動物個体の神経系の非侵襲的インビボ蛍光イメージング
【課題】トランスジェニック動物の体内で発現された蛍光タンパク質の非侵襲的イメージングを含む方法を提供する。
【解決手段】動物の体内における目的とする蛍光タンパク質の発現を検出することを含む方法であって、上記動物は、上記蛍光タンパク質をコードする核酸が該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結されたゲノムを有するトランスジェニック動物であり、上記動物の体内で発現された上記タンパク質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程を含む方法が開示される。
【解決手段】動物の体内における目的とする蛍光タンパク質の発現を検出することを含む方法であって、上記動物は、上記蛍光タンパク質をコードする核酸が該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結されたゲノムを有するトランスジェニック動物であり、上記動物の体内で発現された上記タンパク質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程を含む方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック動物の体内で発現された蛍光タンパク質の非侵襲的イメージングを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）は、アルツハイマー病に次いで２番目に多い神経変性障害である。米国だけでも１００万人以上が既にこの身体障害性の疾患に罹患しており、毎年５万人以上が新たに罹患していると推定されている（Ｆａｈｎ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， ２０００）。ＰＤは、動作緩慢、休止時振戦、硬直、及び歩行困難によって特徴付けられる、進行性かつ加齢に関係した神経変性障害であるが、黒質にあるドーパミン作動性ニューロンの広範かつ進行性の破壊によっても特徴付けられる。他の多くの神経変性障害と同様に、ＰＤは主として散発性であるが、稀に種々の遺伝子の欠陥に関連した単純なメンデル形質からＰＤが発症することもある。
【０００３】
散発性のＰＤと家族性のＰＤとは、幾つかの重要な点で臨床的及び病理学的に相違するが、同じ生化学的な脳異常を示す点、すなわち脳のドーパミン量が著しく減少する点で共通する（Ｄａｕｅｒ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， ２００３）。ＰＤ患者の脳のドーパミンが減少する理由は、黒質ドーパミン作動性経路の変性に起因する（Ｖｉｌａ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， ２００４）。黒質ドーパミン作動性経路は、ドーパミン作動性ニューロンからなるが、ドーパミン作動性ニューロンの細胞体は黒質に位置し、突出した軸索及び神経末端は線条体に存在する。
【０００４】
最もよく特定されたＰＤのモデルは、神経毒であるＭＰＴＰを用いて作製された（Ｂｌｏｅｍ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｆｌｉｎｔ Ｂｅａｌ， ２００１）。ＭＰＴＰは、１９８２年に、カリフォルニアのある麻薬中毒者のグループが重篤なパーキンソニズムを急性発症したときに発見された。調査の結果、その症候群の原因は、合成したヘロイン類縁体を自己投与した際に、そのヘロイン類縁体に合成過程の副生成物であるＭＰＴＰが混入していたためであることが分かった。その後、ＭＰＴＰ投与は、マウス及び霊長類においてＰＤのモデルになることが示された。ＭＰＴＰは脂溶性が高く、血液脳関門を容易に通過する。その後、ＭＰＴＰはモノアミンオキシダーゼＢによって活性代謝物である１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）へと変換される。そして、その活性代謝物がドーパミン及びノルアドレナリンの高親和性取り込みシステムによって取り込まれ、黒質ドーパミン作動性細胞のミトコンドリア内に蓄積される。これにより、細胞機能に多くの悪影響が与えられ、神経細胞死に繋がる（Ｔａｔｔｏｎ ａｎｄ Ｋｉｓｈ，１９９７； Ｔａｎｊｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。マウスでは、従来からのＭＰＴＰよりも２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの方が効果の強い細胞毒であり、細胞質の膨潤、間質浮腫、ドーパミン作動性ニューロンの減少、並びに反応性ミクログリア増殖及びグリオーシスを含む組織病理学的変化を示す（Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ， ２００５）。
【０００５】
ＰＤに関する研究の殆どは成人についてのものであったが、幾つかの報告では、ＭＰＴＰを新生児マウスに全身注射すると脳が永久的に障害を受け、成人になっても残ることが示されている。発生中の脳がＭＰＴＰによる障害に弱いという事実も、さらなる調査が望まれる。
【０００６】
ＭＰＴＰに加え、数多くの他の化学物質もまた、成体マウス脳の様々な領域に神経障害を与えることが報告されている。このような化学物質には、工業用毒性物質、農業用殺虫剤から食品添加物まで、構造的にも機能的にも異なる多くの化合物が含まれる。繰り返しになるが、これまでの神経毒性研究の殆どは、成人のモデルに基づいていた。しかしながら、重要なことに、血液脳関門が不完全である発生中の脳は公知の神経毒によって引き起こされる障害に対して非常に弱く、さらに重要なことに、与えられた障害は発生中の脳によって完全かつ正確には補われない。したがって、化学物質が発生中の脳に対して神経毒性を示す可能性を検査することの重要性は、特に沈黙の神経毒性（すなわち、神経毒性物質に早期に曝露しても成人になるまで臨床兆候を示さない）の問題を扱う上で、強調し過ぎることはない。このことは、米国環境保護庁の発育神経毒性試験に関するガイドライン（ＤＮＴＧ）によってより深刻なものとなっている。最近になり、欧州委員会は、全ての化学物質を厳正に検査することを新たな欧州連合の規制枠組みとして採択したが、実現には７０億ユーロに上る費用と少なくとも１０年の歳月とを要すると見積もられている。
【０００７】
グリア細胞線維性酸性タンパク質は、主として中枢神経系（ＣＮＳ）のアストロサイトに発現している中間フィラメントタンパク質であり、Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， １９８８）により、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を含む様々な神経毒性物質（Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｇｒａｈａｍ， ２００２； Ｋｕｒｏｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）によって成体齧歯類脳に生じた神経障害を、早期かつ感度よくモニタリングするためのバイオマーカーになることが提案されている。ＧＦＡＰ発現の上方制御は、神経障害の悪化と相関があるとされている。内在性のＧＦＡＰ発現を分析するために採用される従来の方法には、主として免疫細胞化学、ノザンブロット、ウエスタンブロット、及びＥＬＩＳＡが含まれる（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， １９９１； Ｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【０００８】
ＧＦＡＰ基本プロモーターはＴＡＴＡボックス及びＣＡＡＴボックスからなる。エンハンサー配列及びサイレンサー配列は、−２５０〜−８０ｂｐと−１９８０〜−１５００ｂｐとに存在する。これらの陽性調節領域には、ｃＡＭＰ反応性エレメントを含む多くの転写因子のためのコンセンサス配列や、Ｓｐ−１，ＮＦ−１，ＡＰ−１，ＡＰ−２転写因子のための結合部位を含む。組織特異性は、−１９８０〜−１５００ｂｐ領域に存在するヒトＧＦＡＰコンセンサス配列によって得られている。
【０００９】
反応性グリオーシス（アストログリオーシス）は中枢神経系（ＣＮＳ）に対する物理的・化学的なあらゆる損傷によって生じるものであり、アストロサイトの細胞体及び突起の肥大と、それに続くＧＦＡＰ発現の増加によって特徴付けられる。反応性グリオーシスは、ＧＦＡＰの上方制御を伴う。同様なＧＦＡＰの増加は、末梢神経系に対する外傷や毒性傷害の後にも生じる。
【００１０】
マウスのトランスジェニック技術の発展や、新たなレポーター遺伝子の発見により、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェラーゼ（ＬＵＣ）を含む幾つかのレポーター遺伝子が、ＧＦＡＰプロモーターの制御下でトランスジェニックマウスに導入されており、インビボにおけるグリオーシスの際のＧＦＡＰ転写活性の研究に有用な代替になることが分かっている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｚｈｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
【００１１】
ＷＯ００／０２９９７及びＵＳ６，５０１，００３には、グリア細胞で緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製することが開示されている。この明細書には、視神経、脳、網膜、坐骨神経、及び角膜の全組織又は切片において、インビトロで蛍光を検出することについて記載されている。
【非特許文献１】Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ， Ｍ． Ｈ．， ２００５． Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ １−ｍｅｔｈｙｌ−４−（２’−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ （２’−ｍｅｔｈｙｌ−ＭＰＴＰ） ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． １９， ３２−４１．
【非特許文献２】Ａｌｉ， Ｓ． Ｆ．， Ｄａｖｉｄ， Ｓ． Ｎ． ａｎｄ Ｎｅｗｐｏｒｔ， Ｇ． Ｄ．， １９９３． Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ＭＰＴＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． １４， ２９−３４．
【非特許文献３】Ａｒａｋｉ， Ｔ．， Ｍｉｋａｍｉ， Ｔ．， Ｔａｎｊｉ， Ｈ．， Ｍａｔｓｕｂａｒａ， Ｍ．， Ｉｍａｉ， Ｙ．， Ｍｉｚｕｇａｋｉ， Ｍ． ａｎｄ Ｉｔｏｙａｍａ， Ｙ．， ２００１． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ １−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ （ＭＰＴＰ） −ｔｒｅａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． １２， ２３１−２３８．
【非特許文献４】Ｂａｒｏｎｅ Ｊｒ．， Ｓ．， Ｈａｙｋａｌ−Ｃｏａｔｅｓ， Ｎ．， Ｐａｒｒａｎ， Ｄ． Ｋ． ａｎｄ Ｔｉｌｓｏｎ， Ｈ． Ａ．， １９９８． Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌｍｅｒｃｕｒｙ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｒｋ−ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｙｓｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １０９， １３−３１．
【非特許文献５】Ｂｈａｕｍｉｋ， Ｓ． ａｎｄ Ｇａｍｂｈｉｒ， Ｓ． Ｓ．， ２００２． Ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ９９， ３３７−３８２．
【非特許文献６】Ｂｌｏｅｍ， Ｂ． Ｒ．， Ｉｒｗｉｎ， Ｉ．， Ｂｕｒｕｍａ， Ｏ． Ｊ． Ｓ．， Ｈａａｎ， Ｊ．， Ｒｏｏｓ， Ｒ． Ａ． Ｃ， Ｔｅｔｒｕｄ， Ｊ． Ｗ． ａｎｄ Ｌａｎｇｓｔｏｎ， Ｊ． Ｗ．， １９９０． Ｔｈｅ ＭＰＴＰ ｍｏｄｅｌ： ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ９７， ２７３−２９３．
【非特許文献７】Ｂｏｕｖｅｔ， Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｎａｒｄｉｎ， Ｓ． Ｒ．， Ｎａｓｓｉｒｐｏｕｒ， Ｒ．， Ｙａｎｇ， Ｍ．， Ｂａｒａｎｏｖ， Ｅ．， Ｊｉａｎｇ， Ｐ．， Ｍｏｏｓｓａ， Ａ． Ｒ． ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｒ． Ｍ．， ２００２． Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｄｅｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ６２， １５３４−１５４０．
【非特許文献８】Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｍ．， Ｋｉｓｓｅｒｂｅｒｔｈ， Ｗ． Ｃ， Ｓｕ， Ｙ．， Ｂｅｓｎａｒｄ， Ｆ． ａｎｄ Ａ， Ｍ．， １９９４． ＧＦＡＰ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｄｉｒｅｃｔｓ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． １４， １０３０−１０３７．
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ， Ｌ． Ｗ．， Ｗｅｉ， Ｌ． Ｃ， Ｑｉｕ， Ｙ．， Ｌｉｕ， Ｈ． Ｌ−， Ｒ， Ｒ． Ｚ．， Ｊｕ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｎ， Ｙ． Ｓ−， ２００２． Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｏｓｔｒｉａｔｕｍ ｏｆ ＭＰＴＰ−ｔｒｅａｔｅｄ ｍｉｃｅ． Ａｒｅ ｔｈｅ ｓｔｒｉａｔａｌ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＭＰＴＰ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ？ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ９２５， ９−１７．
【非特許文献１０】Ｃｏｎｔａｇ， Ｃ． Ｈ．， Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ｄ．， Ｃｏｎｔａｇ， Ｐ． Ｒ． ａｎｄ Ｎｅｇｒｉｎ， Ｒ． Ｓ．， ２０００． Ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ． ２， ４１−５２．
【非特許文献１１】Ｃｏｓｔａ， Ｌ． Ｇ．， Ａｓｃｈｎｅｒ， Ｍ．， Ｖｉｔａｌｏｎｅ， Ａ．， Ｓｙｖｅｒｓｅｎ， Ｔ． ａｎｄ Ｓｏｌｄｉｎ， Ｏ． Ｐ．， ２００４． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｇｅｎｔｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． ４４， ８７−１１０．
【非特許文献１２】Ｄａｍｉｅｒ， Ｐ．， Ｈｉｒｓｃｈ， Ｅ． Ｃ， Ａｇｉｄ， Ｙ． ａｎｄ Ｇｒａｙｂｉｅｌ， Ａ． Ｍ．， １９９９． Ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ． ＩＩ． Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １２２， １４３７−１４４８．
【非特許文献１３】Ｄａｕｅｒ， Ｗ． ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， Ｓ．， ２００３． Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｓ． Ｎｅｕｒｏｎ． ３９， ８８９−９０９．
【非特許文献１４】Ｄｅｒｖａｎ， Ａ． Ｇ．， Ｍｅｓｈｕｌ， Ｃ． Ｋ．， Ｂｅａｌｅｓ， Ｍ．， ＭｃＢｅａｎ， Ｇ． Ｊ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｃ， Ｔｏｔｔｅｒｄｅｌｌ， Ｓ．， Ｓｎｙｄｅｒ， Ａ． Ｋ． ａｎｄ Ｍｅｒｅｄｉｔｈ， Ｇ． Ｅ．， ２００４． Ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． １９０， １４５−１５６．
【非特許文献１５】Ｅｎｇ， Ｌ． Ｆ．， Ｇｈｉｒｎｉｋａｒ， Ｒ． Ｓ． ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｙ． Ｌ．， ２０００． Ｇｌｉａｌ Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ： ＧＦＡＰ Ｔｈｉｒｔｙ−Ｏｎｅ Ｙｅａｒｓ （１９６９−２０００）＊． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２５， １４３９−１４５１．
【非特許文献１６】Ｅｕｒｏｐｅａｎ， Ｃ， ２００３． Ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｒｌｉａｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｕｎｃｉｌ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， Ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （ＲＥＡＣＨ）． ＣＯＭ ２００３ ０６４４ （０３）．
【非特許文献１７】Ｆａｈｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， Ｓ．， ２０００． Ｍｅｒｒｉｔｔ’ｓ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献１８】Ｆｉｅｌｄｓ， Ｒ． Ｄ． ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｇｒａｈａｍ， Ｂ．， ２００２． Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｎ−ｇｌｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２９８， ５５６−５６２．
【非特許文献１９】Ｆｌｉｎｔ Ｂｅａｌ， Ｍ．， ２００１． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ２， ３２５−３３２．
【非特許文献２０】Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｋ． ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓ， Ｇ．， ２００１． Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献２１】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ．， Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ｐ．， １９９３． Ｎｅｏｎａｔａｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｐａｒａｑｕａｔ ｏｒ ＭＰＴＰ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｓｔｒｉａｔｕｍ ｄｏｐａｍｉｎｅ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． １２２， ２５８−２６４．
【非特許文献２２】Ｇａｒｃｉａ， Ｓ． Ｊ．， Ｓｅｉｄｌｅｒ， Ｆ． Ｊ．， Ｑｉａｏ， Ｄ． ａｎｄ Ｓｌｏｔｋｉｎ， Ｔ． Ａ．， ２００２． Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｇｌｉａ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １３３， １５１−１６１．
【非特許文献２３】Ｇｅｒｍａｎ， Ｄ． Ｃ， Ｎｅｌｓｏｎ， Ｅ． Ｌ．， Ｌｉａｎｇ， Ｃ． Ｌ．， Ｓｐｅｃｉａｌｅ， Ｓ． Ｇ．， Ｓｉｎｔｏｎ， Ｃ． Ｍ． ａｎｄ Ｓｏｎｓａｌｌａ， Ｐ． Ｋ．， １９９９． Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ＭＰＴＰ ｃａｕｓｅｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ Ａ８， Ａ９ ａｎｄ Ａ１０ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． ５， ２９９−３１２．
【非特許文献２４】Ｈａｓｓ， Ｕ．， ２００３． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ： ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｖｉｅｗ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ． １４０−１４１， １５５−１５９．
【非特許文献２５】Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｒ． Ｍ．， ２００４． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｔｈｅ ｎｅｗ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ． １０６， ７７−８７．
【非特許文献２６】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ， Ｈ．， Ｙａｍａｄａ， Ｋ．， Ｓａｗａｄａ， Ｈ．， Ｎｉｓｈｉｉ， Ｋ．， Ｉｃｈｉｎｏ， Ｎ．， Ｓａｗａｄａ， Ｍ．， Ｋｕｒｏｓａｗａ， Ｙ．， Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ， Ｎ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｋ．， Ｇｏｔｏ， Ｊ．， Ｈａｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｍａｓｕｄａ， Ｎ．， Ｋａｎａｚａｗａ， Ｉ． ａｎｄ Ｎａｇａｔｓｕ， Ｔ．， ２００１． Ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＡＧ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｃｃｕｒｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｆｏｒ ａ ｍｕｔａｎｔ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ６５， ２８９−２９７．
【非特許文献２７】Ｋａｌａｍａｒｉｄｅｓ， Ｍ．， Ｎｉｗａ−Ｋａｗａｋｉｔａ， Ｍ．， Ｌｅｂｌｏｉｓ， Ｈ．， Ａｂｒａｍｏｗｓｋｉ， Ｖ．， Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｍ．， Ｊａｎｉｎ， Ａ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｇ．， Ｇｕｔｍａｎｎ， Ｄ． Ｈ． ａｎｄ Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ， Ｍ．， ２００２． Ｎｆ２ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ａｒａｃｈｎｏｉｄａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆｏｒ ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． １６， １０６０−１０６５．
【非特許文献２８】Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｗ．， ２００３． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ： ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ． １４０−１４１， １６１−１６９．
【非特許文献２９】Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｒ．， Ｍｕｒａｍａｔｓｕ， Ｙ．， Ｋａｔｏ， Ｈ． ａｎｄ Ａｒａｋｉ， Ｔ．， ２００４． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＭＰＴＰ−ｔｒｅａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒ． ７８， １４３−１５３．
【非特許文献３０】Ｌｕｅｌｌｅｎ， Ｂ． Ａ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｄ． Ｂ．， Ｃｈｉｓｎｅｌｌ， Ａ． Ｃ， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｄ． Ｌ．， Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， Ｊ． Ｐ． ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗｓ， Ａ． Ｍ．， ２００３． Ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｎｄ ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ａｎｄ ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ： １−ｍｅｔｈｙｌ−４−（２’−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ３０７， ９２３−９３１．
【非特許文献３１】Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ， Ｖ．， Ｔｕｎｇ， Ｃ． Ｈ．， Ｂｒｅｍｅｒ， Ｃ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ， Ｒ．， ２００２． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｒｅｓｏｌｖｅｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ８， ７５７− ７６０．
【非特許文献３２】Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， Ｊ． Ｐ．， １９８８． Ｎｅｕｒｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｇｌｉｏｔｙｐｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ． １０， ４４５−４５２．
【非特許文献３３】Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， Ｊ． Ｐ．， １９９１． Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｌｏｔ−ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓｙｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ． １３， ２７５−２８１．
【非特許文献３４】Ｏｌａｎｏｗ， Ｗ． ａｎｄ Ｔａｔｔｏｎ， Ｗ． Ｇ．， １９９９． Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ２２， １２３−１４４．
【非特許文献３５】Ｏｌｎｅｙ， Ｊ． Ｗ．， ２００２． Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． ２３， ６５９−６６８．
【非特許文献３６】Ｏｓｔｅｒｇｒｅｎ， Ａ．， Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． ａｎｄ Ｂｒｉｔｔｅｂｏ， Ｅ． Ｂ．， ２００５． Ｎｏｒｈａｒｍａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｔｏｒｉｃ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｎ ｍｉｃｅ： ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ． Ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ （３ Ａｕｇ ２００５）．
【非特許文献３７】Ｐｅｋｎｙ， Ｍ． ａｎｄ Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｍ．， ２００５． Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｌｉｏｓｉｓ． Ｇｌｉａ． ５０， ４２７−４３４．
【非特許文献３８】Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ， Ａ．， Ｓｔｅｇｍａｎ， Ｌ． Ｄ．， Ｃａｒｄｏｚｏ， Ｓ． Ｊ．， Ｇｕｐｔａ， Ｓ．， Ｈａｌｌ， Ｄ． Ｅ．， Ｃｏｎｔａｇ， Ｃ． Ｈ． ａｎｄ Ｒｏｓｓ， Ｂ． Ｄ．， ２０００． Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ． ２， ４９１−４９５．
【非特許文献３９】Ｒｅｉｎｈａｒｄ， Ｊ． Ｆ． Ｊ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｄ． Ｂ． ａｎｄ Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， Ｊ． Ｐ．， １９８８． Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃａｎｔ ＭＰＴＰ （１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−ｌ，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ） ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｓｔｒｉａｔｕｍ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｌｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｊｕｒｙ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ９５， ２４６−２５１．
【非特許文献４０】Ｓｃａｌｌｅｔ， Ａ． Ｃ， Ｓｃｈｍｕｅｄ， Ｌ． Ｃ， Ｓｌｉｋｋｅｒ， Ｗ．， Ｇｒｕｎｂｅｒｇ， Ｎ．， Ｆａｕｓｔｉｎｏ， Ｐ． Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｈ．， Ｌｅｓｔｅｒ， Ｄ．， Ｐｉｎｅ， Ｐ． Ｓ．， Ｓｉｓｔａｒｅ， Ｆ． ａｎｄ Ｈａｎｉｇ， Ｊ． Ｐ．， ２００４． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｋｅｔａｍｉｎｅ： Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ， ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ， ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ８１， ３６４−３７０．
