哺乳動物細胞の形質転換方法
【課題】本発明は広範な哺乳動物細胞を宿主細胞として利用することができ、遺伝子の導入効率および発現効率が高く、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が高い哺乳動物細胞の形質転換方法を提供する。
【解決手段】本発明の形質転換方法は、ＩＲ／ＭＡＲベクターである第１ベクターと、哺乳動物細胞内において機能するプロモーターおよび分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターとを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へコトランスフェクションを行う。
【解決手段】本発明の形質転換方法は、ＩＲ／ＭＡＲベクターである第１ベクターと、哺乳動物細胞内において機能するプロモーターおよび分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターとを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へコトランスフェクションを行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞を用いて、所望の分泌タンパク質をを高度に生産するための技術に関する。より具体的には、本発明者らが開発した「高度遺伝子増幅系」を用いて所望の目的遺伝子（所望の分泌タンパク質をコードする遺伝子）を増幅および発現させ、所望の分泌タンパク質を生産する際に、遺伝子導入効率および遺伝子増幅効率を向上させることができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、微生物、植物、酵母、昆虫細胞、及び哺乳類細胞が、大量の望ましいタンパク質の発現の宿主として使用されている。多くの種類の発現系の中で、微生物は発現系として最も容易に使用され、多くの種類の微生物系が研究され利用されている。しかしながら、微生物発現系の使用はいくつかの問題点が存在する。まず、遺伝子は微生物において発現され得るが、微生物はタンパク質発現や、例えばグリコシル化、リン酸化及びアミジル化のようなタンパク質修飾機序に関して異なる機序を有するため、発現されたタンパク質の構造および特性は動物タンパク質の構造および特性とは大きく異なる。よって、微生物を用いた組換えタンパク質生産は、元来修飾をほとんどされていないタンパク質、またはタンパク質の修飾や構造がその機能にあまり影響を受けないタンパク質の生産に限定されていた。
【０００３】
そのため、動物のタンパク質生産には哺乳動物細胞が適している。外来性遺伝子が哺乳動物細胞で発現される場合、外来性遺伝子は選抜マーカーを有するベクターとコトランスフェクトされ、形質転換された細胞を選択培地で長時間培養することにより選別する。しかしながら高度に発現する細胞クローンを取得する頻度は低いというのが現状である。外来遺伝子は染色体への挿入されるものの、遺伝子の発現は挿入部位に依存するので、外来遺伝子の発現が予測できない（非特許文献１〜３を参照のこと）。よって、外来性遺伝子は安定して染色体に挿入されたとしても、哺乳動物細胞において多くの外来性遺伝子発現は近隣の核酸により阻止されてしまうために、少量しか発現できない場合がある（非特許文献４および５を参照のこと。）。
【０００４】
上述のごとく、哺乳動物細胞では外来性遺伝子の発現量が少ないとい問題を解決するために、種々の遺伝子発現系が開発された。例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸リダクターゼ）に対する阻害剤であるメトトレキセート（以下「ＭＴＸ」という）を含有する培地でチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下「ＣＨＯ細胞」という）の細胞株を培養し、ＭＴＸの濃度に依存して生存し、遺伝子のコピー数の増加によりタンパク質を高度に発現するＣＨＯ細胞株を得る方法が知られている（例えば非特許文献７および８、特許文献２および３を参考のこと）。この方法は、現在広く利用され重要な技術となっているが、適用できる宿主細胞がＣＨＯ細胞に限られ、汎用性に欠けるという問題点がある。この問題点は、哺乳動物細胞内において医薬品等の有用タンパク質を生産する上での大きな障害となる。
【０００５】
さらに上述した従来技術は、取り扱いが困難なＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等の特殊なＣＨＯ細胞に宿主細胞が限られる上に、選択薬剤であるＭＴＸの毒性作用を考慮しつつ濃度を少しずつ増加させながら細胞を選択していかなければなければならない等の配慮が必要であるため、経験および熟練を必要とする。しかも、発現させたいタンパク質を細胞内に蓄積させた場合には、細胞内に蓄積したタンパク質を取得するために細胞破砕の工程が必要な上、破砕の際にタンパク質が変性する恐れもある。
【０００６】
さらに哺乳動物細胞を用いた組換えタンパク質の発現は、微生物を用いた組換えタンパク質の発現に比して発現効率が低く、さらに培地コストが高いためにタンパク質の生産コストがより高くなるという問題がある。さらに、有用タンパク質を高生産する哺乳動物細胞クローンを選抜するには莫大な時間を必要としていた。このため、哺乳動物細胞を用いた組換えタンパク質の生産においては、少しでもタンパク質の発現効率、および所望のタンパク質を高生産するクローンの選択効率を高めることによって、タンパク質の生産コストを下げる必要があった。
【０００７】
ところで本発明者らは、哺乳動物の複製開始領域（ＩＲ；Initiation Region）と核マトリックス結合領域（ＭＡＲ； Matrix Attachment Region）とを持つプラスミド（以下「ＩＲ／ＭＡＲベクター」または「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」という）をヒト由来がん細胞（COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（ブラスティサイジン（Blasticidine）あるいはネオマイシン（Neomycine））を利用して選択するだけで、
(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子（以下「目的遺伝子」という）の細胞内コピー数を１万コピー程度にまで増幅できること、および、
