原核細胞で活性型の可溶性タンパク質を製造する方法及びそのためのポリシストロンベクター
原核細胞で活性型の可溶性目的タンパク質を製造する方法及びそのためのポリシストロンベクターを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原核細胞で活性型の可溶性目的タンパク質を製造する方法及びそのためのポリシストロンベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換え大腸菌を用いた外来タンパク質の生産システムは、細胞成長速度が速く、低価の基質を用いた高濃度培養が可能であり、他の生物体を用いた場合に比べると良く解明された遺伝子が使用されているので、外来タンパク質の高発現と精製の容易さのために様々な種類のベクターシステムを設計することができるという利点がある(非特許文献１)。
【０００３】
ところが、大腸菌を真核細胞由来タンパク質生産の宿主細胞として用いる場合、タンパク質の成熟に必要な細胞内要素を備えていないため、グリコシル化(glycosylation)などの翻訳後修飾(post-translational modification)過程が行われないという欠点がある。また、外来タンパク質を過量に発現する場合には、不溶性沈殿物である封入体(inclusion body)の形で細胞質内に蓄積されることが多い。
【０００４】
封入体は、目的タンパク質の生成速度と折り畳み速度間の不釣合いのため目的タンパク質の折り畳み中間体が外部に露出されている疎水性部位の相互結合によって形成される。この場合、封入体を容易に分離することができ、一般にタンパク質分解酵素の影響がより少なく、細胞内に高濃度で蓄積されるので生産性に優れるうえ、目的タンパク質を容易に分離することができるという利点を持っており、細胞内折り畳み(folding)が容易でないタンパク質の生産に利用されたりもする。ところが、封入体の形で生産された目的タンパク質は、再折り畳み過程を経て生物学的活性を回復しなければならない付加的工程を必要とする。活性型へのタンパク質の再折り畳み段階は、経験的であって必ずしも成功的に行われるのではなく、組み換えタンパク質を産業的規模に拡張して生産するには難しさがある。また、分子量の大きい抗体タンパク質、組織プラスミノゲン活性因子(tissue plasminogen activator)ｔＰＡ及び因子VIIIなどは、再折り畳み過程を介して活性のあるタンパク質の形で得るのが非常に難しいものと知られている。
【０００５】
上述したように、封入体を完全な構造と生物学的活性を呈するようにするためには再折り畳み過程を経なければならないため(非特許文献２)、細胞内でタンパク質の正しい３次構造の形成を誘導するために、いわゆるタンパク質の「細胞内折り畳み技術(in vivo protein folding technique)」を用いて可溶性タンパク質として発現している。これは、外来タンパク質を封入体の形で生産するときに誘発される問題点を改善するので、大腸菌で外来タンパク質を生産するにおいて産業的に重要な意味がある。
【０００６】
タンパク質の細胞内折り畳みのために一般に用いられている方法は、次の通りである。
【０００７】
第１の方法は、タンパク質の発現位置及び培養環境を調節する方法である。細胞質内でタンパク質を発現させると、目的タンパク質が細胞に有害なものの場合にも細胞が損傷しないうえ、大部分の場合、タンパク質の発現量が非常に多く、発現ベクターの製造が容易であるという利点がある。別の方法として、ペリプラズム(periplasm)にタンパク質を分泌させると、精製が単純になり、タンパク質分解酵素による分解が細胞質に比べて低くなり、相対的に酸化的な環境によってジスルフィド結合などがある程度可能になり、アミノ末端の分泌信号が切断されて天然型タンパク質が得られるという利点があるが、分泌されたタンパク質が凝集して封入体が形成でき、還元された折り畳みが発生する可能性がある。別の方法として、培地中にタンパク質を分泌させると、タンパク質の折り畳み問題と分解酵素による分解を解決することができるが、一般に大腸菌では倍地中にタンパク質が殆ど排出されず、排出されたとしても、タンパク質がすごく希釈されて却って精製を難しくするおそれがある。このような方法は、特定のタンパク質の場合にのみ効果があって、封入体の形成を防ぐ一般的な方法ではない。発酵工程条件の調節も、可溶性タンパク質を増加させる方法としてよく使用されており、大部分の場合、最も経済的な方法である（特許文献１）。培養温度の減少は、全てのタンパク質に適用されるのではないが、一般タンパク質の生成速度をタンパク質の折り畳み速度以下に遅めて相互凝集性の強い折り畳み中間体が蓄積されないようにするので、大部分の場合に非常に効果的な方法である(非特許文献３、非特許文献４)。
【０００８】
第２の方法は、シャペロン(chaperone)及びタンパク質フォールダーゼ(foldase)の同時発現法である。シャペロンとは、タンパク質が所望の３次構造を持つように助ける役割、及び無駄な分子間または分子内の相互作用を防止する役割をする補助タンパク質をいう。折り畳み中間体を保護して凝集及び沈殿を防止する役割をするが、大腸菌ではＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＤｎａＫ、ＨｔｐＧ、ＳｅｃＢ、ＰａｐＤなどがあり、ＰａｐＤ（細胞間膜に存在）を除いては全て細胞質に存在する（特許文献２、非特許文献５および非特許文献６）。フォールダーゼは、折り畳み段階において共有結合または異性化段階を容易にする役割をする補助タンパク質群をいう。例えば、タンパク質のジスルフィド結合の形成を促進するＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤなどがある(非特許文献７および非特許文献８)。
【０００９】
第３の方法は、融合タンパク質を用いる方法である。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(glutathione-S-transferase)、マルトース−結合タンパク質(maltose-binding protein)、タンパク質Ａ(Protein A)、腫瘍怪死因子−アルファ(tumor necrosis factor-α)、リシル−ｔＲＮＡ合成酵素などが融合タンパク質として開発された（非特許文献９、非特許文献１０、特許文献１１および特許文献３）。特許文献４には、ジスルフィドイソメラーゼ(disulphide isomerase)に融合させ、ジスルフィド結合を持つ真核細胞のタンパク質を可溶化させた。また、特許文献５では、Ｈ鎖ヒトフェリチンタンパク質と、大腸菌で不溶性の形で発現されるＬ鎖ヒトフェリチンタンパク質とを結合させ、可溶性融合タンパク質を生産したことがある。前述したように外来タンパク質を前記融合タンパク質と結合させて可溶性タンパク質の形で発現させようとする様々な試みが行われてきたが、ケース別にその影響が異なる。たとえば、各融合タンパク質の種類に応じて封入体の形で発現されることもあり、一部のみが可溶性の形で発現されることもあり、目的タンパク質に融合されるタンパク質が目的タンパク質の折り畳みを補助することもあるなど、様々な様相を示す(非特許文献１２)。
【００１０】
したがって、活性型の可溶性組み換えタンパク質を高効率及び高濃度で大量生産することが可能な技術が切実に求められている。
【特許文献１】韓国特許出願第１９９７−５００２３号
【特許文献２】韓国特許出願第２００３−７００８６５７号
【特許文献３】韓国特許出願第１９９６−４４０１０号
【特許文献４】米国特許第６，０２７，８８８号
【特許文献５】韓国特許出願第２００２−００４０４９７号
【非特許文献１】Jeffrey G. T. and Amanda A. et al, (1997), Applied Biochemistry and Biotechnology 66, 197-238
【非特許文献２】Andrew D. Guise, Shauna M. West, and Julian B. Chaudhuri (1996), Molecular Biotechnology 6, 53-64
【非特許文献３】Schein, C. H. and M. H. M. Noteborn (1988), Biotechnology 6, 291-294
【非特許文献４】More, J. T., Uppal, F. Maley and G. F. Maley (1993), Protein. Expr. Purif. 4, 160-163
【非特許文献５】Hartl, F. U., R. Holdan and T. Langer (1994), Trends Biochem. Sci. 19, 20-25
【非特許文献６】Bernadea-Clark, E. and G. Georgiou (1994), American Chem. Soc. Symp. Ser. Vol. 470, ACS
【非特許文献７】Creighton, T. E., A. Zapun and N. J. Darby (1995), TIBTECH. 13, 18-27
【非特許文献８】Gottesman, M. E. and W. A. Hendrickson (2000). Curr. Opin. Microbiol. 3, 197-202
【非特許文献９】Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988), Gene 67, 31-40
【非特許文献１０】Bedouelle, H. and Duplay, P. (1988), Euro. J. Biochem. 171, 541-549
【非特許文献１１】Nisson, B. et al. (1987), Prot. Eng. 1, 107-113
【非特許文献１２】Savvas C. Makrides (1996), Microbiological Review, 512-538
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような背景の下で、本発明者らは、遺伝子組み換え方法でタンパク質を生産するのに有用な融合タンパク質を探し出す代わりに、原核細胞で封入体として発現される外来タンパク質を活性のある形で大量製造することが可能な新しいベクターシステムを考案しようとした。
【００１２】
その結果、原核細胞で目的タンパク質遺伝子及びβ−ラクタマーゼ遺伝子がポリシストロン的に発現(polycistronic expression)する発現ベクターシステムが、目的タンパク質を過量に発現すると同時にβ−ラクタマーゼを過量に発現するので、目的タンパク質を高い割合の可溶性の形で発現し大量生産するのに効果的であるという事実を見出し、このように構築された発現システムを用いて活性のある目的タンパク質を大量生産する方法を開発することにより、本発明を完成した。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、原核細胞で発現の際に封入体を形成する外来目的タンパク質を活性型の可溶性タンパク質に製造する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記活性型の目的タンパク質を製造するためのポリシストロンベクターシステムを提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
一つの様態として、本発明は、目的タンパク質とβ−ラクタマーゼがそれぞれ第１シストロンと第２シストロンでポリシストロンの形で発現されることを特徴とする、原核細胞で活性型の可溶性目的タンパク質を生産する方法に関するものである。
【００１６】
本発明者らは、原核細胞で発現の際に封入体を形成するヒト成長ホルモンタンパク質とβ−ラクタマーゼをポリシストロン的に発現させることにより、ヒト成長ホルモンとβ−ラクタマーゼが全て過量に発現され、この際、発現されたヒト成長ホルモンが活性を示す可溶性の形であることを確認した。反面、同一の条件でβ−ラクタマーゼの代わりにカナマイシンを用いて塩基性線維芽細胞成長因子と角質細胞成長因子の発現を試験した場合には、前記目的タンパク質の大部分が封入体として発現された。これを基礎に、医薬的に有用であるが原核細胞で発現の際に封入体を形成する多様な目的タンパク質をβ−ラクタマーゼとポリシストロン的に発現させ、その結果、目的タンパク質が活性を示す可溶性の形で製造された。
【００１７】
したがって、別の様態として、本発明は、外来目的タンパク質を、活性を示す可溶性の形で製造するポリシストロンベクターに関するものである。
【００１８】
具体的様態において、本発明は、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロン、及び（iii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンを持っていることを特徴とする、原核細胞で目的タンパク質を活性型の可溶性タンパク質として発現するためのポリシストロンベクターに関するものである。
【００１９】
本願で使用された用語「ポリシストロン(polycistron)」は、一つのｍＲＮＡが同一のプロモータで合成され、各シストロンが終結コドンと開始コドンによって分離されており、各シストロンのためのリボソーム結合領域が存在して、各シストロンに該当するタンパク質が一つのプロモータで転写されたｍＲＮＡから同時に発現されるシステムをいう。ここで、「シストロン」とは、単一タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸のコート配列を意味し、シストロンは、５’開始コドンと３’終結コドンを含む。また、第１シストロン及び第２シストロンは、ＤＮＡ配列上の順序を意味するのではなく、個別的なシストロンを指称するために使用された。
【００２０】
好適な様態において、本発明のポリシストロンは、５’から３’方向に目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロンと、β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンとが作動可能に連結されるか、或いは５’から３’方向にβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンと、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロンとが作動可能に連結できる。
【００２１】
本願において使用された用語「ベクター」は、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味し、具体的には、プロモータ配列、ターミネータ配列、マーカー遺伝子、その他の適切な配列を始めとして適切な調節配列を含むように製作することができる。このようなベクターは、プラスミド、ファージ、コスミドなどであってもよい(Molecular Cloning: Laboratory Mannual second edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))。このようなベクターの製造、突然変異の誘発、配列分析、細部内へのＤＮＡの導入、遺伝子発現及びタンパク質分析法は、文献［Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)］に詳細に記載されている。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製し機能することができるか、或いは一部の場合にゲノムそれ自体に統合できる。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に用いられる形であり、本願において、「プラスミド」及び「ベクター」は時々相互交換的に使用される。本願発明の目的上、ベクターは原核細胞における発現に適切なベクターであり、外来目的タンパク質とβ−ラクタマーゼをポリシストロン的に発現させるポリシストロンベクターである。
【００２２】
本願において使用された用語「作動可能に連結された」は、発現調節配列が目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の転写及び解読を調節するように連結されたことをいい、発現調節配列（プロモータを含む）の調節の下にポリヌクレオチド配列が発現され、ポリヌクレオチド配列によってコードされる目的タンパク質のポリペプチドが生成されるように正確な解読フレームを維持させることを含む。