【非特許文献４１】Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｊ． Ｐ． ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ， Ｎ．， １９９４． Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ． ３５， ４０３−４０７．
【非特許文献４２】Ｓｕ， Ｍ．， Ｈｕ， Ｈ．， Ｌｅｅ， Ｙ．， ｄ’Ａｚｚｏ， Ａ．， Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ａ． ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｍ．， ２００４． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＧＦＡＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２９， ２０７５−２０９３．
【非特許文献４３】Ｔａｎｊｉ， Ｈ．， Ａｒａｋｉ， Ｔ．， Ｎａｇａｓａｗａ， Ｈ． ａｎｄ Ｉｔｏｙａｍａ， Ｙ．， １９９９． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ＭＰＴＰ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ８２４， ２２４−２３１．
【非特許文献４４】Ｔａｔｔｏｎ， Ｎ． Ａ． ａｎｄ Ｋｉｓｈ， Ｓ． Ｊ．， １９９７． Ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｃｏｍｐａｃｔａ ｏｆ １−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ７７， １０３７−１０４８．
【非特許文献４５】Ｔｉｌｓｏｎ， Ｈ． Ａ．， ２０００． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． ２８， １４９−１５６．
【非特許文献４６】Ｔｒｏｙ， Ｔ．， Ｊｅｋｉｃ−ＭｃＭｕｌｌｅｎ， Ｄ．， Ｓａｍｂｕｃｅｔｔｉ， Ｌ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｂ．， ２００４． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ． ３， ９−２３．
【非特許文献４７】Ｖａｎｚａｎｉ， Ｍ． Ｃ， Ｉａｃｏｎｏ， Ｒ． Ｆ．， Ｃａｃｃｕｒｉ， Ｒ． Ｌ． ａｎｄ Ｂｅｒｒｉａ， Ｍ． Ｉ．， ２００５． Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｓ． ｐｌａｑｕｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｍｅｄｉｃｉｎａ−Ｂｕｅｎｏｓ Ａｉｒｅｓ． ６５， ２１３−２１８．
【非特許文献４８】Ｖｉｌａ， Ｍ． ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， Ｓ．， ２００４． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｌｕｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． １０ （Ｓｕｐｐｌ）， Ｓ５８−Ｓ６２．
【非特許文献４９】Ｙａｎｇ， Ｍ．， Ｂａｒａｎｏｖ， Ｅ．， Ｊｉａｎｇ， Ｐ．， Ｓｕｎ， Ｆ． Ｘ．， Ｌｉ， Ｘ． Ｍ．， Ｌｉ， Ｌ．， Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｓ．， Ｂｏｕｖｅｔ， Ｍ．， Ａｌ−Ｔｕｗａｉｊｒｉ， Ｍ．， Ｃｈｉｓｈｉｍａ， Ｔ． ， Ｓｈｉｍａｄａ， Ｈ．， Ｍｏｏｓｓａ， Ａ． Ｒ．， Ｐｅｎｍａｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｒ． Ｍ．， ２０００． Ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ− ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ９７， １２０６−１２１１．
【非特許文献５０】Ｚｈａｎｇ， Ｗ．， Ｆｅｎｇ， Ｑ． Ｊ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ｓ． Ｅ．， Ｃｏｎｔａｇ， Ｐ． Ｒ．， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｄ． Ｋ． ａｎｄ Ｃｏｎｔａｇ， Ｃ． Ｈ．， ２００１． Ｒａｐｉｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １０， ４２３−４３４．
【非特許文献５１】Ｚｈｕ， Ｌ．， Ｒａｍｂｏｚ， Ｓ．， Ｈｅｗｉｔｔ， Ｄ．， Ｂｏｒｉｎｇ， Ｌ．， Ｇｒａｓｓ， Ｄ． Ｓ． ａｎｄ Ｐｕｒｃｈｉｏ， Ａ． Ｆ．， ２００４． Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ＧＦＡＰ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ３６７， ２１０−２１２．
【非特許文献５２】Ｚｈｕｏ， Ｌ．， Ｓｕｎ， Ｂ．， Ｚｈａｎｇ， Ｃ． Ｌ−， Ｆｉｎｅ， Ａ．， Ｃｈｉｕ， Ｓ． Ｙ． ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ａ．， １９９７． Ｌｉｖｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ． １８７， ３６−４２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＰＤの発生的側面及び神経毒性の研究を促進する目的で、本件発明者らは、ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスモデルと市販のイメージングシステムとを備えた非侵襲的システムを構築した。このシステムにより、生きている動物の神経系疾患、障害、及び毒性の様々な観点について研究が可能となる。また、このシステムにより、発生途中の中枢神経系に対する神経毒性のリスクに関し、多数の化学物質を効率的にスクリーニングすることができる。
【００１３】
動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸の制御下で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物を用いることで、生きている動物個体からの蛍光検出が、刺激又は被検物質によるプロモーターからの蛍光タンパク質の発現への影響のモニターに利用できることが示された。このことは、被検物質による無傷動物の神経系への影響をインビボかつリアルタイム又はほぼリアルタイムでモニタリングできるという点で、現在の技術水準に対して大きく貢献するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、最も一般的には、トランスジェニック動物の体内で発現された蛍光タンパク質の非侵襲的イメージングを含む方法に関する。
【００１５】
本発明の第一の側面では、動物の体内における目的とする蛍光タンパク質の発現を検出することを含む方法であって、上記動物は、上記蛍光タンパク質をコードする核酸が該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結されたゲノムを有するトランスジェニック動物であり、上記動物の体内で発現された上記タンパク質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程を含む方法が提供される。
【００１６】
したがって、上記蛍光タンパク質をコードする核酸が該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結されたゲノムを有するトランスジェニック動物を、該動物の体内で発現された上記タンパク質からの蛍光を非侵襲的に検出する方法に使用する方法もまた提供される。
【００１７】
この方法は、上記動物に対する被検物質の投与、又は被検刺激による影響を検査するための方法であって、蛍光を非侵襲的に検出する工程の前に、上記被検物質を上記動物に投与し、又は上記被検刺激を上記動物に与える工程を含むものが好ましい。好ましくは、上記方法は、上記動物の神経状態に対する上記被検物質の投与、又は上記被検刺激による影響を検査するためのものである。したがって、本発明の方法は、神経モジュレーターのスクリーニング方法を提供し得る。
【００１８】
この方法は、被検物質を投与していない対照動物における蛍光と、被検物質の投与後の上記トランスジェニック動物における蛍光とを比較する工程を含むことが好ましい。
【００１９】
被検物質を投与せずに蛍光を検出することで、例えば自己蛍光のための対照値又は基礎値を得ることができ、これは、標準化の目的で相対蛍光値を求めるために、被検物質の投与後に蛍光を検出することと組み合わせることができる。この対照値は、例えば被検物質が投与されるトランスジェニック動物と同種のトランスジェニック動物を用いて検出することができる。この動物は、同種（例えば、マウス）であることが好ましく、同系統であることが最も好ましい。対照値を得るために、対照動物にプラセボ（例えば、生理食塩水）を投与してもよい。
【００２０】
したがって、この方法は、好ましい構成において、
（ｉ）対照とするために、上記被検物質の投与前の上記トランスジェニック動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）上記被検物質の投与後の同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）上記（ｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
【００２１】
また、この方法は、他の好ましい構成において、
（ｉ）対照とするために、第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）上記被検物質を第２のトランスジェニック動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）上記（ｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
上記第１の動物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでも構わない。
【００２２】
ある好ましい構成において、本発明の方法は、被検物質の神経毒性を検査するために用いられる。
【００２３】
他の好ましい構成において、本発明の方法は、神経障害の治療促進又は調節に関する被検物質の効果を検査するために用いられる。
【００２４】
したがって、この方法は、
（ｉ）上記トランスジェニック動物に神経障害を誘導する工程、
（ｉｉ）対照とするため、上記被検物質の投与前に、上記（ｉ）で得られた神経障害動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）上記被検物質の投与後に、上記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含んでもよい。
【００２５】
或いは、この方法は、
（ｉ）対照とするため、第１の動物に神経障害を誘導し、得られた神経障害動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）第２のトランスジェニック動物に神経障害を誘導し、上記被検物質を該動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）上記（ｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含んでもよい。
上記第１の動物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでも構わない。
【００２６】
上記神経障害は、誘導されるものであれば、神経系に対するどのような障害又は傷害であっても構わない。好ましくは、上記障害は中枢神経系に対するものであり、より好ましくは脳に対するものである。
【００２７】
上記神経障害は、例えば反応性グリオーシスである。
【００２８】
上記神経障害は、所定の化学物質を上記動物に投与することにより誘導されるものであってもよい。化学物質としては、ＭＰＴＰ、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）、カイニン酸（ＫＡ）、トリメチル錫等の神経毒、クロルピリホス（ＣＰＦ）等の農薬、エチレンビス（ジチオカルバミン酸）マンガン（Ｍａｎｅｂ又はＭＢ）等の殺菌剤、ロテノン等の殺虫剤、パラコート（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−４，４’−ビピリジニウム）等の除草剤、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）等の有機塩素剤、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）等の食品添加物、３，３’−イミノジプロピオニトリル（ＩＤＰＮ）、トルエン（メチルベンゼン）等の工業用化学物質が挙げられる。当業者であれば、神経障害を誘導するために所定の化学物質を上記動物に投与する際の適切な量を選択することができ、適切な用法を設定することができる。一例として、上記所定の化学物質は、単回又は多数回（例えば、２，３，４，５、或いはそれ以上）に亘って投与される。多数回投与の場合、所定の時間間隔（例えば、１，２，３，４，５，６時間、或いはそれ以上）で投与される。一例として、各回の投与量は、２，４，６，７，８，１２，１４ｍｇ／ｋｇから選択される。
【００２９】
或いは、上記神経障害は、上記動物の頭部及び／又は首及び／又は背中に対する物理的な力（例えば、挫滅外傷）によって誘導されるものであってもよい。この神経障害は、上記動物の神経系への酸素供給を減らし、脳卒中及び／又は脳虚血を引き起こすことにより誘導することができる。神経障害を誘導する他の方法としては、環境刺激、物理的な力、ウイルス粒子への曝露、又は遺伝的要因が挙げられる。
【００３０】
好ましい構成において、上記神経障害は、所定の疾患についての動物モデルを得るものである。この疾患は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病の中から選択される。パーキンソン病の動物モデルは、ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）又は２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの投与により化学的に誘導することができる。
【００３１】
より好ましい構成において、本発明の方法は、神経系疾患の治療促進に関する被検物質の効果を検査するために用いられる。
【００３２】
したがって、この方法は、好ましい構成において、
（ｉ）上記神経系疾患の動物モデルでもある上記トランスジェニック動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするため、上記被検物質の投与前に、上記（ｉ）の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）上記被検物質の投与後に、上記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
【００３３】
或いは、この方法は、
（ｉ）上記神経系疾患の動物モデルでもある第１及び第２の動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするために、上記（ｉ）の第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）上記被検物質を上記（ｉｉ）の第２のトランスジェニック動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
上記第１の動物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでも構わない。
【００３４】
より好ましい構成において、本発明の方法は、神経系疾患の治療効果を検査するために用いられる。
【００３５】
したがって、この方法は、好ましい構成において、
（ｉ）上記神経系疾患の動物モデルでもある上記トランスジェニック動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするため、治療を施す前に、上記（ｉ）の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）治療を施した後に、上記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
【００３６】
或いは、この方法は、
（ｉ）上記神経系疾患の動物モデルでもある第１及び第２の動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするために、上記（ｉ）の第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の第２のトランスジェニック動物に治療を施した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
上記第１の動物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでも構わない。
【００３７】
好ましくは、上記神経系疾患は神経系腫瘍である。神経系腫瘍としては、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経繊維腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、星状細胞腫、及び乏突起膠腫が挙げられる。神経系腫瘍の動物モデルは、当業者によく知られた腫瘍異種移植技術を用いて作製することができる。
【００３８】
上記治療は、好ましくは放射線（例えば、Ｘ線又はγ線）の照射、又は化学療法剤の投与を含む。
【００３９】
本発明の方法が神経障害又は神経系疾患を有する動物の使用を含む場合、特許請求の範囲の発明は、上記動物に上記障害及び／又は疾患を誘導する工程を省略することができる。この場合、上記方法は、そのような動物の作製ではなく、その使用に関する。
【００４０】
上記動物（トランスジェニック及び非トランスジェニック）は、好ましくは、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、その他の齧歯類（ネズミ目に属するあらゆる動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類等の非ヒト哺乳動物、又はその他のあらゆる脊椎動物である。最も好ましくは、上記動物（トランスジェニック及び非トランスジェニック）はマウスである。あらゆる方法において、対照動物及び検査動物としては、好ましくは同種の動物（例えば、マウス）が用いられる。この動物は、あるものがトランスジェニックで他のものが非トランスジェニックであるなど、異なる場合があるが、検査動物は常にトランスジェニックである。対照動物及び検査動物の両者がトランスジェニックであってもよい。
【００４１】
プロモーター核酸は、該動物の神経系で通常発現しているタンパク質に由来する。このプロモーターの核酸配列は、野生型と比べて変異（例えば、ヌクレオチドの置換、付加、欠失（短縮）、挿入、交換）していてもよいが、あるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたとき、そのタンパク質の神経系での発現を調節する能力を有することで特徴付けられる。最も好ましくは、上記プロモーターは、神経系組織において野生型のプロモーターと同程度の転写調節能力（したがって、タンパク質発現能力）を保持している。
【００４２】
本明細書において「作動可能に連結」とは、所定の核酸配列（例えば、タンパク質コード配列）の発現が調節配列（例えば、プロモーター）の影響下又は制御下に置かれるように、上記所定の核酸配列と上記調節核酸配列とが共有結合している状態を含む。したがって、調節配列が、所定の核酸配列の一部又は全部であるタンパク質コード配列の転写に影響を与えることができる場合に、上記調節配列は上記所定の核酸配列に作動可能に連結されているといえる。適切であるならば、転写産物は次に所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳される。
【００４３】
最も好ましくは、上記プロモーターはＧＦＡＰプロモーターである。ＧＦＡＰプロモーター配列は当業者によく知られている。ＧＦＡＰプロモーターの例や、タンパク質の発現がＧＦＡＰ転写調節領域の制御下に置かれるＧＦＡＰ導入遺伝子を構築する際にＧＦＡＰプロモーターを使用する例については、Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０， ３５１−３６４， （１９９６）に記載されており、この開示内容は、参照することにより本願に援用される。
【００４４】
上記蛍光タンパク質としては、あらゆる蛍光タンパク質を使用することができる。緑、青、シアン、黄、オレンジ、赤の蛍光タンパク質など、数多くの適切な蛍光タンパク質が当業者に知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｕ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｌｉｖｅｃｅｌｌｉｍａｇｉｎｇ／ｆｐｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌを参照）。最も好ましくは、上記蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。緑色蛍光タンパク質としては、ｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ緑色蛍光タンパク質遺伝子、ＥＧＦＰ−１緑色蛍光タンパク質遺伝子、若しくはＥＹＦＰ−１緑色蛍光タンパク質遺伝子、又は哺乳類適合配列若しくはヒト化配列（例えば、哺乳類リボソームによる翻訳に適合するように構成を変更するコドン改変）と発光係数を増加させる変異とを有する、上記の遺伝子の任意の変異体が挙げられる。
【００４５】
本明細書において「トランスジェニック動物」とは、該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする核酸が、リコンビナント核酸技術を用いてその生物のゲノム中に導入された動物を含む。トランスジェニック非ヒト動物の作製技術は当業者によく知られている。
【００４６】
本発明の方法において、上記動物は新生児、すなわち生後４週未満であることが好ましい。この新生児動物は、より好ましくは生後３週未満であり、さらに好ましくは生後１４日未満である。また、この新生児動物は、生後１日から１４日の間であってもよく、好ましくは生後１〜７日、又は生後７〜１４日である。新生児動物は、生後１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８日のいずれであってもよい。
【００４７】
新生児マウスを用いることにより、神経系の発生をモニターすることができ、特に神経系の発生における被検物質の影響をモニターすることができる。
【００４８】
本発明の方法において、蛍光は非侵襲的蛍光イメージングによって検出される。このイメージング技術は、動物の体外からイメージングされ、蛍光検出に外科的介入が含まれないという点で非侵襲的である。したがって、動物は、イメージングの間は無傷のままである。蛍光を検出するために動物に麻酔が施される場合もあるが、上記動物は、蛍光検出中に無麻酔であることが好ましい。非侵襲的イメージングのための適切な装置及び技術は、例えばＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＵＳＡ）のように、当業者に知られている。
【００４９】
蛍光検出は、対照値及び検査値を得るため、被検物質の投与前及び投与後の任意の時点で行うことができる。多くの場合、蛍光の経時変化をモニターするため、投与後に連続して検出を行うことが好ましい。対照値は、例えば被検物質ではなくプラセボを投与された動物を用いて、対応する各時点において検出することができる。例えば、被検物質の投与直後又は直前（例えば、投与前１時間以内）に検出を行い、その後、例えば１時間毎に通常の検出を行うことができる。或いは、投与後の検出は、１日１回、１日２回、１日３回、又は１日４回の頻度で検査者が望む期間（例えば１，２，３，４，５日、又はそれ以上）に亘って行うことができる。
【００５０】
蛍光検出は、その動物の所望の領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＲＯＩ）について行うことが好ましい。ＲＯＩは検査者が興味のある領域が好ましい。好ましいＲＯＩは中枢神経系又はその一部であり、最も好ましくは脳又はその一部である。ＲＯＩは、視神経、網膜、坐骨神経、角膜、又は哺乳動物の眼のあらゆる部分を除いてもよい。対応するＲＯＩは、対照動物及び検査動物における蛍光検出を比較するために、好ましく用いられる。
【００５１】
対照動物における蛍光検出により、動物の自己蛍光についての基礎値を得ることができる。基礎値と検査値とを直接比較してもよい。しかしながら、特に好ましい構成では、相対蛍光（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ＲＦ）値が求められ、比較のために用いられる。ＲＦ値は、好ましくは、被検物質をトランスジェニックマウスに投与した後のある時点においてＲＯＩから検出された全蛍光と、対照マウス（トランスジェニックでも非トランスジェニックでもよい）のＲＯＩから検出（任意であるが、例えばプラセボが投与されてから同じ時点）された組織自己蛍光との比として求められる。
【００５２】
好ましい構成において、検出された蛍光が増大することは、神経障害の悪化、神経毒性、又は神経系疾患の進行を意味する。他の構成において、蛍光の減少は神経障害の悪化を意味する。
【００５３】
蛍光検出は、定量的及び／又は定性的である。
【００５４】
本明細書において、動物の神経系とは、中枢神経系又は末梢神経系を含む。より好ましくは中枢神経系であり、さらに好ましくは脳及び／又は脊髄である。
【００５５】
被検物質としては、あらゆる物質、材料、組成物、化学物質、薬物、薬剤、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、小分子、工業用化学物質、農薬、食品添加物、又は防腐剤を用いることができる。被検物質は、検査動物に外科的に埋め込まれた材料又は組織（例えば、人工生体材料）であってもよい。
【００５６】
本発明の方法は、上記動物に対する被検物質の投与による影響をモニターするために用いることができ、例えば以下の目的で用いることができる。
・疾患の診断。
・疾患の予測。
・化学物質誘導性のグリオーシス及び／又は脳における病変発生のモニタリング及び／又は定量化。
・パーキンソン病の診断及び予測。
・治療法（例えば、抗パーキンソン病薬又は遺伝子治療）の開発。
・神経毒物誘導性のグリオーシス及び／又は脳における病変発生のモニタリング及び／又は定量化。
・インプラント及び再生医療に用いられる人工生体材料の発育神経毒性の測定。
・被検物質の薬物動態学特性及び／又は薬力学特性の測定。
【００５７】
本発明は、そのような組み合わせが明らかに許容できず、又は明示的に除外されていない限り、上述した側面及び好ましい特徴の組み合わせを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明の側面及び実施態様を例示的に説明する。当業者にとっては、さらなる側面及び実施態様も明らかである。本文で言及した全ての文献は、参照することにより本願に援用される。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様において、トランスジェニック動物のゲノムは、ＧＦＡＰプロモーターに作動可能に連結された、緑色蛍光タンパク質をコードする核酸を有する。このようなトランスジェニックマウスは、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １８７， ３６−４２； ＷＯ００／０２９９７、及びＵＳ６，５０１，００３に既に開示されており、これらは特に参照することにより、その全体が本願に援用される。ＧＦＡＰプロモーターは、グリア細胞（例えば、アストロサイト、シュワン細胞、及びミュラー細胞）における蛍光タンパク質の発現を誘導する。
【００６０】
トランスジェニックマウスは、グリア細胞線維性酸性タンパク質プロモーターに作動可能に連結された、ヒト化緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする導入遺伝子が発現するように作製した。このトランスジェニックマウスでは、神経障害に応答して、グリア細胞（例えば、アストロサイト、シュワン細胞、及びミュラー細胞）における緑色蛍光タンパク質の発現が上方制御される。
【００６１】
このトランスジェニックマウスは、哺乳動物の受精卵の前核に遺伝的構造を注入し、安定的な遺伝子組み込みを自然に生じさせることにより作製した。その受精卵を子宮内に戻し、出産に至るまで発生を進行させた。
【００６２】
上記遺伝的構造は、グリア細胞に特異的な発現を実現するため、全長のグリア細胞線維性酸性タンパク質プロモーターを有する。そのプロモーターは５’側に位置し、緑色蛍光タンパク質をコードする変異遺伝子と、緑色蛍光タンパク質の３’側に位置し、適切なＲＮＡスプライシング及びポリアデニル化のためのシグナル配列を含む遺伝子をコードするＤＮＡセグメントとに、作動可能に連結されている。
【００６３】
動物の非侵襲的イメージングは、自己蛍光の対照値と被検物質の投与後の検査値とを得るように実施された（例えば、実施例１の「材料及び方法」を参照）。
【００６４】
蛍光の増大は、神経毒又は神経障害の悪化を示した。
【００６５】
以下、例示のため、本発明を実施するために本件発明者らが検討した最良の形態の具体例について説明する。本発明がこれらの具体例に限定されずに実施できることは、当業者にとって明らかである。
【００６６】
＜実施例１＞
上述したスクリーニング目的の非侵襲的蛍光イメージングシステムを構築する際に、トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス（Ｚｈｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７によって過去に作製）の新生児脳における神経毒物のモデルとして、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰを使用した。以下に示されるように、トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスモデルを適切なインビボ光学的イメージングシステムと組み合わせることで、トランスジェニックマウスの体内におけるＧＦＡＰ−ＧＦＰの特徴を確実に検出することができ、ＭＴＰＴの導入に応じた上方制御を量依存的かつ時間依存的に定量化することができる。このような合理的なスループットを示す非侵襲的光学的蛍光システムは、パーキンソニズム等の神経変性疾患や発育神経毒性の研究、或いは前臨床化合物スクリーニングにおいて、幅広い応用が可能である。
【００６７】
［材料及び方法］
（トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス）
トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスの作製及びジェノタイピングは、過去の報告（Ｚｈｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７）に従って行った。４日齢、体重２．０ｇ〜２．５ｇのＦＶＢ／Ｎ系統の新生児マウスを実験に用いた。動物の管理は、国立シンガポール大学の動物飼育施設で行った。本研究の実験プロトコルは、研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されている。
【００６８】
（神経毒物及び投与）
