同一抗原に特異的に結合する複数の抗体の混合物もしくは複数の抗原結合部位を有する抗体
【課題】低用量でも高い中和活性を有する抗体医薬を提供すること。
【解決手段】本発明は、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含む組成物を提供する。本発明はまた、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体を提供する。本発明はまた、これらの組成物または抗体を含む医薬を提供する。
【解決手段】本発明は、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含む組成物を提供する。本発明はまた、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体を提供する。本発明はまた、これらの組成物または抗体を含む医薬を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同一の抗原（例えば、タンパク質またはペプチド）中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の抗体の混合物またはそのような複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の抗原結合部位を有する抗体に関する。
特に、本発明は、同一のヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の抗体の混合物またはそのような複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の抗原結合部位を有する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医薬品として承認されている抗体医薬の大部分は、その投与量が１日当たり数ｍｇ〜数１００ｍｇと非常に多くかつ高価である。抗体医薬品以外のバイオ医薬品の多くが、１日当たり数十μｇ〜１ｍｇの投薬量であるのと比較すると、抗体医薬品の一日に必要な投与量はその約１０倍から１０００倍と大幅な開きがある。したがって、現在の抗体医療においては、単位重量当たりの生物活性をいかに高めるかが大きな課題である。
【０００３】
また、抗体医薬品の製造に関しても、品目が増え必要生産量が大幅に増加しており、生産設備は世界的に不足状態にある。これらの状況からも、より少ない用量で効果を発揮するより中和能に優れた抗体、および／またはより高い生物活性を有するモノクローナル抗体が望まれている。
【０００４】
これまで、ポテリジェント抗体技術（非特許文献１）など多くの研究者がその課題に取り組んできた。Ｇｌａｓｓｙらは、生体内ではモノクローナルな抗体で炎症や免疫反応がコントロールされているのではなく、ポリクローナルな抗体でコントロールされていることに着目し、将来のガン療法として、抗体によるカクテル療法を提案している（非特許文献２）。しかし、Ｇｌａｓｓｙらの提案している抗体カクテル療法は、細胞膜上にあるような非遊離の抗原を標的としたものであり、かつ、当該抗体の抗原に対する直接的な阻害作用ではなくエフェクター細胞などを介した２次的な活性増強を意図している。
【０００５】
Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍらは、ヒトのメラノーマ細胞において、膜抗原（ｐ９７）上の異なったエピトープに対する２種類の抗体を介した細胞障害活性の相乗効果を報告している（非特許文献３）。このような相乗効果は、げっ歯類でも報告されており（非特許文献４および５）、これらはいずれも同一の細胞膜抗原に複数種の抗体が結合することによる補体活性の顕著な亢進であると考えられている。即ち、これらは、複数種の抗体による標的機能の直接的な阻害の増強ではない。
【０００６】
一方、破傷風毒素（ＭＷ＝約１５万）に対するエピトープの異なる抗体を用いて、当該毒素によるマウスでの致死例の減少を評価した報告がある（非特許文献６）。破傷風毒素は、毒性発現にいたる複数のステップがあり（非特許文献７）、それぞれのステップで異なった機能ドメインが役割を果たしている。上記の評価した抗体は、それら異なった機能ドメインの抗体であったことを考えると、in vivoでの相乗効果は、それら異なった機能をそれぞれ阻害したことに由来すると考えられる。
【０００７】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α：Tumor Necrosis Factor α）は、多くの腫瘍細胞に対して極めて強い抗腫瘍作用を発揮するサイトカインであり（非特許文献８）、悪液質誘発因子として同定されたカケクチンと同一物質である。現在では、抗腫瘍作用以外にも、視床下部、多核白血球、血管内皮細胞、骨や脂肪組織などのあらゆる組織や細胞において多彩な作用を示すことが知られている。その他、抗ウイルス作用、抗寄生虫作用等も報告されている。また、関節リウマチやクローン病などの免疫・炎症性疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００８】
ＴＮＦ−αは、１５７個のアミノ酸からなり、主として活性化マクロファージにより産生され、細胞膜表面のＴＮＦレセプターに結合して、炎症を起こした細胞の細胞死（アポトーシス）を誘発、炎症を収束させると考えられている。
【０００９】
現在すでに治療薬として抗ＴＮＦ−α抗体がクローン病や関節リウマチの患者に使用されている。日本国内でも、２００２年にはキメラ抗体であるレミケード(一般名：インフリキシマブ)が臨床で使用されるようになり（非特許文献９）、また２００８年６月には、ＴＮＦ−αの完全ヒト抗体（ヒュミラ：一般名；アドリムマブ）が医薬品として販売されている（非特許文献１０）。
【００１０】
ＴＮＦ−αの特性としては一般的に下記のようなものが知られている。
（１）ＴＮＦ−αの作用
（ａ）血管内皮細胞の障害
ＴＮＦ−αにより、好中球が活性化されると、産生されるエラスターゼが血管内皮細胞を障害し、血管内皮の透過性が亢進する。血漿が血管外に漏出し、血液が濃縮し微小循環障害が起こる。即ち、微小循環障害は、組織の虚血の原因となり臓器の機能不全につながる。
（ｂ）微小血栓の形成
ＴＮＦ−αにより、血管内皮細胞が活性化されると抗凝固因子の発現が低下し、線溶系因子の活性が低下する。そのため、微小血栓が形成される。
（ｃ）ミトコンドリアの障害
ＴＮＦ−αは、血管内皮細胞のミトコンドリアを障害する。神経細胞のミトコンドリアが障害を受けると、興奮性アミノ酸が増加し、二次的神経細胞障害が起こる。また、細胞膜の透過性（permeability）保持機能が消失し、Ca2+が細胞内に流入して、急性の神経細胞壊死が起こる。
（ｄ）アポトーシスの誘導
ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を介して、ミトコンドリアの透過性（permeability）転換を促進する。ミトコンドリア内膜の透過性亢進により、ミトコンドリアの膜間スペースからチトクロームＣが放出され、カスパーゼカスケードを刺激しアポトーシスを誘導する。
（２）疾患との関係
（ａ）関節リウマチ
ＴＮＦ−αはＩＬ−６と並んで、関節リウマチにおける関節破壊などの病態形成に中心的な役割を果たしている。マウスでのコラーゲン関節炎モデルは、ヒト関節炎と類似しているといわれているが、そのモデルにおいてＴＮＦ−αを投与すると疾患の増悪が認められている。臨床においてもインフリキシマブやアダリムマブなどＴＮＦ−αを標的としたモノクローナル抗体が用いられ効果が認められている（非特許文献１１）。
（ｂ）クローン病
クローン病患者においては、血清、糞便においてＴＮＦ−αの増加および粘膜固有層において産生亢進あるいは産生細胞の増加が見られ、ＴＮＦ−αに対する阻害剤がクローン病に有効であろうと考えられ、インフリキシマブが開発されている（非特許文献１２）。
（ｃ）糖尿病・高脂血症
ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を介した肥満に関与していることが報告されている（非特許文献１３）。肥満者は、非肥満者より血中へのＴＮＦ−αの分泌量が増加しており、インシュリン抵抗性を引き起こす可能性があること。ＴＮＦ−αは、インシュリン依存性の細胞内へのグルコース取り込みを抑制し、糖尿病の発症に関連すること。また、ＴＮＦ−αは、リポ蛋白リパーゼの活性を抑制し、高脂血症をきたすことなどが知られている。
（ｄ）敗血症
敗血症とは細菌感染などにより全身的な炎症が引き起こされた状態で、細菌がもつエンドトキシンが、マクロファージを活性化しＴＮＦ−αやＩＬ−１などのサイトカイン産生を亢進させる（非特許文献１４）。その際、ＴＮＦ−αは、感染の拡大を防ぐ働きを有するが、一方、全身的なＴＮＦ−αへの暴露は、末梢血管拡張による急激な血圧低下や播種性血管内凝固症候群（DIC）を引き起こす。
（ｅ）骨粗鬆症
骨では常に破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成が行われており、正常な状態ではこれらのバランスが保たれていることから見かけ上では骨の大きさは変化していない。しかし骨代謝に異常が生じ、この平衡が骨吸収側に傾くと骨量が減少し、骨粗鬆症に陥る。そのような中、ＴＮＦ−αは骨吸収を促進するサイトカインの一つとして知られている（非特許文献１５）
【００１１】
したがって、過剰発現したＴＮＦ−αに結合し、その生物学的活性を喪失させることが、ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる様々な病気に対する治療戦略上、有用であると考えられる。
【００１２】
現在、臨床で使用されている抗ＴＮＦ−α抗体については、関節リウマチの疾患に対する１回の投与量で見た場合、インフリキシマブで１５０ｍｇ／５０ｋｇ、アドリムマブで４０−８０ｍｇ／ヒトであり（非特許文献９および１０）、まだまだそれらの臨床用量は非常に高く、安全性、医療費などの面からも大きな課題といえる。
【００１３】
ＴＮＦ−αは様々な炎症性・免疫疾患の病態形成に重要な役割を果たしており、それらの疾患の治療は長期にわたる可能性が高い。これらのことを考慮すると、現状の抗ＴＮＦ−α抗体医薬品の用量レベルでは、治療期間中の暴露量も莫大なものとなり、やはり安全性、医療費などの面で大きな課題が存在する。
【００１４】
【非特許文献１】設楽研也、他.,ポテリジェント抗体技術とその応用、細胞工学 26巻：278-281, 2007
【非特許文献２】Glassy,M.C., et al.,Requirements for human antibody cocktails for oncology. Expert Opin. Biol. Ther., 5: 1333-137, 2005
【非特許文献３】Hellstrom, I., et al., Monoclonal antibodies to two determinats of melanoma-antigen p97 act synergistically in complement-dependent cytotoxicity. J. Immunology 127: 157-160, 1981
【非特許文献４】Elliott, E.V., et al., Synergistic cytotoxic effects of antibodies directed against different cell surface determinats. Immunology 34: 405-409, 1978
【非特許文献５】Howard, J.C., et al., Monoclonal anti-rat MHC (H-1) alloantibodies. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81: 54-60, 1978
【非特許文献６】Ziegler-Heitbrock, H.W., et al., Protection of mice against tetanus toxin by combination of two human monoclonal antibodies recognizing distinct epitopes on the toxin molecule. Hybridoma, 5: 21-31, 1986
【非特許文献７】Montecucco, C., et al., Tetanus and botulism neurotoxins: a new group of zinc proteases. TIBS, 18: 324-327, 1993
【非特許文献８】Fiers, W., Tumor necrosis factor characterization at the molecular, and cellular and in vivo level. FEBS Lett., 285:199-212, 1991.