【００２３】
本願において使用された用語「プロモータ」は、転写を引き起こすのに十分な最小限の配列を意味し、本願発明の目的上、外部シグナルまたは作用剤によって誘導可能なプロモータを使用する。原核細胞で目的タンパク質を発現するために使用することが可能なプロモータには、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌａｃ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、ｃｓｐＡ、Ｔ７−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ３−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ５−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ４ ｇｅｎｅ ３２、ｎｐｒＭ−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒなどがある。好ましくは、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃ、Ｔ７−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ３−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ５−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ４ ｇｅｎｅ ３２、より好ましくはＴ７、ｔａｃ、Ｔ７−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、最も好ましくはＴ７プロモータである。Ｔ７プロモータは、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素によって調節され、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素の発現は、ＩＰＴＧ(isopropyl-β-D-thiogalactoside)によって調節可能である。したがって、Ｔ７プロモータは、ＩＰＴＧを用いて所望の時期に目的タンパク質の発現を誘導することができる。これは、原核宿主細胞、例えば大腸菌を培養して細胞数が増加するまで発現しないようにし、十分に大腸菌の数が増加した後に目的タンパク質の発現を誘導することが好ましいためである。
【００２４】
リボソーム結合領域は、通常、開始コドンの約１０ｂｐの前に位置しており、ファージまたは原核細胞のポリシストロンオペロンシステムでｍＲＮＡの解読を正確且つ効率的に開始し得るようにする役割を果たす。
【００２５】
本願発明のポリシストロンベクターを用いて発現させる目的タンパク質は、医薬的に利用可能な全てのタンパク質であり得る。特に、その間医薬的用途で使用することが要求されたが、遺伝子操作によって宿主細胞で大量発現されたとき、封入体を形成して不活性タンパク質を作るものと知られているタンパク質が、本願発明の目的タンパク質として使用するに適する。例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒト上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血素板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、転換成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍怪死因子（ＴＮＦ）、アンギオジェニン、アンギオテンシン、インターロイキン（ＩＬ）、組織プラスミノゲン活性因子（ｔＰＡ）などを含み、より好ましくはｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＫＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−７またはＴＰＯなどを含む。このような目的タンパク質は、天然形であってもよく、変形された形であってもよい。これらタンパク質の全体配列またはその断片を含んで欠失、置換または付加などが行われた変形体を含む。本願発明の具体例では、ｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及びＫＧＦを発現する。
【００２６】
本願発明で発現させようとする目的タンパク質は、目的タンパク質自体であリ得るが、精製を容易にし、或いは抗体または酵素と融合して様々な機能を持つようにし、或いは可溶性を増加させるために、可溶性を増加させる配列と融合させるなど、融合タンパク質の形を取ることができる。目的タンパク質が精製などを容易にするための配列を含む場合、目的タンパク質をこのような配列と融合タンパク質の形で発現させることができる。このように融合された目的タンパク質は、融合パートナー−連結ペプチド−目的タンパク質からなってもよく、それぞれの種類に応じて多様に製造されてもよい。さらに好ましくは、融合パートナーは、生産されたタンパク質の精製を容易にするためのもので、ヒスチジンが連結されたヒスチジン−ｔａｇ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(glutathione-S-transferase)、マルトース−結合タンパク質(maltose-binding protein)、タンパク質Ａ(protein A)、タンパク質Ｇ(protein G)、ｆｌａｇペプチド、チオレドキシン(thiredoxin)、Ｓ−ペプチド、アビジン(avidin)、ストレプトアビジン(streptavidine)、ガラクトース結合タンパク質(galactose binding protein)、セルロース結合ドメイン(cellulose-binding domain)、キチン結合ドメイン(chitin-binding domain)、ポリアルギニン(polyarginine)、ポリシステイン(polycysteine)またはポリフェニルアラニン(polyphenylalanine)などを利用することができ、本願発明の具体例では、ヒスチジンが１０個結合したヒスチジン−ｔａｇを利用した。このような融合パートナーと目的タンパク質とを分離させる連結ペプチドは、プロテアーゼによって切断できる配列を含み、配列特異性の強いエンテロキナーゼ、トロンビン、因子Ｘａ、ウロキナーゼ、ＴＥＶプロテアーゼ、またはスブチリシン(subtilisin)の切断配列などを用いることができる。
【００２７】
本願で使用された用語「活性型」は、組み換えベクターによって形質転換された形質転換体で安定的に発現され、完全な折り畳みを成すものであって、別途の変性または再折り畳み過程を経なくても生物学的活性を持つ可溶性タンパク質を意味する。
【００２８】
本願に使用された用語「可溶性」は、タンパク質が水溶液に容易に沈殿されず、封入体またはその他の凝集体をよく形成しない性質を意味する。
【００２９】
本願発明で使用されたβ−ラクタマーゼ（beta-lactamase；ｂｌａ）は、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を選別するための因子であって、アンピシリン(ampicillin)に対する耐性を提供するタンパク質である。本願発明のポリシストロンベクターにおいて、目的タンパク質をコードするシストロンとβ−ラクタマーゼをコードするシストロンの配列順序は任意的に変化でき、好ましくはβ−ラクタマーゼをコードするシストロンが目的タンパク質をコードするシストロンの下部に位置する。
【００３０】
本願発明の具体的実施で使用されたｐＴ０類発現ベクターは、ｐＥＴ３ａのＴ７プロモータの後ろに融合された目的タンパク質の遺伝子（融合パートナー−連結ペプチド−目的タンパク質の遺伝子）または目的タンパク質の遺伝子自体が作動可能に連結され、融合された目的タンパク質の遺伝子または目的タンパク質の遺伝子とβ−ラクタマーゼ遺伝子が同一プロモータの調節の下に転写されて目的タンパク質とβ−ラクタマーゼが過多発現されるベクターであって、融合されたｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及びＫＧＦ、または融合されていないＫＧＦ遺伝子がそれぞれ挿入されたｐＴ０１９１、ｐＴ０−ＣＳＦ、ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦが製作された。これらベクターの発現結果、対照群の場合に比べると、目的タンパク質の大部分が可溶性の活性型で発現された。
【００３１】
一方、本願発明の具体的実施で使用された対照群の発現ベクターｐＴＴ類は、発現ベクターｐＥＴ３ａのＴ７プロモータの直後に融合された目的タンパク質の遺伝子（融合パートナー−連結ペプチド−目的タンパク質の遺伝子）が作動可能に連結されたプラスミドであるが、融合された目的タンパク質の遺伝子とβ−ラクタマーゼ遺伝子がそれぞれ異なるプロモータの調節の下に調節されるベクターである。このようなベクターで形質転換された大腸菌は、融合された目的タンパク質を細胞内で過発現させることができるが、融合タンパク質の多くの量が封入体として発現された（実施例２）。別の対照群であるｐＴＲ０１９１は、発現ベクターｐＴ０１９１でβ−ラクタマーゼ遺伝子を逆方向に転換させた後、Ｔ７プロモータの直後に融合されたヒト成長ホルモン遺伝子が作動可能に連結されたプラスミドであって、目的タンパク質とβ−ラクタマーゼ遺伝子が同一プロモータの調節の下に位置していない状態であり、ｐＴＲ０１９１を宿主細胞で発現させたとき、大部分の融合タンパク質が封入体として発現され、β−ラクタマーゼは少量発現された（実施例５）。
【００３２】
したがって、具体的な一様態として、本願発明は、β−ラクタマーゼを目的タンパク質自体または目的融合タンパク質と同時に過発現させながら目的タンパク質を高い割合の活性型で発現させるために、ｐＴＥ３ａ発現ベクターから由来したｐＴ０発現ベクターに融合されたｈＧＨ（配列番号５）、Ｇ−ＣＳＦ（配列番号７）、ＩＦＮ−α２ｂ（配列番号９）、ｂＦＧＦ（配列番号１１）、ＩＧＦ−１（配列番号１３）、ＩＧＦ−２（配列番号１５）、ＫＧＦ（配列番号２３）及び融合されていないＫＧＦ（配列番号２５）をコードする遺伝子がそれぞれ挿入されたポリシストロン発現ベクターｐＴ０１９１、ｐＴ０−ＣＳＦ、ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＦＧ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦを提供する。特にｐＴ０１９１及びｐＴ０−ＩＦＮをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に、ｐＴ０−ＣＳＦをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにそれぞれ形質転換させ、その形質転換体を２００４年３月１１日に大田市儒城区魚慇洞５２番地に所在の韓国生命工学研究院内ＫＣＴＣ(Korean Collection for Type Cultures)に受託番号ＫＣＴＣ−１０６１０ＢＰ、ＫＣＴＣ−１０６１２ＢＰ及びＫＣＴＣ−１０６１１ＢＰでそれぞれ寄託した。
【００３３】
本発明のポリシストロン発現ベクターは、ＣａＣｌ２を使用する化学的方法やエレクトロポレーション(electroporation)などを含む、当業界に公知になっている任意の方法を用いて、宿主細胞内に導入し、宿主細胞を形質転換させることができる。
【００３４】
本願発明に使用された用語「形質転換」とは、ポリシストロン発現ベクターの遺伝子が発現されるように原核細胞に導入されることを意味する。
【００３５】
融合タンパク質の組み換え核酸配列がその細胞内ｍＲＮＡに適切に転写され、細胞がタンパク質を発現させることができれば、任意の原核宿主細胞が使用できるが、グラム陰性菌である大腸菌とグラム陽性菌であるバチルス菌などが好ましい。より好ましくは大腸菌、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＤ４９４（ＤＥ３）などが使用可能である。前記宿主細胞は、バクテリオファージＴ７ＲＮＡ重合酵素を持っており、これらの例に局限されない。本願発明で使用したバクテリオファージ由来Ｔ７プロモータは、大腸菌ＲＮＡ重合酵素よりバクテリオファージＴ７ＲＮＡ重合酵素によって発現されるのがさらに効率的なので(Studier FW et al. (1990), Method Enzymol. 185, 60-89)、発現ベクターｐＴ０類を、バクテリオファージＴ７ＲＮＡ重合酵素を持っているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどに形質転換させて発現させることが好ましい。本願発明のｐＴ０−ＣＳＦ発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ（ＤＥ３）、またはＡＤ４９４（ＤＥ３）に形質転換させる場合、目的融合タンパク質の７０％以上を活性型で発現させることができる。
【００３６】
したがって、別の様態として、本願発明は、前述したポリシストロン発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。具体的例示として、ｐＴ０１９１、ｐＴ０−ＣＳＦ、ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦまたはｐＴ０Ｎ−ＫＧＦで形質転換された大腸菌を含む。
【００３７】
本願発明に係る発現ベクターによって形質転換された形質転換体は、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列が発現されるように、適切な培地及び条件の下で培養する。形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させる方法は、当業界に公知になっている。例えば、形質転換体が成長し得る適切な培地に接種して種培養を行った後、これを本培養用培地に接種し、適切な条件で培養することにより、タンパク質の発現を誘導することができる。本培養の際、菌体成長段階と組み換えタンパク質の発現誘導段階を区別して実施することにより、組み換えタンパク質の生産性及び収率を増加させることができる。
【００３８】
したがって、別の様態として、本発明は、前述した形質転換体を培養し、培養物から可溶性目的タンパク質を回収する段階を含む、活性型の可溶性タンパク質を生産する方法を提供する。
【００３９】
形質転換体を培養して前記培養物から実質的に純粋な目的タンパク質を回収することにより、これを医薬的に使用することができる。組み換えタンパク質の回収は、当業界に公知になっている多様な分離及び精製方法によって達成することができる。通常、細胞残屑(cell debris)などを除去するために、前記細胞溶解物などを遠心分離した後、沈殿、透析、各種カラムクロマトグラフィーなどを適用する。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相−ＨＰＬＣ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、親和性カラムなどは、カラムクロマトグラフィーの例である。
【００４０】
本願発明に係る可溶性活性型タンパク質の精製は、細胞破砕、遠心分離の後に再折り畳み工程(refolding process)を経なくても、超濾過やイオン交換クロマトグラフィーなどの一般な精製方法によって達成される。これにより、分離して活性型の目的タンパク質を容易に得ることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００４２】
（実施例１：発現ベクターｐＴＴ１９１の構築）
本発明の対照群として、ヒト成長ホルモンを含有した融合タンパク質の大量が封入体として発現されるｐＴＴ１９１を製造した。
【００４３】
