受精を阻害する化合物を同定する方法
受精を阻害する化合物を同定する方法が提供される。本方法は、エクアトリンタンパク質と結合する化合物を選択することを含み得る。長鎖形態及び短鎖形態の２種類のエクアトリンタンパク質が、精巣中に存在し得る。１３８位のＯ−グリコシル化スレオニン残基を含む１０１位〜１４６位のマウスエクアトリンのアミノ酸配列は、受精を阻害する効果を有する抗エクアトリン抗体ＭＮ９により認識されるエピトープを含有する。加えて、ＭＮ９抗体はヒト精子とも結合する。このエピトープと結合する化合物は、受精を阻害することができる。両方の形態のマウスエクアトリン、及びヒトエクアトリンを使用して、受精を阻害する化合物を同定することができる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願全体を通じて角括弧（［］）中に記載される番号は、この節の最後に記載される参考文献に対応する番号を表すことを理解すべきである。
【０００２】
精子のＩｚｕｍｏ１［１］及び卵子のＣＤ９［２〜４］は、精子卵子融合に重要であることが知られる数種類の分子のうちに含まれる。Ｉｚｕｍｏ１は、先体反応前に先体に局在する１型膜貫通タンパク質であり、先体反応後に精子表面上に移動する［１］。このプロセスに関与する分子機構の詳細は依然として明らかでない。テトラスパニン分子であるＣＤ９は卵細胞膜上で発現するが、ＣＤ９−精子のリガンド相互作用の性質は依然として明らかでない。他に配偶子融合の候補分子がいくつか同定されている。しかしながら、遺伝子欠失研究により、これらの役割を他のタンパク質により置換又は迂回することができるが、これらは精子卵子融合に必須ではないことが示されている。これら分子は、ＣＲＩＳＰ１（ＤＥ）［９］及びＣＤ４６［１０］に加えて、それぞれファーティリンα、ファーティリンβ及びシリテスチン（cyritestin）としても知られるＡＤＡＭ１、ＡＤＡＭ２及びＡＤＡＭ３［５〜８］を含む。他にも精子卵子融合に必要とされる候補分子が報告されており、これらの機能が、特異的抗体阻害アッセイにより研究されている。これらは、ＭＮ９抗原としても知られるエクアトリン（ＥＱＴ）［１１、１２］、ＳＰＥＳＰ１（ＥＳＰ）［１３、１４］、ＳＰＡＣＡ４（ＳＡＭＰ１４）［１５］、ＳＰＡＣＡ１（ＳＡＭＰ３２）［１６］、及びＳＰＡＣＡ３（ＳＬＬＰ１）［１７］を含む。このように、精子卵子融合の基礎となる分子機構は、依然として不明である。
【０００３】
精子卵子融合の基礎となる分子機構を解析する際の幾つかの主な困難性には、精子タンパク質の生化学的性質及び局在性が含まれる。実際に、精子糖タンパク質が特有の炭水化物鎖を有し、排精後に精子卵子相互作用まで連続的な修飾を示すことが示されている［１８〜２２］。加えて、エクアトリン［２３］、Ｉｚｕｍｏ１［１］及びＳＰＡＣＡ４［１５］により観察されるように、幾つかの精子タンパク質の局在性は先体反応時に変化する。これら分子は、先体マトリクスから細胞表面まで移行する。これら修飾は、精子分子が精子卵子相互作用に向かうよう刺激する重要な工程であると考えられる。
【０００４】
エクアトリンは、哺乳動物の精子に広く分布する先体タンパク質である。本発明者らは、ヒトを含む哺乳動物にＭＮ９抗原エクアトリンが広く分布し、先体の赤道領域に対して強い親和性を示すことを過去に報告した［２４］。それゆえ、ＭＮ９抗原をエクアトリンと再命名した。機能的には、抗エクアトリン抗体ＭＮ９は、透明帯通過（zona penetration）及び精子卵子結合を阻害することなく表層粒の放出を阻害し、このことはＭＮ９が精子卵子融合、又は早期段階の卵子活性化を阻害することを示唆する［１１］。ＭＮ９抗体は、精子卵子相互作用を、ｉｎ ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ ｖｉｖｏでも阻害する［１２］。エクアトリンは先体反応時に、免疫金染色により観察されるように、赤道部分を覆う細胞膜へと移行する［２３］。赤道部分上の細胞膜は、卵子微絨毛の細胞膜と融合することが知られている［２５〜２８］。
【０００５】
これらの知見に基づき、本発明者らは、エクアトリン遺伝子を同定する必要があり、エクアトリンタンパク質の生化学的性質及び局在性を明らかにする必要があると判断した。特に、ＭＮ９抗体のエピトープ領域（ＭＮ９エピトープ）が精子卵子相互作用に関与するかどうかを決定するために、この領域の性質を理解する必要があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
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【発明の開示】
【０００７】
本発明は、受精を阻害する化合物を同定する方法に関する。本方法は、エクアトリンタンパク質と結合する化合物を選択することを含み得る。長鎖形態及び短鎖形態の２種類のエクアトリンタンパク質が、精巣中に存在し得る。マウスエクアトリンの１３８位のＯ−グリコシル化スレオニン残基を含む１０１位〜１４６位のアミノ酸配列は、受精を阻害する効果を有する抗エクアトリン抗体ＭＮ９により認識されるエピトープを含有する。加えて、ＭＮ９抗体はヒト精子とも結合する。このエピトープと結合する化合物は、受精を阻害することができる。本発明の同定方法では、両方の形態のマウスエクアトリン、及びヒトエクアトリンを使用して、受精を阻害する化合物を同定することができる。
【０００８】
本発明の特徴は、受精を阻害することができる化合物を同定する方法を提供することである。本方法は、マウスエクアトリンの配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有する領域、又はヒトエクアトリンの配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有する領域と結合する化合物を選択することを含み得る。マウスエクアトリンの該領域は、マウスエクアトリンの配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列における１０１位〜１４６位のアミノ酸配列を含む領域であることができ、ヒトエクアトリンの該領域は、ヒトエクアトリンの配列番号５のアミノ酸配列における９２位〜１４４位のアミノ酸配列を含む領域であることができる。
【０００９】
前述の包括的な記載、及び以下の詳細な記載の両方が、例示及び説明のためのものにすぎず、特許請求の範囲に記載される本発明のさらなる説明を提示することを意図するものであることを理解すべきである。
【００１０】
本出願に援用され本出願の一部分を構成する添付した図面は、本発明の実施形態の幾つかを示し、明細書と併せて本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、様々な組織におけるエクアトリンの分布を示す図である。ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット（１２．５％ゲル）。図１Ｂは、エクアトリンのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための精製、及びゲル内検出を示す図である。ＭＮ９抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）。１０％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離。
【図２】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定されたエクアトリンのアミノ酸配列、並びにヒトエクアトリン及びマウスエクアトリンのアライメントを示す図である。
【図３】図３Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるエクアトリンの発現、及び組換えタンパク質を使用する検証研究を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲによる様々な組織におけるｍＲＮＡの発現。図３Ｂは、組換えエクアトリンの検出を示す、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す図である。図３Ｃは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いた間接免疫蛍光（ＩＩＦ）顕微鏡検査で得られた、精巣及び精巣上体尾部におけるエクアトリンの分布を示す画像である。
【図４】図４Ａは、ＭＮ９抗体の免疫染色による、エクアトリンのリン酸化状態及びグリコシル化状態の分析を示す図である。図４Ｂは、グリコシダーゼ処理を使用する移動度シフトアッセイによるグリコシル化状態のウエスタンブロット分析を示す図である。図４Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させたＥＱＴ（Ｌ）−ＥＧＦＰを使用した、ＭＮ９エピトープに対するＯ−グリコシル化阻害剤ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃの影響による、グリコシル化状態のウエスタンブロット分析を示す図である。ＭＮ９抗体（上部パネル）、ＥＱ７０〜８３抗体（中央パネル）を用いた免疫染色。免疫染色したバンドを、デンシトメトリーにより分析し、棒グラフで示した（下部パネル）。
【図５】図５Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞膜上におけるエクアトリンエピトープの所在（Orientation）を示す図である。図５Ｂは、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンＥＱＴ（Ｌ）−ＥＧＦＰの部分欠失を示す図である。例えば、Δ２１〜５０は、２１位〜５０位のアミノ酸配列の欠失を示す。ＭＮ９抗体（上部パネル）及び抗ＧＦＰ抗体（下部パネル、陽性対照）によるウエスタンブロット（１２．５％ゲル）。図５Ｃは、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンの単一アミノ酸置換変異体を示す図である。例えば、Ｔ１２８Ａは、１２８位のａａのＴ（スレオニン）からＡ（アラニン）への置換を示す。ＭＮ９抗体（上部パネル）及びＥＱ７０〜８３抗体（下部パネル、陽性対照）を用いたウエスタンブロット（１２．５％ゲル）。
【図６】図６ＡおよびＢは、ＭＮ９抗体を使用する免疫金電子顕微鏡検査により、成熟精子におけるエクアトリンの局在性を示す図である。
【図７】先体におけるエクアトリンの局在性を示すための、精子頭部の概略図である。
【図８】図８Ａは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ用に、精子尾部エクアトリンを可溶化、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａから４０ｋＤａに集中させて検出するためのＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す図である。図８Ｂは、試料調製図である。
【図９】図９Ａは、ＥＱ７０〜８３抗体を用いたウエスタンブロット（１２．５％ゲル）分析を示す図である。図９Ｂは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いた精巣上体尾部の精子のＩＩＦ顕微鏡検査の結果を示す図である。
【図１０】マウス精子及びヒト精子に関するウエスタンブロット分析、並びにヒト精子頭部に関するＩＩＦ顕微鏡検査を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本出願は、２００９年６月２５日に出願された先の米国仮特許出願第６１／２２０，３６７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張するものであり、該仮特許出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【００１３】
使用した略語：ａａ、アミノ酸（複数も可）；ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ、ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド；ＣＩＡＰ、子ウシ腸アルカリホスファターゼ；ＥＱＴ、エクアトリン；Ｇａｐｄｈ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＩＩＦ、間接免疫蛍光；ＩＲＥＳ、配列内リボソーム進入部位；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、液体クロマトグラフィタンデム質量分析。
【００１４】
本発明は、受精を阻害する化合物を同定する方法に関する。本方法は、エクアトリンタンパク質と結合する化合物を選択することを含み得る。エクアトリンは、哺乳動物の精子に広く分布する先体タンパク質である。本発明者らは、マウスエクアトリン遺伝子をクローニングし、長鎖形態（配列番号３）及び短鎖形態（配列番号２）の２種類のエクアトリンタンパク質が精巣中に存在することを見出した。マウスエクアトリン（配列番号２又は配列番号３）の１３８位のＯ−グリコシル化スレオニン残基を含む１０１位〜１４６位のアミノ酸配列は、受精を阻害する効果を有する抗エクアトリン抗体ＭＮ９により認識されるエピトープを含有する。加えて、本発明者らは、ウエスタンブロット及び間接免疫蛍光分析を使用することにより、ＭＮ９抗体がヒト精子とも結合することを見出したが、このことは、ＭＮ９抗体がヒトエクアトリン（配列番号５）と結合することを示している。そのように、このエピトープと結合する化合物は、受精を阻害することができる。本発明の同定方法では、両方の形態のマウスエクアトリン、及びヒトエクアトリンを使用することができる。
【００１５】
エクアトリン（ＭＮ９抗原分子）は、哺乳動物の精子に広く分布する先体タンパク質である。或る程度の量のエクアトリンが、先体反応時に、赤道領域を覆う細胞膜に移行する。ＭＮ９抗体を使用する体外受精及び体内受精の両方の阻害の研究から、エクアトリンが卵細胞膜との融合に関与することが示唆されている。この研究において本発明者らは、エクアトリンをクローニングし、質量分析及び炭水化物染色を使用して、エクアトリンが高度にグリコシル化されたタンパク質であることを見出した。エクアトリンは精子特有の１型膜貫通タンパク質であり、グリコシダーゼ処理及び組換えタンパク質アッセイにより、エクアトリンがＮ，Ｏ−シアロ糖タンパク質であることが検証された。加えて、ＭＮ９抗体により認識される配偶子相互作用関連ドメインは、翻訳後に修飾される。修飾されるドメインは、アミノ酸置換、脱リン酸化及びＯ−グリコシル化阻害剤アッセイにより分析したところ、Ｏ−グリコシル化される可能性が最も高いスレオニン１３８の近くに特定された。免疫金電子顕微鏡観察により、先体腔に面する先体膜に、ＭＮ９エピトープが存在するエクアトリンＮ末端の局在が見出された。エクアトリンのこれらの生化学的特性及び局在性は、配偶子相互作用をもたらす移行機構のさらなる分析に重要である。
【００１６】
受精を阻害する化合物を同定する方法は、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するマウスエクアトリンの領域、又は配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するヒトエクアトリンの領域と結合する化合物を選択することを含み得る。マウスエクアトリンの領域は、マウスエクアトリンの配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列における１０１位〜１４６位のアミノ酸配列を含む領域であり得る。ヒトエクアトリンの領域は、ヒトエクアトリンの配列番号５のアミノ酸配列における９２位〜１４４位のアミノ酸配列を含む領域であり得る。受精を阻害する化合物を同定する方法は、（１）マウスエクアトリン又はヒトエクアトリンを試験化合物と接触させる工程、（２）上記領域を認識する抗体のマウスエクアトリン又はヒトエクアトリンとの結合を検出する工程、及び（３）試験化合物と接触させない場合における抗体のマウスエクアトリン又はヒトエクアトリンとの結合と比較して、結合を低減する化合物を選択する工程を含み得る。抗体は、受精を阻害する効果を有することができる。抗体は、マウスエクアトリンの当該領域を認識する抗体であり得る。マウスエクアトリン又はヒトエクアトリンは、培養細胞において発現させることができる。マウスエクアトリンは、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列の１０１位〜１４６位の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有する、マウスエクアトリンの部分ペプチドであり得る。ヒトエクアトリンは、配列番号５のアミノ酸配列の９２位〜１４４位の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有する、ヒトエクアトリンの部分ペプチドであり得る。本方法は、選択された化合物を雄性生殖細胞と接触させること、該雄性生殖細胞と雌性生殖細胞との間の受精を検出すること、及び受精を阻害する化合物を選択することを更に含み得る。
【００１７】
本発明者らは、図１〜図４に示されるように、エクアトリン遺伝子をクローニングし、この遺伝子が高度にグリコシル化されたタンパク質をコードすることを見出した。エクアトリンの生化学的性質に関しては、エクアトリンは成熟精子において高度にグリコシル化されたシアロ糖タンパク質であるため、エクアトリンをＳＹＰＲＯルビー（図１Ｂ、レーン３及びレーン４）又は銀染色（データは示していない）により検出することはできなかった。対照的に、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００染色（図２、レーン６）によりエクアトリンのバンドは検出可能となり、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための切り出しに十分な染色強度が示された。このように伝統的なタンパク質染色プロトコルを使用してエクアトリンの検出ができないことは、これらのプロトコルにおける糖タンパク質の染色を妨げる、シアル酸部分を含む豊富な炭水化物に起因し得る。実際に、脱シアル化したエクアトリンは、銀染色により検出された（データは示していない）。フラゲラシアリン（flagellasialin）を含む他の糖タンパク質も、標準的なゲル染色、例えば銀染色及びクーマシーブリリアントブルー染色による検出可能性の低さを示すことが報告されている［４０］。
【００１８】
エクアトリン相同体の配列アライメント分析に基づくと、哺乳動物においては長鎖形態特有の領域が高度に保存されている。現在のところ、長鎖形態がエクアトリンの短鎖形態の前駆体であることを確認するのに利用可能なデータは存在しない。長鎖形態及び短鎖形態がとのような理由で若しくはどのようにして精巣中に存在するのか、又はどちらの形態が翻訳されるのかは、明らかでない。
【００１９】
図４Ｂを参照して以下に記載されるエクアトリンのグリコシル化研究から得られた結果により、シアル化形態が少なくとも４０ｋＤａであると推定される（図１）のに対して、非シアル化（asialylated）形態が２７ｋＤａであると推定される（図４Ｂ）ことが示される。ノイラミニダーゼ処理により相対分子質量がおよそ１３ｋＤａ低減したという事実を考慮すると、エクアトリンは高度にシアル化されている、又はポリシアル化されていると予想されるが、この低減が、安定性の喪失により導かれるタンパク質切断［４１、４２］、又はノイラミニダーゼ処理により活性化された内在性プロテアーゼにより導かれるタンパク質切断のいずれかに起因するという可能性を完全に除外することはできない。
【００２０】