【非特許文献９】田辺三菱製薬株式会社、抗ヒトTNFαモノクローナル抗体製剤 レミケード点滴静注用１００、インフリキシマブ（遺伝子組換え）製剤添付文書、2007年11月改訂
【非特許文献１０】アボットジャパン株式会社、ヒト型抗ヒトTNFαモノクローナル抗体製剤 ヒュミラ皮下注４０ｍｇシリンジ０．８mＬ、皮下注射用アダリムマブ（遺伝子組換え）製剤添付文書、2008年6月改訂
【非特許文献１１】Chang,J., et al., Novel therapies for rheumatoid arthritis. Pathophysiology, 12:217-225, 2005
【非特許文献１２】杉田尚久、インフリキシマブ（レミケード）−抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体製剤−の免疫・炎症性疾患に対する薬効薬理、日薬理誌（Folia Pharmacol.Jpn）,121: 57-64, 2003
【非特許文献１３】Uysal, K., T., et al., Functional analysis of tumor necrosis factor(TNF) receptors in TNF-α−mediated insulin resistance in genetic obesity. Endocrinology, 139: 4832-4838,1998
【非特許文献１４】Waage,A., et al., Association between tumour necrosis factor in serum and fetal outcome in patients with meningococcal disease. Lancet, 1:355-357, 1987
【非特許文献１５】Kobayashi, K., et al., Tumor necrosis factor αstimulate osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK Interaction., J.Exp.Med.,191: 275-285, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記のような状況下で、低用量でも高い中和活性を有する抗体医薬が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、同一抗原（例えば、ＴＮＦ−α）中の複数の異なる抗原決定基（エピトープ）をそれぞれ特異的に認識する複数のモノクローナル抗体の組合せを使って、個々のモノクローナル抗体を単独で用いる場合より、顕著に高い中和能を示すことができることを見出した。
【００１７】
即ち、本発明は、以下の組成物、抗体、医薬、これらの使用、および治療方法を提供する。
【００１８】
（１）同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含む組成物。
（１ａ）同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体の混合物。
（２）上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である、上記（１）に記載の組成物。
（２ａ）上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である（但し、ＧＭ−ＣＳＦを除く）、上記（１）に記載の組成物。
（３）上記抗原がサイトカインである、上記（２）に記載の組成物。
（４）上記サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である、上記（３）に記載の組成物。
（５）上記抗体がモノクローナル抗体である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）上記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、上記（５）に記載の組成物。
【００１９】
（７）同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体。
（８）上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である、上記（７）に記載の抗体。
（８ａ）上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である（但し、ＧＭ−ＣＳＦを除く）、上記（７）に記載の抗体。
（９）上記抗原がサイトカインである、上記（８）に記載の抗体。
（１０）上記サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である、上記（９）に記載の抗体。
（１１）上記複数の異なる抗原結合部位をそれぞれ含む部分が、リンカーにより互いに結合されている、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗体。
（１２）上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の抗体を含む組成物。
【００２０】
（１３）上記（１）〜（６）、上記（１２）のいずれかに記載の組成物からなる医薬。
（１４）ＴＮＦ−αが関与する疾患を治療するための上記（１３）に記載の医薬。
（１５）上記疾患が、関節リウマチ、クローン病、糖尿病・高脂血症、敗血症、または骨粗鬆症である、上記（１４）に記載の医薬。
【００２１】
（１６）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物、上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の抗体、または、上記（１２）に記載の組成物の、医薬としての使用。
（１７）上記（４）に記載の組成物、上記（１０）に記載の抗体、または上記（１４）に記載の医薬の、ＴＮＦ−αが関与する疾患に罹患しているか、または罹患している疑いのある患者の治療薬としての使用。
（１８）上記疾患が、関節リウマチ、クローン病、糖尿病・高脂血症、敗血症、または骨粗鬆症である、上記（１７）に記載の使用。
【００２２】
（１９）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物、上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の抗体、または、上記（１２）に記載の組成物を、患者に投与する工程を含む、疾患の治療方法。
（２０）上記（４）に記載の組成物、上記（１０）に記載の抗体、または上記（１４）に記載の医薬を、ＴＮＦ−αが関与する疾患に罹患しているか、または罹患している疑いのある患者に投与する工程を含む、ＴＮＦ−αが関与する疾患の治療方法。
（２１）上記疾患が、関節リウマチ、クローン病、糖尿病・高脂血症、敗血症、または骨粗鬆症である、上記（２０）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の抗体または抗体の混合物は、生物活性が高く、安全性、医療費などの面から医薬品として顕著な有用性を有する。本発明によれば、従来よりも低用量での抗体医薬を使用した疾患の治療が可能となる。
【００２４】
本発明に係る抗ＴＮＦ−α抗体を含有する医薬は、ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、関節リウマチ、クローン病、糖尿病、敗血症、骨粗しょう症などの疾患の予防ないし治療薬として非常に少量で有効であると考えられ、安全性の面および医療費の面でこれまでの治療薬に比べよりいっそうの有用性がある。
【００２５】
本発明に係る、同一抗原中の異なる複数のエピトープを認識する複数の可変領域（または抗原結合部位）を同一分子内に有する抗体、即ち、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体も、従来の当該抗原に対するモノクローナル抗体をそれぞれ単独で使用する場合と比較して、顕著に高い中和活性を示しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
１．本発明の抗体の混合物または組成物
本発明は、１つの実施形態において、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含む組成物またはそのような抗体の混合物を提供する。
【００２７】
本発明に関して、「抗原」は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である。とりわけ、本発明に関して好ましい抗原は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。「ペプチド」としては、典型的には、アミノ酸数が、数個（例えば、３個、４個、５個）〜数十個（例えば、１０個、２０個、３０個、４０個）のアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、または「ペプチド」には、糖タンパク質、リポタンパク質、プロテオグリカンなどの複合タンパク質も含まれ、それらの例としては、例えば、サイトカイン（ケモカインも含む）、細胞表面抗原、レセプター、トキシン等が挙げられる。本発明において使用される抗原としては、ＴＮＦ−α、特にヒトＴＮＦ−αが好ましい。
【００２８】
一般に、抗体は、４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖であってジスルフィド結合によって相互接続されている。各Ｈ鎖は、Ｈ鎖可変部領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶH」と称す場合がある）とＨ鎖不変部領域（Ｈ鎖不変部領域は３つのドメインからなり、それぞれ「ＣH１」、「ＣH２」、「ＣH３」と称す場合がある）からなる。各Ｌ鎖は、Ｌ鎖可変部領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶL」と称す場合がある）とＬ鎖不変部領域（Ｌ鎖不変部領域は１つのドメインからなり、「ＣL」と称す場合がある）からなる。
【００２９】
特にＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。抗体はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲのアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用するので、可変部領域内のアミノ酸配列は可変部領域の外にある配列よりも個々の抗体間の違いが大きい。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、より一定に保たれたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、それぞれ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列している。
【００３０】
本明細書中、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を有する１つ又は複数の抗体のフラグメントを指す。そのフラグメントには、抗原に特異的に結合する最小限のアミノ酸配列を有するペプチド（本明細書中、「抗原結合部位」ともいう。）が含まれる。したがって、「抗原結合部分」を「抗原結合部位を含む部分」ということもある。また。抗体の可変部領域および／または相補性決定領域を有する一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）も抗原結合部分に含まれるものとする。
【００３１】
本発明に関し、単に「抗体」という場合、２本の重鎖（Ｈ鎖）および２本の軽鎖（Ｌ鎖）からなるもののみならず、上記のような「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）も含むものとする。
【００３２】
すなわち、本発明の抗体は、完全長の抗体若しくはその抗原結合部分、又は完全長でない部分的な抗体であってもよく、可変部領域や、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列をもとにすれば、当該技術分野における周知の技術によって、抗原に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る組換えヒトモノクローナル抗体、モノクローナル抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体も含む）又はその抗原結合部分を複数種類組み合わせてもよい。
【００３３】
本明細書中、「同一抗原」または「同一の抗原」という用語は、複数の抗体（すなわち、正味で複数の抗原結合部位を有する）または複数の抗原結合部位を有する１つの抗体について、それら複数の抗原結合部位が結合する相手として、一つの抗原を対象とするという意味で用いられる。本発明においては、特に、その１つの抗原の中に複数の異なるエピトープが存在し、複数の抗体（すなわち、正味で複数の抗原結合部位を有する）または複数の抗原結合部位を有する１つの抗体のそれぞれの抗原結合部位がそれらの複数の異なるエピトープに結合することを意味する。
【００３４】
ここで、「エピトープ」または「抗原決定基（antigenic determinant）」とは、抗体が認識して結合する抗原の特定の構造単位のことをいう。エピトープは、通常、例えば、６〜１０個のアミノ酸や５〜８個の単糖の配列等からなる。エピトープは抗原性のための最小単位であり、通常、１つの抗原には複数のエピトープが含まれている。抗体は病原微生物や高分子物質などと結合する際、その全体を認識するわけではなく、エピトープを認識して結合する。
【００３５】
本発明に関して「同一の抗原」という場合、例えば、異なるヒト（例えば、異なる患者）由来の同一サイトカイン（例えば、ヒトＴＮＦ−α）は、同一抗原と考える。リコンビナントの技術で得られたｒＴＮＦ−αも糖鎖の違いはあるが同一と考える。当然ながら、ヒトＴＮＦ−αとヒトＩＮＦ−γとは同一の抗原とは言えない。
【００３６】
本明細書中、抗体が抗原に「特異的に結合する」とは、抗体が所定の抗原を認識してそれに結合すること言う。典型的には、抗体は少なくとも約１×１０-7（Ｍ）の親和性で結合し、所定の抗原に対しては、前記所定の抗原又は関係の近い抗原以外の非特異的な抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）に対するその結合親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で結合する。
【００３７】
本発明の抗体の特異的に結合する抗原との解離定数（Ｋｄ値）は、好ましくは１×１０-7Ｍ以下、より好ましくは１×１０-8Ｍ以下、１×１０-9Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０-10（Ｍ）以下である。抗体と抗原との解離定数を測定するには、公知の方法を用いることができる。例えば、チップ上に固定化した抗原を用いてＢＩＡＣＯＲＥ３０００（登録商標）のような蛋白質相互作用解析装置により測定することができる。
【００３８】
「抗原の活性を中和し得る抗体」とは、抗原に結合することによってその抗原の生物学的活性を阻害する抗体を指すものとする。本明細書で使用される、「阻害効果」、「阻害」、「阻害し得る」、「抑制」等々の用語は、源が何であれ、ターゲットとなる抗原に起因する生物活性を約５〜１００％低減させる抗体の活性を称する。好ましくは、治療投与のためには、例えばＴＮＦ−αの観察される生物活性の低減は、約５０〜１００％の範囲にある。
【００３９】
ＴＮＦ−αの生物活性の低減は、例えば、ＴＮＦ-αに感受性な培養細胞を用いて評価することが出来る。具体的には、マウスのＬ９２９細胞を用いＴＮＦ−αによる細胞毒性の程度を評価することによりＴＮＦ−αの生物活性の低減を測定できる（Seckinger, P., et al., J. Exp. Med., 167, 1511-1516, 1988）。
【００４０】
なお、抗体作製の手法としては、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ等の実験動物を利用して常法によりポリクローナル抗体や、モノクローナル抗体を取得することができる。あるいは、このようにして得られる抗体は用いた動物種に特徴的な配列を有しているので、そのままヒトに投与するとヒト免疫系により異物として認識され、ヒト抗動物抗体応答が起こる（即ち、抗体の抗体を作ってしまう）ことがあることを考慮して、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体を使用することもできる。完全ヒト抗体は、抗体医薬として人体に投与したとしても、免疫原性を有さず、免疫反応は見られないものと考えられる。
あるいは、既に周知の供給業者から市販されている抗体を使用することができる。
【００４１】
２．本発明に係る二重特異性抗体または多重特異性抗体
本発明は、別の１つの実施形態において、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体（本明細書中、「二重特異性抗体」または「多重特異性抗体」と呼ぶことがある。）を提供する。
【００４２】
以下、本発明に係る、抗原の２種以上の異なるエピトープを認識する機能を有する二重特異性抗体、または多重特異性抗体について説明する。
【００４３】
一般に、「二重特異性抗体」とは、１つの抗体分子が、２つの異なるエピトープを認識する可変領域を有するものを指すが、本発明について「二重特異性抗体」という場合は、特に、同一抗原中の２つの異なるエピトープを認識する可変領域を同一抗体分子内に保有している抗体のことを指す。同様に、本発明について「多重特異性抗体」という場合は、同一抗原を認識しながら、同一抗体分子内に３個以上の異なるエピトープを認識・結合する機能（または可変領域）を有する抗体を指すものとする。
【００４４】
一般に、二重特異性抗体（または多重特異性抗体）にも、IgG型、knobs-into-holes変異、diabody型、一本鎖diabody(scDb)型、diabody-Fc型など種々の形態が報告されている。また、これらの作成法に関しても多くの方法が紹介されている（Marvin, J.S. et al., Acta. Pharmacol. Sin, 26：649-58, 2005； Nitta, T. et al., Lancet, 335：369-371, 1990； Chengbin, W. et al., Nature Biotechnology, 25, 1290-97, 2007）。本発明の二重特異性抗体または多重特異性抗体も、これらの方法を使用して作製することができる。
【００４５】
より具体的には、例えば、異なる２つの抗体を産生するハイブリドーマを細胞融合させ、二重特性抗体産生ハイブリドーマを得る方法（ＵＳＰ４，４７４，８９３）、遺伝子工学的または化学的に２種類の抗体または抗原結合部分をペプチド性リンカーで結合する方法、およびポリアルキレン、ホリアルケニレン、ポリオキシアルキレンまたは多糖類から選択される合成または天然に存在するポリマー用いて分子間架橋をする方法（特表２００２−５１７５１５）などがある。特に最近は、H鎖の可変領域（VH）とL鎖の可変領域（VL）をペプチドリンカーで結合させた一本鎖抗体（ｓｃFv）が考案され、この技術を更に応用したdiabody型二重特異性抗体（特開２００４−２４２６３８）、さらにFc部分を結合させた、diabody-Fc型などの技術が存在するが（熊谷泉他, 抗体ドメインの積み木細工による高機能化と医薬への展開. 抗体医薬の最前線(シーエムシー出版)： 3-13, 2007）、これらの方法を用いることによって、二重特異性（または多重特異性）を有する抗体を作製することができる。
【００４６】
本発明の二重特異性抗体または多重特異性抗体が結合する抗原としては、既に本発明の抗体の組成物または混合物について説明したものと同様である。また、「特異的に結合」、「抗原の活性を中和」、「阻害効果」、「阻害」、「阻害し得る」、「抑制」等々の用語の使用法についても既に本発明の抗体の組成物または混合物について説明したものと同様である。
