卵成熟プロセス
本発明は、経済的関心のある海洋無脊椎動物由来の卵母細胞の成熟プロセスであって、当該海洋無脊椎動物由来の１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触し、それにより成熟卵母細胞が得られることをを特徴とする、卵母細胞の成熟プロセスに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋無脊椎動物、特にナマコ（sea cucumbers or holothurians）の育成（ナマコの養殖（holothuriculture））に関する。特に本発明は、海洋無脊椎動物、特にナマコの卵成熟（oocyte maturation：卵母細胞成熟）プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナマコの養殖で重要なステップの１つは、大量に受精卵を得ることである。現在使用されている方法では、ナマコを熱ショック（heat chocks）にかける。実際には、雄を、室温の水槽から、数℃高い別の水槽へと繰り返し移動させる。繁殖期にこの処置を施すと、幾つかの個体は、熱ショック（thermal chocks）をかけてから数時間のうちに配偶子を放出することができる。しかしながら、この方法の信頼性はそれほど高くなく、得られる結果はかなりランダムであり、使用されるプロトコルによってだけではなく、使用される種によっても、又は使用される雄によっても大きく変動する。
【０００３】
さらに、現在は、成熟雌の解剖によって得られる卵巣から集められる卵母細胞から、ｉｎ ｖｉｔｒｏで受精を行うことは不可能である。実際、ナマコでは、卵形成が減数分裂の第一分裂前期でブロックされる。このブロックを解除すると、さらなる卵形成が可能となり、それにより卵成熟（それにより受精が可能となる）が動物の産卵直前に自然に起こる。結果的に、ナマコでは、卵成熟プロセス（細胞周辺への核の移動、核膜の破壊、及び２つの核小体の形成を連続して包含するプロセス）が外部環境で起こる。
【０００４】
商業的に利用されるナマコの卵成熟を効率的に誘導する方法の開発は経済的関心が高く、たった１つの繁殖カップル（reproducing couple）から何十万もの受精卵を即座に得ることが可能となる（１匹の成熟雌の卵巣は、成熟を待つ数十万の卵母細胞を含有し得る）。この目的のため、様々なナマコ種について、幾つかの海洋無脊椎動物において卵成熟を誘導することが知られている分子（成熟誘導物質又はＭＩＳ）を試験した。試験した物質は、１−メチルアデニン（１ＭｅＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２，３−ジメルカプトプロパノール（ＤＭＰ又はＢＡＬ）、及びＬ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）であった。これらの分子はすべて、卵成熟の誘導率が非常に低いか、又は誘導しても、卵母細胞が受精できないか、若しくは受精はできるが異常な幼生が産まれたため、ナマコの養殖には役に立たないことが分かった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって本発明は、上記で引用した不都合を改善することを目的とする。特に本発明は、量の制限なく生存可能な幼生を得ることを考慮した、ナマコにおける卵成熟を誘導するプロセスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願人は、棘皮動物抽出物、好ましくはウニ抽出物の助けを借りて、ナマコ等の海洋無脊椎動物の卵成熟を誘導可能であることを見出した。
【０００７】
本発明は第１に、少なくとも１つの棘皮動物由来のタンパク質分画の抽出を含む、卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセスに関する。好ましくは、当該抽出は、棘皮動物の生殖腺の単離を含む。
【０００８】
本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができる棘皮動物のタンパク質抽出物、及び海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟を誘導する当該抽出物の使用にも関する。
【０００９】
本発明は、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセスであって、海洋無脊椎動物の１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触することにより、成熟卵母細胞が得られることを特徴とする、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセスにも関する。
【００１０】
したがって本発明は、ナマコの卵母細胞の成熟プロセスであって、ナマコの１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触することにより、成熟卵母細胞が得られることを特徴とする、ナマコの卵母細胞の成熟プロセスにも関する。
【００１１】
さらに本発明は、本発明によるプロセスによって得られるナマコの卵母細胞から得られるナマコの幼生にも関する。
【００１２】
本発明の他の態様、特色、及び利点は、以下の記載及びそれを説明する実施例を読むことで明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】異なるＭＩＳの存在下及び棘皮動物抽出物（以下、「ｎｉｒｉｎｅ」と称する）の存在下でインキュベートした後の、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ（ハネジナマコ）由来の卵母細胞の成熟率及び産卵率を示すグラフ（標準偏差を含む）である。２つの異なる連続記号（＋＆−又は−＆＋又はａ＆ｂ又はｂ＆ａ）は有意に異なる値を示す（クラスカルワーリス検定；有意性閾値（significant threshold）＝０．０５）。略語：濾過海水（ＯＤＭ）、１-メチルアデニン（１ＭＡ）、ジメルカプトプロパノール（ＤＭＰ又はＢＡＬ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、有効な卵成熟誘導因子を見出した。
【００１５】
「成熟」という用語は、卵母細胞を受精可能にするすべての生理的ステップ及び細胞学的ステップを含む。「卵成熟」という用語は、すべての雌性配偶子の発生プロセスを指すこともあり、それにより卵形成の同義語となる。
【００１６】
したがって本発明は、海洋無脊椎動物の卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセスであって、
（ａ）棘皮動物から少なくとも一部を単離すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた単離物を遠心すること、及び
（ｃ）上記単離物から遠心ペレットを回収することであって、それにより棘皮動物抽出物が得られる、回収すること
を含む、海洋無脊椎動物の卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセスに関する。