被検物質である２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰは、従来からのＭＰＴＰよりも効果の強い類縁体であり（Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ， ２００５）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍ−１０３）。新生児マウスには、０時間の時点で２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇの生理食塩水溶液）を単回皮下注射（ｓｃ）した。対照群には、担体として生理食塩水を用いた。そして、投与後２時間，４時間，６時間，８時間の時点で神経イメージングを行った。
【００６９】
（インビボ神経イメージング）
ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、非侵襲的イメージングを行った。先ず、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰで処理されたトランスジェニック及び非トランスジェニックのペアのマウスを隣同士に配置し、麻酔を施さず、マウスの下背部をテープによって固定した。これは、小児麻酔に広く用いられているケタミンが、新生児ラットにおいては神経のアポトーシスを増加させることにより発育神経毒性を示すという最近の研究（Ｓｃａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）に基づくものである。その後、一対の新生児マウスについて、ＩＶＩＳ（登録商標）システムに備えられたＧＦＰフィルターセットで蛍光イメージングを行った。画像収集時間は１０秒間であった。さらに、生理食塩水が注射された対照のペアについても同様の操作を行った。そして、マウスに対する２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの神経毒性作用を相対蛍光（ＲＦ）、すなわちトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける所望の領域（ＲＯＩ）から検出された全蛍光と、非トランスジェニック（ｎＴｇ）マウスのＲＯＩから検出された組織自己蛍光との比（ＴｇＲＯＩ／ｎＴｇＲＯＩ）として表現した。両者のマウスのＲＯＩは完全に同一であり、このことは本研究で輝度を定量化するために使用した全てのＲＯＩについて共通である。イメージングシステムに起因するバラつきを最小化するため、処理マウス及び対照マウスの各ペアについてそれぞれ３枚の画像を取得し、その平均値をその特定のペアにおける定量値とした。対照群（ｎ＝５ペアのマウス）の値と処理群（ｎ＝５ペアのマウス）の値とは平均値±ＳＥＭとして表され、統計的有意性は、スチューデントの２標本両側ｔ検定によって評価した。
【００７０】
（免疫組織化学）
ＣＮＳのアストロサイトからフォトンが放出されているか否かを確認するため、脳を摘出し、４％パラホルムアルデヒドを含有する０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ， ｐＨ７．４）によって４℃、４時間の条件で固定化した。ＰＢＳ中で１５分間ずつ３回インキュベーションすることにより脳を洗浄し、その後、３０％ショ糖溶液中に４℃で一晩浸漬した。全ての脳を液体窒素中に浸漬することにより凍結溶媒中に埋め込み、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎｕｓｓｌｏｃｈ ＧｍｂＨ； ＣＭ−３０５０Ｓ）を用いてそれらを切片化した。得られた冠状凍結切片（２０μｍ厚の黒質；ブレグマ −３．１６ｍｍ、両耳間 ０．６４ｍｍ）を、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓ，２００１）に従って免疫組織化学に用いた。対照群及び処理群のそれぞれは４匹の動物を含む（ｎ＝３）。
【００７１】
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びＧＦＡＰの免疫染色のため、ウサギ抗ＴＨポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ； Ａｂ−１５２）とウサギ抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ； Ｚ−０３３４）とを用いた。凍結切片を０．１５Ｍの１×ＰＢＳ中で５分間洗浄し、さらに、ブロッキング溶液（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と１０％非免疫ヤギ血清とを含有するＰＢＳ）中で４℃、４時間の条件でインキュベートした。その凍結切片を、０．１５Ｍの１×ＰＢＳ中で１５分間ずつ３回インキュベーションすることにより洗浄した。その後、脳切片を、抗ＴＨ抗体（１：２００）及び抗ＧＦＡＰ抗体（１：２００）とともに４℃で一晩インキュベートした。この抗体は、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と１％非免疫ヤギ血清とを含有するＰＢＳ中に含まれている。さらに、その切片を１×ＰＢＳで１５分間ずつ３回洗浄した後、テキサスレッド共役ヤギポリクローナル抗ウサギＩｇＧ２次抗体（Ａｂｃａｍ Ｌｔｄ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｕ．Ｋ．； Ａｂ−７０８８）とともに室温で２時間インキュベートした。この抗体は、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と１％非免疫ヤギ血清とを含有するＰＢＳによって１：１００に希釈されている。１×ＰＢＳで１５分間ずつ３回洗浄した後、その切片に１０μｌの蛍光媒体によってカバースリップを設け、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ． Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ； ＩＸ−７１）で観察した。
【００７２】
［結果］
（ＧＦＰ蛍光レベルに対する２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの影響）
先ず、脳のＲＯＩから内在的ＧＦＰ蛍光を検出し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、図１（Ａ）に示すように神経領域からの発光をフォトン／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｓｒ）の単位で定量化した。ＣＮＳのアストロサイトからフォトンが放出されているか否かを確認するため、インビボでの最後のイメージングが終わった時点で、脳を摘出し、エクスビボでのイメージングを行った（図１（Ｂ））。この方式により、対照トランスジェニックマウス及び処理トランスジェニックマウスについて、ＧＦＰ蛍光を定性的かつ定量的に比較することが可能になる。
【００７３】
図２のインビボ画像に示されるように、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）が単回投与されたトランスジェニック新生児マウスは、対応する非トランスジェニックのマウスやトランスジェニックの対照マウスよりも、ＲＯＩにおけるＧＦＰ蛍光（フォトン／秒／ｃｍ２／ｓｒ）が有意に増大していた。図３に示すＧＦＰ蛍光の定量値により、図２の観察結果が補強される。すなわち、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ処理群と対照群とでは、投与後４時間，６時間，８時間の時点で相対蛍光（ＲＦ）に有意差が観察され、処理群については、投与後６時間の時点で対照群に対して平均２２％と最も有意（ｐ＜０．０１）に増大した。２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ処理群内では同様であり、０時間の時点と比較すると、４時間，６時間，８時間の時点でＲＦが有意に増大し、特に投与後６時間の時点では、平均１７％と最も有意（ｐ＜０．０００１）に増大した。対照群内では、経時的なＲＦの有意差は観察されなかった（図３）。
【００７４】
（ＧＦＡＰ免疫組織化学）
海馬におけるＧＦＡＰ免疫染色の代表画像を図４に示す。アストロサイトにおけるＧＦＰ発現は、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）の単回投与から６時間の時点で、脳室領域及び海馬領域において明らかに増加していた。非トランスジェニックマウスでは、ＧＦＰ発現は観察されなかった（図４のＡ）。ＧＦＰ発現細胞がアストロサイトであることを確かめるため、同じ切片についてＧＦＡＰの免疫染色を行ったところ、海馬溝におけるＧＦＡＰ免疫陽性の血管周囲アストロサイトと内在性ＧＦＰの蛍光が観察されたアストロサイトとの共局在化は、殆どが突起部分で生じており、細胞体では生じていなかった（２重ラベルされた細胞突起を図４のＤ，Ｅにおいて矢印で示す）。
【００７５】
（ＴＨ免疫組織化学染色）
黒質緻密部（ＳＮＣ）におけるＴＨ免疫染色の代表画像を図５に示す。ＴＨ抗体が結合したドーパミン作動性ニューロンのサイズ（〜２０μｍ）は、免疫組織化学染色を行っていない、内在性ＧＦＰの蛍光が観察されたアストロサイトのサイズ（〜１０μｍ）よりも大きく、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰで処理した新生児マウスのＳＮＣにおける検出が容易であった。ドーパミン作動性細胞の細胞体や繊維は強く染まっており、ＳＮＣには明らかに免疫陽性突起が存在した。２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）の処理から６時間の時点で、ＴＨ免疫陽性の繊維及び細胞体の減少は観察されなかった。しかしながら、アストロサイト内におけるＧＦＡＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の発現は、０時間の時点と比べて６時間の時点では、明らかに上方制御されていた。図５のＡに示すように、非トランスジェニックマウスのＳＮＣにおけるドーパミン作動性ニューロンは、ＴＨ免疫陽性であったが、グリア細胞は導入遺伝子を発現しなかった。ＴＨ免疫陽性のドーパミン作動性ニューロンと、免疫組織化学染色を行っていない、内在性ＧＦＰの蛍光が観察されたアストロサイトとの共局在化は観察されなかった。
【００７６】
＜実施例２：トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰ成体マウスのイメージング＞
（皮弁インビボイメージング）
麻酔が施されたトランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰ成体マウスに皮弁（片側を残したまま皮膚を体から切り剥がしたもの）を形成した。脳及び肝臓の皮弁が形成された部分について、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、インビボイメージングを行った。マウスの体の他の部分からの組織自己蛍光を遮蔽するために低蛍光の黒紙を用い、脳（図６（Ａ））及び肝臓（図６（Ｂ））の皮弁が形成された部分のみを露出させた。
【００７７】
（エクスビボイメージング）
図７（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、トランスジェニック（Ｔｇ）マウス及び非トランスジェニック（ｎＴｇ）マウスの両者から脳、肝臓、腎臓、及び坐骨神経を摘出し、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いてエクスビボでイメージングを行った。放出されたフォトンの数に対応した擬似カラー画像において、ＴｇマウスとｎＴｇマウスとで有意差が観察された。現在、成体マウスに対する代替的な画像診断法の実現可能性調査を行っているところである。
【００７８】
＜実施例３：新生児トランスジェニックマウスにおけるパーキンソニズム及び神経毒性の研究のための非侵襲的脳イメージング法＞
［実験手順］
（動物）
この研究は、４日齢の新生児マウス（実験時点で体重３〜５ｇ）を用いて行った。動物は自由に摂食させ、使用する動物数及び動物の苦痛を最小限とするように努めた。
【００７９】
（毒物注射）
使用した神経毒は２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰである。８ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを２時間毎に４回皮下注射し、投与後２４時間、４８時間、７２時間の時点でインビボ神経画像を取得した。
【００８０】
（ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ及びウエスタンブロット）
先ず、ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ及びウエスタンブロットのため、投与後２４時間の時点でマウスを犠牲死させた。そして、脳を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びポトテイナーゼ阻害剤を含むサンプルバッファで溶解した。全タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法で確認した。次に、そのサンプルを、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリスゲル（４％〜１２％）を用いて、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリス電気泳動にかけた。各サンプルは１５μｇのタンパク質を含む。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。その後、５％無脂肪ドライミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて、４℃で膜のブロッキングを行った。続いて、その膜を１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ヤギＧＦＡＰ抗体（Ｄａｋｏ）／ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（ａｂｃａｍ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで１５分間ずつ３回洗浄した。さらに、その膜を１：２０００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで５分間ずつ３回洗浄した。そして、化学発光検出溶液（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びオートラジオグラフィーフィルムを用いて、２次抗体を可視化した。ウエスタンブロットの終了後、そのニトロセルロース膜をＩＶＩＳ（登録商標）装置でイメージングした。ＥＣＬ Ｐｌｕｓ検出溶液を用いた場合、結合したＨＲＰ、及びＬｕｍｉｇｅｎ ＰＳ−３ アクリダン基質の過酸化物によって触媒された酸化反応により、毎分何千ものアクリジニウムエステル中間体が生成される。この中間体は弱アルカリ性条件下で過酸化物と反応し、４３０ｎｍが極大となる、長時間かつ高強度の化学発光を生じる。この化学発光シグナルは、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて検出することができる。発光強度を示すカラーの膜の画像が得られる。
【００８１】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
先ず、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのため、投与後２４時間の時点でマウスを犠牲死させた。そして、脳を摘出し、ＲＡ１バッファ及びβ−メルカプトエタノールで溶解した。次に、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ ＩＩ キットを用いて、脳から全ＲＮＡを抽出した。そして、ランダムヘキサマーを用いてその全ＲＮＡを逆転写し、遺伝子発現を定量化するために、得られたｃＤＮＡについてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００８２】
［実験結果］
ＭＰＴＰ（４×８ｍｇ／ｋｇ）
（インビボ神経画像）
図８に示すように、脳における所望の領域（ＲＯＩ）から内在的ＧＦＰ蛍光を検出し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、神経領域からの発光をフォトン／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｓｒ）の単位で定量化した。インビボ画像に示されるように、ＭＰＴＰ（８ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）が４回投与されたトランスジェニック新生児マウスは、投与後２４時間の時点の対照マウスと比較したとき、ＲＯＩにおけるＧＦＰ蛍光（フォトン／秒／ｃｍ２／ｓｒ）が最も有意に増大していた。図９に示すＧＦＰ蛍光の定量値によると、ＭＰＴＰ処理群と対照群とでは、投与後２４時間の時点で相対蛍光（ＲＦ）に有意差が観察され、対照群に対して平均１５％と有意（ｐ＜０．０１）に増大した。ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）が単回投与されたトランスジェニック新生児マウスや、対照群内では、経時的なＲＦの有意差は観察されなかった（図９）。
【００８３】
（ウエスタンブロット結果）
図１０（Ａ）に示すウエスタンブロット結果から分かるように、Ｄａｋｏの抗ウサギＧＦＡＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＡＰについて報告された分子量と一致した約５１ｋＤａの位置にバンドが検出された。また、Ａｂｃａｍの抗ウサギＧＦＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＰについて報告された分子量と一致した約２７ｋＤａの位置にバンドが検出された。バンドの太さから、トランスジェニックマウスにおいては、０時間から２４時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の量が増加していることが分かる（レーンａとレーンｂとの比較）。非トランスジェニックマウスにおいても、０時間から２４時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質の量が増加している（ＧＦＡＰウエスタンブロットにおけるレーンｃとレーンｄとの比較）。非トランスジェニックマウス（ＧＦＰウエスタンブロットにおけるレーンｃ，ｄ）においては、導入遺伝子が存在しないため、ＧＦＰタンパク質は検出されなかった。ＩＶＩＳ（登録商標）を用いてウエスタンブロット膜をイメージングしたところ、タンパク質量を表すカラー画像は、同様の結果を示していた（図１０（Ｂ）を参照）。このことは、ＭＰＴＰの投与によってＧＦＡＰが上方制御され、これによりＧＦＰも上方制御されるという事実を補強するものである。
【００８４】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果）
ｍＲＮＡの研究は、ＢＣＡのタンパク質における研究結果や、長い研究過程ではインビボ神経画像と一致するものである。図１１（Ａ）に示すように、ＭＴＰＴ処理後２４時間の時点におけるＧＦＡＰの遺伝子発現は、トランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスの両者とも、未処理のマウスと比較してそれぞれ９１％（ｐ＜０．０１）、８８％（ｐ＜０．０１）と有意に誘導されていた。しかしながら、ＭＴＰＴ処理後２４時間の時点におけるＧＦＰの遺伝子発現は、未処理のマウスと比較して有意に誘導されていなかった（図１１（Ｂ））。これにより、ＭＰＴＰ処理後４８時間、７２時間の時点で神経画像における相対蛍光が減少していることが説明できる（図８，図９を参照）。
【００８５】
（内在性ＧＦＰ及びＴＨ免疫組織化学）
結果を図１２，図１３に示す。
【００８６】
＜実施例４：新生児トランスジェニックマウスにおけるパーキンソニズム及び神経毒性の研究のための非侵襲的脳イメージング法＞
［実験手順］
（動物）
この研究は、４日齢の新生児マウス（実験時点で体重３〜５ｇ）を用いて行った。動物は自由に摂食させ、使用する動物数及び動物の苦痛を最小限とするように努めた。
【００８７】
（毒物注射）
使用した神経毒は２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ及びカイニン酸（ＫＡ）である。ＭＰＴＰの投与は、１２ｍｇ／ｋｇの濃度の単回注射により行われた。ＫＡの投与は、２ｍｇ／ｋｇの濃度の単回注射により行われた。注射は全て皮下である。
【００８８】
（ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ及びウエスタンブロット）
ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスを、投与後６時間の時点で犠牲死させた。そして、脳を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びポトテイナーゼ阻害剤を含むサンプルバッファで溶解した。全タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法で確認した。次に、そのサンプルを、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリスゲル（４％〜１２％）を用いて、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリス電気泳動にかけた。各サンプルは１５μｇのタンパク質を含む。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。その後、５％無脂肪ドライミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて、４℃で膜のブロッキングを行った。続いて、その膜を１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ヤギＧＦＡＰ抗体（Ｄａｋｏ）／ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（ａｂｃａｍ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで１５分間ずつ３回洗浄した。さらに、その膜を１：２０００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで５分間ずつ３回洗浄した。そして、化学発光検出溶液（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びオートラジオグラフィーフィルムを用いて、２次抗体を可視化した。同様の操作を、ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスについても行った。ウエスタンブロットの終了後、ニトロセルロース膜をＩＶＩＳ（登録商標）装置でイメージングした。ＥＣＬ Ｐｌｕｓ検出溶液を用いた場合、結合したＨＲＰ、及びＬｕｍｉｇｅｎ ＰＳ−３ アクリダン基質の過酸化物によって触媒された酸化反応により、毎分何千ものアクリジニウムエステル中間体が生成される。この中間体は弱アルカリ性条件下で過酸化物と反応し、４３０ｎｍが極大となる、長時間かつ高強度の化学発光を生じる。この化学発光シグナルは、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて検出することができる。発光強度を示すカラーの膜の画像が得られる。
【００８９】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスを、投与後２時間の時点で犠牲死させた。そして、脳を摘出し、ＲＡ１バッファ及びβ−メルカプトエタノールで溶解した。次に、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ ＩＩ キットを用いて、脳から全ＲＮＡを抽出した。そして、ランダムヘキサマーを用いてその全ＲＮＡを逆転写し、遺伝子発現を定量化するために、得られたｃＤＮＡについてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。同様の操作を、ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスについても行った。
【００９０】
［実験結果］
ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）
（ウエスタンブロット結果）
図１４（Ａ）に示すウエスタンブロット結果から分かるように、Ｄａｋｏの抗ウサギＧＦＡＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＡＰについて報告された分子量と一致した約５１ｋＤａの位置にバンドが検出された。また、Ａｂｃａｍの抗ウサギＧＦＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＰについて報告された分子量と一致した約２７ｋＤａの位置にバンドが検出された。バンドの太さから、トランスジェニックマウスにおいては、０時間から６時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の量が増加していることが分かる（レーンａとレーンｂとの比較）。非トランスジェニックマウスにおいても、０時間から６時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質の量が増加している（ＧＦＡＰウエスタンブロットにおけるレーンｃとレーンｄとの比較）。非トランスジェニックマウス（ＧＦＰウエスタンブロットにおけるレーンｃ，ｄ）においては、導入遺伝子が存在しないため、ＧＦＰタンパク質は検出されなかった。ＩＶＩＳ（登録商標）を用いてウエスタンブロット膜をイメージングしたところ、タンパク質量を表すカラー画像は、同様の結果を示していた（図１４（Ｂ）を参照）。このことは、ＭＰＴＰの投与によってＧＦＡＰが上方制御され、これによりＧＦＰも上方制御されるという事実を補強するものである。
【００９１】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果）
ｍＲＮＡの研究は、ＢＣＡのタンパク質における研究結果やウエスタンブロットと一致するものである。ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の上方制御は６時間の時点でピークとなるので、ＧＦＡＰ及びＧＦＰのｍＲＮＡの上方制御は、ＭＰＴＰ処理の２時間後には生じていた。この時間差は、ｍＲＮＡからタンパク質に翻訳する時間を表している。図１５に示すように、ＭＴＰＴ処理後２時間の時点におけるＧＦＡＰ及びＧＦＰの遺伝子発現は、それぞれ４７％（ｐ＜０．００１）、２０％（ｐ＜０．０１）と有意に誘導されていた。
【００９２】
ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）
（インビボ神経画像）
図１６に示すように、脳における所望の領域（ＲＯＩ）から内在的ＧＦＰ蛍光を検出し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、神経領域からの発光をフォトン／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｓｒ）の単位で定量化した。インビボ画像に示されるように、ＫＡ（２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）が単回投与されたトランスジェニック新生児マウスは、投与後６時間の時点の対照マウスと比較したとき、ＲＯＩにおけるＧＦＰ蛍光（フォトン／秒／ｃｍ２／ｓｒ）が最も有意に増大していた。図１７に示すＧＦＰ蛍光の定量値によると、ＫＡ処理群と対照群とでは、投与後４時間、６時間の時点で相対蛍光（ＲＦ）に有意差が観察され、処理群については、投与後６時間の時点で対照群に対して平均２５％と最も有意（ｐ＜０．０１）に増大した。ＫＡ処理群内では同様であり、０時間の時点と比較すると、処理後６時間の時点で平均２２％と最も有意（ｐ＜０．０５）に増大した。対照群内では、経時的なＲＦの有意差は観察されなかった（図１７）。
【００９３】
（ウエスタンブロット結果）
図１８（Ａ）に示すウエスタンブロット結果から分かるように、Ｄａｋｏの抗ウサギＧＦＡＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＡＰについて報告された分子量と一致した約５１ｋＤａの位置にバンドが検出された。また、Ａｂｃａｍの抗ウサギＧＦＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＰについて報告された分子量と一致した約２７ｋＤａの位置にバンドが検出された。バンドの太さから、トランスジェニックマウスにおいては、０時間から６時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の量が増加していることが分かる（レーンａとレーンｂとの比較）。非トランスジェニックマウスにおいても、０時間から６時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質の量が増加している（ＧＦＡＰウエスタンブロットにおけるレーンｃとレーンｄとの比較）。非トランスジェニックマウス（ＧＦＰウエスタンブロットにおけるレーンｃ，ｄ）においては、導入遺伝子が存在しないため、ＧＦＰタンパク質は検出されなかった。ＩＶＩＳ（登録商標）を用いてウエスタンブロット膜をイメージングしたところ、タンパク質量を表すカラー画像は、同様の結果を示していた（図１８（Ｂ）を参照）。このことは、ＫＡの投与によってＧＦＡＰが上方制御され、これによりＧＦＰも上方制御されるという事実を補強するものである。
【００９４】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果）
ｍＲＮＡの研究は、ＢＣＡのタンパク質における研究結果やウエスタンブロットと一致するものである。ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の上方制御は６時間の時点でピークとなるので、ＧＦＡＰ及びＧＦＰのｍＲＮＡの上方制御は、ＭＰＴＰ処理の２時間後には生じていた。この時間差は、ｍＲＮＡからタンパク質に翻訳する時間を表している。図１９に示すように、ＫＡ処理後２時間の時点におけるＧＦＡＰ及びＧＦＰの遺伝子発現は、それぞれ２１％（ｐ＜０．０１）、２２％（ｐ＜０．０５）と有意に誘導されていた。
【００９５】
（ＧＦＡＰ免疫組織化学）
海馬のＣＡ１，ＣＡ２，及びＣＡ３サブエリアにおけるＧＦＡＰ免疫染色の代表画像を図２０のＡ〜Ｄに示す。アストロサイトにおけるＧＦＰ発現は、ＫＡ（２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）の単回投与から６時間の時点で、様々な領域において明らかに増加していた。ＧＦＰ発現細胞がアストロサイトであることを確かめるため、同じ切片についてＧＦＡＰの免疫染色を行ったところ、海馬のＣＡ１領域におけるＧＦＡＰ免疫陽性のアストロサイトと内在性ＧＦＰの蛍光が観察されたアストロサイトとの共局在化は、殆どが突起部分で生じており、細胞体では生じていなかった（２重ラベルされた細胞突起を図２０のＢにおいて矢印で示す）。
【００９６】
＜実施例の考察＞
トランスジェニックマウスにおいて、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を誘導する。ＧＦＡＰは、主として中枢神経系（ＣＮＳ）のアストロサイトに発現している中間フィラメントタンパク質である。これらのグリア細胞における変化は、神経活性のモニターに利用することができる。ＣＮＳのニューロンに対する傷害により、ＧＦＡＰが強く誘導される。しかしながら、インビトロアッセイでＧＦＡＰをモニタリングするには、動物を犠牲死させる必要がある。本件発明者らは、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ発現の非侵襲的インビボ神経イメージングにより、長期間に亘りＧＦＡＰをモニターすることができ、この過程で犠牲となる動物の数を減らせることを示した。
【００９７】
