化学薬品の検出および生分解のための識別的蛍光の酵母バイオセンサー
本開示は、化学薬品を検出および／または改変するための方法、装置、システムおよび組成物を提供する。幾つかの実施形態では、バイオセンサーは、化学薬品の検出、その薬品の低毒性形態への改変、および／または化学薬品の該低毒性形態の検出を行うように構成し得る。該バイオセンサーは第１のレポーターをコードする第１の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステルが存在する場合に該第１のレポーターの発現を推進する第１の発現制御配列、第２のレポーターをコードする第２の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステル加水分解生成物が存在する場合に該第２のレポーターの発現を推進する第２の発現制御配列；および該有機リン酸エステルを加水分解して有機リン酸エステル加水分解生成物を生成する、少なくとも１種の酵素；を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００５年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／７４０，８８７号に利益を主張し、その内容は、本明細書中の全体にわたって参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、検体および／または検体変換生成物（複数も）を感知するシステム、生物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ほぼ１００年前に開発されたものであるが、有機リン酸エステル（ＯＰ）神経ガスなどの化学兵器は、軍人、文民の双方にとって今なお重大な脅威である。神経ガスは、１９８０年代のイラク・イラン戦争中に、１９９４年の松本攻撃において日本オウム真理教により、また１９９５年の東京地下鉄攻撃において使用された。この最後の事件では、テロリストらは、地下鉄列車上に揮発性神経ガスのサリン入りプラスチック袋を置き去りにし、傘の先端でその袋を突き刺して逃走した。発生した蒸気のために３７９６人が傷害を受け、１２人が死亡し、大パニックを起こした。ＯＰ神経ガスは、概して安価であり、開発途上国やテロリストにより比較的製造し易いので、大量破壊兵器として特に適している。神経ガスは、容易に分散し得ること、容易に隠し得ること、および少量で致死性になり得ることのために、特に危険になり得る。例えば、幾つかの計算によれば、２５０ｍ３の飛行機客室内で空気を循環すれば、茶さじ１杯の液体サリンからの蒸気により、約２．５分間で致死的となる恐れがある。発生するその蒸気は、容易に皮膚から吸収され、または吸入されるため、速やかに活動不能および死亡を起こす恐れがある。サリンほど揮発性はないが、ＶＸ（Ｏ−エチル Ｓ−［２−ジイソプロピルアミノエチル］メチルホスホノチオレート）などの他のＯＰ神経ガスは、致死量に要する液量が微量に過ぎないので致命的となる恐れがはるかに高い。エアゾール化ＶＸ液滴は、単純な噴霧（例えば、農薬散布機を用いて）により、またはより常套的なミサイル攻撃により分散することができよう。神経ガスは、酵素のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を阻害することにより作用し得る。ＡＣｈＥは、１秒当たりアセチルコリン（ＡＣｈ）分子約１００００個を加水分解する非常に効率的な酵素である。したがって、神経ガスによるＡＣｈＥ阻害は、殆ど直ちにＡＣｈの氾濫を起こす。この結果、呼吸器症状、胸苦しさ、眼のかすみおよび痛みを起こし、重度の暴露例では嘔吐、腹痛、膀胱・腸の過活動、失禁、痙攣、呼吸不全、麻痺および死亡を起こす恐れがある。
【０００４】
ＯＰ神経ガスの脅威は、一部の国が大量の貯蔵品を有しているという事実によって高まっている。世界の貯蔵量は２００キロトンを超えると報告されており、米国の備蓄量だけで３０キロトンに達する。その上、ＯＰ化合物は、殺虫剤などの農業害虫および家害虫の防除に広く使用されている。例えば、米国ではＯＰ殺虫剤４千万ｋｇ強が毎年使用され、更に２千万ｋｇが輸出用に毎年生産されている。この過剰使用に伴い、土壌系および水系のＯＰ汚染に関する公衆衛生上の懸念が当然存在する。ＯＰ殺虫剤への意図せざる暴露（水、食物、土壌）のために、毎年世界全体で殺虫剤被毒が百万例から３百万例起こる恐れがある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
したがって、こうした人工的有毒化合物を処置する安全で有効な方法、および自立可能な検出システムに対する必要性が存在する。本開示は、（１）１種もしくは複数の検体（例えば、化学薬品）、および／または（２）１種もしくは複数の検体（例えば、化学薬品）の変換（例えば、分解）を検知するバイオセンサーに関する。本開示のバイオセンサーは、対象とする化学種の検出および／または変換（例えば、除去）が望ましい場合の任意の用途において有用となり得る。例えば、幾つかの実施形態によれば、バイオセンサーは、ある製造工程および／または有害環境における化学汚染物質の検出および／または除去に使用し得る。
【０００６】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーは微生物を含み得る。例えば、本開示のバイオセンサーは、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の遺伝子操作株を含み得る。酵母は、（ｉ）検体の存在下（例えば、神経ガス兵器薬品および／または殺虫剤との接触）で、検体の非存在下より強い蛍光を発し、（ｉｉ）検体を変換（例えば、加水分解）し、および／または（ｉｉｉ）検体を変換した際に示差的に蛍光を発し得るものである。
【０００７】
幾つかの実施形態では、酵母は、１種または複数の検体を変換（例えば、分解）するためのプロモーター、コード配列、タンパク質および／または他の成分を含み得る。酵母は、１種または複数の検体を検出するためのプロモーター、コード配列、タンパク質および／または他の成分も含み得る。例えば、酵母は、（ｉ）通常は酵母中に見出されない酵素の発現により、化学薬品を分解する能力を付与し、（ｉｉ）その化学薬品汚染物質の存在下ではある波長で、またはその分解生成物の存在下では別の波長で蛍光を発するように示差的に活性化される酵母プロモーターに、転写性に融合した二重蛍光レポーター系を保有するように、遺伝子操作をしてもよい。
【０００８】
極限環境に耐性を示す頑健な非病原性微生物である酵母、Ｓ．セレビシエは、本開示の幾つかの実施形態に従って、内蔵式バイオセンサーとして使用し得る。外因性の基質および／または消費物質は不要とし得る。その上、二重蛍光レポーター系を用いる実施形態では、単純な手持ち式照明具によって、化学薬品汚染物質および分解生成物の識別的な肉眼検出が可能となり得る。
【０００９】
本開示は、更に検体の変換の検出にも関する。本開示の幾つかの実施形態では、検体の変換は、検体の部分的および／または完全な分解（例えば、加水分解）を包含し得る。変換は、検体を別の形態へ転換する（例えば、同化または異化により）ことを包含し得る。例えば、検体は、別の分子との複合および／または大型分子への統合を受けてもよい。検体変換生成物は、親検体より害がない（例えば、低毒性）こともある。
【００１０】
幾つかの実施形態では、検体には有機リン酸エステルがなり得る。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本開示は、（ａ）第１のレポーターをコードする第１の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステルが存在する場合に該第１のレポーターの発現を推進する第１の発現制御配列、（ｂ）第２のレポーターをコードする第２の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステル加水分解生成物が存在する場合に該第２のレポーターの発現を推進する第２の発現制御配列、および（ｃ）有機リン酸エステルを加水分解して有機リン酸エステル加水分解生成物を生成する、少なくとも１種の酵素を含む、酵母バイオセンサーに関する。第１および／または第２のレポーターは、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素および／または氷核タンパク質（ｉｎａＺ）をコードする核酸を含み得る。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはその変異体（例えば、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、酵母強化ＧＦＰ（ＹｅＧＦＰ）、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ ＧＦＰ（ＡｃＧＦＰ））、ＤｓＲｅｄもしくはその変異体（例えば、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス）、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１を包含し得る。発光タンパク質は、昆虫ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）、細菌生物発光（ｌｕｘＣＤＡＢＥ）および／またはレニラルシフェラーゼ（ｒｕｃ）を包含し得る。酵素は、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ｃｏｂＡ）、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼおよび／またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を包含し得る。
【００１２】
第１および第２のレポーターは、幾つかの実施形態によれば相互に異なり得る。第１の発現制御配列は、受入番号ＹＧＲ０３５Ｃ、受入番号ＹＨＲ１３９Ｃ、受入番号ＹＯＲ１８６Ｗ、受入番号ＹＧＲ２１３Ｃ、受入番号ＹＬＲ３４６Ｃ、受入番号ＹＩＲ０１７Ｃおよび受入番号ＹＬＬ０５６Ｃからなる群から選択される遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチド（例えば、−１０００〜−１位のヌクレオチド）を含み得る。第２の発現制御配列は、受入番号ＹＧＬ２０５Ｗ、受入番号ＹＪＬ２１９Ｗ、受入番号ＹＧＲ２８７Ｃおよび受入番号ＹＨＬ０１２Ｗからなる群から選択される遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチド（例えば、−１０００〜−１位のヌクレオチド）を含み得る。幾つかの実施形態では、第１および／または第２の発現制御配列は、前記の例より大なる、または小なるプロモーター断片を含み得る。発現制御配列の活性がその完全な配列の特定ドメイン（例えば、上流活性化配列、上流抑制化配列および／またはＴＡＴＡ配列）に起因する場合、該小なる断片が望ましいものとなり得る。
【００１３】
幾つかの実施形態によれば、有機リン酸エステル分解酵素は、有機リンヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、ホスホトリエステラーゼ、ＯｐｄＡ、有機リン酸アンヒドロラーゼ（ＯＰＡＡ）、ＤＦＰａｓｅおよびパラオキソナーゼ（ＰＯＮ）からなる群から選択し得る（表１５）。これらの酵素は、１種または複数の有機リン酸エステル結合を加水分解し得る（表１６および１７）。酵素は、幾つかの実施形態では、細胞内にあってもよく、細胞表面に提示されてもよく、および／または分泌されてもよい。酵母バイオセンサーは、外因性の薬品（例えば、アルコール）の適用で透過性にし得る。幾つかの実施形態では、酵母バイオセンサーは、エルゴステロール生合成遺伝子中に変異を含み得る。幾つかの実施形態では、酵母バイオセンサーは、（ａ）細胞壁の合成、維持もしくは分解、（ｂ）細胞膜の合成、維持もしくは分解、（ｃ）細胞修復、および／または（ｄ）細胞輸送（例えば、薬物の移出ポンプもしくは移入ポンプ）において、欠陥（例えば、変異）を含み得る。例えば、酵母バイオセンサーは、該センサー中に化学薬品を能動的に移入できる１種もしくは複数のタンパク質、および／または１種もしくは複数の該タンパク質をコードする核酸（複数も）を含み得る。
【００１４】
本開示は、部分的に、有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する方法であって、（ａ）酵母を有機リン酸エステルと接触させる工程、（ｂ）酵母からＲＮＡを収集する工程、（ｃ）相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、該ＲＮＡとを接触させる工程、（ｄ）各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、有機リン酸エステルと接触していない酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程、（ｅ）有機リン酸エステルと接触していない酵母より、有機リン酸エステルと接触した酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程、および（ｆ）同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程を含む方法に関する。
【００１５】
幾つかの実施形態では、有機リン酸エステルに感応する酵母バイオセンサーは、（ａ）有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程、（ｂ）同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程、（ｃ）レポーターをコードする核酸と該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程、および（ｄ）作動可能に連結した核酸を、核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程により調製し得る。作動可能に連結した核酸は、酵母プラスミド中に含み得るか、または酵母染色体の遺伝子座中に組み込み得る。レポーターは、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、またはこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【００１６】
本開示は、有機リン酸エステル加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する方法、および／または有機リン酸エステル加水分解のプロセスにも関する。幾つかの実施形態では、この方法は、（ａ）有機リン酸エステル加水分解生成物と酵母を接触させる工程、および（ｂ）有機リン酸エステルの存在下、組換えＯＰＨ＋酵母の転写プロファイルを野生型酵母と比較する工程を含み得る。幾つかの実施形態では、この方法は、（ａ）有機リン酸エステル加水分解生成物と酵母を接触させ、酵母からＲＮＡを収集する工程、（ｂ）相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、該ＲＮＡとを接触させる工程、（ｃ）各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、有機リン酸エステル加水分解生成物と接触していない酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程、（ｄ）有機リン酸エステル加水分解生成物と接触していない酵母より、有機リン酸エステル加水分解生成物と接触した酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程、および（ｅ）同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程を含み得る。この方法は、定量的逆転写ＰＣＲにより示差的発現を確認する工程を更に含み得る。
【００１７】
本開示は、有機リン酸エステル加水分解により、またはその間に上方調節される酵母遺伝子を同定する方法にも関する。幾つかの実施形態では、この方法は、（ａ）有機リン酸エステル加水分解を可能にする条件下で、有機リン酸エステルと組換えＯＰＨ＋酵母を接触させる工程、（ｂ）組換えＯＰＨ＋酵母からＲＮＡを収集する工程、（ｃ）相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、その差引き済みＲＮＡとを接触させる工程、（ｄ）各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、ＯＰＨを欠如し、有機リン酸エステルと接触した酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程、（ｅ）ＯＰＨを欠如し、有機リン酸エステルと接触した酵母より、有機リン酸エステルと接触した組換えＯＰＨ＋酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程、および（ｆ）同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程を含み得る。この方法は、定量的逆転写ＰＣＲにより示差的発現を確認する工程を更に含み得る。
【００１８】
有機リン酸エステル加水分解生成物および／または有機リン酸エステル加水分解に感応する酵母バイオセンサーは、幾つかの実施形態によれば、（ａ）有機リン酸エステル加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程、（ｂ）同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程、（ｃ）レポーターをコードする核酸と該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程、および（ｄ）作動可能に連結した核酸を、核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程により調製し得る。作動可能に連結した核酸は、酵母プラスミド中に含み得るか、または酵母染色体の遺伝子座中に組み込み得る。レポーターは、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、またはこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【００１９】
有機リン酸エステル、有機リン酸エステル加水分解生成物の双方に感応する酵母バイオセンサーは、（ａ）有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程、（ｂ）同定した有機リン酸エステル感応性遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程、（ｃ）レポーターをコードする核酸と有機リン酸エステル発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程、（ｄ）作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程、（ｅ）有機リン酸エステル加水分解生成物および／または有機リン酸エステル加水分解のプロセスにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程、（ｆ）同定した有機リン酸エステル加水分解感応性遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程、（ｇ）レポーターをコードする核酸と有機リン酸エステル加水分解生成物発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程、ならびに（ｈ）作動可能に連結した有機リン酸エステル加水分解生成物核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程により調製し得る。作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸および／または作動可能に連結した有機リン酸エステル加水分解生成物核酸は、１つもしくは複数のプラスミド中に含み得るか、または酵母染色体中に組み込み得る。発現制御配列は、プロモーターを含み得る。幾つかの実施形態では、発現制御配列は、同定された遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含み得る。レポーターは、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、またはこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本開示の具体的な例示的実施形態は、以下の説明および付随する図面を部分的に参照することにより理解し得る。
【００２１】
（詳細な説明）
神経ガスを検出する現行の手法には、イオン移動度分光分析、電気化学センサー、気液クロマトグラフィー、質量分析、赤外分光、光イオン化検出器、弾性表面波センサー、化学的変色などが挙げられる。こうした方法は、一般に手がかかり、高価な実験装置および複雑な手法を要する恐れがある。神経ガスおよびＯＰ殺虫剤の加水分解に使用される方法には、化学的加水分解と、細菌、哺乳動物、イカ、二枚貝および原虫由来の天然酵素を用いる酵素的加水分解とが含まれる。精製酵素を使用する欠点には、面倒および／または高価な単離・調製法が必要なことと、精製酵素の不安定性とが含まれる。
【００２２】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーは微生物を含み得る（例えば、細菌または酵母）。例えば、ｏｐｄ（有機リン酸エステル分解性）遺伝子を異種的に発現し、有機リン酸エステル化合物を加水分解する全細胞細菌生体触媒を調製し得る。幾つかの実施形態では、細胞における酵素配置が反応速度に影響し得るので、その配置に注意しなければならない。例えば、細胞表面上に発現したＯＰＨは、ＯＰＨが細胞質内に留まっている全細胞生体触媒より有効にＯＰ化合物を加水分解し得る。本開示の任意の実施形態を特定の任意の作用機構に限定することなく、このことは、細菌細胞外被の透過性障壁機能と関係し得る。溶媒、凍結・融解法を用いてその外膜を透過性にし、および／または外膜透過性変異体を使用すると、幾つかの実施形態では、こうした問題が緩和され、受動拡散速度および加水分解速度が増加し得る。
【００２３】
幾つかの実施形態では、酵母バイオセンサーは、（ａ）有機リン酸エステル化合物、および（ｂ）例えば、有機リン酸エステルの分解生成物の検出による、有機リン酸エステルの加水分解を検出できる二重レポーター系を含み得る。酵母バイオセンサーは、有機リン酸エステル化合物を分解するための生化学系を更に含み得る。酵母は、化学薬品汚染物質を生分解する異種酵素の発現により、こうした薬品を生分解できるように遺伝子操作を行い、示差誘導性のプロモーター・蛍光タンパク質融合体を用いて、化学薬品およびその生分解産物を検出するようにも操作を行い得る。幾つかの実施形態によれば、化学薬品を改変、分解および／または解毒できる能力により、センサーは、自浄または自動リセット特性を獲得し得る。他の実施形態では、この能力により、バイオセンサーは、化学薬品を検出するだけでなく、その薬品を空間から一掃するためにも使用できるようにし得る。
【００２４】
酵母Ｓ．セレビシエを本開示の幾つかの実施形態で使用し得る理由は、（ｉ）極限環境に耐性であること、（ｉｉ）サッカロミセスゲノム欠失プロジェクト（スタンフォード）を介して入手できる多数の変異体を用いて、遺伝学的に良く確定されていること、（ｉｉｉ）有機リン酸アンヒドロラーゼのコード遺伝子を含め、異種タンパク質の発現に使用し得ること、（ｉｖ）非病原性であること、（ｖ）凍結乾燥が容易で、１０年間保存後の生存率が良好なこと、および（ｖｉ）酵母の遺伝毒性物質誘導可能遺伝子は、一部の細菌より広範囲の損傷性薬品に応答することである。このことは、異なるＯＰ薬品で誘導し得る遺伝子の同定にとって重要となり得る。
【００２５】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーにとって、細菌の相対的に迅速な倍加時間が有益になり得る（例えば、酵母の７０分に対して２０分）。他の実施形態では、遅めの増殖は、例えば、ＯＰ殺虫剤（例えば、アジンホスメチル、ジアジノン、ジメトエート、ピリミホスメチル）などの大きな基質が酵母細胞に進入できること、および基質透過性を高める特異的変異体が入手できることを考えると許容される。その上、酵母バイオセンサーの作製は、時間が主な制約でない場合、研究室で行い得る。
【００２６】
特定の実施形態では、フラボバクテリウム種／シュードモナス・ディミヌータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）のＯＰＨコード遺伝子をＳ．セレビシエ中で異種的に発現させることにより、ＶＸやＶＸモデル疑似物質のパラオキソンなどの１種または複数のＯＰ化合物を加水分解できる酵母生体触媒を創製し得る。細胞への基質進入を最大限とするために、多孔度が増加し、大きな分子の受動拡散を可能にするＳ．セレビシエの細胞壁変異株を使用し得る。例えば、変異株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Ｄ１ ｌｅｕ２ＤＯ ｍｅｔ１５ＤＯ ｕｒａ３ＤＯ ＤＳＭ１１）（ＡＴＣＣ４００５８８２）は、（１，３）−β−グルカン合成およびキチンシンターゼ発現に関与する遺伝子のＳＭ１１（ＫＮＲ４としても知られている）が欠失しているが、こうしたものは酵母細胞壁の主成分である。ＳＭ１１が欠失すると、（１，３）−β−グルカンの総含量が減少し、（１，３）−β−グルカンシンターゼの活性が低下し、細胞壁キチン含量が増加する。該変異体ではＳＤＳ感受性が高まっており、細胞壁が弱化したことを示唆している。細胞透過性アッセイでは、該変異体は、野生株より基質に対して透過性が高いことが示された。酵母生体触媒のＯＰ化合物に対する加水分解能は、ＶＸやパラオキソンなどのＶＸ疑似物質を用いて試験し得る。
【００２７】
全細胞細菌生体触媒を用いる基質の加水分解における律速段階には、その化合物の細胞への進入がなり得る。したがって、細菌触媒の効率は、基質が受動拡散により細胞に進入できる効率が増加している透過性変異体の使用によって、有意に改善し得る。ＯＰ基質は非特異的機構により酵母に進入することができるが、透過性が増加した酵母変異体を使用し得る。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６２００個の９５％の欠失に成功したサッカロミセスゲノム欠失プロジェクトから、豊富な情報が研究者に提供されてきた。必要とあれば、他の酵母変異体を容易に入手し、ＯＰ基質の細胞進入能について分析し得る。
【００２８】
予備的な結果では、未処置の酵母細胞は、未処置の生体触媒として作用し、モデル基質のパラオキソンを加水分解できることが示された。とは言え、特定の実験では、酵母細胞膜がパラオキソンの進入を制限し、したがって透過性障壁として作用することが示された。ジギトニンなどの透過促進剤で酵母細胞を処理すると、酵母によるパラオキソン加水分解が３〜４倍増加した。このことから、酵母細胞膜の破壊によりパラオキソンの進入速度が増加し、その結果酵母の生体触媒活性が増加することが示唆された。その上、エルゴステロール（膜）生合成に特定の欠陥があるｅｒｇ６変異体は、パラオキソンに対して超感受性を示した。このことから、膜欠陥が基質透過性を増大させ、パラオキソンの進入速度を変えることが示唆される。したがって、幾つかの実施形態では、ｅｒｇ６変異のようにエルゴステロール生合成に変異を潜ませたものなどの酵母変異体は、それを使用して異なる基質に対する膜透過性を増大させ得る（Ｇａｂｅｒ ＲＦら、（１９８９年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９巻、３４４７〜５６頁；Ｈｅｍｅｎｗａｙ ＣＳ ＆ Ｈｅｉｔｍａｎ Ｊ（１９９６年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１巻、１８５２７〜３４頁）。別の実施形態では、酵母（または精選した宿主種）を、活性のあるＯＰ／化学薬品膜輸送物質の発現により化学薬品を活発に取り込むように特異的に操作し、それにより細胞内化学薬品の濃度を増加させ得る。
【００２９】
ＯＰＨのＯＰ基質との相互作用は、特定の流出ポンプで媒介される該薬品の能動的移出の速度からも影響を受け得る。例えば、広範囲の薬物および化合物の能動的流出に関与する、推定上のＡＢＣ輸送タンパク質をコードする２２個の酵母遺伝子が同定された（Ｒｏｇｅｒｓ Ｂら、（２００１年）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３巻、２０１〜２１４頁）。その主要な輸送物質３種は、ＰＤＲ５（多面発現的薬物耐性）、ＹＯＲ１（酵母のオリゴマイシン耐性）およびＳＮＱ２（４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドに対する感受性）である。幾つかの実施形態では、酵母バイオセンサーは、薬物流出変異を単独で、あるいは酵母透過性変異（複数も）および／または細胞の化学薬品感受性を高める、例えば、その基質の細胞内酵素との相互作用を高める変異（複数も）と組み合わせて含み得る。
【００３０】
幾つかの実施形態によれば、ＯＰＨ酵素は、基質の進入および／または流出の制約を回避するために、分泌させるか、または細胞表面に提示してもよい。同様の戦略は、細菌全細胞触媒に対しても採用されてきた。ＯＰＨ酵素と氷核タンパク質との融合により、ＯＰＨ酵素が細胞表面に誘導され、そこで表示され、効率的にＯＰ薬品を触媒した（Ｍｕｌｃｈａｎｄａｎｉ Ａら、（１９９９年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６３巻、２１６〜２３頁；Ｓｈｉｍａｚｕ Ｍら、（２００３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １９巻、１６１２〜４頁；Ｍｕｌｃｈａｎｄａｎｉ Ｐら、（２００１年）Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ １６巻、４３３〜７頁）。酵母におけるタンパク質分泌は、分泌経路を通して該タンパク質を差し向けるのに必要なシグナルを含有する、合成リーダーペプチドとの融合により媒介し得る（Ｐａｒｅｋｈ Ｒら、（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ６巻、５３７〜４５頁）。該リーダーペプチドのウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）との融合により、１４０μｇ／ｍｌの活性ＢＰＴＩ分泌が可能となった（Ｐａｒｅｋｈ ＲＮら、（１９９６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １２巻、１６〜２１頁）。同様に幾つかの実施形態では、ＯＰＨ酵素は、分泌経路シグナルを有するリーダーペプチドを含み得る。ＯＰＨ酵素の移出は、酵母が、親化合物の１種または複数の加水分解生成物より、親化合物に対して浸透性が低い場合に、望ましくなり得る。
【００３１】
ＯＰＨによる加水分解速度は変動し得るが、幾つかの実施形態では、異なる化学薬品に対して触媒活性が増加した酵素を使用し得る。その上、各々が異なる形態のＯＰＨ酵素を発現する、酵母生体触媒の異なる配合物を併用することにより、特定のＯＰ標的に対して最適の基質特異性を実現し得る。
【００３２】
幾つかの実施形態では、ＶＸ（またはパラオキソン）で転写性に誘導したＳ．セレビシエ遺伝子、およびその加水分解生成物で誘導した遺伝子を同定し得る。例えば、ＶＸなどの化学薬品の存在下または非存在下でのＳ．セレビシエＳＭ１１、およびＶＸの存在下または非存在下でのＯＰＨを発現する組換えＳ．セレビシエＳＭ１１について、全体的な転写プロファイル作成（マイクロアレイ分析）を行ってもよい。ＶＸとインキュベートした野生型細胞と、ＶＸとインキュベートしたＯＰＨを発現する組換え細胞との比較によって、ＶＸの加水分解により誘導される１種または複数の酵母遺伝子の同定を促進し得る。ＯＰＨを発現する酵母株を用いたＶＸの加水分解により、ＶＸの加水分解能を欠いた細胞とは異なる転写プロファイルが生成し得る。次いで、様々な濃度のＶＸを用いた優先的標的についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、低濃度で用量依存的に誘導される酵母遺伝子を同定し得る。
【００３３】
優先的遺伝子のプロモーター領域は、サッカロミセスプロモーターデータベース（ＳＣＰＤ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹが維持）、文献解析および／または５’プロモーター分析を用いてマッピングし得る。このようなマッピングは、ＶＸ、ＶＸ加水分解生成物および／またはＶＸ加水分解過程に対する感受性を付与する、１種または複数のプロモーター領域の同定を補助し得る。プロモーターは、クローニングし、異なる分光特性を示す強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）またはＤｓＲｅｄエキスプレス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と融合することにより、ＶＸ汚染の検出および分解中に示差的に蛍光を発する二重レポーター酵素バイオセンサーを創製し得る。幾つかの実施形態では、単一のプロモーター−レポーター融合で、遺伝毒性物質の検出に成功し得る。他の実施形態では、ＯＰ薬品の識別にプロモーター−レポーター融合のサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が必要となり得る。
【００３４】
幾つかの実施形態では、検出系は生物発光成分（例えば、ｌｕｘＡＢ）を含み得る。生物発光は過渡的シグナルとし得る。例えば、ｌｕｘＡＢタンパク質は、高めた温度（３０℃）に感応し得るもので、活性のために追加の基質を必要としてもよい。幾つかの実施形態では、検出系は蛍光成分（例えば、蛍光タンパク質）を含み得る。検出系に使用する蛍光タンパク質は、安定であり、多様な分光特性の１種または複数を有し得る。バイオセンサーは、幾つかの実施形態によれば、研究室外の苛酷な条件下での使用に適した検出系（例えば、蛍光）で構成し得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーは、内蔵式にし得るもので、外因性の基質および／または消費物質は不要とし得るものであり、安価に大量生産し得るものであり、ならびに／あるいは単純な手持ち式照明具を用いて視覚的に確認し得る。
【００３６】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーは、ＶＸ、ソマン、サリン、デメトンＳ、パラオキソン、タブン、ＤＦＰ、アセフェート、クロルピリホス、クマホス、コロキソン、パラチオン、ダイアジノン、ｄＭＵＰなどの有機リン酸エステル神経ガスおよび殺虫剤の検出および分解のために使用し得る。
【００３７】
しかし、異なる化学薬品を分解できる変異酵素（変異性ＰＣＲによる、もしくはＤＮＡシャフリングなどの定向進化による）または天然酵素を用いて、酵素の基質特異性を変えることにより、本開示の実施形態は、Ｈクラス薬品（例えば、マスタードガス）などの他の標的を検出し、生分解するより広い特異性の実現に使用し得る。
【００３８】