【００１７】
本発明の特定の実施形態によれば、上記棘皮動物はウニである。好ましくは、上記棘皮動物は正形類（又は正形ウニ）である。正形類は、明確な放射形対称（五放射相称）、ほぼ球状の殻、正反対に位置する口腔及び肛門を特徴とする。口腔は口側の面の中心にあり、周口膜（peristomeal membrane）を横切っている。肛門は反口側の面の中心にあり、頂板系とも称される頂端の円に内接する肛門周囲膜（periproctal membrane）を横切っている。
【００１８】
好ましい実施形態によれば、上記棘皮動物は、ウニ、すなわち、ウニ綱、特に真ウニ亜綱、特にエキヌス上目、特にエキヌス目、Ｐｈｙｓｏｍａｔｏｉｄａ、及びサンショウウニ目を含む群から、並びにＡｎｔｈｏｃｉｄａｒｉｓ属、Ａｒｂａｃｉａ属、Ｃｏｌｏｂｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属、Ｅｃｈｉｎｏｍｅｔｒａ属、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｒｅｐｈｕｓ属、Ｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｅｖｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｈｅｌｉｏｃｉｄａｒｉｓ属、Ｈｅｔｅｒｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属、Ｌｏｘｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｌｙｔｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｍｅｓｐｉｌｉａ属、Ｐａｒａｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属、Ｐａｒａｓａｌｅｎｉａ属、Ｐａｒｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｂｏｌｅｔｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属、Ｐｓａｍｍｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｓａｌｍａｃｉｓ属、Ｓｐｈａｅｒｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｓｔｅｒｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｓｔｏｍｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｔｅｍｎｏｐｌｅｕｒｕｓ属、Ｔｅｔｒａｐｙｇｕｓ属、Ｔｏｘｏｐｎｅｕｓｔｅｓ属、Ｔｒｉｐｎｅｕｓｔｅｓ属、Ｓｔｏｍｏｐｎｅｕｓｔｅｓ属、及びＳｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属に属するこれらのすべての種の中から選択される。
【００１９】
特定の実施形態によれば、上記プロセスは、ステップ（ａ）において、棘皮動物の器官を単離することを含み、好ましくは、当該プロセスは、ステップ（ａ）において、棘皮動物の生殖腺、好ましくは雌性生殖腺、より好ましくは棘皮動物の卵母細胞を単離することを含む。例えば、上記ステップ（ａ）は、棘皮動物の卵を単離することであり得る。
【００２０】
特定の実施形態によれば、ステップ（ｃ）の遠心ペレットは、それ自体を卵成熟の誘導に使用することができ、又は凍結乾燥することもできる。その後、凍結乾燥品は粉末にすることができる。
【００２１】
特定の実施形態によれば、ステップ（ｃ）で得られる上記棘皮動物抽出物は、タンパク質抽出物であり得る。
【００２２】
特定の実施形態によれば、上記凍結乾燥抽出物は、クロマトグラフィによって分画することができる。好ましくは、本発明によるプロセスによって得られる上記棘皮動物抽出物は、少なくとも１２０００Ｄａの少なくとも１つのタンパク質を含む、タンパク質抽出物である。
【００２３】
本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができる棘皮動物抽出物であって、タンパク質抽出物であることを特徴とする、棘皮動物抽出物にも関する。好ましくは、当該タンパク質抽出物は、棘皮動物の卵に由来する。特定の実施形態によれば、上記棘皮動物抽出物は、分子量１２０００Ｄａ超の少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００２４】
本発明による抽出物は、ナマコ等の海洋無脊椎動物由来の卵母細胞の成熟を誘導することが可能である。
【００２５】
したがって本発明は、海洋無脊椎動物、例えば棘皮動物（ヒトデ綱の棘皮動物、ウニ綱の棘皮動物、及びナマコ綱の棘皮動物等）由来の卵母細胞の成熟を誘導するための、本発明による棘皮動物抽出物の使用にも関する。好ましくは、本発明は、ナマコの卵成熟のための棘皮動物抽出物の使用に関する。
【００２６】
好ましくは、ナマコは、楯手目の（aspidochirote）ナマコであり、例えば、Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ属、Ｂｏｈａｄｓｃｈｉａ属、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ属、Ｉｓｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ属、Ｌａｂｉｄｏｄｅｍａｓ属、Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ属、Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａ属、Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ属に属するすべての種の中から選択することができる。
【００２７】
本発明は、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセスであって、成熟卵母細胞を得るために、海洋無脊椎動物の１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触することを特徴とする、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセスにも関する。
【００２８】
好ましくは、上記棘皮動物抽出物は、本発明による抽出物であるか、又は当該抽出物は、本発明によるプロセスによって得られる。
【００２９】
特定の実施形態によれば、上記プロセスは、
海洋無脊椎動物由来の卵母細胞の試料を採取すること、及び
試料を採取した卵母細胞を、有効量の上記抽出物で処理することであって、それにより当該卵母細胞の成熟を誘導する、処理すること
を含む。好ましくは、抽出物は、ウニ抽出物であり、好ましくはタンパク質抽出物である。
【００３０】