ヒスチジン−ｔａｇ及びエンテロキナーゼ認識配列に連結されたヒト成長ホルモン融合タンパク質（配列番号５）を合成するために、ＰＣＲライゲーション法(Willem P.C. Stemmer, and Herbert L. Heyneker (1995) Gene 164, 49-53; Scott W. Altmann, and Robert A. Kastelein (1995) Protein Expression and Purification 6, 722-726; Ana Paula de Mattos Areas, and Paulo Lee Ho (2002) Protein Expression and Purification 25, 481-487)を用いて融合ヒト成長ホルモン遺伝子を製造した。ＰＣＲライゲーション法は、次のような方法で行った。ＰＣＲチューブに、相補的に２０個の塩基配列が重なり合った合成オリゴヌクレオチド対をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）２．５Ｕ（１μＬ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ、日本）２Ｌ、ｐｆｕ重合酵素緩衝１０倍液２μＬを順次入れた後、最終体積が２０μＬとなるように滅菌蒸留水を入れ、その後ＰＣＲ機械（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を用いて反応を行った。この際、各オリゴヌクレオチドは、テンプレートであると同時にプライマーとして作用する。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分間変性させた後、９５℃で１分、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒間反応を２０回繰り返し行った後、さらに７２℃で１０分間反応させた。各産物の末端に相補的な塩基（２０ｂｐ）配列を有する２種のＰＣＲ産物を重合酵素連鎖反応のチューブに５μＬずつ投入し、ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）２．５Ｕ（１μＬ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ、日本）２μＬ、ｐｆｕ重合酵素緩衝１０倍液２μＬを順次入れた後、最終体積が２０μＬとなるように滅菌蒸留水を入れ、ＰＣＲ機械（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を用いて反応を行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性させた後、９５℃で１分、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒間反応を２０回繰り返し行い、さらに７２℃で１０分間反応させた。このような反応を繰り返し行い、最終段階のＰＣＲ反応は３０回行って合成遺伝子を獲得した。合成された遺伝子は１％アガロースゲルに展開してＱＩＡＱｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いて合成遺伝子を分離した。その結果、ヒスチジン−ｔａｇ（配列番号１）及びエンテロキナーゼ認識配列（配列番号３）を含み、両端に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を含んでいる融合されたヒト成長ホルモン（ソマトトロピン）遺伝子（配列番号５）を製造した。その後、発現ベクターｐＴＴ１９１は、図１に示すように製造された。合成された融合遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩで処理して１％アガロースゲル電気泳動して分離、精製し、ＮｄｅＩと牛の小腸アルカリリン酸分解酵素(calf intestine alkine phosphatase、ＣＩＡＰ)（ＮＥＢ、米国）で処理されたｐＥＴ３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）と混合した。ＣＩＡＰ処理は、ＮｄｅＩによって切断されたｐＥＴ３ａのセルフライゲーション(self ligation)を防止するために３７℃で１時間反応した。融合遺伝子とｐＥＴ３ａの混合物は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、米国）で１６℃で１８時間反応させて連結してｐＴＴ１９１を製造した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質転換した。形質転換体でプラスミドを精製してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）菌株に形質転換させた。発現ベクターｐＴＴ９１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体は、アンピシリン（２００ｇ／ｍＬ）が含まれたＬＢ平板培地から選別され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＴ１９１と命名した。発現ベクターｐＴＴ１９１にヒト成長ホルモンの遺伝子を含んだ融合遺伝子が正しく挿入されたかを制限酵素ＡｌｗｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断した後、ＤＮＡ配列分析によって遺伝子配列を確認した。
【００４４】
（実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＴ１９１形質転換体での融合ヒト成長ホルモンの発現）
対照群である発現ベクターｐＴＴ１９１で形質転換された大腸菌におけるヒト成長ホルモン含有融合タンパク質の発現様相を調査した。
【００４５】
発現ベクターｐＴＴ１９１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＴ１９１をＬＢ培地(Luria-Bertani medium)で３０℃、１２時間培養した後、ＩＰＴＧ(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)で融合タンパク質の発現を誘導した。培養の後、遠心分離によって細胞を回収した後、細胞を破砕し、上澄み液を分離して融合タンパク質の発現を確認した。その結果、図２に示すように、ヒト成長ホルモン含有融合タンパク質が予測した約２４ｋＤａのサイズと一致したが、大部分は封入体として発現された。
【００４６】
（実施例３：発現ベクターｐＴ０１９１の構築）
ヒト成長ホルモン含有融合タンパク質を大量の可溶性タンパク質として発現するためのｐＴ０１９１を製造した。
【００４７】
融合ヒト成長ホルモンタンパク質をコードする遺伝子をｐＥＴ３ａベクターに挿入するために、ｐＴＴ１９１をテンプレートとし、配列の端部に制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄｅIII認識部位が含まれるようにＰＣＲを次の条件で行った。重合酵素連鎖反応チューブに、テンプレートとしてのｐＴＴ１９１プラスミド（実施例１）１００ｎｇ、ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）２．５Ｕ（１μＬ）、プライマーＡ（５’-ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣ−３’、配列番号１９）３０ｐｍｏｌｅ、プライマーＢ（５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣ−３’、配列番号２０）３０ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ、日本）２μＬ、ｐｆｕ重合酵素緩衝１０倍液２μＬを順次入れた後、最終体積が２０μＬとなるように滅菌蒸留水を入れ、その後ＰＣＲ機械（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を用いて反応を行った。反応条件は、９４℃で５分間変性させた後、９５℃で１分、５８℃で３０秒、７２℃で２分間反応を３０回繰り返し行い、さらに７２℃で１０分間反応させることである。製造された遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで処理して１％アガロースゲル電気泳動によって分離、精製した。発現ベクターｐＥＴ３ａは、制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで処理して１％アガロースゲル電気泳動によって４１１９ｂｐサイズの切片を分離、精製して回収した。制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIでそれぞれ処理した融合遺伝子とｐＥＴ３ａ切片をＴ４ ＤＮＡリガーゼで１６℃で１８時間反応させて連結してｐＴ０１９１を製造した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０に形質転換した（図３）。前記形質転換体でプラスミドを精製してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換させた。発現ベクターｐＴ０１９１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体は、アンピシリン２００ｇ／ｍＬが含まれているＬＢ平板培地で選別され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１（ＫＣＴＣ１０６１０ＢＰ）と命名した。ヒト成長ホルモンの遺伝子を含んだ融合遺伝子が発現ベクターｐＴ０１９１に正しく挿入されたかを、制限酵素ＡｌｗｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断した後、ＤＮＡ配列分析によって遺伝子配列を確認した。
【００４８】
（実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１形質転換体での融合ヒト成長ホルモンの発現）
発現ベクターｐＴ０１９１で形質転換された大腸菌におけるヒト成長ホルモン含有融合タンパク質の発現様相を調査した。
【００４９】
発現ベクターｐＴ０１９１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１をＬＢ培地で３０℃、１２時間培養した後、ＩＰＴＧで融合タンパク質の発現を誘導し、ヒト成長ホルモン含有融合タンパク質の発現を確認した。発現された融合タンパク質は、図４に示すように、発現された融合タンパク質の大部分が活性型で発現されて上澄み液に存在し、その大きさは約２４ｋＤａであった。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＴ１９１形質転換体の場合とは異なり、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１形質転換体では、目的とした融合タンパク質と共にβ−ラクタマーゼも過発現されることを確認することができた。Ｎ末端の配列分析によって、発現されたβ−ラクタマーゼを確認することができた。
【００５０】
（実施例５：発現プラスミドｐＴＲ０１９１の構築及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＲ０１９１形質転換体でのヒト成長ホルモンの発現）
実施例３で構築されたｐＴ０１９１プラスミドをＳｐｈＩ／ＨｉｎｄIIIで処理して３８１２ｂｐサイズの切片を精製して準備し、ｐＴ０１９１プラスミドにおいてβ−ラクタマーゼに該当する遺伝子を、２つのプライマー（プライマー１：５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡ−３’（配列番号２１）、プライマー２：５’−ＡＡＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２２））を用いてＰＣＲによって増幅させ、ＳｐｈＩとＨｉｎｄIII制限酵素の方向が変わった９５０ｂｐサイズの切片を得て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで接合することにより、ヒト成長ホルモンとβ−ラクタマーゼ遺伝子配列の方向が異なるｐＴＲ０１９１プラスミドを製造した（図５）。製造されたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて３０℃で発現を確認した。図６に示すように、発現された目的タンパク質は、大部分が封入体として発現され、β−ラクタマーゼの発現量は、ｐＴ０１９１の場合に比べて少量であった。
【００５１】
（実施例６：発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦの構築）
ヒト顆粒球コロニー刺激因子を含む融合タンパク質を大量の可溶性タンパク質として発現するためのｐＴ０−ＣＳＦを製造した。ヒスチジン−ｔａｇ及びエンテロキナーゼ認識配列に連結されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号７）を、実施例１と同様にＰＣＲライゲーション方法で合成し、実施例３と同様にベクターを構成した（図３）。発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ０-ＣＳＦ（ＫＣＴＣ１０６１１ＢＰ）と命名し、ヒト顆粒球コロニー刺激因子の遺伝子を含んだ融合遺伝子が発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦに正しく挿入されたかを、制限酵素ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄIIIで切断した後、ＤＮＡ配列分析によって遺伝子配列を確認した。
【００５２】
（実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ０−ＣＳＦ形質転換体での融合ヒト顆粒球コロニー刺激因子の発現）
発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦで形質転換された大腸菌におけるヒト顆粒球コロニー刺激因子含有融合タンパク質の発現様相を調査した。
【００５３】
発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｂ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ０−ＣＳＦをＬＢ培地で３０℃、１２時間培養した後、ＩＰＴＧで融合タンパク質の発現を誘導した。発現された融合タンパク質は、図７に示すように、発現されたヒト顆粒球コロニー刺激因子含有融合タンパク質の大部分が活性型で発現されて上澄み液に存在し、その大きさは約２０ｋＤａであった。発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｂ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ０−ＣＳＦにおいても、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１形質転換体の場合と同じように、目的とした融合−ヒト顆粒球コロニー刺激因子と共にβ−ラクタマーゼが過発現された。
【００５４】
また、発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）及びＥ．ｃｏｌｉ ＡＤ４９４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に形質転換させて融合−ヒト顆粒球コロニー刺激因子の発現を確認した結果、表１（ｐＴ０−ＣＳＦの宿主細胞の種類によって融合−ヒト顆粒球コロニー刺激因子の発現様相を比較）に示すように、融合タンパク質の大部分が活性型で発現されることが分かった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
（実施例８：発現ベクターｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦの構築）