２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰは、黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンを変性させる神経毒である。また、カイニン酸は、脳に興奮毒性損傷を与える神経毒である。いずれの神経毒もＧＦＡＰ発現を増加させることが知られている。このことは、診断や処置（すなわち、候補薬物や治療）、或いは神経毒性の研究のための非侵襲的インビボイメージングのモデルへと発展させることができる。これらの神経毒を新生児マウスに注射し、その神経毒に起因した新生児脳におけるＧＦＡＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の蛍光の増大を、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて検査した。非侵襲的インビボ神経イメージングモデルが神経発生の研究において信頼できるものであるという結論を補強するため、インビトロアッセイも行った。すなわち、タンパク質発現を定量化するためにＢＣＭＴＭタンパク質アッセイ（ＧＦＰ）及びウエスタンブロットを行い、遺伝子発現を定量化するためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。これらのアッセイは、神経毒の投与によって新生児マウスで生じている変化を追跡するのに用いることができ、その結果はインビボ神経イメージングの結果に匹敵する。
【００９８】
過去半世紀の間、細胞生物学及び分子生物学では、培養皿で培養された細胞について、遺伝子やタンパク質を含む細胞構成要素を細胞外から分析していた。追跡し、分子、タンパク質、及び細胞についての機能情報をインビボで得るために光学プローブを用いる技術は、新規であり、かつ急速に広まったものである。この技術は、感染症、腫瘍学、薬物動態学、薬力学、毒物学、或いはトランスジェニック動物における生物発光又は蛍光のレポーターにおける遺伝子発現の研究など、幅広い応用が可能である（Ｃｏｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｂｈａｕｍｉｃ ａｎｄ Ｇａｍｂｈｉｒ， ２００２； Ｂｏｕｖｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。Ｈｏｆｆｍａｎ（Ｈｏｆｆｍａｎ， ２００４）によって説明されているように、レポーター遺伝子としてＧＦＰが現れたことにより、細胞生物学及び分子生物学においてパラダイム変化が可能になっている。迅速かつ利用し易いイメージング技術を前臨床研究に導入することにより、定量的なデータを得る回数が増え、各プロトコルについてより多くの、かつ質の高い実験データを得ることが可能になるであろう。生きている動物個体を複数の時点でイメージングすることにより、研究者は、無傷の臓器に対する状況毎の影響下で生体分子プロセスを分析することができる。また、追加的な利点として、この方法によれば、より少数の動物がより少ないストレスで統計的優位性の高いデータを得ることができる。非侵襲的な方法は、縦断的研究デザイン、内部実験対照、分子情報、及び定量データの特徴を有する、より予測的な動物モデルの構築に用いることができ、このような方法は、科学研究と、人道的な動物使用との両者にとって有益である。さらに、このようなイメージングは、組織学のための組織採取や生化学分析について適切な目標を与える点で、研究自体を改善することができる。
【００９９】
本研究が直面している１つの問題は、自己蛍光源についてである。典型的に、動物組織（エラスチン、コラーゲン、トリプトファン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ポルフィリン、及びフラビンを含む）における内在的は発色団によって生じる組織自己蛍光は、特に可視波長域においては、機器の自己蛍光よりも遥かに大きい。所望の蛍光プローブの検出能力に影響を与えるため、インビボイメージングにおいては自己蛍光が一番の懸念事項となる。この研究で観察されたように、新生児マウスからの自己蛍光は、マウスが生まれてから成体になるまでに増大する。このため、本件発明者らは、トランスジェニックマウスからの全蛍光を非トランスジェニックマウスからの自己蛍光で正規化して相対蛍光（ＲＦ）を得ることにより、シグナル／ノイズ（ｓ／ｎ）比をモニターする安全システムを考案した。ＲＦが閾値１．３、或いはトランスジェニックマウスから検出されたＧＦＰシグナルの３０％に届かなかった場合、そのデータはｓ／ｎ比が低過ぎ、正確な定量結果を得るために使用できないと考えられる。
【０１００】
モデル物質として２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰを用いたとき、非侵襲的インビボ神経イメージングモデルによって得られたデータは、組織学的に確認された、上方制御されたアストロサイトの存在と整合するものであった。ＭＰＴＰがインビボで中脳のドーパミンニューロンの神経変性死を特異的に誘導し、動物のパーキンソニズムやヒトのパーキンソン病を生じさせることについては、多くの報告がある（Ｄａｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｇｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｏｌａｎｏｗ ａｎｄ Ｔａｔｔｏｎ， １９９９）。過去の研究により、ＭＰＴＰ誘導パーキンソニズムの病理過程におけるアストロサイトの潜在的な役割が示唆されている。例えば、ＭＰＴＰが全身注射された成体マウスは、アストロサイト内のＧＦＡＰが有意に増加し、同時に脳線条体のドーパミン作動性ニューロンにおけるドーパミンが減少する（Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｋｕｒｏｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。注目すべきことに、脳におけるＭＰＴＰ傷害に対する高い影響性は、同じ遺伝的背景を有するより高齢のマウスにおいても観察された（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。成体マウス脳に対するＭＰＴＰの作用に関する研究に比べて、新生児脳のアストロサイトがどのようにＭＰＴＰに反応しているかに関する文献は少ないが、これは恐らく、脳発生の期間、ＧＦＡＰの転写活性を繰り返し非侵襲的に測定する適切な方法がないためである。しかしながら、新生児マウスに対するＭＰＴＰの全身注射によって、成体になっても脳に永久的な障害を受けることを示した報告は殆ど存在しない（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ， １９９４）。とはいえ、これらの初期の報告により、発生中の脳もまたＭＰＴＰに弱く、注意深い調査が必要であることが分かる。したがって、上記したモデルにより、生きている動物における神経変性を研究する幾つかの新たな可能性が得られる。本発明によれば、生きている動物における脳卒中又は挫滅外傷による神経障害を予防するために、様々な薬物の効果をモニターすることができる。さらに、このＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック新生児マウスは、アルツハイマー病（Ｖａｎｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５）やハンチントン病（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１）の種々のモデルにおいて生じるＧＦＡＰの上方制御を研究する際や、種々の薬物治療における神経保護作用を非侵襲的にモニターする際に用いることができる。神経変性のほかに、このマウスは、脳腫瘍の発生及び治療の研究にも有用である。Ｋａｌａｍａｒｉｄｅｓらによる最近の論文（Ｋａｌａｍａｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２）には、クモ膜細胞においてＮｆ２遺伝子が非活性化されたマウス髄膜腫モデルが示されている。腫瘍が脳組織を侵食し、成長する際には、腫瘍を取り巻くアストロサイトにおいてＧＦＡＰ発現が上方制御されている（Ｐｅｋｎｙ ａｎｄ Ｎｉｌｓｓｏｎ， ２００５）。本発明のさらなる利点は、あらゆる神経毒性作用を避けるため、新生児マウスに麻酔が施されない点である。
【０１０１】
２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰで処理したマウスでは、ＳＮＣ及び腹側被蓋領域において、ＴＨ様免疫反応の明らかな変化は観察されず、黒質ドーパミンニューロンの変性は、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの注射後６時間では未だ明らかでないことを示していた。このことは、ＭＰＴＰ処理から５日後にドーパミン作動性ニューロンが減少するというＡｒａｋｉらの観察（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１）や、ＴＨ免疫陽性の繊維及び細胞体は、線条体及び黒質においてＭＰＴＰ処理から１日後に減少するというＫｕｒｏｓａｋｉらの発見とよく一致している。２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの全身投与、及び投与後２４，４８，７２時間に亘るＧＦＡＰ及びＴＨ免疫染色に対する効果についてのさらなる研究により、この分野における知見が広がるであろう。
【０１０２】
ＭＰＴＰに加え、数多くの他の化学物質もまた、成体マウス脳の様々な領域に神経障害を与えることがＧＦＡＰ上昇によって立証され、報告されている。このような化学物質には、トリメチル錫（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， １９８８）及びメチル水銀（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， １９８８； Ｂａｒｏｎｅ Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．， ２００２）のような工業用毒性物質、農業用殺虫剤（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．， ２００２）から食品添加物（Ｏｓｔｅｒｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５）まで、構造的にも機能的にも異なる多くの化合物が含まれる。発生後の成体の脳と比較して血液脳関門が不完全である発生中の脳は、公知の神経毒によって引き起こされる障害、さらに重要なことには、神経毒性の検査を適切に受けることなく人間の食物連鎖や環境中に紛れ込んだ多数の化学物質に対して非常に弱い。化学物質が発生中の脳に対して神経毒性を示す可能性を検査することの重要性は、特に沈黙の神経毒性（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．， ２００４）の問題を扱う上で、強調し過ぎることはない（Ｏｌｎｅｙ， ２００２）。このことは、Ｔｉｌｓｏｎ（Ｔｉｌｓｏｎ， ２０００）によってレビューされた、米国環境保護庁の発育神経毒性試験に関するガイドライン（ＤＮＴＧ）によってより深刻なものとなっている。最近になり、欧州委員会は、全ての化学物質を厳正に検査することを新たな欧州連合の規制枠組みとして採択したが、実現には７０億ユーロに上る費用と少なくとも１０年の歳月とを要すると見積もられている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ， ２００３）。しかしながら、従来のＧＦＡＰ技術を用いて、発生中のＣＮＳに対する神経毒性リスクを多数の化学物質についてインビボで調査することは、特に、そのアッセイ法は合理的なスループットが得られる科学的根拠のあるものでなければならず、工業的（Ｋａｕｆｍａｎｎ， ２００３）にも取締機関（Ｈａｓｓ， ２００３）にとっても、コストが許容できるものでなければならない、という点を考慮に入れると、困難な課題である。
【０１０３】
脳の主用な領域のうちグリア細胞で特異的な発現を示す（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、実績のあるＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスモデル（Ｚｈｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を適切なインビボ光学的バイオイメージングシステムと組み合わせることにより、神経変性疾患、発育神経毒性の非侵襲的な研究、化学物質のリアルタイム選別、或いは外傷からの創傷治癒、脳卒中、及び腫瘍増殖といった他のＣＮＳ病理学における治療的介入の可能性についての研究が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】（Ａ）トランスジェニック及び非トランスジェニックの新生児マウスのペアにおけるインビボ蛍光画像を示す図である。トランスジェニックマウスの脳のＲＯＩからは全蛍光が検出され、非トランスジェニックマウスからは組織自己蛍光が検出された。定量化は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、フォトン／秒／ｃｍ２／ｓｒの単位で行われた。（Ｂ）トランスジェニック及び非トランスジェニックの新生児マウスのペアにおけるエクスビボ蛍光画像を示す図である。
【図２】ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック新生児マウスの非侵襲的インビボ神経イメージングを示す図である。マウスは、生理食塩水（対照）又は１２ｍｇ／ｋｇの２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰを用いて、本文中に示されるように処理された。マウスは、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの投与前に０時間の時点でイメージングされた。画像収集時間は１０秒間であった。マウスの各ペアは、トランスジェニックマウスを右側に示し、非トランスジェニックマウスを左側に示す。
【図３】相対蛍光（ＲＦ）として表現された、トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された全蛍光と非トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された組織自己蛍光との比を、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ処理群と対照群とで比較した図（平均±ＳＥＭ， ｎ＝５）である。ＲＦは０時間の時点に対して正規化されている。＊は２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ処理群と対照群との間の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。＊＊（ｐ＜０．０１）は対照群との比較である。スチューデントの２標本両側ｔ検定。
【図４】海馬におけるＧＦＡＰ免疫染色の共焦点画像を示す図である。（Ａ）ｎＴｇマウスではＧＦＰ発現が観察されなかった。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ，Ｃ）Ｔｇマウスに対する２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの投与から６時間の時点でＧＦＰ発現の増加が観察された。１０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝２００μｍ。（Ｄ，Ｅ）４０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝５０μｍ。ＧＨＡＰ免疫陽性のアストロサイトと内在性ＧＦＡＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の蛍光が観察されたアストロサイトとの細胞突起への局在化を矢印で示す。
【図５】黒質緻密部（ＳＮＣ）におけるＴＨ免疫染色の共焦点画像を示す図である。（Ａ）ｎＴｇマウスではＧＦＰ発現が観察されなかった。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ，Ｃ）Ｔｇマウスに対する２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの投与から６時間の時点でＧＦＰ発現の増加が観察された。２０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝１００μｍ。（Ｄ，Ｅ）４０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝５０μｍ。
【図６】ＧＦＡＰ−ＧＦＰ成体マウスのインビボ皮弁イメージングを示す図である。（Ａ）脳、（Ｂ）肝臓。
【図７】トランスジェニック（Ｔｇ）マウス及び非トランスジェニック（ｎＴｇ）マウスのエクスビボイメージングを示す図である。（Ａ）脳、（Ｂ）肝臓、（Ｃ）坐骨神経、（Ｄ）腎臓。
【図８】ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック新生児マウスの非侵襲的インビボ神経イメージングを示す図である。マウスは、生理食塩水（対照）又は８ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを用いて、本文中に示されるように処理された。マウスは、ＭＰＴＰの投与前に０時間の時点でイメージングされた。画像収集時間は１０秒間であった。マウスの各ペアは、トランスジェニックマウスを右側に示し、非トランスジェニックマウスを左側に示す。
【図９】相対蛍光（ＲＦ）として表現された、トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された全蛍光と非トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された組織自己蛍光との比を、１×１２ｍｇ／ｋｇ又は４×８ｍｇ／ｋｇで投与されたＭＰＴＰ処理群と対応する対照群とで比較した図（平均±ＳＥＭ， ｎ＝５）である。ＲＦは０時間の時点に対して正規化されている。＊はＭＰＴＰ処理群と対照群との間の統計的有意性（ｐ＜０．０１）を示す。スチューデントの２標本両側ｔ検定。
【図１０】（Ａ）ウエスタンブロットを用いて確認された、ＭＰＴＰ（４×８ｍｇ／ｋｇ）によるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。レーンａ：未処理のトランスジェニックマウス。レーンｂ：ＭＰＴＰ処理後２４時間のトランスジェニックマウス。レーンｃ：未処理の非トランスジェニックマウス。レーンｄ：ＭＰＴＰ処理後２４時間の非トランスジェニックマウス。（Ｂ）ウエスタンブロット膜のＩＶＩＳ（登録商標）イメージングにより確認された、ＭＰＴＰによるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。ユニットの単位はｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒである。
【図１１】（Ａ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＭＰＴＰ（４×８ｍｇ／ｋｇ）によるトランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスにおけるＧＦＡＰ遺伝子の発現に対する影響を示す図である。結果は誘導倍率±ＳＥＭを得るために、対照（未処理）に対して正規化されている。＊ｐ＜０．０１。ｎ＝４。標本両側ｔ検定。（Ｂ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＭＰＴＰ（４×８ｍｇ／ｋｇ）によるトランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスにおけるＧＦＰ遺伝子の発現に対する影響を示す図である。結果は誘導倍率±ＳＥＭを得るために、対照（未処理）に対して正規化されている。
【図１２】新生児脳の異なる部位における、ＭＰＴＰ処理前後の内在性ＧＦＰを示す図である。
【図１３】８〜１０週齢の成体トランスジェニックマウスを用いた、抗ＴＨによる免疫組織化学（黒質緻密部）の結果を示す図である。
【図１４】（Ａ）ウエスタンブロットを用いて確認された、ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）によるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。レーンａ：未処理のトランスジェニックマウス。レーンｂ：ＭＰＴＰ処理後６時間のトランスジェニックマウス。レーンｃ：未処理の非トランスジェニックマウス。レーンｄ：ＭＰＴＰ処理後６時間の非トランスジェニックマウス。（Ｂ）ウエスタンブロット膜のＩＶＩＳ（登録商標）イメージングにより確認された、ＭＰＴＰによるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。ユニットの単位はｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒである。
【図１５】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）によるトランスジェニックマウスにおけるＧＦＡＰ遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の発現に対する影響を示す図である。結果は誘導倍率±ＳＥＭを得るために、対照（未処理）に対して正規化されている。＊ｐ＜０．０１、＊＊＜０．００１。ｎ＝５。標本両側ｔ検定。
【図１６】ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック新生児マウスの非侵襲的インビボ神経イメージングを示す図である。マウスは、生理食塩水（対照）又は２ｍｇ／ｋｇのＫＡを用いて、本文中に示されるように処理された。マウスは、ＫＡの投与前に０時間の時点でイメージングされた。画像収集時間は１０秒間であった。マウスの各ペアは、トランスジェニックマウスを右側に示し、非トランスジェニックマウスを左側に示す。
【図１７】相対蛍光（ＲＦ）として表現された、トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された全蛍光と非トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された組織自己蛍光との比を、２ｍｇ／ｋｇで投与されたＫＡ処理群と対照群とで比較した図（平均±ＳＥＭ， ｎ＝４）である。ＲＦは０時間の時点に対して正規化されている。＊はＫＡ処理群と対照群との間の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。＊＊（ｐ＜０．０１）は対照群との比較である。スチューデントの２標本両側ｔ検定。
【図１８】（Ａ）ウエスタンブロットを用いて確認された、ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）によるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。レーンａ：未処理のトランスジェニックマウス。レーンｂ：ＫＡ処理後６時間のトランスジェニックマウス。レーンｃ：未処理の非トランスジェニックマウス。レーンｄ：ＫＡ処理後６時間の非トランスジェニックマウス。（Ｂ）ウエスタンブロット膜のＩＶＩＳ（登録商標）イメージングにより確認された、ＫＡによるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。ユニットの単位はｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒである。
【図１９】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）によるトランスジェニックマウスにおけるＧＦＡＰ遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の発現に対する影響を示す図である。結果は誘導倍率±ＳＥＭを得るために、対照（未処理）に対して正規化されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１。ｎ＝５。標本両側ｔ検定。
【図２０】海馬の各領域におけるＧＦＡＰ免疫染色の共焦点画像を示す図であり、図２０のＡ，ＢはＣＡ１領域を示し、図２０のＣ，ＤはＣＡ２領域及びＣＡ３領域を示す。図２０のＢ，Ｄのように、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスに対するＫＡの投与から６時間の時点で、Ａ，Ｃに示す未処理マウスの海馬領域よりも、ＧＦＰ発現の増加が観察された。２０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝５０μｍ。ＧＨＡＰ免疫陽性のアストロサイトと内在性ＧＦＡＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の蛍光が観察されたアストロサイトとの細胞突起への局在化を矢印で示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック動物の体内で発現された蛍光タンパク質の非侵襲的イメージングを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）は、アルツハイマー病に次いで２番目に多い神経変性障害である。米国だけでも１００万人以上が既にこの身体障害性の疾患に罹患しており、毎年５万人以上が新たに罹患していると推定されている（Ｆａｈｎ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， ２０００）。ＰＤは、動作緩慢、休止時振戦、硬直、及び歩行困難によって特徴付けられる、進行性かつ加齢に関係した神経変性障害であるが、黒質にあるドーパミン作動性ニューロンの広範かつ進行性の破壊によっても特徴付けられる。他の多くの神経変性障害と同様に、ＰＤは主として散発性であるが、稀に種々の遺伝子の欠陥に関連した単純なメンデル形質からＰＤが発症することもある。
【０００３】
散発性のＰＤと家族性のＰＤとは、幾つかの重要な点で臨床的及び病理学的に相違するが、同じ生化学的な脳異常を示す点、すなわち脳のドーパミン量が著しく減少する点で共通する（Ｄａｕｅｒ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， ２００３）。ＰＤ患者の脳のドーパミンが減少する理由は、黒質ドーパミン作動性経路の変性に起因する（Ｖｉｌａ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， ２００４）。黒質ドーパミン作動性経路は、ドーパミン作動性ニューロンからなるが、ドーパミン作動性ニューロンの細胞体は黒質に位置し、突出した軸索及び神経末端は線条体に存在する。
【０００４】
最もよく特定されたＰＤのモデルは、神経毒であるＭＰＴＰを用いて作製された（Ｂｌｏｅｍ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｆｌｉｎｔ Ｂｅａｌ， ２００１）。ＭＰＴＰは、１９８２年に、カリフォルニアのある麻薬中毒者のグループが重篤なパーキンソニズムを急性発症したときに発見された。調査の結果、その症候群の原因は、合成したヘロイン類縁体を自己投与した際に、そのヘロイン類縁体に合成過程の副生成物であるＭＰＴＰが混入していたためであることが分かった。その後、ＭＰＴＰ投与は、マウス及び霊長類においてＰＤのモデルになることが示された。ＭＰＴＰは脂溶性が高く、血液脳関門を容易に通過する。その後、ＭＰＴＰはモノアミンオキシダーゼＢによって活性代謝物である１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）へと変換される。そして、その活性代謝物がドーパミン及びノルアドレナリンの高親和性取り込みシステムによって取り込まれ、黒質ドーパミン作動性細胞のミトコンドリア内に蓄積される。これにより、細胞機能に多くの悪影響が与えられ、神経細胞死に繋がる（Ｔａｔｔｏｎ ａｎｄ Ｋｉｓｈ，１９９７； Ｔａｎｊｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。マウスでは、従来からのＭＰＴＰよりも２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの方が効果の強い細胞毒であり、細胞質の膨潤、間質浮腫、ドーパミン作動性ニューロンの減少、並びに反応性ミクログリア増殖及びグリオーシスを含む組織病理学的変化を示す（Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ， ２００５）。
【０００５】
ＰＤに関する研究の殆どは成人についてのものであったが、幾つかの報告では、ＭＰＴＰを新生児マウスに全身注射すると脳が永久的に障害を受け、成人になっても残ることが示されている。発生中の脳がＭＰＴＰによる障害に弱いという事実も、さらなる調査が望まれる。
【０００６】
ＭＰＴＰに加え、数多くの他の化学物質もまた、成体マウス脳の様々な領域に神経障害を与えることが報告されている。このような化学物質には、工業用毒性物質、農業用殺虫剤から食品添加物まで、構造的にも機能的にも異なる多くの化合物が含まれる。繰り返しになるが、これまでの神経毒性研究の殆どは、成人のモデルに基づいていた。しかしながら、重要なことに、血液脳関門が不完全である発生中の脳は公知の神経毒によって引き起こされる障害に対して非常に弱く、さらに重要なことに、与えられた障害は発生中の脳によって完全かつ正確には補われない。したがって、化学物質が発生中の脳に対して神経毒性を示す可能性を検査することの重要性は、特に沈黙の神経毒性（すなわち、神経毒性物質に早期に曝露しても成人になるまで臨床兆候を示さない）の問題を扱う上で、強調し過ぎることはない。このことは、米国環境保護庁の発育神経毒性試験に関するガイドライン（ＤＮＴＧ）によってより深刻なものとなっている。最近になり、欧州委員会は、全ての化学物質を厳正に検査することを新たな欧州連合の規制枠組みとして採択したが、実現には７０億ユーロに上る費用と少なくとも１０年の歳月とを要すると見積もられている。
【０００７】
グリア細胞線維性酸性タンパク質は、主として中枢神経系（ＣＮＳ）のアストロサイトに発現している中間フィラメントタンパク質であり、Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， １９８８）により、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を含む様々な神経毒性物質（Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｇｒａｈａｍ， ２００２； Ｋｕｒｏｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）によって成体齧歯類脳に生じた神経障害を、早期かつ感度よくモニタリングするためのバイオマーカーになることが提案されている。ＧＦＡＰ発現の上方制御は、神経障害の悪化と相関があるとされている。内在性のＧＦＡＰ発現を分析するために採用される従来の方法には、主として免疫細胞化学、ノザンブロット、ウエスタンブロット、及びＥＬＩＳＡが含まれる（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， １９９１； Ｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【０００８】
ＧＦＡＰ基本プロモーターはＴＡＴＡボックス及びＣＡＡＴボックスからなる。エンハンサー配列及びサイレンサー配列は、−２５０〜−８０ｂｐと−１９８０〜−１５００ｂｐとに存在する。これらの陽性調節領域には、ｃＡＭＰ反応性エレメントを含む多くの転写因子のためのコンセンサス配列や、Ｓｐ−１，ＮＦ−１，ＡＰ−１，ＡＰ−２転写因子のための結合部位を含む。組織特異性は、−１９８０〜−１５００ｂｐ領域に存在するヒトＧＦＡＰコンセンサス配列によって得られている。
【０００９】
反応性グリオーシス（アストログリオーシス）は中枢神経系（ＣＮＳ）に対する物理的・化学的なあらゆる損傷によって生じるものであり、アストロサイトの細胞体及び突起の肥大と、それに続くＧＦＡＰ発現の増加によって特徴付けられる。反応性グリオーシスは、ＧＦＡＰの上方制御を伴う。同様なＧＦＡＰの増加は、末梢神経系に対する外傷や毒性傷害の後にも生じる。
【００１０】
マウスのトランスジェニック技術の発展や、新たなレポーター遺伝子の発見により、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェラーゼ（ＬＵＣ）を含む幾つかのレポーター遺伝子が、ＧＦＡＰプロモーターの制御下でトランスジェニックマウスに導入されており、インビボにおけるグリオーシスの際のＧＦＡＰ転写活性の研究に有用な代替になることが分かっている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｚｈｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
【００１１】
ＷＯ００／０２９９７及びＵＳ６，５０１，００３には、グリア細胞で緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製することが開示されている。この明細書には、視神経、脳、網膜、坐骨神経、及び角膜の全組織又は切片において、インビトロで蛍光を検出することについて記載されている。