ＯＰＨは加水分解を行い、その結果、Ｐ−Ｏ、Ｐ−ＦおよびＰ−Ｓ含有結合の切断により、多様なＯＰ殺虫剤および化学兵器薬品の毒性を低下させる。しかし、ＯＰＨによるこうした結合の切断効率は異なっている。例えば、ＯＰＨの触媒作用は、パラオキソン、パラチオンおよびクマホスのＰ−Ｏ結合に対してｋｃａｔｓが６７〜５０００／秒であり、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、サリンおよびソマンのＰ−Ｆ結合に対してｋｃａｔｓが０．０１〜５００／秒であり、ＶＸ、デメトンＳ、マラチオンおよびアセフェートのＰ−Ｓ結合に対してｋｃａｔｓが０．００６７〜１６７／秒である。したがって、Ｐ−Ｓ結合に対するＯＰＨの加水分解効率は、より低く、例えば、ＶＸはパラオキソンの１／１０００の効率で切断される。ＯＰＨのこの触媒効率および特異性を改善するために、設計手法およびランダム手法によりＯＰＨ変異体が生成された（Ｗａｔｋｉｎｓ ＬＭら、（１９９７年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２巻、２５５９６〜６０１頁；Ｙａｎｇ Ｈら、（２００３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６巻、１３５〜４５頁；Ｃｈｏ ＣＭら、（２００２年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８巻、２０２６〜３０頁；Ｃｈｅｎ−Ｇｏｏｄｓｐｅｅｄ Ｍら、（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０巻、１３２５〜３１頁）。両手法とも、ｏｐｄ遺伝子の変異誘発と、その後の精選した標的のスクリーニングに依拠することにより、その特定の標的に対する変異酵素を最適化している。こうした研究から、「切断困難な」基質を用いて反応効率が３桁増加できることが示された（Ｈｉｌｌ ＣＭら、（２００３年）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５巻、８９９０〜１頁；Ｃｈｏ ＣＭら、（２００４年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０巻、４６８１〜５頁）。更に、変異体の加水分解活性は、最も効率的な加水分解を受ける基質のパラオキソンで得られた活性に匹敵していた。このことは、ＯＰＨ配列の合理的およびランダムな変化により、加水分解し難い基質を標的とした効率的酵素を生成できることを示している。
【００３９】
そのままの組換えＯＰＨ＋酵母細胞は、パラオキソンを加水分解し得る。幾つかの実施形態では、ＯＰＨ酵素の効率を改善するために、ＯＰＨの変異誘発を設計通り、およびランダム化して行い得る。例えば、酵素活性部位のアミノ酸変化を設計通りおよびランダムを併用してスクリーニングした後、特定の有機リン酸エステルに対するランダム定向進化（ＤＮＡシャフリング）を行うことによって、ＯＰ薬品に対する触媒効率が有意に改善されたＯＰＨ変異体を単離し得る。広範な基質類縁体を用いたＯＰＨの三次元構造解析により、該酵素の活性部位内に異なる３種の結合ポケットが特定された。これらの結合部位は、小サブサイト（Ｇｌｙ６０、Ｉｌｅ１０６、Ｌｅｕ３０３、Ｓｅｒ３０８、Ｃｙｓ５９およびＳｅｒ６１の側鎖により規定される）、大サブサイト（Ｈｉｓ２５４、Ｈｉｓ２５７、Ｌｅｕ２７１およびＭｅｔ３１７）、ならびに脱離基サブサイト（Ｔｒｐ１３１、Ｐｈｅ１３２、Ｐｈｅ３０６およびＴｙｒ３０９）と呼称されてきた（Ｖａｎｈｏｏｋｅ ＪＬら、（１９９６年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５巻、６０２０〜５頁）。こうした部位のアミノ酸変化で、ＯＰＨの立体選択性および反応性は激変する（Ｃｈｅｎ−Ｇｏｏｄｓｐｅｅｄ Ｍら、（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０巻、１３２５〜３１頁）。例えば、活性部位のアミノ酸残基（Ｉｌｅ１０６、Ｔｒｙ１３１、Ｐｈｅ１３２、Ｓｅｒ３０８およびＴｙｒ３０９）をランダム化すると、既に効率的に加水分解される基質のパラオキソンに対するＯＰＨ活性が６３倍増加した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ ＆ Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ（２００３年）Ｅｍｂｏ Ｊ ２２巻、２４〜３５頁）。同様にして、Ｈｉｌｌら（Ｈｉｌｌ ＣＭら、（２００３年）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５巻、８９９０〜１頁）は、アミノ酸３個（Ｈｉｓ２５４、Ｈｉｓ２５７およびＬｅｕ３０３をそれぞれグリシン、トリプトファンおよびスレオニンへ）を変えただけで、ソマン類縁体に対するＯＰＨ触媒活性を３桁増加させた。後者の研究は、アミノ酸のランダム変化と、その後の精選するＯＰ基質に対する包括的スクリーニングに依拠していた。
【００４０】
適合性の増した酵素を見出すために、定向進化またはＤＮＡシャフリングを用いてタンパク質配列全体をスクリーニングしてもよい（Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ（１９９４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１巻、１０７４７〜５１頁；Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３７０巻、３８９〜９１頁）。プールした単一または関連遺伝子のランダム断片化の後、その断片をプライマーなしＰＣＲで再構成することによって行われる、この組換え・変異プロセスにより、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼおよびβ−ラクタマーゼの活性が、それぞれ４５倍、１０００倍および３２０００倍改善された（Ｚｈａｎｇ ＪＨら、（１９９７年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４巻、４５０４〜９頁；Ｃｒａｍｅｒｉ Ａら、（１９９６年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４巻、３１５〜９頁）。ＤＮＡシャフリングにより、ＯＰＨの触媒活性の増加にも成功することが証明された（Ｙａｎｇ Ｈら、（２００３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６巻、１３５〜４５頁；Ｃｈｏ ＣＭら、（２００２年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８巻、２０２６〜３０頁）。特に、野生型酵素によって好ましい基質パラオキソンのほぼ１／１０００の速度で加水分解される殺虫剤、クロロピリホスに対するＤＮＡシャフリングの結果、ｋｃａｔ／Ｋｍ値が７２５倍増加した（Ｃｈｏ ＣＭら、（２００４年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０巻、４６８１〜５頁）。
【００４１】
幾つかの実施形態では、フラボバクテリウム種のｏｐｄ遺伝子を、異なる種由来の有機リンヒドロラーゼまたは類似の加水分解性酵素をコードする関連遺伝子とシャフリングしてもよい。例えば、フラボバクテリウム種のｏｐｄ遺伝子は、近縁のアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）のｏｐｄＡ遺伝子とシャフリングすること（Ｈｏｒｎｅ Ｉら、（２００２年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８巻、３３７１〜６頁）により、定向進化を「加速」し得る。近縁遺伝子同士のシャフリングは、単一遺伝子のシャフリングと比較して変異体が改良される可能性を高めることができる（Ｃｒａｍｅｒｉ Ａら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ ３９１巻、２８８〜９１頁）。該ｏｐｄＡ遺伝子は、ヌクレオチド段階でｏｐｄと約８８％同一であり、ｏｐｄより、広い基質範囲と一部の基質に対する優れた速度とを有することが示された。
【００４２】
幾つかの実施形態によれば、効率的な酵母生体触媒／バイオセンサーは、研究室外で機能し得る。こうした実施形態の幾つかでは、バイオセンサーは、（ｉ）高度の発現を実現するために、最適な発現シグナルを使用し、（ｉｉ）ｏｐｄ遺伝子／レポーター遺伝子の多重コピーを酵母ゲノム中に組み込み、次いで発現を増加させ、および／または（ｉｉｉ）選択圧の非存在下でもｏｐｄ遺伝子／レポーター遺伝子を安定に維持し得る。本開示の実施例は、酵母の２μプラスミドからのＯＰＨタンパク質および蛍光レポーターのプラスミドのエピソーム発現に関する。この戦略は、外来遺伝子の異種発現に対する単純化した汎用的な手法を提供し得る。この２μプラスミドは、低い分離安定性を有する恐れがある、即ちこのプラスミドは、酵母集団中で安定に維持されない恐れがある（Ｍｕｒｒａｙ ＡＷ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３４巻、９６１〜７０頁）。この結果、選択圧下でも酵母集団が不均質になり得る。例えば、予備的結果では、酵母細胞の約２５％だけしか、選択圧下でＯＰＨ発現ベクターを安定に維持しないことが示された。このことは、酵母細胞の大半がＯＰＨプラスミドを含有していなかったことであり、したがって非最適条件下で作用していた恐れがあることを意味している。
【００４３】
エピソームのプラスミド不安定性は、幾つかの実施形態によれば、対象とするプラスミド／遺伝子を酵母ゲノム中に組み込むことにより克服し得る。この結果、選択圧がない場合でも多世代に亘り挿入ＤＮＡ配列を維持する、安定なクローン酵母集団が得られる（Ｌｏｐｅｓ ＴＳら、（１９８９年）Ｇｅｎｅ ７９巻、１９９〜２０６頁；Ｐａｒｅｋｈ ＲＮら、（１９９６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １２巻、１６〜２１頁）。組込み配列は、エピソームのプラスミド（３０〜５０）と比較して少ないコピー数（１〜５）で維持し得る（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ ＴＬ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９８３年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３巻、７４７〜９頁）。しかし、組込みコピー数は、酵母ゲノム中の標的部位数に比例する（Ｗｉｌｓｏｎ ＪＨら、（１９９４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１巻、１７７〜８１頁）ので、組込みＤＮＡの多重コピーを保持する酵母細胞は、該挿入配列が多重コピーで存在する場合に生成し得る。例えば、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）は、染色体ＸＩＩ上に縦列に９．１ｋｂ単位のコピー約１４０個を包含している（Ｐｅｔｅｓ ＴＤ（１９７９年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７６巻、４１０〜４頁）。ｒＤＮＡ遺伝子座を標的とすることにより、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）は、細胞１個当たり１００〜２００コピーで組み込まれ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターから発現したとき、全可溶性タンパク質の約５０％を占めた。同様に、細胞１個当たり約１５０〜２００コピーで存在する相同組換え用のＴｙδ配列を標的とすることにより、組込み配列のコピーを最大で３０個得ることができる。２μプラスミドの使用と比較して、タンパク質発現２〜１０倍の増加を実現し得る。したがって、幾つかの実施形態では、ｏｐｄ遺伝子／レポーター遺伝子を酵母ゲノム中に組み込むことにより、安定な酵母の生体触媒／バイオセンサーを創製し得る。
【００４４】
フラボバクテリウム種細菌から元々誘導されたｏｐｄ遺伝子は、酵母（もしくは特定の宿主株）中ではめったに使用されないコドンを含有し、またはそのコード配列内に発現制限的調節要素を含有し得る。幾つかの実施形態では、ＯＰＨコードｏｐｄ遺伝子は、コドンを最適化することにより、酵母／特定の宿主種中で効率的な発現を保証し得る。レポーター遺伝子も、その改変により、最適なコドン認識を保証し、発現制限的調節要素を除去することによって、精選した宿主中での効率的な発現を保証し得る。（例えば、コドンを最適化したｏｐｄおよびＹＤｓＲｅｄ遺伝子が、図４Ａおよび４Ｂに示されている）。
【００４５】
ｐＧＡＬ調節性プロモーターを本開示の実施例で使用して、外来ｏｐｄ遺伝子の発現を推進したが、それは、デキストロースまたはガラクトースの存在で、発現を各々抑制または誘発することができたからである。しかし、構成的に強力に発現するプロモーターは、それを用いてｏｐｄ遺伝子を発現し得る。例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターは、強力にも構成的にも発現するので、それを常套的に用いてＳ．セレビシエにおいて高度の外来遺伝子発現を実現する（Ｅｄｅｎｓ Ｌら、（１９８４年）Ｃｅｌｌ ３７巻、６２９〜３３頁；Ｉｍａｍｕｒａ Ｔら、（１９８７年）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６１巻、３５４３〜９頁）。したがって、幾つかの実施形態では、ＧＡＰＤＨプロモーターまたは同様に高度発現性の構成プロモーターを用いて、酵母中に外来遺伝子発現を推進し得る。例えば、ＧＡＰＤＨプロモーターは、ｏｐｄ遺伝子が構成的に発現するように、ｏｐｄ遺伝子に作動可能に連結（例えば、隣接して配置）し得る。
【００４６】
幾つかの実施形態では、パラオキソンおよびパラオキソン加水分解生成物に感応する遺伝子を同定するために、マイクロアレイ分析を使用し得る。本開示の実施例に例示するように、マイクロアレイ分析により、パラオキソン誘導可能遺伝子およびパラオキソン加水分解に関連する遺伝子をおよそ１９００種同定した。したがって、他の有機リン酸エステルまたは他の化学薬品に感応する遺伝子および対応プロモーターを同定するために、マイクロアレイ分析を使用し得る。マイクロアレイ分析は、他の有機リン酸エステルまたは化学薬品の分解生成物に感応する遺伝子および対応プロモーターを同定するためにも、使用し得る。
【００４７】
化学薬品の存在下または非存在下での野生型Ｓ．セレビシエ（または精選種）、および化学薬品の存在下または非存在下での、酵素／代謝化剤を発現し、化学薬品を加水分解し得る組換えＳ．セレビシエについて、全体的な転写プロファイル作成（マイクロアレイ分析）を行ってもよい。別の実施形態では、化学薬品の加水分解で誘導される遺伝子を同定する代替手法は、化学薬品を加水分解するその細胞に依拠するのではなく、その細胞を加水分解生成物と直接インキュベートすることである。例えば、ＯＰ神経ガスＶＸの酵素的加水分解により、２−（ジイソプロピル）アミノエタンチオールが産生する（Ｂｏｎｉｅｒｂａｌｅ Ｅら、（１９９７年）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ ６８８巻、２５５〜６４頁；Ｊｏｓｈｉ ＫＡら、（２００６年）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７８巻、３３１〜６頁）。マイクロアレイ分析は、２−（ジイソプロピル）アミノエタンチオール塩酸塩の存在下でインキュベートした細胞から調製したＲＮＡを用いて行い得る。
【００４８】
幾つかの実施形態では、加水分解生成物により過渡的に誘導される遺伝子を同定するために、類似の手法を用い得る。過渡的誘導可能遺伝子は、除染過程の進行のモニターを可能とするために、望ましいものとなり得る。細胞は、加水分解生成物に６０分曝し、等分した後、ＲＮＡ調製のために使用するか、または洗浄し、加水分解生成物が欠けた媒体中に再懸濁してもよい。代謝物質により当初誘導されるが、後に基準の非誘導量に戻る遺伝子が、過渡的誘導可能遺伝子である。
【００４９】
別の実施形態では、明確な異なる波長で発光する「発光」（生物発光）遺伝子を、レポーターシグナルとして用いてもよい。例えば、ビブリオ・ハルベイイｌｕｘＡＢ遺伝子は、酵母中で使用し得る（Ｓｚｉｔｔｎｅｒ Ｒら、（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３０９巻、６６〜７０頁）。ＬｕｘＡＢ酵母細胞は、０．５％Ｚ−９テトラデセナールの存在下で生存でき、ｎ−デカナールで得られるものと類似の生物発光シグナルを生じる。その上、生物発光シグナルは、該アルデヒド基質を更に添加せずに２４時間強力に持続する。制限基質ＦＭＮＨ２をコードするビブリオ・ハルベイイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）のオキシドレダクターゼ遺伝子（ｆｒｐ）を共発現すると、生物発光シグナルは原核系に匹敵する量まで更に増加した。こうした実験の結果、生物発光シグナルは、バックグランド量のほぼ９×１０５倍に達した（Ｇｕｐｔａ ＲＫら、（２００３年）Ｆｅｍｓ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ４巻、３０５〜１３頁）。「過渡的」発光シグナルは、除染過程の経時的モニタリングを可能にし得る。
【００５０】
発光の考え得る欠点は、上昇した温度での熱不安定性である（Ｅｓｃｈｅｒ Ａら、（１９８９年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６巻、６５２８〜３２頁）。しかし、ゼノルハドブス・ルミネセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｄｂｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）由来の熱安定ＬｕｘＡＢが、必要または所望とあれば使用してもよい。Ｘ．ルミネセンス由来のルシフェラーゼ活性は、高い熱安定性（４５℃での半減期３時間）を示し、より高い温度で使用するバイオセンサーにとって選りすぐりの生物発光系となり得る。加えて、異なる発光色を有する異なるルシフェラーゼ（Ｌｉｎ ＬＹら、（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻、３１８３〜９４頁）に融合するプロモーターの「サイン」を用いて、長期間に亘る除染過程をモニターし得る。
【００５１】
別の実施形態では、化学薬品を生分解し、化学薬品の毒性を直接低下させるのではなく、それが化学的加水分解を受け易くなるように、生体触媒は化学薬品を改変してもよい。
【００５２】
別の実施形態では、生体触媒は、異なる化学薬品を検出し、生分解するために、多重の生分解酵素および多重のプロモーター・レポーター遺伝子融合体を潜ませてもよい。
【００５３】
別の実施形態では、特定の薬品に対して特定の生分解酵素および特定のレポーター検出系を各々が潜ませた各クローン細胞は、混合することにより、異なる化学薬品を一群として検出し、生分解することができる不均質集団にしてもよい。
【００５４】
別の実施形態では、デオキシリボ核酸（例えば、ＤＮＡザイム）もしくはリボ核酸、または生細胞中で産生できる類似物などの加水分解能を有する分子（酵素以外）を用いて、化学薬品を加水分解または生分解してもよい。
【００５５】
当業者なら理解されようが、本開示の実施形態によれば、化学薬品を検出および／または改変する他の等価または代替のシステム、装置および方法を、その本質的特性から乖離せずに想定することができる。例えば、本開示の装置は、手持ち式または卓上式構成に製造し、散発的、間歇的および／または連続的に操作し得る。その上、バイオセンサーは、１つもしくは複数の温度および／または圧力下で使用するように構成し得る。しかも、当業者であれば、標的化学薬品を検出および／または改変するために、多数の自己および異種核酸を使用し得ることを認識されよう。また、本開示は、任意の特定の光源および／または発光光学装置に限定されず、所望の波長（複数も）に適切に調節し得る任意タイプの発光装置の使用を広く想定している。同様に、本開示は、任意タイプの光検出器および／または光検出装置の使用を想定している。本開示のシステムの全部または一部は、使い捨ておよび／または再使用ができるように構成し得る。時々は、再使用型部品を浄化、修理および／または改造することが望ましい場合もある。更にまた、いずれの実施形態、使用および／または利点も、他の実施形態、使用および／または利点を普遍的に抑制または除外することを意図していないことは、当業者ならば理解されよう。明白な変更および改変を伴うこうした等価物および代替物は、本開示の範囲内に包含されることを意図している。したがって、上記の開示は、以下の特許請求の範囲で明らかにされるように、本開示の範囲に関して例示的なものであって、制限的なものではないことを意図している。
【実施例】
【００５６】
本開示の幾つかの実施形態は、以下の実施例の１つまたは複数により例示し得る。
【００５７】
実施例１〜９は、細菌ｏｐｄ遺伝子を含有する酵母用発現ベクターの構築およびＳ．セレビシエ中への形質転換を詳述する。ｏｐｄ遺伝子が酵母内で発現されたことを確認するために、逆転写ＰＣＲを用いた。組換えＯＰＨ＋酵母から調製した酵素溶解物を用いるパラオキソナーゼアッセイにより、ｏｐｄ遺伝子が、パラオキソンを加水分解する機能性ＯＰＨタンパク質を産生することが示された。未処置全細胞のパラオキソナーゼアッセイにより、酵母細胞はパラオキソンを加水分解し、生体触媒として機能できることが示された。選択培地および非選択培地での酵母コロニーの計数により、酵母エピソームのＯＰＨを発現するプラスミドは、酵母集団により安定に維持されていないことが示された。このことは、酵母生体触媒の最適機能のために、ｏｐｄ遺伝子を酵母ゲノム中に組み込むことにより、安定なクローン酵母集団を創製し得ることを示唆する。試験および最適化研究を行った結果、（ｉ）酵母膜の破壊で全細胞のパラオキソン加水分解が増加すること、（ｉｉ）低濃度のエタノールで前処理すると、全細胞活性が増加すること、および（ｉｉｉ）ｅｒｇ６酵母膜変異体はパラオキソンに超感受性であり、ｅｒｇ６変異がパラオキソンの進入速度を増加させることを示唆することを示した。
【００５８】
実施例１０〜１２は、パラオキソン、パラオキソンの加水分解過程、および／またはパラオキソンの加水分解生成物により転写性に誘導される、Ｓ．セレビシエ遺伝子の同定を詳述する。パラオキソンにより誘導される酵母遺伝子、およびパラオキソン加水分解により誘導される遺伝子を同定するために、マイクロアレイ分析を用いた。相当程度かつ実質的に誘導された多数のパラオキソン誘導可能遺伝子を同定した。パラオキソン誘導可能遺伝子のＹＬＲ３４６ＣおよびＹＧＲ０３５Ｃを優先的に更に分析したところ、定量的リアルタイムＰＣＲによって、この両遺伝子は速やかに（７．５分）かつ感度良くパラオキソンで誘導されることが実証された。したがって、ＹＬＲ３４６ＣおよびＹＧＲ０３５Ｃは、バイオセンサーに組み込むために所望の特性を示し、優先的に実施例１３〜１４に用いた。マイクロアレイ分析により、パラオキソンの加水分解後に少なくとも２倍誘導される遺伝子３３種も同定した。リアルタイムＰＣＲによって、この中の２種の遺伝子（ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃ）だけしか、パラオキソンの存在下、ＯＰＨ＋株中で誘導されないことが立証された。したがって、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃも優先的に実施例１３〜１４に用いた。こうした知見の各々を支持する実験は、以下の本文中で説明する。
【００５９】
実施例１３〜１４は、酵母蛍光バイオセンサーの例示的実施形態の構築を詳述する。酵母コドンを最適化したＹｅＧＦＰおよびＹＤｓＲｅｄレポーターベクターを構築した。２種のパラオキソン誘導プロモーター（ＹＬＲ３４６ＣおよびｐＹＧＲ０３５Ｃ）をＹｅＧＦＰと融合し、パラオキソン加水分解に関連する２種のプロモーター（ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃ）をＹＤｓＲｅｄと融合した。ＹＬＲ３４６Ｃ−ＹｅＧＦＰを潜ませた酵母バイオセンサーは、パラオキソンの存在下、ＹｅＧＦＰ誘導を最大５倍示した。その上、このバイオセンサーは、速やかに誘導され（１５分の暴露後に２倍）、パラオキソンにより用量依存的に誘導された。ＹＤｓＲｅｄと融合したパラオキソン加水分解プロモーター（ＰＯＸ１）を潜ませた組換えＯＰＨ＋酵母も、パラオキソンの存在下、誘発蛍光を示した。ＹＤｓＲｅｄ誘発は、ＯＰＨを発現する酵母株だけに起こったが、このことは、その誘発にＯＰＨ、パラオキソンの両方が必要であることを示した。このことは、ＹＤｓＲｅｄ誘発がパラオキソン加水分解と厳密に関係していたことを示唆する。ＹＤｓＲｅｄは、パラオキソンにより用量依存的に誘発されたが、このことは、バイオセンサーがパラオキソンの加水分解量に応答したことを示唆する。こうした知見の各々を支持する実験は、以下の本文で詳細に説明する。
【００６０】
（実施例１）Ｓ．セレビシエにおける酵母ｏｐｄ発現プラスミドおよびｏｐｄ ｍＲＮＡ発現
酵母ＧＡＬ１プロモーターの転写制御下にあるｏｐｄ遺伝子、および酵母リボソーム結合部位を含有する酵母発現プラスミドを構築した。酵母コドン最適化ｏｐｄ発現プラスミドを同時に構築した。ｏｐｄ発現プラスミドをＳ．セレビシエ中に形質転換し、形質転換酵母細胞のｏｐｄ発現能を相対的ＲＴ−ＰＣＲを用いて試験した。
【００６１】
プラスミドｐＪＫ３３中のフラボバクテリウムｏｐｄ遺伝子、即ちｐＵＣ１８構築体を使用した。フラボバクテリウムｏｐｄ遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ｏｐｄ遺伝子と同一である（Ｍｕｌｂｒｙ ＷＷ ＆ Ｋａｒｎｓ ＪＳ．、（１９８９年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７１巻、６７４０〜６頁）。１ｋｂ ｏｐｄ断片は、プルーフリーディング熱安定ポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅した（図１）。５’プライマーは、最適な翻訳開始を保証するために、酵母リボソーム結合部位を組み込むように設計した（Ｌｏｏｍａｎ ＡＣ ＆ Ｋｕｉｖｅｎｈｏｖｅｎ ＪＡ．、（１９８３年）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１巻。４２６８〜７１頁）。５’および３’プライマーは、それぞれ制限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを組み込むようにも設計された。該ｏｐｄ遺伝子は、標準的な分子生物学技法を用いて、Ｓ．セレビシエ発現ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡの対応部位中に一方向にクローニングする（表１）ことにより、ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを創製した。診断的な制限エンドヌクレアーゼ消化（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）およびアガロースゲル電気泳動によって、適正なクローンが選択されたことを確認した（図２）。ＰＣＲ増幅ｏｐｄ遺伝子の配列は、ダイデオキシターミネーター配列決定法で立証した。ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドは、酵母２μ起点とＳ．セレビシエにおける増殖および選択のためのＵＲＡ３栄養要求性マーカー遺伝子、ＣｏｌＥ１起点と大腸菌における増殖および選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子、Ｓ．セレビシエにおける発現の抑制（デキストロース）または誘発（ガラクトース）用のＧＡＬ１調節性プロモーター、ならびにｏｐｄ遺伝子の下流にある転写終止配列（ＴＣＹＣ１）を含有していた（図３）。酵母コドン最適化ｏｐｄ遺伝子を含有する酵母発現プラスミドも、同時に構築した。コドン最適化は、Ｂｉｏ Ｓ＆Ｔ（ケベック、カナダ）により行われた。コドン最適化ｏｐｄ遺伝子の配列は（図４Ａ）に列挙されている。野生型ｏｐｄ遺伝子と同じクローニング戦略を用いて、コドン最適化ｏｐｄ遺伝子をｐＥＳＣ−ＵＲＡ中にクローニングすることによりｐＹＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを創製した。
【００６２】
ＬｉＡｃ形質転換手順を用いて（Ｉｔｏ Ｈら、（１９８３年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １５３巻、１６３〜８頁）、Ｓ．セレビシエを対照プラスミド（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および試験プラスミド（ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡ）で形質転換した（エピソーム発現）ところ、酵母形質転換体が容易に得られた。ｏｐｄ ｍＲＮＡが十分に発現されることを立証するために、相対的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った（図５）。対照プラスミド（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および試験プラスミド（ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡ）を潜ませた形質転換体は、ＧＡＬ１プロモーターからの発現を抑制（デキストロース培地）または誘発（ガラクトース培地）させる条件下で、合成ドロップアウト培地（ＳＤ）中で増殖させた。総ＲＮＡは、Ｔｒｉ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて当製造業者の教示に従って調製し、ＤＮａｓｅ１で処理した。レトロスクリプトキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて等量のＲＮＡ（約１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。各試料に対して等量のｃＤＮＡが使用されることを保証するために、Ｓ．セレビシエハウスキーピング遺伝子のアクチン（ＡＣＴ１、５４７ｂｐ産物）と対照させて設計したプライマーで、ＰＣＲを最初に行った。次いで必要であれば、ｃＤＮＡ量をそれに応じて調節し、その後ｏｐｄを分析した。ＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動を用いて分離し、分析した。ＰＣＲ分析は、逆転写酵素が欠如した試料（ＲＮＡ試料）についても行ったが、こうした試料からはＲＴ−ＰＣＲ生成物が予想通り全く検出されなかった。ｏｐｄ ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、（ｉ）対照プラスミドを潜ませた形質転換酵母細胞からは、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が検出されないこと（予想通り）、（ｉｉ）ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませた酵母細胞からは、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が検出され、したがってこの酵母細胞は、形質転換に成功しており、ｏｐｄ遺伝子を発現していること、および（ｉｉｉ）ｏｐｄ発現量は、Ｇａｌプロモーターから発現を誘発する条件（ガラクトースの存在）の方が高いことが示された。
【００６３】
酵母の転写および翻訳シグナルを含有する酵母ｏｐｄ発現プラスミドは、その構築に成功した。酵母ｏｐｄ発現プラスミドを潜ませた形質転換酵母細胞は、ｏｐｄ ｍＲＮＡを発現した。
【００６４】
（実施例２）ｏｐｄ発現のＳ．セレビシエ増殖に対する効果
対照プラスミド（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および試験プラスミド（ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡ）を潜ませた組換えＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、抑制（２％デキストロース）または誘発（２％ガラクトース）条件下で、ウラシルが欠けたＳＤ培地中３７℃で増殖させ、その増殖を分光光度法でモニターした。
【００６５】
対照、試験の両培養物共、ガラクトースを含有する最小培地中で、デキストロース含有の場合と比較して増殖が遅かった。ｏｐｄプラスミドを潜ませたＳ．セレビシエは、「空の」対照プラスミドと比較して、僅かに増殖が減少した（図６）。これは、細胞の代謝活性を「排出」し、そのために増殖速度を低下させたタンパク質の過剰発現に単に起因し得る。
【００６６】
ｏｐｄ発現はＳ．セレビシエにとって有毒ではないが、誘発条件下では、ｏｐｄプラスミドを潜ませた酵母細胞の増殖速度がやや抑制された。
【００６７】
（実施例３）パラオキソンのＳ．セレビシエ増殖に対する効果
複合ＹＰＤブロース（酵母エキス、ペプトン、デキストロース）中、またはウラシルおよび２％ガラクトースを補充したＳＤ培地（ＳＤｇａｌ）中３７℃で、Ｓ．セレビシエを定常期まで終夜増殖させた。０時間で培養物を等分し、０．５、１．０、２．０および４．０ｍＭパラオキソンの非存在下または存在下でインキュベートした。増殖をＯＤ６００の分光光度法でモニターした。
【００６８】
０．５ｍＭパラオキソンは、Ｓ．セレビシエの増殖を有意に抑制しなかった（図７Ａ）が、より高い濃度では、パラオキソンは増殖遅延を起こした。したがって予想通り、パラオキソンは、恐らくＯＰの遺伝毒作用のために用量依存的に酵母の増殖を抑制した。
【００６９】
組換えＯＰＨ＋細胞が、パラオキソンの毒作用に「耐性」を示す否かを調べるために、野生型細胞および組換えＯＰＨ＋細胞の増殖を、１ｍＭパラオキソンの非存在下または存在下でモニターした。野生型細胞、ＯＰＨ＋細胞のいずれの増殖も、１ｍＭパラオキソンにより同程度に抑制された（図７Ｂ）。このことから、ＯＰＨ＋細胞は、パラオキソンの毒作用に対する耐性を高めていないことが示唆された。特定の作用機構に何ら限定されるわけではないが、この原因には、（ｉ）パラオキソンの加水分解生成物が酵母に有毒であること、および／または（ｉｉ）（一部の）酵母細胞が、不均質なＯＰＨ＋集団のためにパラオキソンを加水分解できないこと、即ち、ＯＰＨ＋プラスミドは、不安定であり、酵母中で安定に維持されなかったこと（セクション１．４、表２）が、考え得る。
【００７０】
パラオキソンは、用量依存的にＳ．セレビシエの増殖を抑制した。高濃度のパラオキソン（４．０ｍＭ）は、誘導期の延長を起こした。
【００７１】
（実施例４）酵母酵素溶解物のパラオキソンに対する加水分解能
ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（空のプラスミド対照）およびｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませたＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。対数増殖期中に酵母細胞を遠心分離で収集し、細胞ペレットの凍結乾燥を行った。その細胞をＹ−ＭＥＲ透析性溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）０．５ｍｌと室温（ＲＴ）で２０分インキュベートした後、２４０００×ｇで４℃、１５分遠心分離することにより、酵素溶解物を調製した。細胞質ゾル内パラオキソナーゼ活性を測定するために、その上清２５μｌを反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５ｍＭパラオキソン、２％メタノール）９７５μｌと混合した。トリトン抽出性酵素のアッセイ（膜結合型）のために、遠心分離工程から得られた膜ペレットを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中の１％トリトン×１００の１００μｌ中に再懸濁し、ＲＴで２０分インキュベートした後、１５０００ｒｐｍで２分遠心分離した。生成した上清を細胞質ゾル画分の場合と同様に適用した。分光光度計を用いて、基準線が安定化した後、４０５ｎｍでｐ−ニトロフェノール放出量を５分間測定した。試料１個当たり、少なくとも３点の測定を繰り返した。パラオキソナーゼ活性は、１．７×１０４Ｍ−１ｃｍ−１の抽出係数を用いて計算し、μｍｏｌパラオキソン加水分解量／分／ｍｇタンパク質として示した。酵母溶解物の活性は、細菌ｏｐｄの最適化発現プラスミドを潜ませた大腸菌から調製した溶解物と比較した。
【００７２】