ＭＮ９エピトープに関しては、Ｎ−結合型炭水化物を遊離させることが知られている［４３］ＰＮＧアーゼ処理の後に、（図４Ｂを参照して以下に記載されるように）ＭＮ９抗体により依然としてエクアトリン分子が検出されたため、このエピトープがＮ−結合型炭水化物部分を含有する可能性は低い。加えて、ノイラミニダーゼ処理の後にエクアトリンを検出することができた（図４Ｂ）ため、ＭＮ９エピトープにノイラミン酸残基が必須である可能性も低い。アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のノイラミニダーゼは、α２−（３，６，８）−結合型ノイラミン酸残基を遊離させることが知られている［４４］。リン酸化の可能性に関しては、ＣＩＡＰ処理の後でさえも精子エクアトリンのＭＮ９抗原性が残存しており（図４Ａ）、ＭＮ９エピトープはリン酸化されていないことが示された。Ｏ−グリコシル化の可能性に関しては、ＭＮ９エピトープはＯ−グリコシル化阻害剤ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃに対して感受性が高く（図４Ｃ）、Ｏ−グリコシル化がＭＮ９エピトープに関与していることが示唆された。加えて、スレオニン１３８からアラニンへの置換によりＭＮ９抗体による検出性が失われたという所見（図５Ｃ）により、ＭＮ９エピトープ領域がスレオニン１３８の周りに局在することが示される。まとめると、これらのデータにより、ＭＮ９エピトープがスレオニン１３８の周りにＯ−グリコシル化を含有すること、又はＭＮ９抗体が認識することができるエクアトリンの立体構造にこの修飾が少なくとも必要であることが強く示唆される。マウスエクアトリンのスレオニン１３８に対応するスレオニンが、ヒトを含む多くの哺乳動物においてよく保存されていることは注目に値する。これとの関連では、グリカン構造を含むスレオニン１３８の周りの構造を明らかにするためにさらなる分析が必要とされる。精子卵子相互作用に関与するエクアトリンのドメインに関しては、抗ＥＱ７０〜８３ペプチド抗体は精子卵子相互作用を阻害せず（データは示していない）、スレオニン１３８の周りのＭＮ９エピトープドメインの重要性が示唆された。
【００２１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰタグ付きエクアトリン研究（図５）、及び免疫金染色分析（図６）から得られた以下に記載される結果により、図７に示されるように、エクアトリンが先体内膜に主に存在し、そのＮ末端が先体腔に面することが示される。過去に報告された［１１、１２、２３］ように、先体反応前には、エクアトリンが精子の細胞膜上に見出されることはない。先体反応時には、幾らかのエクアトリンが、先体から放出され、精子卵子融合が起こる赤道部分上の細胞膜に到達した［１１、１２、２３］。先体反応時に移行する先体膜貫通タンパク質の詳細な所在を示す報告は存在しないようである。幾つかの先体タンパク質、例えばＩｚｕｍｏ１及びＳＰＡＣＡ４も、精子細胞表面に移行することが報告されている。
【００２２】
要約すると、エクアトリンは、Ｎ末端の２０ａａにおける推定シグナルペプチド領域、及び１８６位〜２０８位の残基の膜貫通領域から構成される４０ｋＤａ〜５０ｋＤａの１型膜貫通Ｎ，Ｏ−シアロ糖タンパク質である。ＭＮ９抗体により認識される配偶子相互作用を阻害するエピトープは、翻訳後修飾、最も可能性が高いのはスレオニン１３８におけるＯ−グリコシル化を必要とする。したがって、これまでに蓄積された証拠により、エクアトリンのＮ末端側がＭＮ９エピトープを有し、先体腔に面する（図７）ことが示唆される。先体反応時に、先体膜上の幾らかのエクアトリンが、赤道部分を覆う細胞膜の表面上に移行し、先体内膜上のエクアトリンが曝露される。赤道部分に到達するスレオニン１３８の周りのエクアトリンのドメインは、精子卵子相互作用において一定の役割を果たすことができる。
【００２３】
本発明を例示することを意図する以下の実施例により、本発明を更に明らかにする。
【実施例】
【００２４】
ヒト精子に関する間接免疫蛍光（ＩＩＦ）画像
ＭＮ９抗体を用いたＩＩＦのために、ヒトが射精した精子を、培養グレードの培地（市販されている）でリンスし、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分間処理した。それから、精子を１／２００００の希釈率のＭＮ９抗体で、４℃で終夜処理した。処理後、精子をＰＢＳで複数回リンスし、引き続きＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（０．５μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳでリンスした後、適切な蛍光用フィルター及びＣＣＤカメラＲＥＴＩＧＡ Ｅｘｉ ＦＡＳＴ １３９４（Qimaging, Surrey, BC, Canada）から構成される画像化システムを備えた、油浸式（oil-imersed）ＵＰｌａｎＡｐｏ１００対物レンズを使用するＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０顕微鏡（Olympus Co., Tokyo, Japan）を用いて観察を行った。データの取得及び保存は、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ４ソフトウェア（Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO, USA）により制御した。
【００２５】
ヒト精子に関するウエスタンブロット
３日間の禁欲後にマスターベーションにより回収されたヒトが射精した精子を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、ＳＤＳ試料緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、２％ ＳＤＳ［ｗ／ｖ］、１０％［ｖ／ｖ］グリセロール、０．００２％［ｗ／ｖ］ブロモフェノールブルー）中で均質化した。ロード直前に試料を９８℃で１０分間煮沸した後、不溶性成分を、１６０００ｇ、１０分間の遠心分離により除去した。単離した上清（１レーン当たり２．５×１０６個の精子）をロードし、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により１２．５％ゲル中で分離した。分離されたタンパク質を、ポリビニリデンジフルオリド膜（Millipore, Bedford, MA, USA）上にブロッティングした。膜を、バックグラウンドを抑えるために５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％［ｗ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ２０）に６０分間浸し、（１／４０００の希釈率の）ＭＮ９抗体で室温にて６０分間処理した。ＴＢＳ−Ｔでリンスした後、膜を、（１／１００００の希釈率の）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体で６０分間処理した。膜をＴＢＳ−Ｔでリンスした後、反応したタンパク質を、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（GE Healthcare）を使用して可視化し、Ｘ線フィルムに露光した。
【００２６】
材料及び方法
動物及び試薬
雄性ＩＣＲマウス（１６週齢）を、Charles River Japan（Yokohama, Japan）から購入し、空調された部屋（１２時間の明／暗サイクル、２４℃）で、飼料及び水を自由に摂取できるようにして維持した。この研究は、千葉大学大学院医学研究院の実験動物の世話及び使用に関するガイドラインに従って実施した。
【００２７】
エクアトリンを特異的に認識するモノクローナル抗体ＭＮ９（ＩｇＧ２ａ）を、ＣＤ１マウス由来の精巣上体尾部の精子で雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することにより、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて産生させた。抗体の産生、精製及び特徴付けは、過去に報告した［１１、１２、２３、２４］。ＥＱ７０〜８３抗体は、以下に記載されるように、エクアトリンの７０位〜８３位の残基の１４アミノ酸（ａａ）に対して新たに見出された特異的な抗体である。
【００２８】
使用した一般的な化学物質及び抗体は以下の通りであった：ＨＲＰ結合型ヒツジ抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合型ロバ抗ウサギＩｇＧ、ＰＹ２０マウス抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（GE Healthcare; Little Chalfont, Buckinghamshire, UK）；Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００糖タンパク質ゲル染色キット、ＳＹＰＲＯルビータンパク質ゲル染色剤、ウサギ抗ＧＦＰ抗体ＩｇＧ画分、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ロバ抗マウスＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）；Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８及びＯ−グリコシル化阻害剤ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ）［２９］（Sigma Aldrich; St. Louis, MO, USA）；並びに５ｎｍ及び１０ｎｍのコロイド金結合型抗マウスＩｇＧ（BBInternational, Cardiff, UK）。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｐｒｏｔｅｃｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen Sciences, Germantown, MD, USA）を使用して抽出した。本発明者らは、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を使用するオリゴ（ｄｔ）プライミングによりｃＤＮＡを合成した。ＰＮＧアーゼＦ、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（New England Biolabs, Beverly, MA, USA）及びノイラミニダーゼ（アルスロバクター・ウレアファシエンス；Marukin Bio, Kyoto, Japan）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【００２９】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析を使用して、様々な組織におけるエクアトリンの分布を調べ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えエクアトリンタンパク質の発現、脱リン酸化、脱グリコシル化、及びアミノ酸置換アッセイを検証した。これらの実験のための試料を、ＳＤＳ試料緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、２％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０％［ｖ／ｖ］グリセロール、０．００２％［ｗ／ｖ］ブロモフェノールブルー）で抽出した。可溶化物を９８℃で１０分間加熱し、１６０００ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質を除去した。それから可溶化物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＰＶＤＦ；Millipore, Bedford, MA, USA）上にブロッティングした。ウエスタンブロット分析を、ブロッキング溶液として及び抗体希釈のために５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％［ｗ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ２０）を使用する、標準的なプロトコルに従って行った。ウエスタンブロット分析のために使用した抗体濃度は以下の通りであった：ＭＮ９抗体は１：４０００（約０．１μｇ／ｍｌ）、ＥＱ７０〜８３抗体は０．３μｇ／ｍｌ、抗ＧＦＰ抗体は１μｇ／ｍｌ、及びＨＲＰ結合型二次抗体は１：１００００。ブロットを、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出試薬（GE Healthcare）を用いて発色させ、Ｘ線フィルムに露光した。
【００３０】
質量分析のための試料調製
精子（１．３×１０９個）を、精巣上体尾部から取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。それから精子を、コンプリートプロテアーゼインヒビターズ（Roche Diagnostics）とともに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳに懸濁し、氷上で１０分間維持し、それから２９０ｇで１０分間遠心分離した。沈殿した精子を、コンプリートプロテアーゼインヒビターズを含有するＳＤＳ−ＥＤＴＡ溶液（７５ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、［ｐＨ６．０］）で抽出し、１６０００ｇで１０分間遠心分離して、不溶性の残渣を除去した。肝臓を、陰性対照としてＳＤＳ−ＥＤＴＡ溶液で直接抽出した。ＳＤＳ−ＥＤＴＡ溶液抽出物を、２Ｄクリーンアップキット（GE Healthcare）により沈殿させた。沈殿させたタンパク質を、ＮＰ−４０溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］）に再懸濁した。可溶化物を、プロテインＧセファロース（GE Healthcare）を用いて４℃で１時間予備精製し、１０μｇのＭＮ９抗体と共に４℃で終夜インキュベーションした。プロテインＧセファロースビーズを添加し、４℃で１時間インキュベーションした。ビーズを、ＮＰ−４０溶解緩衝液で３回、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１回洗浄した。それからビーズをＳＤＳ試料緩衝液に懸濁し、９８℃で５分間加熱して、沈殿を解離させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、試料を、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００、ＳＹＰＲＯルビー、及びＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用して検出した。目的のバンドを、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００で染色したゲルから切り出した。ゲル内トリプシン消化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、過去に報告された［３０］ように行った
【００３１】
アライメント分析
相同体検索をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラム［３１］を使用して行い、配列アライメントをＴ−Ｃｏｆｆｅｅサーバー［３２、３３］を使用して行った。シグナルペプチド領域を、ＳｉｇｎａｌＩＰ３．０サーバー［３４、３５］を使用して予測した。膜貫通ドメインを、ＴＭＨＭＭ２．０サーバー［３６、３７］を使用して予測した。
【００３２】
抗体産生
結果の節に記載されるようなエクアトリンの同定の後に、抗エクアトリンポリクローナル抗体を産生させ、ＥＱ７０〜８３抗体と称することとした。簡潔に述べると、ウサギを、キーホールリンペットヘモシアニンと結合したエクアトリンの１４残基の合成部分配列（GNYYKDIKQYVFTT（配列番号６））で免疫した。それからＥＱ７０〜８３抗体を、１４残基の合成ペプチドと結合したビーズを使用してアフィニティ精製し、最終濃度１．２ｍｇ／ｍｌに調整した。ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体はウエスタンブロット及び免疫蛍光に関して同様の染色パターンを示した（図９）ため、ＥＱ７０〜８３抗体が抗エクアトリン抗体であることが検証されたとみなし、この研究で使用した。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
様々な組織におけるエクアトリンｍＲＮＡの発現を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。使用した特異的なプライマー対は以下の通りであった：Ｅｑｔ−フォワード（５'−AATGCTGGGGATCTCGCTGATG−３'（配列番号７））及びＥｑｔ−リバース（５'−ATTACTCGGTGATCCTTCCTTGTTC−３'（配列番号８））。Ｇａｐｄｈ−フォワード（５'−ACCACAGTCCATGCCATCAC−３'（配列番号９））及びＧａｐｄｈ−リバース（５'−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−３'（配列番号１０））を対照として使用した。エクアトリン長鎖形態の５５０位〜１０１１位のヌクレオチドを、部分的に増幅させた。増幅は２５サイクルで行った：９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長。
【００３４】
組換えタンパク質の産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、理化学研究所のＣｅｌｌ Ｂａｎｋ（Japan）から購入し、１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地中において空気中５％ＣＯ２下で３７℃にて培養した。ベクターを、製造業者の（manufacture's）マニュアルに記載されるようにＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Roche Diagnostics）を使用してトランスフェクションした。簡潔に述べると、細胞を、トランスフェクション後に２４時間（アミノ酸置換研究に関しては、高濃度を得るために４８時間）培養し、ＰＢＳで洗浄した細胞を、ウエスタンブロット分析のためにＳＤＳ試料緩衝液中で可溶化した。ベクター構築物を、ベクター構築の節に記載する。
【００３５】
精巣及び精巣上体に関する間接免疫蛍光（ＩＩＦ）顕微鏡検査
エクアトリンの発現を詳細に調べるために、ＩＩＦ顕微鏡検査を、ＭＮ９抗体及びＥＱ７０〜８３抗体を用いて行った。雄性ＩＣＲマウスを、ネンブタール（Abbott Laboratories, Abbott Park, 140 IL, USA）で麻酔し、左心室への灌流によりブアン固定液で固定した。精巣及び精巣上体を取り出し、同じ固定液中に１時間浸漬した。勾配エタノール系列及びキシレン中で脱水した後、試料を、パラフィン包埋処理し、切り出して２．５μｍの厚みの切片とした。切片を脱パラフィン化し、１２０℃で５分間オートクレーブして抗原性を活性化した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で３０分経過させた後、非特異的な抗体の結合を、ブロッキング緩衝液（５％正常ヤギ血清及び３％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）中における室温で３０分間のインキュベーションにより抑制した。それから切片を、ＭＮ９抗体（希釈率１：２００００、約０．０２μｇ／ｍｌ）及びＥＱ７０〜８３抗体（０．６μｇ／ｍｌ）と共に４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳ中でリンスした。それから切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ヤギ抗ウサギＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（５μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベーションした。適切な蛍光用フィルター及びＲＥＴＩＧＡ Ｅｘｉ ＦＡＳＴ １３９４ ＣＣＤカメラ（Qimaging, Surrey, BC, Canada）から構成される画像化システムを備えた、ＵＰｌａｎＡｐｏ４０×ＮＡ０．８５乾式対物レンズを用いるＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０（Olympus Co., Tokyo, Japan）顕微鏡を使用して観察を行った。データの取得及び保存を、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ４ソフトウェア（Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO, USA）により制御した。
【００３６】
子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）によるエクアトリンの脱リン酸化
