のように、遺伝子免疫には未知の部分が多く、なお試行錯誤の域を出ない。したがって、遺伝子免疫により所望の抗原タンパク質に対する抗体を作製するためには、抗原タンパク質の種類を問わずに再現性よく確実に体液性免疫の応答を誘導することができる技術が求められる。上記した現状に鑑み、本発明は、遺伝子免疫によって抗原タンパク質に対する抗体を作製する際に、より短期間かつ高効率で体液性免疫の応答を誘導することができる各種の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するための方策を種々検討した。その結果、細菌の鞭毛を構成するタンパク質であり、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptors、以下「ＴＬＲｓ」と略記する。）の一種でもあるフラジェリン（flagellin）をコードする遺伝子を利用することにより、所望の抗原タンパク質、特に膜タンパク質に対する体液性免疫の応答をより短期間かつ高効率で誘導できることを見出した。そして、この新たな知見を基礎として、新規の動物の免疫方法、抗体の製造方法等の一連の技術を確立し、本発明を完成した。すなわち、上記課題を解決するために提供される本発明は、以下のとおりである。
【００１２】
請求項１に記載の発明は、非ヒト動物を抗原で免疫することにより、前記非ヒト動物に所望の膜タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法であって、前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を非ヒト動物に投与することにより、当該非ヒト動物内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質に対する体液性免疫を誘導することを特徴とする動物の免疫方法である。
【００１３】
本発明の免疫方法は、遺伝子免疫に属するものであり、膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結してなる融合遺伝子を非ヒト動物に投与する。そして、当該非ヒト動物体内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質の全長又は一部にフラジェリンの全長又は一部を連結してなる融合タンパク質が合成される。その結果、当該膜タンパク質に対する体液性免疫が誘導される。本発明の動物の免疫方法によれば、膜タンパク質をコードする遺伝子を単独で投与しても体液性免疫の応答を誘導できない膜タンパク質であっても、フラジェリンのＴＬＲを介した抗原提示細胞の活性化によって体液性免疫の応答を誘導することができ、当該膜タンパク質に対する抗体を産生させることができる。
【００１４】
前記フラジェリンは、サルモネラ（Salmonella）属、エシェリヒア（Escherichia）属、ボルデテラ（Bordetella）属、シゲラ（Shigella）属、レジオネラ（Legionella）属、ブルクホルデリア（Burkholderia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ヘリコバクター（Helicobacter）属、ビブリオ（Vibrio）属、セラチア（Serratia）属、コーロバクター（Caulobacter）属、リステリア（Listeria）属、クロストリジウム（Clostridium）属、又はボレリア（Borrelia）属に属する微生物に由来するものであることが好ましい（請求項２）。
【００１５】
前記膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンカイネース型受容体、ＣＤ抗原、細胞接着分子、又は癌抗原であることが好ましい（請求項３）。
【００１６】
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、アヒル、又は七面鳥であることが好ましい（請求項４）。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法に使用され、非ヒト動物に投与される免疫用組成物であって、前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を含有することを特徴とする免疫用組成物である。
【００１８】
上記した本発明の動物の免疫方法を実施する場合には、前記融合遺伝子を適当な溶媒に溶かした組成物を調製し、当該組成物を動物に投与することができる。そして、本発明の免疫用組成物は本発明の動物の免疫方法に使用するための免疫用組成物であり、膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を含有する。本発明の免疫用組成物によれば、注射等の方法により前記融合遺伝子を動物に投与することができる。また、組成物中の前記融合遺伝子の濃度を調製することにより、融合遺伝子の投与量を正確に調節することができる。
【００１９】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から、前記膜タンパク質に対する抗体を取得することを特徴とする抗体の製造方法である。
【００２０】
本発明の抗体の製造方法は、本発明の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から膜タンパク質に対する抗体を採取するものである。本発明の抗体の製造方法によれば、精製法が確立されていない膜タンパク質、精製が困難な膜タンパク質、脂質膜に再構成することが困難な膜タンパク質、遺伝子のみ知られている未知の膜タンパク質、組換えＤＮＡ技術では遺伝子の発現量が少ない膜タンパク質等で、かつその遺伝子を単独で投与しても抗体が産生されない膜タンパク質であっても、それらに対する抗体を取得することができる。なお、動物の体液から抗体を取得する場合には、当該抗体はポリクローナルなものとなる。
【００２１】
請求項７に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から採取されたＢリンパ球と、ミエローマとを細胞融合し、前記膜タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマを取得することを特徴とするハイブリドーマの製造方法である。
【００２２】
本発明のハイブリドーマの製造方法においては、上記した本発明の動物の免疫方法により体液性免疫の応答を誘導された非ヒト動物から採取されたＢリンパ球と、ミエローマとを細胞融合することにより、膜タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマを作製する。かかる構成により、膜タンパク質自身あるいはその遺伝子を単独で投与しても抗体が産生されない膜タンパク質であっても、それに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００２３】
請求項８に記載の発明は、請求項７に記載のハイブリドーマの製造方法によって製造されたハイブリドーマから前記膜タンパク質に対する抗体を取得することを特徴とする抗体の製造方法である。
【００２４】
本発明の抗体の製造方法は、上記した本発明のハイブリドーマの製造方法によって製造されたハイブリドーマから前記膜タンパク質に対する抗体を取得する。かかる構成により、膜タンパク質自身あるいはその遺伝子を単独で投与しても抗体が産生されない膜タンパク質であっても、それに対する抗体（モノクローナル抗体）を取得することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の動物の免疫方法及び免疫用組成物によれば、遺伝子免疫を行う際に、その遺伝子を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができない膜タンパク質であっても、体液性免疫の応答を誘導することができる。
【００２６】
本発明の抗体の製造方法によれば、遺伝子免疫を行う際に、その遺伝子を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができない膜タンパク質であっても、当該膜タンパク質に対する抗体を製造することができる。
【００２７】
本発明のハイブリドーマの製造方法によれば、遺伝子免疫を行う際に、その遺伝子を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができない膜タンパク質であっても、当該膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】細胞表面におけるフラジェリン融合ｍＥＴＡＲの発現をフローサイトメーターで解析した図であり、（ａ）はフラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞、（ｂ）は２９３Ｔ細胞の場合を示す。
【図２】各遺伝子免疫群のマウスから採取したＴ細胞からのインターロイキン４（ＩＬ−４）分泌量を示すグラフである。
【図３】各遺伝子免疫群のマウスから採取したＴ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌量を示すグラフである。
【図４】各遺伝子免疫群のマウスから採取した血清の力価をフローサイトメーターで解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。まず実施形態の説明に先立ち、フラジェリンとＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）に関する一般的な説明を行う。
【００３０】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）は、微生物を検知することで、初期の自然免疫において重要な役割を果たしている。ＴＬＲｓは細胞表面やエンドソーム内に膜タンパク質として発現し、現在までにＴＬＲ１〜９までが同定されている。これらの受容体はpathogen-associated molecular pattern（ＰＡＭＰｓ）と呼ばれる病原微生物のみに高度に保存された構造モチーフを認識する。ＰＡＭＰｓにはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ペプチドグリカンやリポタンパク質、糖タンパク質、ウイルス由来の二本鎖ＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡなどが含まれる。ＰＡＭＰｓによるＴＬＲｓへの刺激によってＭｙＤ８８、ＴＲＩＦといったシグナル伝達カスケードが開始される（メジヒトフ・アール（Medzhitov R）ら，ネイチャー（Nature），１９９７年，第３８８巻，第６６４０号，ｐ．３９４−３９７）。これらのシグナル伝達カスケードはＡＰ−１、ＮＦ−κＢおよびＩＲＦといった転写因子の活性化を引き起こすことで炎症性サイトカインおよびエフェクターサイトカインの産生を誘導し、獲得免疫を導くとされる。またこれらのレセプターを介した自然免疫反応がＴ細胞反応を中心とする獲得免疫反応の誘導に重要であることも明らかになってきている（イシイ・ケー・ジェー（Ishii K. J.）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・イミュノロジー（Journal of Clinical Immunology），２００７年，第２７巻，ｐ．３６３−３７１）。
【００３１】
フラジェリン（flagellin）は、細菌の鞭毛のらせん状線維を構成する球状タンパク質である。フラジェリンの分子量は、その由来（菌種）によってかなり異なる（３万〜７万）。フラジェリンは、動物および植物の両方においてＴＬＲ５依存的炎症を誘導する。フラジェリンは、感染宿主への遊走と接着を促進することで細菌自身の病原性に重要な役割を果たしており、抗原特異的なＴ細胞への免疫応答にも関与していることが知られている。
【００３２】
ワクチンの分野において、フラジェリンを、抗原性を高めるアジュバントとして使用するという試みが行われている（特表２００７−５３５９２４号公報、国際公開第２００５／０４２５６４号）。またフラジェリンはＴＬＲ５のリガンドであり、マクロファージや樹状細胞等の抗原提示細胞上のＴＬＲ５に結合して活性化することがわかっている。またフラジェリンは、in vivoにおいてＴ細胞による免疫応答の増強を可能とする効果的なアジュバントであるということも報告されている（マクソーリー・エス．ジェー．（McSorley S. J.）ら，ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Journal of Immunology），２００２年，第１６９巻，ｐ．３９１４−３９１９）。ただし、これらの方法の有効性は可溶性抗原にのみ限定されたものであり、Ｇタンパク質共役型受容体をはじめとする膜タンパク質に関して、フラジェリンの作用を利用して体液性免疫を誘導した例はこれまでに報告されていない。