【００４７】
３．本発明に係る抗体を含有する医薬組成物
本発明は、さらに別の実施形態において、同一抗原の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含有する医薬を提供する。本発明はまた、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体を含有する医薬を提供する。これらの医薬（または医薬組成物）は、医薬として許容される（または薬学的に許容可能な）担体を含んでいても良い。
【００４８】
好ましくは、本発明の医薬は、ＴＮＦ−αが関与する疾患を治療するためのものである。
【００４９】
本明細書で使用される「ＴＮＦ−αが関与する疾患」という用語は、その疾患にかかっている被験対象が過剰なＴＮＦ−αを発現していることが、その疾患の病態病理の原因であり、又はその疾患を悪化させる一因である、ということが示され、又はそうであると考えられる疾病を意味するものとする。このようなＴＮＦ−αの過剰な産生により引き起こされる疾病としては、（ａ）関節リウマチ、（ｂ）クローン病、（ｃ）骨粗鬆症、（ｄ）敗血症などを例示することができる。
【００５０】
本明細書で使用される「医薬品として許容される（または薬学的に許容可能な）担体」には、生理学的に適合可能な任意の、または全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。
【００５１】
医薬品として許容される担体の例には、水、塩類溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１種または複数、並びにこれらの組合せが含まれる。注射剤などとして使用される場合、ｐＨ調節剤や等張剤、例えば糖や、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬品として許容される担体には、さらに、湿潤剤や乳化剤、防腐剤、緩衝剤、安定化剤など、抗体又は抗体部分の保存性または有効性を増大させる少量の補助物質を含めることができる。
【００５２】
本発明の組成物は、様々な剤型にすることができる。そのような組成物には、例えば、溶液（例えば注射可能であり輸液可能な溶液）や分散液、懸濁液、凍結乾燥製剤、錠剤、カプセル、トローチ、ピル、粉末、リポソーム、坐剤など、液体、半固体、固体の剤型が含まれる。好ましい形は、意図される投与形態および治療の適用例により異なる。一般に好ましい組成物は、他の抗体でヒトを受動免疫化するために使用されるものと同様の組成物など、注射可能または輸液可能な溶液の形にあるものである。好ましい投与形態は、非経口的なもの（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内から）である。好ましい実施形態では、抗体は、静脈輸液、または静脈注射によって投与される。別の好ましい実施形態では、抗体は筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【００５３】
本発明の抗体もしくは抗体部分の組合せ、または二重特異性抗体・多重特異性抗体は、非経口投与に適する医薬品組成物に組み込むことができる。抗体又は抗体部分は、単独種類を使用し製剤化する場合には、０．１〜２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能な製剤として調製することが好ましい。一方、複数種類の抗体を混合して製剤化する場合には、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能な製剤として調製することが好ましい。なお、その複数種類の抗体の混合割合は、適宜設定することができる。
【００５４】
注射可能な製剤は、有効成分を液体に溶解したものまたは有効成分を凍結乾燥させたものを、フリントまたはアンバーバイアル、アンプル、またはプレフィルドシリンジに入れたもので構成することができる。緩衝剤は、ｐＨ４．０〜８．０（最適な場合、ｐＨ６．０〜７．５）のＬ−ヒスチジン（１〜５０ｍＭ）、最適な場合は５〜１０ｍＭのＬ−ヒスチジンにすることができる。その他の適切な緩衝剤には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定されない。濃度０〜３００ｍＭの溶液（液体剤型に関しては、最適な場合、１５０ｍＭ）の浸透圧を変えるために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥させた剤型には、凍結保護物質、主に０〜１０％（最適な場合、０．５〜５．０％）のスクロースを含めることができる。その他の適切な凍結保護物質にはマンニトール、トレハロースおよびラクトースが含まれる。凍結乾燥させた剤型には、増量剤、主に１〜１０％のマンニトール（最適な場合、２〜４％）を含めることができる。液体および凍結乾燥させた剤型の両方には、安定剤、主に１〜５０ｍＭＬ（最適な場合、５〜１０ｍＭ）のＬ−メチオニンを使用することができる。その他の適切な安定剤にはグリシン、アルギニンおよびポリソルベート８０等が含まれ、０〜０．０５％（最適な場合、０．００５〜０．０１％）のポリソルベート８０を含めることができる。他の界面活性剤には、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本医薬組成物は、一般に、製造および貯蔵の条件下で無菌または安定でなければならない。この組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に適するその他のオーダーされた構造として、処方することができる。無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物（すなわち抗体又は抗体部分）を、必要な場合には上述の成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に混ぜ、その後、濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、活性化合物を、基本的な分散媒および上記列挙したものから必要とされるその他の成分を含有する無菌ビークル(vehicle)に混ぜることによって、分散液を調製する。無菌の注射可能な溶液を用時調製するための無菌粉末製剤の場合、好ましい調製方法は、前に述べたその滅菌濾過溶液の凍結真空乾燥および噴霧乾燥であり、それによって、活性成分の粉末に加え、前に述べた任意の他の所望の成分を含んだ組成物が得られる。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、また、分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また、界面活性剤を使用することによって、維持することができる。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、その組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩やゼラチンを含めることによって行うことができる。
【００５６】
医薬組成物には、補助的な活性化合物も組み入れることができる。ある実施形態では、本発明の複数種類の組合せからなる抗体又は抗原結合部分は、例えば、ＴＮＦ−αが原因となる疾患を治療するのに有用な１種または複数の他の治療薬と一緒に処方し、またはそのような他治療薬と同時に投与する。例えば、本発明の抗ＴＮＦ−α抗体又は抗体部分は、他の標的に結合する１つまたは複数の他の抗体（例えば、他のサイトカインに結合する抗体、または細胞表面分子に結合する抗体）と一緒に処方し、またはそのような他の抗体と同時に投与することができる。そのような組合せによる療法は、投与された治療薬のより低い用量を有利に利用することができ、したがって、様々な単一療法に伴う可能性ある毒性または合併症が回避される。
【００５７】
特に、本発明の抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を複数種類同時に投与する場合、もしくは二重特異性抗体などを使用する場合などには、単独種類を使用する場合と比較して格段に高い細胞増殖阻害活性（中和活性）を有するので、治療薬全体としてより低い用量で投与することが可能となる。
【００５８】
本発明に係る抗ＴＮＦ−α抗体又はその抗原結合部分のコンビネーションは、ＴＮＦ−αに対して、従来の抗ＴＮＦ−α抗体より高い中和能をもつので、ＴＮＦ−αが関与する疾患（ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる様々な疾病）の治療薬として有用である。ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる疾患は、ＴＮＦ−α活性の阻害によってその疾患の症状および／または進行が緩和されることが予測される疾患である。
【００５９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００６０】
１．ｈＧＭ−ＣＳＦに対する完全ヒト抗体産生細胞クローンの分離
図１は、抗体産生細胞クローンの分離までのフローチャートである。
血清中の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体が高値であるヒトの血液からＢリンパ球を分離し、その後ＥＢＶに感染させ増殖してきた細胞を抗体産生細胞ライブラリーとした。
【００６１】
抗体産生細胞ライブラリーは９６ｗｅｌｌプレートに播種し、およそ３〜４週間の培養後、培養上清中の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の１ｓｔスクリーニングを行った。スクリーニングはリコンビナントｈＧＭ−ＣＳＦをコートした９６ｗｅｌｌプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ法により行った。得られた抗体陽性細胞集団は新たな９６ｗｅｌｌプレートに播種した。３〜４週間培養した後に抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の２ｎｄスクリーニングを行った。得られた抗体陽性細胞集団は新たな９６ｗｅｌｌプレートに限界希釈で播種した。３〜５週間培養した後に、抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の３ｒｄスクリーニングを行った。得られた抗体陽性細胞集団は限界希釈による培養とスクリーニングを行い、ｗｅｌｌ当たり１個まきのプレートから抗体陽性細胞を得た。
【００６２】
２．抗体アイソタイプおよびサブクラスの確認
分離した３種類の抗体（ＥＶ１００７、ＥＶ１０１８、ＥＶ１０１９）産生細胞クローンについて産生する抗体のアイソタイプおよびサブクラスをそれぞれ確認した（表1）。確認の方法はスクリーニングと同様のＥＬＩＳＡ法を利用し、２次抗体としてそれぞれのアイソタイプおよびサブクラスに特異的な抗体を使用した。サンプルはクローン分離後の細胞培養上清を用いた。
表１に、新たに得られた３種類の抗ｈＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体、及び国際公開第０７／０４９４７２号パンフレットにおいてＪ１５８ ４Ｃとして報告したモノクローナル抗体（以下、ＥＶ１００３と称す）について、抗体名及びサブクラスをそれぞれ示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
３．抗体産生細胞からの抗体遺伝子のクローニング
得られた抗体産生細胞からの抗体遺伝子のクローニングを行った。抗体産生細胞からｔｏｔａｌ−ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ ｐｒｉｍｅｒとＲｅｖｅｒｓｅ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いｃＤＮＡ合成を行った。
合成したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法による抗体遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲに使用するｐｒｉｍｅｒは抗体遺伝子シークエンスのデータベースをもとに、５´末端側は転写開始点を含むように、３´末端側は転写終結点を含むように設計した。
【００６５】
４．抗体遺伝子の塩基配列に基づく抗体のアミノ酸配列の決定
得られた３種類の抗体遺伝子（Ｈ鎖・Ｌ鎖）のｃＤＮＡクローンをプラスミドベクターに挿入し、ＡＢＩシークエンサーにより３種類の抗体遺伝子（Ｈ鎖・Ｌ鎖）の塩基配列を確認した。得られた塩基配列より、３種類の抗体の各H鎖およびL鎖のアミノ酸配列を決定した。
また、これら新規の３種類（ＥＶ１００７、ＥＶ１０１８、ＥＶ１０１９）の抗体及びＥＶ１００３の相補性決定領域（ＣＤＲ）の解析には、Kabatの方法を用いた（文献：www.bioinf.org.uk: Dr.andrew C.R. Martin's Group, Antibodies: General Information参照）。これら４種の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のそれぞれのＣＤＲを配列番号１〜２４に示す。具体的にはＥＶ１０１８のＬ鎖ＣＤＲ１，Ｌ鎖ＣＤＲ２，Ｌ鎖ＣＤＲ３、Ｈ鎖ＣＤＲ１，Ｈ鎖ＣＤＲ２，およびＨ鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１〜６、ＥＶ１０１９のＬ鎖ＣＤＲ１，Ｌ鎖ＣＤＲ２，Ｌ鎖ＣＤＲ３、Ｈ鎖ＣＤＲ１，Ｈ鎖ＣＤＲ２，およびＨ鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号７〜１２、ＥＶ１００７のＬ鎖ＣＤＲ１，Ｌ鎖ＣＤＲ２，Ｌ鎖ＣＤＲ３、Ｈ鎖ＣＤＲ１，Ｈ鎖ＣＤＲ２，およびＨ鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１３〜１８、ＥＶ１００３のＬ鎖ＣＤＲ１，Ｌ鎖ＣＤＲ２，Ｌ鎖ＣＤＲ３、Ｈ鎖ＣＤＲ１，Ｈ鎖ＣＤＲ２，およびＨ鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１９〜２４に示す。
【００６６】
５．得られた抗体遺伝子が抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体をコードしていることの確認
得られた３種類の抗体遺伝子（Ｈ鎖・Ｌ鎖）について、各ｃＤＮＡクローンをそれぞれ発現ベクターに挿入した。各抗体のＨ鎖およびＬ鎖を挿入した発現ベクターを
２９３Ｔ細胞に導入し、一過性での抗体発現の確認を行った。
遺伝子導入（transfection）はリポフェクタミン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とプラス試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による方法を採用した。
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の発現は遺伝子導入から２日後の２９３Ｔ細胞の培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧ抗体の検出および抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の検出を行い確認した。
【００６７】
６．ＣＨＯ抗体安定発現株の獲得
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体発現が確認できた発現ベクターをＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、抗体を安定して発現するＣＨＯ細胞クローンの分離を行った。遺伝子導入は上述の２９３Ｔ細胞の場合と同様の方法を採用した。遺伝子導入から２日後のＣＨＯ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、適切なセレクションマーカーの存在下で培養した。およそ２週間培養後、培養上清中の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のスクリーニングを行った。スクリーニングはＥＬＩＳＡ法により行った。得られた抗体発現ＣＨＯ細胞は９６ｗｅｌｌプレートに ｗｅｌｌ当たり１個まきで播種した。１個まきのｗｅｌｌから増殖したＣＨＯ細胞の抗体発現を確認し、抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体安定発現ＣＨＯ細胞クローンを得た。
【００６８】
７．抗体精製
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の精製は抗体安定発現ＣＨＯ細胞クローンを無血清培地を用いて培養した上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＡを用いたアフィニティー精製で行った。カラムはＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のプレパックカラムを使用し、精製条件はカラムメーカーの推奨条件とした。精製後の抗体については、ＥＬＩＳＡによる抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の確認と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる約５０ｋＤａの抗体Ｈ鎖と約２５ｋＤａの抗体L鎖の確認を行った。
【００６９】
８．抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のアフィニティー解析
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のアフィニティー解析は、ビアコアシステム（登録商標）を用いて行った（図２）。
方法はＰｒｏｔｅｉｎＧをセンサーチップに固定化し、ＰｒｏｔｅｉｎＧ固定化表面に抗体を添加して捕捉させる。続いて、抗体が捕捉されているセンサーチップ表面に抗原を添加して相互作用を測定するものである。抗体は精製抗体、抗原にはリコンビナントｈＧＭ−ＣＳＦを用いた。
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のアフィニティー（親和性）の評価としては、ｙｅａｓｔ ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）およびＥ．ｃｏｌｉ ｈＧＭ−ＣＳＦ(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ)に対しての解離定数（ＫＤ（Ｍ））を求めた。結果を（表２）に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
Ｌｅｕｋｉｎｅに対しては、ＥＶ１００７が１．２×１０-9（Ｍ）、ＥＶ１０１８が２．３×１０-10（Ｍ）、ＥＶ１０１９が３．６×１０-10（Ｍ）であった。更に以前取得したＥＶ１００３においては２．３×１０-10（Ｍ）であった。
また、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈに対しては、それぞれＥＶ１００７が９．３×１０-10（Ｍ）、ＥＶ１０１８が１．５×１０-10（Ｍ）、ＥＶ１０１９が１．５×１０-10（Ｍ）であった。更に、ＥＶ１００３に関しては、９．５×１０-11（Ｍ）であり、いずれもｈＧＭ−ＣＳＦに対して非常に高い親和性があることが確認された。
【００７２】
９．抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体による末梢血樹状細胞の増殖抑制効果