精巣上体尾部から取り出した精子を、ＰＢＳで洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液で抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。ＰＶＤＦ膜を、ＣＩＡＰ（２０Ｕ／ｍｌ）を含むＮＥＢ緩衝液３（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ［ｐＨ７．９］、ＥＤＴＡフリー コンプリートミニプロテアーゼインヒビターズ）中において３７℃で１時間インキュベーションし、それから膜を、ＭＮ９エピトープのリン酸化状態を調べるためにＭＮ９抗体を用いて、又はＣＩＡＰ処理による脱リン酸化を確認するために対照としてＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体（０．１μｇ／ｍｌ）を用いて、免疫染色に供した。対照（脱リン酸化していない）試料を、ＣＩＡＰの非存在下でインキュベーションした。１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ−Ｔを、ブロッキング溶液に使用した。
【００３７】
ＰＮＧアーゼＦ処理及びノイラミニダーゼ処理
グリコシダーゼ処理を、基本的に製造業者の取扱説明書（New England Biolabs）に従い、わずかに修正して行った。ノイラミニダーゼを、ＰＮＧアーゼＦ処理プロトコルに同時に添加した。精子を、精巣上体尾部から取り出し（試験管１本当たり５μｌのＰＢＳ中に５×１０５個の精子を懸濁した）、ＰＢＳで洗浄し、１μｌの変性緩衝液（５％ ＳＤＳ、０．４Ｍ ＤＴＴ）を添加することにより変性させ及び可溶化し、９８℃で１０分間加熱した。それから試料を、２μｌのＧ７緩衝液（０．５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）及び２μｌの１０％ ＮＰ−４０を添加することにより中和し、１６０００ｇで遠心分離して、不溶性物質を除去した。回収された上清中のプロテアーゼ活性を、コンプリートプロテアーゼインヒビターズ、及び１μｇ／ｍｌのペプスタチン（Roche Diagnostics）を添加することにより抑制した。ＰＮＧアーゼＦ（１２５Ｕ）、若しくはアルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼ（０．０５Ｕ）、又はその両方を上清に添加し、３７℃で１２時間インキュベーションした。それから試料を等体積のＳＤＳ試料緩衝液と混合し、ウエスタンブロット分析に供した。対照試料を、これらのグリコシダーゼの非存在下でインキュベーションした。
【００３８】
エクアトリンのＯ−グリコシル化のベンジル−α−ＧａｌＮＡｃによる阻害
ｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−ＥＧＦＰベクターのトランスフェクション前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に０ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭのベンジル−α−ＧａｌＮＡｃを添加した（supplemented）。細胞を、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃの存在下で少なくとも２４時間培養し、それからＳＤＳ試料緩衝液中で可溶化し、ウエスタンブロット分析に供した。免疫ブロットのデンシトメトリー分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html）を使用して行った。０ｍＭ ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃでのＥＱ７０〜８３抗体の免疫染色強度に対するＭＮ９抗体の免疫染色強度の相対比率（ＭＮ９／ＥＱ７０〜８３）を、１とみなした。それから、２ｍＭ及び４ｍＭ ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃでのＭＮ９／ＥＱ７０〜８３の相対比率を算出した。結果を棒グラフに示す。ベクター構築物を、ベクター構築の節に記載する。
【００３９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞膜におけるエクアトリンエピトープ領域の所在の決定
ＭＮ９エピトープを特定するために、細胞膜中におけるエクアトリンの所在を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において調べた。細胞を、ポリエチレンイミン（Sigma Aldrich）でプレコーティングしたガラス底皿（AGC Techno Glass Co., Ltd. Chiba, Japan）上で培養し、Ｃ末端ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンベクター（ｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−ＥＧＦＰと称する）でトランスフェクションした。細胞を、トランスフェクション後少なくとも２４時間培養し、ＰＢＳで１回洗浄した。その後細胞を、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳで３０分間固定した。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、細胞を、インキュベーションし、又は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間透過処理し、次いで室温で１時間ＭＮ９抗体（希釈率１：４００００、約０．０１μｇ／ｍｌ）、ＥＱ７０〜８３抗体（０．２４μｇ／ｍｌ）又は抗ＧＦＰ抗体（２μｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションし、ＰＢＳでリンスした。それから細胞を、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ロバ抗マウスＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（５μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベーションした。細胞を、ＣＳＵ−ＸＩ共焦点スキャナ（Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan）を備えたＵＰＬＳＡＰＯ６０×ＮＡ１．２水浸式対物レンズを用いるＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１（Olympus）顕微鏡を使用して分析した。３Ｄ投影画像を、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ４ソフトウェアにより制御されるＱｕａｎｔＥＭ ５１２ＳＣ ＣＣＤカメラ（Photometrics, Tucson, AZ, USA）を使用して撮影した。
【００４０】
免疫金電子顕微鏡検査
ＴＹＨ（Toyoda, Yoshida and Hoshi）培地［３８］中で２回洗浄した後、精巣上体尾部の精子を−８０℃で１回凍結し、一次抗体を適用する前に解凍して、膜を透過処理した。ＭＮ９抗体を、精子に１時間適用した。それから、精子を、コロイド金結合型抗マウスＩｇＧ（約１μｇ／ｍｌ）の溶液中で１時間インキュベーションした。培地中でリンスした後、精子を、１％グルタルアルデヒド中で固定し、２％四酸化オスミウム溶液中で後固定した。固定した精子を、２％寒天中に包埋し、エタノール系列中でルーチン的に脱水し、Ｅｐｏｎ８１２（TAAB Laboratories Equipment, Berks, UK）中に包埋した。超薄切片を、ウルトラミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｅ、Reichert-Jung, Wien, Austria）を使用して通常の手順で作製し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１２００ ＥＸ、JEOL, Tokyo, Japan）を用いた観察のために鉛及び酢酸ウラニルで染色した。
【００４１】
マウス組換えエクアトリンに関するベクター構築
ＦＡＮＴＯＭ ＦＬＳクローン（ＩＤ：１７０００２８Ｂ１５（クローニングされたマウスエクアトリン長鎖形態に関連する）を、ＤＮＡＦＯＲＭ（Kanagawa, Japan）から購入した。エクアトリン長鎖形態を、Ｃ末端６×ＨｉｓタグとインフレームのｐＥＴ−２３ａ（Novagen, Madison, WI, USA）中に挿入し（ｐＥＴ−２３ａ−Ｅｑｔ（Ｌ）−Ｈｉｓと称される）、そして大腸菌のタンパク質発現に使用した。ｐＥＴ−２３ａ−Ｅｑｔ（Ｌ）−Ｈｉｓベクターを、ＢａｍＨＩ及びＢｐｕ１１０２Ｉにより消化した。断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（Toyobo co., Ltd., Osaka, Japan）により平滑断端化し、そしてＥｃｏＲＶで消化してＣＩＡＰで処理したｐＫＳＣＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ中にライゲーションした。このプラスミドを、ｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−Ｈｉｓと称することとし、哺乳動物細胞の培養に使用した。ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンタンパク質発現ベクターｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−ＥＧＦＰを、ｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−Ｈｉｓから開始して、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ突然変異誘発キット（Toyobo）を使用する逆ＰＣＲ突然変異誘発法により、適切なプライマー（表１）を使用して製造業者の取扱説明書に従い、Ｈｉｓタグ及びＩＲＥＳを欠失させることにより作り出した。エクアトリン短鎖形態及びエクアトリン変異タンパク質発現（部分欠失及び単一アミノ酸置換）のためのベクターも、ＰＣＲベースの突然変異誘発を使用して作り出した（表１）。全てのベクターを、ＤＮＡ配列解析により検証した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
結果
様々な組織におけるエクアトリンの分布
様々な組織におけるエクアトリンの分布を測定するために、ＭＮ９抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。可溶化したタンパク質（２０μｇ／レーン）をロードした。各レーンに存在する組織試料は以下の通りであった：レーン１、大脳；レーン２、小脳；レーン３、心臓；レーン４、肺；レーン５、肝臓；レーン６、膵臓；レーン７、脾臓；レーン８、腎臓；レーン９、膀胱；レーン１０、大腸；レーン１１、小腸；レーン１２、精巣；レーン１３、精巣上体頭部；レーン１４、精巣上体体部；レーン１５、精巣上体尾部。調べた組織のうち、４０ｋＤａ〜６５ｋＤａの範囲のエクアトリンのバンドが、図１Ａ、レーン１２に示されるように精巣に、図１Ａ、レーン１３〜レーン１５に示されるように精巣上体に見出された。他の組織ではバンドは検出されなかった（図１Ａ、レーン１〜レーン１１）。肝臓試料においてはＭＮ９抗体によりバンドは検出されなかった（図１Ａ、レーン５）ため、肝臓を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための免疫沈降に関して陰性対照として使用した。
【００４４】
エクアトリンの同定、及びアミノ酸配列の分析
エクアトリンを、ＭＮ９抗体を用いた免疫沈降により精製した。ＳＹＰＲＯルビー染色及びＰｒｏ−Ｑエメラルド３００染色に関しては同量の免疫沈降物を各レーンにロードした（レーン３〜レーン６）が、ウエスタンブロットに関しては１／５０の量をロードした（レーン１及びレーン２）。各レーンに存在する組織試料は以下の通りであった：レーン１、レーン３及びレーン５−肝臓（陰性対照）；並びにレーン２、レーン４、レーン６−精巣上体尾部の精子。レーン１及びレーン２では、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロットを行った。レーン３及びレーン４では、ＳＹＰＲＯルビー染色を行った。レーン５及びレーン６では、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００染色を使用した。エクアトリンは４０ｋＤａに集中した（レーン２及びレーン６）。精製したエクアトリンは、図１Ｂ及び図８に示されるように４０ｋＤａのバンドと同定された。ウエスタンブロット分析により最初に４０ｋＤａに検出された（図１Ｂ、レーン２）エクアトリンは、従来の染色方法、例えば銀染色（公開していないデータ）又はＳＹＰＲＯルビー染色（図１Ｂ、レーン４）によっては検出することができなかったが、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００染色（図１Ｂ、レーン６）により検出されたことを強調することが重要である。対照肝臓試料（図１Ｂ、レーン１、レーン３及びレーン５）にはバンドは検出されなかった。
【００４５】
エクアトリンであると予想される４０ｋＤａのバンドを切り出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。Ｍａｓｃｏｔ検索の結果により、１つの重要な候補４９３０５７９Ｃ１５Ｒｉｋが示された。理化学研究所のＦＡＮＴＯＭ（マウスの機能注釈）全長ｃＤＮＡデータベース（http://fantom.gsc.riken.go.jp）に基づき、ＩＣＲマウスの精巣から調製されたｃＤＮＡを配列解析することによるタンパク質コード領域（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪアクセッション番号：長鎖形態に関してはＡＢ４３８１０５、及び短鎖形態に関してはＡＢ４３８１０６）の検証のために、プライマーを設計した。
【００４６】
得られたデータを、相同体検索及びドメイン検索に基づき、ヒト及びマウスの両方に関するアミノ酸配列アライメントにより分析した。得られたペプチド配列を、図２に示す。アライメント中の同一の配列を、アスタリスクを用いて示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出されたペプチド配列を、ボールド体の文字で示す。１４アミノ酸の配列（ボックスで囲んだ領域）を使用して、ＥＱ７０〜８３抗体を産生させた。推定シグナルペプチド領域に網掛けし、推定膜貫通ドメインに下線を付す。アミノ酸配列から予測された分子量は、エクアトリンの短鎖形態（２９６ａａ）に関しては３３０４２Ｄａであり、長鎖形態（３３７ａａ）に関しては３７７６４Ｄａであった。Ｎ末端の１位〜２０位の残基に推定シグナルペプチド領域が、１８６位〜２０８位の残基に膜貫通領域が存在した。
【００４７】
アミノ酸配列アライメントに基づき、７０位〜８３位の残基の範囲のオリゴペプチド（ヒト及びマウスの両方において高度に保存された領域）を使用して、ＥＱ７０〜８３と称する特異的な抗体を産生させ、これをこの研究のさらなる実験に使用した。
【００４８】
組織におけるエクアトリンｍＲＮＡの発現
エクアトリンの発現を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えタンパク質を使用して調査した。様々な組織におけるエクアトリンのｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析した。興味深いことに、２つのバンド（長鎖形態及び短鎖形態の両方）が、図３Ａ、レーン１１に示されるように、精巣に存在した。各レーンに存在する組織試料は以下の通りであった：レーン１−大脳；レーン２−小脳；レーン３−心臓；レーン４−肺；レーン５−肝臓；レーン６−脾臓；レーン７−腎臓；レーン８−膀胱；レーン９−大腸；レーン１０−小腸；レーン１１−精巣；レーン１２−精巣上体頭部；レーン１３−精巣上体体部；レーン１４−精巣上体尾部。精巣上体を含む他の組織においてバンドは検出されなかった（図３Ａ、レーン１〜レーン１０及びレーン１２〜レーン１４）。
【００４９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えエクアトリンの発現：検証研究
組換えタンパク質によるエクアトリンの検証を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施した。エクアトリンの固有性（identity）を検証するために、長鎖形態、短鎖形態、ＥＧＦＰタグ付き長鎖形態及びＥＧＦＰタグ付き短鎖形態に関するエクアトリン発現ベクターを開発し、これらのエクアトリンベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、ＭＮ９抗体を使用するウエスタンブロット（１０％ゲル）により分析した。同量の培養細胞抽出物を、各レーンにロードした。短鎖形態（レーン１）、長鎖形態（レーン２）、ＥＧＦＰタグ付き短鎖形態（レーン３）及びＥＧＦＰタグ付き長鎖形態（レーン４）に関する発現ベクター。短鎖形態及び長鎖形態が６０ｋＤａ〜８５ｋＤａに見出された（レーン１及びレーン２）が、ＥＧＦＰタグ付き短鎖形態及びＥＧＦＰタグ付き長鎖形態が１０５ｋＤａに見出された（レーン３及びレーン４）。短鎖形態及び長鎖形態の両方が６０ｋＤａ〜８５ｋＤａと同定された（図３Ｂ、レーン１及びレーン２）が、ＥＧＦＰタグ付き短鎖形態及びＥＧＦＰタグ付き長鎖形態の両方がおよそ１０５ｋＤａというはるかに上のバンドとして検出された（図３Ｂ、レーン３及びレーン４）。ＥＧＦＰタグ付きタンパク質は非タグ付きタンパク質より相対分子質量が高いバンドとしてＭＮ９抗体により検出されたため、クローニングした配列がエクアトリンであることが検証された。ＭＮ９抗体は、大腸菌において発現したエクアトリンタンパク質を認識しなかった（データは示していない）。
【００５０】
精巣及び精巣上体におけるエクアトリンの分布
次いで、本発明者らは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いた間接免疫蛍光（ＩＩＦ）顕微鏡検査を使用して、詳細なエクアトリンの分布を決定した。これらの抗体のエピトープは異なっている。ＥＱ７０〜８３抗体はエクアトリンの７０位〜８３位の残基の小ペプチド領域を認識するが、ＭＮ９抗体は、翻訳後修飾（考察で述べる）を受ける抗原領域を認識する。図３Ｃは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いたＩＩＦ顕微鏡検査を使用して、精巣及び精巣上体尾部におけるエクアトリンの分布を示すものである。図３Ｃの画像ａ〜画像ｃは精巣を示す。図３Ｃの画像ｄ〜画像ｆは精巣上体尾部を示す。画像ａ及び画像ｄは、画像ａにおいて円状に分散し、画像ｄの右端及び左端において実質的にアスタリスクの周りに分散した小さな点としてＥＱ７０〜８３抗体を示す（図を色付けして示した場合、赤色で表される）。画像ｂ及び画像ｅは、画像ｂにおいて円状に、及び画像ｅにおいて実質的にアスタリスクの周りに分散した小さな点としてＭＮ９抗体を示す（画像を色付けして示した場合、緑色で表される）。画像ａ、画像ｂ及び画像ｃは、画像の外端に近接して分散した小さな点として、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８を用いた対比染色結果を示す（画像を色付けして示した場合、青色で表される）。ＥＱ７０〜８３抗体、ＭＮ９抗体及び微分干渉コントラスト画像の重ね合わせた画像を、図３Ｃ、画像ｃ及び画像ｆに示す。ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体の両方が、ステージＶＩＩの精細管（ＶＩＩ；ａ〜ｃ）の発生中の（developing）精細胞（ｓ７及びｓ１６）における、及び精巣上体の精子（アスタリスク；ｄ〜ｆ）における先体領域を認識するが、これらの抗体は精巣上体上皮（Ｅｐ；ｂ〜ｆ）を認識しないことに留意すべきである。Ｐ；パキテン期の精母細胞。ｓ７及びｓ１６；それぞれステップ７及びステップ１６の精細胞。バー＝５０μｍ。ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析により、組換えエクアトリンが検出された。したがって、ウエスタンブロット研究の結果（図１Ａ）に矛盾せず、ＩＩＦ顕微鏡検査により、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体により検出されるエクアトリンが精巣及び精巣上体の両方に存在して同じ染色パターンを示すが、精巣上体上皮細胞には存在しないことが示された。該タンパク質は、生殖細胞を含む精子に特有のものであった（図３Ｃ）。