【００３３】
続いて、本発明の実施形態について説明する。なお、以下の説明において、特に断らない限り「膜タンパク質遺伝子」とは「膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子」を指すものとする。同様に、「フラジェリン遺伝子」とは「フラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子」を指すものとする。
【００３４】
本発明の動物の免疫方法は、非ヒト動物を抗原で免疫することにより、当該非ヒト動物に所望の膜タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導するものである。そして、本発明の動物の免疫方法では、「膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子」を非ヒト動物に投与することにより、当該非ヒト動物内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質に対する体液性免疫を誘導する。
【００３５】
本発明の動物の免疫方法においては、膜タンパク質の「全長」をコードする遺伝子と、膜タンパク質の「一部」をコードする遺伝子の両方が使用可能であり、目的に応じて使い分けることができる。膜タンパク質の全長をコードする遺伝子を用いる場合は、例えば、膜タンパク質が持つ複数のエピトープそれぞれに対する抗体や、膜タンパク質の立体構造を認識する抗体を産生させるのに好適である。一方、膜タンパク質の一部をコードする遺伝子を用いる場合は、例えば、特定のエピトープに対する抗体を産生させる際に好適である。
【００３６】
「膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子」（膜タンパク質遺伝子）と「フラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子」（フラジェリン遺伝子）との連結の態様としては、膜タンパク質遺伝子の３’末端とフラジェリン遺伝子の５’末端とが連結された態様と、膜タンパク質遺伝子の５’末端とフラジェリン遺伝子の３’末端とが連結された態様の両方が含まれる。また、スペーサー等の配列を介して膜タンパク質遺伝子とフラジェリン遺伝子とが間接的に連結されていてもよい。
【００３７】
さらに、膜タンパク質遺伝子の末端以外の箇所（すなわち内部）にフラジェリン遺伝子が「挿入」された態様も、本発明に含まれる。本態様は、膜タンパク質の一部をコードする遺伝子の末端にフラジェリン遺伝子の末端が連結されたものと解釈することもできる。同様に、フラジェリン遺伝子の末端以外の箇所（すなわち内部）に膜タンパク質遺伝子が「挿入」された態様も、本発明に含まれる。本態様は、フラジェリン遺伝子の一部をコードする遺伝子の末端に膜タンパク質遺伝子の末端が連結されたものと解釈することもできる。
【００３８】
「膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子」には、膜タンパク質遺伝子とフラジェリン遺伝子以外の遺伝子が含まれていてもよい。例えば、前記したスペーサーの様な介在配列の他、特定の機能等を持たせた配列を前記融合遺伝子の３’末端や５’末端に付加したり、内部に挿入することができる。
【００３９】
本発明で採用されるフラジェリンの種類（由来）は特に限定されず、いずれのフラジェリンであっても使用可能である。フラジェリンの由来の例としては、サルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）等のサルモネラ（Salmonella）属；大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア（Escherichia）属；百日咳菌（Bordetella pertussis）等のボルデテラ（Bordetella）属；赤痢菌等のシゲラ（Shigella）属；レジオネラ（Legionella）属；ブルクホルデリア（Burkholderia）属；シュードモナス（Pseudomonas）属；ヘリコバクター（Helicobacter）属；ビブリオ（Vibrio）属；セラチア（Serratia）属；コーロバクター（Caulobacter）属；リステリア（Listeria）属；クロストリジウム（Clostridium）属；ボレリア（Borrelia）属、等に属する微生物が挙げられる。
【００４０】
フラジェリンの一例として、サルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンについて説明する。サルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンは質量約５２ｋＤａのタンパク質である。サルモネラ・チフィリウムの鞭毛骨格は、当該フラジェリン同士が重合することで形成されている。サルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンの遺伝子は公知であり、その塩基配列も公知である（例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ＃Ｄ１３６８９；配列番号５）。例えば、配列番号５に示す塩基配列の情報を元にプライマーセットを設計し、サルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンの遺伝子を含む核酸（ゲノムＤＮＡ、ベクター、プラスミド等）を鋳型としてＰＣＲを行うことで、所望のフラジェリン遺伝子を取得することができる。また、化学合成によってサルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンの遺伝子を取得することもできる。
【００４１】
なお、本発明の動物の免疫方法における「フラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子」（フラジェリン遺伝子）には、天然のフラジェリンの全長をコードする遺伝子の他に、天然のフラジェリンに由来する同様の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。例としては、天然のフラジェリンをアミノ酸置換・挿入等により改変した変異型のフラジェリンをコードする遺伝子が挙げられる。他にも、天然型もしくは前記変異型フラジェリンの一部のドメインからなるタンパク質をコードする遺伝子や、さらには天然型もしくは変異型フラジェリンの一部のドメインを欠失させたタンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
【００４２】
本発明の動物の免疫方法で採用される膜タンパク質としては特に限定はない。例としては、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル型受容体、チロシンカイネース型受容体、ＣＤ抗原、細胞接着分子、癌抗原などが挙げられる。特に、ＧＰＣＲはヒトと非ヒト動物との種間相同性の高いものであり、医薬品開発に有用なタンパク質である。したがって、本発明の動物の免疫方法を用いてＧＰＣＲに対する抗体を取得することは、アッセイ系の構築や機能解析等に有用である。
【００４３】
ＧＰＣＲの例としては、エンドセリン受容体、ロドプシン、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アドレナリン受容体、アデノシン受容体、アンジオテンシン受容体、ドーパミン受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミン受容体、オピオイド受容体、ＧＡＢＡ受容体、ガストリン受容体、セロトニン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、嗅覚受容体、セクレチン受容体、ソマトスタチン受容体、ブラジキニン受容体、Ｃ−Ｃケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ガラニン受容体、ロイコトリエン受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、プロスタノイド受容体、オレキシン受容体等が挙げられる。
【００４４】
好ましい実施形態として、５’末端から膜タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列と細胞外ドメインをコードする遺伝子との間にフラジェリン遺伝子が挿入された融合遺伝子（５’−膜タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列−フラジェリン遺伝子−細胞外ドメインをコードする遺伝子−３’）、又は５’末端からＩｇκ リーダー配列等の外来シグナル配列をコードするＤＮＡ配列とフラジェリン遺伝子と膜タンパク質遺伝子もしくは膜タンパク質の細胞外ドメインをコードする遺伝子の融合遺伝子（５’−外来シグナル配列をコードするＤＮＡ配列−フラジェリン遺伝子−膜タンパク質遺伝子もしくは膜タンパク質の細胞外ドメインをコードする遺伝子−３’）の使用が挙げられる。かかる構成により、融合遺伝子を発現させたときに細胞膜上にフラジェリンが提示されることとなり、ＴＬＲ５を発現しているマクロファージや樹状細胞を賦活化することができる。
【００４５】
本発明の動物の免疫方法で用いる非ヒト動物としては特に限定はないが、取扱いの容易さの点で、哺乳類と鳥類が好ましく用いられる。哺乳類の例としては、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を挙げることができる。また、鳥類の例としては、ニワトリ、アヒル又は七面鳥を挙げることができる。
【００４６】
本発明の動物の免疫方法においては、融合遺伝子が発現ベクターに組み込まれており、その発現がプロモーターにより調節されている実施形態が好ましい。かかる構成により、融合遺伝子の動物体内における発現が確実となり、体液性免疫の誘導がより確実に行われる。
発現ベクターとしては、動物細胞内で複製可能な発現ベクターであればよく、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ、ｐＴｒｉＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶ等の発現ベクターを挙げることができる。
また、発現ベクター上のプロモーターは、動物細胞内で機能するものであればよい。例えば、サイトメガロウイルス（Cytomegarovirus、ＣＭＶ）のＣＭＶプロモーター；アデノウイルス後期（Adenovirus Major Late、ＡＭＬ）のＡＭＬプロモーター；シミアンウイルス４０（Simian Virus 40、ＳＶ４０）のＳＶ４０プロモーター；ＳＶ４０およびＨＴＬＶ−１ ＬＴＲの融合プロモーターであるＳＲαプロモーター；伸長因子（Elongation Factor、ＥＦ）のＥＦ−１αプロモーター、等が挙げられる。
【００４７】
さらに発現ベクターにはプロモーター活性を増強するエンハンサーを含むものでもよい。さらに、発現ベクターにはＣｐＧモチーフが含まれていてもよい。当該ＣｐＧモチーフは発現ベクター上のどの位置にあってもよく、さらに、１箇所のみでもよいし、複数個所でもよい。
【００４８】
本発明の動物の免疫方法における融合遺伝子の投与方法としては特に限定はなく、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等の公知の手法によって行うことができる。パーティクルガンによる投与も適用可能である。また融合遺伝子の投与量は、用いる発現ベクターやプロモーターの種類等に応じて適宜決定すればよいが、目安としては、１回当たりおおむね１〜３ｍｇ／ｋｇ体重で、これはマウスの場合は２５〜１００μｇ／回になる。また投与の回数は１回でもよいが、一定間隔をおいて複数回行う方がより高い体液性免疫の応答を誘導することができる。
【００４９】
次に、本発明の免疫用組成物について説明する。本発明の免疫用組成物は、本発明の動物の免疫方法に使用され、非ヒト動物に投与されるものであり、膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を含有する。本発明の免疫用組成物の代表的な形状としては、等張液に当該融合遺伝子を溶解させたものである。等張液の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。その他、溶媒には各種の緩衝液を用いることもできる。また、抗体産生能を上昇させるために、Ｍｇ2+等の金属イオンを等張液に添加することも効果的である。さらに、体液性免疫を誘導するＴH２ヘルパーＴ細胞の分化を誘導するようなサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−４を等張液に添加したり、またそれらのサイトカインをコードする遺伝子を添加したりすることも、抗体産生能を上昇させるためには効果的である。さらには、抗体産生の主役であるＢ細胞の活性化、分裂、抗体産生細胞への分化を誘導するサイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０又はそれらをコードする遺伝子を等張液に添加することで、抗体産生を高めることも可能である。本発明の免疫用組成物における融合遺伝子の濃度は例えば、１０〜５００μｇ／ｍＬ程度である。