特定の実施形態によれば、上記タンパク質抽出物は、１０％〜０．０１‰、例えば５％〜０．０５‰、例えば５％〜０．１‰、例えば５％〜０．５‰の範囲の濃度、例えば４０‰、３０‰、２０‰、１５‰、１０‰、９‰、８‰、７‰、６‰、５‰、４‰、３‰、２‰、１‰、０．８‰の濃度で使用される。
【００３１】
本発明は、本発明によるプロセスによって得られる、海洋無脊椎動物、好ましくはナマコ由来の卵母細胞にも関する。
【００３２】
棘皮動物抽出物、好ましくはウニ抽出物から得られるこの誘導因子（以下、ｎｉｒｉｎｅと称する）によって、海洋無脊椎動物、特にナマコの卵巣に含有される、卵黄形成期の卵母細胞の９０％超の成熟が可能となり、これは一年中いつでも可能である（すなわち、ｎｉｒｉｎｅを使用することによって、種の本来の繁殖期中及び繁殖期外に、成熟卵母細胞（さらに受精可能）を得ることができる）。ｎｉｒｉｎｅは、ナマコの楯手目種（すなわち、ヒトの食品に利用されるすべての種のうち数百種）の卵巣に対して活性がある。ｎｉｒｉｎｅは、４℃及び凍結乾燥形態ではタンパク質の性質があり、その生物活性は、１年超の間保持される。特定の実施形態によれば、棘皮動物抽出物は、水性抽出物である。当該抽出物は、棘皮動物をすりつぶした後、遠心し、遠心ペレットを分画することによって得ることができる。
【００３３】
本発明の特定の実施形態によれば、プロセスは、有効量の上記抽出物による、卵母細胞の処理（接触）後に、当該卵母細胞の成熟が誘導されることを含む。「有効量」という用語は、結果を達成するのに十分な棘皮動物抽出物の投与量と理解する必要がある。
【００３４】
好ましい実施形態によれば、卵母細胞は、ヒトの食品で使用される楯手目のナマコから試料を採取される。
【００３５】
本発明は、ナマコの卵母細胞の成熟のための棘皮動物抽出物の使用にも関する。
【００３６】
さらに本発明は、本発明によるプロセスによって得られるナマコの卵母細胞にも関する。
【００３７】
本発明のプロセス及び棘皮動物抽出物は、経済的関心が高いため、商業的に利用されるナマコの卵成熟を効率的に誘導する方法の開発が可能となった。したがって、本発明により、例えば、たった１つの繁殖カップルから何十万もの受精可能な卵を即座に得ることが可能となる。本発明により、量の制限なく生存可能な幼生を得ることも可能となる。
【実施例】
【００３８】
本発明者らは、成熟誘導因子（ここでは「ｎｉｒｉｎｅ」と称する）を見出し、ナマコの解剖によって試料を採取した成熟卵母細胞の９０％超の受精を可能にする技法を開発した。
【実施例１】
【００３９】
他の分子と比較したｎｉｒｉｎｅの効力
成熟誘導分子は、１−メチルアデニン（１Ｍｅａ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジメルカプトプロパノール（ＢＡＬ）、及びＬ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔ）である。これらの物質をそれぞれ、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ由来の卵母細胞に対して異なる濃度で試験した。
【００４０】
図１は、海水中に入れたＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ由来の卵母細胞の成熟率（成熟卵母細胞数／観察卵母細胞数）及び受精率（受精卵数／観察卵数）を、１ＭｅＡ、ＤＭＰ（ＢＡＬ）、Ｌ−システイン、ＤＴＴ、又はｎｉｒｉｎｅのいずれかとインキュベートしたものと比較する図である。使用した分子についてそれぞれ、最大の成熟率が観察された最適な用量を示す。ＤＭＰ及び１ＭｅＡは、成熟の誘導が４０％未満である。Ｌ−システイン及びＤＴＴは、成熟の誘導が７０％超であるが、これらの分子のうち１つで処理した卵母細胞は、受精可能なものが５０％未満である。すべての場合において、受精卵からは、５日より長く生存できない異常な幼生が産まれる。一方で、卵母細胞をｎｉｒｉｎｅとインキュベートすると、成熟が誘導され、その９０％超の受精が可能となり、得られた胚は生存可能であり、発生が正常に起こる幼生及び幼若体が得られる。
【実施例２】
【００４１】
ナマコの卵母細胞の成熟に対するｎｉｒｉｎｅの効果
解剖によってナマコの卵母細胞の試料を採取した。生殖腺を手で回収し、濾過海水で２回洗浄した。次いで、生殖管（gonadic tubules）を０．５ｃｍ長の片に切断し、配偶子放出の一助とした。次に、卵母細胞を、篩（メッシュ径５００ｇｍ）を使用して、生殖管の細片から分離し、室温の濾過海水で満たした容器に入れた。試験中、最大の卵母細胞のみを使用した。
【００４２】
以下に記載する溶液のうちの１つで２時間インキュベートした後、顕微鏡で観察した最初の１００個の卵母細胞から、胚胞（germinative vesicle）を含まず、且つ極体を放出した卵母細胞の数を計数することによって、卵成熟を顕微鏡で検査した。濾過海水１０ｍｌ中でのナマコの卵母細胞のインキュベーションを陰性対照とした。所定濃度のｎｉｒｉｎｅ溶液（卵母細胞濃度４０／ｍｌ）中での卵母細胞のインキュベーションを陽性対照とした。
【００４３】
ｎｉｒｉｎｅの活性を、異なるナマコ種の卵母細胞に関して試験した：Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａ（ニセクロナマコ）、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｅｄｕｌｉｓ（アカミシキリ）、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｆｕｓｃｏｇｉｌｖａ（イシナマコ）、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｍａｃｕｌｏｓａ、Ｂｏｈａｄｓｃｈｉａ ｓｕｂｒｕｂｒａ、Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ ａｎａｎａｓ（バイカナマコ）、及びＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｔｕｂｕｌｏｓａ。すべての引用種において、濾過海水に入れた卵母細胞が１７％しか成熟しなかったのに対し、２‰のｎｉｒｉｎｅ存在下では、平均７０％の卵母細胞が成熟した。これらの種は、楯手目に属した。
【００４４】
楯手目の他の種を試験した：Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｃｉｎｅｒａｓｃｅｎｓ（クロホシアカナマコ）、Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａ ｇｒａｅｆｆｅｉ（クロテナマコ）、Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ ｅｃｈｉｎｉｔｅｓ（トゲクリイロナマコ）。２‰のｎｉｒｉｎｅ溶液中でインキュベートした、これら３つの楯手目種の卵成熟の割合は、海水に入れた卵母細胞の２５％に対し、平均で８８％であった。
【実施例３】
【００４５】
成熟を誘導するタンパク質抽出物の抽出