【００５１】
エクアトリンのホスファターゼ処理
検証研究において、ＭＮ９抗体が大腸菌において発現させたエクアトリンタンパク質を認識しないことが見出されたため、ＭＮ９エピトープは、翻訳後に修飾されると考えられた。最初に、ＭＮ９エピトープの脱リン酸化の影響を、ＣＩＡＰを使用して調べた。図４Ａは、精子エクアトリンのリン酸化状態の、ＣＩＡＰ（ホスファターゼ（phoshatase））処理による分析結果を示す。ＰＶＤＦ膜上の精子タンパク質（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ；５μｇ／レーン）を、ＣＩＡＰを用いず（−）及びＣＩＡＰを用いて（＋）処理し、ＭＮ９抗体（上部パネル）で、又はＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体（下部パネル）で免疫染色した。ＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体を対照として使用して、精子タンパク質の脱リン酸化を確認した。ＣＩＡＰ処理後にＭＮ９抗原性が残存した（上部パネル）ことに留意されたい。ＣＩＡＰ処理後にＭＮ９抗体の免疫染色が残存したがＰＹ２０抗体の免疫染色は減少したという事実（図４Ａ）は、ＭＮ９抗体のエピトープがリン酸化されていないことを示唆している。
【００５２】
移動度シフトアッセイによるエクアトリンのグリコシル化の評価
エクアトリンがＰｒｏ−Ｑエメラルド糖タンパク質染色により検出されたため、精子尾部抽出物をＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼで処理して、エクアトリンがグリコシル化されているかどうか、及びＮ−グリコシル化又はシアル酸部分がＭＮ９抗体のエピトープ領域に関与するかどうかを測定した。酵素処理した試料を、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した（図４Ｂ）。レーン１〜レーン４において、精子尾部抽出物中のエクアトリンを、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット（１５％ゲル）により分析した。同量のＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼで処理した試料を、各レーンにロードした：レーン１−グリコシダーゼ処理なし；レーン２−ＰＮＧアーゼＦのみによる処理；レーン３−ノイラミニダーゼのみによる処理；レーン４−ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼによる処理。移動度のシフトが、ＰＮＧアーゼ処理及びノイラミニダーゼ処理の両方により観察されたが、ＭＮ９抗原性は残存した。ＰＮＧアーゼＦ処理により、エクアトリンの２つの主要なバンドの分子サイズがおよそ２ｋＤａ低減した：上部バンドは５０ｋＤａから４８ｋＤａまで移動し、下部バンドは４０ｋＤａから３８ｋＤａまで移動した（図４Ｂ、レーン１及びレーン２）。加えてＭＮ９抗体は、ノイラミニダーゼ処理後、２７ｋＤａの単一のバンドのみを認識した（図４Ｂ、レーン３及びレーン４）。このバンドが長鎖形態であるか、又は短鎖形態であるかは、現在のところ明らかでない。したがって、エクアトリンは、シアル化されたＯ−グリカンを伴うＮ−グリカンを有する、すなわちエクアトリンは、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａのＮ，Ｏ−シアロ糖タンパク質である。興味深いことに、ＭＮ９抗原性は、ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼでの処理により除去されず、これにより、ＭＮ９エピトープがエピトープ領域にＮ−結合型炭水化物も、シアル酸部分も含有しないことが示唆された。ＭＮ９抗原性におけるＯ−グリコシル化の関与を評価するために、組換えエクアトリンを、Ｏ−グリコシル化阻害剤ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃの存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させた。同量の培養細胞抽出物を、各レーンにロードし、１２．５％ゲル中で分離した。ブロットを、ＭＮ９抗体（図４Ｃ、上部パネル）及びＥＱ７０〜８３抗体（図４Ｃ、中央パネル）で免疫染色した。免疫染色したバンドを、デンシトメトリー（「材料及び方法」を参照されたい）により分析し、棒グラフで示した（図４Ｃ、下部パネル）。レーン上の数字は、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃの濃度を示す。エラーバーは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す。相対ＭＮ９抗原性（ＭＮ９／ＥＱ７０〜８３）は、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ濃度が増大するにつれて減少した。
【００５３】
ＭＮ９／ＥＱ７０〜８３の相対比率は、棒グラフ（図４Ｃ）に示されるように、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ阻害剤の濃度の増大と共に用量依存的に減少し、これにより、ＭＮ９エピトープにおけるＯ−グリコシル化の関与が示唆された。
【００５４】
エクアトリンのエピトープ領域の所在の決定
Ｃ末端ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を、抗体・非透過処理条件下又は抗体・透過処理条件下でＩＩＦにより調べた。図５Ａの画像ａ〜画像ｆは、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンのＩＩＦ顕微鏡検査によるモニタリングの結果を示す。図５Ａの画像ｃ〜画像ｆは、非透過処理条件下での４％ＰＦＡによる固定の結果を示す。図５Ａの画像ｇ及び画像ｈは、透過処理条件下での４％ＰＦＡによる固定の結果を示す。Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８対比染色を核に対して使用し、それは画像において球状に見える（画像を色付けして示した場合、青色で表される）。抗ＥＱ７０〜８３抗体は、画像ａにおいて球状の図形の周りに、及び部分的にその内部に分散したより薄い影で示され（図を色付けして示した場合、赤色で表される）、ＭＮ９抗体は、画像ｃにおいて球状の図形のうちの２つの周りに、及び部分的にその内部に分散したより薄い影で示され（図を色付けして示した場合、赤色で表される）、抗ＧＦＰ抗体は、画像ｅ及び画像ｇにおいて球状の図形のうちの１つの周りに、及びその外周部に分散したより薄い影で示される（図を色付けして示した場合、赤色で表される）。トランスフェクションした細胞においてＣ末端ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンは、画像ｂ、画像ｄ、画像ｆ及び画像ｈにおいて球状の図形の周りに、及び部分的にその内部に分散したより薄い影で示される（図を色付けして示した場合、緑色で示される）。バー＝１０μｍ。Ａｂ；抗体。非透過処理条件下で、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体の両方によりＥＧＦＰタグ付きエクアトリンが検出された（図５Ａ、ａ〜ｄ）が、抗ＧＦＰ抗体は、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンを認識することができなかった（図５Ａ、ｅ及びｆ）。透過処理条件下で、抗ＧＦＰ抗体によりＥＧＦＰタグ付きエクアトリンが検出された（図５Ａ、ｇ及びｈ）。
【００５５】
ＭＮ９エピトープに必須の翻訳後修飾を有するアミノ酸残基の決定
図５Ａの結果により、エクアトリンが１型膜貫通タンパク質であり、外表面に面するＮ末端側に在るＭＮ９エピトープを有することが示唆される（図５Ａ）。したがって、ＭＮ９エピトープに必須の翻訳後修飾が起こる正確なアミノ酸位置を特定するために、エクアトリンの部分アミノ酸配列（Δにより示される）を初めに欠失させ、その構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、ウエスタンブロット分析を使用して免疫染色の喪失を評価した（図５Ｂ）。ＭＮ９抗体は、ＥＱＴ（Ｌ）Δ２１〜５０−ＥＧＦＰ及びＥＱＴ（Ｌ）Δ３１〜１００−ＥＧＦＰを検出したが、ＥＱＴ（Ｌ）Δ３１〜１４６−ＥＧＦＰを検出することができなかった（図５Ｂ、上部パネル）。陽性対照である抗ＧＦＰ抗体は、全ての試料を検出した（図５Ｂ、下部パネル）。ＭＮ９のバンドより下へ泳動されたＧＦＰのバンドは、分解産物であった（図５Ｂ）。ＧＦＰはプロテアーゼに対する耐性が高い［３９］ため、ＧＦＰ自体はその抗原性を維持していたが、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンタンパク質のエクアトリン部分は分解され、ＭＮ９抗原性が除去された。
【００５６】
図４及び図５Ｂの結果に基づき、１０１位〜１４６位のアミノ酸残基におけるＯ−グリコシル化がＭＮ９エピトープに関与するという仮説を立てた。この領域にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により検出されない２つのセリン残基及び３つのスレオニン残基が存在した（図２）ため、本発明者らは、セリン及びスレオニンの単一アミノ酸置換変異タンパク質を、ウエスタンブロットにより分析した（図５Ｃ）。低濃度に起因する偽陰性シグナルを回避するために、エクアトリンを意図的にオーバーロードしたが、これは同時にタンパク質分解を引き起こし、スメアなバンドを示した。図５Ｂ及び図５Ｃに関して、同量の培養細胞抽出物を、各実験において各レーンにロードした。ＭＮ９抗体は、Ｔ１３８Ａ変異体を除く全ての変異タンパク質を検出した。これにより、スレオニン１３８において翻訳後修飾が起こること、及びこの修飾がＭＮ９エピトープ領域に関与することが示唆された。
【００５７】
免疫金電子顕微鏡検査
最後に、エクアトリンの局在性を、ＭＮ９抗体、凍結解凍後の前封埋法（preembedding method）を使用する免疫金電子顕微鏡検査（図６Ａ及び図６Ｂ）により特定した。図６Ａは、前先体領域の画像を示す。免疫金粒子（５ｎｍの金、矢頭）は、先体内膜（ＩＡＭ）上で豊富であり、先体腔（先体腔をアスタリスクにより示す）に面するが、先体外膜（ＯＡＭ）上には乏しい（この写真では金粒子がない）。この写真では、ＯＡＭは凍結解凍処理により部分的に破れており（二重の矢頭）、これにより先体膜への免疫金粒子の浸透が可能となった。免疫金粒子は細胞膜（ＰＭ）上に存在することはない。図６Ｂは、後先体領域（赤道部分）の画像を示す。免疫金粒子（１０ｎｍの金）が、ＩＡＭ（矢頭）及びＯＡＭ（二重の矢頭）の両方に存在し、ここで粒子は狭まった内腔に面する高電子密度の物質と結び付くようである。高電子密度の核周囲の物質は、ＩＡＭと核（Ｎ）との間に見出される。エクアトリンが、先体内膜上に豊富であるが先体外膜上に極めて少ないことが見出された。これは通常、前先体領域において観察される（図６Ａ）。対照的に、エクアトリンは、後先体領域（赤道部分）においては先体内膜及び先体外膜の両方で豊富であった（図６Ｂ）。免疫金粒子が無傷精子における細胞膜で観察されることはなかった（図６Ａ）。
【００５８】
図７は、精子頭部の概略図を示すことにより、先体におけるエクアトリンの局在性を示すものである。ＭＮ９エピトープは、先体外膜（ＯＡＭ）及び先体内膜（ＩＡＭ）の両方に存在する。赤道部分（ＥＳ）のボックスで囲んだ領域を、右側に拡大する。先体反応前には、エクアトリンのＮ末端が先体腔に向いている（図６）。ＡＡ、前先体；ＰＭ、細胞膜。
【００５９】
図８Ａは、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析（１０％ゲル）を示す。精巣上体尾部の精子由来のエクアトリンは、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａという広い見かけの分子量を有していた（レーン１）。エクアトリンは、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理後に４０ｋＤａのバンドに移動した（レーン２）が、エクアトリンは０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化しなかった（レーン３）。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理後、４０ｋＤａのエクアトリンはＳＤＳ−ＥＤＴＡ緩衝液中に可溶化した（レーン４）。図８Ｂは試料調製図を示す。レーン１；未処理の精子全体をＳＤＳ試料緩衝液中で直接可溶化した。レーン２；０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に懸濁した精子全体をＳＤＳ試料緩衝液中で可溶化した。レーン３；０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の精子懸濁液の遠心分離後の上清。レーン４；ＳＤＳ溶解液中に可溶化した、沈殿（レーン３の試料調製による）の遠心分離後の上清。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理により、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａのエクアトリンを４０ｋＤａの単一バンドとして集中させることが可能となった。この集中により、免疫沈降によるエクアトリンの効率的な精製が容易となる。
【００６０】
ＥＱ７０〜８３抗体の特異性を測定するために、ウエスタンブロット分析（１２．５％ゲル）を、ＥＱ７０〜８３抗体を用いて実施した（図９Ａ）。ＥＱ７０〜８３抗体は、ＭＮ９抗体が認識する（図１Ａ）ものと同じバンドを認識した。図９Ｂは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いた精巣上体尾部の精子のＩＩＦ顕微鏡検査結果を示す。先体が無傷の精子を画像ａ、画像ｄ及び画像ｇに示す。先体反応後の（Acrosome reacted）精子を画像ｂ、画像ｅ及び画像ｈに示す。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した精子を、ｃ、ｆ及びｉに示す。ＥＱ７０〜８３抗体は、画像ｂ及び画像ｃにおいて葉形の図として示される（図を色付けして示した場合、赤色で表される）。ＭＮ９抗体は、画像ｅ及び画像ｆにおいて葉形の図として示される（図を色付けして示した場合、緑色で表される）。ＥＱ７０〜８３抗体、ＭＮ９抗体及び微分干渉コントラスト画像の重ね合わせた画像を、画像ｇ〜画像ｉに示す。ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体の両方が、先体反応後の精子、及び先体膜を透過処理した精子の赤道部分を認識したが、先体膜が無傷の精子を認識しなかった。バー＝１μｍ。
【００６１】
図１０はマウス精子及びヒト精子に関するウエスタンブロット分析を示し、画像ａ及び画像ｂは、ＤＩＣを用いない（画像ａ）、及びＤＩＣを用いた（画像ｂ）ヒト精子頭部に関するＩＩＦ顕微鏡検査画像を示す。
【００６２】
出願人は、本開示において引用した全ての参考文献の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが、或る範囲、好ましい範囲、又は好ましい上方値及び好ましい下方値のリストのいずれかとして与えられる場合、範囲が別々に開示されるかどうかに関わらず、これは、任意の範囲上限又は好ましい値、及び任意の範囲下限又は好ましい値の任意の対からなる全ての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。或る数値範囲が本明細書で記載される場合、他に記載がなければ、その範囲は、その端点、並びにその範囲内の全ての整数及び分数を含むことが意図される。本発明の範囲を、或る範囲を規定する際に記載される特定の値に限定することは意図されない。
【００６３】
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討、及び本明細書で開示された本発明の実施から、当業者に明らかであろう。本明細書及び実施例は例示的なものにすぎず、本発明の真の範囲及び精神が添付の特許請求の範囲、及びその均等範囲により示されるものと考えられることが意図される。
【背景技術】
【０００１】
本出願全体を通じて角括弧（［］）中に記載される番号は、この節の最後に記載される参考文献に対応する番号を表すことを理解すべきである。
【０００２】
精子のＩｚｕｍｏ１［１］及び卵子のＣＤ９［２〜４］は、精子卵子融合に重要であることが知られる数種類の分子のうちに含まれる。Ｉｚｕｍｏ１は、先体反応前に先体に局在する１型膜貫通タンパク質であり、先体反応後に精子表面上に移動する［１］。このプロセスに関与する分子機構の詳細は依然として明らかでない。テトラスパニン分子であるＣＤ９は卵細胞膜上で発現するが、ＣＤ９−精子のリガンド相互作用の性質は依然として明らかでない。他に配偶子融合の候補分子がいくつか同定されている。しかしながら、遺伝子欠失研究により、これらの役割を他のタンパク質により置換又は迂回することができるが、これらは精子卵子融合に必須ではないことが示されている。これら分子は、ＣＲＩＳＰ１（ＤＥ）［９］及びＣＤ４６［１０］に加えて、それぞれファーティリンα、ファーティリンβ及びシリテスチン（cyritestin）としても知られるＡＤＡＭ１、ＡＤＡＭ２及びＡＤＡＭ３［５〜８］を含む。他にも精子卵子融合に必要とされる候補分子が報告されており、これらの機能が、特異的抗体阻害アッセイにより研究されている。これらは、ＭＮ９抗原としても知られるエクアトリン（ＥＱＴ）［１１、１２］、ＳＰＥＳＰ１（ＥＳＰ）［１３、１４］、ＳＰＡＣＡ４（ＳＡＭＰ１４）［１５］、ＳＰＡＣＡ１（ＳＡＭＰ３２）［１６］、及びＳＰＡＣＡ３（ＳＬＬＰ１）［１７］を含む。このように、精子卵子融合の基礎となる分子機構は、依然として不明である。
【０００３】
精子卵子融合の基礎となる分子機構を解析する際の幾つかの主な困難性には、精子タンパク質の生化学的性質及び局在性が含まれる。実際に、精子糖タンパク質が特有の炭水化物鎖を有し、排精後に精子卵子相互作用まで連続的な修飾を示すことが示されている［１８〜２２］。加えて、エクアトリン［２３］、Ｉｚｕｍｏ１［１］及びＳＰＡＣＡ４［１５］により観察されるように、幾つかの精子タンパク質の局在性は先体反応時に変化する。これら分子は、先体マトリクスから細胞表面まで移行する。これら修飾は、精子分子が精子卵子相互作用に向かうよう刺激する重要な工程であると考えられる。
【０００４】
エクアトリンは、哺乳動物の精子に広く分布する先体タンパク質である。本発明者らは、ヒトを含む哺乳動物にＭＮ９抗原エクアトリンが広く分布し、先体の赤道領域に対して強い親和性を示すことを過去に報告した［２４］。それゆえ、ＭＮ９抗原をエクアトリンと再命名した。機能的には、抗エクアトリン抗体ＭＮ９は、透明帯通過（zona penetration）及び精子卵子結合を阻害することなく表層粒の放出を阻害し、このことはＭＮ９が精子卵子融合、又は早期段階の卵子活性化を阻害することを示唆する［１１］。ＭＮ９抗体は、精子卵子相互作用を、ｉｎ ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ ｖｉｖｏでも阻害する［１２］。エクアトリンは先体反応時に、免疫金染色により観察されるように、赤道部分を覆う細胞膜へと移行する［２３］。赤道部分上の細胞膜は、卵子微絨毛の細胞膜と融合することが知られている［２５〜２８］。
【０００５】
これらの知見に基づき、本発明者らは、エクアトリン遺伝子を同定する必要があり、エクアトリンタンパク質の生化学的性質及び局在性を明らかにする必要があると判断した。特に、ＭＮ９抗体のエピトープ領域（ＭＮ９エピトープ）が精子卵子相互作用に関与するかどうかを決定するために、この領域の性質を理解する必要があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
1. Inoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe M. The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs. Nature 2005; 434: 234-238.