様々な目的タンパク質自体または目的タンパク質を含む融合タンパク質を大量の可溶性タンパク質として発現するためのｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦを製造した。ヒスチジン−ｔａｇ及びエンテロキナーゼ認識配列に連結されたインターフェロン−アルファ２ｂ融合タンパク質（配列番号９）、塩基性線維芽細胞成長因子融合タンパク質（配列番号１１）、インシュリン様成長因子−１融合タンパク質（配列番号１３）、インシュリン様成長因子−２融合タンパク質（配列番号１５）、角質細胞成長因子融合タンパク質（配列番号２３）、及び融合されていない角質細胞成長因子タンパク質自体（配列番号２５）をコードする遺伝子を、実施例１と同様のＰＣＲライゲーション合成方法で製造し、ｐＥＴ３ａベクターに融合タンパク質を挿入するためにコード遺伝子の配列の端部に制限酵素ＮｄｅＩ認識部位と制限酵素ＨｉｎｄIII認識部位が含まれるようにデザインした。製造された遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで処理して１％アガロースゲル電気泳動して分離、精製した。発現ベクターＰＥＴ３ａは、制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで処理して１％アガロースゲル電気泳動によって４１１９ｂｐサイズの切片を分離、精製して回収した。制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIでそれぞれ処理した融合遺伝子とｐＥＴ３ａ切片をＴ４ＤＮＡリガーゼで１６℃で１８時間反応させて連結してそれぞれ発現ベクターｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＦＧ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦを製造した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０に形質転換した。前記形質転換体でプラスミドを精製してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株にそれぞれ形質転換させた。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＡｌｗｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断した後、ＤＮＡ配列分析によって遺伝子配列を確認した。
【００５７】
（実施例９：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＦＧ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦ形質転換体での各目的タンパク質の発現）
発現ベクターｐＴ０−ＩＦＮ、Ｔ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＦＧ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦそれぞれで形質転換されたそれぞれの大腸菌におけるそれぞれの目的タンパク質の発現様相を調査した。
【００５８】
前記発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地で３０℃、１２時間培養した後、ＩＰＴＧで各目的タンパク質の発現を誘導した。その結果をそれぞれ図８〜図１３に示した。図示の如く、それぞれの発現されたタンパク質は、大部分が上澄み液に存在して可溶性活性タンパク質として発現されるのを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によってβ−ラクタマーゼと目的タンパク質を共に過発現する発現ベクターを提供することにより、原核細胞で発現の際に封入体を形成する外来目的タンパク質を可溶性の活性型で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１はヒト成長ホルモン遺伝子が挿入された発現ベクターＰＴＴ１９１を製造する過程を図式化して示す。
【図２】図２は発現ベクターｐＴＴ１９をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、ヒト成長ホルモンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：ヒト成長ホルモン標準品、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物。）
【図３】図３はそれぞれヒト成長ホルモン遺伝子及びヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子が挿入された発現ベクターｐＴ０１９１及びＰＴ０−ＣＳＦを製造する過程を図式化して示す。
【図４】図４は発現ベクターｐＴ０１９１をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、ヒト成長ホルモンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：ヒト成長ホルモン標準品、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た全体タンパク質、レイン４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン５：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物。）
【図５】図５はβ−ラクタマーゼが逆方向に置換された発現ベクターにヒト成長ホルモン遺伝子が挿入されたｐＴＲ０１９１を示す。
【図６】図６は発現ベクターｐＴＲ０１９１をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、ヒト成長ホルモンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：ヒト成長ホルモン標準品、レイン３及び４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン５及び６：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図７】図７は発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換させた後、ヒト顆粒球コロニー成長因子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導前の形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン３及び４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン５及び６：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物。）
【図８】図８は発現ベクターｐＴ０−ＩＦＮをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、インターフェロン−アルファ２ｂの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図９】図９は発現ベクターｐＴ０−ｂＦＧＦをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、塩基性線維芽細胞成長因子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図１０】図１０は発現ベクターｐＴ０−ＩＧＦ１をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、インシュリン様成長因子−１の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図１１】図１１は発現ベクターｐＴ０−ＩＧＦ２をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、インシュリン様成長因子−２の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図１２】図１２は発現ベクターｐＴ０−ＫＧＦをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、角質細胞成長因子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図１３】図１３は発現ベクターｐＴ０Ｎ−ＫＧＦをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、角質細胞成長因子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導前の形質転換体全体、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物。）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原核細胞で活性型の可溶性目的タンパク質を製造する方法及びそのためのポリシストロンベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換え大腸菌を用いた外来タンパク質の生産システムは、細胞成長速度が速く、低価の基質を用いた高濃度培養が可能であり、他の生物体を用いた場合に比べると良く解明された遺伝子が使用されているので、外来タンパク質の高発現と精製の容易さのために様々な種類のベクターシステムを設計することができるという利点がある(非特許文献１)。
【０００３】
ところが、大腸菌を真核細胞由来タンパク質生産の宿主細胞として用いる場合、タンパク質の成熟に必要な細胞内要素を備えていないため、グリコシル化(glycosylation)などの翻訳後修飾(post-translational modification)過程が行われないという欠点がある。また、外来タンパク質を過量に発現する場合には、不溶性沈殿物である封入体(inclusion body)の形で細胞質内に蓄積されることが多い。
【０００４】
封入体は、目的タンパク質の生成速度と折り畳み速度間の不釣合いのため目的タンパク質の折り畳み中間体が外部に露出されている疎水性部位の相互結合によって形成される。この場合、封入体を容易に分離することができ、一般にタンパク質分解酵素の影響がより少なく、細胞内に高濃度で蓄積されるので生産性に優れるうえ、目的タンパク質を容易に分離することができるという利点を持っており、細胞内折り畳み(folding)が容易でないタンパク質の生産に利用されたりもする。ところが、封入体の形で生産された目的タンパク質は、再折り畳み過程を経て生物学的活性を回復しなければならない付加的工程を必要とする。活性型へのタンパク質の再折り畳み段階は、経験的であって必ずしも成功的に行われるのではなく、組み換えタンパク質を産業的規模に拡張して生産するには難しさがある。また、分子量の大きい抗体タンパク質、組織プラスミノゲン活性因子(tissue plasminogen activator)ｔＰＡ及び因子VIIIなどは、再折り畳み過程を介して活性のあるタンパク質の形で得るのが非常に難しいものと知られている。
【０００５】
上述したように、封入体を完全な構造と生物学的活性を呈するようにするためには再折り畳み過程を経なければならないため(非特許文献２)、細胞内でタンパク質の正しい３次構造の形成を誘導するために、いわゆるタンパク質の「細胞内折り畳み技術(in vivo protein folding technique)」を用いて可溶性タンパク質として発現している。これは、外来タンパク質を封入体の形で生産するときに誘発される問題点を改善するので、大腸菌で外来タンパク質を生産するにおいて産業的に重要な意味がある。
【０００６】
タンパク質の細胞内折り畳みのために一般に用いられている方法は、次の通りである。
【０００７】
第１の方法は、タンパク質の発現位置及び培養環境を調節する方法である。細胞質内でタンパク質を発現させると、目的タンパク質が細胞に有害なものの場合にも細胞が損傷しないうえ、大部分の場合、タンパク質の発現量が非常に多く、発現ベクターの製造が容易であるという利点がある。別の方法として、ペリプラズム(periplasm)にタンパク質を分泌させると、精製が単純になり、タンパク質分解酵素による分解が細胞質に比べて低くなり、相対的に酸化的な環境によってジスルフィド結合などがある程度可能になり、アミノ末端の分泌信号が切断されて天然型タンパク質が得られるという利点があるが、分泌されたタンパク質が凝集して封入体が形成でき、還元された折り畳みが発生する可能性がある。別の方法として、培地中にタンパク質を分泌させると、タンパク質の折り畳み問題と分解酵素による分解を解決することができるが、一般に大腸菌では倍地中にタンパク質が殆ど排出されず、排出されたとしても、タンパク質がすごく希釈されて却って精製を難しくするおそれがある。このような方法は、特定のタンパク質の場合にのみ効果があって、封入体の形成を防ぐ一般的な方法ではない。発酵工程条件の調節も、可溶性タンパク質を増加させる方法としてよく使用されており、大部分の場合、最も経済的な方法である（特許文献１）。培養温度の減少は、全てのタンパク質に適用されるのではないが、一般タンパク質の生成速度をタンパク質の折り畳み速度以下に遅めて相互凝集性の強い折り畳み中間体が蓄積されないようにするので、大部分の場合に非常に効果的な方法である(非特許文献３、非特許文献４)。
【０００８】
第２の方法は、シャペロン(chaperone)及びタンパク質フォールダーゼ(foldase)の同時発現法である。シャペロンとは、タンパク質が所望の３次構造を持つように助ける役割、及び無駄な分子間または分子内の相互作用を防止する役割をする補助タンパク質をいう。折り畳み中間体を保護して凝集及び沈殿を防止する役割をするが、大腸菌ではＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＤｎａＫ、ＨｔｐＧ、ＳｅｃＢ、ＰａｐＤなどがあり、ＰａｐＤ（細胞間膜に存在）を除いては全て細胞質に存在する（特許文献２、非特許文献５および非特許文献６）。フォールダーゼは、折り畳み段階において共有結合または異性化段階を容易にする役割をする補助タンパク質群をいう。例えば、タンパク質のジスルフィド結合の形成を促進するＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤなどがある(非特許文献７および非特許文献８)。
【０００９】
第３の方法は、融合タンパク質を用いる方法である。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(glutathione-S-transferase)、マルトース−結合タンパク質(maltose-binding protein)、タンパク質Ａ(Protein A)、腫瘍怪死因子−アルファ(tumor necrosis factor-α)、リシル−ｔＲＮＡ合成酵素などが融合タンパク質として開発された（非特許文献９、非特許文献１０、特許文献１１および特許文献３）。特許文献４には、ジスルフィドイソメラーゼ(disulphide isomerase)に融合させ、ジスルフィド結合を持つ真核細胞のタンパク質を可溶化させた。また、特許文献５では、Ｈ鎖ヒトフェリチンタンパク質と、大腸菌で不溶性の形で発現されるＬ鎖ヒトフェリチンタンパク質とを結合させ、可溶性融合タンパク質を生産したことがある。前述したように外来タンパク質を前記融合タンパク質と結合させて可溶性タンパク質の形で発現させようとする様々な試みが行われてきたが、ケース別にその影響が異なる。たとえば、各融合タンパク質の種類に応じて封入体の形で発現されることもあり、一部のみが可溶性の形で発現されることもあり、目的タンパク質に融合されるタンパク質が目的タンパク質の折り畳みを補助することもあるなど、様々な様相を示す(非特許文献１２)。
【００１０】
したがって、活性型の可溶性組み換えタンパク質を高効率及び高濃度で大量生産することが可能な技術が切実に求められている。
【特許文献１】韓国特許出願第１９９７−５００２３号
【特許文献２】韓国特許出願第２００３−７００８６５７号
【特許文献３】韓国特許出願第１９９６−４４０１０号
【特許文献４】米国特許第６，０２７，８８８号