(2)目的遺伝子はＩＲ／ＭＡＲベクターに対して同一の遺伝子構築物（シス）として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物（トランス）として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを発見した（特許文献１および非特許文献６参照）。そして、本発明者は当該知見に基づいて、ＩＲ／ＭＡＲベクターと目的遺伝子とを、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来がん細胞（COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株）、ＣＨＯ細胞等）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（BlasticidineあるいはNeomycine）を利用して選択するだけで、目的遺伝子を１万コピー程度に増幅できる系（「高度遺伝子増幅系」という）を完成させるに至った。
【０００８】
ここで、染色体外のダブルマイニュート染色体（以下「ＤＭ」という）と染色体の均一染色領域（以下「ＨＳＲ」という）がＩＲ／ＭＡＲベクターによって生じるメカニズムを図１に示す。ＩＲ／ＭＡＲベクターは宿主細胞内で直列に反復してつながることで多量体化する（Ｓｔｅｐ１）。この多量体は細胞が成長している間は宿主細胞内で安定して存在し、自己複製を行う。上記多量体がそのまま大きくなるか、宿主細胞内に元から存在するＤＭに取り込まれることでＤＭが発生する。また、Ｓｔｅｐ２のように多量体の環状ＤＮＡは宿主細胞内でＤＮＡ２本鎖が切断され（ＤＳＢ;double strand breakage）、直鎖状ＤＮＡになる。すると、当該直鎖状ＤＮＡはクロモソームに組み込まれ、Ｓｔｅｐ３のようなＢＦＢ（Breakage-Fusion-Bridge）サイクルが開始され、ＨＳＲが生じる。
【特許文献１】特開２００３−２４５０８３号公報（公開日：平成１５（２００３）年９月２日）
【特許文献２】国際公開第９６／０９３８３号パンフレット（国際公開日：１９９６年３月２８日）
【特許文献３】特表平８−５０３６１５号公報（公表日：平成８年（１９９６）４月２３日）
【非特許文献１】Grindley et al. Trends Genet.3:16-22(1987)
【非特許文献２】Kucherlapati et al. Crit.Rev.Biochem.16:349-381(1984)
【非特許文献３】Palmiter et al. Annu.Rev.Genet.20:465-499(1986)
【非特許文献４】Eissenberg et al. Trends Genet.7:335-340(1991)
【非特許文献５】Palmiter et al. Annu.Rev.Genet.20:465-499(1986)
【非特許文献６】Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.
【非特許文献７】Nunberg et al., Proc.Natl.Acad.Sci,75:5553-5556(1978)
【非特許文献８】Page et al., Biotechnology, 9:64-68(1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のごとく、従来公知の哺乳動物細胞を用いたタンパク質生産系では、宿主細胞が限定される、操作が煩雑で熟練を要する等の様々の問題点があった。
【００１０】
そこで本発明は、かかる従来技術の課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明の目的は、広範な哺乳動物細胞を宿主細胞として利用することができ、遺伝子の導入効率および発現効率が高く、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が高い哺乳動物細胞の形質転換方法を提供し、医薬品等の有用タンパク質の生産コストを低下させることである。また本発明は、目的タンパク質（発現させる所望のタンパク質）の精製を容易にして有用タンパク質の生産コストをさらに低下させるため、目的タンパク質を細胞内に蓄積させずに細胞外に分泌させることを画した哺乳動物細胞の形質転換方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、高度遺伝子増幅系を用いた目的タンパク質の生産条件について鋭意検討を行ったところ、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子を含むベクターとＩＲ／ＭＡＲベクターとのモル比を所定の範囲となるようにしつつ、哺乳動物細胞へ同時に導入することよって、上記課題を全て解決し得ることを発見し本発明を完成させるに至った。
【００１２】
さらに驚くべきことに、本発明を採用することによって、目的遺伝子が高発現するだけでなく、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が著しく向上するという、当業者が予想し得る以上の有利な効果が得られた。
【００１３】
本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。すなわち本発明にかかる方法は、哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物核マトリックス結合領域とを含む第１ベクター、および哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターとを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入することを特徴とする、哺乳動物細胞の形質転換方法である。
【００１４】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記哺乳動物複製開始領域が、遺伝子増幅活性部位を有する哺乳動物複製開始領域の部分断片であってもよい。
【００１５】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座由来の複製開始領域、β−グロビン遺伝子座由来の複製開始領域、およびエプスタイン・バーウイルス潜在複製開始領域からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
【００１６】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記哺乳動物核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。
【００１７】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、およびハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーターからなる群から選択されるのいずれかであってもよい。