好ましい実施形態によるタンパク質抽出物は、ウニである、Ｔｒｉｐｎｅｕｓｔｅｓ ｇｒａｔｉｌｌａ（シラヒゲウニ）の卵由来の凍結乾燥遠心ペレットである。ナマコの卵成熟を誘導する性質は、Ｔｒｉｐｎｅｕｓｔｅｓ ｇｒａｔｉｌｌａの卵に特有なわけではない。というのも、正形ウニである、Ｓｔｏｍｏｐｎｅｕｓｔｅｓ ｖａｒｉｏｌａｒｉｓ（クロウニ）、Ｅｃｈｉｎｏｍｅｔｒａ ｍａｔｈａｅｉ（ナガウニ）、及びＰａｒａｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｌｉｖｉｄｕｓ（ヨーロッパムラサキウニ）の卵が非常に良好な結果を与えるからである（ブランクの１９％に対し、平均９２％の卵成熟）。
【００４６】
タンパク質抽出物を得るために、最初に、これらのウニの卵を刺激した。これらは、機械的ストレスによって誘導した（動物を数分間手で振盪することにより、動物が成熟した際の配偶子の自発放出を刺激した）。産まれた卵母細胞を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。５０００ｒｐｍ（１分間当たりの回転）の速度で２×１０分間遠心した新鮮な卵のペレットから、成熟誘導産物を調製した。遠心ペレットを、そのまま使用するか、又は凍結、凍結乾燥（２４時間）、粉末化して、実験時まで冷蔵庫で保存した。
【００４７】
このタンパク質抽出物粉末を、適切な濃度（２‰）で海水に希釈し、実験前に溶液を濾過した。
【００４８】
透析膜の使用により、タンパク質抽出物に含有された卵成熟誘導剤の最小分子量を確認することができた。この目的で、３ｍｌのタンパク質抽出物（２‰）を、排除バリア（exclusion barrier）（カットオフ）が１２０００Ｄａの透析膜（ＳＰＥＣＴＲＵＭ）に入れた。この膜を３ｌのトリス緩衝液を含有するビーカー中に撹拌しながら浸漬した。３ｌの緩衝液を２４時間で３回交換した。膜に含有されたｎｉｒｉｎｅを回収し、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａの卵母細胞に対して試験した。成熟試験からは、活性剤は、海水又は緩衝液のいずれに対しても２４時間透析した後もその効力をすべて保持することが示された。したがって、活性物質は１２０００Ｄａ超である。
【００４９】
作用スペクトルの大きいタンパク質消化酵素であるプロテイナーゼＫの作用により、クロマトグラフィによって得られた活性分画中に存在する成熟誘導剤がタンパク質の性質を有することを示すことができた。この目的で、クロマトグラフィによって得られた活性分画に、プロテイナーゼＫ（濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ）を、ｐＨ７、４０℃で３時間、作用させた。この溶液を１００℃で３０分間加熱することによって、プロテイナーゼＫの効果を阻害した。室温で冷却したこの溶液の活性を、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ由来の卵母細胞に対して試験した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋無脊椎動物、特にナマコ（sea cucumbers or holothurians）の育成（ナマコの養殖（holothuriculture））に関する。特に本発明は、海洋無脊椎動物、特にナマコの卵成熟（oocyte maturation：卵母細胞成熟）プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナマコの養殖で重要なステップの１つは、大量に受精卵を得ることである。現在使用されている方法では、ナマコを熱ショック（heat chocks）にかける。実際には、雄を、室温の水槽から、数℃高い別の水槽へと繰り返し移動させる。繁殖期にこの処置を施すと、幾つかの個体は、熱ショック（thermal chocks）をかけてから数時間のうちに配偶子を放出することができる。しかしながら、この方法の信頼性はそれほど高くなく、得られる結果はかなりランダムであり、使用されるプロトコルによってだけではなく、使用される種によっても、又は使用される雄によっても大きく変動する。
【０００３】
さらに、現在は、成熟雌の解剖によって得られる卵巣から集められる卵母細胞から、ｉｎ ｖｉｔｒｏで受精を行うことは不可能である。実際、ナマコでは、卵形成が減数分裂の第一分裂前期でブロックされる。このブロックを解除すると、さらなる卵形成が可能となり、それにより卵成熟（それにより受精が可能となる）が動物の産卵直前に自然に起こる。結果的に、ナマコでは、卵成熟プロセス（細胞周辺への核の移動、核膜の破壊、及び２つの核小体の形成を連続して包含するプロセス）が外部環境で起こる。
【０００４】
商業的に利用されるナマコの卵成熟を効率的に誘導する方法の開発は経済的関心が高く、たった１つの繁殖カップル（reproducing couple）から何十万もの受精卵を即座に得ることが可能となる（１匹の成熟雌の卵巣は、成熟を待つ数十万の卵母細胞を含有し得る）。この目的のため、様々なナマコ種について、幾つかの海洋無脊椎動物において卵成熟を誘導することが知られている分子（成熟誘導物質又はＭＩＳ）を試験した。試験した物質は、１−メチルアデニン（１ＭｅＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２，３−ジメルカプトプロパノール（ＤＭＰ又はＢＡＬ）、及びＬ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）であった。これらの分子はすべて、卵成熟の誘導率が非常に低いか、又は誘導しても、卵母細胞が受精できないか、若しくは受精はできるが異常な幼生が産まれたため、ナマコの養殖には役に立たないことが分かった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって本発明は、上記で引用した不都合を改善することを目的とする。特に本発明は、量の制限なく生存可能な幼生を得ることを考慮した、ナマコにおける卵成熟を誘導するプロセスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願人は、棘皮動物抽出物、好ましくはウニ抽出物の助けを借りて、ナマコ等の海洋無脊椎動物の卵成熟を誘導可能であることを見出した。
【０００７】
本発明は第１に、少なくとも１つの棘皮動物由来のタンパク質分画の抽出を含む、卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセスに関する。好ましくは、当該抽出は、棘皮動物の生殖腺の単離を含む。
【０００８】
本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができる棘皮動物のタンパク質抽出物、及び海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟を誘導する当該抽出物の使用にも関する。
【０００９】
本発明は、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセスであって、海洋無脊椎動物の１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触することにより、成熟卵母細胞が得られることを特徴とする、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセスにも関する。