【特許文献５】韓国特許出願第２００２−００４０４９７号
【非特許文献１】Jeffrey G. T. and Amanda A. et al, (1997), Applied Biochemistry and Biotechnology 66, 197-238
【非特許文献２】Andrew D. Guise, Shauna M. West, and Julian B. Chaudhuri (1996), Molecular Biotechnology 6, 53-64
【非特許文献３】Schein, C. H. and M. H. M. Noteborn (1988), Biotechnology 6, 291-294
【非特許文献４】More, J. T., Uppal, F. Maley and G. F. Maley (1993), Protein. Expr. Purif. 4, 160-163
【非特許文献５】Hartl, F. U., R. Holdan and T. Langer (1994), Trends Biochem. Sci. 19, 20-25
【非特許文献６】Bernadea-Clark, E. and G. Georgiou (1994), American Chem. Soc. Symp. Ser. Vol. 470, ACS
【非特許文献７】Creighton, T. E., A. Zapun and N. J. Darby (1995), TIBTECH. 13, 18-27
【非特許文献８】Gottesman, M. E. and W. A. Hendrickson (2000). Curr. Opin. Microbiol. 3, 197-202
【非特許文献９】Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988), Gene 67, 31-40
【非特許文献１０】Bedouelle, H. and Duplay, P. (1988), Euro. J. Biochem. 171, 541-549
【非特許文献１１】Nisson, B. et al. (1987), Prot. Eng. 1, 107-113
【非特許文献１２】Savvas C. Makrides (1996), Microbiological Review, 512-538
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような背景の下で、本発明者らは、遺伝子組み換え方法でタンパク質を生産するのに有用な融合タンパク質を探し出す代わりに、原核細胞で封入体として発現される外来タンパク質を活性のある形で大量製造することが可能な新しいベクターシステムを考案しようとした。
【００１２】
その結果、原核細胞で目的タンパク質遺伝子及びβ−ラクタマーゼ遺伝子がポリシストロン的に発現(polycistronic expression)する発現ベクターシステムが、目的タンパク質を過量に発現すると同時にβ−ラクタマーゼを過量に発現するので、目的タンパク質を高い割合の可溶性の形で発現し大量生産するのに効果的であるという事実を見出し、このように構築された発現システムを用いて活性のある目的タンパク質を大量生産する方法を開発することにより、本発明を完成した。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、原核細胞で発現の際に封入体を形成する外来目的タンパク質を活性型の可溶性タンパク質に製造する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記活性型の目的タンパク質を製造するためのポリシストロンベクターシステムを提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
一つの様態として、本発明は、目的タンパク質とβ−ラクタマーゼがそれぞれ第１シストロンと第２シストロンでポリシストロンの形で発現されることを特徴とする、原核細胞で活性型の可溶性目的タンパク質を生産する方法に関するものである。
【００１６】
本発明者らは、原核細胞で発現の際に封入体を形成するヒト成長ホルモンタンパク質とβ−ラクタマーゼをポリシストロン的に発現させることにより、ヒト成長ホルモンとβ−ラクタマーゼが全て過量に発現され、この際、発現されたヒト成長ホルモンが活性を示す可溶性の形であることを確認した。反面、同一の条件でβ−ラクタマーゼの代わりにカナマイシンを用いて塩基性線維芽細胞成長因子と角質細胞成長因子の発現を試験した場合には、前記目的タンパク質の大部分が封入体として発現された。これを基礎に、医薬的に有用であるが原核細胞で発現の際に封入体を形成する多様な目的タンパク質をβ−ラクタマーゼとポリシストロン的に発現させ、その結果、目的タンパク質が活性を示す可溶性の形で製造された。
【００１７】
したがって、別の様態として、本発明は、外来目的タンパク質を、活性を示す可溶性の形で製造するポリシストロンベクターに関するものである。
【００１８】
具体的様態において、本発明は、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロン、及び（iii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンを持っていることを特徴とする、原核細胞で目的タンパク質を活性型の可溶性タンパク質として発現するためのポリシストロンベクターに関するものである。
【００１９】
本願で使用された用語「ポリシストロン(polycistron)」は、一つのｍＲＮＡが同一のプロモータで合成され、各シストロンが終結コドンと開始コドンによって分離されており、各シストロンのためのリボソーム結合領域が存在して、各シストロンに該当するタンパク質が一つのプロモータで転写されたｍＲＮＡから同時に発現されるシステムをいう。ここで、「シストロン」とは、単一タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸のコート配列を意味し、シストロンは、５’開始コドンと３’終結コドンを含む。また、第１シストロン及び第２シストロンは、ＤＮＡ配列上の順序を意味するのではなく、個別的なシストロンを指称するために使用された。
【００２０】
好適な様態において、本発明のポリシストロンは、５’から３’方向に目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロンと、β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンとが作動可能に連結されるか、或いは５’から３’方向にβ−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンと、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロンとが作動可能に連結できる。
【００２１】
本願において使用された用語「ベクター」は、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味し、具体的には、プロモータ配列、ターミネータ配列、マーカー遺伝子、その他の適切な配列を始めとして適切な調節配列を含むように製作することができる。このようなベクターは、プラスミド、ファージ、コスミドなどであってもよい(Molecular Cloning: Laboratory Mannual second edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))。このようなベクターの製造、突然変異の誘発、配列分析、細部内へのＤＮＡの導入、遺伝子発現及びタンパク質分析法は、文献［Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)］に詳細に記載されている。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製し機能することができるか、或いは一部の場合にゲノムそれ自体に統合できる。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に用いられる形であり、本願において、「プラスミド」及び「ベクター」は時々相互交換的に使用される。本願発明の目的上、ベクターは原核細胞における発現に適切なベクターであり、外来目的タンパク質とβ−ラクタマーゼをポリシストロン的に発現させるポリシストロンベクターである。
【００２２】
本願において使用された用語「作動可能に連結された」は、発現調節配列が目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の転写及び解読を調節するように連結されたことをいい、発現調節配列（プロモータを含む）の調節の下にポリヌクレオチド配列が発現され、ポリヌクレオチド配列によってコードされる目的タンパク質のポリペプチドが生成されるように正確な解読フレームを維持させることを含む。
【００２３】
本願において使用された用語「プロモータ」は、転写を引き起こすのに十分な最小限の配列を意味し、本願発明の目的上、外部シグナルまたは作用剤によって誘導可能なプロモータを使用する。原核細胞で目的タンパク質を発現するために使用することが可能なプロモータには、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌａｃ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、ｃｓｐＡ、Ｔ７−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ３−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ５−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ４ ｇｅｎｅ ３２、ｎｐｒＭ−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒなどがある。好ましくは、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃ、Ｔ７−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ３−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ５−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ４ ｇｅｎｅ ３２、より好ましくはＴ７、ｔａｃ、Ｔ７−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、最も好ましくはＴ７プロモータである。Ｔ７プロモータは、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素によって調節され、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素の発現は、ＩＰＴＧ(isopropyl-β-D-thiogalactoside)によって調節可能である。したがって、Ｔ７プロモータは、ＩＰＴＧを用いて所望の時期に目的タンパク質の発現を誘導することができる。これは、原核宿主細胞、例えば大腸菌を培養して細胞数が増加するまで発現しないようにし、十分に大腸菌の数が増加した後に目的タンパク質の発現を誘導することが好ましいためである。
【００２４】
リボソーム結合領域は、通常、開始コドンの約１０ｂｐの前に位置しており、ファージまたは原核細胞のポリシストロンオペロンシステムでｍＲＮＡの解読を正確且つ効率的に開始し得るようにする役割を果たす。
【００２５】
本願発明のポリシストロンベクターを用いて発現させる目的タンパク質は、医薬的に利用可能な全てのタンパク質であり得る。特に、その間医薬的用途で使用することが要求されたが、遺伝子操作によって宿主細胞で大量発現されたとき、封入体を形成して不活性タンパク質を作るものと知られているタンパク質が、本願発明の目的タンパク質として使用するに適する。例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球コロニー成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒト上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血素板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、転換成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍怪死因子（ＴＮＦ）、アンギオジェニン、アンギオテンシン、インターロイキン（ＩＬ）、組織プラスミノゲン活性因子（ｔＰＡ）などを含み、より好ましくはｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＫＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−７またはＴＰＯなどを含む。このような目的タンパク質は、天然形であってもよく、変形された形であってもよい。これらタンパク質の全体配列またはその断片を含んで欠失、置換または付加などが行われた変形体を含む。本願発明の具体例では、ｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及びＫＧＦを発現する。
【００２６】
本願発明で発現させようとする目的タンパク質は、目的タンパク質自体であリ得るが、精製を容易にし、或いは抗体または酵素と融合して様々な機能を持つようにし、或いは可溶性を増加させるために、可溶性を増加させる配列と融合させるなど、融合タンパク質の形を取ることができる。目的タンパク質が精製などを容易にするための配列を含む場合、目的タンパク質をこのような配列と融合タンパク質の形で発現させることができる。このように融合された目的タンパク質は、融合パートナー−連結ペプチド−目的タンパク質からなってもよく、それぞれの種類に応じて多様に製造されてもよい。さらに好ましくは、融合パートナーは、生産されたタンパク質の精製を容易にするためのもので、ヒスチジンが連結されたヒスチジン−ｔａｇ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(glutathione-S-transferase)、マルトース−結合タンパク質(maltose-binding protein)、タンパク質Ａ(protein A)、タンパク質Ｇ(protein G)、ｆｌａｇペプチド、チオレドキシン(thiredoxin)、Ｓ−ペプチド、アビジン(avidin)、ストレプトアビジン(streptavidine)、ガラクトース結合タンパク質(galactose binding protein)、セルロース結合ドメイン(cellulose-binding domain)、キチン結合ドメイン(chitin-binding domain)、ポリアルギニン(polyarginine)、ポリシステイン(polycysteine)またはポリフェニルアラニン(polyphenylalanine)などを利用することができ、本願発明の具体例では、ヒスチジンが１０個結合したヒスチジン−ｔａｇを利用した。このような融合パートナーと目的タンパク質とを分離させる連結ペプチドは、プロテアーゼによって切断できる配列を含み、配列特異性の強いエンテロキナーゼ、トロンビン、因子Ｘａ、ウロキナーゼ、ＴＥＶプロテアーゼ、またはスブチリシン(subtilisin)の切断配列などを用いることができる。
【００２７】
本願で使用された用語「活性型」は、組み換えベクターによって形質転換された形質転換体で安定的に発現され、完全な折り畳みを成すものであって、別途の変性または再折り畳み過程を経なくても生物学的活性を持つ可溶性タンパク質を意味する。
【００２８】
本願に使用された用語「可溶性」は、タンパク質が水溶液に容易に沈殿されず、封入体またはその他の凝集体をよく形成しない性質を意味する。
【００２９】