７×１０7の単核球よりＢｌｏｏｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ II Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、５×１０5の樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ:以下、ＤＣと略す。）を回収した。このＤＣには、ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ＤＣとｍｙｅｌｏｉｄ ＤＣが含まれている。
得られたＤＣをＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳにリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）（１ｎｇ／ｍＬ)、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ)、および抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（１μｇ／ｍＬ）を添加した培養液に浮遊し、９６ｗｅｌｌ平底プレートに２×１０4／ｗｅｌｌ播いて１０日間培養した。
なお、コントロールとして、ＧＭ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体（ａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦｐＡｂｓ）（１μｇ／ｍＬ）及びＣＭＶに対するヒトのモノクローナル抗体（ｈＩｇＧ）（１μｇ／ｍＬ）を用いた。
培養結果を図３に示す。
【００７３】
図３から、ＥＶ１００３、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９の各抗体を添加したｗｅｌｌでは、ＤＣのＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖が抑制されたことが判る。一方、ＥＶ１００７はＤＣのＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖を抑制しなかった。また、ａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦ ｐＡｂｓではＤＣのＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖が抑制されたが、ｈＩｇＧでは増殖抑制は認められなかった。
以上より、ＥＶ１００３、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９は、いずれも単独でＤＣの増殖を抑制することが確認された。
【００７４】
１０．抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体のＴＦ−１細胞を用いた中和活性評価
図４及び図５は、精製した３種類の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体（ＥＶ１００７、ＥＶ１０１８、ＥＶ１０１９）及び以前取得したＥＶ１００３について、ＧＭ−ＣＳＦ依存的な増殖が認められることが知られているＴＦ−１細胞を用い、これら抗体の中和活性を調べたものである。
ＴＦ−１細胞に精製抗体とリコンビナントｈＧＭ−ＣＳＦをプレインキュベートしたものを添加して培養し、約２日後の生細胞数をカウントした。抗体に中和活性があれば、添加したＧＭ−ＣＳＦを中和し、ＴＦ−１細胞の増殖を抑えることができる。
【００７５】
図４は、各々ｙｅａｓｔ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）によって、及び図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＳＦ(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ)によって刺激されるＴＦ−１細胞の増殖が、各種抗体などの添加によって抑制される程度（中和活性）をそれぞれ評価したものである。
各種ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体は単体で用い、コントロールとして上記９．の増殖抑制効果と同じａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦ ｐＡｂｓ及びｈＩｇＧを用いた。
【００７６】
各被験物質は、２μｇ／ｍＬ〜３１ｐｇ／ｍＬの濃度範囲で4倍ずつ段階的に希釈し、それぞれの濃度について評価した。使用したｈＧＭ−ＣＳＦ濃度は、いずれの場合も０．５ｎｇ／ｍＬで、約４０時間培養後のＴＦ−１細胞の生細胞数の変化を調べた。生細胞のカウントはＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（同仁）を使用し、発色（Ａ４５０/ｒｅｆ. Ａ５９５）の強さで評価した。
図４及び図５において、縦軸は、３１ｐｇ／ｍＬのｈＩｇＧを添加した場合でのＴＦ−１細胞の生細胞数を１００％とし、同じ条件でＧＭ−ＣＳＦを添加しなかった場合のＴＦ−１細胞の生細胞数を０％としたときの百分率で示したものである。使用した抗体及びコントロールサンプルについては図の下に示し、それらの添加濃度は図の右側にそれぞれ示した。
【００７７】
ＴＦ−１細胞の増殖誘導に、ｙｅａｓｔ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）０．５ｎｇ／ｍＬを用い、各種抗体単体の中和活性を評価した結果を（図４）に示す。陰性対照としてのｈＩｇＧでは、２μｇ／ｍＬの高濃度で非特異的な増殖抑制を認めたが、それ以下のいずれの濃度でも細胞増殖抑制は認められなかった。ＧＭ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体（ａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦ ｐＡｂｓ）では、１２５ｎｇ／ｍＬ以上で抗体用量依存的に細胞増殖抑制が認められた。
精製したモノクローナル抗体においては、ＥＶ１００３では、３１ｎｇ／ｍＬでコントロール（ｈＩｇＧ）の約６０％まで抑制して明確な増殖抑制が認められ、さらにその濃度以上では抗体濃度依存的な細胞増殖抑制が認められた。ＥＶ１０１８は０．５ｎｇ／ｍＬ以上で、ＥＶ１０１９は２ｎｇ／ｍＬ以上で、コントロール（ｈＩｇＧ）の約５０％まで抑制して顕著な細胞増殖抑制が認められ、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９はｈＧＭ−ＣＳＦに対して非常に強い中和活性があることが確認された。また、ＥＶ１００７において、ＴＦ−１細胞の増殖抑制が明らかに認められたのは、０．５μｇ／ｍＬ以上のみで、中和活性が非常に低いことが判った。
【００７８】
一方、ＴＦ−１細胞の増殖誘導にＥ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＳＦ(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ) ０．５ｎｇ／ｍＬを用い、各種抗体単体での中和活性を評価した結果を（図５）に示す。この結果においても、陰性対照としてのｈＩｇＧでは、２μｇ／ｍＬの高濃度で非特異的な増殖抑制を認めたが、それ以下のいずれの濃度でも明らかな細胞増殖抑制は認められなかった。ＧＭ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体（ａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦ ｐＡｂｓ）では、３１ｎｇ／ｍＬ以上で抗体用量依存的に細胞増殖抑制が認められた。
精製したモノクローナル抗体については、ＥＶ１００３では、３１ｎｇ／ｍＬ以上で抗体濃度依存的に明らかな細胞増殖抑制が認められた。ＥＶ１０１８は０．５ｎｇ／ｍＬ以上で、ＥＶ１０１９は２ｎｇ／ｍＬ以上で、コントロール（ｈＩｇＧ）の約５０％以下まで抑制して顕著な細胞増殖抑制が認められ、これらの抗体はｈＧＭ−ＣＳＦに対する中和活性が非常に強いことが確認された。
また、ＥＶ１００７においては、ＴＦ−１細胞の明確な増殖抑制が認められたのは、０．５μｇ／ｍＬ以上のみで、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９の抗体と比較して中和活性が非常に低いことが明らかになった。
【００７９】
図６及び図７は、各種ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体及びｈＩｇＧのうちから２種類を選択して混合した混合抗体について中和活性を評価した結果である。
これら各図の下の部分にも記載したように、各種ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体及びｈＩｇＧの中から用いた混合抗体の組み合わせは、下記表３に示す５種類である。
【００８０】
【表３】
【００８１】
各被験物質は、４μg／ｍＬ〜６２ｐg／ｍＬの濃度範囲で4倍ずつ段階的に希釈し、それぞれ同じ濃度の抗体溶液を２種類混合した混合抗体（終濃度は図６及び７中に示した値）について評価した。生細胞のカウントはＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（同仁）を使用し、発色（Ａ４５０/ｒｅｆ. Ａ５９５）の強さで評価した。
【００８２】
図６及び図７においても、縦軸は、３１ｐｇ／ｍＬのｈＩｇＧを添加した場合でのＴＦ−１細胞の生細胞数を１００％とし、同じ条件でＧＭ−ＣＳＦを添加しなかった場合のＴＦ−１細胞の生細胞数を０％としたときの百分率で示したものである。よって、コントロールは図４及び図５に示した３１ｐｇ／ｍＬのｈＩｇＧであり、図６及び図７には図示していない。使用した抗体の組み合わせについては、図の下に示し、それらの添加濃度は図の右側にそれぞれ示した。
【００８３】
これらの組み合わせの中で、特に、上記Ｍｉｘ−２：ＥＶ１００３＋ＥＶ１００７、Ｍｉｘ−３：ＥＶ１００３＋ＥＶ１０１８及びＭｉｘ−４：ＥＶ１００３＋ＥＶ１０１９の抗体の組み合わせでは、各抗体単独の場合に比べ中和活性が顕著に向上していることが認められた。例えば、図６のＭｉｘ−４：ＥＶ１００３＋ＥＶ１０１９では、それぞれ８ｎｇ／ｍＬ（約５５ｐＭ）混合で細胞増殖が約１０％にまで抑制されており、図４に示した同濃度の抗体単独での増殖抑制効果がＥＶ１００３では０％、ＥＶ１０１９では約５０％であったことに比較すると、非常に顕著な中和活性が認められた。
また、ＥＶ１００７は、単独では中和活性が非常に弱いにもかかわらず、Ｍｉｘ−２：ＥＶ１００３＋ＥＶ１００７の組み合わせでは、図６及び図７のいずれの場合においても、これらの抗体がそれぞれ８ｎｇ／ｍＬ（約５５ｐＭ）以上で、細胞増殖がコントロール（ｈＩｇＧ）の約１０％もしくはそれ以下まで抑制されていた。
【００８４】
特に図７に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＦＳ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いてＴＦ−１細胞増殖を誘導した場合、Ｍｉｘ−２、Ｍｉｘ−３及びＭｉｘ−４の混合抗体においては、各抗体濃度が３１ｎｇ／ｍＬ混合以上で、ＴＦ−１細胞の増殖がほとんど完全に抑制されており、これらの混合抗体は非常に強力な中和活性を有していたことが示された。
一方、Ｍｉｘ−５：ＥＶ１０１８＋ＥＶ１０１９においても、Ｍｉｘ−２〜４ほどの明らかな相乗効果とはいえないが、図４及び図５において各抗体をそれぞれ単独で使用した場合と異なり、細胞増殖抑制率が濃度依存的により亢進しているのが認められた。
なお、抗体の混合効果が顕著でないＭｉｘ５：ＥＶ１０１８＋ＥＶ１０１９のケースでは、それら単体使用時の中和活性の用量曲線（中和活性のパターン）が似通っていること、及び、両者のＣＤＲのアミノ酸配列に相同性が見られることなどの特徴がみられた。従って、顕著な混合効果を得るための抗体の選別には、中和活性パターン、ＣＤＲの相同性、及び抗体が結合する抗原の部位などが指標になる可能が考えられる。
【００８５】
図４及び図５が示すように、４種類の抗体（ＥＶ１００３、ＥＶ１００７、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９）のうち単独で最も強い中和活性が認められるのは２μｇ／ｍＬの濃度のＥＶ１００３であるが、そのような高濃度でもその細胞増殖はコントロールの約２０％は残存している。しかし、Ｍｉｘ−２、Ｍｉｘ−３及びＭｉｘ−４の混合抗体においては、それぞれ３１〜１２５ｎｇ／ｍＬ以上の混合で、ＴＦ−１細胞の増殖がほぼ完全に抑えられている。このことから考えても、これらの３種の混合抗体（Ｍｉｘ−２、Ｍｉｘ−３及びＭｉｘ−４）は、非常に顕著な中和活性があるといえる。
なお、ＧＭ−ＣＳＦ抗体であるＥＶ１００３と、ＧＭ−ＣＳＦとは異なる抗原（ＣＭＶ）に反応する抗ＣＭＶ抗体であるｈＩｇＧとの混合抗体Ｍｉｘ−１については、Ｍｉｘ２〜５のような抗体の混合による顕著な中和活性の亢進は、認められなかった。
以上より、精製された３種類の抗体のうち２種類のＧＭ−ＣＳＦ抗体（ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９）は、夫々単独及び混合抗体として非常に高い中和活性を有することが判った。また、これら３種類の抗体及びＥＶ１００３のうち、２種類を組み合わせた混合抗体では、単独での各抗体の中和活性を足し合わせた効果以上の、格段に高い中和活性を有する組み合わせがあることが判った。
【００８６】
このようにして得られた抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合部分は、様々な疾病の原因となるｈＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合し、その生物活性を喪失（中和）させ、従来の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体より（ｈＧＭ−ＣＳＦに対して）さらに優れた中和能を発揮することができる。また、ヒトのモノクローナル抗体である為、免疫原性を有さず、免疫反応も見られない。
また、このようなモノクローナル抗体（好ましくはヒトのモノクローナル抗体）又はその抗原結合部分を複数種類同時に使用することにより、単独で使用する場合と比較して格段に高い細胞増殖阻害活性（中和活性）を発揮することが可能である。このことはＧＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体についてだけでなく、更に、各種癌、免疫疾患、および感染症など抗体による治療が有効な分野において、ターゲットとなる同一の抗原に特異的なモノクローナル抗体においても、それらに対する抗体またはその抗原結合部分を複数種類同時に使用することにより、単独で使用する場合と比較して格段に高い治療効果を発揮することが期待できる。
【００８７】
以上の性質より、抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合部分は、例えば、喘息、アトピー、花粉症などのアレルギー疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、関節リウマチ、その他、ｈＧＭ−ＣＳＦによって引き起こされる病的状態の予防ないし治療薬として、少量で有用であると考えられる。
また、ＧＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体のみならず、ＴＮＦ−αやＶＥＧＦのような各種サイトカインに対するモノクローナル抗体、及びＣＤ２０、ＣＤ３３やＥＧＦリセプターのような細胞表面の各種抗原に対するモノクローナル抗体、更には各種ウイルスや細菌に対するモノクローナル抗体などのように、治療に用いられる可能性のあるあらゆるモノクローナル抗体全般について応用可能であり、ある種の抗原に特異性を有するモノクローナル抗体を複数種類含む医薬組成物は、投薬量の大幅削減のみならず更に画期的な治療効果を与える可能性が考えられる。
【００８８】
１１．Ｌ９２９細胞でのＴＮＦ−αの誘導による細胞毒性の中和活性
ヒト組換えＴＮＦ−α（ｒｈＴＮＦ−α）は、１８〜２４時間のインキュベーション期間後にマウスＬ９２９細胞に細胞毒性を生起する。それぞれ異なるエピトープに結合する２つの抗ヒトＴＮＦ−α抗体、ＮＦ２（マウス抗ｈＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社））およびＮＦ７（マウス抗ｈＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社））について、それぞれ単独とコントロール抗体とを混合して用いた場合と、２つの抗体（ＮＦ２およびＮＦ７）を混合して用いた場合とについて、Ｌ９２９細胞でのＴＮＦ−α誘導細胞毒性の中和能を評価した。コントロール抗体としては、ＨＣＭＶに対するマウスモノクローナル抗体（ｍＩｇＧ）を使用した。
【００８９】
（手順）
（１）２×１０5 細胞/mlのＬ９２９細胞懸濁液（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地）を調製し、１００μｌ/ウェルで９６−ウェルプレートに播種した。
（２）５％ＣＯ2中、３７℃で一晩培養した後、１００μｌの２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地に交換した。
（３）別の９６ウェルプレートに２倍希釈系列で抗体溶液（２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地）を調整した。そこに２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で調整したｈｒＴＮＦ−α溶液を加え、３７℃で２時間、プレーインキュベーションした。
（４）上記の抗体−ＴＮＦ−α混合液５０μｌをＬ９２９細胞に添加した。さらに、アクチノマイシンＤ溶液を５０μ／ウェルで添加した。ＴＮＦ−αおよびアクチノマイシンＤの最終濃度はそれぞれ１ｎｇ／ｍｌ、および、１μｇ／ｍｌとした。
（５）５％ＣＯ２中、３７℃で２０時間培養後、培地１００μｌを除き、１０μｌのＷＳＴ−１溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ、同人）を各ウェルに添加した。
（６）３７℃で４時間呈色反応した後、４５０−５９５ｎｍを測定した。各試料について曲線をプロットし、ＴＮＦ−αを添加しない場合を１００％増殖とし、標準的方法により、ＩＣ50を決定した。
【００９０】
（結果）
図８および下記の表４に示すように、ＮＦ２またはＮＦ７をコントロール抗体と混合して使用した場合に比べて、ＮＦ２およびＮＦ７を併用した場合は、ＩＣ50値において顕著な低下（改善）が観察された。なお、コントロール抗体の添加は、ＮＦ２抗体またはＨＦ７抗体の中和活性には全く影響しないことは確認できている（図９)。
この結果は、同一抗原の異なるエピトープに対する複数の抗体を使用することにより、それらの抗体を単独で使用する場合と比べて、その中和活性を顕著に高められること、それゆえ単独使用の場合に比べて低用量でも高い効果が得られることを示す。
【００９１】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の抗体または抗体の混合物は、生物活性が高く、安全性、医療費などの面から医薬品として顕著な有用性を有する。本発明によれば、従来よりも低用量での抗体医薬を使用した疾患の治療が可能となる。
【００９３】
本発明に係る抗ＴＮＦ−α抗体を含有する医薬は、ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、関節リウマチ、クローン病、糖尿病、敗血症、骨粗しょう症などの疾患の予防ないし治療薬として非常に少量で有効であると考えられ、安全性の面および医療費の面でこれまでの治療薬に比べよりいっそうの有用性がある。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体を産生する抗体産生細胞クローン分離の手順をフローチャートで表した図である。