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【発明の開示】
【０００７】
本発明は、受精を阻害する化合物を同定する方法に関する。本方法は、エクアトリンタンパク質と結合する化合物を選択することを含み得る。長鎖形態及び短鎖形態の２種類のエクアトリンタンパク質が、精巣中に存在し得る。マウスエクアトリンの１３８位のＯ−グリコシル化スレオニン残基を含む１０１位〜１４６位のアミノ酸配列は、受精を阻害する効果を有する抗エクアトリン抗体ＭＮ９により認識されるエピトープを含有する。加えて、ＭＮ９抗体はヒト精子とも結合する。このエピトープと結合する化合物は、受精を阻害することができる。本発明の同定方法では、両方の形態のマウスエクアトリン、及びヒトエクアトリンを使用して、受精を阻害する化合物を同定することができる。
【０００８】
本発明の特徴は、受精を阻害することができる化合物を同定する方法を提供することである。本方法は、マウスエクアトリンの配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有する領域、又はヒトエクアトリンの配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有する領域と結合する化合物を選択することを含み得る。マウスエクアトリンの該領域は、マウスエクアトリンの配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列における１０１位〜１４６位のアミノ酸配列を含む領域であることができ、ヒトエクアトリンの該領域は、ヒトエクアトリンの配列番号５のアミノ酸配列における９２位〜１４４位のアミノ酸配列を含む領域であることができる。
【０００９】
前述の包括的な記載、及び以下の詳細な記載の両方が、例示及び説明のためのものにすぎず、特許請求の範囲に記載される本発明のさらなる説明を提示することを意図するものであることを理解すべきである。
【００１０】
本出願に援用され本出願の一部分を構成する添付した図面は、本発明の実施形態の幾つかを示し、明細書と併せて本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、様々な組織におけるエクアトリンの分布を示す図である。ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット（１２．５％ゲル）。図１Ｂは、エクアトリンのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための精製、及びゲル内検出を示す図である。ＭＮ９抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）。１０％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離。
【図２】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定されたエクアトリンのアミノ酸配列、並びにヒトエクアトリン及びマウスエクアトリンのアライメントを示す図である。
【図３】図３Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるエクアトリンの発現、及び組換えタンパク質を使用する検証研究を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲによる様々な組織におけるｍＲＮＡの発現。図３Ｂは、組換えエクアトリンの検出を示す、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す図である。図３Ｃは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いた間接免疫蛍光（ＩＩＦ）顕微鏡検査で得られた、精巣及び精巣上体尾部におけるエクアトリンの分布を示す画像である。
【図４】図４Ａは、ＭＮ９抗体の免疫染色による、エクアトリンのリン酸化状態及びグリコシル化状態の分析を示す図である。図４Ｂは、グリコシダーゼ処理を使用する移動度シフトアッセイによるグリコシル化状態のウエスタンブロット分析を示す図である。図４Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させたＥＱＴ（Ｌ）−ＥＧＦＰを使用した、ＭＮ９エピトープに対するＯ−グリコシル化阻害剤ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃの影響による、グリコシル化状態のウエスタンブロット分析を示す図である。ＭＮ９抗体（上部パネル）、ＥＱ７０〜８３抗体（中央パネル）を用いた免疫染色。免疫染色したバンドを、デンシトメトリーにより分析し、棒グラフで示した（下部パネル）。
【図５】図５Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞膜上におけるエクアトリンエピトープの所在（Orientation）を示す図である。図５Ｂは、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンＥＱＴ（Ｌ）−ＥＧＦＰの部分欠失を示す図である。例えば、Δ２１〜５０は、２１位〜５０位のアミノ酸配列の欠失を示す。ＭＮ９抗体（上部パネル）及び抗ＧＦＰ抗体（下部パネル、陽性対照）によるウエスタンブロット（１２．５％ゲル）。図５Ｃは、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンの単一アミノ酸置換変異体を示す図である。例えば、Ｔ１２８Ａは、１２８位のａａのＴ（スレオニン）からＡ（アラニン）への置換を示す。ＭＮ９抗体（上部パネル）及びＥＱ７０〜８３抗体（下部パネル、陽性対照）を用いたウエスタンブロット（１２．５％ゲル）。
【図６】図６ＡおよびＢは、ＭＮ９抗体を使用する免疫金電子顕微鏡検査により、成熟精子におけるエクアトリンの局在性を示す図である。
【図７】先体におけるエクアトリンの局在性を示すための、精子頭部の概略図である。
【図８】図８Ａは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ用に、精子尾部エクアトリンを可溶化、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａから４０ｋＤａに集中させて検出するためのＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析を示す図である。図８Ｂは、試料調製図である。
【図９】図９Ａは、ＥＱ７０〜８３抗体を用いたウエスタンブロット（１２．５％ゲル）分析を示す図である。図９Ｂは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いた精巣上体尾部の精子のＩＩＦ顕微鏡検査の結果を示す図である。
【図１０】マウス精子及びヒト精子に関するウエスタンブロット分析、並びにヒト精子頭部に関するＩＩＦ顕微鏡検査を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本出願は、２００９年６月２５日に出願された先の米国仮特許出願第６１／２２０，３６７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張するものであり、該仮特許出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【００１３】
使用した略語：ａａ、アミノ酸（複数も可）；ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ、ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド；ＣＩＡＰ、子ウシ腸アルカリホスファターゼ；ＥＱＴ、エクアトリン；Ｇａｐｄｈ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＩＩＦ、間接免疫蛍光；ＩＲＥＳ、配列内リボソーム進入部位；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、液体クロマトグラフィタンデム質量分析。
【００１４】
本発明は、受精を阻害する化合物を同定する方法に関する。本方法は、エクアトリンタンパク質と結合する化合物を選択することを含み得る。エクアトリンは、哺乳動物の精子に広く分布する先体タンパク質である。本発明者らは、マウスエクアトリン遺伝子をクローニングし、長鎖形態（配列番号３）及び短鎖形態（配列番号２）の２種類のエクアトリンタンパク質が精巣中に存在することを見出した。マウスエクアトリン（配列番号２又は配列番号３）の１３８位のＯ−グリコシル化スレオニン残基を含む１０１位〜１４６位のアミノ酸配列は、受精を阻害する効果を有する抗エクアトリン抗体ＭＮ９により認識されるエピトープを含有する。加えて、本発明者らは、ウエスタンブロット及び間接免疫蛍光分析を使用することにより、ＭＮ９抗体がヒト精子とも結合することを見出したが、このことは、ＭＮ９抗体がヒトエクアトリン（配列番号５）と結合することを示している。そのように、このエピトープと結合する化合物は、受精を阻害することができる。本発明の同定方法では、両方の形態のマウスエクアトリン、及びヒトエクアトリンを使用することができる。
【００１５】
エクアトリン（ＭＮ９抗原分子）は、哺乳動物の精子に広く分布する先体タンパク質である。或る程度の量のエクアトリンが、先体反応時に、赤道領域を覆う細胞膜に移行する。ＭＮ９抗体を使用する体外受精及び体内受精の両方の阻害の研究から、エクアトリンが卵細胞膜との融合に関与することが示唆されている。この研究において本発明者らは、エクアトリンをクローニングし、質量分析及び炭水化物染色を使用して、エクアトリンが高度にグリコシル化されたタンパク質であることを見出した。エクアトリンは精子特有の１型膜貫通タンパク質であり、グリコシダーゼ処理及び組換えタンパク質アッセイにより、エクアトリンがＮ，Ｏ−シアロ糖タンパク質であることが検証された。加えて、ＭＮ９抗体により認識される配偶子相互作用関連ドメインは、翻訳後に修飾される。修飾されるドメインは、アミノ酸置換、脱リン酸化及びＯ−グリコシル化阻害剤アッセイにより分析したところ、Ｏ−グリコシル化される可能性が最も高いスレオニン１３８の近くに特定された。免疫金電子顕微鏡観察により、先体腔に面する先体膜に、ＭＮ９エピトープが存在するエクアトリンＮ末端の局在が見出された。エクアトリンのこれらの生化学的特性及び局在性は、配偶子相互作用をもたらす移行機構のさらなる分析に重要である。
【００１６】
受精を阻害する化合物を同定する方法は、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するマウスエクアトリンの領域、又は配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するヒトエクアトリンの領域と結合する化合物を選択することを含み得る。マウスエクアトリンの領域は、マウスエクアトリンの配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列における１０１位〜１４６位のアミノ酸配列を含む領域であり得る。ヒトエクアトリンの領域は、ヒトエクアトリンの配列番号５のアミノ酸配列における９２位〜１４４位のアミノ酸配列を含む領域であり得る。受精を阻害する化合物を同定する方法は、（１）マウスエクアトリン又はヒトエクアトリンを試験化合物と接触させる工程、（２）上記領域を認識する抗体のマウスエクアトリン又はヒトエクアトリンとの結合を検出する工程、及び（３）試験化合物と接触させない場合における抗体のマウスエクアトリン又はヒトエクアトリンとの結合と比較して、結合を低減する化合物を選択する工程を含み得る。抗体は、受精を阻害する効果を有することができる。抗体は、マウスエクアトリンの当該領域を認識する抗体であり得る。マウスエクアトリン又はヒトエクアトリンは、培養細胞において発現させることができる。マウスエクアトリンは、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列の１０１位〜１４６位の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有する、マウスエクアトリンの部分ペプチドであり得る。ヒトエクアトリンは、配列番号５のアミノ酸配列の９２位〜１４４位の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有する、ヒトエクアトリンの部分ペプチドであり得る。本方法は、選択された化合物を雄性生殖細胞と接触させること、該雄性生殖細胞と雌性生殖細胞との間の受精を検出すること、及び受精を阻害する化合物を選択することを更に含み得る。
【００１７】
本発明者らは、図１〜図４に示されるように、エクアトリン遺伝子をクローニングし、この遺伝子が高度にグリコシル化されたタンパク質をコードすることを見出した。エクアトリンの生化学的性質に関しては、エクアトリンは成熟精子において高度にグリコシル化されたシアロ糖タンパク質であるため、エクアトリンをＳＹＰＲＯルビー（図１Ｂ、レーン３及びレーン４）又は銀染色（データは示していない）により検出することはできなかった。対照的に、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００染色（図２、レーン６）によりエクアトリンのバンドは検出可能となり、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための切り出しに十分な染色強度が示された。このように伝統的なタンパク質染色プロトコルを使用してエクアトリンの検出ができないことは、これらのプロトコルにおける糖タンパク質の染色を妨げる、シアル酸部分を含む豊富な炭水化物に起因し得る。実際に、脱シアル化したエクアトリンは、銀染色により検出された（データは示していない）。フラゲラシアリン（flagellasialin）を含む他の糖タンパク質も、標準的なゲル染色、例えば銀染色及びクーマシーブリリアントブルー染色による検出可能性の低さを示すことが報告されている［４０］。
【００１８】
エクアトリン相同体の配列アライメント分析に基づくと、哺乳動物においては長鎖形態特有の領域が高度に保存されている。現在のところ、長鎖形態がエクアトリンの短鎖形態の前駆体であることを確認するのに利用可能なデータは存在しない。長鎖形態及び短鎖形態がとのような理由で若しくはどのようにして精巣中に存在するのか、又はどちらの形態が翻訳されるのかは、明らかでない。
【００１９】
図４Ｂを参照して以下に記載されるエクアトリンのグリコシル化研究から得られた結果により、シアル化形態が少なくとも４０ｋＤａであると推定される（図１）のに対して、非シアル化（asialylated）形態が２７ｋＤａであると推定される（図４Ｂ）ことが示される。ノイラミニダーゼ処理により相対分子質量がおよそ１３ｋＤａ低減したという事実を考慮すると、エクアトリンは高度にシアル化されている、又はポリシアル化されていると予想されるが、この低減が、安定性の喪失により導かれるタンパク質切断［４１、４２］、又はノイラミニダーゼ処理により活性化された内在性プロテアーゼにより導かれるタンパク質切断のいずれかに起因するという可能性を完全に除外することはできない。
【００２０】
ＭＮ９エピトープに関しては、Ｎ−結合型炭水化物を遊離させることが知られている［４３］ＰＮＧアーゼ処理の後に、（図４Ｂを参照して以下に記載されるように）ＭＮ９抗体により依然としてエクアトリン分子が検出されたため、このエピトープがＮ−結合型炭水化物部分を含有する可能性は低い。加えて、ノイラミニダーゼ処理の後にエクアトリンを検出することができた（図４Ｂ）ため、ＭＮ９エピトープにノイラミン酸残基が必須である可能性も低い。アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のノイラミニダーゼは、α２−（３，６，８）−結合型ノイラミン酸残基を遊離させることが知られている［４４］。リン酸化の可能性に関しては、ＣＩＡＰ処理の後でさえも精子エクアトリンのＭＮ９抗原性が残存しており（図４Ａ）、ＭＮ９エピトープはリン酸化されていないことが示された。Ｏ−グリコシル化の可能性に関しては、ＭＮ９エピトープはＯ−グリコシル化阻害剤ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃに対して感受性が高く（図４Ｃ）、Ｏ−グリコシル化がＭＮ９エピトープに関与していることが示唆された。加えて、スレオニン１３８からアラニンへの置換によりＭＮ９抗体による検出性が失われたという所見（図５Ｃ）により、ＭＮ９エピトープ領域がスレオニン１３８の周りに局在することが示される。まとめると、これらのデータにより、ＭＮ９エピトープがスレオニン１３８の周りにＯ−グリコシル化を含有すること、又はＭＮ９抗体が認識することができるエクアトリンの立体構造にこの修飾が少なくとも必要であることが強く示唆される。マウスエクアトリンのスレオニン１３８に対応するスレオニンが、ヒトを含む多くの哺乳動物においてよく保存されていることは注目に値する。これとの関連では、グリカン構造を含むスレオニン１３８の周りの構造を明らかにするためにさらなる分析が必要とされる。精子卵子相互作用に関与するエクアトリンのドメインに関しては、抗ＥＱ７０〜８３ペプチド抗体は精子卵子相互作用を阻害せず（データは示していない）、スレオニン１３８の周りのＭＮ９エピトープドメインの重要性が示唆された。
【００２１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰタグ付きエクアトリン研究（図５）、及び免疫金染色分析（図６）から得られた以下に記載される結果により、図７に示されるように、エクアトリンが先体内膜に主に存在し、そのＮ末端が先体腔に面することが示される。過去に報告された［１１、１２、２３］ように、先体反応前には、エクアトリンが精子の細胞膜上に見出されることはない。先体反応時には、幾らかのエクアトリンが、先体から放出され、精子卵子融合が起こる赤道部分上の細胞膜に到達した［１１、１２、２３］。先体反応時に移行する先体膜貫通タンパク質の詳細な所在を示す報告は存在しないようである。幾つかの先体タンパク質、例えばＩｚｕｍｏ１及びＳＰＡＣＡ４も、精子細胞表面に移行することが報告されている。
【００２２】
要約すると、エクアトリンは、Ｎ末端の２０ａａにおける推定シグナルペプチド領域、及び１８６位〜２０８位の残基の膜貫通領域から構成される４０ｋＤａ〜５０ｋＤａの１型膜貫通Ｎ，Ｏ−シアロ糖タンパク質である。ＭＮ９抗体により認識される配偶子相互作用を阻害するエピトープは、翻訳後修飾、最も可能性が高いのはスレオニン１３８におけるＯ−グリコシル化を必要とする。したがって、これまでに蓄積された証拠により、エクアトリンのＮ末端側がＭＮ９エピトープを有し、先体腔に面する（図７）ことが示唆される。先体反応時に、先体膜上の幾らかのエクアトリンが、赤道部分を覆う細胞膜の表面上に移行し、先体内膜上のエクアトリンが曝露される。赤道部分に到達するスレオニン１３８の周りのエクアトリンのドメインは、精子卵子相互作用において一定の役割を果たすことができる。
【００２３】
本発明を例示することを意図する以下の実施例により、本発明を更に明らかにする。
【実施例】
【００２４】
ヒト精子に関する間接免疫蛍光（ＩＩＦ）画像
ＭＮ９抗体を用いたＩＩＦのために、ヒトが射精した精子を、培養グレードの培地（市販されている）でリンスし、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分間処理した。それから、精子を１／２００００の希釈率のＭＮ９抗体で、４℃で終夜処理した。処理後、精子をＰＢＳで複数回リンスし、引き続きＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（０．５μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳでリンスした後、適切な蛍光用フィルター及びＣＣＤカメラＲＥＴＩＧＡ Ｅｘｉ ＦＡＳＴ １３９４（Qimaging, Surrey, BC, Canada）から構成される画像化システムを備えた、油浸式（oil-imersed）ＵＰｌａｎＡｐｏ１００対物レンズを使用するＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０顕微鏡（Olympus Co., Tokyo, Japan）を用いて観察を行った。データの取得及び保存は、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ４ソフトウェア（Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO, USA）により制御した。