空のプラスミドを潜ませた酵母細胞から調製した対照酵素溶解物は、パラオキソンを加水分解することができなかった。対照的に、ｏｐｄ発現プラスミドを潜ませた酵母細胞は、パラオキソンを加水分解する機能的ＯＰＨタンパク質を産生した（表１）。Ｓ．セレビシエにおける酵素活性の大半（７５％）は膜結合型（トリトン抽出性）であり、その他は細胞質ゾル画分中にあった。この分布は、野生型フラボバクテリウム種に対応していた（Ｍｕｌｂｒｙ ＷＷ ＆ Ｋａｒｎｓ ＪＳ．、（１９８９年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７１巻、６７４０〜６頁）。野生型ｏｐｄ遺伝子または酵素コドン最適化ｏｐｄ遺伝子を潜ませた酵母細胞から調製した酵素溶解物に、パラオキソナーゼ活性の差は検出されず、このため、コドンの偏りは、酵母における効率的ｏｐｄ発現に対する制限的な決定因子ではないことが示唆される。
【００７３】
【表１】
酵素溶解物と比較して、最適化ｏｐｄ細菌発現プラスミドを潜ませた大腸菌溶解物の方が、パラオキソナーゼ活性の高いことは明白であった。この活性増加の原因は、遺伝子の用量効果であると考え得る。例えば、大腸菌プラスミド（ＣｏｌＥ１複製起点）のコピー数が、細胞１個当たり通常３００〜５００プラスミドであるのに対して、酵母２μプラスミドの対応コピー数は、細胞１個当たり約３０〜５０プラスミドである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ ＴＬ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９８３年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３巻、７４７〜９頁）、即ち約１０分の１である。加えて、この酵母プラスミドは、不安定であり、酵母集団中で一貫して維持されることがないと判明した。該酵母プラスミドを潜ませた酵母細胞を選択培地および非選択培地上に播種した結果、酵母細胞の２０〜２５％しかプラスミドを維持していないことが示された（表２）。したがって、酵母溶解物の比活性は、大腸菌に比較して過少評価されている恐れがある。酵母２μプラスミドの不安定性即ち低分離安定性は、以前に報告されていた（Ｍｕｒｒａｙ ＡＷ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３４巻、９６１〜７０頁）。この問題は、ｏｐｄ遺伝子をＳ．セレビシエゲノム中に安定に組み込むことにより、修正することができる。その組込み配列を最大１００コピー有する安定な酵母細胞は、標的相同組換えにより生成することができる（Ｐａｒｅｋｈ Ｒら、（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ６巻、５３７〜４５頁；Ｐａｒｅｋｈ ＲＮら、（１９９６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １２巻、１６〜２１頁）。
【００７４】
【表２】
ｏｐｄ発現プラスミドを潜ませた組換え酵母細胞は、パラオキソンを加水分解できる機能的ＯＰＨタンパク質を産生した。酵素活性の大半は、野生型フラボバクテリウム酵素と同様の膜結合型である。酵母２μプラスミドからのｏｐｄの発現は、プラスミド不安定性のために、ほぼ間違いなく不均質ＯＰＨ＋集団を生じる。
【００７５】
（実施例５）未処置組換え酵母のパラオキソンに対する加水分解能
ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（対照）またはｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませた、対数増殖期中のＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。酵母細胞を遠心分離により収集し、未処置細胞を用いてパラオキソナーゼアッセイを行った。比較として、細菌ｏｐｄ最適化発現プラスミドを潜ませた培養大腸菌の全細胞パラオキソナーゼ活性も測定した。
【００７６】
ｏｐｄ発現プラスミドを潜ませた未処置酵母細胞は、パラオキソンを加水分解することができた（表３）。酵母細胞は、未処置大腸菌細胞より３〜４倍高いパラオキソナーゼ活性を示した。酵母の酵素溶解物および未処置細胞は異なる量のパラオキソナーゼ活性を示し、未処置細胞は全細胞活性の２〜３％しか示さなかった。特定の作用機構に何ら限定されるわけではないが、未処置酵母細胞のパラオキソンに対する加水分解能の制約には、パラオキソンの細胞中への進入速度がなり得る（Ｍｕｌｃｈａｎｄａｎｉ Ａら、（１９９９年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６３巻、２１６〜２３頁；Ｓｈｉｍａｚｕ Ｍら、（２００３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １９巻、１６１２〜４頁）。細胞への進入速度を制限する障壁には、細胞壁、細胞膜のいずれかがなり得る。
【００７７】
【表３】
未処置組換え酵母細胞は、パラオキソンを加水分解し、酵母生体触媒として機能することができた。未処置酵母細胞は、酵母溶解物と比較して少量のパラオキソン加水分解を示したが、その理由は、律速段階が細胞内へのパラオキソンの拡散速度であると推定される。
【００７８】
（実施例６）スフェロプラストのパラオキソンに対する加水分解能
ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませた対数増殖期中のＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。酵母細胞を遠心分離で収集し、等分し、β−メルカプトエタノール１μｌ／ｍｌおよびザイモリアーゼ１５μｌ／ｍｌ（５単位／μｌ、細胞壁除去酵素）の存在下または非存在下、スフェロプラスト緩衝液（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５）中３７℃でインキュベートした。２０分後、スフェロプラスト形成が、０．２％ＳＤＳの添加（１：１混合）による溶解細胞の顕微鏡検査によって、また、選択培地上で４８時間後にスフェロプラストがコロニーを形成できないことによって確認された。対照細胞およびスフェロプラストを１Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で４回洗浄（１８００×ｇ、５分）した後、パラオキソン加水分解のアッセイを行った。
【００７９】
細胞壁を欠いているスフェロプラストのパラオキソン加水分解を、未処置酵母細胞と比較した。未処置酵母細胞とスフェロプラストとの間に、パラオキソン加水分解に実質的な差はなかった（表４）。したがって、幾つかの実施形態では、細胞壁の除去により、細胞内へのパラオキソンの進入速度は増加せず、そのため酵母生体触媒のパラオキソン加水分解も増加しない。したがって、こうした実施形態の１つまたは複数において、パラオキソン進入に対して考え得る障壁は、酵素の細胞膜である。
【００８０】
【表４】
幾つかの実施形態では、細胞壁の除去により、全細胞によるパラオキソン加水分解は改善されなかった。このことから、パラオキソンの細胞進入は、細胞壁により阻害し得ないことが示唆される。
【００８１】
（実施例７）透過性増加酵母のパラオキソンに対する加水分解能
ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませたＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。ＯＤ６００が０．５の時点で、酵母細胞を遠心分離で収集し、等分し、０．１％ジギトニンを含有するジメチルスルホキシドの存在下または非存在下、ＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中３０℃でインキュベートした（Ｂｅｃｋｅｒ ＪＭら、（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９６８巻、４０８〜１７頁）。１５分間振とう後、透過性増加細胞の存在を０．４％トリパンブルーの添加（１：１混合）により評価した。顕微鏡検査により、ジギトニン処理細胞の９９％は青色に見える（視野当たり）が、対照細胞は不透明のままであることが示された。「青色」酵母細胞の外観は、損傷した、または透過性が増加した膜を示している。ジギトニン処理細胞は、選択培地上でのインキュベーション４８時間後に、１０３分の１の生細胞も予想通り示した。対照細胞および透過性増加細胞をＴＥ緩衝液で４回洗浄した（２０００×ｇ、１０分）後、パラオキソナーゼ活性のアッセイを行った。
【００８２】
透過促進剤のジギトニンによる該細胞の処理により、パラオキソン加水分解が、対照細胞と比較して３〜４倍増加した（表５）。このことから、酵母膜の破壊で細胞内へのパラオキソン進入速度、したがって酵母の生体触媒活性が増加することが示唆される。これは、細菌の細胞外皮が、基質に対する透過性障壁として作用することを示した、細菌生体触媒を用いた研究と一致している。例えば、細菌の細胞表面上に発現したＯＰＨは、ＯＰＨが細胞質内に留まっている全細胞生体触媒より、有効にＯＰ化合物を加水分解する。溶媒を用いた外膜の透過性促進は、こうした問題を克服し、受動拡散および加水分解の速度を増加させることができるが、こうした方法の実施に当たっては、細胞死を回避するように注意を払うことが必要となり得る。
【００８３】
【表５】
酵母膜の透過性増加は、恐らく、その膜を破壊した結果、細胞内へのパラオキソンの進入速度を増加させることにより、酵母生体触媒の効率を増加させた。この結果から、酵母膜は、パラオキソンの進入に対する主要な障壁であることが示唆される。
【００８４】
（実施例８）エタノールなどの膜透過剤のパラオキソン加水分解に対する効果
ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませた酵母細胞を、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）および２％、４％、６％、８％いずれかのエタノール（最終濃度）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。増殖をＯＤ６００で分光光度法によりモニターし、細胞生存率をトリパンブルー染色で調べた。致死量未満のエタノール濃度で前処理した酵母細胞の能力を、全細胞によるパラオキソン加水分解について調べた。
【００８５】
２％または４％エタノールでインキュベーションすると、Ｓ．セレビシエの増殖速度は減少し、より高いエタノール濃度（６〜８％）でインキュベーションすると、増殖が激しく抑制された（図８）。しかし、３．７５時間の処理後、対照と４％エタノール処理細胞との間に生存率の差はなかった。したがって、ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませた酵母細胞を、２％または４％エタノールで４．５時間、前処理した後、パラオキソナーゼアッセイを行った。致死量未満のエタノール濃度で前処理すると、全細胞のパラオキソン加水分解が増加した（表６）。２％エタノールによる前処理後のアッセイで、全細胞活性が、対照細胞と比較して１．２９倍増加する一方、４％エタノールによる前処理で活性が１．４６倍増加した。
【００８６】
【表６】
致死量未満のエタノール濃度で前処理した結果、ほぼ間違いなくパラオキソンに対する膜透過性の増加により、全細胞のパラオキソン加水分解が増加した。エタノールの前処理は、酵母生体触媒の活性を増加させることができる。
【００８７】
（実施例９）酵母膜変異体のパラオキソンに対する感受性
エルゴステロール生合成に特定の変異を有する酵母変異体は、酵母膜の変化を介したパラオキソン拡散の増加のために、パラオキソンに超感受性となり得る。したがって、酵母膜変異株のパラオキソンに対する感受性増加を調べるために、低濃度のパラオキソンの存在下または非存在下での増殖曲線を実行した。Ｓ．セレビシエ野生型ＢＹ４７４１と、膜変異株ｅｒｇ３、ｅｒｇ４およびｅｒｇ６とを、複合ＹＰＤブロース（変異株に対しては２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を追加）中３７℃で、定常期まで終夜増殖させた。０時間で培養物を等分し、０．５ｍＭパラオキソンの非存在下または存在下でインキュベートした。培養物の増殖は、ＯＤ６００での分光光度法でモニターした。
【００８８】
０．５ｍＭパラオキソンの存在下または非存在下、野生型とｅｒｇ３またはｅｒｇ４株との間に増殖速度の差はなかった（図９ＡおよびＢ）。このことから、ＥＲＧ３およびＥＲＧ４における変異は、パラオキソンに対する感受性の増加を付与しないことが示された。対照的に、０．５ｍＭパラオキソンにより、野生株と比較してｅｒｇ６の増殖速度は有意に減少した（図９Ｃ）。
【００８９】
パラオキソンに対するｅｒｇ６の感受性の程度を調べるために、パラオキソン濃度を下げて（０．２５ｍＭおよび０．１２５ｍＭ）、追加の増殖曲線を実行した。ｅｒｇ６の増殖速度は０．１２５ｍＭパラオキソンで抑制されたが、この濃度は野生株には無効であった（図１０ＡおよびＢ）。したがって、この結果は、ｅｒｇ６がパラオキソンに超感受性であり、酵母生体触媒中に組み込むために有用となり得ることを示すが、ｅｒｇ６変異体使用の考え得る欠点は、野生株と比較してＹＰＤ培地中での増殖速度が損なわれていることである（Ｗｅｌｉｈｎｄａ ＡＡら、（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１９３巻、１０７〜１７頁）。
【００９０】
特定の膜変異体ｅｒｇ６は、パラオキソンに対して超感受性であるが、その原因は、恐らくパラオキソンに対するその防御膜の透過性増加である。ｅｒｇ６などの酵母膜変異体の使用は、生体触媒の効率を増加させ得る。
【００９１】
（実施例１０）野生型および組換えＯＰＨ＋酵母遺伝子のマイクロアレイ分析
パラオキソンの存在下または非存在下でのＳ．セレビシエ、およびパラオキソンの存在下または非存在下での組換えＯＰＨ＋酵母に関して、全体的な転写プロファイル作成（マイクロアレイ分析）を行った。パラオキソンとインキュベートした野生型細胞と、パラオキソンとインキュベートした、ＯＰＨを発現する組換え細胞とを比較した結果、パラオキソンの加水分解で誘導される酵母遺伝子が同定された。
【００９２】
３ｍＭパラオキソンの存在下または非存在下、Ｓ．セレビシエＷ３０３１ＡをＳＤｇａｌ（発現誘発）中、３７℃で６０分増殖させた。こうした試料を用いて、パラオキソンの存在下で上方調節される酵母遺伝子を同定した。３ｍＭパラオキソンの存在下または非存在下、６０分で組換えＯＰＨ＋株の培養物も調製した。こうした試料により、パラオキソン加水分解に特異的な誘導可能遺伝子の同定が可能となった。ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、その製造業者の教示に従って、ＲＮＡを繰り返し３回の培養物から調製した。ＲＮＡ調製物は、ＤＮａｓｅ１で処理後、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にＲＮＡを通すことにより、更に精製した。
【００９３】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に対して確立された標準的手順を用いて、総ＲＮＡ１０μｇからビオチン標識断片化ｃＲＮＡ標的を調製した。単一アレイ上にＳ．セレビシエゲノム全体（ＯＲＦおよそ６２００個）を含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓ９８ Ａｒｒａｙと、標的とのハイブリッドを形成した。ハイブリッド形成は、独自の培養物３点に由来するＲＮＡ調製物３点を用いて、繰り返し３回行った。ハイブリッド形成後の洗浄、染色およびスキャンは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが開発した標準的条件を用いて行った。マイクロアレイのハイブリッド形成データ（ＣＥＬファイル）は、ＧＣＲＭＡのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ実施（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ ＲＣら、（２００４年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ５巻、Ｒ８０頁）を用いて規格化し、規格化ハイブリッド形成データを、処理に関する２つ１組の比較のために分析プログラムｄＣｈｉｐ中にインポートした。パラオキソン誘導可能遺伝子は、次の規準：即ち、野生型の処理対非処理および組換え体の処理対非処理に対して、４倍超の発現増加および統計的差（対応のないｔ−検定、ｐ＜０．０１）により定義した。パラオキソン加水分解に関連する候補遺伝子は、次の規準：即ち、組換え体のパラオキソン処理対組換え体の非処理に対して、２倍超の発現増加および統計的差（対応のないｔ−検定、ｐ＜０．０１）により定義し、パラオキソン誘導可能遺伝子は除外した。相関係数１および連鎖の距離測定基準を有し、重心法で計算した標準化発現値（ｚ規格化）を用いて、ｄＣｈｉｐにより各集合の候補遺伝子に関して階層的クラスタ分析を行った。
【００９４】
まとめると、パラオキソンで誘導された遺伝子の個数および発現量の変化は、大きかった。例えば、パラオキソン処理および非処理対照細胞間の比較を目的とした、ｔ−検定を用いた倍率変化（ｐ＜０．０１）に対する２つ１組の比較によって、示差的に発現する遺伝子が約１９００種同定された。示差的発現の誤発見率（ＦＤＲ）は低く（０．３％）、該遺伝子１９００種のうち、誤りは僅か約６種に過ぎないと推定されることを示した。６５種の遺伝子は、パラオキソン暴露のために示差的に発現することが確認され、（ｉ）４倍以上の示差的発現、（ｉｉ）ｐ値＜０．０１のｔ−検定に基づく統計的有意性、（ｉｉｉ）発現の増加だけ（抑制されない）、および（ｉｖ）両方の処理集合（野生型および組換え酵母）からパラオキソンで誘導されること、により選択された。誘導倍率に基づくパラオキソン誘導可能遺伝子７種の選択リストを表７に示してある。示差的発現量は、誘導倍率１８倍から１７００倍まで（ＹＧＲ０３５Ｃの場合）にも及んでおり、したがって発現量の大きな増加を示した。パラオキソン誘導可能遺伝子７種のうち４種は、未知の機能を有するが、遺伝子機能割付けの共通テーマは、予想されるような薬物耐性である。
【００９５】
【表７】
この特定の実施例において、パラオキソン加水分解に関連する遺伝子の個数および示差的に調節される遺伝子のレベルは、パラオキソン誘導可能遺伝子ほど大規模ではなかった。同定された遺伝子がより少なかった理由は、（ｉ）パラオキソンのインキュベーション時間６０分が、転写プロファイルを変えるほどにパラオキソンを加水分解するには不十分であったこと、または（ｉｉ）ＯＰＨ＋プラスミドが不安定なため、パラオキソン加水分解生成物を産生できない集団中の比率（％）が高かったことに起因し得る。とは言え、示差的に発現した遺伝子３３種が、パラオキソン加水分解に関連していた。遺伝子は、次の規準：（ｉ）２倍以上の示差的発現、（ｉｉ）ｐ値＜０．０１のｔ−検定に基づく統計的有意性、（ｉｉｉ）発現の増加だけ（抑制されない）、および（ｉｖ）パラオキソンだけで誘導された遺伝子の除外に則って選択した。パラオキソン加水分解に関連する遺伝子４種の選択リストを表８に示してある。示差的発現は、誘導倍率４〜７倍に亘っていた。遺伝子産物４種のうち２種の機能は、不明である。
【００９６】
【表８】
マイクロアレイ分析により、パラオキソン誘導酵母遺伝子およびパラオキソン加水分解に関連する酵母遺伝子が同定された。これら遺伝子の幾つかは、大量に誘導され、プロモーター−レポーター遺伝子融合体の理想的候補である。
【００９７】
（実施例１１）パラオキソン誘導可能遺伝子の優先順位決定
マイクロアレイ分析で単離した遺伝子の示差的発現は、相対的ＲＴ−ＰＣＲおよび定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって個別に立証した。パラオキソン誘導可能遺伝子は、表７に列挙されている。誘導倍率に基づく優先的遺伝子は、低濃度のパラオキソンにより用量依存的（０．０５〜１．０ｍＭ）に誘導されるか否かを調べるために分析した。パラオキソンで感受性良好に誘導された優先的遺伝子は、様々な暴露時間（７．５、１５および３０分）後に調べた。酵母バイオセンサーの構築に優先される特性を示した遺伝子を優先させた。こうした遺伝子には、（ｉ）最大の誘導倍率、（ｉｉ）マイクロアレイ分析に用いた濃度（３ｍＭ）より低濃度のパラオキソンに対する感受性、および（ｉｉｉ）速やかな誘導応答時間を示すものが含まれていた。
【００９８】
相対的ＲＴ−ＰＣＲは、マイクロアレイ分析で同定した遺伝子が、パラオキソンに応答して示差的に発現するか否かを立証するために使用した。ハウスキーピング遺伝子のアクチンと対照させて設計したプライマーは、各ＰＣＲ反応に対して類似量のｃＤＮＡが使用されていることを立証するために、内部負荷対照として使用した。ＹＧＲ０３５Ｃ、ＹＬＲ３４６Ｃ、ＳＰＳ１００、ＹＯＲ１８６Ｗ、ＲＴＡ１、ＭＥＴ２８およびＹＬＬ０５６Ｃの発現量増加は、３ｍＭパラオキソンの存在下、６０分増殖させた野生型および組換えＯＰＨ＋酵母細胞について、検出された（図１１のレーンＣＰおよびＴＰ）。したがって、相対的ＲＴ−ＰＣＲは、マイクロアレイ分析で同定した遺伝子が、パラオキソンに応答して示差的に発現することを個別に立証することができた。ＹＬＲ３４６ＣおよびＹＧＲ０３５Ｃは、マイクロアレイ分析、相対的ＲＴ−ＰＣＲの双方で相当程度誘発されることが示されたので、更なる分析のために優先した。
【００９９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、パラオキソンに応答する優先遺伝子ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃの変化を定量するために、使用した。ＹＧＲ０３５Ｃは、非処理対照と比較して、パラオキソン処理細胞において３５倍〜１９０倍誘導された。ＹＬＲ３４６Ｃは、同等の実験試料について１７倍〜３１倍誘導された。したがって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃが相当程度誘発されることを確認された。
【０１００】
パラオキソン遺伝子が、マイクロアレイ分析に用いた濃度（３ｍＭパラオキソン）より低いパラオキソン濃度で感受性良好に誘導されるか否かを調べるために、ｐＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませたＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを０．０５、０．１、０．２５、０．５および１．０ｍＭのパラオキソンに６０分間暴露した。遺伝子発現量の変化を調べるために、相対的およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。相対的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＹＯＲ１８６Ｗ、ＳＰＳ１００およびＲＴＡ１の遺伝子発現量に、より低い試験濃度では明白な変化が見られないことが示された（図１２）。対照的に、ＹＧＲ０３５Ｃは、０．５および１．０ｍＭのパラオキソンで各々１８倍および３１倍誘導された。同様に、ＹＬＲ３４６Ｃは、０．５および１．０ｍＭのパラオキソンで各々８倍および１０倍誘導された（図１３）。したがって、ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃは、ＹＯＲ１８６Ｗ、ＳＰＳ１００およびＲＴＡ１と比較して、ある範囲のパラオキソン濃度に感受性良く応答し、更なる分析のために優先された。
【０１０１】
マイクロアレイ分析では、６０分の暴露でパラオキソンにより誘導される遺伝子を同定した。速やかにパラオキソンにより誘導される遺伝子が好ましいと見込まれるので、ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃに対して、短期パラオキソンインキュベーションに応答して誘発されるその能力を調べた。ｐＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませたＳ．セレビシエを、２．５ｍＭのパラオキソンに７．５、１５、３０および６０分暴露し、相対的およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現量の変化を調べた。ＹＧＲ０３５Ｃ、ＹＬＲ３４６Ｃは共に、７．５分後に相当程度であって、最大限（各々９８倍および３２倍）に誘導された（図１４）。暴露を継続する（６０分まで）と、７．５分の初期値と比較して誘導倍率が減少した。
【０１０２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現量の変化を定量し、マイクロアレイ分析で同定したパラオキソン誘導可能遺伝子候補の示差的調節を確認した。ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃは、（ｉ）各々１９０倍および３２倍まで相当程度に誘導され、（ｉｉ）ある範囲のパラオキソン濃度に感受性を示し、（ｉｉｉ）パラオキソン暴露の７．５分後に誘導されるので、実施例１３〜１４において使用するために優先された。
【０１０３】
（実施例１２）パラオキソン加水分解に関連する遺伝子の優先順位決定
マイクロアレイ分析で同定した遺伝子（表８）の示差的発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって個別に立証した。
【０１０４】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、パラオキソン非存在下または存在下での野生型酵母細胞（各々ＣおよびＣＰ）、およびパラオキソン非存在下または存在下での組換えＯＰＨ＋酵母（各々ＴおよびＴＰ）から、ＹＨＬ０１２Ｗ、ＨＸＴ９、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃの発現を調べた。ＹＨＬ０１２の発現には、パラオキソン存在下もしくは非存在下で、または野生型酵母と組換え酵母との間に差がなかった（表９）。ＨＸＴ９の発現は、パラオキソンにより約３倍誘導された。しかし、野生型、組換えＯＰＨ＋双方の酵母細胞におけるパラオキソン誘導ＨＸＴ９発現からは、ＨＸＴ９誘導が、ｏｐｄ発現、したがってパラオキソン加水分解に関連していないことが示された。これは、リアルタイムＰＣＲでは、候補遺伝子ＹＨＬ０１２およびＨＸＴ９に対するマイクロアレイの結果を立証できなかったことを示している。対照的に、ＰＯＸ１発現量の増加（２．４倍）は、パラオキソン存在下の組換えＯＰＨ＋酵母でしか検出されなかったため、ＰＯＸ１発現がパラオキソン加水分解に関連していることを示した。同様に、ＹＧＲ２８７Ｃの発現は、パラオキソン存在下の組換えＯＰＨ＋酵母細胞中で９倍増加した。しかし、パラオキソンは、程度ははるかに低いとはいえ（２倍）、野生型細胞中でもＹＧＲ２８７Ｃを誘導した。
【０１０５】
【表９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲから、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃは、パラオキソン存在下の組換えＯＰＨ＋酵母中で優先して発現されることが確認されたが、このことは、誘導がパラオキソン加水分解に関連していることを示唆した。したがって、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃは、実施例１３〜１４で使用するために優先された。
【０１０６】
（実施例１３）パラオキソンを検知する酵母ＹｅＧＦＰバイオセンサー
酵母コドン最適化・強化ＧＦＰ（ＹｅＧＦＰ）遺伝子を含有するプラスミドを構築した。実施例１１で同定した優先的パラオキソン誘導可能遺伝子２種（ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃ）のプロモーター領域（−５００ｂｐおよび−１０００ｂｐ上流の断片）は、クローニングし、ＹｅＧＦＰと融合し、野生型Ｓ．セレビシエ中に形質転換した。ＹＧＲ０３５Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰの配列は示してある（図１５Ａの太字はプロモーター配列、下線はＹｅＧＦＰ遺伝子配列）。ｐＹＬＲ３４６Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰの配列は示してある（図１５Ｂの太字はプロモーター配列、下線はＹｅＧＦＰ遺伝子配列）。酵母バイオセンサーの機能性を、様々な濃度のパラオキソン存在下、様々な時間パラオキソンに暴露した後、ＹｅＧＦＰ蛍光の測定により調べた。
【０１０７】
ＹｅＧＦＰ無プロモーター酵母ベクターの構築：ＹｅＧＦＰは、アミノ酸の変更２個を有し、野生型ＧＦＰより蛍光強度が７５倍増加しているエクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰ変異体である。加えて、ＹｅＧＦＰは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）酵母中に発現させるために、コドンが最適化されており、Ｓ．セレビシエ中でも高度の蛍光を示す（Ｃｏｒｍａｃｋ ＢＰら、（１９９７年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３巻、３０３〜１１頁）。ＹｅＧＦＰを含有するＣ．アルビカンスの株を使用した。７００ｂｐのＹｅＧＦＰ遺伝子は、プルーフリーディングポメラーゼと、鋳型としてＣ．アルビカンスＹｅＧＦＰゲノムＤＮＡとを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩのエンドヌクレアーゼ部位を含有することにより、ｐＥＳＣ−ＨＩＳの各部位内にクローニングできるように設計した。生成した「無プロモーター」ＹｅＧＦＰ−ＨＩＳプラスミドは、パラオキソン誘導プロモーターをクローニングするための多重クローニング部位（ＭＣＳ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩ）を含有していた。クローニングおよび増殖は、大腸菌ＥＲ２７３８中で行った。ＹｅＧＦＰの同一性は、ＤＮＡの配列決定により立証した。
【０１０８】
パラオキソン誘導プロモーター−ＹｅＧＦＰ融合レポータープラスミドの構築：プロモーター配列は、サッカロミセスプロモーターデータベース（ＳＣＰＤ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹが維持）を用いて当初マッピングした。このＳＣＰＤは、調節領域が既にマッピングされた酵母遺伝子に関する広範な情報を有し、全酵母遺伝子の注釈付き推定調節部位を有し、対象とする遺伝子に対するプロモーター配列および既知の調節要素を検索するための広範なツールを有している。優先的パラオキソン誘導可能遺伝子２種（ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃ）のプロモーターは、文献中で以前にはマッピングされなかったが、ＳＣＰＤを用いた５‘上流プロモーター領域を分析した結果、薬物耐性およびストレス耐性に関与する推定プロモーター調節部位が、予想通り特定された。ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃのプロモーターを包含するために、−１０００ｂｐおよび−５００ｂｐ上流の配列（ＡＴＧに対して）を含有する、各遺伝子用の推定プロモーター断片２個をＹｅＧＦＰの前方にクローニングした。推定プロモーター領域は、鋳型としてのＳ．セレビシエＷ３０３１ＡゲノムＤＮＡと、プルーフリーディング熱安定ＤＮＡポリメラーゼとを用いてＰＣＲでクローニングした。５‘および３‘プライマーは、ｐＹｅＧＦＰ−ＨＩＳの同じ部位内に一方向クローニングをするために、各々ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を含有することにより、プロモーター−レポーター遺伝子融合体を生成した。生成したプラスミドは、−１０００および−５００プロモーター断片に対して、それぞれＦ１およびＦ２と命名した（表１１）。
【０１０９】
パラオキソン誘導プロモーター−ＹｅＧＦＰバイオセンサーのアッセイ：プロモーター領域がパラオキソンに対する感受性を付与するか否かを試験するために、ＹｅＧＦＰ蛍光アッセイを行った。Ｓ．セレビシエＢＹ４７４１をプロモーター−レポーター構築体および空の「無プロモーター」対照ベクターで形質転換した。Ｓ．セレビシエＢＹ４７４１をＳ．セレビシエＷ３０３１Ａより好んで使用したのは、Ｗ３０３１ＡがＢＹ４７４１より強い自己蛍光を示したからである。パラオキソンの存在下または非存在下、ヒスチジンを欠くＳＤｇａｌ／ｓｕｃ（３％ガラクトース、１％スクロース）中で、細胞を１５、３０、６０および１２０分、３７℃で増殖させた。細胞を遠心分離で収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中に再懸濁し、試料２点のＹｅＧＦＰ蛍光（励起および発光極大値が４８５および５２０ｎｍ）をＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ（ＢＭＧ）を用いて測定した。ＧＦＰがｐＨ感受性であるため、試料はアルカリ性緩衝液中に懸濁した。ＧＦＰは、ｐＨ７〜１１．５で安定であるが、他のｐＨでは活性を失う恐れがある（例えば、ｐＨ６では５０％低下）。したがって、幾つかの実施形態では、培地およびｐＨ配合物を最適化することにより、酵母培養物のｐＨを中性ｐＨまたはその近くに維持し得る。全ての結果は、存在細胞数（ＯＤ６００）、「無プロモーター」対照ベクター（ＹｅＧＦＰ−ＨＩＳ）に対して規格化した後、パラオキソンを欠いた細胞と比較した誘導倍率として提示している。パラオキソンの存在下でインキュベートした酵母細胞は、パラオキソンを欠いた細胞と比較してＹｅＧＦＰ蛍光の増加を示した（図１６）。ｐＹＬＲ３４６Ｃ−ＹｅＧＦＰおよびｐＹＧＲ０３５Ｃ−ＹｅＧＦＰを潜ませた酵母細胞は、３ｍＭパラオキソンとの２時間のインキュベーション後、各々５倍および３倍誘導された。パラオキソンとのインキュベーションが２時間を超えても（４、６、８および２４時間）、誘導倍率は増加しなかった（データは示されていない）。経時分析から、ＹｅＧＦＰ蛍光はパラオキソンで速やかに誘導されることが示された。例えば、ｐＹＬＲ３４６を潜ませた酵母株は、パラオキソンに僅か１５分暴露した後２倍に誘導された。
【０１１０】
このアッセイの感度を決定し、組換え酵母が異なるパラオキソン濃度に応答するか否かを調べるために、用量応答曲線を実行した。ｐＹＬＲ３４６Ｃ−Ｆ１−ＹｅＧＦＰを潜ませたＳ．セレビシエを０．１、０．２５、０．５、１．０および３ｍＭのパラオキソンと２時間インキュベートした後、ＹｅＧＦＰ蛍光のアッセイを行った。プロモーター断片ＹＬＲ３４６Ｃ−Ｆ１を潜ませたこの構築体は、３ｍＭのパラオキソンに非常に良く応答したため、この実験に対して選択した（図１６の５倍）。パラオキソン濃度が増加するにつれ、ＹｅＧＦＰの誘導量も増加した（図１７）。加えて、蛍光量は、最低試験濃度でも（０．１ｍＭパラオキソン）、僅かではあるが（１．３倍）増加した。したがって、この結果から、酵母バイオセンサーは、パラオキソンに対して用量応答を示し、０．１ｍＭパラオキソンに応答することが示された。
【０１１１】
ＹｅＧＦＰ蛍光は、パラオキソンの存在下で５倍まで誘発された。しかし、ＹｅＧＦＰ誘導量は、同一条件下で観察された遺伝子発現量の変化倍率（ＹＬＲ３４６Ｃについて３０倍）より低かった。特定の作用機構に何ら限定されるわけではないが、これは、ＹｅＧＦＰ発現を推進するプロモーター断片が最適でないことに起因し得る。各遺伝子に対して僅か２個のプロモーター断片（ＡＴＧに対しておよそ−５００および−１０００）しか、試験しなかった。幾つかの実施形態では、追加のプロモーター特性決定には、５’プロモーター欠失分析を含めることにより、パラオキソン誘導性の付与に必要なプロモーター断片を更に同定し得る。追加のプロモーター特性決定には、調節転写モチーフをやはり含有し得るＡＴＧ開始部位の３’側配列の同定も含めてもよい。
【０１１２】
その上、ＹｅＧＦＰ蛍光とＹｅＧＦＰ発現との差異は、多重コピープラスミド上にあるプロモーターから発現を誘導するのに必要な追加の転写因子（複数も）の供給により、減少させ得る。ＹＬＲ３４６Ｃプロモーターが、多重コピープラスミド上で細胞１個当たり約２０〜５０コピーで維持されているのに対し、染色体には内因性プロモーターが単一コピーしかない。したがって、パラオキソン誘導に必要な内因性転写因子は、多重の転写因子結合部位の存在により飽和している恐れがある。追加の転写因子（複数も）の供給には、プラスミドコピー数の減少を含み得る、または必要な転写因子（既知の場合）の共発現が、この制約を克服し得る。酵母のバックグランド自己蛍光は、一部の状況下では示差的な誘導発現量を低下させる恐れがある。このような場合には、バックグランド自己蛍光が比較的弱い酵母株、例えばＳ．セレビシエＢＹ４７４１の使用で、自己蛍光を相殺または克服し得る。例えば、Ｓ．セレビシエＷ３０３１Ａは、Ｓ．セレビシエＢＹ４７４１より強いバックグランド自己蛍光を示した。したがって、バイオセンサー蛍光アッセイ用の宿主増殖株としてＢＹ４７４１を使用した。