【００５０】
さらに、本発明の免疫用組成物には、ＣｐＧモチーフからなるオリゴヌクレオチドを含むものでもよい。この場合、当該オリゴヌクレオチドはアジュバントとして機能し、より高い免疫応答を誘導するためのワクチンとしても用いることができる。
【００５１】
次に、本発明の抗体の製造方法について説明する。本発明の抗体の製造方法は２つの様相を含む。１つの様相は、本発明の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から、膜タンパク質に対する抗体を取得するものである。具体例を挙げると、免疫後の動物から定期的に部分採血を行って抗体価を測定し、抗体の産生状態をモニターする。そして、抗体価が最大に達した時点で全採血を行い、血清を調製する。そして、得られた血清から抗体を得る。この際、得られる抗体はポリクローナル抗体である。また、血清から抗体を単離・精製する方法としては、一般に抗体の精製に用いられている方法を使用することができ、例えば、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーを用いることができる。
本発明の抗体の製造方法における他の様相については、後で述べる。
【００５２】
次に、本発明のハイブリドーマの製造方法について説明する。本発明のハイブリドーマの製造方法は、本発明の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から採取されたＢリンパ球と、ミエローマとを細胞融合し、膜タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマを取得するものである。細胞融合、ハイブリドーマの選抜及びクローニングについては、公知の方法をそのまま使用することができる。例えば、細胞融合はケーラーとミルシュタインの方法により行うことができる。また、ハイブリドーマの選抜は、ＨＡＴ選択培地を用いた培養により行うことができる。さらに、ハイブリドーマのクローニングは限界希釈法により行うことができる。
【００５３】
このようにしてクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、膜タンパク質に対する抗体（モノクローナル抗体）を製造することができる。すなわち、本発明の抗体の製造方法における他の様相は、本発明のハイブリドーマ製造方法によって製造されたハイブリドーマから膜タンパク質に対する抗体を取得するものである。例えば、当該ハイブリドーマを培養し、その培養物から所望の抗体を取得することができる。ハイブリドーマの培養は、マウス等の動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。マウス等の動物の腹腔内でハイブリドーマを培養した場合は、腹水を採取し、その腹水から抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養した場合は、その培養液から抗体を単離・精製することができる。抗体を精製する方法としては、サブクラスがＩｇＧの抗体の場合は、例えば、上記したプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって行うことができる。
【実施例】
【００５４】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００５５】
（１）マウス由来エンドセリンＡ受容体（ｍＥＴＡＲ）遺伝子の単離・調製
モデル抗原タンパク質としてマウス由来エンドセリンＡ受容体（ｍＥＴＡＲ）（ＮＭ＿０１０３３２．２）の遺伝子を、マウス肺ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するｍＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ａ）を得た。ＤＮＡ断片Ａには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端に２個の終止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＳａｌＩサイトが導入された。また、前記マウス肺ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号２及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、シグナル配列（ｓ．ｓ．）を除いたｍＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ、ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．））を得た。ＤＮＡ断片Ｂ（ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．））には、プライマーに由来して、５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩサイト、３'末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＳａｌＩサイトが導入された。
【００５６】
（２）フラジェリン遺伝子の調製
配列番号５に示す塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ＃Ｄ１３６８９の情報より入手）を有するサルモネラ・チフィリウム由来フラジェリン遺伝子（ＦｌｉＣ）の、５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ及び配列番号３に示すｍＥＴＡＲ由来のシグナル配列（ｓ．ｓ．）、さらには配列番号６に示すｆｌａｇタグ配列の遺伝子が導入され、３'末端にはＳａｌＩサイトが導入された遺伝子（以下、「ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ」と称する。）を合成した。ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣをサブクローンニング用ベクターｐＵＣ５７へ組み込み、プラスミドｐＵＣ５７−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣを得た。
【００５７】
（３）マウス由来エンドセリンＡ受容体にフラジェリンが連結された融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターｐＣＩ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲを得た。さらに、ベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲをＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を構築した。さらにｐＣＩ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）および上記（２）で調製したｐＵＣ５７−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣをＮｏｔＩとＮｈｅＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣを挿入し、ｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）は、ｍＥＴＡＲ遺伝子の５’末端にフラジェリン遺伝子が連結されてなる融合遺伝子を有している。一方、ベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲはｍＥＴＡＲ遺伝子のみを有している。
【００５８】
（４）マウス由来エンドセリンＡ受容体の安定発現細胞の作製
（３）で構築したベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲをＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、ｐＣＩｎｅｏ（プロメガ社）のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイトに導入し、ベクターｐＣＩｎｅｏ−ｍＥＴＡＲを構築した。
【００５９】
リポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（インビトロジェン社）溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ギブコ社）培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｍＥＴＡＲを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｍＥＴＡＲを２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＤＳファーマ社）に導入した。遺伝子が導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ'ｓＦ１２Ｋ（和光純薬社）＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０5個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ'ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、抗生物質耐性細胞をクローニングした。
【００６０】
（５）ｆｌａｇ−Ｆｌｉｃ−ｍＥＴＡＲの細胞表面発現
ベクターｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を、リポフェクタミン２０００を用いて２９３Ｔ細胞（ＤＳファーマ社）に導入した（以下、「遺伝子導入２９３Ｔ細胞」と称する。）。この遺伝子導入２９３Ｔ細胞をＭｅｍ−α（和光純薬社）＋１０％ＦＢＳ培地にて４８時間培養した。培養した細胞を剥離・回収後、ＰＢＳで洗浄し、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シグマ社）を一次抗体として添加し、室温にて反応させた。さらに細胞をＰＢＳで洗浄し、二次抗体にフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を用いて、遺伝子導入２９３Ｔ細胞の細胞膜上における「ｍＥＴＡＲ遺伝子にフラジェリン遺伝子を連結させてなる融合遺伝子」（フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ）の発現を解析した。対照として、遺伝子を導入していない宿主のみの２９３Ｔ細胞でも同様の条件で測定した。結果を図１に示す。
【００６１】
図１（ａ）に示す様に、遺伝子導入２９３Ｔ細胞ではフィコエリスリン由来の蛍光が検出された。一方、図１（ｂ）に示す様に、対照の２９３Ｔ細胞ではフィコエリスリン由来の蛍光がほとんど検出されなかった。このことから、遺伝子導入２９３Ｔ細胞において、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲが細胞膜上で発現していることが示された。
【００６２】
（６）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を５００μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃ（雌）の両足大腿筋に各０．１０ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を両足に各５０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり１００μｇ投与した。その後、７日目、２１日目及び２８日目にも同様して繰り返し免疫した。そして、０、２１、２８日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、ベクターを含まないＰＢＳのみを投与したマウス（対照Ａ）と、ｍＥＴＡＲを単独で発現するベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲを投与したマウス（対照Ｂ）を使って評価した。