【図２】抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のアフィニティー解析手順を表した概略図である。
【図３】ＧＭ−ＣＳＦ存在下で樹状細胞の細胞増殖に与える各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の影響を評価したものである。
【図４】Ｙｅａｓｔ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）存在下でＴＦ−１細胞の細胞増殖に対する各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の影響を評価したものである。
【図５】Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）存在下でＴＦ−１細胞の細胞増殖に対する各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の影響を評価したものである。
【図６】Ｙｅａｓｔ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）存在下でＴＦ−１細胞の細胞増殖に対する各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の混合抗体の影響を評価したものである。
【図７】Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）存在下でＴＦ−１細胞の細胞増殖に対する各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の混合抗体の影響を評価したものである。
【図８】ＴＮＦ−αにより誘導されるＬ９２９細胞への細胞毒性に対し、抗ＴＮＦ-α抗体とコントロール抗体を混合した場合、および２つの抗ＴＮＦ-α抗体同士を併用した場合の中和活性を評価したものである。
【図９】ＴＮＦ−αにより誘導されるＬ９２９細胞への細胞毒性に対し、ＴＮＦ-α抗体およびそれらにコントロール抗体を混合した場合の中和活性を評価したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同一の抗原（例えば、タンパク質またはペプチド）中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の抗体の混合物またはそのような複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の抗原結合部位を有する抗体に関する。
特に、本発明は、同一のヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の抗体の混合物またはそのような複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の抗原結合部位を有する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医薬品として承認されている抗体医薬の大部分は、その投与量が１日当たり数ｍｇ〜数１００ｍｇと非常に多くかつ高価である。抗体医薬品以外のバイオ医薬品の多くが、１日当たり数十μｇ〜１ｍｇの投薬量であるのと比較すると、抗体医薬品の一日に必要な投与量はその約１０倍から１０００倍と大幅な開きがある。したがって、現在の抗体医療においては、単位重量当たりの生物活性をいかに高めるかが大きな課題である。
【０００３】
また、抗体医薬品の製造に関しても、品目が増え必要生産量が大幅に増加しており、生産設備は世界的に不足状態にある。これらの状況からも、より少ない用量で効果を発揮するより中和能に優れた抗体、および／またはより高い生物活性を有するモノクローナル抗体が望まれている。
【０００４】
これまで、ポテリジェント抗体技術（非特許文献１）など多くの研究者がその課題に取り組んできた。Ｇｌａｓｓｙらは、生体内ではモノクローナルな抗体で炎症や免疫反応がコントロールされているのではなく、ポリクローナルな抗体でコントロールされていることに着目し、将来のガン療法として、抗体によるカクテル療法を提案している（非特許文献２）。しかし、Ｇｌａｓｓｙらの提案している抗体カクテル療法は、細胞膜上にあるような非遊離の抗原を標的としたものであり、かつ、当該抗体の抗原に対する直接的な阻害作用ではなくエフェクター細胞などを介した２次的な活性増強を意図している。
【０００５】
Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍらは、ヒトのメラノーマ細胞において、膜抗原（ｐ９７）上の異なったエピトープに対する２種類の抗体を介した細胞障害活性の相乗効果を報告している（非特許文献３）。このような相乗効果は、げっ歯類でも報告されており（非特許文献４および５）、これらはいずれも同一の細胞膜抗原に複数種の抗体が結合することによる補体活性の顕著な亢進であると考えられている。即ち、これらは、複数種の抗体による標的機能の直接的な阻害の増強ではない。
【０００６】
一方、破傷風毒素（ＭＷ＝約１５万）に対するエピトープの異なる抗体を用いて、当該毒素によるマウスでの致死例の減少を評価した報告がある（非特許文献６）。破傷風毒素は、毒性発現にいたる複数のステップがあり（非特許文献７）、それぞれのステップで異なった機能ドメインが役割を果たしている。上記の評価した抗体は、それら異なった機能ドメインの抗体であったことを考えると、in vivoでの相乗効果は、それら異なった機能をそれぞれ阻害したことに由来すると考えられる。
【０００７】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α：Tumor Necrosis Factor α）は、多くの腫瘍細胞に対して極めて強い抗腫瘍作用を発揮するサイトカインであり（非特許文献８）、悪液質誘発因子として同定されたカケクチンと同一物質である。現在では、抗腫瘍作用以外にも、視床下部、多核白血球、血管内皮細胞、骨や脂肪組織などのあらゆる組織や細胞において多彩な作用を示すことが知られている。その他、抗ウイルス作用、抗寄生虫作用等も報告されている。また、関節リウマチやクローン病などの免疫・炎症性疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００８】
ＴＮＦ−αは、１５７個のアミノ酸からなり、主として活性化マクロファージにより産生され、細胞膜表面のＴＮＦレセプターに結合して、炎症を起こした細胞の細胞死（アポトーシス）を誘発、炎症を収束させると考えられている。
【０００９】
現在すでに治療薬として抗ＴＮＦ−α抗体がクローン病や関節リウマチの患者に使用されている。日本国内でも、２００２年にはキメラ抗体であるレミケード(一般名：インフリキシマブ)が臨床で使用されるようになり（非特許文献９）、また２００８年６月には、ＴＮＦ−αの完全ヒト抗体（ヒュミラ：一般名；アドリムマブ）が医薬品として販売されている（非特許文献１０）。
【００１０】
ＴＮＦ−αの特性としては一般的に下記のようなものが知られている。
（１）ＴＮＦ−αの作用
（ａ）血管内皮細胞の障害
ＴＮＦ−αにより、好中球が活性化されると、産生されるエラスターゼが血管内皮細胞を障害し、血管内皮の透過性が亢進する。血漿が血管外に漏出し、血液が濃縮し微小循環障害が起こる。即ち、微小循環障害は、組織の虚血の原因となり臓器の機能不全につながる。
（ｂ）微小血栓の形成
ＴＮＦ−αにより、血管内皮細胞が活性化されると抗凝固因子の発現が低下し、線溶系因子の活性が低下する。そのため、微小血栓が形成される。
（ｃ）ミトコンドリアの障害
ＴＮＦ−αは、血管内皮細胞のミトコンドリアを障害する。神経細胞のミトコンドリアが障害を受けると、興奮性アミノ酸が増加し、二次的神経細胞障害が起こる。また、細胞膜の透過性（permeability）保持機能が消失し、Ca2+が細胞内に流入して、急性の神経細胞壊死が起こる。
（ｄ）アポトーシスの誘導
ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を介して、ミトコンドリアの透過性（permeability）転換を促進する。ミトコンドリア内膜の透過性亢進により、ミトコンドリアの膜間スペースからチトクロームＣが放出され、カスパーゼカスケードを刺激しアポトーシスを誘導する。
（２）疾患との関係
（ａ）関節リウマチ
ＴＮＦ−αはＩＬ−６と並んで、関節リウマチにおける関節破壊などの病態形成に中心的な役割を果たしている。マウスでのコラーゲン関節炎モデルは、ヒト関節炎と類似しているといわれているが、そのモデルにおいてＴＮＦ−αを投与すると疾患の増悪が認められている。臨床においてもインフリキシマブやアダリムマブなどＴＮＦ−αを標的としたモノクローナル抗体が用いられ効果が認められている（非特許文献１１）。
（ｂ）クローン病
クローン病患者においては、血清、糞便においてＴＮＦ−αの増加および粘膜固有層において産生亢進あるいは産生細胞の増加が見られ、ＴＮＦ−αに対する阻害剤がクローン病に有効であろうと考えられ、インフリキシマブが開発されている（非特許文献１２）。
（ｃ）糖尿病・高脂血症
ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）を介した肥満に関与していることが報告されている（非特許文献１３）。肥満者は、非肥満者より血中へのＴＮＦ−αの分泌量が増加しており、インシュリン抵抗性を引き起こす可能性があること。ＴＮＦ−αは、インシュリン依存性の細胞内へのグルコース取り込みを抑制し、糖尿病の発症に関連すること。また、ＴＮＦ−αは、リポ蛋白リパーゼの活性を抑制し、高脂血症をきたすことなどが知られている。
（ｄ）敗血症
敗血症とは細菌感染などにより全身的な炎症が引き起こされた状態で、細菌がもつエンドトキシンが、マクロファージを活性化しＴＮＦ−αやＩＬ−１などのサイトカイン産生を亢進させる（非特許文献１４）。その際、ＴＮＦ−αは、感染の拡大を防ぐ働きを有するが、一方、全身的なＴＮＦ−αへの暴露は、末梢血管拡張による急激な血圧低下や播種性血管内凝固症候群（DIC）を引き起こす。
（ｅ）骨粗鬆症
骨では常に破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成が行われており、正常な状態ではこれらのバランスが保たれていることから見かけ上では骨の大きさは変化していない。しかし骨代謝に異常が生じ、この平衡が骨吸収側に傾くと骨量が減少し、骨粗鬆症に陥る。そのような中、ＴＮＦ−αは骨吸収を促進するサイトカインの一つとして知られている（非特許文献１５）
【００１１】
したがって、過剰発現したＴＮＦ−αに結合し、その生物学的活性を喪失させることが、ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる様々な病気に対する治療戦略上、有用であると考えられる。
【００１２】
現在、臨床で使用されている抗ＴＮＦ−α抗体については、関節リウマチの疾患に対する１回の投与量で見た場合、インフリキシマブで１５０ｍｇ／５０ｋｇ、アドリムマブで４０−８０ｍｇ／ヒトであり（非特許文献９および１０）、まだまだそれらの臨床用量は非常に高く、安全性、医療費などの面からも大きな課題といえる。
【００１３】
ＴＮＦ−αは様々な炎症性・免疫疾患の病態形成に重要な役割を果たしており、それらの疾患の治療は長期にわたる可能性が高い。これらのことを考慮すると、現状の抗ＴＮＦ−α抗体医薬品の用量レベルでは、治療期間中の暴露量も莫大なものとなり、やはり安全性、医療費などの面で大きな課題が存在する。
【００１４】
【非特許文献１】設楽研也、他.,ポテリジェント抗体技術とその応用、細胞工学 26巻：278-281, 2007
【非特許文献２】Glassy,M.C., et al.,Requirements for human antibody cocktails for oncology. Expert Opin. Biol. Ther., 5: 1333-137, 2005
【非特許文献３】Hellstrom, I., et al., Monoclonal antibodies to two determinats of melanoma-antigen p97 act synergistically in complement-dependent cytotoxicity. J. Immunology 127: 157-160, 1981
【非特許文献４】Elliott, E.V., et al., Synergistic cytotoxic effects of antibodies directed against different cell surface determinats. Immunology 34: 405-409, 1978
【非特許文献５】Howard, J.C., et al., Monoclonal anti-rat MHC (H-1) alloantibodies. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81: 54-60, 1978
【非特許文献６】Ziegler-Heitbrock, H.W., et al., Protection of mice against tetanus toxin by combination of two human monoclonal antibodies recognizing distinct epitopes on the toxin molecule. Hybridoma, 5: 21-31, 1986
【非特許文献７】Montecucco, C., et al., Tetanus and botulism neurotoxins: a new group of zinc proteases. TIBS, 18: 324-327, 1993
【非特許文献８】Fiers, W., Tumor necrosis factor characterization at the molecular, and cellular and in vivo level. FEBS Lett., 285:199-212, 1991.
【非特許文献９】田辺三菱製薬株式会社、抗ヒトTNFαモノクローナル抗体製剤 レミケード点滴静注用１００、インフリキシマブ（遺伝子組換え）製剤添付文書、2007年11月改訂
【非特許文献１０】アボットジャパン株式会社、ヒト型抗ヒトTNFαモノクローナル抗体製剤 ヒュミラ皮下注４０ｍｇシリンジ０．８mＬ、皮下注射用アダリムマブ（遺伝子組換え）製剤添付文書、2008年6月改訂
【非特許文献１１】Chang,J., et al., Novel therapies for rheumatoid arthritis. Pathophysiology, 12:217-225, 2005
【非特許文献１２】杉田尚久、インフリキシマブ（レミケード）−抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体製剤−の免疫・炎症性疾患に対する薬効薬理、日薬理誌（Folia Pharmacol.Jpn）,121: 57-64, 2003
【非特許文献１３】Uysal, K., T., et al., Functional analysis of tumor necrosis factor(TNF) receptors in TNF-α−mediated insulin resistance in genetic obesity. Endocrinology, 139: 4832-4838,1998
【非特許文献１４】Waage,A., et al., Association between tumour necrosis factor in serum and fetal outcome in patients with meningococcal disease. Lancet, 1:355-357, 1987
【非特許文献１５】Kobayashi, K., et al., Tumor necrosis factor αstimulate osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK Interaction., J.Exp.Med.,191: 275-285, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記のような状況下で、低用量でも高い中和活性を有する抗体医薬が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、同一抗原（例えば、ＴＮＦ−α）中の複数の異なる抗原決定基（エピトープ）をそれぞれ特異的に認識する複数のモノクローナル抗体の組合せを使って、個々のモノクローナル抗体を単独で用いる場合より、顕著に高い中和能を示すことができることを見出した。
【００１７】
即ち、本発明は、以下の組成物、抗体、医薬、これらの使用、および治療方法を提供する。
【００１８】
（１）同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含む組成物。
（１ａ）同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体の混合物。
（２）上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である、上記（１）に記載の組成物。
（２ａ）上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である（但し、ＧＭ−ＣＳＦを除く）、上記（１）に記載の組成物。
（３）上記抗原がサイトカインである、上記（２）に記載の組成物。
（４）上記サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である、上記（３）に記載の組成物。
（５）上記抗体がモノクローナル抗体である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）上記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、上記（５）に記載の組成物。
【００１９】
（７）同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体。
（８）上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である、上記（７）に記載の抗体。
（８ａ）上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である（但し、ＧＭ−ＣＳＦを除く）、上記（７）に記載の抗体。
（９）上記抗原がサイトカインである、上記（８）に記載の抗体。
（１０）上記サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である、上記（９）に記載の抗体。
（１１）上記複数の異なる抗原結合部位をそれぞれ含む部分が、リンカーにより互いに結合されている、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗体。
（１２）上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の抗体を含む組成物。
【００２０】
（１３）上記（１）〜（６）、上記（１２）のいずれかに記載の組成物からなる医薬。
（１４）ＴＮＦ−αが関与する疾患を治療するための上記（１３）に記載の医薬。
（１５）上記疾患が、関節リウマチ、クローン病、糖尿病・高脂血症、敗血症、または骨粗鬆症である、上記（１４）に記載の医薬。
【００２１】
（１６）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物、上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の抗体、または、上記（１２）に記載の組成物の、医薬としての使用。
（１７）上記（４）に記載の組成物、上記（１０）に記載の抗体、または上記（１４）に記載の医薬の、ＴＮＦ−αが関与する疾患に罹患しているか、または罹患している疑いのある患者の治療薬としての使用。