【０１１３】
パラオキソン誘導性プロモーター−ＹｅＧＦＰ融合体を潜ませた酵母細胞は、パラオキソン存在下でインキュベートしたとき、対照細胞と比較して最大５倍の蛍光増加を示した。ＹｅＧＦＰ量の増加は、パラオキソンに暴露してから１５分後に検出された。ＹｅＧＦＰバイオセンサーは、僅か０．１ｍＭのパラオキソンに感応し、パラオキソン濃度の増加につれてＹｅＧＦＰ蛍光を増加させることにより、用量依存特性を示した。この結果は、バイオセンサーとして機能し、パラオキソンの存在を検出する酵母細胞の能力を実証している。
【０１１４】
（実施例１４）パラオキソン加水分解を検出する酵母ＹＤｓＲｅｄバイオセンサー
酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄ（ＹＤｓＲｅｄ）遺伝子を含有するプラスミドを構築した。実施例１０〜１２で同定した優先的パラオキソン誘導可能遺伝子２種（ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃ）のプロモーター領域（−５００ｂｐおよび−１０００ｂｐ上流の断片）は、クローニングし、ＹＤｓＲｅｄと融合し、野生型および組換えＯＨＰ＋のＳ．セレビシエ中に形質転換した。ＹＧＲ２８７Ｃ−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄの配列は示してある（図１８Ａの太字はプロモーター配列、下線はＹＤｓＲｅｄ遺伝子配列）。ｐＰＯＸ１−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄの配列は示してある（図１８Ｂの太字はプロモーター配列、下線はＹＤｓＲｅｄ遺伝子配列）。ＹＤｓＲｅｄ蛍光を増加させる酵母バイオセンサーの能力を、野生型（対照）および組換え酵母の培養物で比較した。ＹＤｓＲｅｄ蛍光は、様々な濃度のパラオキソン存在下、様々な時間パラオキソンに暴露した後に測定した。
【０１１５】
ＹＤｓＲｅｄ無プロモーター酵母ベクターの構築：ＤｓＲｅｄエキスプレス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、サンゴ礁ディスコマ種の赤色蛍光タンパク質の変異体であって、該タンパク質の溶解度を改善するように改変され、感受性増強のために真核細胞中で高度に発現するようにコドンが最適化された変異体である。これは、ＥＧＦＰに匹敵する高い蛍光強度を生じる。とは言え、ＤｓＲｅｄエキスプレスは、Ｓ．セレビシエ中では稀にしか使用されないコドンを幾つも含有している。したがって、ＤｓＲｅｄを酵母中で発現するようにコドンを最適化した（Ｂｉｏ Ｓ ＆ Ｔが実施）（図４Ｂ）。酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄのＹＤｓＲｅｄは、好ましい酵母リボソーム結合部位と、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の対応部位にクローニングするためのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とを含有するようにも設計した。生成したｐＹＤｓＲｅｄ−ＬＥＵ無プロモーターベクターは、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃプロモーターをクローニングするための十分なＭＣＳを含有していた。
【０１１６】
プロモーター−ＹＤｓＲｅｄ融合レポータープラスミドの構築：ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃのプロモーターを包含するために、およそ−１０００ｂｐおよび−５００ｂｐ上流の配列（ＡＴＧに対して）を含有する、各遺伝子用の推定プロモーター断片２個をＹＤｓＲｅｄの前方にクローニングした。推定プロモーター領域は、鋳型としてのＳ．セレビシエＷ３０３１ＡゲノムＤＮＡと、プルーフリーディング熱安定ＤＮＡポリメラーゼとを用いてＰＣＲでクローニングした。５‘および３‘プライマーは、ｐＹＤｓＲｅｄ−ＬＥＵの同等部位内に一方向クローニングをするために、各々ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を含有することにより、プロモーター−レポーター遺伝子融合体を生成した。生成したプラスミドは、−１０００および−５００プロモーター断片に対して、それぞれＦ１およびＦ２と命名した。
【０１１７】
プロモーター−ＹＤｓＲｅｄバイオセンサーのアッセイ：プロモーター領域がパラオキソン加水分解により「スイッチが入る」か否かを分析するために、ＹＤｓＲｅｄ蛍光アッセイを行った。ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（ＯＰＨを欠く対照株）を潜ませたＳ．セレビシエＢＹ４７４１を、プロモーター−レポーター構築体および空の「無プロモーター」対照ベクター（ｐＹＤｓＲｅｄ−ＬＥＵ）で形質転換した。組換えＯＰＨ＋（試験株、ＯＰＨを発現する）を類似のプラスミドで形質転換した。３ｍＭパラオキソンの存在下または非存在下、ロイシンを欠くＳＤｇａｌ／ｓｕｃ中で、細胞を４．５時間、３７℃で増殖させた。細胞を遠心分離で収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中に再懸濁し、試料２点のＹＤｓＲｅｄ蛍光（励起および発光が、各々５５４および５９０ｎｍ）を測定した。全ての結果は、存在細胞数（ＯＤ６００）、「無プロモーター」対照ベクター（ＹＤｓＲｅｄ−ＬＥＵ）に対して規格化した後、パラオキソンを欠いた細胞と比較した誘発倍率として提示している。パラオキソン存在下でインキュベートした組換えＯＰＨ＋細胞は、分析した全構築体について、パラオキソンを欠いた細胞と比較してＹＤｓＲｅｄ蛍光の誘発を示した（表１０）。誘発は２〜８倍に亘っていたが、これは、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲから得た誘発結果と同等である。重要なことには、ＯＰＨを欠いた対照株（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ空ベクター）では、同じ構築体がパラオキソン誘発性を殆どないし全く示さなかった。したがって、ＹＤｓＲｅｄはパラオキソン自体には誘発されず、誘発にはＯＰＨを必要としたので、ＹＤｓＲｅｄの誘発は、パラオキソンの加水分解と厳密に関係していることが示された。
【０１１８】
【表１０】
ｐＰＯＸ１−Ｆ２ ＹＤｓＲｅｄ融合構築体を用いて、ＹＤｓＲｅｄ誘発を調べる経時分析を行った。ｐＰＯＸ１−Ｆ２−ＹＤｓＲｅｄ融合構築体を潜ませた組換えＯＰＨ＋培養物に、パラオキソンを添加してから３０、６０、１２０および２６０分後にＹｓＤｓＲｅｄ蛍光を測定した（図１９）。パラオキソンへの暴露時間が増加するにつれ、ＹＤｓＲｅｄ誘導の着実な増加が認められた。ＹＤｓＲｅｄ蛍光は、パラオキソンに２６０分暴露後、２．５倍誘発された。このアッセイの感度を決定し、組換え酵母が異なるパラオキソン濃度に応答するか否かを調べるために、用量応答曲線を実行した。ｐＰＯＸ１−Ｆ２−ＹＤｓＲｅｄを潜ませたＳ．セレビシエＯＰＨ＋を０．１、０．２５、０．５、１．０および３ｍＭのパラオキソンと２５５分インキュベートした後、ＹＤｓＲｅｄ蛍光のアッセイを行った。パラオキソン濃度が増加するにつれ、ＹＤｓＲｅｄの誘導量も少しではあるが増加した（図２０）。したがって、この結果から、酵母バイオセンサーは、パラオキソン加水分解に対して用量応答特性を示したことが示唆される。
【０１１９】
蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄを選択した理由は、（ｉ）酵母中のレポータータンパク質として成功裏に使用されてきたこと（Ｂｅｖｉｓ ＢＪ ＆ Ｇｌｉｃｋ ＢＳ（２００２年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０巻、８３〜７頁）、（ｉｉ）安定なタンパク質であること、および（ｉｉｉ）ＹｅＧＦＰと比較して異なる分光特性を放つことであるが、ＹＤｓＲｅｄを発現する酵母培養物とバックグランド自己蛍光量（ＹＤｓＲｅｄを欠いている）との間の示差的蛍光量は、最小限であった。ＹＤｓＲｅｄの低発現量は、更なる実験および最適化に従えば克服し得る。この潜在的制約を克服し、「シグナル対ノイズ比」を上げるために、ビブリオ・ハーベイイｌｕｘＡＢレポーター遺伝子を用いることにより、ＯＰ加水分解後に生物発光を起こす酵母バイオセンサーを創製し得る。細菌系と類似の光強度を示す生物発光酵母が、生成されてきた（Ｓｚｉｔｔｎｅｒ Ｒら、（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３０９巻、６６〜７０頁）。酵母細胞は自然には生物発光を起こさないので、バックグランド量の９０００００倍近い生物発光シグナルが実現された（Ｇｕｐｔａ ＲＫら、（２００３年）Ｆｅｍｓ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ４巻、３０５〜１３頁）。その上、「過渡的」発光シグナルは（安定なＹＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質と異なり）、発光量の増減の検知を可能とし得る。したがって、生物発光シグナルは、除染過程のモニターに対する適性が高くなり得る。
【０１２０】
パラオキソン加水分解に関連するプロモーターを潜ませ、ＹＤｓＲｅｄと融合した組換えＯＰＨ＋酵母細胞は、パラオキソンの存在下で２．５〜８倍のＹＤｓＲｅｄ誘発量を示した。ＹＤｓＲｅｄ誘発は野生型酵母細胞（ＯＰＨを欠いている）では認められなかったので、ＹＤｓＲｅｄ誘発は、パラオキソンの加水分解と厳密に関係していることが示唆された。ＹＤｓＲｅｄ誘発量はパラオキソン濃度の増加と共に増加したので、この酵母バイオセンサーがパラオキソンの加水分解量に応答したことが示される。
【０１２１】
【表１１−１】
【０１２２】
【表１１−２】
【０１２３】
【表１２】
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
【表１６】
【０１２８】
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、ｏｐｄ遺伝子のＰＣＲ増幅を例示するゲルの画像である（ＭはλＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡマーカー、レーン１は陰性ＰＣＲ対照、レーン２はｏｐｄ ＰＣＲ産物）。
【図２】図２は、酵母ｐＥＳＣ−ＵＲＡプラスミド中へのｏｐｄ遺伝子のクローニングを確認するために、ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡの診断的な制限酵素消化（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ）により、１０３１ｂｐおよび６５５４ｂｐの断片（右端レーン）が産生したことを例示するゲルの画像である。
【図３】図３は、プラスミド複製用の酵母２μ起点、酵母形質転換細胞選択用のＵＲＡ３栄養要求性マーカー、発現調節用の酵母ｐＧＡＬ１プロモーター、細菌ｏｐｄ遺伝子、および転写終止用の酵母ＴＣＹＣ１終止配列を有する酵母ｏｐｄ発現プラスミドのスケッチである。
【図４−Ａ】図４Ａは、酵母コドン最適化ｏｐｄ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）を図示し、図４Ｂは、酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄエキスプレス遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号２）を図示する。
【図４−Ｂ】図４Ａは、酵母コドン最適化ｏｐｄ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）を図示し、図４Ｂは、酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄエキスプレス遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号２）を図示する。
【図５】図５は、ｏｐｄを発現する酵母形質転換細胞を例示するゲルの画像であり、（ｉ）ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（対照プラスミド）およびｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡをＳ．セレビシエＷ３０３１Ａ中に形質転換し、（ｉｉ）ＲＮＡを調製し、（ｉｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲを用いてｏｐｄ ｍＲＮＡ発現を調べ、（ｉｖ）アクチンを内部負荷対照として用いた画像である（Ｄｅｘはデキストロース、Ｇａｌはガラクトース）。
【図６】図６は、抑制（ｄｅｘはデキストロース）または誘導（ｇａｌはガラクトース）条件下で、対照（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）または試験（ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡ）プラスミドを潜ませたＳ．セレビシエの増殖（Ａ６００でモニター）を図示するグラフである。
【図７−Ａ】図７Ａは、パラオキソン存在下でのＳ．セレビシエＢＹ４７４１の増殖（Ａ６００でモニター）の用量依存的阻害を図示するグラフであり、図７Ｂは、１ｍＭパラオキソン存在下でのＳ．セレビシエＷ３０３１Ａ野生型（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および組換えＯＰＨ＋細胞の増殖（Ａ６００でモニター）を図示するグラフである。
【図７−Ｂ】図７Ａは、パラオキソン存在下でのＳ．セレビシエＢＹ４７４１の増殖（Ａ６００でモニター）の用量依存的阻害を図示するグラフであり、図７Ｂは、１ｍＭパラオキソン存在下でのＳ．セレビシエＷ３０３１Ａ野生型（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および組換えＯＰＨ＋細胞の増殖（Ａ６００でモニター）を図示するグラフである。
【図８】図８は、様々なエタノール濃度（２〜８％）の存在下、ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませたＳ．セレビシエの増殖（Ａ６００でモニター）を図示するグラフである。
【図９−Ａ】図９Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ３の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｂは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ４の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｃは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ６の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフである。
【図９−Ｂ】図９Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ３の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｂは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ４の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｃは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ６の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフである。
【図９−Ｃ】図９Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ３の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｂは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ４の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｃは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ６の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフである。
【図１０−Ａ】図１０Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）の増殖に対する５００、２５０および１２５μＭのパラオキソン（ｐａｒａ）の効果を図示するグラフであり、図１０Ｂは、Ｓ．セレビシエ膜変異株ｅｒｇ６の増殖に対する５００、２５０および１２５μＭのパラオキソン（ｐａｒａ）の効果を図示するグラフである。
【図１０−Ｂ】図１０Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）の増殖に対する５００、２５０および１２５μＭのパラオキソン（ｐａｒａ）の効果を図示するグラフであり、図１０Ｂは、Ｓ．セレビシエ膜変異株ｅｒｇ６の増殖に対する５００、２５０および１２５μＭのパラオキソン（ｐａｒａ）の効果を図示するグラフである。
【図１１】図１１は、パラオキソン誘導可能遺伝子（相対的ＲＴ−ＰＣＲによりモニター）の発現を例示するゲルの画像であり、ＲＮＡを、３ｍＭパラオキソンの非存在下または存在下で６０分インキュベートした野生型または組換え酵母から調製した画像である（Ｃはパラオキソンなしの野生型、ＣＰはパラオキソンを用いた野生型、パラオキソンなしの組換え（Ｔ）、パラオキソンを用いた組換え（ＴＰ））。
【図１２】図１２は、様々な濃度のパラオキソンと６０分インキュベートした野生型酵母の遺伝子発現（相対的ＲＴ−ＰＣＲによりモニター）を例示するゲルの画像である。
【図１３】図１３は、相対的およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりモニターした遺伝子発現の用量応答変化を例示するゲルの画像であり、ＲＮＡを、様々な濃度のパラオキソンと６０分インキュベートした野生型酵母から調製した画像である。
【図１４】図１４は、相対的およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりモニターしたＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃの時間経過を例示するゲルの画像であり、ＲＮＡを、２．５ｍＭパラオキソンとインキュベートした野生型酵母から調製した画像である。
【図１５−Ａ】図１５Ａは、ＹＧＲ０３５Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号３）を図示し、図１５Ｂは、ｐＹＬＲ３４６Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号４）を図示する。
【図１５−Ｂ】図１５Ａは、ＹＧＲ０３５Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号３）を図示し、図１５Ｂは、ｐＹＬＲ３４６Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号４）を図示する。
【図１６】図１６は、３ｍＭパラオキソンの存在下、ｐＹＧＲ０３５Ｃ−Ｆ１−ＹｅＧＦＰ、ｐＹＬＲ３４６Ｃ−Ｆ１−ＹｅＧＦＰのいずれかを潜ませたＳ．セレビシエにおける、ＹｅＧＦＰ誘導の時間経過を例示するグラフである。
【図１７】図１７は、ｐＹＬＲ３４６Ｃ−Ｆ１−ＹｅＧＦＰを潜ませたＳ．セレビシエにおける、パラオキソン０．１〜３．０ｍＭ存在下１２０分でのＹｅＧＦＰ誘導の用量応答を例示するグラフである。
【図１８−Ａ】図１８Ａは、ｐＹＧＲ２８７Ｃ−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄのＤＮＡ配列（配列番号５）を図示し、図１８Ｂは、ｐＰＯＸ１−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄのＤＮＡ配列（配列番号６）を図示する。
【図１８−Ｂ】図１８Ａは、ｐＹＧＲ２８７Ｃ−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄのＤＮＡ配列（配列番号５）を図示し、図１８Ｂは、ｐＰＯＸ１−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄのＤＮＡ配列（配列番号６）を図示する。
【図１９】図１９は、３ｍＭパラオキソンの存在下、ｐＰＯＸ１−Ｆ２−ＹＤｓＲｅｄを潜ませた組換えＯＰＨ＋酵母における、ＹＤｓＲｅｄ誘導の時間経過を例示するグラフである。
【図２０】図２０は、ｐＰＯＸ１−Ｆ２−ＹＤｓＲｅｄを潜ませたＳ．セレビシエＯＰＨ＋における、パラオキソン０．１〜３．０ｍＭ存在下２５５分でのＹＤｓＲｅｄ誘導の用量応答を例示するグラフである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００５年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／７４０，８８７号に利益を主張し、その内容は、本明細書中の全体にわたって参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、検体および／または検体変換生成物（複数も）を感知するシステム、生物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ほぼ１００年前に開発されたものであるが、有機リン酸エステル（ＯＰ）神経ガスなどの化学兵器は、軍人、文民の双方にとって今なお重大な脅威である。神経ガスは、１９８０年代のイラク・イラン戦争中に、１９９４年の松本攻撃において日本オウム真理教により、また１９９５年の東京地下鉄攻撃において使用された。この最後の事件では、テロリストらは、地下鉄列車上に揮発性神経ガスのサリン入りプラスチック袋を置き去りにし、傘の先端でその袋を突き刺して逃走した。発生した蒸気のために３７９６人が傷害を受け、１２人が死亡し、大パニックを起こした。ＯＰ神経ガスは、概して安価であり、開発途上国やテロリストにより比較的製造し易いので、大量破壊兵器として特に適している。神経ガスは、容易に分散し得ること、容易に隠し得ること、および少量で致死性になり得ることのために、特に危険になり得る。例えば、幾つかの計算によれば、２５０ｍ３の飛行機客室内で空気を循環すれば、茶さじ１杯の液体サリンからの蒸気により、約２．５分間で致死的となる恐れがある。発生するその蒸気は、容易に皮膚から吸収され、または吸入されるため、速やかに活動不能および死亡を起こす恐れがある。サリンほど揮発性はないが、ＶＸ（Ｏ−エチル Ｓ−［２−ジイソプロピルアミノエチル］メチルホスホノチオレート）などの他のＯＰ神経ガスは、致死量に要する液量が微量に過ぎないので致命的となる恐れがはるかに高い。エアゾール化ＶＸ液滴は、単純な噴霧（例えば、農薬散布機を用いて）により、またはより常套的なミサイル攻撃により分散することができよう。神経ガスは、酵素のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を阻害することにより作用し得る。ＡＣｈＥは、１秒当たりアセチルコリン（ＡＣｈ）分子約１００００個を加水分解する非常に効率的な酵素である。したがって、神経ガスによるＡＣｈＥ阻害は、殆ど直ちにＡＣｈの氾濫を起こす。この結果、呼吸器症状、胸苦しさ、眼のかすみおよび痛みを起こし、重度の暴露例では嘔吐、腹痛、膀胱・腸の過活動、失禁、痙攣、呼吸不全、麻痺および死亡を起こす恐れがある。
【０００４】
ＯＰ神経ガスの脅威は、一部の国が大量の貯蔵品を有しているという事実によって高まっている。世界の貯蔵量は２００キロトンを超えると報告されており、米国の備蓄量だけで３０キロトンに達する。その上、ＯＰ化合物は、殺虫剤などの農業害虫および家害虫の防除に広く使用されている。例えば、米国ではＯＰ殺虫剤４千万ｋｇ強が毎年使用され、更に２千万ｋｇが輸出用に毎年生産されている。この過剰使用に伴い、土壌系および水系のＯＰ汚染に関する公衆衛生上の懸念が当然存在する。ＯＰ殺虫剤への意図せざる暴露（水、食物、土壌）のために、毎年世界全体で殺虫剤被毒が百万例から３百万例起こる恐れがある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
したがって、こうした人工的有毒化合物を処置する安全で有効な方法、および自立可能な検出システムに対する必要性が存在する。本開示は、（１）１種もしくは複数の検体（例えば、化学薬品）、および／または（２）１種もしくは複数の検体（例えば、化学薬品）の変換（例えば、分解）を検知するバイオセンサーに関する。本開示のバイオセンサーは、対象とする化学種の検出および／または変換（例えば、除去）が望ましい場合の任意の用途において有用となり得る。例えば、幾つかの実施形態によれば、バイオセンサーは、ある製造工程および／または有害環境における化学汚染物質の検出および／または除去に使用し得る。
【０００６】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーは微生物を含み得る。例えば、本開示のバイオセンサーは、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の遺伝子操作株を含み得る。酵母は、（ｉ）検体の存在下（例えば、神経ガス兵器薬品および／または殺虫剤との接触）で、検体の非存在下より強い蛍光を発し、（ｉｉ）検体を変換（例えば、加水分解）し、および／または（ｉｉｉ）検体を変換した際に示差的に蛍光を発し得るものである。
【０００７】
幾つかの実施形態では、酵母は、１種または複数の検体を変換（例えば、分解）するためのプロモーター、コード配列、タンパク質および／または他の成分を含み得る。酵母は、１種または複数の検体を検出するためのプロモーター、コード配列、タンパク質および／または他の成分も含み得る。例えば、酵母は、（ｉ）通常は酵母中に見出されない酵素の発現により、化学薬品を分解する能力を付与し、（ｉｉ）その化学薬品汚染物質の存在下ではある波長で、またはその分解生成物の存在下では別の波長で蛍光を発するように示差的に活性化される酵母プロモーターに、転写性に融合した二重蛍光レポーター系を保有するように、遺伝子操作をしてもよい。
【０００８】
極限環境に耐性を示す頑健な非病原性微生物である酵母、Ｓ．セレビシエは、本開示の幾つかの実施形態に従って、内蔵式バイオセンサーとして使用し得る。外因性の基質および／または消費物質は不要とし得る。その上、二重蛍光レポーター系を用いる実施形態では、単純な手持ち式照明具によって、化学薬品汚染物質および分解生成物の識別的な肉眼検出が可能となり得る。
【０００９】
本開示は、更に検体の変換の検出にも関する。本開示の幾つかの実施形態では、検体の変換は、検体の部分的および／または完全な分解（例えば、加水分解）を包含し得る。変換は、検体を別の形態へ転換する（例えば、同化または異化により）ことを包含し得る。例えば、検体は、別の分子との複合および／または大型分子への統合を受けてもよい。検体変換生成物は、親検体より害がない（例えば、低毒性）こともある。
【００１０】
幾つかの実施形態では、検体には有機リン酸エステルがなり得る。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本開示は、（ａ）第１のレポーターをコードする第１の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステルが存在する場合に該第１のレポーターの発現を推進する第１の発現制御配列、（ｂ）第２のレポーターをコードする第２の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステル加水分解生成物が存在する場合に該第２のレポーターの発現を推進する第２の発現制御配列、および（ｃ）有機リン酸エステルを加水分解して有機リン酸エステル加水分解生成物を生成する、少なくとも１種の酵素を含む、酵母バイオセンサーに関する。第１および／または第２のレポーターは、蛍光タンパク質、発光タンパク質、酵素および／または氷核タンパク質（ｉｎａＺ）をコードする核酸を含み得る。蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはその変異体（例えば、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、酵母強化ＧＦＰ（ＹｅＧＦＰ）、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ ＧＦＰ（ＡｃＧＦＰ））、ＤｓＲｅｄもしくはその変異体（例えば、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス）、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１を包含し得る。発光タンパク質は、昆虫ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）、細菌生物発光（ｌｕｘＣＤＡＢＥ）および／またはレニラルシフェラーゼ（ｒｕｃ）を包含し得る。酵素は、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ｃｏｂＡ）、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼおよび／またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を包含し得る。
【００１２】
第１および第２のレポーターは、幾つかの実施形態によれば相互に異なり得る。第１の発現制御配列は、受入番号ＹＧＲ０３５Ｃ、受入番号ＹＨＲ１３９Ｃ、受入番号ＹＯＲ１８６Ｗ、受入番号ＹＧＲ２１３Ｃ、受入番号ＹＬＲ３４６Ｃ、受入番号ＹＩＲ０１７Ｃおよび受入番号ＹＬＬ０５６Ｃからなる群から選択される遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチド（例えば、−１０００〜−１位のヌクレオチド）を含み得る。第２の発現制御配列は、受入番号ＹＧＬ２０５Ｗ、受入番号ＹＪＬ２１９Ｗ、受入番号ＹＧＲ２８７Ｃおよび受入番号ＹＨＬ０１２Ｗからなる群から選択される遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチド（例えば、−１０００〜−１位のヌクレオチド）を含み得る。幾つかの実施形態では、第１および／または第２の発現制御配列は、前記の例より大なる、または小なるプロモーター断片を含み得る。発現制御配列の活性がその完全な配列の特定ドメイン（例えば、上流活性化配列、上流抑制化配列および／またはＴＡＴＡ配列）に起因する場合、該小なる断片が望ましいものとなり得る。
【００１３】
幾つかの実施形態によれば、有機リン酸エステル分解酵素は、有機リンヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、ホスホトリエステラーゼ、ＯｐｄＡ、有機リン酸アンヒドロラーゼ（ＯＰＡＡ）、ＤＦＰａｓｅおよびパラオキソナーゼ（ＰＯＮ）からなる群から選択し得る（表１５）。これらの酵素は、１種または複数の有機リン酸エステル結合を加水分解し得る（表１６および１７）。酵素は、幾つかの実施形態では、細胞内にあってもよく、細胞表面に提示されてもよく、および／または分泌されてもよい。酵母バイオセンサーは、外因性の薬品（例えば、アルコール）の適用で透過性にし得る。幾つかの実施形態では、酵母バイオセンサーは、エルゴステロール生合成遺伝子中に変異を含み得る。幾つかの実施形態では、酵母バイオセンサーは、（ａ）細胞壁の合成、維持もしくは分解、（ｂ）細胞膜の合成、維持もしくは分解、（ｃ）細胞修復、および／または（ｄ）細胞輸送（例えば、薬物の移出ポンプもしくは移入ポンプ）において、欠陥（例えば、変異）を含み得る。例えば、酵母バイオセンサーは、該センサー中に化学薬品を能動的に移入できる１種もしくは複数のタンパク質、および／または１種もしくは複数の該タンパク質をコードする核酸（複数も）を含み得る。
【００１４】
本開示は、部分的に、有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する方法であって、（ａ）酵母を有機リン酸エステルと接触させる工程、（ｂ）酵母からＲＮＡを収集する工程、（ｃ）相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、該ＲＮＡとを接触させる工程、（ｄ）各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、有機リン酸エステルと接触していない酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程、（ｅ）有機リン酸エステルと接触していない酵母より、有機リン酸エステルと接触した酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程、および（ｆ）同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程を含む方法に関する。
【００１５】
幾つかの実施形態では、有機リン酸エステルに感応する酵母バイオセンサーは、（ａ）有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程、（ｂ）同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程、（ｃ）レポーターをコードする核酸と該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程、および（ｄ）作動可能に連結した核酸を、核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程により調製し得る。作動可能に連結した核酸は、酵母プラスミド中に含み得るか、または酵母染色体の遺伝子座中に組み込み得る。レポーターは、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、またはこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【００１６】
本開示は、有機リン酸エステル加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する方法、および／または有機リン酸エステル加水分解のプロセスにも関する。幾つかの実施形態では、この方法は、（ａ）有機リン酸エステル加水分解生成物と酵母を接触させる工程、および（ｂ）有機リン酸エステルの存在下、組換えＯＰＨ＋酵母の転写プロファイルを野生型酵母と比較する工程を含み得る。幾つかの実施形態では、この方法は、（ａ）有機リン酸エステル加水分解生成物と酵母を接触させ、酵母からＲＮＡを収集する工程、（ｂ）相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、該ＲＮＡとを接触させる工程、（ｃ）各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、有機リン酸エステル加水分解生成物と接触していない酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程、（ｄ）有機リン酸エステル加水分解生成物と接触していない酵母より、有機リン酸エステル加水分解生成物と接触した酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程、および（ｅ）同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程を含み得る。この方法は、定量的逆転写ＰＣＲにより示差的発現を確認する工程を更に含み得る。