本願発明で使用されたβ−ラクタマーゼ（beta-lactamase；ｂｌａ）は、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を選別するための因子であって、アンピシリン(ampicillin)に対する耐性を提供するタンパク質である。本願発明のポリシストロンベクターにおいて、目的タンパク質をコードするシストロンとβ−ラクタマーゼをコードするシストロンの配列順序は任意的に変化でき、好ましくはβ−ラクタマーゼをコードするシストロンが目的タンパク質をコードするシストロンの下部に位置する。
【００３０】
本願発明の具体的実施で使用されたｐＴ０類発現ベクターは、ｐＥＴ３ａのＴ７プロモータの後ろに融合された目的タンパク質の遺伝子（融合パートナー−連結ペプチド−目的タンパク質の遺伝子）または目的タンパク質の遺伝子自体が作動可能に連結され、融合された目的タンパク質の遺伝子または目的タンパク質の遺伝子とβ−ラクタマーゼ遺伝子が同一プロモータの調節の下に転写されて目的タンパク質とβ−ラクタマーゼが過多発現されるベクターであって、融合されたｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２ｂ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及びＫＧＦ、または融合されていないＫＧＦ遺伝子がそれぞれ挿入されたｐＴ０１９１、ｐＴ０−ＣＳＦ、ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦが製作された。これらベクターの発現結果、対照群の場合に比べると、目的タンパク質の大部分が可溶性の活性型で発現された。
【００３１】
一方、本願発明の具体的実施で使用された対照群の発現ベクターｐＴＴ類は、発現ベクターｐＥＴ３ａのＴ７プロモータの直後に融合された目的タンパク質の遺伝子（融合パートナー−連結ペプチド−目的タンパク質の遺伝子）が作動可能に連結されたプラスミドであるが、融合された目的タンパク質の遺伝子とβ−ラクタマーゼ遺伝子がそれぞれ異なるプロモータの調節の下に調節されるベクターである。このようなベクターで形質転換された大腸菌は、融合された目的タンパク質を細胞内で過発現させることができるが、融合タンパク質の多くの量が封入体として発現された（実施例２）。別の対照群であるｐＴＲ０１９１は、発現ベクターｐＴ０１９１でβ−ラクタマーゼ遺伝子を逆方向に転換させた後、Ｔ７プロモータの直後に融合されたヒト成長ホルモン遺伝子が作動可能に連結されたプラスミドであって、目的タンパク質とβ−ラクタマーゼ遺伝子が同一プロモータの調節の下に位置していない状態であり、ｐＴＲ０１９１を宿主細胞で発現させたとき、大部分の融合タンパク質が封入体として発現され、β−ラクタマーゼは少量発現された（実施例５）。
【００３２】
したがって、具体的な一様態として、本願発明は、β−ラクタマーゼを目的タンパク質自体または目的融合タンパク質と同時に過発現させながら目的タンパク質を高い割合の活性型で発現させるために、ｐＴＥ３ａ発現ベクターから由来したｐＴ０発現ベクターに融合されたｈＧＨ（配列番号５）、Ｇ−ＣＳＦ（配列番号７）、ＩＦＮ−α２ｂ（配列番号９）、ｂＦＧＦ（配列番号１１）、ＩＧＦ−１（配列番号１３）、ＩＧＦ−２（配列番号１５）、ＫＧＦ（配列番号２３）及び融合されていないＫＧＦ（配列番号２５）をコードする遺伝子がそれぞれ挿入されたポリシストロン発現ベクターｐＴ０１９１、ｐＴ０−ＣＳＦ、ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＦＧ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦを提供する。特にｐＴ０１９１及びｐＴ０−ＩＦＮをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に、ｐＴ０−ＣＳＦをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにそれぞれ形質転換させ、その形質転換体を２００４年３月１１日に大田市儒城区魚慇洞５２番地に所在の韓国生命工学研究院内ＫＣＴＣ(Korean Collection for Type Cultures)に受託番号ＫＣＴＣ−１０６１０ＢＰ、ＫＣＴＣ−１０６１２ＢＰ及びＫＣＴＣ−１０６１１ＢＰでそれぞれ寄託した。
【００３３】
本発明のポリシストロン発現ベクターは、ＣａＣｌ２を使用する化学的方法やエレクトロポレーション(electroporation)などを含む、当業界に公知になっている任意の方法を用いて、宿主細胞内に導入し、宿主細胞を形質転換させることができる。
【００３４】
本願発明に使用された用語「形質転換」とは、ポリシストロン発現ベクターの遺伝子が発現されるように原核細胞に導入されることを意味する。
【００３５】
融合タンパク質の組み換え核酸配列がその細胞内ｍＲＮＡに適切に転写され、細胞がタンパク質を発現させることができれば、任意の原核宿主細胞が使用できるが、グラム陰性菌である大腸菌とグラム陽性菌であるバチルス菌などが好ましい。より好ましくは大腸菌、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＤ４９４（ＤＥ３）などが使用可能である。前記宿主細胞は、バクテリオファージＴ７ＲＮＡ重合酵素を持っており、これらの例に局限されない。本願発明で使用したバクテリオファージ由来Ｔ７プロモータは、大腸菌ＲＮＡ重合酵素よりバクテリオファージＴ７ＲＮＡ重合酵素によって発現されるのがさらに効率的なので(Studier FW et al. (1990), Method Enzymol. 185, 60-89)、発現ベクターｐＴ０類を、バクテリオファージＴ７ＲＮＡ重合酵素を持っているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどに形質転換させて発現させることが好ましい。本願発明のｐＴ０−ＣＳＦ発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ（ＤＥ３）、またはＡＤ４９４（ＤＥ３）に形質転換させる場合、目的融合タンパク質の７０％以上を活性型で発現させることができる。
【００３６】
したがって、別の様態として、本願発明は、前述したポリシストロン発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。具体的例示として、ｐＴ０１９１、ｐＴ０−ＣＳＦ、ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦまたはｐＴ０Ｎ−ＫＧＦで形質転換された大腸菌を含む。
【００３７】
本願発明に係る発現ベクターによって形質転換された形質転換体は、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列が発現されるように、適切な培地及び条件の下で培養する。形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させる方法は、当業界に公知になっている。例えば、形質転換体が成長し得る適切な培地に接種して種培養を行った後、これを本培養用培地に接種し、適切な条件で培養することにより、タンパク質の発現を誘導することができる。本培養の際、菌体成長段階と組み換えタンパク質の発現誘導段階を区別して実施することにより、組み換えタンパク質の生産性及び収率を増加させることができる。
【００３８】
したがって、別の様態として、本発明は、前述した形質転換体を培養し、培養物から可溶性目的タンパク質を回収する段階を含む、活性型の可溶性タンパク質を生産する方法を提供する。
【００３９】
形質転換体を培養して前記培養物から実質的に純粋な目的タンパク質を回収することにより、これを医薬的に使用することができる。組み換えタンパク質の回収は、当業界に公知になっている多様な分離及び精製方法によって達成することができる。通常、細胞残屑(cell debris)などを除去するために、前記細胞溶解物などを遠心分離した後、沈殿、透析、各種カラムクロマトグラフィーなどを適用する。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相−ＨＰＬＣ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、親和性カラムなどは、カラムクロマトグラフィーの例である。
【００４０】
本願発明に係る可溶性活性型タンパク質の精製は、細胞破砕、遠心分離の後に再折り畳み工程(refolding process)を経なくても、超濾過やイオン交換クロマトグラフィーなどの一般な精製方法によって達成される。これにより、分離して活性型の目的タンパク質を容易に得ることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００４２】
（実施例１：発現ベクターｐＴＴ１９１の構築）
本発明の対照群として、ヒト成長ホルモンを含有した融合タンパク質の大量が封入体として発現されるｐＴＴ１９１を製造した。
【００４３】
ヒスチジン−ｔａｇ及びエンテロキナーゼ認識配列に連結されたヒト成長ホルモン融合タンパク質（配列番号５）を合成するために、ＰＣＲライゲーション法(Willem P.C. Stemmer, and Herbert L. Heyneker (1995) Gene 164, 49-53; Scott W. Altmann, and Robert A. Kastelein (1995) Protein Expression and Purification 6, 722-726; Ana Paula de Mattos Areas, and Paulo Lee Ho (2002) Protein Expression and Purification 25, 481-487)を用いて融合ヒト成長ホルモン遺伝子を製造した。ＰＣＲライゲーション法は、次のような方法で行った。ＰＣＲチューブに、相補的に２０個の塩基配列が重なり合った合成オリゴヌクレオチド対をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）２．５Ｕ（１μＬ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ、日本）２Ｌ、ｐｆｕ重合酵素緩衝１０倍液２μＬを順次入れた後、最終体積が２０μＬとなるように滅菌蒸留水を入れ、その後ＰＣＲ機械（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を用いて反応を行った。この際、各オリゴヌクレオチドは、テンプレートであると同時にプライマーとして作用する。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分間変性させた後、９５℃で１分、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒間反応を２０回繰り返し行った後、さらに７２℃で１０分間反応させた。各産物の末端に相補的な塩基（２０ｂｐ）配列を有する２種のＰＣＲ産物を重合酵素連鎖反応のチューブに５μＬずつ投入し、ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）２．５Ｕ（１μＬ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ、日本）２μＬ、ｐｆｕ重合酵素緩衝１０倍液２μＬを順次入れた後、最終体積が２０μＬとなるように滅菌蒸留水を入れ、ＰＣＲ機械（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を用いて反応を行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性させた後、９５℃で１分、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒間反応を２０回繰り返し行い、さらに７２℃で１０分間反応させた。このような反応を繰り返し行い、最終段階のＰＣＲ反応は３０回行って合成遺伝子を獲得した。合成された遺伝子は１％アガロースゲルに展開してＱＩＡＱｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いて合成遺伝子を分離した。その結果、ヒスチジン−ｔａｇ（配列番号１）及びエンテロキナーゼ認識配列（配列番号３）を含み、両端に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を含んでいる融合されたヒト成長ホルモン（ソマトトロピン）遺伝子（配列番号５）を製造した。その後、発現ベクターｐＴＴ１９１は、図１に示すように製造された。合成された融合遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩで処理して１％アガロースゲル電気泳動して分離、精製し、ＮｄｅＩと牛の小腸アルカリリン酸分解酵素(calf intestine alkine phosphatase、ＣＩＡＰ)（ＮＥＢ、米国）で処理されたｐＥＴ３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）と混合した。ＣＩＡＰ処理は、ＮｄｅＩによって切断されたｐＥＴ３ａのセルフライゲーション(self ligation)を防止するために３７℃で１時間反応した。融合遺伝子とｐＥＴ３ａの混合物は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、米国）で１６℃で１８時間反応させて連結してｐＴＴ１９１を製造した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質転換した。形質転換体でプラスミドを精製してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）菌株に形質転換させた。発現ベクターｐＴＴ９１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体は、アンピシリン（２００ｇ／ｍＬ）が含まれたＬＢ平板培地から選別され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＴ１９１と命名した。発現ベクターｐＴＴ１９１にヒト成長ホルモンの遺伝子を含んだ融合遺伝子が正しく挿入されたかを制限酵素ＡｌｗｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断した後、ＤＮＡ配列分析によって遺伝子配列を確認した。
【００４４】
（実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＴ１９１形質転換体での融合ヒト成長ホルモンの発現）
対照群である発現ベクターｐＴＴ１９１で形質転換された大腸菌におけるヒト成長ホルモン含有融合タンパク質の発現様相を調査した。
【００４５】
発現ベクターｐＴＴ１９１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＴ１９１をＬＢ培地(Luria-Bertani medium)で３０℃、１２時間培養した後、ＩＰＴＧ(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)で融合タンパク質の発現を誘導した。培養の後、遠心分離によって細胞を回収した後、細胞を破砕し、上澄み液を分離して融合タンパク質の発現を確認した。その結果、図２に示すように、ヒト成長ホルモン含有融合タンパク質が予測した約２４ｋＤａのサイズと一致したが、大部分は封入体として発現された。
【００４６】
（実施例３：発現ベクターｐＴ０１９１の構築）
ヒト成長ホルモン含有融合タンパク質を大量の可溶性タンパク質として発現するためのｐＴ０１９１を製造した。
【００４７】