【００１０】
したがって本発明は、ナマコの卵母細胞の成熟プロセスであって、ナマコの１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触することにより、成熟卵母細胞が得られることを特徴とする、ナマコの卵母細胞の成熟プロセスにも関する。
【００１１】
さらに本発明は、本発明によるプロセスによって得られるナマコの卵母細胞から得られるナマコの幼生にも関する。
【００１２】
本発明の他の態様、特色、及び利点は、以下の記載及びそれを説明する実施例を読むことで明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】異なるＭＩＳの存在下及び棘皮動物抽出物（以下、「ｎｉｒｉｎｅ」と称する）の存在下でインキュベートした後の、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ（ハネジナマコ）由来の卵母細胞の成熟率及び産卵率を示すグラフ（標準偏差を含む）である。２つの異なる連続記号（＋＆−又は−＆＋又はａ＆ｂ又はｂ＆ａ）は有意に異なる値を示す（クラスカルワーリス検定；有意性閾値（significant threshold）＝０．０５）。略語：濾過海水（ＯＤＭ）、１-メチルアデニン（１ＭＡ）、ジメルカプトプロパノール（ＤＭＰ又はＢＡＬ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、有効な卵成熟誘導因子を見出した。
【００１５】
「成熟」という用語は、卵母細胞を受精可能にするすべての生理的ステップ及び細胞学的ステップを含む。「卵成熟」という用語は、すべての雌性配偶子の発生プロセスを指すこともあり、それにより卵形成の同義語となる。
【００１６】
したがって本発明は、海洋無脊椎動物の卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセスであって、
（ａ）棘皮動物から少なくとも一部を単離すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた単離物を遠心すること、及び
（ｃ）上記単離物から遠心ペレットを回収することであって、それにより棘皮動物抽出物が得られる、回収すること
を含む、海洋無脊椎動物の卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセスに関する。
【００１７】
本発明の特定の実施形態によれば、上記棘皮動物はウニである。好ましくは、上記棘皮動物は正形類（又は正形ウニ）である。正形類は、明確な放射形対称（五放射相称）、ほぼ球状の殻、正反対に位置する口腔及び肛門を特徴とする。口腔は口側の面の中心にあり、周口膜（peristomeal membrane）を横切っている。肛門は反口側の面の中心にあり、頂板系とも称される頂端の円に内接する肛門周囲膜（periproctal membrane）を横切っている。
【００１８】
好ましい実施形態によれば、上記棘皮動物は、ウニ、すなわち、ウニ綱、特に真ウニ亜綱、特にエキヌス上目、特にエキヌス目、Ｐｈｙｓｏｍａｔｏｉｄａ、及びサンショウウニ目を含む群から、並びにＡｎｔｈｏｃｉｄａｒｉｓ属、Ａｒｂａｃｉａ属、Ｃｏｌｏｂｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属、Ｅｃｈｉｎｏｍｅｔｒａ属、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｒｅｐｈｕｓ属、Ｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｅｖｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｈｅｌｉｏｃｉｄａｒｉｓ属、Ｈｅｔｅｒｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属、Ｌｏｘｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｌｙｔｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｍｅｓｐｉｌｉａ属、Ｐａｒａｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属、Ｐａｒａｓａｌｅｎｉａ属、Ｐａｒｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｂｏｌｅｔｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属、Ｐｓａｍｍｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｓａｌｍａｃｉｓ属、Ｓｐｈａｅｒｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｓｔｅｒｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｓｔｏｍｅｃｈｉｎｕｓ属、Ｔｅｍｎｏｐｌｅｕｒｕｓ属、Ｔｅｔｒａｐｙｇｕｓ属、Ｔｏｘｏｐｎｅｕｓｔｅｓ属、Ｔｒｉｐｎｅｕｓｔｅｓ属、Ｓｔｏｍｏｐｎｅｕｓｔｅｓ属、及びＳｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ属に属するこれらのすべての種の中から選択される。
【００１９】
特定の実施形態によれば、上記プロセスは、ステップ（ａ）において、棘皮動物の器官を単離することを含み、好ましくは、当該プロセスは、ステップ（ａ）において、棘皮動物の生殖腺、好ましくは雌性生殖腺、より好ましくは棘皮動物の卵母細胞を単離することを含む。例えば、上記ステップ（ａ）は、棘皮動物の卵を単離することであり得る。
【００２０】
特定の実施形態によれば、ステップ（ｃ）の遠心ペレットは、それ自体を卵成熟の誘導に使用することができ、又は凍結乾燥することもできる。その後、凍結乾燥品は粉末にすることができる。
【００２１】
特定の実施形態によれば、ステップ（ｃ）で得られる上記棘皮動物抽出物は、タンパク質抽出物であり得る。
【００２２】
特定の実施形態によれば、上記凍結乾燥抽出物は、クロマトグラフィによって分画することができる。好ましくは、本発明によるプロセスによって得られる上記棘皮動物抽出物は、少なくとも１２０００Ｄａの少なくとも１つのタンパク質を含む、タンパク質抽出物である。
【００２３】
本発明は、本発明によるプロセスによって得ることができる棘皮動物抽出物であって、タンパク質抽出物であることを特徴とする、棘皮動物抽出物にも関する。好ましくは、当該タンパク質抽出物は、棘皮動物の卵に由来する。特定の実施形態によれば、上記棘皮動物抽出物は、分子量１２０００Ｄａ超の少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００２４】
本発明による抽出物は、ナマコ等の海洋無脊椎動物由来の卵母細胞の成熟を誘導することが可能である。
【００２５】