【００１７】
本開示は、有機リン酸エステル加水分解により、またはその間に上方調節される酵母遺伝子を同定する方法にも関する。幾つかの実施形態では、この方法は、（ａ）有機リン酸エステル加水分解を可能にする条件下で、有機リン酸エステルと組換えＯＰＨ＋酵母を接触させる工程、（ｂ）組換えＯＰＨ＋酵母からＲＮＡを収集する工程、（ｃ）相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、その差引き済みＲＮＡとを接触させる工程、（ｄ）各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、ＯＰＨを欠如し、有機リン酸エステルと接触した酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程、（ｅ）ＯＰＨを欠如し、有機リン酸エステルと接触した酵母より、有機リン酸エステルと接触した組換えＯＰＨ＋酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程、および（ｆ）同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程を含み得る。この方法は、定量的逆転写ＰＣＲにより示差的発現を確認する工程を更に含み得る。
【００１８】
有機リン酸エステル加水分解生成物および／または有機リン酸エステル加水分解に感応する酵母バイオセンサーは、幾つかの実施形態によれば、（ａ）有機リン酸エステル加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程、（ｂ）同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程、（ｃ）レポーターをコードする核酸と該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程、および（ｄ）作動可能に連結した核酸を、核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程により調製し得る。作動可能に連結した核酸は、酵母プラスミド中に含み得るか、または酵母染色体の遺伝子座中に組み込み得る。レポーターは、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、またはこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【００１９】
有機リン酸エステル、有機リン酸エステル加水分解生成物の双方に感応する酵母バイオセンサーは、（ａ）有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程、（ｂ）同定した有機リン酸エステル感応性遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程、（ｃ）レポーターをコードする核酸と有機リン酸エステル発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程、（ｄ）作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程、（ｅ）有機リン酸エステル加水分解生成物および／または有機リン酸エステル加水分解のプロセスにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程、（ｆ）同定した有機リン酸エステル加水分解感応性遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程、（ｇ）レポーターをコードする核酸と有機リン酸エステル加水分解生成物発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程、ならびに（ｈ）作動可能に連結した有機リン酸エステル加水分解生成物核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程により調製し得る。作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸および／または作動可能に連結した有機リン酸エステル加水分解生成物核酸は、１つもしくは複数のプラスミド中に含み得るか、または酵母染色体中に組み込み得る。発現制御配列は、プロモーターを含み得る。幾つかの実施形態では、発現制御配列は、同定された遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含み得る。レポーターは、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、またはこれらの組合せからなる群から選択し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本開示の具体的な例示的実施形態は、以下の説明および付随する図面を部分的に参照することにより理解し得る。
【００２１】
（詳細な説明）
神経ガスを検出する現行の手法には、イオン移動度分光分析、電気化学センサー、気液クロマトグラフィー、質量分析、赤外分光、光イオン化検出器、弾性表面波センサー、化学的変色などが挙げられる。こうした方法は、一般に手がかかり、高価な実験装置および複雑な手法を要する恐れがある。神経ガスおよびＯＰ殺虫剤の加水分解に使用される方法には、化学的加水分解と、細菌、哺乳動物、イカ、二枚貝および原虫由来の天然酵素を用いる酵素的加水分解とが含まれる。精製酵素を使用する欠点には、面倒および／または高価な単離・調製法が必要なことと、精製酵素の不安定性とが含まれる。
【００２２】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーは微生物を含み得る（例えば、細菌または酵母）。例えば、ｏｐｄ（有機リン酸エステル分解性）遺伝子を異種的に発現し、有機リン酸エステル化合物を加水分解する全細胞細菌生体触媒を調製し得る。幾つかの実施形態では、細胞における酵素配置が反応速度に影響し得るので、その配置に注意しなければならない。例えば、細胞表面上に発現したＯＰＨは、ＯＰＨが細胞質内に留まっている全細胞生体触媒より有効にＯＰ化合物を加水分解し得る。本開示の任意の実施形態を特定の任意の作用機構に限定することなく、このことは、細菌細胞外被の透過性障壁機能と関係し得る。溶媒、凍結・融解法を用いてその外膜を透過性にし、および／または外膜透過性変異体を使用すると、幾つかの実施形態では、こうした問題が緩和され、受動拡散速度および加水分解速度が増加し得る。
【００２３】
幾つかの実施形態では、酵母バイオセンサーは、（ａ）有機リン酸エステル化合物、および（ｂ）例えば、有機リン酸エステルの分解生成物の検出による、有機リン酸エステルの加水分解を検出できる二重レポーター系を含み得る。酵母バイオセンサーは、有機リン酸エステル化合物を分解するための生化学系を更に含み得る。酵母は、化学薬品汚染物質を生分解する異種酵素の発現により、こうした薬品を生分解できるように遺伝子操作を行い、示差誘導性のプロモーター・蛍光タンパク質融合体を用いて、化学薬品およびその生分解産物を検出するようにも操作を行い得る。幾つかの実施形態によれば、化学薬品を改変、分解および／または解毒できる能力により、センサーは、自浄または自動リセット特性を獲得し得る。他の実施形態では、この能力により、バイオセンサーは、化学薬品を検出するだけでなく、その薬品を空間から一掃するためにも使用できるようにし得る。
【００２４】
酵母Ｓ．セレビシエを本開示の幾つかの実施形態で使用し得る理由は、（ｉ）極限環境に耐性であること、（ｉｉ）サッカロミセスゲノム欠失プロジェクト（スタンフォード）を介して入手できる多数の変異体を用いて、遺伝学的に良く確定されていること、（ｉｉｉ）有機リン酸アンヒドロラーゼのコード遺伝子を含め、異種タンパク質の発現に使用し得ること、（ｉｖ）非病原性であること、（ｖ）凍結乾燥が容易で、１０年間保存後の生存率が良好なこと、および（ｖｉ）酵母の遺伝毒性物質誘導可能遺伝子は、一部の細菌より広範囲の損傷性薬品に応答することである。このことは、異なるＯＰ薬品で誘導し得る遺伝子の同定にとって重要となり得る。
【００２５】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーにとって、細菌の相対的に迅速な倍加時間が有益になり得る（例えば、酵母の７０分に対して２０分）。他の実施形態では、遅めの増殖は、例えば、ＯＰ殺虫剤（例えば、アジンホスメチル、ジアジノン、ジメトエート、ピリミホスメチル）などの大きな基質が酵母細胞に進入できること、および基質透過性を高める特異的変異体が入手できることを考えると許容される。その上、酵母バイオセンサーの作製は、時間が主な制約でない場合、研究室で行い得る。
【００２６】
特定の実施形態では、フラボバクテリウム種／シュードモナス・ディミヌータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）のＯＰＨコード遺伝子をＳ．セレビシエ中で異種的に発現させることにより、ＶＸやＶＸモデル疑似物質のパラオキソンなどの１種または複数のＯＰ化合物を加水分解できる酵母生体触媒を創製し得る。細胞への基質進入を最大限とするために、多孔度が増加し、大きな分子の受動拡散を可能にするＳ．セレビシエの細胞壁変異株を使用し得る。例えば、変異株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Ｄ１ ｌｅｕ２ＤＯ ｍｅｔ１５ＤＯ ｕｒａ３ＤＯ ＤＳＭ１１）（ＡＴＣＣ４００５８８２）は、（１，３）−β−グルカン合成およびキチンシンターゼ発現に関与する遺伝子のＳＭ１１（ＫＮＲ４としても知られている）が欠失しているが、こうしたものは酵母細胞壁の主成分である。ＳＭ１１が欠失すると、（１，３）−β−グルカンの総含量が減少し、（１，３）−β−グルカンシンターゼの活性が低下し、細胞壁キチン含量が増加する。該変異体ではＳＤＳ感受性が高まっており、細胞壁が弱化したことを示唆している。細胞透過性アッセイでは、該変異体は、野生株より基質に対して透過性が高いことが示された。酵母生体触媒のＯＰ化合物に対する加水分解能は、ＶＸやパラオキソンなどのＶＸ疑似物質を用いて試験し得る。
【００２７】
全細胞細菌生体触媒を用いる基質の加水分解における律速段階には、その化合物の細胞への進入がなり得る。したがって、細菌触媒の効率は、基質が受動拡散により細胞に進入できる効率が増加している透過性変異体の使用によって、有意に改善し得る。ＯＰ基質は非特異的機構により酵母に進入することができるが、透過性が増加した酵母変異体を使用し得る。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６２００個の９５％の欠失に成功したサッカロミセスゲノム欠失プロジェクトから、豊富な情報が研究者に提供されてきた。必要とあれば、他の酵母変異体を容易に入手し、ＯＰ基質の細胞進入能について分析し得る。
【００２８】
予備的な結果では、未処置の酵母細胞は、未処置の生体触媒として作用し、モデル基質のパラオキソンを加水分解できることが示された。とは言え、特定の実験では、酵母細胞膜がパラオキソンの進入を制限し、したがって透過性障壁として作用することが示された。ジギトニンなどの透過促進剤で酵母細胞を処理すると、酵母によるパラオキソン加水分解が３〜４倍増加した。このことから、酵母細胞膜の破壊によりパラオキソンの進入速度が増加し、その結果酵母の生体触媒活性が増加することが示唆された。その上、エルゴステロール（膜）生合成に特定の欠陥があるｅｒｇ６変異体は、パラオキソンに対して超感受性を示した。このことから、膜欠陥が基質透過性を増大させ、パラオキソンの進入速度を変えることが示唆される。したがって、幾つかの実施形態では、ｅｒｇ６変異のようにエルゴステロール生合成に変異を潜ませたものなどの酵母変異体は、それを使用して異なる基質に対する膜透過性を増大させ得る（Ｇａｂｅｒ ＲＦら、（１９８９年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９巻、３４４７〜５６頁；Ｈｅｍｅｎｗａｙ ＣＳ ＆ Ｈｅｉｔｍａｎ Ｊ（１９９６年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１巻、１８５２７〜３４頁）。別の実施形態では、酵母（または精選した宿主種）を、活性のあるＯＰ／化学薬品膜輸送物質の発現により化学薬品を活発に取り込むように特異的に操作し、それにより細胞内化学薬品の濃度を増加させ得る。
【００２９】
ＯＰＨのＯＰ基質との相互作用は、特定の流出ポンプで媒介される該薬品の能動的移出の速度からも影響を受け得る。例えば、広範囲の薬物および化合物の能動的流出に関与する、推定上のＡＢＣ輸送タンパク質をコードする２２個の酵母遺伝子が同定された（Ｒｏｇｅｒｓ Ｂら、（２００１年）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３巻、２０１〜２１４頁）。その主要な輸送物質３種は、ＰＤＲ５（多面発現的薬物耐性）、ＹＯＲ１（酵母のオリゴマイシン耐性）およびＳＮＱ２（４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドに対する感受性）である。幾つかの実施形態では、酵母バイオセンサーは、薬物流出変異を単独で、あるいは酵母透過性変異（複数も）および／または細胞の化学薬品感受性を高める、例えば、その基質の細胞内酵素との相互作用を高める変異（複数も）と組み合わせて含み得る。
【００３０】
幾つかの実施形態によれば、ＯＰＨ酵素は、基質の進入および／または流出の制約を回避するために、分泌させるか、または細胞表面に提示してもよい。同様の戦略は、細菌全細胞触媒に対しても採用されてきた。ＯＰＨ酵素と氷核タンパク質との融合により、ＯＰＨ酵素が細胞表面に誘導され、そこで表示され、効率的にＯＰ薬品を触媒した（Ｍｕｌｃｈａｎｄａｎｉ Ａら、（１９９９年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６３巻、２１６〜２３頁；Ｓｈｉｍａｚｕ Ｍら、（２００３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １９巻、１６１２〜４頁；Ｍｕｌｃｈａｎｄａｎｉ Ｐら、（２００１年）Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ １６巻、４３３〜７頁）。酵母におけるタンパク質分泌は、分泌経路を通して該タンパク質を差し向けるのに必要なシグナルを含有する、合成リーダーペプチドとの融合により媒介し得る（Ｐａｒｅｋｈ Ｒら、（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ６巻、５３７〜４５頁）。該リーダーペプチドのウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）との融合により、１４０μｇ／ｍｌの活性ＢＰＴＩ分泌が可能となった（Ｐａｒｅｋｈ ＲＮら、（１９９６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １２巻、１６〜２１頁）。同様に幾つかの実施形態では、ＯＰＨ酵素は、分泌経路シグナルを有するリーダーペプチドを含み得る。ＯＰＨ酵素の移出は、酵母が、親化合物の１種または複数の加水分解生成物より、親化合物に対して浸透性が低い場合に、望ましくなり得る。
【００３１】
ＯＰＨによる加水分解速度は変動し得るが、幾つかの実施形態では、異なる化学薬品に対して触媒活性が増加した酵素を使用し得る。その上、各々が異なる形態のＯＰＨ酵素を発現する、酵母生体触媒の異なる配合物を併用することにより、特定のＯＰ標的に対して最適の基質特異性を実現し得る。
【００３２】
幾つかの実施形態では、ＶＸ（またはパラオキソン）で転写性に誘導したＳ．セレビシエ遺伝子、およびその加水分解生成物で誘導した遺伝子を同定し得る。例えば、ＶＸなどの化学薬品の存在下または非存在下でのＳ．セレビシエＳＭ１１、およびＶＸの存在下または非存在下でのＯＰＨを発現する組換えＳ．セレビシエＳＭ１１について、全体的な転写プロファイル作成（マイクロアレイ分析）を行ってもよい。ＶＸとインキュベートした野生型細胞と、ＶＸとインキュベートしたＯＰＨを発現する組換え細胞との比較によって、ＶＸの加水分解により誘導される１種または複数の酵母遺伝子の同定を促進し得る。ＯＰＨを発現する酵母株を用いたＶＸの加水分解により、ＶＸの加水分解能を欠いた細胞とは異なる転写プロファイルが生成し得る。次いで、様々な濃度のＶＸを用いた優先的標的についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、低濃度で用量依存的に誘導される酵母遺伝子を同定し得る。
【００３３】
優先的遺伝子のプロモーター領域は、サッカロミセスプロモーターデータベース（ＳＣＰＤ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹが維持）、文献解析および／または５’プロモーター分析を用いてマッピングし得る。このようなマッピングは、ＶＸ、ＶＸ加水分解生成物および／またはＶＸ加水分解過程に対する感受性を付与する、１種または複数のプロモーター領域の同定を補助し得る。プロモーターは、クローニングし、異なる分光特性を示す強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）またはＤｓＲｅｄエキスプレス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と融合することにより、ＶＸ汚染の検出および分解中に示差的に蛍光を発する二重レポーター酵素バイオセンサーを創製し得る。幾つかの実施形態では、単一のプロモーター−レポーター融合で、遺伝毒性物質の検出に成功し得る。他の実施形態では、ＯＰ薬品の識別にプロモーター−レポーター融合のサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が必要となり得る。
【００３４】
幾つかの実施形態では、検出系は生物発光成分（例えば、ｌｕｘＡＢ）を含み得る。生物発光は過渡的シグナルとし得る。例えば、ｌｕｘＡＢタンパク質は、高めた温度（３０℃）に感応し得るもので、活性のために追加の基質を必要としてもよい。幾つかの実施形態では、検出系は蛍光成分（例えば、蛍光タンパク質）を含み得る。検出系に使用する蛍光タンパク質は、安定であり、多様な分光特性の１種または複数を有し得る。バイオセンサーは、幾つかの実施形態によれば、研究室外の苛酷な条件下での使用に適した検出系（例えば、蛍光）で構成し得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーは、内蔵式にし得るもので、外因性の基質および／または消費物質は不要とし得るものであり、安価に大量生産し得るものであり、ならびに／あるいは単純な手持ち式照明具を用いて視覚的に確認し得る。
【００３６】
幾つかの実施形態では、バイオセンサーは、ＶＸ、ソマン、サリン、デメトンＳ、パラオキソン、タブン、ＤＦＰ、アセフェート、クロルピリホス、クマホス、コロキソン、パラチオン、ダイアジノン、ｄＭＵＰなどの有機リン酸エステル神経ガスおよび殺虫剤の検出および分解のために使用し得る。
【００３７】
しかし、異なる化学薬品を分解できる変異酵素（変異性ＰＣＲによる、もしくはＤＮＡシャフリングなどの定向進化による）または天然酵素を用いて、酵素の基質特異性を変えることにより、本開示の実施形態は、Ｈクラス薬品（例えば、マスタードガス）などの他の標的を検出し、生分解するより広い特異性の実現に使用し得る。
【００３８】
ＯＰＨは加水分解を行い、その結果、Ｐ−Ｏ、Ｐ−ＦおよびＰ−Ｓ含有結合の切断により、多様なＯＰ殺虫剤および化学兵器薬品の毒性を低下させる。しかし、ＯＰＨによるこうした結合の切断効率は異なっている。例えば、ＯＰＨの触媒作用は、パラオキソン、パラチオンおよびクマホスのＰ−Ｏ結合に対してｋｃａｔｓが６７〜５０００／秒であり、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、サリンおよびソマンのＰ−Ｆ結合に対してｋｃａｔｓが０．０１〜５００／秒であり、ＶＸ、デメトンＳ、マラチオンおよびアセフェートのＰ−Ｓ結合に対してｋｃａｔｓが０．００６７〜１６７／秒である。したがって、Ｐ−Ｓ結合に対するＯＰＨの加水分解効率は、より低く、例えば、ＶＸはパラオキソンの１／１０００の効率で切断される。ＯＰＨのこの触媒効率および特異性を改善するために、設計手法およびランダム手法によりＯＰＨ変異体が生成された（Ｗａｔｋｉｎｓ ＬＭら、（１９９７年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２巻、２５５９６〜６０１頁；Ｙａｎｇ Ｈら、（２００３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６巻、１３５〜４５頁；Ｃｈｏ ＣＭら、（２００２年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８巻、２０２６〜３０頁；Ｃｈｅｎ−Ｇｏｏｄｓｐｅｅｄ Ｍら、（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０巻、１３２５〜３１頁）。両手法とも、ｏｐｄ遺伝子の変異誘発と、その後の精選した標的のスクリーニングに依拠することにより、その特定の標的に対する変異酵素を最適化している。こうした研究から、「切断困難な」基質を用いて反応効率が３桁増加できることが示された（Ｈｉｌｌ ＣＭら、（２００３年）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５巻、８９９０〜１頁；Ｃｈｏ ＣＭら、（２００４年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０巻、４６８１〜５頁）。更に、変異体の加水分解活性は、最も効率的な加水分解を受ける基質のパラオキソンで得られた活性に匹敵していた。このことは、ＯＰＨ配列の合理的およびランダムな変化により、加水分解し難い基質を標的とした効率的酵素を生成できることを示している。
【００３９】
そのままの組換えＯＰＨ＋酵母細胞は、パラオキソンを加水分解し得る。幾つかの実施形態では、ＯＰＨ酵素の効率を改善するために、ＯＰＨの変異誘発を設計通り、およびランダム化して行い得る。例えば、酵素活性部位のアミノ酸変化を設計通りおよびランダムを併用してスクリーニングした後、特定の有機リン酸エステルに対するランダム定向進化（ＤＮＡシャフリング）を行うことによって、ＯＰ薬品に対する触媒効率が有意に改善されたＯＰＨ変異体を単離し得る。広範な基質類縁体を用いたＯＰＨの三次元構造解析により、該酵素の活性部位内に異なる３種の結合ポケットが特定された。これらの結合部位は、小サブサイト（Ｇｌｙ６０、Ｉｌｅ１０６、Ｌｅｕ３０３、Ｓｅｒ３０８、Ｃｙｓ５９およびＳｅｒ６１の側鎖により規定される）、大サブサイト（Ｈｉｓ２５４、Ｈｉｓ２５７、Ｌｅｕ２７１およびＭｅｔ３１７）、ならびに脱離基サブサイト（Ｔｒｐ１３１、Ｐｈｅ１３２、Ｐｈｅ３０６およびＴｙｒ３０９）と呼称されてきた（Ｖａｎｈｏｏｋｅ ＪＬら、（１９９６年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５巻、６０２０〜５頁）。こうした部位のアミノ酸変化で、ＯＰＨの立体選択性および反応性は激変する（Ｃｈｅｎ−Ｇｏｏｄｓｐｅｅｄ Ｍら、（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０巻、１３２５〜３１頁）。例えば、活性部位のアミノ酸残基（Ｉｌｅ１０６、Ｔｒｙ１３１、Ｐｈｅ１３２、Ｓｅｒ３０８およびＴｙｒ３０９）をランダム化すると、既に効率的に加水分解される基質のパラオキソンに対するＯＰＨ活性が６３倍増加した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ ＆ Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ（２００３年）Ｅｍｂｏ Ｊ ２２巻、２４〜３５頁）。同様にして、Ｈｉｌｌら（Ｈｉｌｌ ＣＭら、（２００３年）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５巻、８９９０〜１頁）は、アミノ酸３個（Ｈｉｓ２５４、Ｈｉｓ２５７およびＬｅｕ３０３をそれぞれグリシン、トリプトファンおよびスレオニンへ）を変えただけで、ソマン類縁体に対するＯＰＨ触媒活性を３桁増加させた。後者の研究は、アミノ酸のランダム変化と、その後の精選するＯＰ基質に対する包括的スクリーニングに依拠していた。
【００４０】
適合性の増した酵素を見出すために、定向進化またはＤＮＡシャフリングを用いてタンパク質配列全体をスクリーニングしてもよい（Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ（１９９４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１巻、１０７４７〜５１頁；Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３７０巻、３８９〜９１頁）。プールした単一または関連遺伝子のランダム断片化の後、その断片をプライマーなしＰＣＲで再構成することによって行われる、この組換え・変異プロセスにより、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼおよびβ−ラクタマーゼの活性が、それぞれ４５倍、１０００倍および３２０００倍改善された（Ｚｈａｎｇ ＪＨら、（１９９７年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４巻、４５０４〜９頁；Ｃｒａｍｅｒｉ Ａら、（１９９６年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４巻、３１５〜９頁）。ＤＮＡシャフリングにより、ＯＰＨの触媒活性の増加にも成功することが証明された（Ｙａｎｇ Ｈら、（２００３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６巻、１３５〜４５頁；Ｃｈｏ ＣＭら、（２００２年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８巻、２０２６〜３０頁）。特に、野生型酵素によって好ましい基質パラオキソンのほぼ１／１０００の速度で加水分解される殺虫剤、クロロピリホスに対するＤＮＡシャフリングの結果、ｋｃａｔ／Ｋｍ値が７２５倍増加した（Ｃｈｏ ＣＭら、（２００４年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０巻、４６８１〜５頁）。
【００４１】
幾つかの実施形態では、フラボバクテリウム種のｏｐｄ遺伝子を、異なる種由来の有機リンヒドロラーゼまたは類似の加水分解性酵素をコードする関連遺伝子とシャフリングしてもよい。例えば、フラボバクテリウム種のｏｐｄ遺伝子は、近縁のアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）のｏｐｄＡ遺伝子とシャフリングすること（Ｈｏｒｎｅ Ｉら、（２００２年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８巻、３３７１〜６頁）により、定向進化を「加速」し得る。近縁遺伝子同士のシャフリングは、単一遺伝子のシャフリングと比較して変異体が改良される可能性を高めることができる（Ｃｒａｍｅｒｉ Ａら、（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ ３９１巻、２８８〜９１頁）。該ｏｐｄＡ遺伝子は、ヌクレオチド段階でｏｐｄと約８８％同一であり、ｏｐｄより、広い基質範囲と一部の基質に対する優れた速度とを有することが示された。
【００４２】
幾つかの実施形態によれば、効率的な酵母生体触媒／バイオセンサーは、研究室外で機能し得る。こうした実施形態の幾つかでは、バイオセンサーは、（ｉ）高度の発現を実現するために、最適な発現シグナルを使用し、（ｉｉ）ｏｐｄ遺伝子／レポーター遺伝子の多重コピーを酵母ゲノム中に組み込み、次いで発現を増加させ、および／または（ｉｉｉ）選択圧の非存在下でもｏｐｄ遺伝子／レポーター遺伝子を安定に維持し得る。本開示の実施例は、酵母の２μプラスミドからのＯＰＨタンパク質および蛍光レポーターのプラスミドのエピソーム発現に関する。この戦略は、外来遺伝子の異種発現に対する単純化した汎用的な手法を提供し得る。この２μプラスミドは、低い分離安定性を有する恐れがある、即ちこのプラスミドは、酵母集団中で安定に維持されない恐れがある（Ｍｕｒｒａｙ ＡＷ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３４巻、９６１〜７０頁）。この結果、選択圧下でも酵母集団が不均質になり得る。例えば、予備的結果では、酵母細胞の約２５％だけしか、選択圧下でＯＰＨ発現ベクターを安定に維持しないことが示された。このことは、酵母細胞の大半がＯＰＨプラスミドを含有していなかったことであり、したがって非最適条件下で作用していた恐れがあることを意味している。
【００４３】
エピソームのプラスミド不安定性は、幾つかの実施形態によれば、対象とするプラスミド／遺伝子を酵母ゲノム中に組み込むことにより克服し得る。この結果、選択圧がない場合でも多世代に亘り挿入ＤＮＡ配列を維持する、安定なクローン酵母集団が得られる（Ｌｏｐｅｓ ＴＳら、（１９８９年）Ｇｅｎｅ ７９巻、１９９〜２０６頁；Ｐａｒｅｋｈ ＲＮら、（１９９６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １２巻、１６〜２１頁）。組込み配列は、エピソームのプラスミド（３０〜５０）と比較して少ないコピー数（１〜５）で維持し得る（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ ＴＬ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９８３年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３巻、７４７〜９頁）。しかし、組込みコピー数は、酵母ゲノム中の標的部位数に比例する（Ｗｉｌｓｏｎ ＪＨら、（１９９４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１巻、１７７〜８１頁）ので、組込みＤＮＡの多重コピーを保持する酵母細胞は、該挿入配列が多重コピーで存在する場合に生成し得る。例えば、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）は、染色体ＸＩＩ上に縦列に９．１ｋｂ単位のコピー約１４０個を包含している（Ｐｅｔｅｓ ＴＤ（１９７９年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７６巻、４１０〜４頁）。ｒＤＮＡ遺伝子座を標的とすることにより、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）は、細胞１個当たり１００〜２００コピーで組み込まれ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターから発現したとき、全可溶性タンパク質の約５０％を占めた。同様に、細胞１個当たり約１５０〜２００コピーで存在する相同組換え用のＴｙδ配列を標的とすることにより、組込み配列のコピーを最大で３０個得ることができる。２μプラスミドの使用と比較して、タンパク質発現２〜１０倍の増加を実現し得る。したがって、幾つかの実施形態では、ｏｐｄ遺伝子／レポーター遺伝子を酵母ゲノム中に組み込むことにより、安定な酵母の生体触媒／バイオセンサーを創製し得る。
【００４４】
フラボバクテリウム種細菌から元々誘導されたｏｐｄ遺伝子は、酵母（もしくは特定の宿主株）中ではめったに使用されないコドンを含有し、またはそのコード配列内に発現制限的調節要素を含有し得る。幾つかの実施形態では、ＯＰＨコードｏｐｄ遺伝子は、コドンを最適化することにより、酵母／特定の宿主種中で効率的な発現を保証し得る。レポーター遺伝子も、その改変により、最適なコドン認識を保証し、発現制限的調節要素を除去することによって、精選した宿主中での効率的な発現を保証し得る。（例えば、コドンを最適化したｏｐｄおよびＹＤｓＲｅｄ遺伝子が、図４Ａおよび４Ｂに示されている）。
【００４５】
ｐＧＡＬ調節性プロモーターを本開示の実施例で使用して、外来ｏｐｄ遺伝子の発現を推進したが、それは、デキストロースまたはガラクトースの存在で、発現を各々抑制または誘発することができたからである。しかし、構成的に強力に発現するプロモーターは、それを用いてｏｐｄ遺伝子を発現し得る。例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターは、強力にも構成的にも発現するので、それを常套的に用いてＳ．セレビシエにおいて高度の外来遺伝子発現を実現する（Ｅｄｅｎｓ Ｌら、（１９８４年）Ｃｅｌｌ ３７巻、６２９〜３３頁；Ｉｍａｍｕｒａ Ｔら、（１９８７年）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６１巻、３５４３〜９頁）。したがって、幾つかの実施形態では、ＧＡＰＤＨプロモーターまたは同様に高度発現性の構成プロモーターを用いて、酵母中に外来遺伝子発現を推進し得る。例えば、ＧＡＰＤＨプロモーターは、ｏｐｄ遺伝子が構成的に発現するように、ｏｐｄ遺伝子に作動可能に連結（例えば、隣接して配置）し得る。
【００４６】
幾つかの実施形態では、パラオキソンおよびパラオキソン加水分解生成物に感応する遺伝子を同定するために、マイクロアレイ分析を使用し得る。本開示の実施例に例示するように、マイクロアレイ分析により、パラオキソン誘導可能遺伝子およびパラオキソン加水分解に関連する遺伝子をおよそ１９００種同定した。したがって、他の有機リン酸エステルまたは他の化学薬品に感応する遺伝子および対応プロモーターを同定するために、マイクロアレイ分析を使用し得る。マイクロアレイ分析は、他の有機リン酸エステルまたは化学薬品の分解生成物に感応する遺伝子および対応プロモーターを同定するためにも、使用し得る。
【００４７】
化学薬品の存在下または非存在下での野生型Ｓ．セレビシエ（または精選種）、および化学薬品の存在下または非存在下での、酵素／代謝化剤を発現し、化学薬品を加水分解し得る組換えＳ．セレビシエについて、全体的な転写プロファイル作成（マイクロアレイ分析）を行ってもよい。別の実施形態では、化学薬品の加水分解で誘導される遺伝子を同定する代替手法は、化学薬品を加水分解するその細胞に依拠するのではなく、その細胞を加水分解生成物と直接インキュベートすることである。例えば、ＯＰ神経ガスＶＸの酵素的加水分解により、２−（ジイソプロピル）アミノエタンチオールが産生する（Ｂｏｎｉｅｒｂａｌｅ Ｅら、（１９９７年）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ ６８８巻、２５５〜６４頁；Ｊｏｓｈｉ ＫＡら、（２００６年）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７８巻、３３１〜６頁）。マイクロアレイ分析は、２−（ジイソプロピル）アミノエタンチオール塩酸塩の存在下でインキュベートした細胞から調製したＲＮＡを用いて行い得る。
【００４８】
幾つかの実施形態では、加水分解生成物により過渡的に誘導される遺伝子を同定するために、類似の手法を用い得る。過渡的誘導可能遺伝子は、除染過程の進行のモニターを可能とするために、望ましいものとなり得る。細胞は、加水分解生成物に６０分曝し、等分した後、ＲＮＡ調製のために使用するか、または洗浄し、加水分解生成物が欠けた媒体中に再懸濁してもよい。代謝物質により当初誘導されるが、後に基準の非誘導量に戻る遺伝子が、過渡的誘導可能遺伝子である。
【００４９】