【００６３】
（７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ 測定
（６）で免疫したマウスのリンパ球が体液性免疫を誘導しているのかを調べるために、Ｔ細胞を単離して体液性免疫を誘導するサイトカインＩＬ−４を測定した。具体的には、（６）で免疫したマウスの脾臓とリンパ節からＭＡＣＳ ＣＤ４ビーズ（ミルテニーバイオテック社）を使い、ＣＤ４+Ｔ細胞をソーティングした。単離したＣＤ４+Ｔ細胞を２×１０6個／ｍＬになるようにＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社）＋１０％ＦＢＳで懸濁しておき、あらかじめ抗αβＴＣＲ抗体（ベクトンディッキンソン社）を３０μｇ／ｍＬでコーティングしたプレートに添加し、細胞を刺激した。ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２４時間培養し、培養上清を回収した。
【００６４】
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ベクトンディッキンソン社）を用いて２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＩＬ−４抗体をＥＬＩＳＡプレートに播き、４℃にて固相化した。ＰＢＳとＴｗｅｅｎ２０が混合されている洗浄液（ＰＢＳＴ）にて洗浄後、ブロッキング溶液（ナカライテスク社）を加えて室温にてブロッキングを行った。ＰＢＳＴにて洗浄後、（７）で回収した培養上清を加え、室温にて反応させた。さらにＰＢＳＴで洗浄し、１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識抗ＩＬ−４抗体を添加した。室温にて反応後、ＰＢＳＴにて洗浄を行い、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを加えてさらに反応を行った。最後に、ＰＢＳＴで洗浄操作の後、ＴＭＢ（ベチル社）を添加して比色反応を行った。その後、１Ｎの硫酸（和光純薬社）にて反応を停止させた。その後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社）にて４５０ｎｍの波長でＩＬ−４を測定した（図２）。
【００６５】
図２に示す様に、ＰＢＳのみを投与したマウス（対照Ａ）のＴ細胞ではＩＬ−４がほとんど分泌されなかった。また、ｍＥＴＡＲ遺伝子のみを投与したマウス（対照Ｂ）のＴ細胞からもＩＬ−４は非常に少ない量しか分泌されなかった。これに対し、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を投与したマウスのＴ細胞からはＩＬ−４が分泌されていた。これは、フラジェリンが体液性免疫を誘導することを示していた。
【００６６】
上記の操作でＩＬ−４にかえてＩＦＮ−γを測定した（図３）。図３に示す様に、ＰＢＳのみを投与したマウス（対照Ａ）のＴ細胞ではＩＦＮ−γがほとんど分泌されなかった。また、ｍＥＴＡＲ遺伝子のみを投与したマウス（対照Ｂ）のＴ細胞からもＩＦＮ−γは非常に少ない量しか分泌されなかった。これに対し、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を投与したマウスのＴ細胞からはＩＦＮ−γが分泌されていた。これは、フラジェリンがＴ細胞よりＩＦＮ−γの分泌を誘導することを示していた。
【００６７】
（９）フローサイトメトリーによるｍＥＴＡＲに対する血清中抗体結合性評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｍＥＴＡＲが導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｍＥＴＡＲ遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞」と称する。）、及びｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞」と称する。）をＰＢＳで洗浄した。免疫後４２日目の血清を１００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒにて各細胞と血清中の抗ｍＥＴＡＲ抗体との相互作用を解析した。結果を図４に示す。
【００６８】
図４に示す様に、ｍＥＴＡＲ遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合、遺伝子免疫前のマウスからの血清、ＰＢＳ投与マウス（対照Ａ）からの血清、及びｍＥＴＡＲ遺伝子投与マウス（対照Ｂ）からの血清のいずれからも、フィコエリスリン由来の蛍光は検出されなかった。これは、対照Ａと対照Ｂのマウスにおいて、ｍＥＴＡＲに対する体液性免疫が誘導されていないことを示していた。一方、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を投与したマウスの血清からはフィコエリスリン由来の蛍光が検出された。これは、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を投与したマウスが抗ｍＥＴＡＲ抗体を産生し、当該抗ｍＥＴＡＲ抗体がｍＥＴＡＲ遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合することを示していた。
【００６９】
なお、対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合は、いずれのマウスの血清でもフィコエリスリン由来の蛍光が検出されなかった。これは、前記抗ｍＥＴＡＲ抗体が対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合しないことを示していた。
以上のことから、ベクターｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）による遺伝子免疫によって、マウス血清中にｍＥＴＡＲの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、並びに、ハイブリドーマの製造方法に関し、さらに詳細には、膜タンパク質をコードする遺伝子とフラジェリンをコードする遺伝子との融合遺伝子を非ヒト動物に投与して体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法、当該免疫方法に使用するための免疫用組成物、当該免疫方法を用いた抗体の製造方法、当該免疫方法により免疫された非ヒト動物のＢリンパ球とミエローマとを細胞融合するハイブリドーマの製造方法、並びに、当該ハイブリドーマを用いた抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は体液性免疫の主役であり、感作リンパ球とともに生体防御機構の重要な役割を担っている。一方で、抗体は、その抗原との特異的親和性を利用した各種の技術、例えば、アフィニティクロマトグラフィーや免疫測定法等にも頻繁に利用されている。すなわち、抗体は特定の抗原に対して特異的に強く結合するので、特定の抗原を同定・定量したり、さらには機能未知なタンパク質に対する解析ツールとして有用である。このような目的で、抗体は臨床検査やバイオテクノロジーの分野において幅広く用いられている。
【０００３】
特定の抗原に対する抗体を作製する代表的な方法は、抗原となる所望のタンパク質を動物に投与して体液性免疫を誘導し、当該動物の体液から抗血清を採取することである。すなわち、動物に投与する（免疫する）免疫原として、抗原タンパク質そのものを使用する。この際に免疫原として使用する抗原タンパク質としては、例えば、生体試料等から単離・精製されたものを使用する。また、組換えＤＮＡ技術を用いて取得した組換え型の抗原タンパク質や、抗原タンパク質の一部に対応するペプチドを化学的に合成し、それを免疫原として動物に投与することも行われている。
【０００４】
一方、抗原タンパク質そのものではなく、その抗原タンパク質をコードする遺伝子を免疫原として使用する遺伝子免疫と呼ばれる技術がある。遺伝子免疫を行う場合は、例えば、抗原タンパク質をコードする遺伝子を適宜の発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを動物に接種する。すると、発現ベクターに組み込まれた遺伝子が動物体内で発現し、抗原タンパク質が合成される。その結果、動物体内で合成された抗原タンパク質により免疫応答が誘導される。
【０００５】
上記のように、特定の抗原に対する抗体を作製する技術は多様であり、目的に応じて選択することができる。例えば、以下のような場合には遺伝子免疫が適当である。
まず、遺伝子免疫によれば、抗原タンパク質をコードする遺伝子さえ単離されておれば免疫を行うことができ、抗原タンパク質を単離・精製する必要がない。したがって遺伝子免疫は、抗原タンパク質の調製作業を省略して工程を簡略化したい場合や、精製法が確立されていない抗原タンパク質、精製が困難な抗原タンパク質、遺伝子のみ知られている未知の抗原タンパク質などに対する抗体を作製したい場合に適している。
また、タンパク質が生体内で機能を発揮するためには正しい立体構造を形成することが必要であるが、遺伝子免疫は、タンパク質における正しい立体構造を認識する抗体を取得したい場合に適している。すなわち遺伝子免疫では、動物に投与された遺伝子が生体内にて転写・翻訳されるので、高次構造をもつ抗原タンパク質に対する抗体を取得するのに有用である。
さらに、遺伝子免疫の場合は、動物体内で遺伝子が発現して合成される抗原タンパク質の量が、抗原タンパク質を直接投与する場合に必要な量と比較して格段に少なくても免疫応答を誘導できるという利点もある。さらに、組換えＤＮＡ技術によって抗原タンパク質を調製することが困難な場合等であっても、従来の方法のようにペプチド抗原を別途化学合成する必要がなく、遺伝子の全長を動物に導入するだけでよいという利点もある。
【０００６】
上記のように、遺伝子免疫は従来の方法にはない利点を有するが、抗原タンパク質の種類によっては体液性免疫の応答が誘導されず、抗体が産生されない場合がある。
例えば、抗原タンパク質が、免疫した動物が内在的に有するタンパク質と極めて相同性が高いものである場合は、動物体内でその抗原タンパク質が合成されても異物として認識されないため、体液性免疫の応答が誘導されないことがある。
また、抗原タンパク質がその動物体内で不安定なものである場合、動物体内における抗原タンパク質の量が少なくなり、体液性免疫の応答が誘導されないことがある。また、抗原タンパク質が主として細胞性免疫を誘導するものである場合は、体液性免疫が誘導されにくくなる。
さらに、遺伝子免疫特有の問題点として、抗原タンパク質の遺伝子が動物への導入効率が悪いものである場合や、抗原タンパク質の遺伝子が動物体内での発現量が低いものである場合にも、抗原タンパク質の量が少なくなり、体液性免疫の応答が誘導されないことがある。
【０００７】
上記した遺伝子免疫の問題点を解決するために、各種の工夫が提案されている。例えば、ウロキナーゼに対する免疫応答を誘導する際に、ウロキナーゼ遺伝子を単独で投与するのではなく、膜貫通ドメインの遺伝子との融合遺伝子の形で投与することにより、ウロキナーゼに対する高い免疫応答を誘導し、ウロキナーゼに対する抗体を取得した例がある（特許文献１）。ここで得られた高い免疫応答は、融合遺伝子の発現産物である融合タンパク質において、ウロキナーゼ部分が強制的に細胞表面に配置されるために起こったと考えられる。
【０００８】
また、ワクチンの分野において、ヒートショックプロテインであるＨＳＰ７０をコードする遺伝子と抗原タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子（キメラ核酸）をＤＮＡワクチンとして使用した例がある（特許文献２）。この例では、結核菌由来ＨＳＰ７０をコードする遺伝子を使用している。しかしながら、この技術では、抗原特異的細胞性免疫（キラーＴ細胞）を誘導することはできたが、体液性免疫すなわち抗体産生は誘導されていない。一方で、結核菌由来ＨＳＰ７０と抗原タンパク質との融合タンパク質を免疫原として用いると、ＨＳＰ７０が好適なアジュバントとして機能し、抗原タンパク質に対する抗体産生が誘導されたという報告がある（特許文献３）。
これらのことは、ＨＳＰ７０と抗原タンパク質との融合タンパク質による免疫応答と、ＨＳＰ７０遺伝子と抗原タンパク質遺伝子との融合遺伝子による免疫応答とでは、抗原提示細胞での免疫応答機構が異なることを意味している。このように、ある抗原タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導したい場合に、その抗原タンパク質の遺伝子を用いて免疫しても、所望の免疫応答が誘導されるとは限らない。むしろ、抗原タンパク質に対する所望の免疫応答を誘導できない可能性の方が高いと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０２／０８４１６号