融合ヒト成長ホルモンタンパク質をコードする遺伝子をｐＥＴ３ａベクターに挿入するために、ｐＴＴ１９１をテンプレートとし、配列の端部に制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄｅIII認識部位が含まれるようにＰＣＲを次の条件で行った。重合酵素連鎖反応チューブに、テンプレートとしてのｐＴＴ１９１プラスミド（実施例１）１００ｎｇ、ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）２．５Ｕ（１μＬ）、プライマーＡ（５’-ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣ−３’、配列番号１９）３０ｐｍｏｌｅ、プライマーＢ（５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣ−３’、配列番号２０）３０ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｔａｋａｒａ、日本）２μＬ、ｐｆｕ重合酵素緩衝１０倍液２μＬを順次入れた後、最終体積が２０μＬとなるように滅菌蒸留水を入れ、その後ＰＣＲ機械（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を用いて反応を行った。反応条件は、９４℃で５分間変性させた後、９５℃で１分、５８℃で３０秒、７２℃で２分間反応を３０回繰り返し行い、さらに７２℃で１０分間反応させることである。製造された遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで処理して１％アガロースゲル電気泳動によって分離、精製した。発現ベクターｐＥＴ３ａは、制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで処理して１％アガロースゲル電気泳動によって４１１９ｂｐサイズの切片を分離、精製して回収した。制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIでそれぞれ処理した融合遺伝子とｐＥＴ３ａ切片をＴ４ ＤＮＡリガーゼで１６℃で１８時間反応させて連結してｐＴ０１９１を製造した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０に形質転換した（図３）。前記形質転換体でプラスミドを精製してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換させた。発現ベクターｐＴ０１９１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体は、アンピシリン２００ｇ／ｍＬが含まれているＬＢ平板培地で選別され、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１（ＫＣＴＣ１０６１０ＢＰ）と命名した。ヒト成長ホルモンの遺伝子を含んだ融合遺伝子が発現ベクターｐＴ０１９１に正しく挿入されたかを、制限酵素ＡｌｗｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断した後、ＤＮＡ配列分析によって遺伝子配列を確認した。
【００４８】
（実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１形質転換体での融合ヒト成長ホルモンの発現）
発現ベクターｐＴ０１９１で形質転換された大腸菌におけるヒト成長ホルモン含有融合タンパク質の発現様相を調査した。
【００４９】
発現ベクターｐＴ０１９１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１をＬＢ培地で３０℃、１２時間培養した後、ＩＰＴＧで融合タンパク質の発現を誘導し、ヒト成長ホルモン含有融合タンパク質の発現を確認した。発現された融合タンパク質は、図４に示すように、発現された融合タンパク質の大部分が活性型で発現されて上澄み液に存在し、その大きさは約２４ｋＤａであった。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＴ１９１形質転換体の場合とは異なり、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１形質転換体では、目的とした融合タンパク質と共にβ−ラクタマーゼも過発現されることを確認することができた。Ｎ末端の配列分析によって、発現されたβ−ラクタマーゼを確認することができた。
【００５０】
（実施例５：発現プラスミドｐＴＲ０１９１の構築及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴＲ０１９１形質転換体でのヒト成長ホルモンの発現）
実施例３で構築されたｐＴ０１９１プラスミドをＳｐｈＩ／ＨｉｎｄIIIで処理して３８１２ｂｐサイズの切片を精製して準備し、ｐＴ０１９１プラスミドにおいてβ−ラクタマーゼに該当する遺伝子を、２つのプライマー（プライマー１：５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡ−３’（配列番号２１）、プライマー２：５’−ＡＡＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２２））を用いてＰＣＲによって増幅させ、ＳｐｈＩとＨｉｎｄIII制限酵素の方向が変わった９５０ｂｐサイズの切片を得て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで接合することにより、ヒト成長ホルモンとβ−ラクタマーゼ遺伝子配列の方向が異なるｐＴＲ０１９１プラスミドを製造した（図５）。製造されたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて３０℃で発現を確認した。図６に示すように、発現された目的タンパク質は、大部分が封入体として発現され、β−ラクタマーゼの発現量は、ｐＴ０１９１の場合に比べて少量であった。
【００５１】
（実施例６：発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦの構築）
ヒト顆粒球コロニー刺激因子を含む融合タンパク質を大量の可溶性タンパク質として発現するためのｐＴ０−ＣＳＦを製造した。ヒスチジン−ｔａｇ及びエンテロキナーゼ認識配列に連結されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号７）を、実施例１と同様にＰＣＲライゲーション方法で合成し、実施例３と同様にベクターを構成した（図３）。発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ０-ＣＳＦ（ＫＣＴＣ１０６１１ＢＰ）と命名し、ヒト顆粒球コロニー刺激因子の遺伝子を含んだ融合遺伝子が発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦに正しく挿入されたかを、制限酵素ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄIIIで切断した後、ＤＮＡ配列分析によって遺伝子配列を確認した。
【００５２】
（実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ０−ＣＳＦ形質転換体での融合ヒト顆粒球コロニー刺激因子の発現）
発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦで形質転換された大腸菌におけるヒト顆粒球コロニー刺激因子含有融合タンパク質の発現様相を調査した。
【００５３】
発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｂ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ０−ＣＳＦをＬＢ培地で３０℃、１２時間培養した後、ＩＰＴＧで融合タンパク質の発現を誘導した。発現された融合タンパク質は、図７に示すように、発現されたヒト顆粒球コロニー刺激因子含有融合タンパク質の大部分が活性型で発現されて上澄み液に存在し、その大きさは約２０ｋＤａであった。発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｂ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＴ０−ＣＳＦにおいても、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０１９１形質転換体の場合と同じように、目的とした融合−ヒト顆粒球コロニー刺激因子と共にβ−ラクタマーゼが過発現された。
【００５４】
また、発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）及びＥ．ｃｏｌｉ ＡＤ４９４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に形質転換させて融合−ヒト顆粒球コロニー刺激因子の発現を確認した結果、表１（ｐＴ０−ＣＳＦの宿主細胞の種類によって融合−ヒト顆粒球コロニー刺激因子の発現様相を比較）に示すように、融合タンパク質の大部分が活性型で発現されることが分かった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
（実施例８：発現ベクターｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦの構築）
様々な目的タンパク質自体または目的タンパク質を含む融合タンパク質を大量の可溶性タンパク質として発現するためのｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＧＦ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦを製造した。ヒスチジン−ｔａｇ及びエンテロキナーゼ認識配列に連結されたインターフェロン−アルファ２ｂ融合タンパク質（配列番号９）、塩基性線維芽細胞成長因子融合タンパク質（配列番号１１）、インシュリン様成長因子−１融合タンパク質（配列番号１３）、インシュリン様成長因子−２融合タンパク質（配列番号１５）、角質細胞成長因子融合タンパク質（配列番号２３）、及び融合されていない角質細胞成長因子タンパク質自体（配列番号２５）をコードする遺伝子を、実施例１と同様のＰＣＲライゲーション合成方法で製造し、ｐＥＴ３ａベクターに融合タンパク質を挿入するためにコード遺伝子の配列の端部に制限酵素ＮｄｅＩ認識部位と制限酵素ＨｉｎｄIII認識部位が含まれるようにデザインした。製造された遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで処理して１％アガロースゲル電気泳動して分離、精製した。発現ベクターＰＥＴ３ａは、制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで処理して１％アガロースゲル電気泳動によって４１１９ｂｐサイズの切片を分離、精製して回収した。制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIでそれぞれ処理した融合遺伝子とｐＥＴ３ａ切片をＴ４ＤＮＡリガーゼで１６℃で１８時間反応させて連結してそれぞれ発現ベクターｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＦＧ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦを製造した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０に形質転換した。前記形質転換体でプラスミドを精製してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株にそれぞれ形質転換させた。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＡｌｗｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断した後、ＤＮＡ配列分析によって遺伝子配列を確認した。
【００５７】
（実施例９：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＦＧ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦ形質転換体での各目的タンパク質の発現）
発現ベクターｐＴ０−ＩＦＮ、Ｔ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＦＧ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＧＦそれぞれで形質転換されたそれぞれの大腸菌におけるそれぞれの目的タンパク質の発現様相を調査した。
【００５８】
前記発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地で３０℃、１２時間培養した後、ＩＰＴＧで各目的タンパク質の発現を誘導した。その結果をそれぞれ図８〜図１３に示した。図示の如く、それぞれの発現されたタンパク質は、大部分が上澄み液に存在して可溶性活性タンパク質として発現されるのを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によってβ−ラクタマーゼと目的タンパク質を共に過発現する発現ベクターを提供することにより、原核細胞で発現の際に封入体を形成する外来目的タンパク質を可溶性の活性型で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１はヒト成長ホルモン遺伝子が挿入された発現ベクターＰＴＴ１９１を製造する過程を図式化して示す。
【図２】図２は発現ベクターｐＴＴ１９をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、ヒト成長ホルモンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：ヒト成長ホルモン標準品、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物。）
【図３】図３はそれぞれヒト成長ホルモン遺伝子及びヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子が挿入された発現ベクターｐＴ０１９１及びＰＴ０−ＣＳＦを製造する過程を図式化して示す。
【図４】図４は発現ベクターｐＴ０１９１をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、ヒト成長ホルモンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：ヒト成長ホルモン標準品、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た全体タンパク質、レイン４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン５：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物。）
【図５】図５はβ−ラクタマーゼが逆方向に置換された発現ベクターにヒト成長ホルモン遺伝子が挿入されたｐＴＲ０１９１を示す。
【図６】図６は発現ベクターｐＴＲ０１９１をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、ヒト成長ホルモンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：ヒト成長ホルモン標準品、レイン３及び４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン５及び６：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図７】図７は発現ベクターｐＴ０−ＣＳＦをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換させた後、ヒト顆粒球コロニー成長因子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導前の形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン３及び４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン５及び６：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物。）