したがって本発明は、海洋無脊椎動物、例えば棘皮動物（ヒトデ綱の棘皮動物、ウニ綱の棘皮動物、及びナマコ綱の棘皮動物等）由来の卵母細胞の成熟を誘導するための、本発明による棘皮動物抽出物の使用にも関する。好ましくは、本発明は、ナマコの卵成熟のための棘皮動物抽出物の使用に関する。
【００２６】
好ましくは、ナマコは、楯手目の（aspidochirote）ナマコであり、例えば、Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ属、Ｂｏｈａｄｓｃｈｉａ属、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ属、Ｉｓｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ属、Ｌａｂｉｄｏｄｅｍａｓ属、Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ属、Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａ属、Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ属に属するすべての種の中から選択することができる。
【００２７】
本発明は、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセスであって、成熟卵母細胞を得るために、海洋無脊椎動物の１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触することを特徴とする、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセスにも関する。
【００２８】
好ましくは、上記棘皮動物抽出物は、本発明による抽出物であるか、又は当該抽出物は、本発明によるプロセスによって得られる。
【００２９】
特定の実施形態によれば、上記プロセスは、
海洋無脊椎動物由来の卵母細胞の試料を採取すること、及び
試料を採取した卵母細胞を、有効量の上記抽出物で処理することであって、それにより当該卵母細胞の成熟を誘導する、処理すること
を含む。好ましくは、抽出物は、ウニ抽出物であり、好ましくはタンパク質抽出物である。
【００３０】
特定の実施形態によれば、上記タンパク質抽出物は、１０％〜０．０１‰、例えば５％〜０．０５‰、例えば５％〜０．１‰、例えば５％〜０．５‰の範囲の濃度、例えば４０‰、３０‰、２０‰、１５‰、１０‰、９‰、８‰、７‰、６‰、５‰、４‰、３‰、２‰、１‰、０．８‰の濃度で使用される。
【００３１】
本発明は、本発明によるプロセスによって得られる、海洋無脊椎動物、好ましくはナマコ由来の卵母細胞にも関する。
【００３２】
棘皮動物抽出物、好ましくはウニ抽出物から得られるこの誘導因子（以下、ｎｉｒｉｎｅと称する）によって、海洋無脊椎動物、特にナマコの卵巣に含有される、卵黄形成期の卵母細胞の９０％超の成熟が可能となり、これは一年中いつでも可能である（すなわち、ｎｉｒｉｎｅを使用することによって、種の本来の繁殖期中及び繁殖期外に、成熟卵母細胞（さらに受精可能）を得ることができる）。ｎｉｒｉｎｅは、ナマコの楯手目種（すなわち、ヒトの食品に利用されるすべての種のうち数百種）の卵巣に対して活性がある。ｎｉｒｉｎｅは、４℃及び凍結乾燥形態ではタンパク質の性質があり、その生物活性は、１年超の間保持される。特定の実施形態によれば、棘皮動物抽出物は、水性抽出物である。当該抽出物は、棘皮動物をすりつぶした後、遠心し、遠心ペレットを分画することによって得ることができる。
【００３３】
本発明の特定の実施形態によれば、プロセスは、有効量の上記抽出物による、卵母細胞の処理（接触）後に、当該卵母細胞の成熟が誘導されることを含む。「有効量」という用語は、結果を達成するのに十分な棘皮動物抽出物の投与量と理解する必要がある。
【００３４】
好ましい実施形態によれば、卵母細胞は、ヒトの食品で使用される楯手目のナマコから試料を採取される。
【００３５】
本発明は、ナマコの卵母細胞の成熟のための棘皮動物抽出物の使用にも関する。
【００３６】
さらに本発明は、本発明によるプロセスによって得られるナマコの卵母細胞にも関する。
【００３７】
本発明のプロセス及び棘皮動物抽出物は、経済的関心が高いため、商業的に利用されるナマコの卵成熟を効率的に誘導する方法の開発が可能となった。したがって、本発明により、例えば、たった１つの繁殖カップルから何十万もの受精可能な卵を即座に得ることが可能となる。本発明により、量の制限なく生存可能な幼生を得ることも可能となる。
【実施例】
【００３８】
本発明者らは、成熟誘導因子（ここでは「ｎｉｒｉｎｅ」と称する）を見出し、ナマコの解剖によって試料を採取した成熟卵母細胞の９０％超の受精を可能にする技法を開発した。
【実施例１】
【００３９】
他の分子と比較したｎｉｒｉｎｅの効力
成熟誘導分子は、１−メチルアデニン（１Ｍｅａ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジメルカプトプロパノール（ＢＡＬ）、及びＬ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔ）である。これらの物質をそれぞれ、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ由来の卵母細胞に対して異なる濃度で試験した。
【００４０】
図１は、海水中に入れたＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ由来の卵母細胞の成熟率（成熟卵母細胞数／観察卵母細胞数）及び受精率（受精卵数／観察卵数）を、１ＭｅＡ、ＤＭＰ（ＢＡＬ）、Ｌ−システイン、ＤＴＴ、又はｎｉｒｉｎｅのいずれかとインキュベートしたものと比較する図である。使用した分子についてそれぞれ、最大の成熟率が観察された最適な用量を示す。ＤＭＰ及び１ＭｅＡは、成熟の誘導が４０％未満である。Ｌ−システイン及びＤＴＴは、成熟の誘導が７０％超であるが、これらの分子のうち１つで処理した卵母細胞は、受精可能なものが５０％未満である。すべての場合において、受精卵からは、５日より長く生存できない異常な幼生が産まれる。一方で、卵母細胞をｎｉｒｉｎｅとインキュベートすると、成熟が誘導され、その９０％超の受精が可能となり、得られた胚は生存可能であり、発生が正常に起こる幼生及び幼若体が得られる。
【実施例２】
【００４１】
ナマコの卵母細胞の成熟に対するｎｉｒｉｎｅの効果
解剖によってナマコの卵母細胞の試料を採取した。生殖腺を手で回収し、濾過海水で２回洗浄した。次いで、生殖管（gonadic tubules）を０．５ｃｍ長の片に切断し、配偶子放出の一助とした。次に、卵母細胞を、篩（メッシュ径５００ｇｍ）を使用して、生殖管の細片から分離し、室温の濾過海水で満たした容器に入れた。試験中、最大の卵母細胞のみを使用した。
【００４２】
以下に記載する溶液のうちの１つで２時間インキュベートした後、顕微鏡で観察した最初の１００個の卵母細胞から、胚胞（germinative vesicle）を含まず、且つ極体を放出した卵母細胞の数を計数することによって、卵成熟を顕微鏡で検査した。濾過海水１０ｍｌ中でのナマコの卵母細胞のインキュベーションを陰性対照とした。所定濃度のｎｉｒｉｎｅ溶液（卵母細胞濃度４０／ｍｌ）中での卵母細胞のインキュベーションを陽性対照とした。