【特許文献２】国際公開第０１／２９２３３号
【特許文献３】国際公開第９４／２９４５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のように、遺伝子免疫には未知の部分が多く、なお試行錯誤の域を出ない。したがって、遺伝子免疫により所望の抗原タンパク質に対する抗体を作製するためには、抗原タンパク質の種類を問わずに再現性よく確実に体液性免疫の応答を誘導することができる技術が求められる。上記した現状に鑑み、本発明は、遺伝子免疫によって抗原タンパク質に対する抗体を作製する際に、より短期間かつ高効率で体液性免疫の応答を誘導することができる各種の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するための方策を種々検討した。その結果、細菌の鞭毛を構成するタンパク質であり、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptors、以下「ＴＬＲｓ」と略記する。）の一種でもあるフラジェリン（flagellin）をコードする遺伝子を利用することにより、所望の抗原タンパク質、特に膜タンパク質に対する体液性免疫の応答をより短期間かつ高効率で誘導できることを見出した。そして、この新たな知見を基礎として、新規の動物の免疫方法、抗体の製造方法等の一連の技術を確立し、本発明を完成した。すなわち、上記課題を解決するために提供される本発明は、以下のとおりである。
【００１２】
請求項１に記載の発明は、非ヒト動物を抗原で免疫することにより、前記非ヒト動物に所望の膜タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法であって、前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を非ヒト動物に投与することにより、当該非ヒト動物内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質に対する体液性免疫を誘導することを特徴とする動物の免疫方法である。
【００１３】
本発明の免疫方法は、遺伝子免疫に属するものであり、膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結してなる融合遺伝子を非ヒト動物に投与する。そして、当該非ヒト動物体内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質の全長又は一部にフラジェリンの全長又は一部を連結してなる融合タンパク質が合成される。その結果、当該膜タンパク質に対する体液性免疫が誘導される。本発明の動物の免疫方法によれば、膜タンパク質をコードする遺伝子を単独で投与しても体液性免疫の応答を誘導できない膜タンパク質であっても、フラジェリンのＴＬＲを介した抗原提示細胞の活性化によって体液性免疫の応答を誘導することができ、当該膜タンパク質に対する抗体を産生させることができる。
【００１４】
前記フラジェリンは、サルモネラ（Salmonella）属、エシェリヒア（Escherichia）属、ボルデテラ（Bordetella）属、シゲラ（Shigella）属、レジオネラ（Legionella）属、ブルクホルデリア（Burkholderia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ヘリコバクター（Helicobacter）属、ビブリオ（Vibrio）属、セラチア（Serratia）属、コーロバクター（Caulobacter）属、リステリア（Listeria）属、クロストリジウム（Clostridium）属、又はボレリア（Borrelia）属に属する微生物に由来するものであることが好ましい（請求項２）。
【００１５】
前記膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンカイネース型受容体、ＣＤ抗原、細胞接着分子、又は癌抗原であることが好ましい（請求項３）。
【００１６】
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、アヒル、又は七面鳥であることが好ましい（請求項４）。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法に使用され、非ヒト動物に投与される免疫用組成物であって、前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を含有することを特徴とする免疫用組成物である。
【００１８】
上記した本発明の動物の免疫方法を実施する場合には、前記融合遺伝子を適当な溶媒に溶かした組成物を調製し、当該組成物を動物に投与することができる。そして、本発明の免疫用組成物は本発明の動物の免疫方法に使用するための免疫用組成物であり、膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を含有する。本発明の免疫用組成物によれば、注射等の方法により前記融合遺伝子を動物に投与することができる。また、組成物中の前記融合遺伝子の濃度を調製することにより、融合遺伝子の投与量を正確に調節することができる。
【００１９】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から、前記膜タンパク質に対する抗体を取得することを特徴とする抗体の製造方法である。
【００２０】
本発明の抗体の製造方法は、本発明の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から膜タンパク質に対する抗体を採取するものである。本発明の抗体の製造方法によれば、精製法が確立されていない膜タンパク質、精製が困難な膜タンパク質、脂質膜に再構成することが困難な膜タンパク質、遺伝子のみ知られている未知の膜タンパク質、組換えＤＮＡ技術では遺伝子の発現量が少ない膜タンパク質等で、かつその遺伝子を単独で投与しても抗体が産生されない膜タンパク質であっても、それらに対する抗体を取得することができる。なお、動物の体液から抗体を取得する場合には、当該抗体はポリクローナルなものとなる。
【００２１】
請求項７に記載の発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から採取されたＢリンパ球と、ミエローマとを細胞融合し、前記膜タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマを取得することを特徴とするハイブリドーマの製造方法である。
【００２２】
本発明のハイブリドーマの製造方法においては、上記した本発明の動物の免疫方法により体液性免疫の応答を誘導された非ヒト動物から採取されたＢリンパ球と、ミエローマとを細胞融合することにより、膜タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマを作製する。かかる構成により、膜タンパク質自身あるいはその遺伝子を単独で投与しても抗体が産生されない膜タンパク質であっても、それに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００２３】
請求項８に記載の発明は、請求項７に記載のハイブリドーマの製造方法によって製造されたハイブリドーマから前記膜タンパク質に対する抗体を取得することを特徴とする抗体の製造方法である。
【００２４】
本発明の抗体の製造方法は、上記した本発明のハイブリドーマの製造方法によって製造されたハイブリドーマから前記膜タンパク質に対する抗体を取得する。かかる構成により、膜タンパク質自身あるいはその遺伝子を単独で投与しても抗体が産生されない膜タンパク質であっても、それに対する抗体（モノクローナル抗体）を取得することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の動物の免疫方法及び免疫用組成物によれば、遺伝子免疫を行う際に、その遺伝子を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができない膜タンパク質であっても、体液性免疫の応答を誘導することができる。
【００２６】
本発明の抗体の製造方法によれば、遺伝子免疫を行う際に、その遺伝子を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができない膜タンパク質であっても、当該膜タンパク質に対する抗体を製造することができる。
【００２７】
本発明のハイブリドーマの製造方法によれば、遺伝子免疫を行う際に、その遺伝子を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができない膜タンパク質であっても、当該膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】細胞表面におけるフラジェリン融合ｍＥＴＡＲの発現をフローサイトメーターで解析した図であり、（ａ）はフラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞、（ｂ）は２９３Ｔ細胞の場合を示す。
【図２】各遺伝子免疫群のマウスから採取したＴ細胞からのインターロイキン４（ＩＬ−４）分泌量を示すグラフである。
【図３】各遺伝子免疫群のマウスから採取したＴ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌量を示すグラフである。
【図４】各遺伝子免疫群のマウスから採取した血清の力価をフローサイトメーターで解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。まず実施形態の説明に先立ち、フラジェリンとＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）に関する一般的な説明を行う。
【００３０】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）は、微生物を検知することで、初期の自然免疫において重要な役割を果たしている。ＴＬＲｓは細胞表面やエンドソーム内に膜タンパク質として発現し、現在までにＴＬＲ１〜９までが同定されている。これらの受容体はpathogen-associated molecular pattern（ＰＡＭＰｓ）と呼ばれる病原微生物のみに高度に保存された構造モチーフを認識する。ＰＡＭＰｓにはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ペプチドグリカンやリポタンパク質、糖タンパク質、ウイルス由来の二本鎖ＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡなどが含まれる。ＰＡＭＰｓによるＴＬＲｓへの刺激によってＭｙＤ８８、ＴＲＩＦといったシグナル伝達カスケードが開始される（メジヒトフ・アール（Medzhitov R）ら，ネイチャー（Nature），１９９７年，第３８８巻，第６６４０号，ｐ．３９４−３９７）。これらのシグナル伝達カスケードはＡＰ−１、ＮＦ−κＢおよびＩＲＦといった転写因子の活性化を引き起こすことで炎症性サイトカインおよびエフェクターサイトカインの産生を誘導し、獲得免疫を導くとされる。またこれらのレセプターを介した自然免疫反応がＴ細胞反応を中心とする獲得免疫反応の誘導に重要であることも明らかになってきている（イシイ・ケー・ジェー（Ishii K. J.）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・イミュノロジー（Journal of Clinical Immunology），２００７年，第２７巻，ｐ．３６３−３７１）。
【００３１】
フラジェリン（flagellin）は、細菌の鞭毛のらせん状線維を構成する球状タンパク質である。フラジェリンの分子量は、その由来（菌種）によってかなり異なる（３万〜７万）。フラジェリンは、動物および植物の両方においてＴＬＲ５依存的炎症を誘導する。フラジェリンは、感染宿主への遊走と接着を促進することで細菌自身の病原性に重要な役割を果たしており、抗原特異的なＴ細胞への免疫応答にも関与していることが知られている。
【００３２】
ワクチンの分野において、フラジェリンを、抗原性を高めるアジュバントとして使用するという試みが行われている（特表２００７−５３５９２４号公報、国際公開第２００５／０４２５６４号）。またフラジェリンはＴＬＲ５のリガンドであり、マクロファージや樹状細胞等の抗原提示細胞上のＴＬＲ５に結合して活性化することがわかっている。またフラジェリンは、in vivoにおいてＴ細胞による免疫応答の増強を可能とする効果的なアジュバントであるということも報告されている（マクソーリー・エス．ジェー．（McSorley S. J.）ら，ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Journal of Immunology），２００２年，第１６９巻，ｐ．３９１４−３９１９）。ただし、これらの方法の有効性は可溶性抗原にのみ限定されたものであり、Ｇタンパク質共役型受容体をはじめとする膜タンパク質に関して、フラジェリンの作用を利用して体液性免疫を誘導した例はこれまでに報告されていない。