【非特許文献１】Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ， Ｍ． Ｈ．， ２００５． Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ １−ｍｅｔｈｙｌ−４−（２’−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ （２’−ｍｅｔｈｙｌ−ＭＰＴＰ） ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． １９， ３２−４１．
【非特許文献２】Ａｌｉ， Ｓ． Ｆ．， Ｄａｖｉｄ， Ｓ． Ｎ． ａｎｄ Ｎｅｗｐｏｒｔ， Ｇ． Ｄ．， １９９３． Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ＭＰＴＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． １４， ２９−３４．
【非特許文献３】Ａｒａｋｉ， Ｔ．， Ｍｉｋａｍｉ， Ｔ．， Ｔａｎｊｉ， Ｈ．， Ｍａｔｓｕｂａｒａ， Ｍ．， Ｉｍａｉ， Ｙ．， Ｍｉｚｕｇａｋｉ， Ｍ． ａｎｄ Ｉｔｏｙａｍａ， Ｙ．， ２００１． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ １−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ （ＭＰＴＰ） −ｔｒｅａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． １２， ２３１−２３８．
【非特許文献４】Ｂａｒｏｎｅ Ｊｒ．， Ｓ．， Ｈａｙｋａｌ−Ｃｏａｔｅｓ， Ｎ．， Ｐａｒｒａｎ， Ｄ． Ｋ． ａｎｄ Ｔｉｌｓｏｎ， Ｈ． Ａ．， １９９８． Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌｍｅｒｃｕｒｙ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｒｋ−ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｙｓｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １０９， １３−３１．
【非特許文献５】Ｂｈａｕｍｉｋ， Ｓ． ａｎｄ Ｇａｍｂｈｉｒ， Ｓ． Ｓ．， ２００２． Ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ９９， ３３７−３８２．
【非特許文献６】Ｂｌｏｅｍ， Ｂ． Ｒ．， Ｉｒｗｉｎ， Ｉ．， Ｂｕｒｕｍａ， Ｏ． Ｊ． Ｓ．， Ｈａａｎ， Ｊ．， Ｒｏｏｓ， Ｒ． Ａ． Ｃ， Ｔｅｔｒｕｄ， Ｊ． Ｗ． ａｎｄ Ｌａｎｇｓｔｏｎ， Ｊ． Ｗ．， １９９０． Ｔｈｅ ＭＰＴＰ ｍｏｄｅｌ： ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ９７， ２７３−２９３．
【非特許文献７】Ｂｏｕｖｅｔ， Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｎａｒｄｉｎ， Ｓ． Ｒ．， Ｎａｓｓｉｒｐｏｕｒ， Ｒ．， Ｙａｎｇ， Ｍ．， Ｂａｒａｎｏｖ， Ｅ．， Ｊｉａｎｇ， Ｐ．， Ｍｏｏｓｓａ， Ａ． Ｒ． ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｒ． Ｍ．， ２００２． Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｄｅｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ６２， １５３４−１５４０．
【非特許文献８】Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｍ．， Ｋｉｓｓｅｒｂｅｒｔｈ， Ｗ． Ｃ， Ｓｕ， Ｙ．， Ｂｅｓｎａｒｄ， Ｆ． ａｎｄ Ａ， Ｍ．， １９９４． ＧＦＡＰ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｄｉｒｅｃｔｓ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． １４， １０３０−１０３７．
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ， Ｌ． Ｗ．， Ｗｅｉ， Ｌ． Ｃ， Ｑｉｕ， Ｙ．， Ｌｉｕ， Ｈ． Ｌ−， Ｒ， Ｒ． Ｚ．， Ｊｕ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｎ， Ｙ． Ｓ−， ２００２． Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｏｓｔｒｉａｔｕｍ ｏｆ ＭＰＴＰ−ｔｒｅａｔｅｄ ｍｉｃｅ． Ａｒｅ ｔｈｅ ｓｔｒｉａｔａｌ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＭＰＴＰ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ？ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ９２５， ９−１７．
【非特許文献１０】Ｃｏｎｔａｇ， Ｃ． Ｈ．， Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ｄ．， Ｃｏｎｔａｇ， Ｐ． Ｒ． ａｎｄ Ｎｅｇｒｉｎ， Ｒ． Ｓ．， ２０００． Ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ． ２， ４１−５２．
【非特許文献１１】Ｃｏｓｔａ， Ｌ． Ｇ．， Ａｓｃｈｎｅｒ， Ｍ．， Ｖｉｔａｌｏｎｅ， Ａ．， Ｓｙｖｅｒｓｅｎ， Ｔ． ａｎｄ Ｓｏｌｄｉｎ， Ｏ． Ｐ．， ２００４． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｇｅｎｔｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． ４４， ８７−１１０．
【非特許文献１２】Ｄａｍｉｅｒ， Ｐ．， Ｈｉｒｓｃｈ， Ｅ． Ｃ， Ａｇｉｄ， Ｙ． ａｎｄ Ｇｒａｙｂｉｅｌ， Ａ． Ｍ．， １９９９． Ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ． ＩＩ． Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １２２， １４３７−１４４８．
【非特許文献１３】Ｄａｕｅｒ， Ｗ． ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， Ｓ．， ２００３． Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｓ． Ｎｅｕｒｏｎ． ３９， ８８９−９０９．
【非特許文献１４】Ｄｅｒｖａｎ， Ａ． Ｇ．， Ｍｅｓｈｕｌ， Ｃ． Ｋ．， Ｂｅａｌｅｓ， Ｍ．， ＭｃＢｅａｎ， Ｇ． Ｊ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｃ， Ｔｏｔｔｅｒｄｅｌｌ， Ｓ．， Ｓｎｙｄｅｒ， Ａ． Ｋ． ａｎｄ Ｍｅｒｅｄｉｔｈ， Ｇ． Ｅ．， ２００４． Ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． １９０， １４５−１５６．
【非特許文献１５】Ｅｎｇ， Ｌ． Ｆ．， Ｇｈｉｒｎｉｋａｒ， Ｒ． Ｓ． ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｙ． Ｌ．， ２０００． Ｇｌｉａｌ Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ： ＧＦＡＰ Ｔｈｉｒｔｙ−Ｏｎｅ Ｙｅａｒｓ （１９６９−２０００）＊． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２５， １４３９−１４５１．
【非特許文献１６】Ｅｕｒｏｐｅａｎ， Ｃ， ２００３． Ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｒｌｉａｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｕｎｃｉｌ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， Ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （ＲＥＡＣＨ）． ＣＯＭ ２００３ ０６４４ （０３）．
【非特許文献１７】Ｆａｈｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， Ｓ．， ２０００． Ｍｅｒｒｉｔｔ’ｓ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
【非特許文献１８】Ｆｉｅｌｄｓ， Ｒ． Ｄ． ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｇｒａｈａｍ， Ｂ．， ２００２． Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｎ−ｇｌｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２９８， ５５６−５６２．
【非特許文献１９】Ｆｌｉｎｔ Ｂｅａｌ， Ｍ．， ２００１． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ２， ３２５−３３２．
【非特許文献２０】Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｋ． ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓ， Ｇ．， ２００１． Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献２１】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ．， Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ｐ．， １９９３． Ｎｅｏｎａｔａｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｐａｒａｑｕａｔ ｏｒ ＭＰＴＰ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｓｔｒｉａｔｕｍ ｄｏｐａｍｉｎｅ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． １２２， ２５８−２６４．
【非特許文献２２】Ｇａｒｃｉａ， Ｓ． Ｊ．， Ｓｅｉｄｌｅｒ， Ｆ． Ｊ．， Ｑｉａｏ， Ｄ． ａｎｄ Ｓｌｏｔｋｉｎ， Ｔ． Ａ．， ２００２． Ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｇｌｉａ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １３３， １５１−１６１．
【非特許文献２３】Ｇｅｒｍａｎ， Ｄ． Ｃ， Ｎｅｌｓｏｎ， Ｅ． Ｌ．， Ｌｉａｎｇ， Ｃ． Ｌ．， Ｓｐｅｃｉａｌｅ， Ｓ． Ｇ．， Ｓｉｎｔｏｎ， Ｃ． Ｍ． ａｎｄ Ｓｏｎｓａｌｌａ， Ｐ． Ｋ．， １９９９． Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ＭＰＴＰ ｃａｕｓｅｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ Ａ８， Ａ９ ａｎｄ Ａ１０ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． ５， ２９９−３１２．
【非特許文献２４】Ｈａｓｓ， Ｕ．， ２００３． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ： ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｖｉｅｗ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ． １４０−１４１， １５５−１５９．
【非特許文献２５】Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｒ． Ｍ．， ２００４． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｔｈｅ ｎｅｗ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ． １０６， ７７−８７．
【非特許文献２６】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ， Ｈ．， Ｙａｍａｄａ， Ｋ．， Ｓａｗａｄａ， Ｈ．， Ｎｉｓｈｉｉ， Ｋ．， Ｉｃｈｉｎｏ， Ｎ．， Ｓａｗａｄａ， Ｍ．， Ｋｕｒｏｓａｗａ， Ｙ．， Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ， Ｎ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｋ．， Ｇｏｔｏ， Ｊ．， Ｈａｓｈｉｄａ， Ｈ．， Ｍａｓｕｄａ， Ｎ．， Ｋａｎａｚａｗａ， Ｉ． ａｎｄ Ｎａｇａｔｓｕ， Ｔ．， ２００１． Ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＡＧ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｃｃｕｒｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｆｏｒ ａ ｍｕｔａｎｔ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ６５， ２８９−２９７．
【非特許文献２７】Ｋａｌａｍａｒｉｄｅｓ， Ｍ．， Ｎｉｗａ−Ｋａｗａｋｉｔａ， Ｍ．， Ｌｅｂｌｏｉｓ， Ｈ．， Ａｂｒａｍｏｗｓｋｉ， Ｖ．， Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｍ．， Ｊａｎｉｎ， Ａ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｇ．， Ｇｕｔｍａｎｎ， Ｄ． Ｈ． ａｎｄ Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ， Ｍ．， ２００２． Ｎｆ２ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ａｒａｃｈｎｏｉｄａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆｏｒ ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． １６， １０６０−１０６５．
【非特許文献２８】Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｗ．， ２００３． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ： ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ． １４０−１４１， １６１−１６９．
【非特許文献２９】Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｒ．， Ｍｕｒａｍａｔｓｕ， Ｙ．， Ｋａｔｏ， Ｈ． ａｎｄ Ａｒａｋｉ， Ｔ．， ２００４． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＭＰＴＰ−ｔｒｅａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒ． ７８， １４３−１５３．
【非特許文献３０】Ｌｕｅｌｌｅｎ， Ｂ． Ａ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｄ． Ｂ．， Ｃｈｉｓｎｅｌｌ， Ａ． Ｃ， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｄ． Ｌ．， Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， Ｊ． Ｐ． ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗｓ， Ａ． Ｍ．， ２００３． Ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｎｄ ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ａｎｄ ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ： １−ｍｅｔｈｙｌ−４−（２’−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ３０７， ９２３−９３１．
【非特許文献３１】Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ， Ｖ．， Ｔｕｎｇ， Ｃ． Ｈ．， Ｂｒｅｍｅｒ， Ｃ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ， Ｒ．， ２００２． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｒｅｓｏｌｖｅｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ８， ７５７− ７６０．
【非特許文献３２】Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， Ｊ． Ｐ．， １９８８． Ｎｅｕｒｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｇｌｉｏｔｙｐｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ． １０， ４４５−４５２．
【非特許文献３３】Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， Ｊ． Ｐ．， １９９１． Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｌｏｔ−ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓｙｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ． １３， ２７５−２８１．
【非特許文献３４】Ｏｌａｎｏｗ， Ｗ． ａｎｄ Ｔａｔｔｏｎ， Ｗ． Ｇ．， １９９９． Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ２２， １２３−１４４．
【非特許文献３５】Ｏｌｎｅｙ， Ｊ． Ｗ．， ２００２． Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． ２３， ６５９−６６８．
【非特許文献３６】Ｏｓｔｅｒｇｒｅｎ， Ａ．， Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． ａｎｄ Ｂｒｉｔｔｅｂｏ， Ｅ． Ｂ．， ２００５． Ｎｏｒｈａｒｍａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｔｏｒｉｃ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｎ ｍｉｃｅ： ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ． Ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ （３ Ａｕｇ ２００５）．
【非特許文献３７】Ｐｅｋｎｙ， Ｍ． ａｎｄ Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｍ．， ２００５． Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｌｉｏｓｉｓ． Ｇｌｉａ． ５０， ４２７−４３４．
【非特許文献３８】Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ， Ａ．， Ｓｔｅｇｍａｎ， Ｌ． Ｄ．， Ｃａｒｄｏｚｏ， Ｓ． Ｊ．， Ｇｕｐｔａ， Ｓ．， Ｈａｌｌ， Ｄ． Ｅ．， Ｃｏｎｔａｇ， Ｃ． Ｈ． ａｎｄ Ｒｏｓｓ， Ｂ． Ｄ．， ２０００． Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ． ２， ４９１−４９５．
【非特許文献３９】Ｒｅｉｎｈａｒｄ， Ｊ． Ｆ． Ｊ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｄ． Ｂ． ａｎｄ Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， Ｊ． Ｐ．， １９８８． Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃａｎｔ ＭＰＴＰ （１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−ｌ，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ） ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｓｔｒｉａｔｕｍ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｌｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｊｕｒｙ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ９５， ２４６−２５１．
【非特許文献４０】Ｓｃａｌｌｅｔ， Ａ． Ｃ， Ｓｃｈｍｕｅｄ， Ｌ． Ｃ， Ｓｌｉｋｋｅｒ， Ｗ．， Ｇｒｕｎｂｅｒｇ， Ｎ．， Ｆａｕｓｔｉｎｏ， Ｐ． Ｊ．， Ｄａｖｉｓ， Ｈ．， Ｌｅｓｔｅｒ， Ｄ．， Ｐｉｎｅ， Ｐ． Ｓ．， Ｓｉｓｔａｒｅ， Ｆ． ａｎｄ Ｈａｎｉｇ， Ｊ． Ｐ．， ２００４． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｋｅｔａｍｉｎｅ： Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ， ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ， ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ８１， ３６４−３７０．
【非特許文献４１】Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｊ． Ｐ． ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ， Ｎ．， １９９４． Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ． ３５， ４０３−４０７．
【非特許文献４２】Ｓｕ， Ｍ．， Ｈｕ， Ｈ．， Ｌｅｅ， Ｙ．， ｄ’Ａｚｚｏ， Ａ．， Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ａ． ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｍ．， ２００４． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＧＦＡＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２９， ２０７５−２０９３．
【非特許文献４３】Ｔａｎｊｉ， Ｈ．， Ａｒａｋｉ， Ｔ．， Ｎａｇａｓａｗａ， Ｈ． ａｎｄ Ｉｔｏｙａｍａ， Ｙ．， １９９９． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ＭＰＴＰ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ８２４， ２２４−２３１．
【非特許文献４４】Ｔａｔｔｏｎ， Ｎ． Ａ． ａｎｄ Ｋｉｓｈ， Ｓ． Ｊ．， １９９７． Ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｃｏｍｐａｃｔａ ｏｆ １−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ７７， １０３７−１０４８．
【非特許文献４５】Ｔｉｌｓｏｎ， Ｈ． Ａ．， ２０００． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． ２８， １４９−１５６．
【非特許文献４６】Ｔｒｏｙ， Ｔ．， Ｊｅｋｉｃ−ＭｃＭｕｌｌｅｎ， Ｄ．， Ｓａｍｂｕｃｅｔｔｉ， Ｌ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｂ．， ２００４． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ． ３， ９−２３．
【非特許文献４７】Ｖａｎｚａｎｉ， Ｍ． Ｃ， Ｉａｃｏｎｏ， Ｒ． Ｆ．， Ｃａｃｃｕｒｉ， Ｒ． Ｌ． ａｎｄ Ｂｅｒｒｉａ， Ｍ． Ｉ．， ２００５． Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｓ． ｐｌａｑｕｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｍｅｄｉｃｉｎａ−Ｂｕｅｎｏｓ Ａｉｒｅｓ． ６５， ２１３−２１８．
【非特許文献４８】Ｖｉｌａ， Ｍ． ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ， Ｓ．， ２００４． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｌｕｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． １０ （Ｓｕｐｐｌ）， Ｓ５８−Ｓ６２．
【非特許文献４９】Ｙａｎｇ， Ｍ．， Ｂａｒａｎｏｖ， Ｅ．， Ｊｉａｎｇ， Ｐ．， Ｓｕｎ， Ｆ． Ｘ．， Ｌｉ， Ｘ． Ｍ．， Ｌｉ， Ｌ．， Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｓ．， Ｂｏｕｖｅｔ， Ｍ．， Ａｌ−Ｔｕｗａｉｊｒｉ， Ｍ．， Ｃｈｉｓｈｉｍａ， Ｔ． ， Ｓｈｉｍａｄａ， Ｈ．， Ｍｏｏｓｓａ， Ａ． Ｒ．， Ｐｅｎｍａｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｒ． Ｍ．， ２０００． Ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ− ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ９７， １２０６−１２１１．
【非特許文献５０】Ｚｈａｎｇ， Ｗ．， Ｆｅｎｇ， Ｑ． Ｊ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ｓ． Ｅ．， Ｃｏｎｔａｇ， Ｐ． Ｒ．， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｄ． Ｋ． ａｎｄ Ｃｏｎｔａｇ， Ｃ． Ｈ．， ２００１． Ｒａｐｉｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １０， ４２３−４３４．
【非特許文献５１】Ｚｈｕ， Ｌ．， Ｒａｍｂｏｚ， Ｓ．， Ｈｅｗｉｔｔ， Ｄ．， Ｂｏｒｉｎｇ， Ｌ．， Ｇｒａｓｓ， Ｄ． Ｓ． ａｎｄ Ｐｕｒｃｈｉｏ， Ａ． Ｆ．， ２００４． Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ＧＦＡＰ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ３６７， ２１０−２１２．
【非特許文献５２】Ｚｈｕｏ， Ｌ．， Ｓｕｎ， Ｂ．， Ｚｈａｎｇ， Ｃ． Ｌ−， Ｆｉｎｅ， Ａ．， Ｃｈｉｕ， Ｓ． Ｙ． ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ａ．， １９９７． Ｌｉｖｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ． １８７， ３６−４２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＰＤの発生的側面及び神経毒性の研究を促進する目的で、本件発明者らは、ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスモデルと市販のイメージングシステムとを備えた非侵襲的システムを構築した。このシステムにより、生きている動物の神経系疾患、障害、及び毒性の様々な観点について研究が可能となる。また、このシステムにより、発生途中の中枢神経系に対する神経毒性のリスクに関し、多数の化学物質を効率的にスクリーニングすることができる。
【００１３】
動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸の制御下で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物を用いることで、生きている動物個体からの蛍光検出が、刺激又は被検物質によるプロモーターからの蛍光タンパク質の発現への影響のモニターに利用できることが示された。このことは、被検物質による無傷動物の神経系への影響をインビボかつリアルタイム又はほぼリアルタイムでモニタリングできるという点で、現在の技術水準に対して大きく貢献するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、最も一般的には、トランスジェニック動物の体内で発現された蛍光タンパク質の非侵襲的イメージングを含む方法に関する。
【００１５】
本発明の第一の側面では、動物の体内における目的とする蛍光タンパク質の発現を検出することを含む方法であって、上記動物は、上記蛍光タンパク質をコードする核酸が該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結されたゲノムを有するトランスジェニック動物であり、上記動物の体内で発現された上記タンパク質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程を含む方法が提供される。
【００１６】
したがって、上記蛍光タンパク質をコードする核酸が該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結されたゲノムを有するトランスジェニック動物を、該動物の体内で発現された上記タンパク質からの蛍光を非侵襲的に検出する方法に使用する方法もまた提供される。
【００１７】
この方法は、上記動物に対する被検物質の投与、又は被検刺激による影響を検査するための方法であって、蛍光を非侵襲的に検出する工程の前に、上記被検物質を上記動物に投与し、又は上記被検刺激を上記動物に与える工程を含むものが好ましい。好ましくは、上記方法は、上記動物の神経状態に対する上記被検物質の投与、又は上記被検刺激による影響を検査するためのものである。したがって、本発明の方法は、神経モジュレーターのスクリーニング方法を提供し得る。
【００１８】
この方法は、被検物質を投与していない対照動物における蛍光と、被検物質の投与後の上記トランスジェニック動物における蛍光とを比較する工程を含むことが好ましい。
【００１９】
被検物質を投与せずに蛍光を検出することで、例えば自己蛍光のための対照値又は基礎値を得ることができ、これは、標準化の目的で相対蛍光値を求めるために、被検物質の投与後に蛍光を検出することと組み合わせることができる。この対照値は、例えば被検物質が投与されるトランスジェニック動物と同種のトランスジェニック動物を用いて検出することができる。この動物は、同種（例えば、マウス）であることが好ましく、同系統であることが最も好ましい。対照値を得るために、対照動物にプラセボ（例えば、生理食塩水）を投与してもよい。
【００２０】