【００２５】
ヒト精子に関するウエスタンブロット
３日間の禁欲後にマスターベーションにより回収されたヒトが射精した精子を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、ＳＤＳ試料緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、２％ ＳＤＳ［ｗ／ｖ］、１０％［ｖ／ｖ］グリセロール、０．００２％［ｗ／ｖ］ブロモフェノールブルー）中で均質化した。ロード直前に試料を９８℃で１０分間煮沸した後、不溶性成分を、１６０００ｇ、１０分間の遠心分離により除去した。単離した上清（１レーン当たり２．５×１０６個の精子）をロードし、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により１２．５％ゲル中で分離した。分離されたタンパク質を、ポリビニリデンジフルオリド膜（Millipore, Bedford, MA, USA）上にブロッティングした。膜を、バックグラウンドを抑えるために５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％［ｗ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ２０）に６０分間浸し、（１／４０００の希釈率の）ＭＮ９抗体で室温にて６０分間処理した。ＴＢＳ−Ｔでリンスした後、膜を、（１／１００００の希釈率の）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体で６０分間処理した。膜をＴＢＳ−Ｔでリンスした後、反応したタンパク質を、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（GE Healthcare）を使用して可視化し、Ｘ線フィルムに露光した。
【００２６】
材料及び方法
動物及び試薬
雄性ＩＣＲマウス（１６週齢）を、Charles River Japan（Yokohama, Japan）から購入し、空調された部屋（１２時間の明／暗サイクル、２４℃）で、飼料及び水を自由に摂取できるようにして維持した。この研究は、千葉大学大学院医学研究院の実験動物の世話及び使用に関するガイドラインに従って実施した。
【００２７】
エクアトリンを特異的に認識するモノクローナル抗体ＭＮ９（ＩｇＧ２ａ）を、ＣＤ１マウス由来の精巣上体尾部の精子で雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することにより、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて産生させた。抗体の産生、精製及び特徴付けは、過去に報告した［１１、１２、２３、２４］。ＥＱ７０〜８３抗体は、以下に記載されるように、エクアトリンの７０位〜８３位の残基の１４アミノ酸（ａａ）に対して新たに見出された特異的な抗体である。
【００２８】
使用した一般的な化学物質及び抗体は以下の通りであった：ＨＲＰ結合型ヒツジ抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合型ロバ抗ウサギＩｇＧ、ＰＹ２０マウス抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（GE Healthcare; Little Chalfont, Buckinghamshire, UK）；Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００糖タンパク質ゲル染色キット、ＳＹＰＲＯルビータンパク質ゲル染色剤、ウサギ抗ＧＦＰ抗体ＩｇＧ画分、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ロバ抗マウスＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）；Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８及びＯ−グリコシル化阻害剤ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ）［２９］（Sigma Aldrich; St. Louis, MO, USA）；並びに５ｎｍ及び１０ｎｍのコロイド金結合型抗マウスＩｇＧ（BBInternational, Cardiff, UK）。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｐｒｏｔｅｃｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen Sciences, Germantown, MD, USA）を使用して抽出した。本発明者らは、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を使用するオリゴ（ｄｔ）プライミングによりｃＤＮＡを合成した。ＰＮＧアーゼＦ、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（New England Biolabs, Beverly, MA, USA）及びノイラミニダーゼ（アルスロバクター・ウレアファシエンス；Marukin Bio, Kyoto, Japan）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【００２９】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析を使用して、様々な組織におけるエクアトリンの分布を調べ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えエクアトリンタンパク質の発現、脱リン酸化、脱グリコシル化、及びアミノ酸置換アッセイを検証した。これらの実験のための試料を、ＳＤＳ試料緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、２％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０％［ｖ／ｖ］グリセロール、０．００２％［ｗ／ｖ］ブロモフェノールブルー）で抽出した。可溶化物を９８℃で１０分間加熱し、１６０００ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質を除去した。それから可溶化物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＰＶＤＦ；Millipore, Bedford, MA, USA）上にブロッティングした。ウエスタンブロット分析を、ブロッキング溶液として及び抗体希釈のために５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％［ｗ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ２０）を使用する、標準的なプロトコルに従って行った。ウエスタンブロット分析のために使用した抗体濃度は以下の通りであった：ＭＮ９抗体は１：４０００（約０．１μｇ／ｍｌ）、ＥＱ７０〜８３抗体は０．３μｇ／ｍｌ、抗ＧＦＰ抗体は１μｇ／ｍｌ、及びＨＲＰ結合型二次抗体は１：１００００。ブロットを、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出試薬（GE Healthcare）を用いて発色させ、Ｘ線フィルムに露光した。
【００３０】
質量分析のための試料調製
精子（１．３×１０９個）を、精巣上体尾部から取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。それから精子を、コンプリートプロテアーゼインヒビターズ（Roche Diagnostics）とともに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳに懸濁し、氷上で１０分間維持し、それから２９０ｇで１０分間遠心分離した。沈殿した精子を、コンプリートプロテアーゼインヒビターズを含有するＳＤＳ−ＥＤＴＡ溶液（７５ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、［ｐＨ６．０］）で抽出し、１６０００ｇで１０分間遠心分離して、不溶性の残渣を除去した。肝臓を、陰性対照としてＳＤＳ−ＥＤＴＡ溶液で直接抽出した。ＳＤＳ−ＥＤＴＡ溶液抽出物を、２Ｄクリーンアップキット（GE Healthcare）により沈殿させた。沈殿させたタンパク質を、ＮＰ−４０溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］）に再懸濁した。可溶化物を、プロテインＧセファロース（GE Healthcare）を用いて４℃で１時間予備精製し、１０μｇのＭＮ９抗体と共に４℃で終夜インキュベーションした。プロテインＧセファロースビーズを添加し、４℃で１時間インキュベーションした。ビーズを、ＮＰ−４０溶解緩衝液で３回、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１回洗浄した。それからビーズをＳＤＳ試料緩衝液に懸濁し、９８℃で５分間加熱して、沈殿を解離させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、試料を、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００、ＳＹＰＲＯルビー、及びＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用して検出した。目的のバンドを、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００で染色したゲルから切り出した。ゲル内トリプシン消化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、過去に報告された［３０］ように行った
【００３１】
アライメント分析
相同体検索をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラム［３１］を使用して行い、配列アライメントをＴ−Ｃｏｆｆｅｅサーバー［３２、３３］を使用して行った。シグナルペプチド領域を、ＳｉｇｎａｌＩＰ３．０サーバー［３４、３５］を使用して予測した。膜貫通ドメインを、ＴＭＨＭＭ２．０サーバー［３６、３７］を使用して予測した。
【００３２】
抗体産生
結果の節に記載されるようなエクアトリンの同定の後に、抗エクアトリンポリクローナル抗体を産生させ、ＥＱ７０〜８３抗体と称することとした。簡潔に述べると、ウサギを、キーホールリンペットヘモシアニンと結合したエクアトリンの１４残基の合成部分配列（GNYYKDIKQYVFTT（配列番号６））で免疫した。それからＥＱ７０〜８３抗体を、１４残基の合成ペプチドと結合したビーズを使用してアフィニティ精製し、最終濃度１．２ｍｇ／ｍｌに調整した。ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体はウエスタンブロット及び免疫蛍光に関して同様の染色パターンを示した（図９）ため、ＥＱ７０〜８３抗体が抗エクアトリン抗体であることが検証されたとみなし、この研究で使用した。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
様々な組織におけるエクアトリンｍＲＮＡの発現を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。使用した特異的なプライマー対は以下の通りであった：Ｅｑｔ−フォワード（５'−AATGCTGGGGATCTCGCTGATG−３'（配列番号７））及びＥｑｔ−リバース（５'−ATTACTCGGTGATCCTTCCTTGTTC−３'（配列番号８））。Ｇａｐｄｈ−フォワード（５'−ACCACAGTCCATGCCATCAC−３'（配列番号９））及びＧａｐｄｈ−リバース（５'−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−３'（配列番号１０））を対照として使用した。エクアトリン長鎖形態の５５０位〜１０１１位のヌクレオチドを、部分的に増幅させた。増幅は２５サイクルで行った：９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長。
【００３４】
組換えタンパク質の産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、理化学研究所のＣｅｌｌ Ｂａｎｋ（Japan）から購入し、１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地中において空気中５％ＣＯ２下で３７℃にて培養した。ベクターを、製造業者の（manufacture's）マニュアルに記載されるようにＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Roche Diagnostics）を使用してトランスフェクションした。簡潔に述べると、細胞を、トランスフェクション後に２４時間（アミノ酸置換研究に関しては、高濃度を得るために４８時間）培養し、ＰＢＳで洗浄した細胞を、ウエスタンブロット分析のためにＳＤＳ試料緩衝液中で可溶化した。ベクター構築物を、ベクター構築の節に記載する。
【００３５】
精巣及び精巣上体に関する間接免疫蛍光（ＩＩＦ）顕微鏡検査
エクアトリンの発現を詳細に調べるために、ＩＩＦ顕微鏡検査を、ＭＮ９抗体及びＥＱ７０〜８３抗体を用いて行った。雄性ＩＣＲマウスを、ネンブタール（Abbott Laboratories, Abbott Park, 140 IL, USA）で麻酔し、左心室への灌流によりブアン固定液で固定した。精巣及び精巣上体を取り出し、同じ固定液中に１時間浸漬した。勾配エタノール系列及びキシレン中で脱水した後、試料を、パラフィン包埋処理し、切り出して２．５μｍの厚みの切片とした。切片を脱パラフィン化し、１２０℃で５分間オートクレーブして抗原性を活性化した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で３０分経過させた後、非特異的な抗体の結合を、ブロッキング緩衝液（５％正常ヤギ血清及び３％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ）中における室温で３０分間のインキュベーションにより抑制した。それから切片を、ＭＮ９抗体（希釈率１：２００００、約０．０２μｇ／ｍｌ）及びＥＱ７０〜８３抗体（０．６μｇ／ｍｌ）と共に４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳ中でリンスした。それから切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ヤギ抗ウサギＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（５μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベーションした。適切な蛍光用フィルター及びＲＥＴＩＧＡ Ｅｘｉ ＦＡＳＴ １３９４ ＣＣＤカメラ（Qimaging, Surrey, BC, Canada）から構成される画像化システムを備えた、ＵＰｌａｎＡｐｏ４０×ＮＡ０．８５乾式対物レンズを用いるＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０（Olympus Co., Tokyo, Japan）顕微鏡を使用して観察を行った。データの取得及び保存を、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ４ソフトウェア（Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO, USA）により制御した。
【００３６】
子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）によるエクアトリンの脱リン酸化
精巣上体尾部から取り出した精子を、ＰＢＳで洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液で抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。ＰＶＤＦ膜を、ＣＩＡＰ（２０Ｕ／ｍｌ）を含むＮＥＢ緩衝液３（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ［ｐＨ７．９］、ＥＤＴＡフリー コンプリートミニプロテアーゼインヒビターズ）中において３７℃で１時間インキュベーションし、それから膜を、ＭＮ９エピトープのリン酸化状態を調べるためにＭＮ９抗体を用いて、又はＣＩＡＰ処理による脱リン酸化を確認するために対照としてＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体（０．１μｇ／ｍｌ）を用いて、免疫染色に供した。対照（脱リン酸化していない）試料を、ＣＩＡＰの非存在下でインキュベーションした。１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ−Ｔを、ブロッキング溶液に使用した。
【００３７】
ＰＮＧアーゼＦ処理及びノイラミニダーゼ処理
グリコシダーゼ処理を、基本的に製造業者の取扱説明書（New England Biolabs）に従い、わずかに修正して行った。ノイラミニダーゼを、ＰＮＧアーゼＦ処理プロトコルに同時に添加した。精子を、精巣上体尾部から取り出し（試験管１本当たり５μｌのＰＢＳ中に５×１０５個の精子を懸濁した）、ＰＢＳで洗浄し、１μｌの変性緩衝液（５％ ＳＤＳ、０．４Ｍ ＤＴＴ）を添加することにより変性させ及び可溶化し、９８℃で１０分間加熱した。それから試料を、２μｌのＧ７緩衝液（０．５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）及び２μｌの１０％ ＮＰ−４０を添加することにより中和し、１６０００ｇで遠心分離して、不溶性物質を除去した。回収された上清中のプロテアーゼ活性を、コンプリートプロテアーゼインヒビターズ、及び１μｇ／ｍｌのペプスタチン（Roche Diagnostics）を添加することにより抑制した。ＰＮＧアーゼＦ（１２５Ｕ）、若しくはアルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼ（０．０５Ｕ）、又はその両方を上清に添加し、３７℃で１２時間インキュベーションした。それから試料を等体積のＳＤＳ試料緩衝液と混合し、ウエスタンブロット分析に供した。対照試料を、これらのグリコシダーゼの非存在下でインキュベーションした。
【００３８】
エクアトリンのＯ−グリコシル化のベンジル−α−ＧａｌＮＡｃによる阻害
ｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−ＥＧＦＰベクターのトランスフェクション前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に０ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭのベンジル−α−ＧａｌＮＡｃを添加した（supplemented）。細胞を、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃの存在下で少なくとも２４時間培養し、それからＳＤＳ試料緩衝液中で可溶化し、ウエスタンブロット分析に供した。免疫ブロットのデンシトメトリー分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html）を使用して行った。０ｍＭ ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃでのＥＱ７０〜８３抗体の免疫染色強度に対するＭＮ９抗体の免疫染色強度の相対比率（ＭＮ９／ＥＱ７０〜８３）を、１とみなした。それから、２ｍＭ及び４ｍＭ ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃでのＭＮ９／ＥＱ７０〜８３の相対比率を算出した。結果を棒グラフに示す。ベクター構築物を、ベクター構築の節に記載する。