別の実施形態では、明確な異なる波長で発光する「発光」（生物発光）遺伝子を、レポーターシグナルとして用いてもよい。例えば、ビブリオ・ハルベイイｌｕｘＡＢ遺伝子は、酵母中で使用し得る（Ｓｚｉｔｔｎｅｒ Ｒら、（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３０９巻、６６〜７０頁）。ＬｕｘＡＢ酵母細胞は、０．５％Ｚ−９テトラデセナールの存在下で生存でき、ｎ−デカナールで得られるものと類似の生物発光シグナルを生じる。その上、生物発光シグナルは、該アルデヒド基質を更に添加せずに２４時間強力に持続する。制限基質ＦＭＮＨ２をコードするビブリオ・ハルベイイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）のオキシドレダクターゼ遺伝子（ｆｒｐ）を共発現すると、生物発光シグナルは原核系に匹敵する量まで更に増加した。こうした実験の結果、生物発光シグナルは、バックグランド量のほぼ９×１０５倍に達した（Ｇｕｐｔａ ＲＫら、（２００３年）Ｆｅｍｓ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ４巻、３０５〜１３頁）。「過渡的」発光シグナルは、除染過程の経時的モニタリングを可能にし得る。
【００５０】
発光の考え得る欠点は、上昇した温度での熱不安定性である（Ｅｓｃｈｅｒ Ａら、（１９８９年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６巻、６５２８〜３２頁）。しかし、ゼノルハドブス・ルミネセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｄｂｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）由来の熱安定ＬｕｘＡＢが、必要または所望とあれば使用してもよい。Ｘ．ルミネセンス由来のルシフェラーゼ活性は、高い熱安定性（４５℃での半減期３時間）を示し、より高い温度で使用するバイオセンサーにとって選りすぐりの生物発光系となり得る。加えて、異なる発光色を有する異なるルシフェラーゼ（Ｌｉｎ ＬＹら、（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻、３１８３〜９４頁）に融合するプロモーターの「サイン」を用いて、長期間に亘る除染過程をモニターし得る。
【００５１】
別の実施形態では、化学薬品を生分解し、化学薬品の毒性を直接低下させるのではなく、それが化学的加水分解を受け易くなるように、生体触媒は化学薬品を改変してもよい。
【００５２】
別の実施形態では、生体触媒は、異なる化学薬品を検出し、生分解するために、多重の生分解酵素および多重のプロモーター・レポーター遺伝子融合体を潜ませてもよい。
【００５３】
別の実施形態では、特定の薬品に対して特定の生分解酵素および特定のレポーター検出系を各々が潜ませた各クローン細胞は、混合することにより、異なる化学薬品を一群として検出し、生分解することができる不均質集団にしてもよい。
【００５４】
別の実施形態では、デオキシリボ核酸（例えば、ＤＮＡザイム）もしくはリボ核酸、または生細胞中で産生できる類似物などの加水分解能を有する分子（酵素以外）を用いて、化学薬品を加水分解または生分解してもよい。
【００５５】
当業者なら理解されようが、本開示の実施形態によれば、化学薬品を検出および／または改変する他の等価または代替のシステム、装置および方法を、その本質的特性から乖離せずに想定することができる。例えば、本開示の装置は、手持ち式または卓上式構成に製造し、散発的、間歇的および／または連続的に操作し得る。その上、バイオセンサーは、１つもしくは複数の温度および／または圧力下で使用するように構成し得る。しかも、当業者であれば、標的化学薬品を検出および／または改変するために、多数の自己および異種核酸を使用し得ることを認識されよう。また、本開示は、任意の特定の光源および／または発光光学装置に限定されず、所望の波長（複数も）に適切に調節し得る任意タイプの発光装置の使用を広く想定している。同様に、本開示は、任意タイプの光検出器および／または光検出装置の使用を想定している。本開示のシステムの全部または一部は、使い捨ておよび／または再使用ができるように構成し得る。時々は、再使用型部品を浄化、修理および／または改造することが望ましい場合もある。更にまた、いずれの実施形態、使用および／または利点も、他の実施形態、使用および／または利点を普遍的に抑制または除外することを意図していないことは、当業者ならば理解されよう。明白な変更および改変を伴うこうした等価物および代替物は、本開示の範囲内に包含されることを意図している。したがって、上記の開示は、以下の特許請求の範囲で明らかにされるように、本開示の範囲に関して例示的なものであって、制限的なものではないことを意図している。
【実施例】
【００５６】
本開示の幾つかの実施形態は、以下の実施例の１つまたは複数により例示し得る。
【００５７】
実施例１〜９は、細菌ｏｐｄ遺伝子を含有する酵母用発現ベクターの構築およびＳ．セレビシエ中への形質転換を詳述する。ｏｐｄ遺伝子が酵母内で発現されたことを確認するために、逆転写ＰＣＲを用いた。組換えＯＰＨ＋酵母から調製した酵素溶解物を用いるパラオキソナーゼアッセイにより、ｏｐｄ遺伝子が、パラオキソンを加水分解する機能性ＯＰＨタンパク質を産生することが示された。未処置全細胞のパラオキソナーゼアッセイにより、酵母細胞はパラオキソンを加水分解し、生体触媒として機能できることが示された。選択培地および非選択培地での酵母コロニーの計数により、酵母エピソームのＯＰＨを発現するプラスミドは、酵母集団により安定に維持されていないことが示された。このことは、酵母生体触媒の最適機能のために、ｏｐｄ遺伝子を酵母ゲノム中に組み込むことにより、安定なクローン酵母集団を創製し得ることを示唆する。試験および最適化研究を行った結果、（ｉ）酵母膜の破壊で全細胞のパラオキソン加水分解が増加すること、（ｉｉ）低濃度のエタノールで前処理すると、全細胞活性が増加すること、および（ｉｉｉ）ｅｒｇ６酵母膜変異体はパラオキソンに超感受性であり、ｅｒｇ６変異がパラオキソンの進入速度を増加させることを示唆することを示した。
【００５８】
実施例１０〜１２は、パラオキソン、パラオキソンの加水分解過程、および／またはパラオキソンの加水分解生成物により転写性に誘導される、Ｓ．セレビシエ遺伝子の同定を詳述する。パラオキソンにより誘導される酵母遺伝子、およびパラオキソン加水分解により誘導される遺伝子を同定するために、マイクロアレイ分析を用いた。相当程度かつ実質的に誘導された多数のパラオキソン誘導可能遺伝子を同定した。パラオキソン誘導可能遺伝子のＹＬＲ３４６ＣおよびＹＧＲ０３５Ｃを優先的に更に分析したところ、定量的リアルタイムＰＣＲによって、この両遺伝子は速やかに（７．５分）かつ感度良くパラオキソンで誘導されることが実証された。したがって、ＹＬＲ３４６ＣおよびＹＧＲ０３５Ｃは、バイオセンサーに組み込むために所望の特性を示し、優先的に実施例１３〜１４に用いた。マイクロアレイ分析により、パラオキソンの加水分解後に少なくとも２倍誘導される遺伝子３３種も同定した。リアルタイムＰＣＲによって、この中の２種の遺伝子（ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃ）だけしか、パラオキソンの存在下、ＯＰＨ＋株中で誘導されないことが立証された。したがって、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃも優先的に実施例１３〜１４に用いた。こうした知見の各々を支持する実験は、以下の本文中で説明する。
【００５９】
実施例１３〜１４は、酵母蛍光バイオセンサーの例示的実施形態の構築を詳述する。酵母コドンを最適化したＹｅＧＦＰおよびＹＤｓＲｅｄレポーターベクターを構築した。２種のパラオキソン誘導プロモーター（ＹＬＲ３４６ＣおよびｐＹＧＲ０３５Ｃ）をＹｅＧＦＰと融合し、パラオキソン加水分解に関連する２種のプロモーター（ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃ）をＹＤｓＲｅｄと融合した。ＹＬＲ３４６Ｃ−ＹｅＧＦＰを潜ませた酵母バイオセンサーは、パラオキソンの存在下、ＹｅＧＦＰ誘導を最大５倍示した。その上、このバイオセンサーは、速やかに誘導され（１５分の暴露後に２倍）、パラオキソンにより用量依存的に誘導された。ＹＤｓＲｅｄと融合したパラオキソン加水分解プロモーター（ＰＯＸ１）を潜ませた組換えＯＰＨ＋酵母も、パラオキソンの存在下、誘発蛍光を示した。ＹＤｓＲｅｄ誘発は、ＯＰＨを発現する酵母株だけに起こったが、このことは、その誘発にＯＰＨ、パラオキソンの両方が必要であることを示した。このことは、ＹＤｓＲｅｄ誘発がパラオキソン加水分解と厳密に関係していたことを示唆する。ＹＤｓＲｅｄは、パラオキソンにより用量依存的に誘発されたが、このことは、バイオセンサーがパラオキソンの加水分解量に応答したことを示唆する。こうした知見の各々を支持する実験は、以下の本文で詳細に説明する。
【００６０】
（実施例１）Ｓ．セレビシエにおける酵母ｏｐｄ発現プラスミドおよびｏｐｄ ｍＲＮＡ発現
酵母ＧＡＬ１プロモーターの転写制御下にあるｏｐｄ遺伝子、および酵母リボソーム結合部位を含有する酵母発現プラスミドを構築した。酵母コドン最適化ｏｐｄ発現プラスミドを同時に構築した。ｏｐｄ発現プラスミドをＳ．セレビシエ中に形質転換し、形質転換酵母細胞のｏｐｄ発現能を相対的ＲＴ−ＰＣＲを用いて試験した。
【００６１】
プラスミドｐＪＫ３３中のフラボバクテリウムｏｐｄ遺伝子、即ちｐＵＣ１８構築体を使用した。フラボバクテリウムｏｐｄ遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ｏｐｄ遺伝子と同一である（Ｍｕｌｂｒｙ ＷＷ ＆ Ｋａｒｎｓ ＪＳ．、（１９８９年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７１巻、６７４０〜６頁）。１ｋｂ ｏｐｄ断片は、プルーフリーディング熱安定ポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅した（図１）。５’プライマーは、最適な翻訳開始を保証するために、酵母リボソーム結合部位を組み込むように設計した（Ｌｏｏｍａｎ ＡＣ ＆ Ｋｕｉｖｅｎｈｏｖｅｎ ＪＡ．、（１９８３年）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１巻。４２６８〜７１頁）。５’および３’プライマーは、それぞれ制限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを組み込むようにも設計された。該ｏｐｄ遺伝子は、標準的な分子生物学技法を用いて、Ｓ．セレビシエ発現ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡの対応部位中に一方向にクローニングする（表１）ことにより、ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを創製した。診断的な制限エンドヌクレアーゼ消化（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）およびアガロースゲル電気泳動によって、適正なクローンが選択されたことを確認した（図２）。ＰＣＲ増幅ｏｐｄ遺伝子の配列は、ダイデオキシターミネーター配列決定法で立証した。ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドは、酵母２μ起点とＳ．セレビシエにおける増殖および選択のためのＵＲＡ３栄養要求性マーカー遺伝子、ＣｏｌＥ１起点と大腸菌における増殖および選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子、Ｓ．セレビシエにおける発現の抑制（デキストロース）または誘発（ガラクトース）用のＧＡＬ１調節性プロモーター、ならびにｏｐｄ遺伝子の下流にある転写終止配列（ＴＣＹＣ１）を含有していた（図３）。酵母コドン最適化ｏｐｄ遺伝子を含有する酵母発現プラスミドも、同時に構築した。コドン最適化は、Ｂｉｏ Ｓ＆Ｔ（ケベック、カナダ）により行われた。コドン最適化ｏｐｄ遺伝子の配列は（図４Ａ）に列挙されている。野生型ｏｐｄ遺伝子と同じクローニング戦略を用いて、コドン最適化ｏｐｄ遺伝子をｐＥＳＣ−ＵＲＡ中にクローニングすることによりｐＹＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを創製した。
【００６２】
ＬｉＡｃ形質転換手順を用いて（Ｉｔｏ Ｈら、（１９８３年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １５３巻、１６３〜８頁）、Ｓ．セレビシエを対照プラスミド（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および試験プラスミド（ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡ）で形質転換した（エピソーム発現）ところ、酵母形質転換体が容易に得られた。ｏｐｄ ｍＲＮＡが十分に発現されることを立証するために、相対的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った（図５）。対照プラスミド（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および試験プラスミド（ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡ）を潜ませた形質転換体は、ＧＡＬ１プロモーターからの発現を抑制（デキストロース培地）または誘発（ガラクトース培地）させる条件下で、合成ドロップアウト培地（ＳＤ）中で増殖させた。総ＲＮＡは、Ｔｒｉ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて当製造業者の教示に従って調製し、ＤＮａｓｅ１で処理した。レトロスクリプトキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて等量のＲＮＡ（約１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。各試料に対して等量のｃＤＮＡが使用されることを保証するために、Ｓ．セレビシエハウスキーピング遺伝子のアクチン（ＡＣＴ１、５４７ｂｐ産物）と対照させて設計したプライマーで、ＰＣＲを最初に行った。次いで必要であれば、ｃＤＮＡ量をそれに応じて調節し、その後ｏｐｄを分析した。ＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動を用いて分離し、分析した。ＰＣＲ分析は、逆転写酵素が欠如した試料（ＲＮＡ試料）についても行ったが、こうした試料からはＲＴ−ＰＣＲ生成物が予想通り全く検出されなかった。ｏｐｄ ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、（ｉ）対照プラスミドを潜ませた形質転換酵母細胞からは、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が検出されないこと（予想通り）、（ｉｉ）ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませた酵母細胞からは、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が検出され、したがってこの酵母細胞は、形質転換に成功しており、ｏｐｄ遺伝子を発現していること、および（ｉｉｉ）ｏｐｄ発現量は、Ｇａｌプロモーターから発現を誘発する条件（ガラクトースの存在）の方が高いことが示された。
【００６３】
酵母の転写および翻訳シグナルを含有する酵母ｏｐｄ発現プラスミドは、その構築に成功した。酵母ｏｐｄ発現プラスミドを潜ませた形質転換酵母細胞は、ｏｐｄ ｍＲＮＡを発現した。
【００６４】
（実施例２）ｏｐｄ発現のＳ．セレビシエ増殖に対する効果
対照プラスミド（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および試験プラスミド（ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡ）を潜ませた組換えＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、抑制（２％デキストロース）または誘発（２％ガラクトース）条件下で、ウラシルが欠けたＳＤ培地中３７℃で増殖させ、その増殖を分光光度法でモニターした。
【００６５】
対照、試験の両培養物共、ガラクトースを含有する最小培地中で、デキストロース含有の場合と比較して増殖が遅かった。ｏｐｄプラスミドを潜ませたＳ．セレビシエは、「空の」対照プラスミドと比較して、僅かに増殖が減少した（図６）。これは、細胞の代謝活性を「排出」し、そのために増殖速度を低下させたタンパク質の過剰発現に単に起因し得る。
【００６６】
ｏｐｄ発現はＳ．セレビシエにとって有毒ではないが、誘発条件下では、ｏｐｄプラスミドを潜ませた酵母細胞の増殖速度がやや抑制された。
【００６７】
（実施例３）パラオキソンのＳ．セレビシエ増殖に対する効果
複合ＹＰＤブロース（酵母エキス、ペプトン、デキストロース）中、またはウラシルおよび２％ガラクトースを補充したＳＤ培地（ＳＤｇａｌ）中３７℃で、Ｓ．セレビシエを定常期まで終夜増殖させた。０時間で培養物を等分し、０．５、１．０、２．０および４．０ｍＭパラオキソンの非存在下または存在下でインキュベートした。増殖をＯＤ６００の分光光度法でモニターした。
【００６８】
０．５ｍＭパラオキソンは、Ｓ．セレビシエの増殖を有意に抑制しなかった（図７Ａ）が、より高い濃度では、パラオキソンは増殖遅延を起こした。したがって予想通り、パラオキソンは、恐らくＯＰの遺伝毒作用のために用量依存的に酵母の増殖を抑制した。
【００６９】
組換えＯＰＨ＋細胞が、パラオキソンの毒作用に「耐性」を示す否かを調べるために、野生型細胞および組換えＯＰＨ＋細胞の増殖を、１ｍＭパラオキソンの非存在下または存在下でモニターした。野生型細胞、ＯＰＨ＋細胞のいずれの増殖も、１ｍＭパラオキソンにより同程度に抑制された（図７Ｂ）。このことから、ＯＰＨ＋細胞は、パラオキソンの毒作用に対する耐性を高めていないことが示唆された。特定の作用機構に何ら限定されるわけではないが、この原因には、（ｉ）パラオキソンの加水分解生成物が酵母に有毒であること、および／または（ｉｉ）（一部の）酵母細胞が、不均質なＯＰＨ＋集団のためにパラオキソンを加水分解できないこと、即ち、ＯＰＨ＋プラスミドは、不安定であり、酵母中で安定に維持されなかったこと（セクション１．４、表２）が、考え得る。
【００７０】
パラオキソンは、用量依存的にＳ．セレビシエの増殖を抑制した。高濃度のパラオキソン（４．０ｍＭ）は、誘導期の延長を起こした。
【００７１】
（実施例４）酵母酵素溶解物のパラオキソンに対する加水分解能
ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（空のプラスミド対照）およびｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませたＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。対数増殖期中に酵母細胞を遠心分離で収集し、細胞ペレットの凍結乾燥を行った。その細胞をＹ−ＭＥＲ透析性溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）０．５ｍｌと室温（ＲＴ）で２０分インキュベートした後、２４０００×ｇで４℃、１５分遠心分離することにより、酵素溶解物を調製した。細胞質ゾル内パラオキソナーゼ活性を測定するために、その上清２５μｌを反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５ｍＭパラオキソン、２％メタノール）９７５μｌと混合した。トリトン抽出性酵素のアッセイ（膜結合型）のために、遠心分離工程から得られた膜ペレットを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中の１％トリトン×１００の１００μｌ中に再懸濁し、ＲＴで２０分インキュベートした後、１５０００ｒｐｍで２分遠心分離した。生成した上清を細胞質ゾル画分の場合と同様に適用した。分光光度計を用いて、基準線が安定化した後、４０５ｎｍでｐ−ニトロフェノール放出量を５分間測定した。試料１個当たり、少なくとも３点の測定を繰り返した。パラオキソナーゼ活性は、１．７×１０４Ｍ−１ｃｍ−１の抽出係数を用いて計算し、μｍｏｌパラオキソン加水分解量／分／ｍｇタンパク質として示した。酵母溶解物の活性は、細菌ｏｐｄの最適化発現プラスミドを潜ませた大腸菌から調製した溶解物と比較した。
【００７２】
空のプラスミドを潜ませた酵母細胞から調製した対照酵素溶解物は、パラオキソンを加水分解することができなかった。対照的に、ｏｐｄ発現プラスミドを潜ませた酵母細胞は、パラオキソンを加水分解する機能的ＯＰＨタンパク質を産生した（表１）。Ｓ．セレビシエにおける酵素活性の大半（７５％）は膜結合型（トリトン抽出性）であり、その他は細胞質ゾル画分中にあった。この分布は、野生型フラボバクテリウム種に対応していた（Ｍｕｌｂｒｙ ＷＷ ＆ Ｋａｒｎｓ ＪＳ．、（１９８９年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７１巻、６７４０〜６頁）。野生型ｏｐｄ遺伝子または酵素コドン最適化ｏｐｄ遺伝子を潜ませた酵母細胞から調製した酵素溶解物に、パラオキソナーゼ活性の差は検出されず、このため、コドンの偏りは、酵母における効率的ｏｐｄ発現に対する制限的な決定因子ではないことが示唆される。
【００７３】
【表１】
酵素溶解物と比較して、最適化ｏｐｄ細菌発現プラスミドを潜ませた大腸菌溶解物の方が、パラオキソナーゼ活性の高いことは明白であった。この活性増加の原因は、遺伝子の用量効果であると考え得る。例えば、大腸菌プラスミド（ＣｏｌＥ１複製起点）のコピー数が、細胞１個当たり通常３００〜５００プラスミドであるのに対して、酵母２μプラスミドの対応コピー数は、細胞１個当たり約３０〜５０プラスミドである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ ＴＬ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９８３年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３巻、７４７〜９頁）、即ち約１０分の１である。加えて、この酵母プラスミドは、不安定であり、酵母集団中で一貫して維持されることがないと判明した。該酵母プラスミドを潜ませた酵母細胞を選択培地および非選択培地上に播種した結果、酵母細胞の２０〜２５％しかプラスミドを維持していないことが示された（表２）。したがって、酵母溶解物の比活性は、大腸菌に比較して過少評価されている恐れがある。酵母２μプラスミドの不安定性即ち低分離安定性は、以前に報告されていた（Ｍｕｒｒａｙ ＡＷ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ（１９８３年）Ｃｅｌｌ ３４巻、９６１〜７０頁）。この問題は、ｏｐｄ遺伝子をＳ．セレビシエゲノム中に安定に組み込むことにより、修正することができる。その組込み配列を最大１００コピー有する安定な酵母細胞は、標的相同組換えにより生成することができる（Ｐａｒｅｋｈ Ｒら、（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ６巻、５３７〜４５頁；Ｐａｒｅｋｈ ＲＮら、（１９９６年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １２巻、１６〜２１頁）。
【００７４】
【表２】
ｏｐｄ発現プラスミドを潜ませた組換え酵母細胞は、パラオキソンを加水分解できる機能的ＯＰＨタンパク質を産生した。酵素活性の大半は、野生型フラボバクテリウム酵素と同様の膜結合型である。酵母２μプラスミドからのｏｐｄの発現は、プラスミド不安定性のために、ほぼ間違いなく不均質ＯＰＨ＋集団を生じる。
【００７５】
（実施例５）未処置組換え酵母のパラオキソンに対する加水分解能
ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（対照）またはｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませた、対数増殖期中のＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。酵母細胞を遠心分離により収集し、未処置細胞を用いてパラオキソナーゼアッセイを行った。比較として、細菌ｏｐｄ最適化発現プラスミドを潜ませた培養大腸菌の全細胞パラオキソナーゼ活性も測定した。
【００７６】
ｏｐｄ発現プラスミドを潜ませた未処置酵母細胞は、パラオキソンを加水分解することができた（表３）。酵母細胞は、未処置大腸菌細胞より３〜４倍高いパラオキソナーゼ活性を示した。酵母の酵素溶解物および未処置細胞は異なる量のパラオキソナーゼ活性を示し、未処置細胞は全細胞活性の２〜３％しか示さなかった。特定の作用機構に何ら限定されるわけではないが、未処置酵母細胞のパラオキソンに対する加水分解能の制約には、パラオキソンの細胞中への進入速度がなり得る（Ｍｕｌｃｈａｎｄａｎｉ Ａら、（１９９９年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６３巻、２１６〜２３頁；Ｓｈｉｍａｚｕ Ｍら、（２００３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １９巻、１６１２〜４頁）。細胞への進入速度を制限する障壁には、細胞壁、細胞膜のいずれかがなり得る。
【００７７】
【表３】
未処置組換え酵母細胞は、パラオキソンを加水分解し、酵母生体触媒として機能することができた。未処置酵母細胞は、酵母溶解物と比較して少量のパラオキソン加水分解を示したが、その理由は、律速段階が細胞内へのパラオキソンの拡散速度であると推定される。
【００７８】
（実施例６）スフェロプラストのパラオキソンに対する加水分解能
ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませた対数増殖期中のＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。酵母細胞を遠心分離で収集し、等分し、β−メルカプトエタノール１μｌ／ｍｌおよびザイモリアーゼ１５μｌ／ｍｌ（５単位／μｌ、細胞壁除去酵素）の存在下または非存在下、スフェロプラスト緩衝液（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５）中３７℃でインキュベートした。２０分後、スフェロプラスト形成が、０．２％ＳＤＳの添加（１：１混合）による溶解細胞の顕微鏡検査によって、また、選択培地上で４８時間後にスフェロプラストがコロニーを形成できないことによって確認された。対照細胞およびスフェロプラストを１Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で４回洗浄（１８００×ｇ、５分）した後、パラオキソン加水分解のアッセイを行った。
【００７９】
細胞壁を欠いているスフェロプラストのパラオキソン加水分解を、未処置酵母細胞と比較した。未処置酵母細胞とスフェロプラストとの間に、パラオキソン加水分解に実質的な差はなかった（表４）。したがって、幾つかの実施形態では、細胞壁の除去により、細胞内へのパラオキソンの進入速度は増加せず、そのため酵母生体触媒のパラオキソン加水分解も増加しない。したがって、こうした実施形態の１つまたは複数において、パラオキソン進入に対して考え得る障壁は、酵素の細胞膜である。
【００８０】
【表４】
幾つかの実施形態では、細胞壁の除去により、全細胞によるパラオキソン加水分解は改善されなかった。このことから、パラオキソンの細胞進入は、細胞壁により阻害し得ないことが示唆される。
【００８１】
（実施例７）透過性増加酵母のパラオキソンに対する加水分解能
ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませたＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。ＯＤ６００が０．５の時点で、酵母細胞を遠心分離で収集し、等分し、０．１％ジギトニンを含有するジメチルスルホキシドの存在下または非存在下、ＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中３０℃でインキュベートした（Ｂｅｃｋｅｒ ＪＭら、（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９６８巻、４０８〜１７頁）。１５分間振とう後、透過性増加細胞の存在を０．４％トリパンブルーの添加（１：１混合）により評価した。顕微鏡検査により、ジギトニン処理細胞の９９％は青色に見える（視野当たり）が、対照細胞は不透明のままであることが示された。「青色」酵母細胞の外観は、損傷した、または透過性が増加した膜を示している。ジギトニン処理細胞は、選択培地上でのインキュベーション４８時間後に、１０３分の１の生細胞も予想通り示した。対照細胞および透過性増加細胞をＴＥ緩衝液で４回洗浄した（２０００×ｇ、１０分）後、パラオキソナーゼ活性のアッセイを行った。
【００８２】
透過促進剤のジギトニンによる該細胞の処理により、パラオキソン加水分解が、対照細胞と比較して３〜４倍増加した（表５）。このことから、酵母膜の破壊で細胞内へのパラオキソン進入速度、したがって酵母の生体触媒活性が増加することが示唆される。これは、細菌の細胞外皮が、基質に対する透過性障壁として作用することを示した、細菌生体触媒を用いた研究と一致している。例えば、細菌の細胞表面上に発現したＯＰＨは、ＯＰＨが細胞質内に留まっている全細胞生体触媒より、有効にＯＰ化合物を加水分解する。溶媒を用いた外膜の透過性促進は、こうした問題を克服し、受動拡散および加水分解の速度を増加させることができるが、こうした方法の実施に当たっては、細胞死を回避するように注意を払うことが必要となり得る。
【００８３】
【表５】
酵母膜の透過性増加は、恐らく、その膜を破壊した結果、細胞内へのパラオキソンの進入速度を増加させることにより、酵母生体触媒の効率を増加させた。この結果から、酵母膜は、パラオキソンの進入に対する主要な障壁であることが示唆される。
【００８４】
（実施例８）エタノールなどの膜透過剤のパラオキソン加水分解に対する効果
ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませた酵母細胞を、２％ガラクトース（ｐＧＡＬ１誘発条件）および２％、４％、６％、８％いずれかのエタノール（最終濃度）を含有するＳＤ培地中で増殖させた。増殖をＯＤ６００で分光光度法によりモニターし、細胞生存率をトリパンブルー染色で調べた。致死量未満のエタノール濃度で前処理した酵母細胞の能力を、全細胞によるパラオキソン加水分解について調べた。
【００８５】
２％または４％エタノールでインキュベーションすると、Ｓ．セレビシエの増殖速度は減少し、より高いエタノール濃度（６〜８％）でインキュベーションすると、増殖が激しく抑制された（図８）。しかし、３．７５時間の処理後、対照と４％エタノール処理細胞との間に生存率の差はなかった。したがって、ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドを潜ませた酵母細胞を、２％または４％エタノールで４．５時間、前処理した後、パラオキソナーゼアッセイを行った。致死量未満のエタノール濃度で前処理すると、全細胞のパラオキソン加水分解が増加した（表６）。２％エタノールによる前処理後のアッセイで、全細胞活性が、対照細胞と比較して１．２９倍増加する一方、４％エタノールによる前処理で活性が１．４６倍増加した。
【００８６】
【表６】
致死量未満のエタノール濃度で前処理した結果、ほぼ間違いなくパラオキソンに対する膜透過性の増加により、全細胞のパラオキソン加水分解が増加した。エタノールの前処理は、酵母生体触媒の活性を増加させることができる。
【００８７】
（実施例９）酵母膜変異体のパラオキソンに対する感受性
エルゴステロール生合成に特定の変異を有する酵母変異体は、酵母膜の変化を介したパラオキソン拡散の増加のために、パラオキソンに超感受性となり得る。したがって、酵母膜変異株のパラオキソンに対する感受性増加を調べるために、低濃度のパラオキソンの存在下または非存在下での増殖曲線を実行した。Ｓ．セレビシエ野生型ＢＹ４７４１と、膜変異株ｅｒｇ３、ｅｒｇ４およびｅｒｇ６とを、複合ＹＰＤブロース（変異株に対しては２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を追加）中３７℃で、定常期まで終夜増殖させた。０時間で培養物を等分し、０．５ｍＭパラオキソンの非存在下または存在下でインキュベートした。培養物の増殖は、ＯＤ６００での分光光度法でモニターした。
【００８８】
０．５ｍＭパラオキソンの存在下または非存在下、野生型とｅｒｇ３またはｅｒｇ４株との間に増殖速度の差はなかった（図９ＡおよびＢ）。このことから、ＥＲＧ３およびＥＲＧ４における変異は、パラオキソンに対する感受性の増加を付与しないことが示された。対照的に、０．５ｍＭパラオキソンにより、野生株と比較してｅｒｇ６の増殖速度は有意に減少した（図９Ｃ）。
【００８９】
パラオキソンに対するｅｒｇ６の感受性の程度を調べるために、パラオキソン濃度を下げて（０．２５ｍＭおよび０．１２５ｍＭ）、追加の増殖曲線を実行した。ｅｒｇ６の増殖速度は０．１２５ｍＭパラオキソンで抑制されたが、この濃度は野生株には無効であった（図１０ＡおよびＢ）。したがって、この結果は、ｅｒｇ６がパラオキソンに超感受性であり、酵母生体触媒中に組み込むために有用となり得ることを示すが、ｅｒｇ６変異体使用の考え得る欠点は、野生株と比較してＹＰＤ培地中での増殖速度が損なわれていることである（Ｗｅｌｉｈｎｄａ ＡＡら、（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１９３巻、１０７〜１７頁）。
【００９０】
特定の膜変異体ｅｒｇ６は、パラオキソンに対して超感受性であるが、その原因は、恐らくパラオキソンに対するその防御膜の透過性増加である。ｅｒｇ６などの酵母膜変異体の使用は、生体触媒の効率を増加させ得る。
【００９１】
（実施例１０）野生型および組換えＯＰＨ＋酵母遺伝子のマイクロアレイ分析
パラオキソンの存在下または非存在下でのＳ．セレビシエ、およびパラオキソンの存在下または非存在下での組換えＯＰＨ＋酵母に関して、全体的な転写プロファイル作成（マイクロアレイ分析）を行った。パラオキソンとインキュベートした野生型細胞と、パラオキソンとインキュベートした、ＯＰＨを発現する組換え細胞とを比較した結果、パラオキソンの加水分解で誘導される酵母遺伝子が同定された。
【００９２】
３ｍＭパラオキソンの存在下または非存在下、Ｓ．セレビシエＷ３０３１ＡをＳＤｇａｌ（発現誘発）中、３７℃で６０分増殖させた。こうした試料を用いて、パラオキソンの存在下で上方調節される酵母遺伝子を同定した。３ｍＭパラオキソンの存在下または非存在下、６０分で組換えＯＰＨ＋株の培養物も調製した。こうした試料により、パラオキソン加水分解に特異的な誘導可能遺伝子の同定が可能となった。ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、その製造業者の教示に従って、ＲＮＡを繰り返し３回の培養物から調製した。ＲＮＡ調製物は、ＤＮａｓｅ１で処理後、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にＲＮＡを通すことにより、更に精製した。
【００９３】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に対して確立された標準的手順を用いて、総ＲＮＡ１０μｇからビオチン標識断片化ｃＲＮＡ標的を調製した。単一アレイ上にＳ．セレビシエゲノム全体（ＯＲＦおよそ６２００個）を含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓ９８ Ａｒｒａｙと、標的とのハイブリッドを形成した。ハイブリッド形成は、独自の培養物３点に由来するＲＮＡ調製物３点を用いて、繰り返し３回行った。ハイブリッド形成後の洗浄、染色およびスキャンは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが開発した標準的条件を用いて行った。マイクロアレイのハイブリッド形成データ（ＣＥＬファイル）は、ＧＣＲＭＡのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ実施（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ ＲＣら、（２００４年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ５巻、Ｒ８０頁）を用いて規格化し、規格化ハイブリッド形成データを、処理に関する２つ１組の比較のために分析プログラムｄＣｈｉｐ中にインポートした。パラオキソン誘導可能遺伝子は、次の規準：即ち、野生型の処理対非処理および組換え体の処理対非処理に対して、４倍超の発現増加および統計的差（対応のないｔ−検定、ｐ＜０．０１）により定義した。パラオキソン加水分解に関連する候補遺伝子は、次の規準：即ち、組換え体のパラオキソン処理対組換え体の非処理に対して、２倍超の発現増加および統計的差（対応のないｔ−検定、ｐ＜０．０１）により定義し、パラオキソン誘導可能遺伝子は除外した。相関係数１および連鎖の距離測定基準を有し、重心法で計算した標準化発現値（ｚ規格化）を用いて、ｄＣｈｉｐにより各集合の候補遺伝子に関して階層的クラスタ分析を行った。