したがって、この方法は、好ましい構成において、
（ｉ）対照とするために、上記被検物質の投与前の上記トランスジェニック動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）上記被検物質の投与後の同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）上記（ｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
【００２１】
また、この方法は、他の好ましい構成において、
（ｉ）対照とするために、第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）上記被検物質を第２のトランスジェニック動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）上記（ｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
上記第１の動物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでも構わない。
【００２２】
ある好ましい構成において、本発明の方法は、被検物質の神経毒性を検査するために用いられる。
【００２３】
他の好ましい構成において、本発明の方法は、神経障害の治療促進又は調節に関する被検物質の効果を検査するために用いられる。
【００２４】
したがって、この方法は、
（ｉ）上記トランスジェニック動物に神経障害を誘導する工程、
（ｉｉ）対照とするため、上記被検物質の投与前に、上記（ｉ）で得られた神経障害動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）上記被検物質の投与後に、上記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含んでもよい。
【００２５】
或いは、この方法は、
（ｉ）対照とするため、第１の動物に神経障害を誘導し、得られた神経障害動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）第２のトランスジェニック動物に神経障害を誘導し、上記被検物質を該動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）上記（ｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含んでもよい。
上記第１の動物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでも構わない。
【００２６】
上記神経障害は、誘導されるものであれば、神経系に対するどのような障害又は傷害であっても構わない。好ましくは、上記障害は中枢神経系に対するものであり、より好ましくは脳に対するものである。
【００２７】
上記神経障害は、例えば反応性グリオーシスである。
【００２８】
上記神経障害は、所定の化学物質を上記動物に投与することにより誘導されるものであってもよい。化学物質としては、ＭＰＴＰ、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）、カイニン酸（ＫＡ）、トリメチル錫等の神経毒、クロルピリホス（ＣＰＦ）等の農薬、エチレンビス（ジチオカルバミン酸）マンガン（Ｍａｎｅｂ又はＭＢ）等の殺菌剤、ロテノン等の殺虫剤、パラコート（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−４，４’−ビピリジニウム）等の除草剤、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）等の有機塩素剤、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）等の食品添加物、３，３’−イミノジプロピオニトリル（ＩＤＰＮ）、トルエン（メチルベンゼン）等の工業用化学物質が挙げられる。当業者であれば、神経障害を誘導するために所定の化学物質を上記動物に投与する際の適切な量を選択することができ、適切な用法を設定することができる。一例として、上記所定の化学物質は、単回又は多数回（例えば、２，３，４，５、或いはそれ以上）に亘って投与される。多数回投与の場合、所定の時間間隔（例えば、１，２，３，４，５，６時間、或いはそれ以上）で投与される。一例として、各回の投与量は、２，４，６，７，８，１２，１４ｍｇ／ｋｇから選択される。
【００２９】
或いは、上記神経障害は、上記動物の頭部及び／又は首及び／又は背中に対する物理的な力（例えば、挫滅外傷）によって誘導されるものであってもよい。この神経障害は、上記動物の神経系への酸素供給を減らし、脳卒中及び／又は脳虚血を引き起こすことにより誘導することができる。神経障害を誘導する他の方法としては、環境刺激、物理的な力、ウイルス粒子への曝露、又は遺伝的要因が挙げられる。
【００３０】
好ましい構成において、上記神経障害は、所定の疾患についての動物モデルを得るものである。この疾患は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病の中から選択される。パーキンソン病の動物モデルは、ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）又は２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの投与により化学的に誘導することができる。
【００３１】
より好ましい構成において、本発明の方法は、神経系疾患の治療促進に関する被検物質の効果を検査するために用いられる。
【００３２】
したがって、この方法は、好ましい構成において、
（ｉ）上記神経系疾患の動物モデルでもある上記トランスジェニック動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするため、上記被検物質の投与前に、上記（ｉ）の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）上記被検物質の投与後に、上記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
【００３３】
或いは、この方法は、
（ｉ）上記神経系疾患の動物モデルでもある第１及び第２の動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするために、上記（ｉ）の第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）上記被検物質を上記（ｉｉ）の第２のトランスジェニック動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
上記第１の動物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでも構わない。
【００３４】
より好ましい構成において、本発明の方法は、神経系疾患の治療効果を検査するために用いられる。
【００３５】
したがって、この方法は、好ましい構成において、
（ｉ）上記神経系疾患の動物モデルでもある上記トランスジェニック動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするため、治療を施す前に、上記（ｉ）の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）治療を施した後に、上記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
【００３６】
或いは、この方法は、
（ｉ）上記神経系疾患の動物モデルでもある第１及び第２の動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするために、上記（ｉ）の第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の第２のトランスジェニック動物に治療を施した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で検出された蛍光と上記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む。
上記第１の動物は、トランスジェニックでも非トランスジェニックでも構わない。
【００３７】
好ましくは、上記神経系疾患は神経系腫瘍である。神経系腫瘍としては、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経繊維腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、星状細胞腫、及び乏突起膠腫が挙げられる。神経系腫瘍の動物モデルは、当業者によく知られた腫瘍異種移植技術を用いて作製することができる。
【００３８】
上記治療は、好ましくは放射線（例えば、Ｘ線又はγ線）の照射、又は化学療法剤の投与を含む。
【００３９】
本発明の方法が神経障害又は神経系疾患を有する動物の使用を含む場合、特許請求の範囲の発明は、上記動物に上記障害及び／又は疾患を誘導する工程を省略することができる。この場合、上記方法は、そのような動物の作製ではなく、その使用に関する。
【００４０】
上記動物（トランスジェニック及び非トランスジェニック）は、好ましくは、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、その他の齧歯類（ネズミ目に属するあらゆる動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類等の非ヒト哺乳動物、又はその他のあらゆる脊椎動物である。最も好ましくは、上記動物（トランスジェニック及び非トランスジェニック）はマウスである。あらゆる方法において、対照動物及び検査動物としては、好ましくは同種の動物（例えば、マウス）が用いられる。この動物は、あるものがトランスジェニックで他のものが非トランスジェニックであるなど、異なる場合があるが、検査動物は常にトランスジェニックである。対照動物及び検査動物の両者がトランスジェニックであってもよい。
【００４１】
プロモーター核酸は、該動物の神経系で通常発現しているタンパク質に由来する。このプロモーターの核酸配列は、野生型と比べて変異（例えば、ヌクレオチドの置換、付加、欠失（短縮）、挿入、交換）していてもよいが、あるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたとき、そのタンパク質の神経系での発現を調節する能力を有することで特徴付けられる。最も好ましくは、上記プロモーターは、神経系組織において野生型のプロモーターと同程度の転写調節能力（したがって、タンパク質発現能力）を保持している。
【００４２】
本明細書において「作動可能に連結」とは、所定の核酸配列（例えば、タンパク質コード配列）の発現が調節配列（例えば、プロモーター）の影響下又は制御下に置かれるように、上記所定の核酸配列と上記調節核酸配列とが共有結合している状態を含む。したがって、調節配列が、所定の核酸配列の一部又は全部であるタンパク質コード配列の転写に影響を与えることができる場合に、上記調節配列は上記所定の核酸配列に作動可能に連結されているといえる。適切であるならば、転写産物は次に所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳される。
【００４３】
最も好ましくは、上記プロモーターはＧＦＡＰプロモーターである。ＧＦＡＰプロモーター配列は当業者によく知られている。ＧＦＡＰプロモーターの例や、タンパク質の発現がＧＦＡＰ転写調節領域の制御下に置かれるＧＦＡＰ導入遺伝子を構築する際にＧＦＡＰプロモーターを使用する例については、Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０， ３５１−３６４， （１９９６）に記載されており、この開示内容は、参照することにより本願に援用される。
【００４４】
上記蛍光タンパク質としては、あらゆる蛍光タンパク質を使用することができる。緑、青、シアン、黄、オレンジ、赤の蛍光タンパク質など、数多くの適切な蛍光タンパク質が当業者に知られている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｕ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｌｉｖｅｃｅｌｌｉｍａｇｉｎｇ／ｆｐｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌを参照）。最も好ましくは、上記蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。緑色蛍光タンパク質としては、ｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ緑色蛍光タンパク質遺伝子、ＥＧＦＰ−１緑色蛍光タンパク質遺伝子、若しくはＥＹＦＰ−１緑色蛍光タンパク質遺伝子、又は哺乳類適合配列若しくはヒト化配列（例えば、哺乳類リボソームによる翻訳に適合するように構成を変更するコドン改変）と発光係数を増加させる変異とを有する、上記の遺伝子の任意の変異体が挙げられる。
【００４５】
本明細書において「トランスジェニック動物」とは、該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする核酸が、リコンビナント核酸技術を用いてその生物のゲノム中に導入された動物を含む。トランスジェニック非ヒト動物の作製技術は当業者によく知られている。
【００４６】
本発明の方法において、上記動物は新生児、すなわち生後４週未満であることが好ましい。この新生児動物は、より好ましくは生後３週未満であり、さらに好ましくは生後１４日未満である。また、この新生児動物は、生後１日から１４日の間であってもよく、好ましくは生後１〜７日、又は生後７〜１４日である。新生児動物は、生後１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８日のいずれであってもよい。
【００４７】
新生児マウスを用いることにより、神経系の発生をモニターすることができ、特に神経系の発生における被検物質の影響をモニターすることができる。
【００４８】
本発明の方法において、蛍光は非侵襲的蛍光イメージングによって検出される。このイメージング技術は、動物の体外からイメージングされ、蛍光検出に外科的介入が含まれないという点で非侵襲的である。したがって、動物は、イメージングの間は無傷のままである。蛍光を検出するために動物に麻酔が施される場合もあるが、上記動物は、蛍光検出中に無麻酔であることが好ましい。非侵襲的イメージングのための適切な装置及び技術は、例えばＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＵＳＡ）のように、当業者に知られている。
【００４９】
蛍光検出は、対照値及び検査値を得るため、被検物質の投与前及び投与後の任意の時点で行うことができる。多くの場合、蛍光の経時変化をモニターするため、投与後に連続して検出を行うことが好ましい。対照値は、例えば被検物質ではなくプラセボを投与された動物を用いて、対応する各時点において検出することができる。例えば、被検物質の投与直後又は直前（例えば、投与前１時間以内）に検出を行い、その後、例えば１時間毎に通常の検出を行うことができる。或いは、投与後の検出は、１日１回、１日２回、１日３回、又は１日４回の頻度で検査者が望む期間（例えば１，２，３，４，５日、又はそれ以上）に亘って行うことができる。
【００５０】
蛍光検出は、その動物の所望の領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＲＯＩ）について行うことが好ましい。ＲＯＩは検査者が興味のある領域が好ましい。好ましいＲＯＩは中枢神経系又はその一部であり、最も好ましくは脳又はその一部である。ＲＯＩは、視神経、網膜、坐骨神経、角膜、又は哺乳動物の眼のあらゆる部分を除いてもよい。対応するＲＯＩは、対照動物及び検査動物における蛍光検出を比較するために、好ましく用いられる。
【００５１】
対照動物における蛍光検出により、動物の自己蛍光についての基礎値を得ることができる。基礎値と検査値とを直接比較してもよい。しかしながら、特に好ましい構成では、相対蛍光（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ＲＦ）値が求められ、比較のために用いられる。ＲＦ値は、好ましくは、被検物質をトランスジェニックマウスに投与した後のある時点においてＲＯＩから検出された全蛍光と、対照マウス（トランスジェニックでも非トランスジェニックでもよい）のＲＯＩから検出（任意であるが、例えばプラセボが投与されてから同じ時点）された組織自己蛍光との比として求められる。
【００５２】
好ましい構成において、検出された蛍光が増大することは、神経障害の悪化、神経毒性、又は神経系疾患の進行を意味する。他の構成において、蛍光の減少は神経障害の悪化を意味する。
【００５３】
蛍光検出は、定量的及び／又は定性的である。
【００５４】
本明細書において、動物の神経系とは、中枢神経系又は末梢神経系を含む。より好ましくは中枢神経系であり、さらに好ましくは脳及び／又は脊髄である。
【００５５】
被検物質としては、あらゆる物質、材料、組成物、化学物質、薬物、薬剤、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、小分子、工業用化学物質、農薬、食品添加物、又は防腐剤を用いることができる。被検物質は、検査動物に外科的に埋め込まれた材料又は組織（例えば、人工生体材料）であってもよい。
【００５６】
本発明の方法は、上記動物に対する被検物質の投与による影響をモニターするために用いることができ、例えば以下の目的で用いることができる。
・疾患の診断。
・疾患の予測。
・化学物質誘導性のグリオーシス及び／又は脳における病変発生のモニタリング及び／又は定量化。
・パーキンソン病の診断及び予測。
・治療法（例えば、抗パーキンソン病薬又は遺伝子治療）の開発。
・神経毒物誘導性のグリオーシス及び／又は脳における病変発生のモニタリング及び／又は定量化。
・インプラント及び再生医療に用いられる人工生体材料の発育神経毒性の測定。
・被検物質の薬物動態学特性及び／又は薬力学特性の測定。
【００５７】
本発明は、そのような組み合わせが明らかに許容できず、又は明示的に除外されていない限り、上述した側面及び好ましい特徴の組み合わせを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明の側面及び実施態様を例示的に説明する。当業者にとっては、さらなる側面及び実施態様も明らかである。本文で言及した全ての文献は、参照することにより本願に援用される。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様において、トランスジェニック動物のゲノムは、ＧＦＡＰプロモーターに作動可能に連結された、緑色蛍光タンパク質をコードする核酸を有する。このようなトランスジェニックマウスは、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １８７， ３６−４２； ＷＯ００／０２９９７、及びＵＳ６，５０１，００３に既に開示されており、これらは特に参照することにより、その全体が本願に援用される。ＧＦＡＰプロモーターは、グリア細胞（例えば、アストロサイト、シュワン細胞、及びミュラー細胞）における蛍光タンパク質の発現を誘導する。
【００６０】
トランスジェニックマウスは、グリア細胞線維性酸性タンパク質プロモーターに作動可能に連結された、ヒト化緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする導入遺伝子が発現するように作製した。このトランスジェニックマウスでは、神経障害に応答して、グリア細胞（例えば、アストロサイト、シュワン細胞、及びミュラー細胞）における緑色蛍光タンパク質の発現が上方制御される。
【００６１】
このトランスジェニックマウスは、哺乳動物の受精卵の前核に遺伝的構造を注入し、安定的な遺伝子組み込みを自然に生じさせることにより作製した。その受精卵を子宮内に戻し、出産に至るまで発生を進行させた。
【００６２】
上記遺伝的構造は、グリア細胞に特異的な発現を実現するため、全長のグリア細胞線維性酸性タンパク質プロモーターを有する。そのプロモーターは５’側に位置し、緑色蛍光タンパク質をコードする変異遺伝子と、緑色蛍光タンパク質の３’側に位置し、適切なＲＮＡスプライシング及びポリアデニル化のためのシグナル配列を含む遺伝子をコードするＤＮＡセグメントとに、作動可能に連結されている。
【００６３】
動物の非侵襲的イメージングは、自己蛍光の対照値と被検物質の投与後の検査値とを得るように実施された（例えば、実施例１の「材料及び方法」を参照）。
【００６４】
蛍光の増大は、神経毒又は神経障害の悪化を示した。
【００６５】
以下、例示のため、本発明を実施するために本件発明者らが検討した最良の形態の具体例について説明する。本発明がこれらの具体例に限定されずに実施できることは、当業者にとって明らかである。
【００６６】
＜実施例１＞
上述したスクリーニング目的の非侵襲的蛍光イメージングシステムを構築する際に、トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス（Ｚｈｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７によって過去に作製）の新生児脳における神経毒物のモデルとして、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰを使用した。以下に示されるように、トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスモデルを適切なインビボ光学的イメージングシステムと組み合わせることで、トランスジェニックマウスの体内におけるＧＦＡＰ−ＧＦＰの特徴を確実に検出することができ、ＭＴＰＴの導入に応じた上方制御を量依存的かつ時間依存的に定量化することができる。このような合理的なスループットを示す非侵襲的光学的蛍光システムは、パーキンソニズム等の神経変性疾患や発育神経毒性の研究、或いは前臨床化合物スクリーニングにおいて、幅広い応用が可能である。
【００６７】
［材料及び方法］
（トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス）
トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスの作製及びジェノタイピングは、過去の報告（Ｚｈｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７）に従って行った。４日齢、体重２．０ｇ〜２．５ｇのＦＶＢ／Ｎ系統の新生児マウスを実験に用いた。動物の管理は、国立シンガポール大学の動物飼育施設で行った。本研究の実験プロトコルは、研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されている。
【００６８】
（神経毒物及び投与）
被検物質である２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰは、従来からのＭＰＴＰよりも効果の強い類縁体であり（Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ， ２００５）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍ−１０３）。新生児マウスには、０時間の時点で２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇの生理食塩水溶液）を単回皮下注射（ｓｃ）した。対照群には、担体として生理食塩水を用いた。そして、投与後２時間，４時間，６時間，８時間の時点で神経イメージングを行った。
【００６９】
（インビボ神経イメージング）
ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、非侵襲的イメージングを行った。先ず、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰで処理されたトランスジェニック及び非トランスジェニックのペアのマウスを隣同士に配置し、麻酔を施さず、マウスの下背部をテープによって固定した。これは、小児麻酔に広く用いられているケタミンが、新生児ラットにおいては神経のアポトーシスを増加させることにより発育神経毒性を示すという最近の研究（Ｓｃａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）に基づくものである。その後、一対の新生児マウスについて、ＩＶＩＳ（登録商標）システムに備えられたＧＦＰフィルターセットで蛍光イメージングを行った。画像収集時間は１０秒間であった。さらに、生理食塩水が注射された対照のペアについても同様の操作を行った。そして、マウスに対する２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの神経毒性作用を相対蛍光（ＲＦ）、すなわちトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける所望の領域（ＲＯＩ）から検出された全蛍光と、非トランスジェニック（ｎＴｇ）マウスのＲＯＩから検出された組織自己蛍光との比（ＴｇＲＯＩ／ｎＴｇＲＯＩ）として表現した。両者のマウスのＲＯＩは完全に同一であり、このことは本研究で輝度を定量化するために使用した全てのＲＯＩについて共通である。イメージングシステムに起因するバラつきを最小化するため、処理マウス及び対照マウスの各ペアについてそれぞれ３枚の画像を取得し、その平均値をその特定のペアにおける定量値とした。対照群（ｎ＝５ペアのマウス）の値と処理群（ｎ＝５ペアのマウス）の値とは平均値±ＳＥＭとして表され、統計的有意性は、スチューデントの２標本両側ｔ検定によって評価した。
【００７０】
（免疫組織化学）
ＣＮＳのアストロサイトからフォトンが放出されているか否かを確認するため、脳を摘出し、４％パラホルムアルデヒドを含有する０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ， ｐＨ７．４）によって４℃、４時間の条件で固定化した。ＰＢＳ中で１５分間ずつ３回インキュベーションすることにより脳を洗浄し、その後、３０％ショ糖溶液中に４℃で一晩浸漬した。全ての脳を液体窒素中に浸漬することにより凍結溶媒中に埋め込み、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎｕｓｓｌｏｃｈ ＧｍｂＨ； ＣＭ−３０５０Ｓ）を用いてそれらを切片化した。得られた冠状凍結切片（２０μｍ厚の黒質；ブレグマ −３．１６ｍｍ、両耳間 ０．６４ｍｍ）を、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓ，２００１）に従って免疫組織化学に用いた。対照群及び処理群のそれぞれは４匹の動物を含む（ｎ＝３）。
【００７１】
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びＧＦＡＰの免疫染色のため、ウサギ抗ＴＨポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ； Ａｂ−１５２）とウサギ抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ； Ｚ−０３３４）とを用いた。凍結切片を０．１５Ｍの１×ＰＢＳ中で５分間洗浄し、さらに、ブロッキング溶液（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と１０％非免疫ヤギ血清とを含有するＰＢＳ）中で４℃、４時間の条件でインキュベートした。その凍結切片を、０．１５Ｍの１×ＰＢＳ中で１５分間ずつ３回インキュベーションすることにより洗浄した。その後、脳切片を、抗ＴＨ抗体（１：２００）及び抗ＧＦＡＰ抗体（１：２００）とともに４℃で一晩インキュベートした。この抗体は、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と１％非免疫ヤギ血清とを含有するＰＢＳ中に含まれている。さらに、その切片を１×ＰＢＳで１５分間ずつ３回洗浄した後、テキサスレッド共役ヤギポリクローナル抗ウサギＩｇＧ２次抗体（Ａｂｃａｍ Ｌｔｄ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｕ．Ｋ．； Ａｂ−７０８８）とともに室温で２時間インキュベートした。この抗体は、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と１％非免疫ヤギ血清とを含有するＰＢＳによって１：１００に希釈されている。１×ＰＢＳで１５分間ずつ３回洗浄した後、その切片に１０μｌの蛍光媒体によってカバースリップを設け、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ． Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ； ＩＸ−７１）で観察した。
【００７２】
［結果］
（ＧＦＰ蛍光レベルに対する２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの影響）
先ず、脳のＲＯＩから内在的ＧＦＰ蛍光を検出し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、図１（Ａ）に示すように神経領域からの発光をフォトン／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｓｒ）の単位で定量化した。ＣＮＳのアストロサイトからフォトンが放出されているか否かを確認するため、インビボでの最後のイメージングが終わった時点で、脳を摘出し、エクスビボでのイメージングを行った（図１（Ｂ））。この方式により、対照トランスジェニックマウス及び処理トランスジェニックマウスについて、ＧＦＰ蛍光を定性的かつ定量的に比較することが可能になる。
【００７３】
図２のインビボ画像に示されるように、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）が単回投与されたトランスジェニック新生児マウスは、対応する非トランスジェニックのマウスやトランスジェニックの対照マウスよりも、ＲＯＩにおけるＧＦＰ蛍光（フォトン／秒／ｃｍ２／ｓｒ）が有意に増大していた。図３に示すＧＦＰ蛍光の定量値により、図２の観察結果が補強される。すなわち、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ処理群と対照群とでは、投与後４時間，６時間，８時間の時点で相対蛍光（ＲＦ）に有意差が観察され、処理群については、投与後６時間の時点で対照群に対して平均２２％と最も有意（ｐ＜０．０１）に増大した。２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ処理群内では同様であり、０時間の時点と比較すると、４時間，６時間，８時間の時点でＲＦが有意に増大し、特に投与後６時間の時点では、平均１７％と最も有意（ｐ＜０．０００１）に増大した。対照群内では、経時的なＲＦの有意差は観察されなかった（図３）。
【００７４】
（ＧＦＡＰ免疫組織化学）
海馬におけるＧＦＡＰ免疫染色の代表画像を図４に示す。アストロサイトにおけるＧＦＰ発現は、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）の単回投与から６時間の時点で、脳室領域及び海馬領域において明らかに増加していた。非トランスジェニックマウスでは、ＧＦＰ発現は観察されなかった（図４のＡ）。ＧＦＰ発現細胞がアストロサイトであることを確かめるため、同じ切片についてＧＦＡＰの免疫染色を行ったところ、海馬溝におけるＧＦＡＰ免疫陽性の血管周囲アストロサイトと内在性ＧＦＰの蛍光が観察されたアストロサイトとの共局在化は、殆どが突起部分で生じており、細胞体では生じていなかった（２重ラベルされた細胞突起を図４のＤ，Ｅにおいて矢印で示す）。
【００７５】
（ＴＨ免疫組織化学染色）
黒質緻密部（ＳＮＣ）におけるＴＨ免疫染色の代表画像を図５に示す。ＴＨ抗体が結合したドーパミン作動性ニューロンのサイズ（〜２０μｍ）は、免疫組織化学染色を行っていない、内在性ＧＦＰの蛍光が観察されたアストロサイトのサイズ（〜１０μｍ）よりも大きく、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰで処理した新生児マウスのＳＮＣにおける検出が容易であった。ドーパミン作動性細胞の細胞体や繊維は強く染まっており、ＳＮＣには明らかに免疫陽性突起が存在した。２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）の処理から６時間の時点で、ＴＨ免疫陽性の繊維及び細胞体の減少は観察されなかった。しかしながら、アストロサイト内におけるＧＦＡＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の発現は、０時間の時点と比べて６時間の時点では、明らかに上方制御されていた。図５のＡに示すように、非トランスジェニックマウスのＳＮＣにおけるドーパミン作動性ニューロンは、ＴＨ免疫陽性であったが、グリア細胞は導入遺伝子を発現しなかった。ＴＨ免疫陽性のドーパミン作動性ニューロンと、免疫組織化学染色を行っていない、内在性ＧＦＰの蛍光が観察されたアストロサイトとの共局在化は観察されなかった。