【００３９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞膜におけるエクアトリンエピトープ領域の所在の決定
ＭＮ９エピトープを特定するために、細胞膜中におけるエクアトリンの所在を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において調べた。細胞を、ポリエチレンイミン（Sigma Aldrich）でプレコーティングしたガラス底皿（AGC Techno Glass Co., Ltd. Chiba, Japan）上で培養し、Ｃ末端ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンベクター（ｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−ＥＧＦＰと称する）でトランスフェクションした。細胞を、トランスフェクション後少なくとも２４時間培養し、ＰＢＳで１回洗浄した。その後細胞を、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳで３０分間固定した。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、細胞を、インキュベーションし、又は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間透過処理し、次いで室温で１時間ＭＮ９抗体（希釈率１：４００００、約０．０１μｇ／ｍｌ）、ＥＱ７０〜８３抗体（０．２４μｇ／ｍｌ）又は抗ＧＦＰ抗体（２μｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションし、ＰＢＳでリンスした。それから細胞を、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ロバ抗マウスＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（０．５μｇ／ｍｌ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（５μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベーションした。細胞を、ＣＳＵ−ＸＩ共焦点スキャナ（Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan）を備えたＵＰＬＳＡＰＯ６０×ＮＡ１．２水浸式対物レンズを用いるＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１（Olympus）顕微鏡を使用して分析した。３Ｄ投影画像を、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ４ソフトウェアにより制御されるＱｕａｎｔＥＭ ５１２ＳＣ ＣＣＤカメラ（Photometrics, Tucson, AZ, USA）を使用して撮影した。
【００４０】
免疫金電子顕微鏡検査
ＴＹＨ（Toyoda, Yoshida and Hoshi）培地［３８］中で２回洗浄した後、精巣上体尾部の精子を−８０℃で１回凍結し、一次抗体を適用する前に解凍して、膜を透過処理した。ＭＮ９抗体を、精子に１時間適用した。それから、精子を、コロイド金結合型抗マウスＩｇＧ（約１μｇ／ｍｌ）の溶液中で１時間インキュベーションした。培地中でリンスした後、精子を、１％グルタルアルデヒド中で固定し、２％四酸化オスミウム溶液中で後固定した。固定した精子を、２％寒天中に包埋し、エタノール系列中でルーチン的に脱水し、Ｅｐｏｎ８１２（TAAB Laboratories Equipment, Berks, UK）中に包埋した。超薄切片を、ウルトラミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｅ、Reichert-Jung, Wien, Austria）を使用して通常の手順で作製し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１２００ ＥＸ、JEOL, Tokyo, Japan）を用いた観察のために鉛及び酢酸ウラニルで染色した。
【００４１】
マウス組換えエクアトリンに関するベクター構築
ＦＡＮＴＯＭ ＦＬＳクローン（ＩＤ：１７０００２８Ｂ１５（クローニングされたマウスエクアトリン長鎖形態に関連する）を、ＤＮＡＦＯＲＭ（Kanagawa, Japan）から購入した。エクアトリン長鎖形態を、Ｃ末端６×ＨｉｓタグとインフレームのｐＥＴ−２３ａ（Novagen, Madison, WI, USA）中に挿入し（ｐＥＴ−２３ａ−Ｅｑｔ（Ｌ）−Ｈｉｓと称される）、そして大腸菌のタンパク質発現に使用した。ｐＥＴ−２３ａ−Ｅｑｔ（Ｌ）−Ｈｉｓベクターを、ＢａｍＨＩ及びＢｐｕ１１０２Ｉにより消化した。断片をＢｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（Toyobo co., Ltd., Osaka, Japan）により平滑断端化し、そしてＥｃｏＲＶで消化してＣＩＡＰで処理したｐＫＳＣＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ中にライゲーションした。このプラスミドを、ｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−Ｈｉｓと称することとし、哺乳動物細胞の培養に使用した。ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンタンパク質発現ベクターｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−ＥＧＦＰを、ｐＫＳＣＸ−Ｅｑｔ（Ｌ）−Ｈｉｓから開始して、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ突然変異誘発キット（Toyobo）を使用する逆ＰＣＲ突然変異誘発法により、適切なプライマー（表１）を使用して製造業者の取扱説明書に従い、Ｈｉｓタグ及びＩＲＥＳを欠失させることにより作り出した。エクアトリン短鎖形態及びエクアトリン変異タンパク質発現（部分欠失及び単一アミノ酸置換）のためのベクターも、ＰＣＲベースの突然変異誘発を使用して作り出した（表１）。全てのベクターを、ＤＮＡ配列解析により検証した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
結果
様々な組織におけるエクアトリンの分布
様々な組織におけるエクアトリンの分布を測定するために、ＭＮ９抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。可溶化したタンパク質（２０μｇ／レーン）をロードした。各レーンに存在する組織試料は以下の通りであった：レーン１、大脳；レーン２、小脳；レーン３、心臓；レーン４、肺；レーン５、肝臓；レーン６、膵臓；レーン７、脾臓；レーン８、腎臓；レーン９、膀胱；レーン１０、大腸；レーン１１、小腸；レーン１２、精巣；レーン１３、精巣上体頭部；レーン１４、精巣上体体部；レーン１５、精巣上体尾部。調べた組織のうち、４０ｋＤａ〜６５ｋＤａの範囲のエクアトリンのバンドが、図１Ａ、レーン１２に示されるように精巣に、図１Ａ、レーン１３〜レーン１５に示されるように精巣上体に見出された。他の組織ではバンドは検出されなかった（図１Ａ、レーン１〜レーン１１）。肝臓試料においてはＭＮ９抗体によりバンドは検出されなかった（図１Ａ、レーン５）ため、肝臓を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための免疫沈降に関して陰性対照として使用した。
【００４４】
エクアトリンの同定、及びアミノ酸配列の分析
エクアトリンを、ＭＮ９抗体を用いた免疫沈降により精製した。ＳＹＰＲＯルビー染色及びＰｒｏ−Ｑエメラルド３００染色に関しては同量の免疫沈降物を各レーンにロードした（レーン３〜レーン６）が、ウエスタンブロットに関しては１／５０の量をロードした（レーン１及びレーン２）。各レーンに存在する組織試料は以下の通りであった：レーン１、レーン３及びレーン５−肝臓（陰性対照）；並びにレーン２、レーン４、レーン６−精巣上体尾部の精子。レーン１及びレーン２では、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロットを行った。レーン３及びレーン４では、ＳＹＰＲＯルビー染色を行った。レーン５及びレーン６では、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００染色を使用した。エクアトリンは４０ｋＤａに集中した（レーン２及びレーン６）。精製したエクアトリンは、図１Ｂ及び図８に示されるように４０ｋＤａのバンドと同定された。ウエスタンブロット分析により最初に４０ｋＤａに検出された（図１Ｂ、レーン２）エクアトリンは、従来の染色方法、例えば銀染色（公開していないデータ）又はＳＹＰＲＯルビー染色（図１Ｂ、レーン４）によっては検出することができなかったが、Ｐｒｏ−Ｑエメラルド３００染色（図１Ｂ、レーン６）により検出されたことを強調することが重要である。対照肝臓試料（図１Ｂ、レーン１、レーン３及びレーン５）にはバンドは検出されなかった。
【００４５】
エクアトリンであると予想される４０ｋＤａのバンドを切り出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。Ｍａｓｃｏｔ検索の結果により、１つの重要な候補４９３０５７９Ｃ１５Ｒｉｋが示された。理化学研究所のＦＡＮＴＯＭ（マウスの機能注釈）全長ｃＤＮＡデータベース（http://fantom.gsc.riken.go.jp）に基づき、ＩＣＲマウスの精巣から調製されたｃＤＮＡを配列解析することによるタンパク質コード領域（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪアクセッション番号：長鎖形態に関してはＡＢ４３８１０５、及び短鎖形態に関してはＡＢ４３８１０６）の検証のために、プライマーを設計した。
【００４６】
得られたデータを、相同体検索及びドメイン検索に基づき、ヒト及びマウスの両方に関するアミノ酸配列アライメントにより分析した。得られたペプチド配列を、図２に示す。アライメント中の同一の配列を、アスタリスクを用いて示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出されたペプチド配列を、ボールド体の文字で示す。１４アミノ酸の配列（ボックスで囲んだ領域）を使用して、ＥＱ７０〜８３抗体を産生させた。推定シグナルペプチド領域に網掛けし、推定膜貫通ドメインに下線を付す。アミノ酸配列から予測された分子量は、エクアトリンの短鎖形態（２９６ａａ）に関しては３３０４２Ｄａであり、長鎖形態（３３７ａａ）に関しては３７７６４Ｄａであった。Ｎ末端の１位〜２０位の残基に推定シグナルペプチド領域が、１８６位〜２０８位の残基に膜貫通領域が存在した。
【００４７】
アミノ酸配列アライメントに基づき、７０位〜８３位の残基の範囲のオリゴペプチド（ヒト及びマウスの両方において高度に保存された領域）を使用して、ＥＱ７０〜８３と称する特異的な抗体を産生させ、これをこの研究のさらなる実験に使用した。
【００４８】
組織におけるエクアトリンｍＲＮＡの発現
エクアトリンの発現を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えタンパク質を使用して調査した。様々な組織におけるエクアトリンのｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析した。興味深いことに、２つのバンド（長鎖形態及び短鎖形態の両方）が、図３Ａ、レーン１１に示されるように、精巣に存在した。各レーンに存在する組織試料は以下の通りであった：レーン１−大脳；レーン２−小脳；レーン３−心臓；レーン４−肺；レーン５−肝臓；レーン６−脾臓；レーン７−腎臓；レーン８−膀胱；レーン９−大腸；レーン１０−小腸；レーン１１−精巣；レーン１２−精巣上体頭部；レーン１３−精巣上体体部；レーン１４−精巣上体尾部。精巣上体を含む他の組織においてバンドは検出されなかった（図３Ａ、レーン１〜レーン１０及びレーン１２〜レーン１４）。
【００４９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換えエクアトリンの発現：検証研究
組換えタンパク質によるエクアトリンの検証を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施した。エクアトリンの固有性（identity）を検証するために、長鎖形態、短鎖形態、ＥＧＦＰタグ付き長鎖形態及びＥＧＦＰタグ付き短鎖形態に関するエクアトリン発現ベクターを開発し、これらのエクアトリンベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、ＭＮ９抗体を使用するウエスタンブロット（１０％ゲル）により分析した。同量の培養細胞抽出物を、各レーンにロードした。短鎖形態（レーン１）、長鎖形態（レーン２）、ＥＧＦＰタグ付き短鎖形態（レーン３）及びＥＧＦＰタグ付き長鎖形態（レーン４）に関する発現ベクター。短鎖形態及び長鎖形態が６０ｋＤａ〜８５ｋＤａに見出された（レーン１及びレーン２）が、ＥＧＦＰタグ付き短鎖形態及びＥＧＦＰタグ付き長鎖形態が１０５ｋＤａに見出された（レーン３及びレーン４）。短鎖形態及び長鎖形態の両方が６０ｋＤａ〜８５ｋＤａと同定された（図３Ｂ、レーン１及びレーン２）が、ＥＧＦＰタグ付き短鎖形態及びＥＧＦＰタグ付き長鎖形態の両方がおよそ１０５ｋＤａというはるかに上のバンドとして検出された（図３Ｂ、レーン３及びレーン４）。ＥＧＦＰタグ付きタンパク質は非タグ付きタンパク質より相対分子質量が高いバンドとしてＭＮ９抗体により検出されたため、クローニングした配列がエクアトリンであることが検証された。ＭＮ９抗体は、大腸菌において発現したエクアトリンタンパク質を認識しなかった（データは示していない）。
【００５０】
精巣及び精巣上体におけるエクアトリンの分布
次いで、本発明者らは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いた間接免疫蛍光（ＩＩＦ）顕微鏡検査を使用して、詳細なエクアトリンの分布を決定した。これらの抗体のエピトープは異なっている。ＥＱ７０〜８３抗体はエクアトリンの７０位〜８３位の残基の小ペプチド領域を認識するが、ＭＮ９抗体は、翻訳後修飾（考察で述べる）を受ける抗原領域を認識する。図３Ｃは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いたＩＩＦ顕微鏡検査を使用して、精巣及び精巣上体尾部におけるエクアトリンの分布を示すものである。図３Ｃの画像ａ〜画像ｃは精巣を示す。図３Ｃの画像ｄ〜画像ｆは精巣上体尾部を示す。画像ａ及び画像ｄは、画像ａにおいて円状に分散し、画像ｄの右端及び左端において実質的にアスタリスクの周りに分散した小さな点としてＥＱ７０〜８３抗体を示す（図を色付けして示した場合、赤色で表される）。画像ｂ及び画像ｅは、画像ｂにおいて円状に、及び画像ｅにおいて実質的にアスタリスクの周りに分散した小さな点としてＭＮ９抗体を示す（画像を色付けして示した場合、緑色で表される）。画像ａ、画像ｂ及び画像ｃは、画像の外端に近接して分散した小さな点として、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８を用いた対比染色結果を示す（画像を色付けして示した場合、青色で表される）。ＥＱ７０〜８３抗体、ＭＮ９抗体及び微分干渉コントラスト画像の重ね合わせた画像を、図３Ｃ、画像ｃ及び画像ｆに示す。ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体の両方が、ステージＶＩＩの精細管（ＶＩＩ；ａ〜ｃ）の発生中の（developing）精細胞（ｓ７及びｓ１６）における、及び精巣上体の精子（アスタリスク；ｄ〜ｆ）における先体領域を認識するが、これらの抗体は精巣上体上皮（Ｅｐ；ｂ〜ｆ）を認識しないことに留意すべきである。Ｐ；パキテン期の精母細胞。ｓ７及びｓ１６；それぞれステップ７及びステップ１６の精細胞。バー＝５０μｍ。ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析により、組換えエクアトリンが検出された。したがって、ウエスタンブロット研究の結果（図１Ａ）に矛盾せず、ＩＩＦ顕微鏡検査により、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体により検出されるエクアトリンが精巣及び精巣上体の両方に存在して同じ染色パターンを示すが、精巣上体上皮細胞には存在しないことが示された。該タンパク質は、生殖細胞を含む精子に特有のものであった（図３Ｃ）。
【００５１】
エクアトリンのホスファターゼ処理
検証研究において、ＭＮ９抗体が大腸菌において発現させたエクアトリンタンパク質を認識しないことが見出されたため、ＭＮ９エピトープは、翻訳後に修飾されると考えられた。最初に、ＭＮ９エピトープの脱リン酸化の影響を、ＣＩＡＰを使用して調べた。図４Ａは、精子エクアトリンのリン酸化状態の、ＣＩＡＰ（ホスファターゼ（phoshatase））処理による分析結果を示す。ＰＶＤＦ膜上の精子タンパク質（１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ；５μｇ／レーン）を、ＣＩＡＰを用いず（−）及びＣＩＡＰを用いて（＋）処理し、ＭＮ９抗体（上部パネル）で、又はＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体（下部パネル）で免疫染色した。ＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体を対照として使用して、精子タンパク質の脱リン酸化を確認した。ＣＩＡＰ処理後にＭＮ９抗原性が残存した（上部パネル）ことに留意されたい。ＣＩＡＰ処理後にＭＮ９抗体の免疫染色が残存したがＰＹ２０抗体の免疫染色は減少したという事実（図４Ａ）は、ＭＮ９抗体のエピトープがリン酸化されていないことを示唆している。
【００５２】
移動度シフトアッセイによるエクアトリンのグリコシル化の評価