【００１８】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記プロモーターが、ＳＲαプロモーターまたはヒト伸長因子１−αプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は１．５であることが好ましい。
【００１９】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は３であることが好ましい。
【００２０】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、目的遺伝子の５’末端側に分泌シグナル配列を含むことが好ましい。
【００２１】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記第１ベクターおよび／または第２ベクターに、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００２２】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ブラスチシジンＳデアミナーゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質遺伝子からなる群より選択されるものであってもよい。
【００２３】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胎児腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト子宮頸部癌細胞、およびマウスミエローマ細胞からなる群から選択されるものであってもよい。
【００２４】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、第１ベクターおよび第２ベクターを哺乳動物細胞に導入した後に、目的遺伝子が高発現するクローンを選抜する選抜工程を含む方法であってもよい。
【００２５】
一方、本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記本発明にかかる形質転換方法によって得られた形質転換細胞を培養する培養工程を含む方法である。
【００２６】
本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記培養工程によって得られた培養物から所望のタンパク質を精製する精製工程を含む方法であってもよい。
【００２７】
また本発明は、上記本発明にかかる形質転換方法によって得られた形質転換細胞をも包含する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、目的遺伝子の導入効率および発現効率が高く、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が高い哺乳動物細胞の形質転換方法を提供し、医薬品等の有用タンパク質の生産コストを低下させることができる。なお、本発明において利用するＩＲ／ＭＡＲベクターを用いた高度遺伝子増幅系は、宿主細胞は特に限定されず、広範な哺乳動物細胞を利用することができる。
【００２９】
さらに、本発明の形質転換方法において、ＩＲの全長の代わりに遺伝子増幅活性を有するＩＲの部分断片を適用した場合は、従来の高度遺伝子増幅系で用いられていたＩＲ／ＭＡＲベクターと比べてサイズが小さいために、下記のメリットをさらに享受できる。
(A)哺乳動物細胞への遺伝子導入効率がさらに向上する。
(B)さらにサイズの大きい目的遺伝子を高度遺伝子増幅系へ適用することが可能となる。
(C)タグタンパク質やシグナルペプチド等のその他のエレメントをコードするポリヌクレオチドを、ＩＲ／ＭＡＲベクターに容易に組み込むことができるようになり、より複雑なベクターを構築することも可能になる。
【００３０】
また上記に加え、下記の効果が得られるということを本発明者らは偶然にも見出した。この効果は当業者が予想し得る以上の有利な効果であるといえる。
(D)全長のＩＲを用いた従来法よりもＨＳＲの発生頻度が著しく向上する。
【００３１】
したがって本発明によれば、所望のタンパク質を大量かつ容易に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００３３】
＜１.本発明の形質転換方法＞
本発明の一実施形態は、哺乳動物細胞の形質転換方法に関する。上記方法のことを「本発明の形質転換方法」と称する。
【００３４】
ここで本発明の形質転換方法は、哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物核マトリックス結合領域とを含む第１ベクター、
および哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入する工程（以下、「導入工程」という）を含むことを特徴としている。
【００３５】
（１）第１ベクター
本発明の形質転換方法において利用する「第１ベクター」は、哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）と、哺乳動物核マトリックス結合領域（ＭＡＲ）とを少なくとも含むベクター（すなわち「ＩＲ／ＭＡＲベクター」）である。かかる第１ベクターに含まれるＩＲおよびＭＡＲは、哺乳動物をはじめとする真核生物細胞内で機能するＩＲおよびＭＡＲであれば特に限定されるものではない。
【００３６】
上記ＩＲとしては、例えばｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子座由来、β-グロビン遺伝子座由来等の複製開始領域、やエプスタイン・バーウイルス潜在複製開始領域等が挙げられる。なおｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域については、「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242 (1990)」を参照のこと。またＤＨＦＲ遺伝子座の複製開始領域については、「Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409 (1988) 」を参照のこと。またβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域については、「Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009 (1998) 」を参照のこと。またエプスタイン・バーウイルス潜在複製開始領域については「Baer, R. et al., Nature vol.310, p207-211(1984)」を参照のこと。