【００９４】
まとめると、パラオキソンで誘導された遺伝子の個数および発現量の変化は、大きかった。例えば、パラオキソン処理および非処理対照細胞間の比較を目的とした、ｔ−検定を用いた倍率変化（ｐ＜０．０１）に対する２つ１組の比較によって、示差的に発現する遺伝子が約１９００種同定された。示差的発現の誤発見率（ＦＤＲ）は低く（０．３％）、該遺伝子１９００種のうち、誤りは僅か約６種に過ぎないと推定されることを示した。６５種の遺伝子は、パラオキソン暴露のために示差的に発現することが確認され、（ｉ）４倍以上の示差的発現、（ｉｉ）ｐ値＜０．０１のｔ−検定に基づく統計的有意性、（ｉｉｉ）発現の増加だけ（抑制されない）、および（ｉｖ）両方の処理集合（野生型および組換え酵母）からパラオキソンで誘導されること、により選択された。誘導倍率に基づくパラオキソン誘導可能遺伝子７種の選択リストを表７に示してある。示差的発現量は、誘導倍率１８倍から１７００倍まで（ＹＧＲ０３５Ｃの場合）にも及んでおり、したがって発現量の大きな増加を示した。パラオキソン誘導可能遺伝子７種のうち４種は、未知の機能を有するが、遺伝子機能割付けの共通テーマは、予想されるような薬物耐性である。
【００９５】
【表７】
この特定の実施例において、パラオキソン加水分解に関連する遺伝子の個数および示差的に調節される遺伝子のレベルは、パラオキソン誘導可能遺伝子ほど大規模ではなかった。同定された遺伝子がより少なかった理由は、（ｉ）パラオキソンのインキュベーション時間６０分が、転写プロファイルを変えるほどにパラオキソンを加水分解するには不十分であったこと、または（ｉｉ）ＯＰＨ＋プラスミドが不安定なため、パラオキソン加水分解生成物を産生できない集団中の比率（％）が高かったことに起因し得る。とは言え、示差的に発現した遺伝子３３種が、パラオキソン加水分解に関連していた。遺伝子は、次の規準：（ｉ）２倍以上の示差的発現、（ｉｉ）ｐ値＜０．０１のｔ−検定に基づく統計的有意性、（ｉｉｉ）発現の増加だけ（抑制されない）、および（ｉｖ）パラオキソンだけで誘導された遺伝子の除外に則って選択した。パラオキソン加水分解に関連する遺伝子４種の選択リストを表８に示してある。示差的発現は、誘導倍率４〜７倍に亘っていた。遺伝子産物４種のうち２種の機能は、不明である。
【００９６】
【表８】
マイクロアレイ分析により、パラオキソン誘導酵母遺伝子およびパラオキソン加水分解に関連する酵母遺伝子が同定された。これら遺伝子の幾つかは、大量に誘導され、プロモーター−レポーター遺伝子融合体の理想的候補である。
【００９７】
（実施例１１）パラオキソン誘導可能遺伝子の優先順位決定
マイクロアレイ分析で単離した遺伝子の示差的発現は、相対的ＲＴ−ＰＣＲおよび定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって個別に立証した。パラオキソン誘導可能遺伝子は、表７に列挙されている。誘導倍率に基づく優先的遺伝子は、低濃度のパラオキソンにより用量依存的（０．０５〜１．０ｍＭ）に誘導されるか否かを調べるために分析した。パラオキソンで感受性良好に誘導された優先的遺伝子は、様々な暴露時間（７．５、１５および３０分）後に調べた。酵母バイオセンサーの構築に優先される特性を示した遺伝子を優先させた。こうした遺伝子には、（ｉ）最大の誘導倍率、（ｉｉ）マイクロアレイ分析に用いた濃度（３ｍＭ）より低濃度のパラオキソンに対する感受性、および（ｉｉｉ）速やかな誘導応答時間を示すものが含まれていた。
【００９８】
相対的ＲＴ−ＰＣＲは、マイクロアレイ分析で同定した遺伝子が、パラオキソンに応答して示差的に発現するか否かを立証するために使用した。ハウスキーピング遺伝子のアクチンと対照させて設計したプライマーは、各ＰＣＲ反応に対して類似量のｃＤＮＡが使用されていることを立証するために、内部負荷対照として使用した。ＹＧＲ０３５Ｃ、ＹＬＲ３４６Ｃ、ＳＰＳ１００、ＹＯＲ１８６Ｗ、ＲＴＡ１、ＭＥＴ２８およびＹＬＬ０５６Ｃの発現量増加は、３ｍＭパラオキソンの存在下、６０分増殖させた野生型および組換えＯＰＨ＋酵母細胞について、検出された（図１１のレーンＣＰおよびＴＰ）。したがって、相対的ＲＴ−ＰＣＲは、マイクロアレイ分析で同定した遺伝子が、パラオキソンに応答して示差的に発現することを個別に立証することができた。ＹＬＲ３４６ＣおよびＹＧＲ０３５Ｃは、マイクロアレイ分析、相対的ＲＴ−ＰＣＲの双方で相当程度誘発されることが示されたので、更なる分析のために優先した。
【００９９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、パラオキソンに応答する優先遺伝子ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃの変化を定量するために、使用した。ＹＧＲ０３５Ｃは、非処理対照と比較して、パラオキソン処理細胞において３５倍〜１９０倍誘導された。ＹＬＲ３４６Ｃは、同等の実験試料について１７倍〜３１倍誘導された。したがって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃが相当程度誘発されることを確認された。
【０１００】
パラオキソン遺伝子が、マイクロアレイ分析に用いた濃度（３ｍＭパラオキソン）より低いパラオキソン濃度で感受性良好に誘導されるか否かを調べるために、ｐＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませたＳ．セレビシエＷ３０３１Ａを０．０５、０．１、０．２５、０．５および１．０ｍＭのパラオキソンに６０分間暴露した。遺伝子発現量の変化を調べるために、相対的およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。相対的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＹＯＲ１８６Ｗ、ＳＰＳ１００およびＲＴＡ１の遺伝子発現量に、より低い試験濃度では明白な変化が見られないことが示された（図１２）。対照的に、ＹＧＲ０３５Ｃは、０．５および１．０ｍＭのパラオキソンで各々１８倍および３１倍誘導された。同様に、ＹＬＲ３４６Ｃは、０．５および１．０ｍＭのパラオキソンで各々８倍および１０倍誘導された（図１３）。したがって、ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃは、ＹＯＲ１８６Ｗ、ＳＰＳ１００およびＲＴＡ１と比較して、ある範囲のパラオキソン濃度に感受性良く応答し、更なる分析のために優先された。
【０１０１】
マイクロアレイ分析では、６０分の暴露でパラオキソンにより誘導される遺伝子を同定した。速やかにパラオキソンにより誘導される遺伝子が好ましいと見込まれるので、ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃに対して、短期パラオキソンインキュベーションに応答して誘発されるその能力を調べた。ｐＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませたＳ．セレビシエを、２．５ｍＭのパラオキソンに７．５、１５、３０および６０分暴露し、相対的およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現量の変化を調べた。ＹＧＲ０３５Ｃ、ＹＬＲ３４６Ｃは共に、７．５分後に相当程度であって、最大限（各々９８倍および３２倍）に誘導された（図１４）。暴露を継続する（６０分まで）と、７．５分の初期値と比較して誘導倍率が減少した。
【０１０２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子発現量の変化を定量し、マイクロアレイ分析で同定したパラオキソン誘導可能遺伝子候補の示差的調節を確認した。ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃは、（ｉ）各々１９０倍および３２倍まで相当程度に誘導され、（ｉｉ）ある範囲のパラオキソン濃度に感受性を示し、（ｉｉｉ）パラオキソン暴露の７．５分後に誘導されるので、実施例１３〜１４において使用するために優先された。
【０１０３】
（実施例１２）パラオキソン加水分解に関連する遺伝子の優先順位決定
マイクロアレイ分析で同定した遺伝子（表８）の示差的発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって個別に立証した。
【０１０４】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、パラオキソン非存在下または存在下での野生型酵母細胞（各々ＣおよびＣＰ）、およびパラオキソン非存在下または存在下での組換えＯＰＨ＋酵母（各々ＴおよびＴＰ）から、ＹＨＬ０１２Ｗ、ＨＸＴ９、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃの発現を調べた。ＹＨＬ０１２の発現には、パラオキソン存在下もしくは非存在下で、または野生型酵母と組換え酵母との間に差がなかった（表９）。ＨＸＴ９の発現は、パラオキソンにより約３倍誘導された。しかし、野生型、組換えＯＰＨ＋双方の酵母細胞におけるパラオキソン誘導ＨＸＴ９発現からは、ＨＸＴ９誘導が、ｏｐｄ発現、したがってパラオキソン加水分解に関連していないことが示された。これは、リアルタイムＰＣＲでは、候補遺伝子ＹＨＬ０１２およびＨＸＴ９に対するマイクロアレイの結果を立証できなかったことを示している。対照的に、ＰＯＸ１発現量の増加（２．４倍）は、パラオキソン存在下の組換えＯＰＨ＋酵母でしか検出されなかったため、ＰＯＸ１発現がパラオキソン加水分解に関連していることを示した。同様に、ＹＧＲ２８７Ｃの発現は、パラオキソン存在下の組換えＯＰＨ＋酵母細胞中で９倍増加した。しかし、パラオキソンは、程度ははるかに低いとはいえ（２倍）、野生型細胞中でもＹＧＲ２８７Ｃを誘導した。
【０１０５】
【表９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲから、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃは、パラオキソン存在下の組換えＯＰＨ＋酵母中で優先して発現されることが確認されたが、このことは、誘導がパラオキソン加水分解に関連していることを示唆した。したがって、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃは、実施例１３〜１４で使用するために優先された。
【０１０６】
（実施例１３）パラオキソンを検知する酵母ＹｅＧＦＰバイオセンサー
酵母コドン最適化・強化ＧＦＰ（ＹｅＧＦＰ）遺伝子を含有するプラスミドを構築した。実施例１１で同定した優先的パラオキソン誘導可能遺伝子２種（ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃ）のプロモーター領域（−５００ｂｐおよび−１０００ｂｐ上流の断片）は、クローニングし、ＹｅＧＦＰと融合し、野生型Ｓ．セレビシエ中に形質転換した。ＹＧＲ０３５Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰの配列は示してある（図１５Ａの太字はプロモーター配列、下線はＹｅＧＦＰ遺伝子配列）。ｐＹＬＲ３４６Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰの配列は示してある（図１５Ｂの太字はプロモーター配列、下線はＹｅＧＦＰ遺伝子配列）。酵母バイオセンサーの機能性を、様々な濃度のパラオキソン存在下、様々な時間パラオキソンに暴露した後、ＹｅＧＦＰ蛍光の測定により調べた。
【０１０７】
ＹｅＧＦＰ無プロモーター酵母ベクターの構築：ＹｅＧＦＰは、アミノ酸の変更２個を有し、野生型ＧＦＰより蛍光強度が７５倍増加しているエクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰ変異体である。加えて、ＹｅＧＦＰは、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）酵母中に発現させるために、コドンが最適化されており、Ｓ．セレビシエ中でも高度の蛍光を示す（Ｃｏｒｍａｃｋ ＢＰら、（１９９７年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３巻、３０３〜１１頁）。ＹｅＧＦＰを含有するＣ．アルビカンスの株を使用した。７００ｂｐのＹｅＧＦＰ遺伝子は、プルーフリーディングポメラーゼと、鋳型としてＣ．アルビカンスＹｅＧＦＰゲノムＤＮＡとを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩのエンドヌクレアーゼ部位を含有することにより、ｐＥＳＣ−ＨＩＳの各部位内にクローニングできるように設計した。生成した「無プロモーター」ＹｅＧＦＰ−ＨＩＳプラスミドは、パラオキソン誘導プロモーターをクローニングするための多重クローニング部位（ＭＣＳ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩ）を含有していた。クローニングおよび増殖は、大腸菌ＥＲ２７３８中で行った。ＹｅＧＦＰの同一性は、ＤＮＡの配列決定により立証した。
【０１０８】
パラオキソン誘導プロモーター−ＹｅＧＦＰ融合レポータープラスミドの構築：プロモーター配列は、サッカロミセスプロモーターデータベース（ＳＣＰＤ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹが維持）を用いて当初マッピングした。このＳＣＰＤは、調節領域が既にマッピングされた酵母遺伝子に関する広範な情報を有し、全酵母遺伝子の注釈付き推定調節部位を有し、対象とする遺伝子に対するプロモーター配列および既知の調節要素を検索するための広範なツールを有している。優先的パラオキソン誘導可能遺伝子２種（ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃ）のプロモーターは、文献中で以前にはマッピングされなかったが、ＳＣＰＤを用いた５‘上流プロモーター領域を分析した結果、薬物耐性およびストレス耐性に関与する推定プロモーター調節部位が、予想通り特定された。ＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃのプロモーターを包含するために、−１０００ｂｐおよび−５００ｂｐ上流の配列（ＡＴＧに対して）を含有する、各遺伝子用の推定プロモーター断片２個をＹｅＧＦＰの前方にクローニングした。推定プロモーター領域は、鋳型としてのＳ．セレビシエＷ３０３１ＡゲノムＤＮＡと、プルーフリーディング熱安定ＤＮＡポリメラーゼとを用いてＰＣＲでクローニングした。５‘および３‘プライマーは、ｐＹｅＧＦＰ−ＨＩＳの同じ部位内に一方向クローニングをするために、各々ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を含有することにより、プロモーター−レポーター遺伝子融合体を生成した。生成したプラスミドは、−１０００および−５００プロモーター断片に対して、それぞれＦ１およびＦ２と命名した（表１１）。
【０１０９】
パラオキソン誘導プロモーター−ＹｅＧＦＰバイオセンサーのアッセイ：プロモーター領域がパラオキソンに対する感受性を付与するか否かを試験するために、ＹｅＧＦＰ蛍光アッセイを行った。Ｓ．セレビシエＢＹ４７４１をプロモーター−レポーター構築体および空の「無プロモーター」対照ベクターで形質転換した。Ｓ．セレビシエＢＹ４７４１をＳ．セレビシエＷ３０３１Ａより好んで使用したのは、Ｗ３０３１ＡがＢＹ４７４１より強い自己蛍光を示したからである。パラオキソンの存在下または非存在下、ヒスチジンを欠くＳＤｇａｌ／ｓｕｃ（３％ガラクトース、１％スクロース）中で、細胞を１５、３０、６０および１２０分、３７℃で増殖させた。細胞を遠心分離で収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中に再懸濁し、試料２点のＹｅＧＦＰ蛍光（励起および発光極大値が４８５および５２０ｎｍ）をＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ（ＢＭＧ）を用いて測定した。ＧＦＰがｐＨ感受性であるため、試料はアルカリ性緩衝液中に懸濁した。ＧＦＰは、ｐＨ７〜１１．５で安定であるが、他のｐＨでは活性を失う恐れがある（例えば、ｐＨ６では５０％低下）。したがって、幾つかの実施形態では、培地およびｐＨ配合物を最適化することにより、酵母培養物のｐＨを中性ｐＨまたはその近くに維持し得る。全ての結果は、存在細胞数（ＯＤ６００）、「無プロモーター」対照ベクター（ＹｅＧＦＰ−ＨＩＳ）に対して規格化した後、パラオキソンを欠いた細胞と比較した誘導倍率として提示している。パラオキソンの存在下でインキュベートした酵母細胞は、パラオキソンを欠いた細胞と比較してＹｅＧＦＰ蛍光の増加を示した（図１６）。ｐＹＬＲ３４６Ｃ−ＹｅＧＦＰおよびｐＹＧＲ０３５Ｃ−ＹｅＧＦＰを潜ませた酵母細胞は、３ｍＭパラオキソンとの２時間のインキュベーション後、各々５倍および３倍誘導された。パラオキソンとのインキュベーションが２時間を超えても（４、６、８および２４時間）、誘導倍率は増加しなかった（データは示されていない）。経時分析から、ＹｅＧＦＰ蛍光はパラオキソンで速やかに誘導されることが示された。例えば、ｐＹＬＲ３４６を潜ませた酵母株は、パラオキソンに僅か１５分暴露した後２倍に誘導された。
【０１１０】
このアッセイの感度を決定し、組換え酵母が異なるパラオキソン濃度に応答するか否かを調べるために、用量応答曲線を実行した。ｐＹＬＲ３４６Ｃ−Ｆ１−ＹｅＧＦＰを潜ませたＳ．セレビシエを０．１、０．２５、０．５、１．０および３ｍＭのパラオキソンと２時間インキュベートした後、ＹｅＧＦＰ蛍光のアッセイを行った。プロモーター断片ＹＬＲ３４６Ｃ−Ｆ１を潜ませたこの構築体は、３ｍＭのパラオキソンに非常に良く応答したため、この実験に対して選択した（図１６の５倍）。パラオキソン濃度が増加するにつれ、ＹｅＧＦＰの誘導量も増加した（図１７）。加えて、蛍光量は、最低試験濃度でも（０．１ｍＭパラオキソン）、僅かではあるが（１．３倍）増加した。したがって、この結果から、酵母バイオセンサーは、パラオキソンに対して用量応答を示し、０．１ｍＭパラオキソンに応答することが示された。
【０１１１】
ＹｅＧＦＰ蛍光は、パラオキソンの存在下で５倍まで誘発された。しかし、ＹｅＧＦＰ誘導量は、同一条件下で観察された遺伝子発現量の変化倍率（ＹＬＲ３４６Ｃについて３０倍）より低かった。特定の作用機構に何ら限定されるわけではないが、これは、ＹｅＧＦＰ発現を推進するプロモーター断片が最適でないことに起因し得る。各遺伝子に対して僅か２個のプロモーター断片（ＡＴＧに対しておよそ−５００および−１０００）しか、試験しなかった。幾つかの実施形態では、追加のプロモーター特性決定には、５’プロモーター欠失分析を含めることにより、パラオキソン誘導性の付与に必要なプロモーター断片を更に同定し得る。追加のプロモーター特性決定には、調節転写モチーフをやはり含有し得るＡＴＧ開始部位の３’側配列の同定も含めてもよい。
【０１１２】
その上、ＹｅＧＦＰ蛍光とＹｅＧＦＰ発現との差異は、多重コピープラスミド上にあるプロモーターから発現を誘導するのに必要な追加の転写因子（複数も）の供給により、減少させ得る。ＹＬＲ３４６Ｃプロモーターが、多重コピープラスミド上で細胞１個当たり約２０〜５０コピーで維持されているのに対し、染色体には内因性プロモーターが単一コピーしかない。したがって、パラオキソン誘導に必要な内因性転写因子は、多重の転写因子結合部位の存在により飽和している恐れがある。追加の転写因子（複数も）の供給には、プラスミドコピー数の減少を含み得る、または必要な転写因子（既知の場合）の共発現が、この制約を克服し得る。酵母のバックグランド自己蛍光は、一部の状況下では示差的な誘導発現量を低下させる恐れがある。このような場合には、バックグランド自己蛍光が比較的弱い酵母株、例えばＳ．セレビシエＢＹ４７４１の使用で、自己蛍光を相殺または克服し得る。例えば、Ｓ．セレビシエＷ３０３１Ａは、Ｓ．セレビシエＢＹ４７４１より強いバックグランド自己蛍光を示した。したがって、バイオセンサー蛍光アッセイ用の宿主増殖株としてＢＹ４７４１を使用した。
【０１１３】
パラオキソン誘導性プロモーター−ＹｅＧＦＰ融合体を潜ませた酵母細胞は、パラオキソン存在下でインキュベートしたとき、対照細胞と比較して最大５倍の蛍光増加を示した。ＹｅＧＦＰ量の増加は、パラオキソンに暴露してから１５分後に検出された。ＹｅＧＦＰバイオセンサーは、僅か０．１ｍＭのパラオキソンに感応し、パラオキソン濃度の増加につれてＹｅＧＦＰ蛍光を増加させることにより、用量依存特性を示した。この結果は、バイオセンサーとして機能し、パラオキソンの存在を検出する酵母細胞の能力を実証している。
【０１１４】
（実施例１４）パラオキソン加水分解を検出する酵母ＹＤｓＲｅｄバイオセンサー
酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄ（ＹＤｓＲｅｄ）遺伝子を含有するプラスミドを構築した。実施例１０〜１２で同定した優先的パラオキソン誘導可能遺伝子２種（ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃ）のプロモーター領域（−５００ｂｐおよび−１０００ｂｐ上流の断片）は、クローニングし、ＹＤｓＲｅｄと融合し、野生型および組換えＯＨＰ＋のＳ．セレビシエ中に形質転換した。ＹＧＲ２８７Ｃ−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄの配列は示してある（図１８Ａの太字はプロモーター配列、下線はＹＤｓＲｅｄ遺伝子配列）。ｐＰＯＸ１−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄの配列は示してある（図１８Ｂの太字はプロモーター配列、下線はＹＤｓＲｅｄ遺伝子配列）。ＹＤｓＲｅｄ蛍光を増加させる酵母バイオセンサーの能力を、野生型（対照）および組換え酵母の培養物で比較した。ＹＤｓＲｅｄ蛍光は、様々な濃度のパラオキソン存在下、様々な時間パラオキソンに暴露した後に測定した。
【０１１５】
ＹＤｓＲｅｄ無プロモーター酵母ベクターの構築：ＤｓＲｅｄエキスプレス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、サンゴ礁ディスコマ種の赤色蛍光タンパク質の変異体であって、該タンパク質の溶解度を改善するように改変され、感受性増強のために真核細胞中で高度に発現するようにコドンが最適化された変異体である。これは、ＥＧＦＰに匹敵する高い蛍光強度を生じる。とは言え、ＤｓＲｅｄエキスプレスは、Ｓ．セレビシエ中では稀にしか使用されないコドンを幾つも含有している。したがって、ＤｓＲｅｄを酵母中で発現するようにコドンを最適化した（Ｂｉｏ Ｓ ＆ Ｔが実施）（図４Ｂ）。酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄのＹＤｓＲｅｄは、好ましい酵母リボソーム結合部位と、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の対応部位にクローニングするためのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とを含有するようにも設計した。生成したｐＹＤｓＲｅｄ−ＬＥＵ無プロモーターベクターは、ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃプロモーターをクローニングするための十分なＭＣＳを含有していた。
【０１１６】
プロモーター−ＹＤｓＲｅｄ融合レポータープラスミドの構築：ＰＯＸ１およびＹＧＲ２８７Ｃのプロモーターを包含するために、およそ−１０００ｂｐおよび−５００ｂｐ上流の配列（ＡＴＧに対して）を含有する、各遺伝子用の推定プロモーター断片２個をＹＤｓＲｅｄの前方にクローニングした。推定プロモーター領域は、鋳型としてのＳ．セレビシエＷ３０３１ＡゲノムＤＮＡと、プルーフリーディング熱安定ＤＮＡポリメラーゼとを用いてＰＣＲでクローニングした。５‘および３‘プライマーは、ｐＹＤｓＲｅｄ−ＬＥＵの同等部位内に一方向クローニングをするために、各々ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を含有することにより、プロモーター−レポーター遺伝子融合体を生成した。生成したプラスミドは、−１０００および−５００プロモーター断片に対して、それぞれＦ１およびＦ２と命名した。
【０１１７】
プロモーター−ＹＤｓＲｅｄバイオセンサーのアッセイ：プロモーター領域がパラオキソン加水分解により「スイッチが入る」か否かを分析するために、ＹＤｓＲｅｄ蛍光アッセイを行った。ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（ＯＰＨを欠く対照株）を潜ませたＳ．セレビシエＢＹ４７４１を、プロモーター−レポーター構築体および空の「無プロモーター」対照ベクター（ｐＹＤｓＲｅｄ−ＬＥＵ）で形質転換した。組換えＯＰＨ＋（試験株、ＯＰＨを発現する）を類似のプラスミドで形質転換した。３ｍＭパラオキソンの存在下または非存在下、ロイシンを欠くＳＤｇａｌ／ｓｕｃ中で、細胞を４．５時間、３７℃で増殖させた。細胞を遠心分離で収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中に再懸濁し、試料２点のＹＤｓＲｅｄ蛍光（励起および発光が、各々５５４および５９０ｎｍ）を測定した。全ての結果は、存在細胞数（ＯＤ６００）、「無プロモーター」対照ベクター（ＹＤｓＲｅｄ−ＬＥＵ）に対して規格化した後、パラオキソンを欠いた細胞と比較した誘発倍率として提示している。パラオキソン存在下でインキュベートした組換えＯＰＨ＋細胞は、分析した全構築体について、パラオキソンを欠いた細胞と比較してＹＤｓＲｅｄ蛍光の誘発を示した（表１０）。誘発は２〜８倍に亘っていたが、これは、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲから得た誘発結果と同等である。重要なことには、ＯＰＨを欠いた対照株（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ空ベクター）では、同じ構築体がパラオキソン誘発性を殆どないし全く示さなかった。したがって、ＹＤｓＲｅｄはパラオキソン自体には誘発されず、誘発にはＯＰＨを必要としたので、ＹＤｓＲｅｄの誘発は、パラオキソンの加水分解と厳密に関係していることが示された。
【０１１８】
【表１０】
ｐＰＯＸ１−Ｆ２ ＹＤｓＲｅｄ融合構築体を用いて、ＹＤｓＲｅｄ誘発を調べる経時分析を行った。ｐＰＯＸ１−Ｆ２−ＹＤｓＲｅｄ融合構築体を潜ませた組換えＯＰＨ＋培養物に、パラオキソンを添加してから３０、６０、１２０および２６０分後にＹｓＤｓＲｅｄ蛍光を測定した（図１９）。パラオキソンへの暴露時間が増加するにつれ、ＹＤｓＲｅｄ誘導の着実な増加が認められた。ＹＤｓＲｅｄ蛍光は、パラオキソンに２６０分暴露後、２．５倍誘発された。このアッセイの感度を決定し、組換え酵母が異なるパラオキソン濃度に応答するか否かを調べるために、用量応答曲線を実行した。ｐＰＯＸ１−Ｆ２−ＹＤｓＲｅｄを潜ませたＳ．セレビシエＯＰＨ＋を０．１、０．２５、０．５、１．０および３ｍＭのパラオキソンと２５５分インキュベートした後、ＹＤｓＲｅｄ蛍光のアッセイを行った。パラオキソン濃度が増加するにつれ、ＹＤｓＲｅｄの誘導量も少しではあるが増加した（図２０）。したがって、この結果から、酵母バイオセンサーは、パラオキソン加水分解に対して用量応答特性を示したことが示唆される。
【０１１９】
蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄを選択した理由は、（ｉ）酵母中のレポータータンパク質として成功裏に使用されてきたこと（Ｂｅｖｉｓ ＢＪ ＆ Ｇｌｉｃｋ ＢＳ（２００２年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０巻、８３〜７頁）、（ｉｉ）安定なタンパク質であること、および（ｉｉｉ）ＹｅＧＦＰと比較して異なる分光特性を放つことであるが、ＹＤｓＲｅｄを発現する酵母培養物とバックグランド自己蛍光量（ＹＤｓＲｅｄを欠いている）との間の示差的蛍光量は、最小限であった。ＹＤｓＲｅｄの低発現量は、更なる実験および最適化に従えば克服し得る。この潜在的制約を克服し、「シグナル対ノイズ比」を上げるために、ビブリオ・ハーベイイｌｕｘＡＢレポーター遺伝子を用いることにより、ＯＰ加水分解後に生物発光を起こす酵母バイオセンサーを創製し得る。細菌系と類似の光強度を示す生物発光酵母が、生成されてきた（Ｓｚｉｔｔｎｅｒ Ｒら、（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３０９巻、６６〜７０頁）。酵母細胞は自然には生物発光を起こさないので、バックグランド量の９０００００倍近い生物発光シグナルが実現された（Ｇｕｐｔａ ＲＫら、（２００３年）Ｆｅｍｓ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ４巻、３０５〜１３頁）。その上、「過渡的」発光シグナルは（安定なＹＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質と異なり）、発光量の増減の検知を可能とし得る。したがって、生物発光シグナルは、除染過程のモニターに対する適性が高くなり得る。
【０１２０】
パラオキソン加水分解に関連するプロモーターを潜ませ、ＹＤｓＲｅｄと融合した組換えＯＰＨ＋酵母細胞は、パラオキソンの存在下で２．５〜８倍のＹＤｓＲｅｄ誘発量を示した。ＹＤｓＲｅｄ誘発は野生型酵母細胞（ＯＰＨを欠いている）では認められなかったので、ＹＤｓＲｅｄ誘発は、パラオキソンの加水分解と厳密に関係していることが示唆された。ＹＤｓＲｅｄ誘発量はパラオキソン濃度の増加と共に増加したので、この酵母バイオセンサーがパラオキソンの加水分解量に応答したことが示される。
【０１２１】
【表１１−１】
【０１２２】
【表１１−２】
【０１２３】
【表１２】
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
【表１６】
【０１２８】
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、ｏｐｄ遺伝子のＰＣＲ増幅を例示するゲルの画像である（ＭはλＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡマーカー、レーン１は陰性ＰＣＲ対照、レーン２はｏｐｄ ＰＣＲ産物）。
【図２】図２は、酵母ｐＥＳＣ−ＵＲＡプラスミド中へのｏｐｄ遺伝子のクローニングを確認するために、ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡの診断的な制限酵素消化（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ）により、１０３１ｂｐおよび６５５４ｂｐの断片（右端レーン）が産生したことを例示するゲルの画像である。
【図３】図３は、プラスミド複製用の酵母２μ起点、酵母形質転換細胞選択用のＵＲＡ３栄養要求性マーカー、発現調節用の酵母ｐＧＡＬ１プロモーター、細菌ｏｐｄ遺伝子、および転写終止用の酵母ＴＣＹＣ１終止配列を有する酵母ｏｐｄ発現プラスミドのスケッチである。
【図４−Ａ】図４Ａは、酵母コドン最適化ｏｐｄ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）を図示し、図４Ｂは、酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄエキスプレス遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号２）を図示する。
【図４−Ｂ】図４Ａは、酵母コドン最適化ｏｐｄ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）を図示し、図４Ｂは、酵母コドン最適化ＤｓＲｅｄエキスプレス遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号２）を図示する。
【図５】図５は、ｏｐｄを発現する酵母形質転換細胞を例示するゲルの画像であり、（ｉ）ｐＥＳＣ−ＵＲＡ（対照プラスミド）およびｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡをＳ．セレビシエＷ３０３１Ａ中に形質転換し、（ｉｉ）ＲＮＡを調製し、（ｉｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲを用いてｏｐｄ ｍＲＮＡ発現を調べ、（ｉｖ）アクチンを内部負荷対照として用いた画像である（Ｄｅｘはデキストロース、Ｇａｌはガラクトース）。
【図６】図６は、抑制（ｄｅｘはデキストロース）または誘導（ｇａｌはガラクトース）条件下で、対照（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）または試験（ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡ）プラスミドを潜ませたＳ．セレビシエの増殖（Ａ６００でモニター）を図示するグラフである。
【図７−Ａ】図７Ａは、パラオキソン存在下でのＳ．セレビシエＢＹ４７４１の増殖（Ａ６００でモニター）の用量依存的阻害を図示するグラフであり、図７Ｂは、１ｍＭパラオキソン存在下でのＳ．セレビシエＷ３０３１Ａ野生型（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および組換えＯＰＨ＋細胞の増殖（Ａ６００でモニター）を図示するグラフである。
【図７−Ｂ】図７Ａは、パラオキソン存在下でのＳ．セレビシエＢＹ４７４１の増殖（Ａ６００でモニター）の用量依存的阻害を図示するグラフであり、図７Ｂは、１ｍＭパラオキソン存在下でのＳ．セレビシエＷ３０３１Ａ野生型（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ）および組換えＯＰＨ＋細胞の増殖（Ａ６００でモニター）を図示するグラフである。
【図８】図８は、様々なエタノール濃度（２〜８％）の存在下、ｐＯＰＤ−ＥＳＣ−ＵＲＡを潜ませたＳ．セレビシエの増殖（Ａ６００でモニター）を図示するグラフである。
【図９−Ａ】図９Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ３の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｂは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ４の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｃは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ６の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフである。
【図９−Ｂ】図９Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ３の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｂは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ４の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｃは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ６の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフである。