【００３３】
続いて、本発明の実施形態について説明する。なお、以下の説明において、特に断らない限り「膜タンパク質遺伝子」とは「膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子」を指すものとする。同様に、「フラジェリン遺伝子」とは「フラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子」を指すものとする。
【００３４】
本発明の動物の免疫方法は、非ヒト動物を抗原で免疫することにより、当該非ヒト動物に所望の膜タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導するものである。そして、本発明の動物の免疫方法では、「膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子」を非ヒト動物に投与することにより、当該非ヒト動物内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質に対する体液性免疫を誘導する。
【００３５】
本発明の動物の免疫方法においては、膜タンパク質の「全長」をコードする遺伝子と、膜タンパク質の「一部」をコードする遺伝子の両方が使用可能であり、目的に応じて使い分けることができる。膜タンパク質の全長をコードする遺伝子を用いる場合は、例えば、膜タンパク質が持つ複数のエピトープそれぞれに対する抗体や、膜タンパク質の立体構造を認識する抗体を産生させるのに好適である。一方、膜タンパク質の一部をコードする遺伝子を用いる場合は、例えば、特定のエピトープに対する抗体を産生させる際に好適である。
【００３６】
「膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子」（膜タンパク質遺伝子）と「フラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子」（フラジェリン遺伝子）との連結の態様としては、膜タンパク質遺伝子の３’末端とフラジェリン遺伝子の５’末端とが連結された態様と、膜タンパク質遺伝子の５’末端とフラジェリン遺伝子の３’末端とが連結された態様の両方が含まれる。また、スペーサー等の配列を介して膜タンパク質遺伝子とフラジェリン遺伝子とが間接的に連結されていてもよい。
【００３７】
さらに、膜タンパク質遺伝子の末端以外の箇所（すなわち内部）にフラジェリン遺伝子が「挿入」された態様も、本発明に含まれる。本態様は、膜タンパク質の一部をコードする遺伝子の末端にフラジェリン遺伝子の末端が連結されたものと解釈することもできる。同様に、フラジェリン遺伝子の末端以外の箇所（すなわち内部）に膜タンパク質遺伝子が「挿入」された態様も、本発明に含まれる。本態様は、フラジェリン遺伝子の一部をコードする遺伝子の末端に膜タンパク質遺伝子の末端が連結されたものと解釈することもできる。
【００３８】
「膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子」には、膜タンパク質遺伝子とフラジェリン遺伝子以外の遺伝子が含まれていてもよい。例えば、前記したスペーサーの様な介在配列の他、特定の機能等を持たせた配列を前記融合遺伝子の３’末端や５’末端に付加したり、内部に挿入することができる。
【００３９】
本発明で採用されるフラジェリンの種類（由来）は特に限定されず、いずれのフラジェリンであっても使用可能である。フラジェリンの由来の例としては、サルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）等のサルモネラ（Salmonella）属；大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア（Escherichia）属；百日咳菌（Bordetella pertussis）等のボルデテラ（Bordetella）属；赤痢菌等のシゲラ（Shigella）属；レジオネラ（Legionella）属；ブルクホルデリア（Burkholderia）属；シュードモナス（Pseudomonas）属；ヘリコバクター（Helicobacter）属；ビブリオ（Vibrio）属；セラチア（Serratia）属；コーロバクター（Caulobacter）属；リステリア（Listeria）属；クロストリジウム（Clostridium）属；ボレリア（Borrelia）属、等に属する微生物が挙げられる。
【００４０】
フラジェリンの一例として、サルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンについて説明する。サルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンは質量約５２ｋＤａのタンパク質である。サルモネラ・チフィリウムの鞭毛骨格は、当該フラジェリン同士が重合することで形成されている。サルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンの遺伝子は公知であり、その塩基配列も公知である（例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ＃Ｄ１３６８９；配列番号５）。例えば、配列番号５に示す塩基配列の情報を元にプライマーセットを設計し、サルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンの遺伝子を含む核酸（ゲノムＤＮＡ、ベクター、プラスミド等）を鋳型としてＰＣＲを行うことで、所望のフラジェリン遺伝子を取得することができる。また、化学合成によってサルモネラ・チフィリウム由来フラジェリンの遺伝子を取得することもできる。
【００４１】
なお、本発明の動物の免疫方法における「フラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子」（フラジェリン遺伝子）には、天然のフラジェリンの全長をコードする遺伝子の他に、天然のフラジェリンに由来する同様の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。例としては、天然のフラジェリンをアミノ酸置換・挿入等により改変した変異型のフラジェリンをコードする遺伝子が挙げられる。他にも、天然型もしくは前記変異型フラジェリンの一部のドメインからなるタンパク質をコードする遺伝子や、さらには天然型もしくは変異型フラジェリンの一部のドメインを欠失させたタンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
【００４２】
本発明の動物の免疫方法で採用される膜タンパク質としては特に限定はない。例としては、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル型受容体、チロシンカイネース型受容体、ＣＤ抗原、細胞接着分子、癌抗原などが挙げられる。特に、ＧＰＣＲはヒトと非ヒト動物との種間相同性の高いものであり、医薬品開発に有用なタンパク質である。したがって、本発明の動物の免疫方法を用いてＧＰＣＲに対する抗体を取得することは、アッセイ系の構築や機能解析等に有用である。
【００４３】
ＧＰＣＲの例としては、エンドセリン受容体、ロドプシン、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アドレナリン受容体、アデノシン受容体、アンジオテンシン受容体、ドーパミン受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミン受容体、オピオイド受容体、ＧＡＢＡ受容体、ガストリン受容体、セロトニン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、嗅覚受容体、セクレチン受容体、ソマトスタチン受容体、ブラジキニン受容体、Ｃ−Ｃケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ガラニン受容体、ロイコトリエン受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、プロスタノイド受容体、オレキシン受容体等が挙げられる。
【００４４】
好ましい実施形態として、５’末端から膜タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列と細胞外ドメインをコードする遺伝子との間にフラジェリン遺伝子が挿入された融合遺伝子（５’−膜タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列−フラジェリン遺伝子−細胞外ドメインをコードする遺伝子−３’）、又は５’末端からＩｇκ リーダー配列等の外来シグナル配列をコードするＤＮＡ配列とフラジェリン遺伝子と膜タンパク質遺伝子もしくは膜タンパク質の細胞外ドメインをコードする遺伝子の融合遺伝子（５’−外来シグナル配列をコードするＤＮＡ配列−フラジェリン遺伝子−膜タンパク質遺伝子もしくは膜タンパク質の細胞外ドメインをコードする遺伝子−３’）の使用が挙げられる。かかる構成により、融合遺伝子を発現させたときに細胞膜上にフラジェリンが提示されることとなり、ＴＬＲ５を発現しているマクロファージや樹状細胞を賦活化することができる。
【００４５】
本発明の動物の免疫方法で用いる非ヒト動物としては特に限定はないが、取扱いの容易さの点で、哺乳類と鳥類が好ましく用いられる。哺乳類の例としては、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を挙げることができる。また、鳥類の例としては、ニワトリ、アヒル又は七面鳥を挙げることができる。
【００４６】
本発明の動物の免疫方法においては、融合遺伝子が発現ベクターに組み込まれており、その発現がプロモーターにより調節されている実施形態が好ましい。かかる構成により、融合遺伝子の動物体内における発現が確実となり、体液性免疫の誘導がより確実に行われる。
発現ベクターとしては、動物細胞内で複製可能な発現ベクターであればよく、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ、ｐＴｒｉＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶ等の発現ベクターを挙げることができる。
また、発現ベクター上のプロモーターは、動物細胞内で機能するものであればよい。例えば、サイトメガロウイルス（Cytomegarovirus、ＣＭＶ）のＣＭＶプロモーター；アデノウイルス後期（Adenovirus Major Late、ＡＭＬ）のＡＭＬプロモーター；シミアンウイルス４０（Simian Virus 40、ＳＶ４０）のＳＶ４０プロモーター；ＳＶ４０およびＨＴＬＶ−１ ＬＴＲの融合プロモーターであるＳＲαプロモーター；伸長因子（Elongation Factor、ＥＦ）のＥＦ−１αプロモーター、等が挙げられる。
【００４７】
さらに発現ベクターにはプロモーター活性を増強するエンハンサーを含むものでもよい。さらに、発現ベクターにはＣｐＧモチーフが含まれていてもよい。当該ＣｐＧモチーフは発現ベクター上のどの位置にあってもよく、さらに、１箇所のみでもよいし、複数個所でもよい。
【００４８】
本発明の動物の免疫方法における融合遺伝子の投与方法としては特に限定はなく、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等の公知の手法によって行うことができる。パーティクルガンによる投与も適用可能である。また融合遺伝子の投与量は、用いる発現ベクターやプロモーターの種類等に応じて適宜決定すればよいが、目安としては、１回当たりおおむね１〜３ｍｇ／ｋｇ体重で、これはマウスの場合は２５〜１００μｇ／回になる。また投与の回数は１回でもよいが、一定間隔をおいて複数回行う方がより高い体液性免疫の応答を誘導することができる。
【００４９】