【図８】図８は発現ベクターｐＴ０−ＩＦＮをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、インターフェロン−アルファ２ｂの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図９】図９は発現ベクターｐＴ０−ｂＦＧＦをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、塩基性線維芽細胞成長因子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図１０】図１０は発現ベクターｐＴ０−ＩＧＦ１をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、インシュリン様成長因子−１の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図１１】図１１は発現ベクターｐＴ０−ＩＧＦ２をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、インシュリン様成長因子−２の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図１２】図１２は発現ベクターｐＴ０−ＫＧＦをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、角質細胞成長因子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液。）
【図１３】図１３は発現ベクターｐＴ０Ｎ−ＫＧＦをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、角質細胞成長因子の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果の写真である。（レイン１：タンパク質サイズマーカー、レイン２：発現誘導前の形質転換体全体、レイン３：発現誘導した形質転換体を破砕して得た上澄み液、レイン４：発現誘導した形質転換体を破砕して得た沈殿物。）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質とβ−ラクタマーゼがそれぞれ第１シストロンと第２シストロンでポリシストロンの形で発現されることを特徴とする、原核細胞で活性型の可溶性目的タンパク質を生産する方法。
【請求項２】
前記ポリシストロンが、５’から３’方向に作動可能に連結された、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロン、及び（iii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンを有する組み換えベクターから由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリシストロンが、５’から３’方向に作動可能に連結された、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロン、及び（iii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロンを有する組み換えベクターから由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
目的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子、角質細胞成長因子、エリトロポエチン、トロンボポエチン、ヒト上皮細胞成長因子、血素板誘導成長因子、血管内皮成長因子、神経成長因子、転換成長因子、腫瘍怪死因子、アンギオジェニン、アンギオテンシン、及びインターロイキンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
目的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ２ｂ、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、インシュリン様成長因子−２、及び角質細胞成長因子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
原核細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
大腸菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ（ＤＥ３）、及びＥ．ｃｏｌｉ ＡＤ４９４（ＤＥ３）よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロン、及び（iii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンを持っていることを特徴とする、原核細胞で目的タンパク質を活性型の可溶性タンパク質として発現するためのポリシストロンベクター。
【請求項９】
５’から３’方向に作動可能に連結された、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロン、及び（iii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンを持っていることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
５’から３’方向に作動可能に連結された、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロン、及び（iii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロンを持っていることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
目的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子、角質細胞成長因子、エリトロポエチン、トロンボポエチン、ヒト上皮細胞成長因子、血素板誘導成長因子、血管内皮成長因子、神経成長因子、転換成長因子、腫瘍怪死因子、アンギオジェニン、アンギオテンシン、及びインターロイキンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
目的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ２ｂ、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、インシュリン様成長因子−２、及び角質細胞成長因子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
プロモータが、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌａｃ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、ｃｓｐＡ、Ｔ７−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ３−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ５−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ４ ｇｅｎｅ ３２、及びｎｐｒＭ−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１４】
プロモータがＴ７プロモータであることを特徴とする、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
ｐＴ０１９１、ｐＴ０−ＣＳＦ、ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＦＧ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＦＧよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項８に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
大腸菌である、請求項１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収することを特徴として、活性型の可溶性目的タンパク質を生産する方法。
【請求項１】
目的タンパク質とβ−ラクタマーゼがそれぞれ第１シストロンと第２シストロンでポリシストロンの形で発現されることを特徴とする、原核細胞で活性型の可溶性目的タンパク質を生産する方法。
【請求項２】
前記ポリシストロンが、５’から３’方向に作動可能に連結された、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロン、及び（iii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンを有する組み換えベクターから由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリシストロンが、５’から３’方向に作動可能に連結された、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロン、及び（iii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロンを有する組み換えベクターから由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
目的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子、角質細胞成長因子、エリトロポエチン、トロンボポエチン、ヒト上皮細胞成長因子、血素板誘導成長因子、血管内皮成長因子、神経成長因子、転換成長因子、腫瘍怪死因子、アンギオジェニン、アンギオテンシン、及びインターロイキンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
目的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ２ｂ、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、インシュリン様成長因子−２、及び角質細胞成長因子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
原核細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
大腸菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ（ＤＥ３）、及びＥ．ｃｏｌｉ ＡＤ４９４（ＤＥ３）よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロン、及び（iii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンを持っていることを特徴とする、原核細胞で目的タンパク質を活性型の可溶性タンパク質として発現するためのポリシストロンベクター。
【請求項９】
５’から３’方向に作動可能に連結された、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロン、及び（iii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロンを持っていることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
５’から３’方向に作動可能に連結された、（i）原核細胞で作動可能なプロモータ、（ii）β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２シストロン、及び（iii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第１シストロンを持っていることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
目的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子、角質細胞成長因子、エリトロポエチン、トロンボポエチン、ヒト上皮細胞成長因子、血素板誘導成長因子、血管内皮成長因子、神経成長因子、転換成長因子、腫瘍怪死因子、アンギオジェニン、アンギオテンシン、及びインターロイキンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１２】
目的タンパク質が、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ２ｂ、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子−１、インシュリン様成長因子−２、及び角質細胞成長因子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
プロモータが、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌａｃ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ、ｃｓｐＡ、Ｔ７−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ３−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ５−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ、Ｔ４ ｇｅｎｅ ３２、及びｎｐｒＭ−ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１４】
プロモータがＴ７プロモータであることを特徴とする、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
ｐＴ０１９１、ｐＴ０−ＣＳＦ、ｐＴ０−ＩＦＮ、ｐＴ０−ｂＦＧＦ、ｐＴ０−ＩＧＦ１、ｐＴ０−ＩＦＧ２、ｐＴ０−ＫＧＦ及びｐＴ０Ｎ−ＫＦＧよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項８に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
大腸菌である、請求項１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収することを特徴として、活性型の可溶性目的タンパク質を生産する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００７−５３５９２３（Ｐ２００７−５３５９２３Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１２６７（Ｐ２００７−５１１２６７）
【出願日】平成１６年６月１１日（２００４．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１３９３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０８５８５
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０６１２２５１２）デウン カンパニー，リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１１日（２００４．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１３９３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０８５８５
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０６１２２５１２）デウン カンパニー，リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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