【００７６】
＜実施例２：トランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰ成体マウスのイメージング＞
（皮弁インビボイメージング）
麻酔が施されたトランスジェニックＧＦＡＰ−ＧＦＰ成体マウスに皮弁（片側を残したまま皮膚を体から切り剥がしたもの）を形成した。脳及び肝臓の皮弁が形成された部分について、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム１００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、インビボイメージングを行った。マウスの体の他の部分からの組織自己蛍光を遮蔽するために低蛍光の黒紙を用い、脳（図６（Ａ））及び肝臓（図６（Ｂ））の皮弁が形成された部分のみを露出させた。
【００７７】
（エクスビボイメージング）
図７（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、トランスジェニック（Ｔｇ）マウス及び非トランスジェニック（ｎＴｇ）マウスの両者から脳、肝臓、腎臓、及び坐骨神経を摘出し、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いてエクスビボでイメージングを行った。放出されたフォトンの数に対応した擬似カラー画像において、ＴｇマウスとｎＴｇマウスとで有意差が観察された。現在、成体マウスに対する代替的な画像診断法の実現可能性調査を行っているところである。
【００７８】
＜実施例３：新生児トランスジェニックマウスにおけるパーキンソニズム及び神経毒性の研究のための非侵襲的脳イメージング法＞
［実験手順］
（動物）
この研究は、４日齢の新生児マウス（実験時点で体重３〜５ｇ）を用いて行った。動物は自由に摂食させ、使用する動物数及び動物の苦痛を最小限とするように努めた。
【００７９】
（毒物注射）
使用した神経毒は２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰである。８ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを２時間毎に４回皮下注射し、投与後２４時間、４８時間、７２時間の時点でインビボ神経画像を取得した。
【００８０】
（ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ及びウエスタンブロット）
先ず、ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ及びウエスタンブロットのため、投与後２４時間の時点でマウスを犠牲死させた。そして、脳を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びポトテイナーゼ阻害剤を含むサンプルバッファで溶解した。全タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法で確認した。次に、そのサンプルを、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリスゲル（４％〜１２％）を用いて、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリス電気泳動にかけた。各サンプルは１５μｇのタンパク質を含む。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。その後、５％無脂肪ドライミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて、４℃で膜のブロッキングを行った。続いて、その膜を１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ヤギＧＦＡＰ抗体（Ｄａｋｏ）／ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（ａｂｃａｍ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで１５分間ずつ３回洗浄した。さらに、その膜を１：２０００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで５分間ずつ３回洗浄した。そして、化学発光検出溶液（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びオートラジオグラフィーフィルムを用いて、２次抗体を可視化した。ウエスタンブロットの終了後、そのニトロセルロース膜をＩＶＩＳ（登録商標）装置でイメージングした。ＥＣＬ Ｐｌｕｓ検出溶液を用いた場合、結合したＨＲＰ、及びＬｕｍｉｇｅｎ ＰＳ−３ アクリダン基質の過酸化物によって触媒された酸化反応により、毎分何千ものアクリジニウムエステル中間体が生成される。この中間体は弱アルカリ性条件下で過酸化物と反応し、４３０ｎｍが極大となる、長時間かつ高強度の化学発光を生じる。この化学発光シグナルは、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて検出することができる。発光強度を示すカラーの膜の画像が得られる。
【００８１】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
先ず、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのため、投与後２４時間の時点でマウスを犠牲死させた。そして、脳を摘出し、ＲＡ１バッファ及びβ−メルカプトエタノールで溶解した。次に、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ ＩＩ キットを用いて、脳から全ＲＮＡを抽出した。そして、ランダムヘキサマーを用いてその全ＲＮＡを逆転写し、遺伝子発現を定量化するために、得られたｃＤＮＡについてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００８２】
［実験結果］
ＭＰＴＰ（４×８ｍｇ／ｋｇ）
（インビボ神経画像）
図８に示すように、脳における所望の領域（ＲＯＩ）から内在的ＧＦＰ蛍光を検出し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、神経領域からの発光をフォトン／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｓｒ）の単位で定量化した。インビボ画像に示されるように、ＭＰＴＰ（８ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）が４回投与されたトランスジェニック新生児マウスは、投与後２４時間の時点の対照マウスと比較したとき、ＲＯＩにおけるＧＦＰ蛍光（フォトン／秒／ｃｍ２／ｓｒ）が最も有意に増大していた。図９に示すＧＦＰ蛍光の定量値によると、ＭＰＴＰ処理群と対照群とでは、投与後２４時間の時点で相対蛍光（ＲＦ）に有意差が観察され、対照群に対して平均１５％と有意（ｐ＜０．０１）に増大した。ＭＰＴＰ（１２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）が単回投与されたトランスジェニック新生児マウスや、対照群内では、経時的なＲＦの有意差は観察されなかった（図９）。
【００８３】
（ウエスタンブロット結果）
図１０（Ａ）に示すウエスタンブロット結果から分かるように、Ｄａｋｏの抗ウサギＧＦＡＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＡＰについて報告された分子量と一致した約５１ｋＤａの位置にバンドが検出された。また、Ａｂｃａｍの抗ウサギＧＦＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＰについて報告された分子量と一致した約２７ｋＤａの位置にバンドが検出された。バンドの太さから、トランスジェニックマウスにおいては、０時間から２４時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の量が増加していることが分かる（レーンａとレーンｂとの比較）。非トランスジェニックマウスにおいても、０時間から２４時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質の量が増加している（ＧＦＡＰウエスタンブロットにおけるレーンｃとレーンｄとの比較）。非トランスジェニックマウス（ＧＦＰウエスタンブロットにおけるレーンｃ，ｄ）においては、導入遺伝子が存在しないため、ＧＦＰタンパク質は検出されなかった。ＩＶＩＳ（登録商標）を用いてウエスタンブロット膜をイメージングしたところ、タンパク質量を表すカラー画像は、同様の結果を示していた（図１０（Ｂ）を参照）。このことは、ＭＰＴＰの投与によってＧＦＡＰが上方制御され、これによりＧＦＰも上方制御されるという事実を補強するものである。
【００８４】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果）
ｍＲＮＡの研究は、ＢＣＡのタンパク質における研究結果や、長い研究過程ではインビボ神経画像と一致するものである。図１１（Ａ）に示すように、ＭＴＰＴ処理後２４時間の時点におけるＧＦＡＰの遺伝子発現は、トランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスの両者とも、未処理のマウスと比較してそれぞれ９１％（ｐ＜０．０１）、８８％（ｐ＜０．０１）と有意に誘導されていた。しかしながら、ＭＴＰＴ処理後２４時間の時点におけるＧＦＰの遺伝子発現は、未処理のマウスと比較して有意に誘導されていなかった（図１１（Ｂ））。これにより、ＭＰＴＰ処理後４８時間、７２時間の時点で神経画像における相対蛍光が減少していることが説明できる（図８，図９を参照）。
【００８５】
（内在性ＧＦＰ及びＴＨ免疫組織化学）
結果を図１２，図１３に示す。
【００８６】
＜実施例４：新生児トランスジェニックマウスにおけるパーキンソニズム及び神経毒性の研究のための非侵襲的脳イメージング法＞
［実験手順］
（動物）
この研究は、４日齢の新生児マウス（実験時点で体重３〜５ｇ）を用いて行った。動物は自由に摂食させ、使用する動物数及び動物の苦痛を最小限とするように努めた。
【００８７】
（毒物注射）
使用した神経毒は２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ及びカイニン酸（ＫＡ）である。ＭＰＴＰの投与は、１２ｍｇ／ｋｇの濃度の単回注射により行われた。ＫＡの投与は、２ｍｇ／ｋｇの濃度の単回注射により行われた。注射は全て皮下である。
【００８８】
（ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ及びウエスタンブロット）
ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスを、投与後６時間の時点で犠牲死させた。そして、脳を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びポトテイナーゼ阻害剤を含むサンプルバッファで溶解した。全タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法で確認した。次に、そのサンプルを、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリスゲル（４％〜１２％）を用いて、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリス電気泳動にかけた。各サンプルは１５μｇのタンパク質を含む。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。その後、５％無脂肪ドライミルク及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて、４℃で膜のブロッキングを行った。続いて、その膜を１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ヤギＧＦＡＰ抗体（Ｄａｋｏ）／ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（ａｂｃａｍ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで１５分間ずつ３回洗浄した。さらに、その膜を１：２０００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで５分間ずつ３回洗浄した。そして、化学発光検出溶液（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びオートラジオグラフィーフィルムを用いて、２次抗体を可視化した。同様の操作を、ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスについても行った。ウエスタンブロットの終了後、ニトロセルロース膜をＩＶＩＳ（登録商標）装置でイメージングした。ＥＣＬ Ｐｌｕｓ検出溶液を用いた場合、結合したＨＲＰ、及びＬｕｍｉｇｅｎ ＰＳ−３ アクリダン基質の過酸化物によって触媒された酸化反応により、毎分何千ものアクリジニウムエステル中間体が生成される。この中間体は弱アルカリ性条件下で過酸化物と反応し、４３０ｎｍが極大となる、長時間かつ高強度の化学発光を生じる。この化学発光シグナルは、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて検出することができる。発光強度を示すカラーの膜の画像が得られる。
【００８９】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスを、投与後２時間の時点で犠牲死させた。そして、脳を摘出し、ＲＡ１バッファ及びβ−メルカプトエタノールで溶解した。次に、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ ＩＩ キットを用いて、脳から全ＲＮＡを抽出した。そして、ランダムヘキサマーを用いてその全ＲＮＡを逆転写し、遺伝子発現を定量化するために、得られたｃＤＮＡについてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。同様の操作を、ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスについても行った。
【００９０】
［実験結果］
ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）
（ウエスタンブロット結果）
図１４（Ａ）に示すウエスタンブロット結果から分かるように、Ｄａｋｏの抗ウサギＧＦＡＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＡＰについて報告された分子量と一致した約５１ｋＤａの位置にバンドが検出された。また、Ａｂｃａｍの抗ウサギＧＦＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＰについて報告された分子量と一致した約２７ｋＤａの位置にバンドが検出された。バンドの太さから、トランスジェニックマウスにおいては、０時間から６時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の量が増加していることが分かる（レーンａとレーンｂとの比較）。非トランスジェニックマウスにおいても、０時間から６時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質の量が増加している（ＧＦＡＰウエスタンブロットにおけるレーンｃとレーンｄとの比較）。非トランスジェニックマウス（ＧＦＰウエスタンブロットにおけるレーンｃ，ｄ）においては、導入遺伝子が存在しないため、ＧＦＰタンパク質は検出されなかった。ＩＶＩＳ（登録商標）を用いてウエスタンブロット膜をイメージングしたところ、タンパク質量を表すカラー画像は、同様の結果を示していた（図１４（Ｂ）を参照）。このことは、ＭＰＴＰの投与によってＧＦＡＰが上方制御され、これによりＧＦＰも上方制御されるという事実を補強するものである。
【００９１】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果）
ｍＲＮＡの研究は、ＢＣＡのタンパク質における研究結果やウエスタンブロットと一致するものである。ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の上方制御は６時間の時点でピークとなるので、ＧＦＡＰ及びＧＦＰのｍＲＮＡの上方制御は、ＭＰＴＰ処理の２時間後には生じていた。この時間差は、ｍＲＮＡからタンパク質に翻訳する時間を表している。図１５に示すように、ＭＴＰＴ処理後２時間の時点におけるＧＦＡＰ及びＧＦＰの遺伝子発現は、それぞれ４７％（ｐ＜０．００１）、２０％（ｐ＜０．０１）と有意に誘導されていた。
【００９２】
ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）
（インビボ神経画像）
図１６に示すように、脳における所望の領域（ＲＯＩ）から内在的ＧＦＰ蛍光を検出し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、神経領域からの発光をフォトン／秒／ｃｍ２／ステラジアン（ｓｒ）の単位で定量化した。インビボ画像に示されるように、ＫＡ（２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）が単回投与されたトランスジェニック新生児マウスは、投与後６時間の時点の対照マウスと比較したとき、ＲＯＩにおけるＧＦＰ蛍光（フォトン／秒／ｃｍ２／ｓｒ）が最も有意に増大していた。図１７に示すＧＦＰ蛍光の定量値によると、ＫＡ処理群と対照群とでは、投与後４時間、６時間の時点で相対蛍光（ＲＦ）に有意差が観察され、処理群については、投与後６時間の時点で対照群に対して平均２５％と最も有意（ｐ＜０．０１）に増大した。ＫＡ処理群内では同様であり、０時間の時点と比較すると、処理後６時間の時点で平均２２％と最も有意（ｐ＜０．０５）に増大した。対照群内では、経時的なＲＦの有意差は観察されなかった（図１７）。
【００９３】
（ウエスタンブロット結果）
図１８（Ａ）に示すウエスタンブロット結果から分かるように、Ｄａｋｏの抗ウサギＧＦＡＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＡＰについて報告された分子量と一致した約５１ｋＤａの位置にバンドが検出された。また、Ａｂｃａｍの抗ウサギＧＦＰ抗体を用いることで、マウスＧＦＰについて報告された分子量と一致した約２７ｋＤａの位置にバンドが検出された。バンドの太さから、トランスジェニックマウスにおいては、０時間から６時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の量が増加していることが分かる（レーンａとレーンｂとの比較）。非トランスジェニックマウスにおいても、０時間から６時間までの時点で、ＧＦＡＰタンパク質の量が増加している（ＧＦＡＰウエスタンブロットにおけるレーンｃとレーンｄとの比較）。非トランスジェニックマウス（ＧＦＰウエスタンブロットにおけるレーンｃ，ｄ）においては、導入遺伝子が存在しないため、ＧＦＰタンパク質は検出されなかった。ＩＶＩＳ（登録商標）を用いてウエスタンブロット膜をイメージングしたところ、タンパク質量を表すカラー画像は、同様の結果を示していた（図１８（Ｂ）を参照）。このことは、ＫＡの投与によってＧＦＡＰが上方制御され、これによりＧＦＰも上方制御されるという事実を補強するものである。
【００９４】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果）
ｍＲＮＡの研究は、ＢＣＡのタンパク質における研究結果やウエスタンブロットと一致するものである。ＧＦＡＰタンパク質及びＧＦＰタンパク質の上方制御は６時間の時点でピークとなるので、ＧＦＡＰ及びＧＦＰのｍＲＮＡの上方制御は、ＭＰＴＰ処理の２時間後には生じていた。この時間差は、ｍＲＮＡからタンパク質に翻訳する時間を表している。図１９に示すように、ＫＡ処理後２時間の時点におけるＧＦＡＰ及びＧＦＰの遺伝子発現は、それぞれ２１％（ｐ＜０．０１）、２２％（ｐ＜０．０５）と有意に誘導されていた。
【００９５】
（ＧＦＡＰ免疫組織化学）
海馬のＣＡ１，ＣＡ２，及びＣＡ３サブエリアにおけるＧＦＡＰ免疫染色の代表画像を図２０のＡ〜Ｄに示す。アストロサイトにおけるＧＦＰ発現は、ＫＡ（２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）の単回投与から６時間の時点で、様々な領域において明らかに増加していた。ＧＦＰ発現細胞がアストロサイトであることを確かめるため、同じ切片についてＧＦＡＰの免疫染色を行ったところ、海馬のＣＡ１領域におけるＧＦＡＰ免疫陽性のアストロサイトと内在性ＧＦＰの蛍光が観察されたアストロサイトとの共局在化は、殆どが突起部分で生じており、細胞体では生じていなかった（２重ラベルされた細胞突起を図２０のＢにおいて矢印で示す）。
【００９６】
＜実施例の考察＞
トランスジェニックマウスにおいて、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を誘導する。ＧＦＡＰは、主として中枢神経系（ＣＮＳ）のアストロサイトに発現している中間フィラメントタンパク質である。これらのグリア細胞における変化は、神経活性のモニターに利用することができる。ＣＮＳのニューロンに対する傷害により、ＧＦＡＰが強く誘導される。しかしながら、インビトロアッセイでＧＦＡＰをモニタリングするには、動物を犠牲死させる必要がある。本件発明者らは、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ発現の非侵襲的インビボ神経イメージングにより、長期間に亘りＧＦＡＰをモニターすることができ、この過程で犠牲となる動物の数を減らせることを示した。
【００９７】
２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰは、黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンを変性させる神経毒である。また、カイニン酸は、脳に興奮毒性損傷を与える神経毒である。いずれの神経毒もＧＦＡＰ発現を増加させることが知られている。このことは、診断や処置（すなわち、候補薬物や治療）、或いは神経毒性の研究のための非侵襲的インビボイメージングのモデルへと発展させることができる。これらの神経毒を新生児マウスに注射し、その神経毒に起因した新生児脳におけるＧＦＡＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の蛍光の増大を、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムを用いて検査した。非侵襲的インビボ神経イメージングモデルが神経発生の研究において信頼できるものであるという結論を補強するため、インビトロアッセイも行った。すなわち、タンパク質発現を定量化するためにＢＣＭＴＭタンパク質アッセイ（ＧＦＰ）及びウエスタンブロットを行い、遺伝子発現を定量化するためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。これらのアッセイは、神経毒の投与によって新生児マウスで生じている変化を追跡するのに用いることができ、その結果はインビボ神経イメージングの結果に匹敵する。
【００９８】
過去半世紀の間、細胞生物学及び分子生物学では、培養皿で培養された細胞について、遺伝子やタンパク質を含む細胞構成要素を細胞外から分析していた。追跡し、分子、タンパク質、及び細胞についての機能情報をインビボで得るために光学プローブを用いる技術は、新規であり、かつ急速に広まったものである。この技術は、感染症、腫瘍学、薬物動態学、薬力学、毒物学、或いはトランスジェニック動物における生物発光又は蛍光のレポーターにおける遺伝子発現の研究など、幅広い応用が可能である（Ｃｏｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｂｈａｕｍｉｃ ａｎｄ Ｇａｍｂｈｉｒ， ２００２； Ｂｏｕｖｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。Ｈｏｆｆｍａｎ（Ｈｏｆｆｍａｎ， ２００４）によって説明されているように、レポーター遺伝子としてＧＦＰが現れたことにより、細胞生物学及び分子生物学においてパラダイム変化が可能になっている。迅速かつ利用し易いイメージング技術を前臨床研究に導入することにより、定量的なデータを得る回数が増え、各プロトコルについてより多くの、かつ質の高い実験データを得ることが可能になるであろう。生きている動物個体を複数の時点でイメージングすることにより、研究者は、無傷の臓器に対する状況毎の影響下で生体分子プロセスを分析することができる。また、追加的な利点として、この方法によれば、より少数の動物がより少ないストレスで統計的優位性の高いデータを得ることができる。非侵襲的な方法は、縦断的研究デザイン、内部実験対照、分子情報、及び定量データの特徴を有する、より予測的な動物モデルの構築に用いることができ、このような方法は、科学研究と、人道的な動物使用との両者にとって有益である。さらに、このようなイメージングは、組織学のための組織採取や生化学分析について適切な目標を与える点で、研究自体を改善することができる。
【００９９】
本研究が直面している１つの問題は、自己蛍光源についてである。典型的に、動物組織（エラスチン、コラーゲン、トリプトファン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ポルフィリン、及びフラビンを含む）における内在的は発色団によって生じる組織自己蛍光は、特に可視波長域においては、機器の自己蛍光よりも遥かに大きい。所望の蛍光プローブの検出能力に影響を与えるため、インビボイメージングにおいては自己蛍光が一番の懸念事項となる。この研究で観察されたように、新生児マウスからの自己蛍光は、マウスが生まれてから成体になるまでに増大する。このため、本件発明者らは、トランスジェニックマウスからの全蛍光を非トランスジェニックマウスからの自己蛍光で正規化して相対蛍光（ＲＦ）を得ることにより、シグナル／ノイズ（ｓ／ｎ）比をモニターする安全システムを考案した。ＲＦが閾値１．３、或いはトランスジェニックマウスから検出されたＧＦＰシグナルの３０％に届かなかった場合、そのデータはｓ／ｎ比が低過ぎ、正確な定量結果を得るために使用できないと考えられる。
【０１００】
モデル物質として２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰを用いたとき、非侵襲的インビボ神経イメージングモデルによって得られたデータは、組織学的に確認された、上方制御されたアストロサイトの存在と整合するものであった。ＭＰＴＰがインビボで中脳のドーパミンニューロンの神経変性死を特異的に誘導し、動物のパーキンソニズムやヒトのパーキンソン病を生じさせることについては、多くの報告がある（Ｄａｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｇｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｏｌａｎｏｗ ａｎｄ Ｔａｔｔｏｎ， １９９９）。過去の研究により、ＭＰＴＰ誘導パーキンソニズムの病理過程におけるアストロサイトの潜在的な役割が示唆されている。例えば、ＭＰＴＰが全身注射された成体マウスは、アストロサイト内のＧＦＡＰが有意に増加し、同時に脳線条体のドーパミン作動性ニューロンにおけるドーパミンが減少する（Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｋｕｒｏｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。注目すべきことに、脳におけるＭＰＴＰ傷害に対する高い影響性は、同じ遺伝的背景を有するより高齢のマウスにおいても観察された（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。成体マウス脳に対するＭＰＴＰの作用に関する研究に比べて、新生児脳のアストロサイトがどのようにＭＰＴＰに反応しているかに関する文献は少ないが、これは恐らく、脳発生の期間、ＧＦＡＰの転写活性を繰り返し非侵襲的に測定する適切な方法がないためである。しかしながら、新生児マウスに対するＭＰＴＰの全身注射によって、成体になっても脳に永久的な障害を受けることを示した報告は殆ど存在しない（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ， １９９４）。とはいえ、これらの初期の報告により、発生中の脳もまたＭＰＴＰに弱く、注意深い調査が必要であることが分かる。したがって、上記したモデルにより、生きている動物における神経変性を研究する幾つかの新たな可能性が得られる。本発明によれば、生きている動物における脳卒中又は挫滅外傷による神経障害を予防するために、様々な薬物の効果をモニターすることができる。さらに、このＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック新生児マウスは、アルツハイマー病（Ｖａｎｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５）やハンチントン病（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１）の種々のモデルにおいて生じるＧＦＡＰの上方制御を研究する際や、種々の薬物治療における神経保護作用を非侵襲的にモニターする際に用いることができる。神経変性のほかに、このマウスは、脳腫瘍の発生及び治療の研究にも有用である。Ｋａｌａｍａｒｉｄｅｓらによる最近の論文（Ｋａｌａｍａｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２）には、クモ膜細胞においてＮｆ２遺伝子が非活性化されたマウス髄膜腫モデルが示されている。腫瘍が脳組織を侵食し、成長する際には、腫瘍を取り巻くアストロサイトにおいてＧＦＡＰ発現が上方制御されている（Ｐｅｋｎｙ ａｎｄ Ｎｉｌｓｓｏｎ， ２００５）。本発明のさらなる利点は、あらゆる神経毒性作用を避けるため、新生児マウスに麻酔が施されない点である。
【０１０１】
２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰで処理したマウスでは、ＳＮＣ及び腹側被蓋領域において、ＴＨ様免疫反応の明らかな変化は観察されず、黒質ドーパミンニューロンの変性は、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの注射後６時間では未だ明らかでないことを示していた。このことは、ＭＰＴＰ処理から５日後にドーパミン作動性ニューロンが減少するというＡｒａｋｉらの観察（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１）や、ＴＨ免疫陽性の繊維及び細胞体は、線条体及び黒質においてＭＰＴＰ処理から１日後に減少するというＫｕｒｏｓａｋｉらの発見とよく一致している。２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの全身投与、及び投与後２４，４８，７２時間に亘るＧＦＡＰ及びＴＨ免疫染色に対する効果についてのさらなる研究により、この分野における知見が広がるであろう。
【０１０２】