エクアトリンがＰｒｏ−Ｑエメラルド糖タンパク質染色により検出されたため、精子尾部抽出物をＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼで処理して、エクアトリンがグリコシル化されているかどうか、及びＮ−グリコシル化又はシアル酸部分がＭＮ９抗体のエピトープ領域に関与するかどうかを測定した。酵素処理した試料を、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した（図４Ｂ）。レーン１〜レーン４において、精子尾部抽出物中のエクアトリンを、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット（１５％ゲル）により分析した。同量のＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼで処理した試料を、各レーンにロードした：レーン１−グリコシダーゼ処理なし；レーン２−ＰＮＧアーゼＦのみによる処理；レーン３−ノイラミニダーゼのみによる処理；レーン４−ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼによる処理。移動度のシフトが、ＰＮＧアーゼ処理及びノイラミニダーゼ処理の両方により観察されたが、ＭＮ９抗原性は残存した。ＰＮＧアーゼＦ処理により、エクアトリンの２つの主要なバンドの分子サイズがおよそ２ｋＤａ低減した：上部バンドは５０ｋＤａから４８ｋＤａまで移動し、下部バンドは４０ｋＤａから３８ｋＤａまで移動した（図４Ｂ、レーン１及びレーン２）。加えてＭＮ９抗体は、ノイラミニダーゼ処理後、２７ｋＤａの単一のバンドのみを認識した（図４Ｂ、レーン３及びレーン４）。このバンドが長鎖形態であるか、又は短鎖形態であるかは、現在のところ明らかでない。したがって、エクアトリンは、シアル化されたＯ−グリカンを伴うＮ−グリカンを有する、すなわちエクアトリンは、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａのＮ，Ｏ−シアロ糖タンパク質である。興味深いことに、ＭＮ９抗原性は、ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼでの処理により除去されず、これにより、ＭＮ９エピトープがエピトープ領域にＮ−結合型炭水化物も、シアル酸部分も含有しないことが示唆された。ＭＮ９抗原性におけるＯ−グリコシル化の関与を評価するために、組換えエクアトリンを、Ｏ−グリコシル化阻害剤ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃの存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させた。同量の培養細胞抽出物を、各レーンにロードし、１２．５％ゲル中で分離した。ブロットを、ＭＮ９抗体（図４Ｃ、上部パネル）及びＥＱ７０〜８３抗体（図４Ｃ、中央パネル）で免疫染色した。免疫染色したバンドを、デンシトメトリー（「材料及び方法」を参照されたい）により分析し、棒グラフで示した（図４Ｃ、下部パネル）。レーン上の数字は、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃの濃度を示す。エラーバーは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す。相対ＭＮ９抗原性（ＭＮ９／ＥＱ７０〜８３）は、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ濃度が増大するにつれて減少した。
【００５３】
ＭＮ９／ＥＱ７０〜８３の相対比率は、棒グラフ（図４Ｃ）に示されるように、ベンジル−α−ＧａｌＮＡｃ阻害剤の濃度の増大と共に用量依存的に減少し、これにより、ＭＮ９エピトープにおけるＯ−グリコシル化の関与が示唆された。
【００５４】
エクアトリンのエピトープ領域の所在の決定
Ｃ末端ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を、抗体・非透過処理条件下又は抗体・透過処理条件下でＩＩＦにより調べた。図５Ａの画像ａ〜画像ｆは、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンのＩＩＦ顕微鏡検査によるモニタリングの結果を示す。図５Ａの画像ｃ〜画像ｆは、非透過処理条件下での４％ＰＦＡによる固定の結果を示す。図５Ａの画像ｇ及び画像ｈは、透過処理条件下での４％ＰＦＡによる固定の結果を示す。Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８対比染色を核に対して使用し、それは画像において球状に見える（画像を色付けして示した場合、青色で表される）。抗ＥＱ７０〜８３抗体は、画像ａにおいて球状の図形の周りに、及び部分的にその内部に分散したより薄い影で示され（図を色付けして示した場合、赤色で表される）、ＭＮ９抗体は、画像ｃにおいて球状の図形のうちの２つの周りに、及び部分的にその内部に分散したより薄い影で示され（図を色付けして示した場合、赤色で表される）、抗ＧＦＰ抗体は、画像ｅ及び画像ｇにおいて球状の図形のうちの１つの周りに、及びその外周部に分散したより薄い影で示される（図を色付けして示した場合、赤色で表される）。トランスフェクションした細胞においてＣ末端ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンは、画像ｂ、画像ｄ、画像ｆ及び画像ｈにおいて球状の図形の周りに、及び部分的にその内部に分散したより薄い影で示される（図を色付けして示した場合、緑色で示される）。バー＝１０μｍ。Ａｂ；抗体。非透過処理条件下で、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体の両方によりＥＧＦＰタグ付きエクアトリンが検出された（図５Ａ、ａ〜ｄ）が、抗ＧＦＰ抗体は、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンを認識することができなかった（図５Ａ、ｅ及びｆ）。透過処理条件下で、抗ＧＦＰ抗体によりＥＧＦＰタグ付きエクアトリンが検出された（図５Ａ、ｇ及びｈ）。
【００５５】
ＭＮ９エピトープに必須の翻訳後修飾を有するアミノ酸残基の決定
図５Ａの結果により、エクアトリンが１型膜貫通タンパク質であり、外表面に面するＮ末端側に在るＭＮ９エピトープを有することが示唆される（図５Ａ）。したがって、ＭＮ９エピトープに必須の翻訳後修飾が起こる正確なアミノ酸位置を特定するために、エクアトリンの部分アミノ酸配列（Δにより示される）を初めに欠失させ、その構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、ウエスタンブロット分析を使用して免疫染色の喪失を評価した（図５Ｂ）。ＭＮ９抗体は、ＥＱＴ（Ｌ）Δ２１〜５０−ＥＧＦＰ及びＥＱＴ（Ｌ）Δ３１〜１００−ＥＧＦＰを検出したが、ＥＱＴ（Ｌ）Δ３１〜１４６−ＥＧＦＰを検出することができなかった（図５Ｂ、上部パネル）。陽性対照である抗ＧＦＰ抗体は、全ての試料を検出した（図５Ｂ、下部パネル）。ＭＮ９のバンドより下へ泳動されたＧＦＰのバンドは、分解産物であった（図５Ｂ）。ＧＦＰはプロテアーゼに対する耐性が高い［３９］ため、ＧＦＰ自体はその抗原性を維持していたが、ＥＧＦＰタグ付きエクアトリンタンパク質のエクアトリン部分は分解され、ＭＮ９抗原性が除去された。
【００５６】
図４及び図５Ｂの結果に基づき、１０１位〜１４６位のアミノ酸残基におけるＯ−グリコシル化がＭＮ９エピトープに関与するという仮説を立てた。この領域にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により検出されない２つのセリン残基及び３つのスレオニン残基が存在した（図２）ため、本発明者らは、セリン及びスレオニンの単一アミノ酸置換変異タンパク質を、ウエスタンブロットにより分析した（図５Ｃ）。低濃度に起因する偽陰性シグナルを回避するために、エクアトリンを意図的にオーバーロードしたが、これは同時にタンパク質分解を引き起こし、スメアなバンドを示した。図５Ｂ及び図５Ｃに関して、同量の培養細胞抽出物を、各実験において各レーンにロードした。ＭＮ９抗体は、Ｔ１３８Ａ変異体を除く全ての変異タンパク質を検出した。これにより、スレオニン１３８において翻訳後修飾が起こること、及びこの修飾がＭＮ９エピトープ領域に関与することが示唆された。
【００５７】
免疫金電子顕微鏡検査
最後に、エクアトリンの局在性を、ＭＮ９抗体、凍結解凍後の前封埋法（preembedding method）を使用する免疫金電子顕微鏡検査（図６Ａ及び図６Ｂ）により特定した。図６Ａは、前先体領域の画像を示す。免疫金粒子（５ｎｍの金、矢頭）は、先体内膜（ＩＡＭ）上で豊富であり、先体腔（先体腔をアスタリスクにより示す）に面するが、先体外膜（ＯＡＭ）上には乏しい（この写真では金粒子がない）。この写真では、ＯＡＭは凍結解凍処理により部分的に破れており（二重の矢頭）、これにより先体膜への免疫金粒子の浸透が可能となった。免疫金粒子は細胞膜（ＰＭ）上に存在することはない。図６Ｂは、後先体領域（赤道部分）の画像を示す。免疫金粒子（１０ｎｍの金）が、ＩＡＭ（矢頭）及びＯＡＭ（二重の矢頭）の両方に存在し、ここで粒子は狭まった内腔に面する高電子密度の物質と結び付くようである。高電子密度の核周囲の物質は、ＩＡＭと核（Ｎ）との間に見出される。エクアトリンが、先体内膜上に豊富であるが先体外膜上に極めて少ないことが見出された。これは通常、前先体領域において観察される（図６Ａ）。対照的に、エクアトリンは、後先体領域（赤道部分）においては先体内膜及び先体外膜の両方で豊富であった（図６Ｂ）。免疫金粒子が無傷精子における細胞膜で観察されることはなかった（図６Ａ）。
【００５８】
図７は、精子頭部の概略図を示すことにより、先体におけるエクアトリンの局在性を示すものである。ＭＮ９エピトープは、先体外膜（ＯＡＭ）及び先体内膜（ＩＡＭ）の両方に存在する。赤道部分（ＥＳ）のボックスで囲んだ領域を、右側に拡大する。先体反応前には、エクアトリンのＮ末端が先体腔に向いている（図６）。ＡＡ、前先体；ＰＭ、細胞膜。
【００５９】
図８Ａは、ＭＮ９抗体を用いたウエスタンブロット分析（１０％ゲル）を示す。精巣上体尾部の精子由来のエクアトリンは、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａという広い見かけの分子量を有していた（レーン１）。エクアトリンは、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理後に４０ｋＤａのバンドに移動した（レーン２）が、エクアトリンは０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で可溶化しなかった（レーン３）。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理後、４０ｋＤａのエクアトリンはＳＤＳ−ＥＤＴＡ緩衝液中に可溶化した（レーン４）。図８Ｂは試料調製図を示す。レーン１；未処理の精子全体をＳＤＳ試料緩衝液中で直接可溶化した。レーン２；０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に懸濁した精子全体をＳＤＳ試料緩衝液中で可溶化した。レーン３；０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の精子懸濁液の遠心分離後の上清。レーン４；ＳＤＳ溶解液中に可溶化した、沈殿（レーン３の試料調製による）の遠心分離後の上清。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理により、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａのエクアトリンを４０ｋＤａの単一バンドとして集中させることが可能となった。この集中により、免疫沈降によるエクアトリンの効率的な精製が容易となる。
【００６０】
ＥＱ７０〜８３抗体の特異性を測定するために、ウエスタンブロット分析（１２．５％ゲル）を、ＥＱ７０〜８３抗体を用いて実施した（図９Ａ）。ＥＱ７０〜８３抗体は、ＭＮ９抗体が認識する（図１Ａ）ものと同じバンドを認識した。図９Ｂは、ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体を用いた精巣上体尾部の精子のＩＩＦ顕微鏡検査結果を示す。先体が無傷の精子を画像ａ、画像ｄ及び画像ｇに示す。先体反応後の（Acrosome reacted）精子を画像ｂ、画像ｅ及び画像ｈに示す。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した精子を、ｃ、ｆ及びｉに示す。ＥＱ７０〜８３抗体は、画像ｂ及び画像ｃにおいて葉形の図として示される（図を色付けして示した場合、赤色で表される）。ＭＮ９抗体は、画像ｅ及び画像ｆにおいて葉形の図として示される（図を色付けして示した場合、緑色で表される）。ＥＱ７０〜８３抗体、ＭＮ９抗体及び微分干渉コントラスト画像の重ね合わせた画像を、画像ｇ〜画像ｉに示す。ＥＱ７０〜８３抗体及びＭＮ９抗体の両方が、先体反応後の精子、及び先体膜を透過処理した精子の赤道部分を認識したが、先体膜が無傷の精子を認識しなかった。バー＝１μｍ。
【００６１】
図１０はマウス精子及びヒト精子に関するウエスタンブロット分析を示し、画像ａ及び画像ｂは、ＤＩＣを用いない（画像ａ）、及びＤＩＣを用いた（画像ｂ）ヒト精子頭部に関するＩＩＦ顕微鏡検査画像を示す。
【００６２】
出願人は、本開示において引用した全ての参考文献の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが、或る範囲、好ましい範囲、又は好ましい上方値及び好ましい下方値のリストのいずれかとして与えられる場合、範囲が別々に開示されるかどうかに関わらず、これは、任意の範囲上限又は好ましい値、及び任意の範囲下限又は好ましい値の任意の対からなる全ての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。或る数値範囲が本明細書で記載される場合、他に記載がなければ、その範囲は、その端点、並びにその範囲内の全ての整数及び分数を含むことが意図される。本発明の範囲を、或る範囲を規定する際に記載される特定の値に限定することは意図されない。
【００６３】
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討、及び本明細書で開示された本発明の実施から、当業者に明らかであろう。本明細書及び実施例は例示的なものにすぎず、本発明の真の範囲及び精神が添付の特許請求の範囲、及びその均等範囲により示されるものと考えられることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受精を阻害する化合物を同定する方法であって、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するマウスエクアトリンの領域、又は配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するヒトエクアトリンの領域と結合する化合物を選択することを含む、化合物を同定する方法。
【請求項２】
マウスエクアトリンの前記領域がマウスエクアトリンの配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列における１０１位〜１４６位のアミノ酸配列を含む領域であり、ヒトエクアトリンの前記領域がヒトエクアトリンの配列番号５のアミノ酸配列における９２位〜１４４位のアミノ酸配列を含む領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程：
（１）マウスエクアトリン又はヒトエクアトリンを試験化合物と接触させる工程、
（２）前記領域を認識する抗体の該マウスエクアトリン又は該ヒトエクアトリンとの結合を検出する工程、及び
（３）試験化合物と接触させない場合における該抗体のマウスエクアトリン又はヒトエクアトリンとの結合と比較して、該結合を低減する化合物を選択する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が受精を阻害する効果を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、マウスエクアトリンの前記領域を認識する抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
培養細胞において該マウスエクアトリン又は該ヒトエクアトリンを発現させる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
マウスエクアトリンが、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列の１０１位〜１４６位の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するマウスエクアトリンの部分ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ヒトエクアトリンが、配列番号５のアミノ酸配列の９２位〜１４４位の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するヒトエクアトリンの部分ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
選択された化合物を雄性生殖細胞と接触させる工程、該雄性生殖細胞と雌性生殖細胞との間の受精を検出する工程、及び該受精を阻害する化合物を選択する工程を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１】
受精を阻害する化合物を同定する方法であって、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するマウスエクアトリンの領域、又は配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するヒトエクアトリンの領域と結合する化合物を選択することを含む、化合物を同定する方法。
【請求項２】
マウスエクアトリンの前記領域がマウスエクアトリンの配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列における１０１位〜１４６位のアミノ酸配列を含む領域であり、ヒトエクアトリンの前記領域がヒトエクアトリンの配列番号５のアミノ酸配列における９２位〜１４４位のアミノ酸配列を含む領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程：
（１）マウスエクアトリン又はヒトエクアトリンを試験化合物と接触させる工程、
（２）前記領域を認識する抗体の該マウスエクアトリン又は該ヒトエクアトリンとの結合を検出する工程、及び
（３）試験化合物と接触させない場合における該抗体のマウスエクアトリン又はヒトエクアトリンとの結合と比較して、該結合を低減する化合物を選択する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が受精を阻害する効果を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、マウスエクアトリンの前記領域を認識する抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
培養細胞において該マウスエクアトリン又は該ヒトエクアトリンを発現させる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
マウスエクアトリンが、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列の１０１位〜１４６位の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列の１３８位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するマウスエクアトリンの部分ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ヒトエクアトリンが、配列番号５のアミノ酸配列の９２位〜１４４位の連続するアミノ酸残基を含み、配列番号５のアミノ酸配列の１３６位に位置するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含有するヒトエクアトリンの部分ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
選択された化合物を雄性生殖細胞と接触させる工程、該雄性生殖細胞と雌性生殖細胞との間の受精を検出する工程、及び該受精を阻害する化合物を選択する工程を更に含む、請求項３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５３１１９６（Ｐ２０１２−５３１１９６Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６８８３（Ｐ２０１２−５１６８８３）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５１３９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５０１１０
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５１３９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５０１１０
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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