【００４３】
ｎｉｒｉｎｅの活性を、異なるナマコ種の卵母細胞に関して試験した：Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａ（ニセクロナマコ）、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｅｄｕｌｉｓ（アカミシキリ）、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｆｕｓｃｏｇｉｌｖａ（イシナマコ）、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｍａｃｕｌｏｓａ、Ｂｏｈａｄｓｃｈｉａ ｓｕｂｒｕｂｒａ、Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ ａｎａｎａｓ（バイカナマコ）、及びＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｔｕｂｕｌｏｓａ。すべての引用種において、濾過海水に入れた卵母細胞が１７％しか成熟しなかったのに対し、２‰のｎｉｒｉｎｅ存在下では、平均７０％の卵母細胞が成熟した。これらの種は、楯手目に属した。
【００４４】
楯手目の他の種を試験した：Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｃｉｎｅｒａｓｃｅｎｓ（クロホシアカナマコ）、Ｐｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａ ｇｒａｅｆｆｅｉ（クロテナマコ）、Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ ｅｃｈｉｎｉｔｅｓ（トゲクリイロナマコ）。２‰のｎｉｒｉｎｅ溶液中でインキュベートした、これら３つの楯手目種の卵成熟の割合は、海水に入れた卵母細胞の２５％に対し、平均で８８％であった。
【実施例３】
【００４５】
成熟を誘導するタンパク質抽出物の抽出
好ましい実施形態によるタンパク質抽出物は、ウニである、Ｔｒｉｐｎｅｕｓｔｅｓ ｇｒａｔｉｌｌａ（シラヒゲウニ）の卵由来の凍結乾燥遠心ペレットである。ナマコの卵成熟を誘導する性質は、Ｔｒｉｐｎｅｕｓｔｅｓ ｇｒａｔｉｌｌａの卵に特有なわけではない。というのも、正形ウニである、Ｓｔｏｍｏｐｎｅｕｓｔｅｓ ｖａｒｉｏｌａｒｉｓ（クロウニ）、Ｅｃｈｉｎｏｍｅｔｒａ ｍａｔｈａｅｉ（ナガウニ）、及びＰａｒａｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｌｉｖｉｄｕｓ（ヨーロッパムラサキウニ）の卵が非常に良好な結果を与えるからである（ブランクの１９％に対し、平均９２％の卵成熟）。
【００４６】
タンパク質抽出物を得るために、最初に、これらのウニの卵を刺激した。これらは、機械的ストレスによって誘導した（動物を数分間手で振盪することにより、動物が成熟した際の配偶子の自発放出を刺激した）。産まれた卵母細胞を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。５０００ｒｐｍ（１分間当たりの回転）の速度で２×１０分間遠心した新鮮な卵のペレットから、成熟誘導産物を調製した。遠心ペレットを、そのまま使用するか、又は凍結、凍結乾燥（２４時間）、粉末化して、実験時まで冷蔵庫で保存した。
【００４７】
このタンパク質抽出物粉末を、適切な濃度（２‰）で海水に希釈し、実験前に溶液を濾過した。
【００４８】
透析膜の使用により、タンパク質抽出物に含有された卵成熟誘導剤の最小分子量を確認することができた。この目的で、３ｍｌのタンパク質抽出物（２‰）を、排除バリア（exclusion barrier）（カットオフ）が１２０００Ｄａの透析膜（ＳＰＥＣＴＲＵＭ）に入れた。この膜を３ｌのトリス緩衝液を含有するビーカー中に撹拌しながら浸漬した。３ｌの緩衝液を２４時間で３回交換した。膜に含有されたｎｉｒｉｎｅを回収し、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａの卵母細胞に対して試験した。成熟試験からは、活性剤は、海水又は緩衝液のいずれに対しても２４時間透析した後もその効力をすべて保持することが示された。したがって、活性物質は１２０００Ｄａ超である。
【００４９】
作用スペクトルの大きいタンパク質消化酵素であるプロテイナーゼＫの作用により、クロマトグラフィによって得られた活性分画中に存在する成熟誘導剤がタンパク質の性質を有することを示すことができた。この目的で、クロマトグラフィによって得られた活性分画に、プロテイナーゼＫ（濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ）を、ｐＨ７、４０℃で３時間、作用させた。この溶液を１００℃で３０分間加熱することによって、プロテイナーゼＫの効果を阻害した。室温で冷却したこの溶液の活性を、Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ ｓｃａｂｒａ由来の卵母細胞に対して試験した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセスであって、
（ａ）棘皮動物から少なくとも一部を単離すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた単離物を遠心すること、及び
（ｃ）前記単離物から遠心ペレットを回収することであって、それにより前記棘皮動物抽出物が得られる、回収すること
を含む、卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセス。
【請求項２】
前記棘皮動物がウニであることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記棘皮動物が正形ウニであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
ステップ（ａ）が、前記棘皮動物の卵を単離することを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記棘皮動物抽出物の凍結乾燥を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセスによって得ることができる棘皮動物抽出物。
【請求項７】
タンパク質抽出物であることを特徴とする、棘皮動物抽出物。
【請求項８】
前記タンパク質抽出物が前記棘皮動物の卵に由来することを特徴とする、請求項７に記載の棘皮動物抽出物。
【請求項９】
分子量１２０００Ｄａ超の少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項７又は８に記載の棘皮動物抽出物。
【請求項１０】
海洋無脊椎動物、好ましくは棘皮動物、より好ましくはナマコの卵母細胞の成熟を誘導するための、請求項６〜９のいずれか一項に記載の棘皮動物抽出物の使用。
【請求項１１】
前記棘皮動物抽出物がタンパク質抽出物であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