（１８）上記疾患が、関節リウマチ、クローン病、糖尿病・高脂血症、敗血症、または骨粗鬆症である、上記（１７）に記載の使用。
【００２２】
（１９）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物、上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の抗体、または、上記（１２）に記載の組成物を、患者に投与する工程を含む、疾患の治療方法。
（２０）上記（４）に記載の組成物、上記（１０）に記載の抗体、または上記（１４）に記載の医薬を、ＴＮＦ−αが関与する疾患に罹患しているか、または罹患している疑いのある患者に投与する工程を含む、ＴＮＦ−αが関与する疾患の治療方法。
（２１）上記疾患が、関節リウマチ、クローン病、糖尿病・高脂血症、敗血症、または骨粗鬆症である、上記（２０）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の抗体または抗体の混合物は、生物活性が高く、安全性、医療費などの面から医薬品として顕著な有用性を有する。本発明によれば、従来よりも低用量での抗体医薬を使用した疾患の治療が可能となる。
【００２４】
本発明に係る抗ＴＮＦ−α抗体を含有する医薬は、ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、関節リウマチ、クローン病、糖尿病、敗血症、骨粗しょう症などの疾患の予防ないし治療薬として非常に少量で有効であると考えられ、安全性の面および医療費の面でこれまでの治療薬に比べよりいっそうの有用性がある。
【００２５】
本発明に係る、同一抗原中の異なる複数のエピトープを認識する複数の可変領域（または抗原結合部位）を同一分子内に有する抗体、即ち、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体も、従来の当該抗原に対するモノクローナル抗体をそれぞれ単独で使用する場合と比較して、顕著に高い中和活性を示しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
１．本発明の抗体の混合物または組成物
本発明は、１つの実施形態において、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含む組成物またはそのような抗体の混合物を提供する。
【００２７】
本発明に関して、「抗原」は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である。とりわけ、本発明に関して好ましい抗原は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。「ペプチド」としては、典型的には、アミノ酸数が、数個（例えば、３個、４個、５個）〜数十個（例えば、１０個、２０個、３０個、４０個）のアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、または「ペプチド」には、糖タンパク質、リポタンパク質、プロテオグリカンなどの複合タンパク質も含まれ、それらの例としては、例えば、サイトカイン（ケモカインも含む）、細胞表面抗原、レセプター、トキシン等が挙げられる。本発明において使用される抗原としては、ＴＮＦ−α、特にヒトＴＮＦ−αが好ましい。
【００２８】
一般に、抗体は、４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖であってジスルフィド結合によって相互接続されている。各Ｈ鎖は、Ｈ鎖可変部領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶH」と称す場合がある）とＨ鎖不変部領域（Ｈ鎖不変部領域は３つのドメインからなり、それぞれ「ＣH１」、「ＣH２」、「ＣH３」と称す場合がある）からなる。各Ｌ鎖は、Ｌ鎖可変部領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶL」と称す場合がある）とＬ鎖不変部領域（Ｌ鎖不変部領域は１つのドメインからなり、「ＣL」と称す場合がある）からなる。
【００２９】
特にＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。抗体はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲのアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用するので、可変部領域内のアミノ酸配列は可変部領域の外にある配列よりも個々の抗体間の違いが大きい。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、より一定に保たれたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、それぞれ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列している。
【００３０】
本明細書中、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を有する１つ又は複数の抗体のフラグメントを指す。そのフラグメントには、抗原に特異的に結合する最小限のアミノ酸配列を有するペプチド（本明細書中、「抗原結合部位」ともいう。）が含まれる。したがって、「抗原結合部分」を「抗原結合部位を含む部分」ということもある。また。抗体の可変部領域および／または相補性決定領域を有する一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）も抗原結合部分に含まれるものとする。
【００３１】
本発明に関し、単に「抗体」という場合、２本の重鎖（Ｈ鎖）および２本の軽鎖（Ｌ鎖）からなるもののみならず、上記のような「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）も含むものとする。
【００３２】
すなわち、本発明の抗体は、完全長の抗体若しくはその抗原結合部分、又は完全長でない部分的な抗体であってもよく、可変部領域や、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列をもとにすれば、当該技術分野における周知の技術によって、抗原に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る組換えヒトモノクローナル抗体、モノクローナル抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体も含む）又はその抗原結合部分を複数種類組み合わせてもよい。
【００３３】
本明細書中、「同一抗原」または「同一の抗原」という用語は、複数の抗体（すなわち、正味で複数の抗原結合部位を有する）または複数の抗原結合部位を有する１つの抗体について、それら複数の抗原結合部位が結合する相手として、一つの抗原を対象とするという意味で用いられる。本発明においては、特に、その１つの抗原の中に複数の異なるエピトープが存在し、複数の抗体（すなわち、正味で複数の抗原結合部位を有する）または複数の抗原結合部位を有する１つの抗体のそれぞれの抗原結合部位がそれらの複数の異なるエピトープに結合することを意味する。
【００３４】
ここで、「エピトープ」または「抗原決定基（antigenic determinant）」とは、抗体が認識して結合する抗原の特定の構造単位のことをいう。エピトープは、通常、例えば、６〜１０個のアミノ酸や５〜８個の単糖の配列等からなる。エピトープは抗原性のための最小単位であり、通常、１つの抗原には複数のエピトープが含まれている。抗体は病原微生物や高分子物質などと結合する際、その全体を認識するわけではなく、エピトープを認識して結合する。
【００３５】
本発明に関して「同一の抗原」という場合、例えば、異なるヒト（例えば、異なる患者）由来の同一サイトカイン（例えば、ヒトＴＮＦ−α）は、同一抗原と考える。リコンビナントの技術で得られたｒＴＮＦ−αも糖鎖の違いはあるが同一と考える。当然ながら、ヒトＴＮＦ−αとヒトＩＮＦ−γとは同一の抗原とは言えない。
【００３６】
本明細書中、抗体が抗原に「特異的に結合する」とは、抗体が所定の抗原を認識してそれに結合すること言う。典型的には、抗体は少なくとも約１×１０-7（Ｍ）の親和性で結合し、所定の抗原に対しては、前記所定の抗原又は関係の近い抗原以外の非特異的な抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）に対するその結合親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で結合する。
【００３７】
本発明の抗体の特異的に結合する抗原との解離定数（Ｋｄ値）は、好ましくは１×１０-7Ｍ以下、より好ましくは１×１０-8Ｍ以下、１×１０-9Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０-10（Ｍ）以下である。抗体と抗原との解離定数を測定するには、公知の方法を用いることができる。例えば、チップ上に固定化した抗原を用いてＢＩＡＣＯＲＥ３０００（登録商標）のような蛋白質相互作用解析装置により測定することができる。
【００３８】
「抗原の活性を中和し得る抗体」とは、抗原に結合することによってその抗原の生物学的活性を阻害する抗体を指すものとする。本明細書で使用される、「阻害効果」、「阻害」、「阻害し得る」、「抑制」等々の用語は、源が何であれ、ターゲットとなる抗原に起因する生物活性を約５〜１００％低減させる抗体の活性を称する。好ましくは、治療投与のためには、例えばＴＮＦ−αの観察される生物活性の低減は、約５０〜１００％の範囲にある。
【００３９】
ＴＮＦ−αの生物活性の低減は、例えば、ＴＮＦ-αに感受性な培養細胞を用いて評価することが出来る。具体的には、マウスのＬ９２９細胞を用いＴＮＦ−αによる細胞毒性の程度を評価することによりＴＮＦ−αの生物活性の低減を測定できる（Seckinger, P., et al., J. Exp. Med., 167, 1511-1516, 1988）。
【００４０】
なお、抗体作製の手法としては、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ等の実験動物を利用して常法によりポリクローナル抗体や、モノクローナル抗体を取得することができる。あるいは、このようにして得られる抗体は用いた動物種に特徴的な配列を有しているので、そのままヒトに投与するとヒト免疫系により異物として認識され、ヒト抗動物抗体応答が起こる（即ち、抗体の抗体を作ってしまう）ことがあることを考慮して、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体を使用することもできる。完全ヒト抗体は、抗体医薬として人体に投与したとしても、免疫原性を有さず、免疫反応は見られないものと考えられる。
あるいは、既に周知の供給業者から市販されている抗体を使用することができる。
【００４１】
２．本発明に係る二重特異性抗体または多重特異性抗体
本発明は、別の１つの実施形態において、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体（本明細書中、「二重特異性抗体」または「多重特異性抗体」と呼ぶことがある。）を提供する。
【００４２】
以下、本発明に係る、抗原の２種以上の異なるエピトープを認識する機能を有する二重特異性抗体、または多重特異性抗体について説明する。
【００４３】
一般に、「二重特異性抗体」とは、１つの抗体分子が、２つの異なるエピトープを認識する可変領域を有するものを指すが、本発明について「二重特異性抗体」という場合は、特に、同一抗原中の２つの異なるエピトープを認識する可変領域を同一抗体分子内に保有している抗体のことを指す。同様に、本発明について「多重特異性抗体」という場合は、同一抗原を認識しながら、同一抗体分子内に３個以上の異なるエピトープを認識・結合する機能（または可変領域）を有する抗体を指すものとする。
【００４４】
一般に、二重特異性抗体（または多重特異性抗体）にも、IgG型、knobs-into-holes変異、diabody型、一本鎖diabody(scDb)型、diabody-Fc型など種々の形態が報告されている。また、これらの作成法に関しても多くの方法が紹介されている（Marvin, J.S. et al., Acta. Pharmacol. Sin, 26：649-58, 2005； Nitta, T. et al., Lancet, 335：369-371, 1990； Chengbin, W. et al., Nature Biotechnology, 25, 1290-97, 2007）。本発明の二重特異性抗体または多重特異性抗体も、これらの方法を使用して作製することができる。
【００４５】
より具体的には、例えば、異なる２つの抗体を産生するハイブリドーマを細胞融合させ、二重特性抗体産生ハイブリドーマを得る方法（ＵＳＰ４，４７４，８９３）、遺伝子工学的または化学的に２種類の抗体または抗原結合部分をペプチド性リンカーで結合する方法、およびポリアルキレン、ホリアルケニレン、ポリオキシアルキレンまたは多糖類から選択される合成または天然に存在するポリマー用いて分子間架橋をする方法（特表２００２−５１７５１５）などがある。特に最近は、H鎖の可変領域（VH）とL鎖の可変領域（VL）をペプチドリンカーで結合させた一本鎖抗体（ｓｃFv）が考案され、この技術を更に応用したdiabody型二重特異性抗体（特開２００４−２４２６３８）、さらにFc部分を結合させた、diabody-Fc型などの技術が存在するが（熊谷泉他, 抗体ドメインの積み木細工による高機能化と医薬への展開. 抗体医薬の最前線(シーエムシー出版)： 3-13, 2007）、これらの方法を用いることによって、二重特異性（または多重特異性）を有する抗体を作製することができる。
【００４６】
本発明の二重特異性抗体または多重特異性抗体が結合する抗原としては、既に本発明の抗体の組成物または混合物について説明したものと同様である。また、「特異的に結合」、「抗原の活性を中和」、「阻害効果」、「阻害」、「阻害し得る」、「抑制」等々の用語の使用法についても既に本発明の抗体の組成物または混合物について説明したものと同様である。
【００４７】
３．本発明に係る抗体を含有する医薬組成物
本発明は、さらに別の実施形態において、同一抗原の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含有する医薬を提供する。本発明はまた、同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体を含有する医薬を提供する。これらの医薬（または医薬組成物）は、医薬として許容される（または薬学的に許容可能な）担体を含んでいても良い。
【００４８】
好ましくは、本発明の医薬は、ＴＮＦ−αが関与する疾患を治療するためのものである。
【００４９】
本明細書で使用される「ＴＮＦ−αが関与する疾患」という用語は、その疾患にかかっている被験対象が過剰なＴＮＦ−αを発現していることが、その疾患の病態病理の原因であり、又はその疾患を悪化させる一因である、ということが示され、又はそうであると考えられる疾病を意味するものとする。このようなＴＮＦ−αの過剰な産生により引き起こされる疾病としては、（ａ）関節リウマチ、（ｂ）クローン病、（ｃ）骨粗鬆症、（ｄ）敗血症などを例示することができる。
【００５０】
本明細書で使用される「医薬品として許容される（または薬学的に許容可能な）担体」には、生理学的に適合可能な任意の、または全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。
【００５１】
医薬品として許容される担体の例には、水、塩類溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１種または複数、並びにこれらの組合せが含まれる。注射剤などとして使用される場合、ｐＨ調節剤や等張剤、例えば糖や、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬品として許容される担体には、さらに、湿潤剤や乳化剤、防腐剤、緩衝剤、安定化剤など、抗体又は抗体部分の保存性または有効性を増大させる少量の補助物質を含めることができる。
【００５２】
本発明の組成物は、様々な剤型にすることができる。そのような組成物には、例えば、溶液（例えば注射可能であり輸液可能な溶液）や分散液、懸濁液、凍結乾燥製剤、錠剤、カプセル、トローチ、ピル、粉末、リポソーム、坐剤など、液体、半固体、固体の剤型が含まれる。好ましい形は、意図される投与形態および治療の適用例により異なる。一般に好ましい組成物は、他の抗体でヒトを受動免疫化するために使用されるものと同様の組成物など、注射可能または輸液可能な溶液の形にあるものである。好ましい投与形態は、非経口的なもの（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内から）である。好ましい実施形態では、抗体は、静脈輸液、または静脈注射によって投与される。別の好ましい実施形態では、抗体は筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【００５３】
本発明の抗体もしくは抗体部分の組合せ、または二重特異性抗体・多重特異性抗体は、非経口投与に適する医薬品組成物に組み込むことができる。抗体又は抗体部分は、単独種類を使用し製剤化する場合には、０．１〜２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能な製剤として調製することが好ましい。一方、複数種類の抗体を混合して製剤化する場合には、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能な製剤として調製することが好ましい。なお、その複数種類の抗体の混合割合は、適宜設定することができる。
【００５４】
注射可能な製剤は、有効成分を液体に溶解したものまたは有効成分を凍結乾燥させたものを、フリントまたはアンバーバイアル、アンプル、またはプレフィルドシリンジに入れたもので構成することができる。緩衝剤は、ｐＨ４．０〜８．０（最適な場合、ｐＨ６．０〜７．５）のＬ−ヒスチジン（１〜５０ｍＭ）、最適な場合は５〜１０ｍＭのＬ−ヒスチジンにすることができる。その他の適切な緩衝剤には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定されない。濃度０〜３００ｍＭの溶液（液体剤型に関しては、最適な場合、１５０ｍＭ）の浸透圧を変えるために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥させた剤型には、凍結保護物質、主に０〜１０％（最適な場合、０．５〜５．０％）のスクロースを含めることができる。その他の適切な凍結保護物質にはマンニトール、トレハロースおよびラクトースが含まれる。凍結乾燥させた剤型には、増量剤、主に１〜１０％のマンニトール（最適な場合、２〜４％）を含めることができる。液体および凍結乾燥させた剤型の両方には、安定剤、主に１〜５０ｍＭＬ（最適な場合、５〜１０ｍＭ）のＬ−メチオニンを使用することができる。その他の適切な安定剤にはグリシン、アルギニンおよびポリソルベート８０等が含まれ、０〜０．０５％（最適な場合、０．００５〜０．０１％）のポリソルベート８０を含めることができる。他の界面活性剤には、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本医薬組成物は、一般に、製造および貯蔵の条件下で無菌または安定でなければならない。この組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に適するその他のオーダーされた構造として、処方することができる。無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物（すなわち抗体又は抗体部分）を、必要な場合には上述の成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に混ぜ、その後、濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、活性化合物を、基本的な分散媒および上記列挙したものから必要とされるその他の成分を含有する無菌ビークル(vehicle)に混ぜることによって、分散液を調製する。無菌の注射可能な溶液を用時調製するための無菌粉末製剤の場合、好ましい調製方法は、前に述べたその滅菌濾過溶液の凍結真空乾燥および噴霧乾燥であり、それによって、活性成分の粉末に加え、前に述べた任意の他の所望の成分を含んだ組成物が得られる。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、また、分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また、界面活性剤を使用することによって、維持することができる。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、その組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩やゼラチンを含めることによって行うことができる。