ＭＰＴＰに加え、数多くの他の化学物質もまた、成体マウス脳の様々な領域に神経障害を与えることがＧＦＡＰ上昇によって立証され、報告されている。このような化学物質には、トリメチル錫（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， １９８８）及びメチル水銀（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ， １９８８； Ｂａｒｏｎｅ Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．， ２００２）のような工業用毒性物質、農業用殺虫剤（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．， ２００２）から食品添加物（Ｏｓｔｅｒｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５）まで、構造的にも機能的にも異なる多くの化合物が含まれる。発生後の成体の脳と比較して血液脳関門が不完全である発生中の脳は、公知の神経毒によって引き起こされる障害、さらに重要なことには、神経毒性の検査を適切に受けることなく人間の食物連鎖や環境中に紛れ込んだ多数の化学物質に対して非常に弱い。化学物質が発生中の脳に対して神経毒性を示す可能性を検査することの重要性は、特に沈黙の神経毒性（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．， ２００４）の問題を扱う上で、強調し過ぎることはない（Ｏｌｎｅｙ， ２００２）。このことは、Ｔｉｌｓｏｎ（Ｔｉｌｓｏｎ， ２０００）によってレビューされた、米国環境保護庁の発育神経毒性試験に関するガイドライン（ＤＮＴＧ）によってより深刻なものとなっている。最近になり、欧州委員会は、全ての化学物質を厳正に検査することを新たな欧州連合の規制枠組みとして採択したが、実現には７０億ユーロに上る費用と少なくとも１０年の歳月とを要すると見積もられている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ， ２００３）。しかしながら、従来のＧＦＡＰ技術を用いて、発生中のＣＮＳに対する神経毒性リスクを多数の化学物質についてインビボで調査することは、特に、そのアッセイ法は合理的なスループットが得られる科学的根拠のあるものでなければならず、工業的（Ｋａｕｆｍａｎｎ， ２００３）にも取締機関（Ｈａｓｓ， ２００３）にとっても、コストが許容できるものでなければならない、という点を考慮に入れると、困難な課題である。
【０１０３】
脳の主用な領域のうちグリア細胞で特異的な発現を示す（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、実績のあるＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニックマウスモデル（Ｚｈｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を適切なインビボ光学的バイオイメージングシステムと組み合わせることにより、神経変性疾患、発育神経毒性の非侵襲的な研究、化学物質のリアルタイム選別、或いは外傷からの創傷治癒、脳卒中、及び腫瘍増殖といった他のＣＮＳ病理学における治療的介入の可能性についての研究が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】（Ａ）トランスジェニック及び非トランスジェニックの新生児マウスのペアにおけるインビボ蛍光画像を示す図である。トランスジェニックマウスの脳のＲＯＩからは全蛍光が検出され、非トランスジェニックマウスからは組織自己蛍光が検出された。定量化は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、フォトン／秒／ｃｍ２／ｓｒの単位で行われた。（Ｂ）トランスジェニック及び非トランスジェニックの新生児マウスのペアにおけるエクスビボ蛍光画像を示す図である。
【図２】ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック新生児マウスの非侵襲的インビボ神経イメージングを示す図である。マウスは、生理食塩水（対照）又は１２ｍｇ／ｋｇの２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰを用いて、本文中に示されるように処理された。マウスは、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの投与前に０時間の時点でイメージングされた。画像収集時間は１０秒間であった。マウスの各ペアは、トランスジェニックマウスを右側に示し、非トランスジェニックマウスを左側に示す。
【図３】相対蛍光（ＲＦ）として表現された、トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された全蛍光と非トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された組織自己蛍光との比を、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ処理群と対照群とで比較した図（平均±ＳＥＭ， ｎ＝５）である。ＲＦは０時間の時点に対して正規化されている。＊は２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ処理群と対照群との間の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。＊＊（ｐ＜０．０１）は対照群との比較である。スチューデントの２標本両側ｔ検定。
【図４】海馬におけるＧＦＡＰ免疫染色の共焦点画像を示す図である。（Ａ）ｎＴｇマウスではＧＦＰ発現が観察されなかった。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ，Ｃ）Ｔｇマウスに対する２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの投与から６時間の時点でＧＦＰ発現の増加が観察された。１０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝２００μｍ。（Ｄ，Ｅ）４０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝５０μｍ。ＧＨＡＰ免疫陽性のアストロサイトと内在性ＧＦＡＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の蛍光が観察されたアストロサイトとの細胞突起への局在化を矢印で示す。
【図５】黒質緻密部（ＳＮＣ）におけるＴＨ免疫染色の共焦点画像を示す図である。（Ａ）ｎＴｇマウスではＧＦＰ発現が観察されなかった。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ，Ｃ）Ｔｇマウスに対する２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰの投与から６時間の時点でＧＦＰ発現の増加が観察された。２０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝１００μｍ。（Ｄ，Ｅ）４０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝５０μｍ。
【図６】ＧＦＡＰ−ＧＦＰ成体マウスのインビボ皮弁イメージングを示す図である。（Ａ）脳、（Ｂ）肝臓。
【図７】トランスジェニック（Ｔｇ）マウス及び非トランスジェニック（ｎＴｇ）マウスのエクスビボイメージングを示す図である。（Ａ）脳、（Ｂ）肝臓、（Ｃ）坐骨神経、（Ｄ）腎臓。
【図８】ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック新生児マウスの非侵襲的インビボ神経イメージングを示す図である。マウスは、生理食塩水（対照）又は８ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを用いて、本文中に示されるように処理された。マウスは、ＭＰＴＰの投与前に０時間の時点でイメージングされた。画像収集時間は１０秒間であった。マウスの各ペアは、トランスジェニックマウスを右側に示し、非トランスジェニックマウスを左側に示す。
【図９】相対蛍光（ＲＦ）として表現された、トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された全蛍光と非トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された組織自己蛍光との比を、１×１２ｍｇ／ｋｇ又は４×８ｍｇ／ｋｇで投与されたＭＰＴＰ処理群と対応する対照群とで比較した図（平均±ＳＥＭ， ｎ＝５）である。ＲＦは０時間の時点に対して正規化されている。＊はＭＰＴＰ処理群と対照群との間の統計的有意性（ｐ＜０．０１）を示す。スチューデントの２標本両側ｔ検定。
【図１０】（Ａ）ウエスタンブロットを用いて確認された、ＭＰＴＰ（４×８ｍｇ／ｋｇ）によるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。レーンａ：未処理のトランスジェニックマウス。レーンｂ：ＭＰＴＰ処理後２４時間のトランスジェニックマウス。レーンｃ：未処理の非トランスジェニックマウス。レーンｄ：ＭＰＴＰ処理後２４時間の非トランスジェニックマウス。（Ｂ）ウエスタンブロット膜のＩＶＩＳ（登録商標）イメージングにより確認された、ＭＰＴＰによるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。ユニットの単位はｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒである。
【図１１】（Ａ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＭＰＴＰ（４×８ｍｇ／ｋｇ）によるトランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスにおけるＧＦＡＰ遺伝子の発現に対する影響を示す図である。結果は誘導倍率±ＳＥＭを得るために、対照（未処理）に対して正規化されている。＊ｐ＜０．０１。ｎ＝４。標本両側ｔ検定。（Ｂ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＭＰＴＰ（４×８ｍｇ／ｋｇ）によるトランスジェニックマウス及び非トランスジェニックマウスにおけるＧＦＰ遺伝子の発現に対する影響を示す図である。結果は誘導倍率±ＳＥＭを得るために、対照（未処理）に対して正規化されている。
【図１２】新生児脳の異なる部位における、ＭＰＴＰ処理前後の内在性ＧＦＰを示す図である。
【図１３】８〜１０週齢の成体トランスジェニックマウスを用いた、抗ＴＨによる免疫組織化学（黒質緻密部）の結果を示す図である。
【図１４】（Ａ）ウエスタンブロットを用いて確認された、ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）によるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。レーンａ：未処理のトランスジェニックマウス。レーンｂ：ＭＰＴＰ処理後６時間のトランスジェニックマウス。レーンｃ：未処理の非トランスジェニックマウス。レーンｄ：ＭＰＴＰ処理後６時間の非トランスジェニックマウス。（Ｂ）ウエスタンブロット膜のＩＶＩＳ（登録商標）イメージングにより確認された、ＭＰＴＰによるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。ユニットの単位はｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒである。
【図１５】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＭＰＴＰ（１×１２ｍｇ／ｋｇ）によるトランスジェニックマウスにおけるＧＦＡＰ遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の発現に対する影響を示す図である。結果は誘導倍率±ＳＥＭを得るために、対照（未処理）に対して正規化されている。＊ｐ＜０．０１、＊＊＜０．００１。ｎ＝５。標本両側ｔ検定。
【図１６】ＧＦＡＰ−ＧＦＰトランスジェニック新生児マウスの非侵襲的インビボ神経イメージングを示す図である。マウスは、生理食塩水（対照）又は２ｍｇ／ｋｇのＫＡを用いて、本文中に示されるように処理された。マウスは、ＫＡの投与前に０時間の時点でイメージングされた。画像収集時間は１０秒間であった。マウスの各ペアは、トランスジェニックマウスを右側に示し、非トランスジェニックマウスを左側に示す。
【図１７】相対蛍光（ＲＦ）として表現された、トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された全蛍光と非トランスジェニックマウスのＲＯＩから検出された組織自己蛍光との比を、２ｍｇ／ｋｇで投与されたＫＡ処理群と対照群とで比較した図（平均±ＳＥＭ， ｎ＝４）である。ＲＦは０時間の時点に対して正規化されている。＊はＫＡ処理群と対照群との間の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。＊＊（ｐ＜０．０１）は対照群との比較である。スチューデントの２標本両側ｔ検定。
【図１８】（Ａ）ウエスタンブロットを用いて確認された、ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）によるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。レーンａ：未処理のトランスジェニックマウス。レーンｂ：ＫＡ処理後６時間のトランスジェニックマウス。レーンｃ：未処理の非トランスジェニックマウス。レーンｄ：ＫＡ処理後６時間の非トランスジェニックマウス。（Ｂ）ウエスタンブロット膜のＩＶＩＳ（登録商標）イメージングにより確認された、ＫＡによるＧＦＡＰ及びＧＦＰの発現に対する影響を示す図である。ユニットの単位はｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒである。
【図１９】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた、ＫＡ（１×２ｍｇ／ｋｇ）によるトランスジェニックマウスにおけるＧＦＡＰ遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の発現に対する影響を示す図である。結果は誘導倍率±ＳＥＭを得るために、対照（未処理）に対して正規化されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１。ｎ＝５。標本両側ｔ検定。
【図２０】海馬の各領域におけるＧＦＡＰ免疫染色の共焦点画像を示す図であり、図２０のＡ，ＢはＣＡ１領域を示し、図２０のＣ，ＤはＣＡ２領域及びＣＡ３領域を示す。図２０のＢ，Ｄのように、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスに対するＫＡの投与から６時間の時点で、Ａ，Ｃに示す未処理マウスの海馬領域よりも、ＧＦＰ発現の増加が観察された。２０倍の対物レンズを使用。スケールバー＝５０μｍ。ＧＨＡＰ免疫陽性のアストロサイトと内在性ＧＦＡＰ−ＧＦＰ導入遺伝子の蛍光が観察されたアストロサイトとの細胞突起への局在化を矢印で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の体内における目的とする蛍光タンパク質の発現を検出することを含む方法であって、
前記動物は、前記蛍光タンパク質をコードする核酸が該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結されたゲノムを有するトランスジェニック動物であり、
前記動物の体内で発現された前記タンパク質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記プロモーターがＧＦＡＰプロモーターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記動物に対する被検物質の投与による影響を検査するための方法であり、
蛍光を非侵襲的に検出する工程の前に前記被検物質を前記動物に投与する工程を含む、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記被検物質を投与していない対照動物における蛍光と、前記被検物質の投与後の前記トランスジェニック動物における蛍光とを比較する工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）対照とするために、前記被検物質の投与前の前記トランスジェニック動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）前記被検物質の投与後の前記動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）対照とするために、第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）前記被検物質を第２のトランスジェニック動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項８】
前記被検物質の神経毒性を検査する方法である、請求項４から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
神経障害の治療促進又は調節に関する被検物質の効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記トランスジェニック動物に神経障害を誘導する工程、
（ｉｉ）対照とするため、前記被検物質の投与前に、前記（ｉ）で得られた神経障害動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）前記被検物質の投与後に、前記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
神経障害の治療促進又は調節に関する被検物質の効果を検査する方法であり、
（ｉ）対照とするため、第１の動物に神経障害を誘導し、得られた神経障害動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）第２のトランスジェニック動物に神経障害を誘導し、前記被検物質を該動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記神経障害は、所定の化学物質を前記動物に投与することにより誘導される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記化学物質は、所定の疾患についての化学誘導動物モデルを得るために投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病の中から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記化学物質が、ＭＰＴＰ、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）、カイニン酸、トリメチル錫、クロルピリホス（ＣＰＦ）、エチレンビス（ジチオカルバミン酸）マンガン（Ｍａｎｅｂ又はＭＢ）、ロテノン、パラコート（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−４，４’−ビピリジニウム）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、３，３’−イミノジプロピオニトリル（ＩＤＰＮ）、及びトルエン（メチルベンゼン）の中から選択される、請求項１１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記神経障害は、前記動物の頭部及び／又は首及び／又は背中に対する物理的な力によって誘導される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１６】
前記神経障害は、前記動物の神経系への酸素供給を減らし、脳虚血を引き起こすことにより誘導される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１７】
神経系疾患の治療促進に関する被検物質の効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記神経系疾患の動物モデルでもある前記トランスジェニック動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするため、前記被検物質の投与前に、前記（ｉ）の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）前記被検物質の投与後に、前記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
神経系疾患の治療促進に関する被検物質の効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記神経系疾患の動物モデルでもある第１及び第２の動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするために、前記（ｉ）の第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）前記被検物質を前記（ｉｉ）の第２のトランスジェニック動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
神経系疾患の治療効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記神経系疾患の動物モデルでもある前記トランスジェニック動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするため、治療を施す前に、前記（ｉ）の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）治療を施した後に、前記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
神経系疾患の治療効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記神経系疾患の動物モデルでもある第１及び第２の動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするために、前記（ｉ）の第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の第２のトランスジェニック動物に治療を施した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項２１】
前記治療がＸ線又はγ線の照射を含む、請求項１９又は２０記載の方法。
【請求項２２】
前記神経系疾患が神経系腫瘍である、請求項１７から２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍が、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経繊維腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、星状細胞腫、及び乏突起膠腫の中から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記動物が哺乳動物である、請求項１から２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記動物が新生児である、請求項１から２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
動物の体内における目的とする蛍光タンパク質の発現を検出することを含む方法であって、
前記動物は、前記蛍光タンパク質をコードする核酸が該動物の神経系で通常発現しているタンパク質のプロモーター核酸に作動可能に連結されたゲノムを有するトランスジェニック動物であり、
前記動物の体内で発現された前記タンパク質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記プロモーターがＧＦＡＰプロモーターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記動物に対する被検物質の投与による影響を検査するための方法であり、
蛍光を非侵襲的に検出する工程の前に前記被検物質を前記動物に投与する工程を含む、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記被検物質を投与していない対照動物における蛍光と、前記被検物質の投与後の前記トランスジェニック動物における蛍光とを比較する工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）対照とするために、前記被検物質の投与前の前記トランスジェニック動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）前記被検物質の投与後の前記動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）対照とするために、第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）前記被検物質を第２のトランスジェニック動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項８】
前記被検物質の神経毒性を検査する方法である、請求項４から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
神経障害の治療促進又は調節に関する被検物質の効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記トランスジェニック動物に神経障害を誘導する工程、
（ｉｉ）対照とするため、前記被検物質の投与前に、前記（ｉ）で得られた神経障害動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）前記被検物質の投与後に、前記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
神経障害の治療促進又は調節に関する被検物質の効果を検査する方法であり、
（ｉ）対照とするため、第１の動物に神経障害を誘導し、得られた神経障害動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉ）第２のトランスジェニック動物に神経障害を誘導し、前記被検物質を該動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記神経障害は、所定の化学物質を前記動物に投与することにより誘導される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記化学物質は、所定の疾患についての化学誘導動物モデルを得るために投与される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病の中から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記化学物質が、ＭＰＴＰ、２’−ＣＨ３−ＭＰＴＰ、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）、カイニン酸、トリメチル錫、クロルピリホス（ＣＰＦ）、エチレンビス（ジチオカルバミン酸）マンガン（Ｍａｎｅｂ又はＭＢ）、ロテノン、パラコート（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−４，４’−ビピリジニウム）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、３，３’−イミノジプロピオニトリル（ＩＤＰＮ）、及びトルエン（メチルベンゼン）の中から選択される、請求項１１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記神経障害は、前記動物の頭部及び／又は首及び／又は背中に対する物理的な力によって誘導される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１６】
前記神経障害は、前記動物の神経系への酸素供給を減らし、脳虚血を引き起こすことにより誘導される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１７】
神経系疾患の治療促進に関する被検物質の効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記神経系疾患の動物モデルでもある前記トランスジェニック動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするため、前記被検物質の投与前に、前記（ｉ）の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）前記被検物質の投与後に、前記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
神経系疾患の治療促進に関する被検物質の効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記神経系疾患の動物モデルでもある第１及び第２の動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするために、前記（ｉ）の第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）前記被検物質を前記（ｉｉ）の第２のトランスジェニック動物に投与した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
神経系疾患の治療効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記神経系疾患の動物モデルでもある前記トランスジェニック動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするため、治療を施す前に、前記（ｉ）の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）治療を施した後に、前記（ｉｉ）と同じ動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
神経系疾患の治療効果を検査する方法であり、
（ｉ）前記神経系疾患の動物モデルでもある第１及び第２の動物を準備する工程、
（ｉｉ）対照とするために、前記（ｉ）の第１の動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の第２のトランスジェニック動物に治療を施した後、該動物における蛍光を非侵襲的に検出する工程、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉ）で検出された蛍光と前記（ｉｉｉ）で検出された蛍光とを比較する工程を含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項２１】
前記治療がＸ線又はγ線の照射を含む、請求項１９又は２０記載の方法。
【請求項２２】
前記神経系疾患が神経系腫瘍である、請求項１７から２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍が、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経繊維腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、星状細胞腫、及び乏突起膠腫の中から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記動物が哺乳動物である、請求項１から２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記動物が新生児である、請求項１から２４のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００９−５１２８５３（Ｐ２００９−５１２８５３Ａ）
【公表日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３６５５４（Ｐ２００８−５３６５５４）
【出願日】平成１８年９月２７日（２００６．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００６／０００２８４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４６７７４
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０４３５４１１７）エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ (17)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２７日（２００６．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００６／０００２８４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４６７７４
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０４３５４１１７）エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ (17)
【Ｆターム（参考）】
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