海洋無脊椎動物の１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触し、それにより成熟卵母細胞が得られることを特徴とする、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセス。
【請求項１３】
前記棘皮動物抽出物が請求項６〜９のいずれか一項に記載の抽出物であるか、又は該棘皮動物抽出物が請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセスによって得られることを特徴とする、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
海洋無脊椎動物由来の卵母細胞の試料を採取すること、及び
前記試料を採取した卵母細胞を、有効量の前記棘皮動物抽出物で処理することであって、それにより該卵母細胞の成熟を誘導する、処理すること
を含むことを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記棘皮動物抽出物がウニ抽出物であることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記棘皮動物抽出物がタンパク質抽出物であることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記タンパク質抽出物が、１０％〜０．０１‰の範囲の濃度で使用されることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のプロセスによって得られるナマコの卵母細胞。
【請求項１】
卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセスであって、
（ａ）棘皮動物から少なくとも一部を単離すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた単離物を遠心すること、及び
（ｃ）前記単離物から遠心ペレットを回収することであって、それにより前記棘皮動物抽出物が得られる、回収すること
を含む、卵成熟の誘導に好適な棘皮動物抽出物を得るプロセス。
【請求項２】
前記棘皮動物がウニであることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記棘皮動物が正形ウニであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
ステップ（ａ）が、前記棘皮動物の卵を単離することを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記棘皮動物抽出物の凍結乾燥を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセスによって得ることができる棘皮動物抽出物。
【請求項７】
タンパク質抽出物であることを特徴とする、棘皮動物抽出物。
【請求項８】
前記タンパク質抽出物が前記棘皮動物の卵に由来することを特徴とする、請求項７に記載の棘皮動物抽出物。
【請求項９】
分子量１２０００Ｄａ超の少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項７又は８に記載の棘皮動物抽出物。
【請求項１０】
海洋無脊椎動物、好ましくは棘皮動物、より好ましくはナマコの卵母細胞の成熟を誘導するための、請求項６〜９のいずれか一項に記載の棘皮動物抽出物の使用。
【請求項１１】
前記棘皮動物抽出物がタンパク質抽出物であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
海洋無脊椎動物の１つ又は複数の卵母細胞が、有効量の棘皮動物抽出物と接触し、それにより成熟卵母細胞が得られることを特徴とする、海洋無脊椎動物の卵母細胞の成熟プロセス。
【請求項１３】
前記棘皮動物抽出物が請求項６〜９のいずれか一項に記載の抽出物であるか、又は該棘皮動物抽出物が請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセスによって得られることを特徴とする、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
海洋無脊椎動物由来の卵母細胞の試料を採取すること、及び
前記試料を採取した卵母細胞を、有効量の前記棘皮動物抽出物で処理することであって、それにより該卵母細胞の成熟を誘導する、処理すること
を含むことを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記棘皮動物抽出物がウニ抽出物であることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記棘皮動物抽出物がタンパク質抽出物であることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記タンパク質抽出物が、１０％〜０．０１‰の範囲の濃度で使用されることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のプロセスによって得られるナマコの卵母細胞。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５４１４５７（Ｐ２００９−５４１４５７Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１７２４９（Ｐ２００９−５１７２４９）
【出願日】平成１９年７月３日（２００７．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５６６６５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００３６９１
【国際公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【出願人】（５０７３３８１３８）
【出願人】（５０９００５７６４）インスティテュート ハリュウティクエ イーティー デス サイエンシズ マリーンズ デ エル’ユニヴァルシテ デ トリアラ (1)
【出願人】（５０９００５７５３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月３日（２００７．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５６６６５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００３６９１
【国際公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【出願人】（５０７３３８１３８）
【出願人】（５０９００５７６４）インスティテュート ハリュウティクエ イーティー デス サイエンシズ マリーンズ デ エル’ユニヴァルシテ デ トリアラ (1)
【出願人】（５０９００５７５３）
【Ｆターム（参考）】
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