【００５６】
医薬組成物には、補助的な活性化合物も組み入れることができる。ある実施形態では、本発明の複数種類の組合せからなる抗体又は抗原結合部分は、例えば、ＴＮＦ−αが原因となる疾患を治療するのに有用な１種または複数の他の治療薬と一緒に処方し、またはそのような他治療薬と同時に投与する。例えば、本発明の抗ＴＮＦ−α抗体又は抗体部分は、他の標的に結合する１つまたは複数の他の抗体（例えば、他のサイトカインに結合する抗体、または細胞表面分子に結合する抗体）と一緒に処方し、またはそのような他の抗体と同時に投与することができる。そのような組合せによる療法は、投与された治療薬のより低い用量を有利に利用することができ、したがって、様々な単一療法に伴う可能性ある毒性または合併症が回避される。
【００５７】
特に、本発明の抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を複数種類同時に投与する場合、もしくは二重特異性抗体などを使用する場合などには、単独種類を使用する場合と比較して格段に高い細胞増殖阻害活性（中和活性）を有するので、治療薬全体としてより低い用量で投与することが可能となる。
【００５８】
本発明に係る抗ＴＮＦ−α抗体又はその抗原結合部分のコンビネーションは、ＴＮＦ−αに対して、従来の抗ＴＮＦ−α抗体より高い中和能をもつので、ＴＮＦ−αが関与する疾患（ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる様々な疾病）の治療薬として有用である。ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる疾患は、ＴＮＦ−α活性の阻害によってその疾患の症状および／または進行が緩和されることが予測される疾患である。
【００５９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００６０】
１．ｈＧＭ−ＣＳＦに対する完全ヒト抗体産生細胞クローンの分離
図１は、抗体産生細胞クローンの分離までのフローチャートである。
血清中の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体が高値であるヒトの血液からＢリンパ球を分離し、その後ＥＢＶに感染させ増殖してきた細胞を抗体産生細胞ライブラリーとした。
【００６１】
抗体産生細胞ライブラリーは９６ｗｅｌｌプレートに播種し、およそ３〜４週間の培養後、培養上清中の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の１ｓｔスクリーニングを行った。スクリーニングはリコンビナントｈＧＭ−ＣＳＦをコートした９６ｗｅｌｌプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ法により行った。得られた抗体陽性細胞集団は新たな９６ｗｅｌｌプレートに播種した。３〜４週間培養した後に抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の２ｎｄスクリーニングを行った。得られた抗体陽性細胞集団は新たな９６ｗｅｌｌプレートに限界希釈で播種した。３〜５週間培養した後に、抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の３ｒｄスクリーニングを行った。得られた抗体陽性細胞集団は限界希釈による培養とスクリーニングを行い、ｗｅｌｌ当たり１個まきのプレートから抗体陽性細胞を得た。
【００６２】
２．抗体アイソタイプおよびサブクラスの確認
分離した３種類の抗体（ＥＶ１００７、ＥＶ１０１８、ＥＶ１０１９）産生細胞クローンについて産生する抗体のアイソタイプおよびサブクラスをそれぞれ確認した（表1）。確認の方法はスクリーニングと同様のＥＬＩＳＡ法を利用し、２次抗体としてそれぞれのアイソタイプおよびサブクラスに特異的な抗体を使用した。サンプルはクローン分離後の細胞培養上清を用いた。
表１に、新たに得られた３種類の抗ｈＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体、及び国際公開第０７／０４９４７２号パンフレットにおいてＪ１５８ ４Ｃとして報告したモノクローナル抗体（以下、ＥＶ１００３と称す）について、抗体名及びサブクラスをそれぞれ示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
３．抗体産生細胞からの抗体遺伝子のクローニング
得られた抗体産生細胞からの抗体遺伝子のクローニングを行った。抗体産生細胞からｔｏｔａｌ−ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ ｐｒｉｍｅｒとＲｅｖｅｒｓｅ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いｃＤＮＡ合成を行った。
合成したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法による抗体遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲに使用するｐｒｉｍｅｒは抗体遺伝子シークエンスのデータベースをもとに、５´末端側は転写開始点を含むように、３´末端側は転写終結点を含むように設計した。
【００６５】
４．抗体遺伝子の塩基配列に基づく抗体のアミノ酸配列の決定
得られた３種類の抗体遺伝子（Ｈ鎖・Ｌ鎖）のｃＤＮＡクローンをプラスミドベクターに挿入し、ＡＢＩシークエンサーにより３種類の抗体遺伝子（Ｈ鎖・Ｌ鎖）の塩基配列を確認した。得られた塩基配列より、３種類の抗体の各H鎖およびL鎖のアミノ酸配列を決定した。
また、これら新規の３種類（ＥＶ１００７、ＥＶ１０１８、ＥＶ１０１９）の抗体及びＥＶ１００３の相補性決定領域（ＣＤＲ）の解析には、Kabatの方法を用いた（文献：www.bioinf.org.uk: Dr.andrew C.R. Martin's Group, Antibodies: General Information参照）。これら４種の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のそれぞれのＣＤＲを配列番号１〜２４に示す。具体的にはＥＶ１０１８のＬ鎖ＣＤＲ１，Ｌ鎖ＣＤＲ２，Ｌ鎖ＣＤＲ３、Ｈ鎖ＣＤＲ１，Ｈ鎖ＣＤＲ２，およびＨ鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１〜６、ＥＶ１０１９のＬ鎖ＣＤＲ１，Ｌ鎖ＣＤＲ２，Ｌ鎖ＣＤＲ３、Ｈ鎖ＣＤＲ１，Ｈ鎖ＣＤＲ２，およびＨ鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号７〜１２、ＥＶ１００７のＬ鎖ＣＤＲ１，Ｌ鎖ＣＤＲ２，Ｌ鎖ＣＤＲ３、Ｈ鎖ＣＤＲ１，Ｈ鎖ＣＤＲ２，およびＨ鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１３〜１８、ＥＶ１００３のＬ鎖ＣＤＲ１，Ｌ鎖ＣＤＲ２，Ｌ鎖ＣＤＲ３、Ｈ鎖ＣＤＲ１，Ｈ鎖ＣＤＲ２，およびＨ鎖ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１９〜２４に示す。
【００６６】
５．得られた抗体遺伝子が抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体をコードしていることの確認
得られた３種類の抗体遺伝子（Ｈ鎖・Ｌ鎖）について、各ｃＤＮＡクローンをそれぞれ発現ベクターに挿入した。各抗体のＨ鎖およびＬ鎖を挿入した発現ベクターを
２９３Ｔ細胞に導入し、一過性での抗体発現の確認を行った。
遺伝子導入（transfection）はリポフェクタミン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とプラス試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による方法を採用した。
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の発現は遺伝子導入から２日後の２９３Ｔ細胞の培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧ抗体の検出および抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の検出を行い確認した。
【００６７】
６．ＣＨＯ抗体安定発現株の獲得
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体発現が確認できた発現ベクターをＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、抗体を安定して発現するＣＨＯ細胞クローンの分離を行った。遺伝子導入は上述の２９３Ｔ細胞の場合と同様の方法を採用した。遺伝子導入から２日後のＣＨＯ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、適切なセレクションマーカーの存在下で培養した。およそ２週間培養後、培養上清中の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のスクリーニングを行った。スクリーニングはＥＬＩＳＡ法により行った。得られた抗体発現ＣＨＯ細胞は９６ｗｅｌｌプレートに ｗｅｌｌ当たり１個まきで播種した。１個まきのｗｅｌｌから増殖したＣＨＯ細胞の抗体発現を確認し、抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体安定発現ＣＨＯ細胞クローンを得た。
【００６８】
７．抗体精製
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の精製は抗体安定発現ＣＨＯ細胞クローンを無血清培地を用いて培養した上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＡを用いたアフィニティー精製で行った。カラムはＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のプレパックカラムを使用し、精製条件はカラムメーカーの推奨条件とした。精製後の抗体については、ＥＬＩＳＡによる抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体の確認と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる約５０ｋＤａの抗体Ｈ鎖と約２５ｋＤａの抗体L鎖の確認を行った。
【００６９】
８．抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のアフィニティー解析
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のアフィニティー解析は、ビアコアシステム（登録商標）を用いて行った（図２）。
方法はＰｒｏｔｅｉｎＧをセンサーチップに固定化し、ＰｒｏｔｅｉｎＧ固定化表面に抗体を添加して捕捉させる。続いて、抗体が捕捉されているセンサーチップ表面に抗原を添加して相互作用を測定するものである。抗体は精製抗体、抗原にはリコンビナントｈＧＭ−ＣＳＦを用いた。
抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のアフィニティー（親和性）の評価としては、ｙｅａｓｔ ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）およびＥ．ｃｏｌｉ ｈＧＭ−ＣＳＦ(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ)に対しての解離定数（ＫＤ（Ｍ））を求めた。結果を（表２）に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
Ｌｅｕｋｉｎｅに対しては、ＥＶ１００７が１．２×１０-9（Ｍ）、ＥＶ１０１８が２．３×１０-10（Ｍ）、ＥＶ１０１９が３．６×１０-10（Ｍ）であった。更に以前取得したＥＶ１００３においては２．３×１０-10（Ｍ）であった。
また、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈに対しては、それぞれＥＶ１００７が９．３×１０-10（Ｍ）、ＥＶ１０１８が１．５×１０-10（Ｍ）、ＥＶ１０１９が１．５×１０-10（Ｍ）であった。更に、ＥＶ１００３に関しては、９．５×１０-11（Ｍ）であり、いずれもｈＧＭ−ＣＳＦに対して非常に高い親和性があることが確認された。
【００７２】
９．抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体による末梢血樹状細胞の増殖抑制効果
７×１０7の単核球よりＢｌｏｏｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ II Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、５×１０5の樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ:以下、ＤＣと略す。）を回収した。このＤＣには、ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ＤＣとｍｙｅｌｏｉｄ ＤＣが含まれている。
得られたＤＣをＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳにリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）（１ｎｇ／ｍＬ)、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ)、および抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（１μｇ／ｍＬ）を添加した培養液に浮遊し、９６ｗｅｌｌ平底プレートに２×１０4／ｗｅｌｌ播いて１０日間培養した。
なお、コントロールとして、ＧＭ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体（ａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦｐＡｂｓ）（１μｇ／ｍＬ）及びＣＭＶに対するヒトのモノクローナル抗体（ｈＩｇＧ）（１μｇ／ｍＬ）を用いた。
培養結果を図３に示す。
【００７３】
図３から、ＥＶ１００３、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９の各抗体を添加したｗｅｌｌでは、ＤＣのＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖が抑制されたことが判る。一方、ＥＶ１００７はＤＣのＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖を抑制しなかった。また、ａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦ ｐＡｂｓではＤＣのＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖が抑制されたが、ｈＩｇＧでは増殖抑制は認められなかった。
以上より、ＥＶ１００３、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９は、いずれも単独でＤＣの増殖を抑制することが確認された。
【００７４】
１０．抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体のＴＦ−１細胞を用いた中和活性評価
図４及び図５は、精製した３種類の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体（ＥＶ１００７、ＥＶ１０１８、ＥＶ１０１９）及び以前取得したＥＶ１００３について、ＧＭ−ＣＳＦ依存的な増殖が認められることが知られているＴＦ−１細胞を用い、これら抗体の中和活性を調べたものである。
ＴＦ−１細胞に精製抗体とリコンビナントｈＧＭ−ＣＳＦをプレインキュベートしたものを添加して培養し、約２日後の生細胞数をカウントした。抗体に中和活性があれば、添加したＧＭ−ＣＳＦを中和し、ＴＦ−１細胞の増殖を抑えることができる。
【００７５】
図４は、各々ｙｅａｓｔ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）によって、及び図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＳＦ(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ)によって刺激されるＴＦ−１細胞の増殖が、各種抗体などの添加によって抑制される程度（中和活性）をそれぞれ評価したものである。
各種ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体は単体で用い、コントロールとして上記９．の増殖抑制効果と同じａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦ ｐＡｂｓ及びｈＩｇＧを用いた。
【００７６】
各被験物質は、２μｇ／ｍＬ〜３１ｐｇ／ｍＬの濃度範囲で4倍ずつ段階的に希釈し、それぞれの濃度について評価した。使用したｈＧＭ−ＣＳＦ濃度は、いずれの場合も０．５ｎｇ／ｍＬで、約４０時間培養後のＴＦ−１細胞の生細胞数の変化を調べた。生細胞のカウントはＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（同仁）を使用し、発色（Ａ４５０/ｒｅｆ. Ａ５９５）の強さで評価した。
図４及び図５において、縦軸は、３１ｐｇ／ｍＬのｈＩｇＧを添加した場合でのＴＦ−１細胞の生細胞数を１００％とし、同じ条件でＧＭ−ＣＳＦを添加しなかった場合のＴＦ−１細胞の生細胞数を０％としたときの百分率で示したものである。使用した抗体及びコントロールサンプルについては図の下に示し、それらの添加濃度は図の右側にそれぞれ示した。
【００７７】
ＴＦ−１細胞の増殖誘導に、ｙｅａｓｔ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）０．５ｎｇ／ｍＬを用い、各種抗体単体の中和活性を評価した結果を（図４）に示す。陰性対照としてのｈＩｇＧでは、２μｇ／ｍＬの高濃度で非特異的な増殖抑制を認めたが、それ以下のいずれの濃度でも細胞増殖抑制は認められなかった。ＧＭ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体（ａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦ ｐＡｂｓ）では、１２５ｎｇ／ｍＬ以上で抗体用量依存的に細胞増殖抑制が認められた。