【図９−Ｃ】図９Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ３の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｂは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ４の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフであり、図９Ｃは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）および膜変異株ｅｒｇ６の増殖（Ａ６００でモニター）に対する０．５ｍＭパラオキソンの効果を図示するグラフである。
【図１０−Ａ】図１０Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）の増殖に対する５００、２５０および１２５μＭのパラオキソン（ｐａｒａ）の効果を図示するグラフであり、図１０Ｂは、Ｓ．セレビシエ膜変異株ｅｒｇ６の増殖に対する５００、２５０および１２５μＭのパラオキソン（ｐａｒａ）の効果を図示するグラフである。
【図１０−Ｂ】図１０Ａは、Ｓ．セレビシエ野生型（ＢＹ４７４１）の増殖に対する５００、２５０および１２５μＭのパラオキソン（ｐａｒａ）の効果を図示するグラフであり、図１０Ｂは、Ｓ．セレビシエ膜変異株ｅｒｇ６の増殖に対する５００、２５０および１２５μＭのパラオキソン（ｐａｒａ）の効果を図示するグラフである。
【図１１】図１１は、パラオキソン誘導可能遺伝子（相対的ＲＴ−ＰＣＲによりモニター）の発現を例示するゲルの画像であり、ＲＮＡを、３ｍＭパラオキソンの非存在下または存在下で６０分インキュベートした野生型または組換え酵母から調製した画像である（Ｃはパラオキソンなしの野生型、ＣＰはパラオキソンを用いた野生型、パラオキソンなしの組換え（Ｔ）、パラオキソンを用いた組換え（ＴＰ））。
【図１２】図１２は、様々な濃度のパラオキソンと６０分インキュベートした野生型酵母の遺伝子発現（相対的ＲＴ−ＰＣＲによりモニター）を例示するゲルの画像である。
【図１３】図１３は、相対的およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりモニターした遺伝子発現の用量応答変化を例示するゲルの画像であり、ＲＮＡを、様々な濃度のパラオキソンと６０分インキュベートした野生型酵母から調製した画像である。
【図１４】図１４は、相対的およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりモニターしたＹＧＲ０３５ＣおよびＹＬＲ３４６Ｃの時間経過を例示するゲルの画像であり、ＲＮＡを、２．５ｍＭパラオキソンとインキュベートした野生型酵母から調製した画像である。
【図１５−Ａ】図１５Ａは、ＹＧＲ０３５Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号３）を図示し、図１５Ｂは、ｐＹＬＲ３４６Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号４）を図示する。
【図１５−Ｂ】図１５Ａは、ＹＧＲ０３５Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号３）を図示し、図１５Ｂは、ｐＹＬＲ３４６Ｃ−ＦＩ−ＹｅＧＦＰのＤＮＡ配列（配列番号４）を図示する。
【図１６】図１６は、３ｍＭパラオキソンの存在下、ｐＹＧＲ０３５Ｃ−Ｆ１−ＹｅＧＦＰ、ｐＹＬＲ３４６Ｃ−Ｆ１−ＹｅＧＦＰのいずれかを潜ませたＳ．セレビシエにおける、ＹｅＧＦＰ誘導の時間経過を例示するグラフである。
【図１７】図１７は、ｐＹＬＲ３４６Ｃ−Ｆ１−ＹｅＧＦＰを潜ませたＳ．セレビシエにおける、パラオキソン０．１〜３．０ｍＭ存在下１２０分でのＹｅＧＦＰ誘導の用量応答を例示するグラフである。
【図１８−Ａ】図１８Ａは、ｐＹＧＲ２８７Ｃ−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄのＤＮＡ配列（配列番号５）を図示し、図１８Ｂは、ｐＰＯＸ１−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄのＤＮＡ配列（配列番号６）を図示する。
【図１８−Ｂ】図１８Ａは、ｐＹＧＲ２８７Ｃ−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄのＤＮＡ配列（配列番号５）を図示し、図１８Ｂは、ｐＰＯＸ１−ＦＩ−ＹＤｓＲｅｄのＤＮＡ配列（配列番号６）を図示する。
【図１９】図１９は、３ｍＭパラオキソンの存在下、ｐＰＯＸ１−Ｆ２−ＹＤｓＲｅｄを潜ませた組換えＯＰＨ＋酵母における、ＹＤｓＲｅｄ誘導の時間経過を例示するグラフである。
【図２０】図２０は、ｐＰＯＸ１−Ｆ２−ＹＤｓＲｅｄを潜ませたＳ．セレビシエＯＰＨ＋における、パラオキソン０．１〜３．０ｍＭ存在下２５５分でのＹＤｓＲｅｄ誘導の用量応答を例示するグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のレポーターをコードする第１の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステルが存在する場合に該第１のレポーターの発現を推進する第１の発現制御配列、
第２のレポーターをコードする第２の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステル加水分解生成物が存在する場合に該第２のレポーターの発現を推進する第２の発現制御配列；および
該有機リン酸エステルを加水分解して有機リン酸エステル加水分解生成物を生成する、少なくとも１種の酵素；
を含む、酵母バイオセンサー。
【請求項２】
前記第１のレポーターが、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項３】
前記第２のレポーターが、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項４】
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、相異なる、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項５】
前記第１の発現制御配列が、受入番号ＹＧＲ０３５Ｃ、受入番号ＹＨＲ１３９Ｃ、受入番号ＹＯＲ１８６Ｗ、受入番号ＹＧＲ２１３Ｃ、受入番号ＹＬＲ３４６Ｃ、受入番号ＹＩＲ０１７Ｃおよび受入番号ＹＬＬ０５６Ｃからなる群から選択される遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項６】
前記第１の発現制御配列が、受入番号ＹＧＲ０３５Ｃ、受入番号ＹＨＲ１３９Ｃ、受入番号ＹＯＲ１８６Ｗ、受入番号ＹＧＲ２１３Ｃ、受入番号ＹＬＲ３４６Ｃ、受入番号ＹＩＲ０１７Ｃおよび受入番号ＹＬＬ０５６Ｃからなる群から選択される遺伝子の−１０００〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項７】
前記第２の発現制御配列が、受入番号ＹＧＬ２０５Ｗ、受入番号ＹＪＬ２１９Ｗ、受入番号ＹＧＲ２８７Ｃおよび受入番号ＹＨＬ０１２Ｗからなる群から選択される遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項８】
前記第２の発現制御配列が、受入番号ＹＧＬ２０５Ｗ、受入番号ＹＪＬ２１９Ｗ、受入番号ＹＧＲ２８７Ｃおよび受入番号ＹＨＬ０１２Ｗからなる群から選択される遺伝子の−１０００〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項９】
前記少なくとも１種の酵素が、有機リンヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、ホスホトリエステラーゼ、ＯｐｄＡ、有機リン酸アンヒドロラーゼ（ＯＰＡＡ）、ＤＦＰａｓｅおよびパラオキソナーゼ（ＰＯＮ）からなる群から選択される、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の酵素が細胞内にある、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項１１】
前記酵母バイオセンサーが、エルゴステロール生合成遺伝子中に変異を含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項１２】
有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する方法であって、
酵母を該有機リン酸エステルと接触させる工程；
該酵母からＲＮＡを収集する工程；
相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、該ＲＮＡとを接触させる工程；
各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、有機リン酸エステルと接触していない酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程；
該有機リン酸エステルと接触していない該酵母より、該有機リン酸エステルと接触した該酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程；および
該同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程；
を含む方法。
【請求項１３】
有機リン酸エステルに感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
ＹｅＧＦＰ、ＹＤｓＲｅｄ、ｌｕｘＡＢからなる群から選択されるレポーターをコードする核酸と、該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；および
該作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含む方法。
【請求項１４】
前記作動可能に連結した核酸が、酵母プラスミド中に含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記作動可能に連結した核酸の取込みは、該作動可能に連結した核酸の少なくとも１コピーの染色体中への組込みを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現制御配列が、前記同定された遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
有機リン酸エステル加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する方法であって、
該有機リン酸エステル加水分解生成物と酵母を接触させる工程；
該酵母からＲＮＡを収集する工程；
相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、該ＲＮＡとを接触させる工程；
各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、該有機リン酸エステル加水分解生成物と接触していない酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程；
該有機リン酸エステル加水分解生成物と接触していない該酵母より、有機リン酸エステル加水分解生成物と接触した該酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程；および
該同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程；
を含む方法。
【請求項１８】
有機リン酸エステル加水分解により上方調節される酵母遺伝子を同定する方法であって、
有機リン酸エステル加水分解を可能にする条件下で、有機リン酸エステルと組換えＯＰＨ＋酵母を接触させる工程；
該組換えＯＰＨ＋酵母からＲＮＡを収集する工程；
相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、その差引き済みＲＮＡとを接触させる工程；
各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、ＯＰＨを欠如し、該有機リン酸エステルと接触した酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程；
ＯＰＨを欠如し、該有機リン酸エステルと接触した該酵母より、該有機リン酸エステルと接触した該組換えＯＰＨ＋酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程；および
該同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程；
を含む方法。
【請求項１９】
有機リン酸エステル加水分解生成物に感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステル加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択されるレポーターをコードする核酸と、該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；
該作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含む方法。
【請求項２０】
前記作動可能に連結した核酸が、酵母プラスミド中に含まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記作動可能に連結した核酸の取込みは、該作動可能に連結した核酸の少なくとも１コピーの染色体中への組込みを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現制御配列が、同定された遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
有機リン酸エステルおよび該有機リン酸エステルの加水分解生成物に感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定した有機リン酸エステル感応性遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、第１のレポーターをコードする核酸と、該有機リン酸エステル発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；
該作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
該有機リン酸エステルの加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
有機リン酸エステル加水分解生成物感応性の該同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、第２のレポーターをコードする核酸と、該有機リン酸エステル加水分解生成物の発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；ならびに
該有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含み、該第１のレポーターをコードする核酸および該第２のレポーターをコードする核酸が、相異なる、方法。
【請求項２４】
前記作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸が、酵母プラスミド中に含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸が、酵母プラスミド中に含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸の取込みは、該作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸の少なくとも１コピーの染色体中への組込みを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸の取込みは、該有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸の少なくとも１コピーの染色体中への組込みを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記有機リン酸エステル発現制御配列が、前記同定した有機リン酸エステル感応性遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記有機リン酸エステル加水分解生成物の発現制御配列が、前記有機リン酸エステル加水分解生成物感応性の同定された遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
有機リン酸エステルの加水分解に感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステルの加水分解により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択されるレポーターをコードする核酸と、該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；
該作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含む方法。
【請求項３１】
有機リン酸エステルおよび該有機リン酸エステルの加水分解に感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定した有機リン酸エステル感応性遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、第１のレポーターをコードする核酸と、該有機リン酸エステル発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；
該作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
該有機リン酸エステルの加水分解により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該有機リン酸エステル加水分解生成物感応性の同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、第２のレポーターをコードする核酸と、該有機リン酸エステル加水分解生成物の発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；ならびに
該有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含み、該第１のレポーターをコードする核酸および該第２のレポーターをコードする核酸が、相異なる、方法。
【請求項１】
第１のレポーターをコードする第１の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステルが存在する場合に該第１のレポーターの発現を推進する第１の発現制御配列、
第２のレポーターをコードする第２の核酸に作動可能に連結し、有機リン酸エステル加水分解生成物が存在する場合に該第２のレポーターの発現を推進する第２の発現制御配列；および
該有機リン酸エステルを加水分解して有機リン酸エステル加水分解生成物を生成する、少なくとも１種の酵素；
を含む、酵母バイオセンサー。
【請求項２】
前記第１のレポーターが、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項３】
前記第２のレポーターが、強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項４】
前記第１のレポーターおよび前記第２のレポーターが、相異なる、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項５】
前記第１の発現制御配列が、受入番号ＹＧＲ０３５Ｃ、受入番号ＹＨＲ１３９Ｃ、受入番号ＹＯＲ１８６Ｗ、受入番号ＹＧＲ２１３Ｃ、受入番号ＹＬＲ３４６Ｃ、受入番号ＹＩＲ０１７Ｃおよび受入番号ＹＬＬ０５６Ｃからなる群から選択される遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項６】
前記第１の発現制御配列が、受入番号ＹＧＲ０３５Ｃ、受入番号ＹＨＲ１３９Ｃ、受入番号ＹＯＲ１８６Ｗ、受入番号ＹＧＲ２１３Ｃ、受入番号ＹＬＲ３４６Ｃ、受入番号ＹＩＲ０１７Ｃおよび受入番号ＹＬＬ０５６Ｃからなる群から選択される遺伝子の−１０００〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項７】
前記第２の発現制御配列が、受入番号ＹＧＬ２０５Ｗ、受入番号ＹＪＬ２１９Ｗ、受入番号ＹＧＲ２８７Ｃおよび受入番号ＹＨＬ０１２Ｗからなる群から選択される遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項８】
前記第２の発現制御配列が、受入番号ＹＧＬ２０５Ｗ、受入番号ＹＪＬ２１９Ｗ、受入番号ＹＧＲ２８７Ｃおよび受入番号ＹＨＬ０１２Ｗからなる群から選択される遺伝子の−１０００〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項９】
前記少なくとも１種の酵素が、有機リンヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、ホスホトリエステラーゼ、ＯｐｄＡ、有機リン酸アンヒドロラーゼ（ＯＰＡＡ）、ＤＦＰａｓｅおよびパラオキソナーゼ（ＰＯＮ）からなる群から選択される、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の酵素が細胞内にある、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項１１】
前記酵母バイオセンサーが、エルゴステロール生合成遺伝子中に変異を含む、請求項１に記載の酵母バイオセンサー。
【請求項１２】
有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する方法であって、
酵母を該有機リン酸エステルと接触させる工程；
該酵母からＲＮＡを収集する工程；
相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、該ＲＮＡとを接触させる工程；
各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、有機リン酸エステルと接触していない酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程；
該有機リン酸エステルと接触していない該酵母より、該有機リン酸エステルと接触した該酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程；および
該同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程；
を含む方法。
【請求項１３】
有機リン酸エステルに感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
ＹｅＧＦＰ、ＹＤｓＲｅｄ、ｌｕｘＡＢからなる群から選択されるレポーターをコードする核酸と、該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；および
該作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含む方法。
【請求項１４】
前記作動可能に連結した核酸が、酵母プラスミド中に含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記作動可能に連結した核酸の取込みは、該作動可能に連結した核酸の少なくとも１コピーの染色体中への組込みを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現制御配列が、前記同定された遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
有機リン酸エステル加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する方法であって、
該有機リン酸エステル加水分解生成物と酵母を接触させる工程；
該酵母からＲＮＡを収集する工程；
相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、該ＲＮＡとを接触させる工程；
各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、該有機リン酸エステル加水分解生成物と接触していない酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程；
該有機リン酸エステル加水分解生成物と接触していない該酵母より、有機リン酸エステル加水分解生成物と接触した該酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程；および
該同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程；
を含む方法。
【請求項１８】
有機リン酸エステル加水分解により上方調節される酵母遺伝子を同定する方法であって、
有機リン酸エステル加水分解を可能にする条件下で、有機リン酸エステルと組換えＯＰＨ＋酵母を接触させる工程；
該組換えＯＰＨ＋酵母からＲＮＡを収集する工程；
相補配列のハイブリッド形成を可能にする条件下で、酵母遺伝子に対応する特徴遺伝子座を有する酵母マイクロアレイと、その差引き済みＲＮＡとを接触させる工程；
各特徴遺伝子座における、ある測定基準のそのハイブリッド形成量を、ＯＰＨを欠如し、該有機リン酸エステルと接触した酵母由来のＲＮＡ用の対応する特徴遺伝子座における、同じ測定基準のハイブリッド形成量と比較する工程；
ＯＰＨを欠如し、該有機リン酸エステルと接触した該酵母より、該有機リン酸エステルと接触した該組換えＯＰＨ＋酵母の方が、該測定基準のハイブリッド形成量が高い特徴遺伝子座を同定する工程；および
該同定された特徴遺伝子座を個々の酵母遺伝子と相関させる工程；
を含む方法。
【請求項１９】
有機リン酸エステル加水分解生成物に感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステル加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択されるレポーターをコードする核酸と、該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；
該作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含む方法。
【請求項２０】
前記作動可能に連結した核酸が、酵母プラスミド中に含まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記作動可能に連結した核酸の取込みは、該作動可能に連結した核酸の少なくとも１コピーの染色体中への組込みを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現制御配列が、同定された遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
有機リン酸エステルおよび該有機リン酸エステルの加水分解生成物に感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定した有機リン酸エステル感応性遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、第１のレポーターをコードする核酸と、該有機リン酸エステル発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；
該作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
該有機リン酸エステルの加水分解生成物により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
有機リン酸エステル加水分解生成物感応性の該同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、第２のレポーターをコードする核酸と、該有機リン酸エステル加水分解生成物の発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；ならびに
該有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含み、該第１のレポーターをコードする核酸および該第２のレポーターをコードする核酸が、相異なる、方法。
【請求項２４】
前記作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸が、酵母プラスミド中に含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸が、酵母プラスミド中に含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸の取込みは、該作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸の少なくとも１コピーの染色体中への組込みを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸の取込みは、該有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸の少なくとも１コピーの染色体中への組込みを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記有機リン酸エステル発現制御配列が、前記同定した有機リン酸エステル感応性遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記有機リン酸エステル加水分解生成物の発現制御配列が、前記有機リン酸エステル加水分解生成物感応性の同定された遺伝子の−５００位〜−１位のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
有機リン酸エステルの加水分解に感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステルの加水分解により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択されるレポーターをコードする核酸と、該発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；
該作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含む方法。
【請求項３１】
有機リン酸エステルおよび該有機リン酸エステルの加水分解に感応する酵母バイオセンサーを調製する方法であって、
有機リン酸エステルにより上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該同定した有機リン酸エステル感応性遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、第１のレポーターをコードする核酸と、該有機リン酸エステル発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；
該作動可能に連結した有機リン酸エステル核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
該有機リン酸エステルの加水分解により上方調節される酵母遺伝子を同定する工程；
該有機リン酸エステル加水分解生成物感応性の同定された遺伝子の少なくとも１種の発現制御配列を同定する工程；
強化緑色蛍光タンパク質、酵母強化緑色蛍光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｃｏｅｒｅｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ単量体、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄエキスプレス、ＲｅｄＳｔａｒ２、ＡＳＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１および／またはＡｍＣｙａｎ１、昆虫ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、細菌生物発光、レニラルシフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、氷核タンパク質、およびそれらの組合せからなる群から選択される、第２のレポーターをコードする核酸と、該有機リン酸エステル加水分解生成物の発現制御配列を含む核酸とを作動可能に連結する工程；ならびに
該有機リン酸エステル加水分解生成物の作動可能に連結した核酸を、該核酸の取込みを可能とする条件下で細胞と接触させる工程；
を含み、該第１のレポーターをコードする核酸および該第２のレポーターをコードする核酸が、相異なる、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７−Ａ】
【図７−Ｂ】
【図８】
【図９−Ａ】
【図９−Ｂ】
【図９−Ｃ】
【図１０−Ａ】
【図１０−Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５−Ａ】
【図１５−Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８−Ａ】
【図１８−Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７−Ａ】
【図７−Ｂ】
【図８】
【図９−Ａ】
【図９−Ｂ】
【図９−Ｃ】
【図１０−Ａ】
【図１０−Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５−Ａ】
【図１５−Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８−Ａ】
【図１８−Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２００９−５１８００６（Ｐ２００９−５１８００６Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３４３７（Ｐ２００８−５４３４３７）
【出願日】平成１８年１１月２９日（２００６．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５７６１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４５６６１
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０８１５９３７４）ギルド アソシエイツ， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２９日（２００６．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５７６１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４５６６１
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０８１５９３７４）ギルド アソシエイツ， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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