次に、本発明の免疫用組成物について説明する。本発明の免疫用組成物は、本発明の動物の免疫方法に使用され、非ヒト動物に投与されるものであり、膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を含有する。本発明の免疫用組成物の代表的な形状としては、等張液に当該融合遺伝子を溶解させたものである。等張液の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。その他、溶媒には各種の緩衝液を用いることもできる。また、抗体産生能を上昇させるために、Ｍｇ2+等の金属イオンを等張液に添加することも効果的である。さらに、体液性免疫を誘導するＴH２ヘルパーＴ細胞の分化を誘導するようなサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−４を等張液に添加したり、またそれらのサイトカインをコードする遺伝子を添加したりすることも、抗体産生能を上昇させるためには効果的である。さらには、抗体産生の主役であるＢ細胞の活性化、分裂、抗体産生細胞への分化を誘導するサイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０又はそれらをコードする遺伝子を等張液に添加することで、抗体産生を高めることも可能である。本発明の免疫用組成物における融合遺伝子の濃度は例えば、１０〜５００μｇ／ｍＬ程度である。
【００５０】
さらに、本発明の免疫用組成物には、ＣｐＧモチーフからなるオリゴヌクレオチドを含むものでもよい。この場合、当該オリゴヌクレオチドはアジュバントとして機能し、より高い免疫応答を誘導するためのワクチンとしても用いることができる。
【００５１】
次に、本発明の抗体の製造方法について説明する。本発明の抗体の製造方法は２つの様相を含む。１つの様相は、本発明の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から、膜タンパク質に対する抗体を取得するものである。具体例を挙げると、免疫後の動物から定期的に部分採血を行って抗体価を測定し、抗体の産生状態をモニターする。そして、抗体価が最大に達した時点で全採血を行い、血清を調製する。そして、得られた血清から抗体を得る。この際、得られる抗体はポリクローナル抗体である。また、血清から抗体を単離・精製する方法としては、一般に抗体の精製に用いられている方法を使用することができ、例えば、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーを用いることができる。
本発明の抗体の製造方法における他の様相については、後で述べる。
【００５２】
次に、本発明のハイブリドーマの製造方法について説明する。本発明のハイブリドーマの製造方法は、本発明の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から採取されたＢリンパ球と、ミエローマとを細胞融合し、膜タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマを取得するものである。細胞融合、ハイブリドーマの選抜及びクローニングについては、公知の方法をそのまま使用することができる。例えば、細胞融合はケーラーとミルシュタインの方法により行うことができる。また、ハイブリドーマの選抜は、ＨＡＴ選択培地を用いた培養により行うことができる。さらに、ハイブリドーマのクローニングは限界希釈法により行うことができる。
【００５３】
このようにしてクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、膜タンパク質に対する抗体（モノクローナル抗体）を製造することができる。すなわち、本発明の抗体の製造方法における他の様相は、本発明のハイブリドーマ製造方法によって製造されたハイブリドーマから膜タンパク質に対する抗体を取得するものである。例えば、当該ハイブリドーマを培養し、その培養物から所望の抗体を取得することができる。ハイブリドーマの培養は、マウス等の動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。マウス等の動物の腹腔内でハイブリドーマを培養した場合は、腹水を採取し、その腹水から抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養した場合は、その培養液から抗体を単離・精製することができる。抗体を精製する方法としては、サブクラスがＩｇＧの抗体の場合は、例えば、上記したプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって行うことができる。
【実施例】
【００５４】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００５５】
（１）マウス由来エンドセリンＡ受容体（ｍＥＴＡＲ）遺伝子の単離・調製
モデル抗原タンパク質としてマウス由来エンドセリンＡ受容体（ｍＥＴＡＲ）（ＮＭ＿０１０３３２．２）の遺伝子を、マウス肺ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するｍＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ａ）を得た。ＤＮＡ断片Ａには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端に２個の終止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＳａｌＩサイトが導入された。また、前記マウス肺ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号２及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、シグナル配列（ｓ．ｓ．）を除いたｍＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ、ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．））を得た。ＤＮＡ断片Ｂ（ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．））には、プライマーに由来して、５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩサイト、３'末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＳａｌＩサイトが導入された。
【００５６】
（２）フラジェリン遺伝子の調製
配列番号５に示す塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ＃Ｄ１３６８９の情報より入手）を有するサルモネラ・チフィリウム由来フラジェリン遺伝子（ＦｌｉＣ）の、５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ及び配列番号３に示すｍＥＴＡＲ由来のシグナル配列（ｓ．ｓ．）、さらには配列番号６に示すｆｌａｇタグ配列の遺伝子が導入され、３'末端にはＳａｌＩサイトが導入された遺伝子（以下、「ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ」と称する。）を合成した。ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣをサブクローンニング用ベクターｐＵＣ５７へ組み込み、プラスミドｐＵＣ５７−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣを得た。
【００５７】
（３）マウス由来エンドセリンＡ受容体にフラジェリンが連結された融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターｐＣＩ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲを得た。さらに、ベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲをＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を構築した。さらにｐＣＩ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）および上記（２）で調製したｐＵＣ５７−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣをＮｏｔＩとＮｈｅＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣを挿入し、ｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）は、ｍＥＴＡＲ遺伝子の５’末端にフラジェリン遺伝子が連結されてなる融合遺伝子を有している。一方、ベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲはｍＥＴＡＲ遺伝子のみを有している。
【００５８】
（４）マウス由来エンドセリンＡ受容体の安定発現細胞の作製
（３）で構築したベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲをＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、ｐＣＩｎｅｏ（プロメガ社）のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイトに導入し、ベクターｐＣＩｎｅｏ−ｍＥＴＡＲを構築した。
【００５９】
リポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（インビトロジェン社）溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ギブコ社）培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｍＥＴＡＲを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｍＥＴＡＲを２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＤＳファーマ社）に導入した。遺伝子が導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ'ｓＦ１２Ｋ（和光純薬社）＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０5個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ'ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、抗生物質耐性細胞をクローニングした。
【００６０】
（５）ｆｌａｇ−Ｆｌｉｃ−ｍＥＴＡＲの細胞表面発現
ベクターｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を、リポフェクタミン２０００を用いて２９３Ｔ細胞（ＤＳファーマ社）に導入した（以下、「遺伝子導入２９３Ｔ細胞」と称する。）。この遺伝子導入２９３Ｔ細胞をＭｅｍ−α（和光純薬社）＋１０％ＦＢＳ培地にて４８時間培養した。培養した細胞を剥離・回収後、ＰＢＳで洗浄し、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シグマ社）を一次抗体として添加し、室温にて反応させた。さらに細胞をＰＢＳで洗浄し、二次抗体にフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を用いて、遺伝子導入２９３Ｔ細胞の細胞膜上における「ｍＥＴＡＲ遺伝子にフラジェリン遺伝子を連結させてなる融合遺伝子」（フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ）の発現を解析した。対照として、遺伝子を導入していない宿主のみの２９３Ｔ細胞でも同様の条件で測定した。結果を図１に示す。
【００６１】
図１（ａ）に示す様に、遺伝子導入２９３Ｔ細胞ではフィコエリスリン由来の蛍光が検出された。一方、図１（ｂ）に示す様に、対照の２９３Ｔ細胞ではフィコエリスリン由来の蛍光がほとんど検出されなかった。このことから、遺伝子導入２９３Ｔ細胞において、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲが細胞膜上で発現していることが示された。
【００６２】
（６）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を５００μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃ（雌）の両足大腿筋に各０．１０ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）を両足に各５０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり１００μｇ投与した。その後、７日目、２１日目及び２８日目にも同様して繰り返し免疫した。そして、０、２１、２８日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、ベクターを含まないＰＢＳのみを投与したマウス（対照Ａ）と、ｍＥＴＡＲを単独で発現するベクターｐＣＩ−ｍＥＴＡＲを投与したマウス（対照Ｂ）を使って評価した。