精製したモノクローナル抗体においては、ＥＶ１００３では、３１ｎｇ／ｍＬでコントロール（ｈＩｇＧ）の約６０％まで抑制して明確な増殖抑制が認められ、さらにその濃度以上では抗体濃度依存的な細胞増殖抑制が認められた。ＥＶ１０１８は０．５ｎｇ／ｍＬ以上で、ＥＶ１０１９は２ｎｇ／ｍＬ以上で、コントロール（ｈＩｇＧ）の約５０％まで抑制して顕著な細胞増殖抑制が認められ、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９はｈＧＭ−ＣＳＦに対して非常に強い中和活性があることが確認された。また、ＥＶ１００７において、ＴＦ−１細胞の増殖抑制が明らかに認められたのは、０．５μｇ／ｍＬ以上のみで、中和活性が非常に低いことが判った。
【００７８】
一方、ＴＦ−１細胞の増殖誘導にＥ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＳＦ(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ) ０．５ｎｇ／ｍＬを用い、各種抗体単体での中和活性を評価した結果を（図５）に示す。この結果においても、陰性対照としてのｈＩｇＧでは、２μｇ／ｍＬの高濃度で非特異的な増殖抑制を認めたが、それ以下のいずれの濃度でも明らかな細胞増殖抑制は認められなかった。ＧＭ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体（ａｎｔｉ ＧＭ−ＣＳＦ ｐＡｂｓ）では、３１ｎｇ／ｍＬ以上で抗体用量依存的に細胞増殖抑制が認められた。
精製したモノクローナル抗体については、ＥＶ１００３では、３１ｎｇ／ｍＬ以上で抗体濃度依存的に明らかな細胞増殖抑制が認められた。ＥＶ１０１８は０．５ｎｇ／ｍＬ以上で、ＥＶ１０１９は２ｎｇ／ｍＬ以上で、コントロール（ｈＩｇＧ）の約５０％以下まで抑制して顕著な細胞増殖抑制が認められ、これらの抗体はｈＧＭ−ＣＳＦに対する中和活性が非常に強いことが確認された。
また、ＥＶ１００７においては、ＴＦ−１細胞の明確な増殖抑制が認められたのは、０．５μｇ／ｍＬ以上のみで、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９の抗体と比較して中和活性が非常に低いことが明らかになった。
【００７９】
図６及び図７は、各種ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体及びｈＩｇＧのうちから２種類を選択して混合した混合抗体について中和活性を評価した結果である。
これら各図の下の部分にも記載したように、各種ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体及びｈＩｇＧの中から用いた混合抗体の組み合わせは、下記表３に示す５種類である。
【００８０】
【表３】
【００８１】
各被験物質は、４μg／ｍＬ〜６２ｐg／ｍＬの濃度範囲で4倍ずつ段階的に希釈し、それぞれ同じ濃度の抗体溶液を２種類混合した混合抗体（終濃度は図６及び７中に示した値）について評価した。生細胞のカウントはＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（同仁）を使用し、発色（Ａ４５０/ｒｅｆ. Ａ５９５）の強さで評価した。
【００８２】
図６及び図７においても、縦軸は、３１ｐｇ／ｍＬのｈＩｇＧを添加した場合でのＴＦ−１細胞の生細胞数を１００％とし、同じ条件でＧＭ−ＣＳＦを添加しなかった場合のＴＦ−１細胞の生細胞数を０％としたときの百分率で示したものである。よって、コントロールは図４及び図５に示した３１ｐｇ／ｍＬのｈＩｇＧであり、図６及び図７には図示していない。使用した抗体の組み合わせについては、図の下に示し、それらの添加濃度は図の右側にそれぞれ示した。
【００８３】
これらの組み合わせの中で、特に、上記Ｍｉｘ−２：ＥＶ１００３＋ＥＶ１００７、Ｍｉｘ−３：ＥＶ１００３＋ＥＶ１０１８及びＭｉｘ−４：ＥＶ１００３＋ＥＶ１０１９の抗体の組み合わせでは、各抗体単独の場合に比べ中和活性が顕著に向上していることが認められた。例えば、図６のＭｉｘ−４：ＥＶ１００３＋ＥＶ１０１９では、それぞれ８ｎｇ／ｍＬ（約５５ｐＭ）混合で細胞増殖が約１０％にまで抑制されており、図４に示した同濃度の抗体単独での増殖抑制効果がＥＶ１００３では０％、ＥＶ１０１９では約５０％であったことに比較すると、非常に顕著な中和活性が認められた。
また、ＥＶ１００７は、単独では中和活性が非常に弱いにもかかわらず、Ｍｉｘ−２：ＥＶ１００３＋ＥＶ１００７の組み合わせでは、図６及び図７のいずれの場合においても、これらの抗体がそれぞれ８ｎｇ／ｍＬ（約５５ｐＭ）以上で、細胞増殖がコントロール（ｈＩｇＧ）の約１０％もしくはそれ以下まで抑制されていた。
【００８４】
特に図７に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＦＳ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いてＴＦ−１細胞増殖を誘導した場合、Ｍｉｘ−２、Ｍｉｘ−３及びＭｉｘ−４の混合抗体においては、各抗体濃度が３１ｎｇ／ｍＬ混合以上で、ＴＦ−１細胞の増殖がほとんど完全に抑制されており、これらの混合抗体は非常に強力な中和活性を有していたことが示された。
一方、Ｍｉｘ−５：ＥＶ１０１８＋ＥＶ１０１９においても、Ｍｉｘ−２〜４ほどの明らかな相乗効果とはいえないが、図４及び図５において各抗体をそれぞれ単独で使用した場合と異なり、細胞増殖抑制率が濃度依存的により亢進しているのが認められた。
なお、抗体の混合効果が顕著でないＭｉｘ５：ＥＶ１０１８＋ＥＶ１０１９のケースでは、それら単体使用時の中和活性の用量曲線（中和活性のパターン）が似通っていること、及び、両者のＣＤＲのアミノ酸配列に相同性が見られることなどの特徴がみられた。従って、顕著な混合効果を得るための抗体の選別には、中和活性パターン、ＣＤＲの相同性、及び抗体が結合する抗原の部位などが指標になる可能が考えられる。
【００８５】
図４及び図５が示すように、４種類の抗体（ＥＶ１００３、ＥＶ１００７、ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９）のうち単独で最も強い中和活性が認められるのは２μｇ／ｍＬの濃度のＥＶ１００３であるが、そのような高濃度でもその細胞増殖はコントロールの約２０％は残存している。しかし、Ｍｉｘ−２、Ｍｉｘ−３及びＭｉｘ−４の混合抗体においては、それぞれ３１〜１２５ｎｇ／ｍＬ以上の混合で、ＴＦ−１細胞の増殖がほぼ完全に抑えられている。このことから考えても、これらの３種の混合抗体（Ｍｉｘ−２、Ｍｉｘ−３及びＭｉｘ−４）は、非常に顕著な中和活性があるといえる。
なお、ＧＭ−ＣＳＦ抗体であるＥＶ１００３と、ＧＭ−ＣＳＦとは異なる抗原（ＣＭＶ）に反応する抗ＣＭＶ抗体であるｈＩｇＧとの混合抗体Ｍｉｘ−１については、Ｍｉｘ２〜５のような抗体の混合による顕著な中和活性の亢進は、認められなかった。
以上より、精製された３種類の抗体のうち２種類のＧＭ−ＣＳＦ抗体（ＥＶ１０１８及びＥＶ１０１９）は、夫々単独及び混合抗体として非常に高い中和活性を有することが判った。また、これら３種類の抗体及びＥＶ１００３のうち、２種類を組み合わせた混合抗体では、単独での各抗体の中和活性を足し合わせた効果以上の、格段に高い中和活性を有する組み合わせがあることが判った。
【００８６】
このようにして得られた抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合部分は、様々な疾病の原因となるｈＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合し、その生物活性を喪失（中和）させ、従来の抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体より（ｈＧＭ−ＣＳＦに対して）さらに優れた中和能を発揮することができる。また、ヒトのモノクローナル抗体である為、免疫原性を有さず、免疫反応も見られない。
また、このようなモノクローナル抗体（好ましくはヒトのモノクローナル抗体）又はその抗原結合部分を複数種類同時に使用することにより、単独で使用する場合と比較して格段に高い細胞増殖阻害活性（中和活性）を発揮することが可能である。このことはＧＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体についてだけでなく、更に、各種癌、免疫疾患、および感染症など抗体による治療が有効な分野において、ターゲットとなる同一の抗原に特異的なモノクローナル抗体においても、それらに対する抗体またはその抗原結合部分を複数種類同時に使用することにより、単独で使用する場合と比較して格段に高い治療効果を発揮することが期待できる。
【００８７】
以上の性質より、抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体又はその抗原結合部分は、例えば、喘息、アトピー、花粉症などのアレルギー疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、関節リウマチ、その他、ｈＧＭ−ＣＳＦによって引き起こされる病的状態の予防ないし治療薬として、少量で有用であると考えられる。
また、ＧＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体のみならず、ＴＮＦ−αやＶＥＧＦのような各種サイトカインに対するモノクローナル抗体、及びＣＤ２０、ＣＤ３３やＥＧＦリセプターのような細胞表面の各種抗原に対するモノクローナル抗体、更には各種ウイルスや細菌に対するモノクローナル抗体などのように、治療に用いられる可能性のあるあらゆるモノクローナル抗体全般について応用可能であり、ある種の抗原に特異性を有するモノクローナル抗体を複数種類含む医薬組成物は、投薬量の大幅削減のみならず更に画期的な治療効果を与える可能性が考えられる。
【００８８】
１１．Ｌ９２９細胞でのＴＮＦ−αの誘導による細胞毒性の中和活性
ヒト組換えＴＮＦ−α（ｒｈＴＮＦ−α）は、１８〜２４時間のインキュベーション期間後にマウスＬ９２９細胞に細胞毒性を生起する。それぞれ異なるエピトープに結合する２つの抗ヒトＴＮＦ−α抗体、ＮＦ２（マウス抗ｈＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社））およびＮＦ７（マウス抗ｈＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社））について、それぞれ単独とコントロール抗体とを混合して用いた場合と、２つの抗体（ＮＦ２およびＮＦ７）を混合して用いた場合とについて、Ｌ９２９細胞でのＴＮＦ−α誘導細胞毒性の中和能を評価した。コントロール抗体としては、ＨＣＭＶに対するマウスモノクローナル抗体（ｍＩｇＧ）を使用した。
【００８９】
（手順）
（１）２×１０5 細胞/mlのＬ９２９細胞懸濁液（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地）を調製し、１００μｌ/ウェルで９６−ウェルプレートに播種した。
（２）５％ＣＯ2中、３７℃で一晩培養した後、１００μｌの２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地に交換した。
（３）別の９６ウェルプレートに２倍希釈系列で抗体溶液（２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地）を調整した。そこに２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で調整したｈｒＴＮＦ−α溶液を加え、３７℃で２時間、プレーインキュベーションした。
（４）上記の抗体−ＴＮＦ−α混合液５０μｌをＬ９２９細胞に添加した。さらに、アクチノマイシンＤ溶液を５０μ／ウェルで添加した。ＴＮＦ−αおよびアクチノマイシンＤの最終濃度はそれぞれ１ｎｇ／ｍｌ、および、１μｇ／ｍｌとした。
（５）５％ＣＯ２中、３７℃で２０時間培養後、培地１００μｌを除き、１０μｌのＷＳＴ−１溶液（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ、同人）を各ウェルに添加した。
（６）３７℃で４時間呈色反応した後、４５０−５９５ｎｍを測定した。各試料について曲線をプロットし、ＴＮＦ−αを添加しない場合を１００％増殖とし、標準的方法により、ＩＣ50を決定した。
【００９０】
（結果）
図８および下記の表４に示すように、ＮＦ２またはＮＦ７をコントロール抗体と混合して使用した場合に比べて、ＮＦ２およびＮＦ７を併用した場合は、ＩＣ50値において顕著な低下（改善）が観察された。なお、コントロール抗体の添加は、ＮＦ２抗体またはＨＦ７抗体の中和活性には全く影響しないことは確認できている（図９)。
この結果は、同一抗原の異なるエピトープに対する複数の抗体を使用することにより、それらの抗体を単独で使用する場合と比べて、その中和活性を顕著に高められること、それゆえ単独使用の場合に比べて低用量でも高い効果が得られることを示す。
【００９１】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の抗体または抗体の混合物は、生物活性が高く、安全性、医療費などの面から医薬品として顕著な有用性を有する。本発明によれば、従来よりも低用量での抗体医薬を使用した疾患の治療が可能となる。
【００９３】
本発明に係る抗ＴＮＦ−α抗体を含有する医薬は、ＴＮＦ−αが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、関節リウマチ、クローン病、糖尿病、敗血症、骨粗しょう症などの疾患の予防ないし治療薬として非常に少量で有効であると考えられ、安全性の面および医療費の面でこれまでの治療薬に比べよりいっそうの有用性がある。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体を産生する抗体産生細胞クローン分離の手順をフローチャートで表した図である。
【図２】抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体のアフィニティー解析手順を表した概略図である。
【図３】ＧＭ−ＣＳＦ存在下で樹状細胞の細胞増殖に与える各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の影響を評価したものである。
【図４】Ｙｅａｓｔ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）存在下でＴＦ−１細胞の細胞増殖に対する各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の影響を評価したものである。
【図５】Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）存在下でＴＦ−１細胞の細胞増殖に対する各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の影響を評価したものである。
【図６】Ｙｅａｓｔ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）存在下でＴＦ−１細胞の細胞増殖に対する各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の混合抗体の影響を評価したものである。
【図７】Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）存在下でＴＦ−１細胞の細胞増殖に対する各種抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の混合抗体の影響を評価したものである。
【図８】ＴＮＦ−αにより誘導されるＬ９２９細胞への細胞毒性に対し、抗ＴＮＦ-α抗体とコントロール抗体を混合した場合、および２つの抗ＴＮＦ-α抗体同士を併用した場合の中和活性を評価したものである。
【図９】ＴＮＦ−αにより誘導されるＬ９２９細胞への細胞毒性に対し、ＴＮＦ-α抗体およびそれらにコントロール抗体を混合した場合の中和活性を評価したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含む組成物。
【請求項２】
前記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原がサイトカインである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体。
【請求項８】
前記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗原がサイトカインである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記複数の異なる抗原結合部位をそれぞれ含む部分が、リンカーにより互いに結合されている、請求項７〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれかに記載の抗体を含む組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６、請求項１２のいずれかに記載の組成物からなる医薬。
【請求項１４】
ＴＮＦ−αが関与する疾患を治療するための請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
前記疾患が、関節リウマチ、クローン病、糖尿病・高脂血症、敗血症、または骨粗鬆症である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１】
同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗体を含む組成物。
【請求項２】
前記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原がサイトカインである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
同一抗原中の複数の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する複数の異なる抗原結合部位を有する抗体。
【請求項８】
前記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、脂質、核酸、または低分子化合物である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗原がサイトカインである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記複数の異なる抗原結合部位をそれぞれ含む部分が、リンカーにより互いに結合されている、請求項７〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれかに記載の抗体を含む組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６、請求項１２のいずれかに記載の組成物からなる医薬。
【請求項１４】
ＴＮＦ−αが関与する疾患を治療するための請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
前記疾患が、関節リウマチ、クローン病、糖尿病・高脂血症、敗血症、または骨粗鬆症である、請求項１４に記載の医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−１１６３３８（Ｐ２０１０−１１６３３８Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８９７０９（Ｐ２００８−２８９７０９）
【出願日】平成２０年１１月１２日（２００８．１１．１２）
【出願人】（５０３１６１７６３）株式会社イーベック (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１２日（２００８．１１．１２）
【出願人】（５０３１６１７６３）株式会社イーベック (6)
【Ｆターム（参考）】
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