【００６３】
（７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ 測定
（６）で免疫したマウスのリンパ球が体液性免疫を誘導しているのかを調べるために、Ｔ細胞を単離して体液性免疫を誘導するサイトカインＩＬ−４を測定した。具体的には、（６）で免疫したマウスの脾臓とリンパ節からＭＡＣＳ ＣＤ４ビーズ（ミルテニーバイオテック社）を使い、ＣＤ４+Ｔ細胞をソーティングした。単離したＣＤ４+Ｔ細胞を２×１０6個／ｍＬになるようにＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社）＋１０％ＦＢＳで懸濁しておき、あらかじめ抗αβＴＣＲ抗体（ベクトンディッキンソン社）を３０μｇ／ｍＬでコーティングしたプレートに添加し、細胞を刺激した。ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２４時間培養し、培養上清を回収した。
【００６４】
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ベクトンディッキンソン社）を用いて２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＩＬ−４抗体をＥＬＩＳＡプレートに播き、４℃にて固相化した。ＰＢＳとＴｗｅｅｎ２０が混合されている洗浄液（ＰＢＳＴ）にて洗浄後、ブロッキング溶液（ナカライテスク社）を加えて室温にてブロッキングを行った。ＰＢＳＴにて洗浄後、（７）で回収した培養上清を加え、室温にて反応させた。さらにＰＢＳＴで洗浄し、１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識抗ＩＬ−４抗体を添加した。室温にて反応後、ＰＢＳＴにて洗浄を行い、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを加えてさらに反応を行った。最後に、ＰＢＳＴで洗浄操作の後、ＴＭＢ（ベチル社）を添加して比色反応を行った。その後、１Ｎの硫酸（和光純薬社）にて反応を停止させた。その後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社）にて４５０ｎｍの波長でＩＬ−４を測定した（図２）。
【００６５】
図２に示す様に、ＰＢＳのみを投与したマウス（対照Ａ）のＴ細胞ではＩＬ−４がほとんど分泌されなかった。また、ｍＥＴＡＲ遺伝子のみを投与したマウス（対照Ｂ）のＴ細胞からもＩＬ−４は非常に少ない量しか分泌されなかった。これに対し、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を投与したマウスのＴ細胞からはＩＬ−４が分泌されていた。これは、フラジェリンが体液性免疫を誘導することを示していた。
【００６６】
上記の操作でＩＬ−４にかえてＩＦＮ−γを測定した（図３）。図３に示す様に、ＰＢＳのみを投与したマウス（対照Ａ）のＴ細胞ではＩＦＮ−γがほとんど分泌されなかった。また、ｍＥＴＡＲ遺伝子のみを投与したマウス（対照Ｂ）のＴ細胞からもＩＦＮ−γは非常に少ない量しか分泌されなかった。これに対し、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を投与したマウスのＴ細胞からはＩＦＮ−γが分泌されていた。これは、フラジェリンがＴ細胞よりＩＦＮ−γの分泌を誘導することを示していた。
【００６７】
（９）フローサイトメトリーによるｍＥＴＡＲに対する血清中抗体結合性評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｍＥＴＡＲが導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｍＥＴＡＲ遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞」と称する。）、及びｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞」と称する。）をＰＢＳで洗浄した。免疫後４２日目の血清を１００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒにて各細胞と血清中の抗ｍＥＴＡＲ抗体との相互作用を解析した。結果を図４に示す。
【００６８】
図４に示す様に、ｍＥＴＡＲ遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合、遺伝子免疫前のマウスからの血清、ＰＢＳ投与マウス（対照Ａ）からの血清、及びｍＥＴＡＲ遺伝子投与マウス（対照Ｂ）からの血清のいずれからも、フィコエリスリン由来の蛍光は検出されなかった。これは、対照Ａと対照Ｂのマウスにおいて、ｍＥＴＡＲに対する体液性免疫が誘導されていないことを示していた。一方、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を投与したマウスの血清からはフィコエリスリン由来の蛍光が検出された。これは、フラジェリン融合ｍＥＴＡＲ遺伝子を投与したマウスが抗ｍＥＴＡＲ抗体を産生し、当該抗ｍＥＴＡＲ抗体がｍＥＴＡＲ遺伝子導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合することを示していた。
【００６９】
なお、対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合は、いずれのマウスの血清でもフィコエリスリン由来の蛍光が検出されなかった。これは、前記抗ｍＥＴＡＲ抗体が対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合しないことを示していた。
以上のことから、ベクターｐＣＩ−ｓ．ｓ．−ｆｌａｇ−ＦｌｉＣ−ｍＥＴＡＲ（Δｓ．ｓ．）による遺伝子免疫によって、マウス血清中にｍＥＴＡＲの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物を抗原で免疫することにより、前記非ヒト動物に所望の膜タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法であって、
前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を非ヒト動物に投与することにより、当該非ヒト動物内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質に対する体液性免疫を誘導することを特徴とする動物の免疫方法。
【請求項２】
前記フラジェリンは、サルモネラ（Salmonella）属、エシェリヒア（Escherichia）属、ボルデテラ（Bordetella）属、シゲラ（Shigella）属、レジオネラ（Legionella）属、ブルクホルデリア（Burkholderia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ヘリコバクター（Helicobacter）属、ビブリオ（Vibrio）属、セラチア（Serratia）属、コーロバクター（Caulobacter）属、リステリア（Listeria）属、クロストリジウム（Clostridium）属、又はボレリア（Borrelia）属に属する微生物に由来するものであることを特徴とする請求項１に記載の動物の免疫方法。
【請求項３】
前記膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンカイネース型受容体、ＣＤ抗原、細胞接着分子、又は癌抗原であることを特徴とする請求項１又は２に記載の動物の免疫方法。
【請求項４】
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、アヒル、又は七面鳥であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の動物の免疫方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法に使用され、非ヒト動物に投与される免疫用組成物であって、
前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を含有することを特徴とする免疫用組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から、前記膜タンパク質に対する抗体を取得することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から採取されたＢリンパ球と、ミエローマとを細胞融合し、前記膜タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマを取得することを特徴とするハイブリドーマの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載のハイブリドーマの製造方法によって製造されたハイブリドーマから前記膜タンパク質に対する抗体を取得することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項１】
非ヒト動物を抗原で免疫することにより、前記非ヒト動物に所望の膜タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法であって、
前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を非ヒト動物に投与することにより、当該非ヒト動物内で前記融合遺伝子を発現させ、前記膜タンパク質に対する体液性免疫を誘導することを特徴とする動物の免疫方法。
【請求項２】
前記フラジェリンは、サルモネラ（Salmonella）属、エシェリヒア（Escherichia）属、ボルデテラ（Bordetella）属、シゲラ（Shigella）属、レジオネラ（Legionella）属、ブルクホルデリア（Burkholderia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ヘリコバクター（Helicobacter）属、ビブリオ（Vibrio）属、セラチア（Serratia）属、コーロバクター（Caulobacter）属、リステリア（Listeria）属、クロストリジウム（Clostridium）属、又はボレリア（Borrelia）属に属する微生物に由来するものであることを特徴とする請求項１に記載の動物の免疫方法。
【請求項３】
前記膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンカイネース型受容体、ＣＤ抗原、細胞接着分子、又は癌抗原であることを特徴とする請求項１又は２に記載の動物の免疫方法。
【請求項４】
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、アヒル、又は七面鳥であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の動物の免疫方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法に使用され、非ヒト動物に投与される免疫用組成物であって、
前記膜タンパク質の全長又は一部をコードする遺伝子にフラジェリンの全長又は一部をコードする遺伝子を連結させてなる融合遺伝子を含有することを特徴とする免疫用組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から、前記膜タンパク質に対する抗体を取得することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の動物の免疫方法によって免疫された非ヒト動物から採取されたＢリンパ球と、ミエローマとを細胞融合し、前記膜タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマを取得することを特徴とするハイブリドーマの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載のハイブリドーマの製造方法によって製造されたハイブリドーマから前記膜タンパク質に対する抗体を取得することを特徴とする抗体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−９０５７１（Ｐ２０１２−９０５７１Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４０７２７（Ｐ２０１０−２４０７２７）
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
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