【００３７】
また上記ＭＡＲとしては、例えば、Igκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座等の核マトリックス結合領域に由来するポリヌクレオチドが挙げられる。なお、Igκ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、「Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem. vol. 268, p12886-12894 (1993) 」参照のこと。またＳＶ４０初期領域の核マトリックス結合領域については、「Pommier, Y. et al., J. Virol., vol 64, p419-423 (1990) 」を参照のこと。またジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、「Shimizu N. et al., Cancer Res. vol. 61, p6987-6990 」を参照のこと。
【００３８】
なお本明細書において特に言及しない場合においては、哺乳動物複製開始領域を「ＩＲ」と表記し、哺乳動物各マトリクス結合領域を「ＭＡＲ」と表記する。また全長のＩＲおよびＭＡＲのみならず、これらの部分断片により構成されているベクターも「ＩＲ／ＭＡＲベクター」と称する。
【００３９】
なお本発明の形質転換方法では、第１ベクター（ＩＲ／ＭＡＲベクター）のサイズを小さくするために、全長のＩＲの代わりに遺伝子増幅活性部位を有するＩＲの部分断片（「増幅活性断片」という）を用いてもよい。ここで上記「哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）の部分断片」とは全長のＩＲを除くＩＲの一部分であることを意味する。ＩＲの部分断片の長さは特に限定されるものではないが、約２．４ｋｂｐであるｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来のＩＲの場合は、部分断片の長さは０．５ｋｂｐ以上２．０ｋｂｐ以下であることが好ましく、０．５ｋｂｐ以上１．５ｋｂｐ以下であることがさらに好ましく、０．５ｋｂｐ以上１．３ｋｂｐ以下であることが最も好ましい。また約４．６ｋｂｐであるＤＨＦＲ遺伝子座由来のＩＲの場合は、部分断片の長さは１．７ｋｂｐ以上３．５ｋｂｐ以下であることが好ましく、１．７ｋｂｐ以上３．１ｋｂｐ以下であることがさらに好ましい。上記好ましい範囲を満たす場合は、発明の効果の項で記載した(A)〜(D)の効果が得られやすい。
【００４０】
ここで「遺伝子増幅活性部位」とは、高度遺伝子増幅系における遺伝子増幅が起こるために必須なエレメントのことを意味する。たとえばあるＩＲの部分断片が、上記遺伝子増幅活性部位を有しているか否かは、例えば、当該部分断片とＭＡＲとを用いてＩＲ／ＭＡＲベクターを調製し、当該ＩＲ／ＭＡＲベクターと目的遺伝子とを哺乳動物細胞へ導入した際に遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）の発生頻度を検討することによって判断することができる。すなわち上記検討において遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）の発生頻度が全長のＩＲを用いた場合に比して著しく低下する、または遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）が発生しなくなれば、その検討に用いたＩＲの部分断片には遺伝子増幅活性部位が含まれていないと判断できる。逆に、ＩＲの部分断片を用いた場合の遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）の発生頻度が、全長のＩＲを用いた場合のそれに比して、同等か若しくはそれ以上であれば、当該ＩＲの部分断片が遺伝子増幅活性部位を有するＩＲの部分断片（増幅活性断片）であると判断することができる。形質転換細胞のクローンにおいて上記増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）が形成されたか否かを検出する方法については、特に限定されるものではないが、例えば分裂期の染色体について公知のＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）を行い、哺乳動物細胞へ導入した遺伝子を検出することによって判断し得る。上記判断は、当業者であれば容易に行い得る。なおＦＩＳＨ法を実施する際の具体的な方法については特に限定されるものではなく、従来公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。
【００４１】
本発明者らの検討によれば、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲの場合、配列番号１、２、３、７、および１２に示される塩基配列からなるＩＲの部分断片が遺伝子増幅活性部位を有していることが明らかとなった。特に配列番号１、３、および１２に示される塩基配列からなるＩＲの部分断片をＩＲ／ＭＡＲベクターの全長ＩＲの代わりに使用することで、全長ＩＲを使用した場合に比して目的遺伝子の増幅効率が向上するという驚くべき知見が得られた。なお、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲの塩基配列は、例えばGenbank HSMYCC(accession number X00364)の第１〜２３４９位に相当するものが挙げられる。
【００４２】
またＤＨＦＲ由来ＩＲの場合、配列番号５２および５５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが増幅活性断片に該当することを本発明者らは確認した。なおＤＨＦＲ由来ＩＲの塩基配列としては、Genbank CFORIDHFR(accession number X94372)の第１５３２〜６１６６位に示される塩基配列がその一例として挙げられる。特に配列番号５２に示される塩基配列からなるＩＲの部分断片をＩＲ／ＭＡＲベクターの全長ＩＲの代わりに使用することで、全長ＩＲを使用した場合に比して目的遺伝子の増幅効率が向上するという驚くべき知見が得られた。
【００４３】
増幅活性断片として機能するものであれば、配列番号１、２、３、７、１２、５２および５５に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドもＩＲの部分断片の好ましい実施形態に該当するということを、当業者は容易に理解する。上記変異ポリヌクレオチドとオリジナルのポリヌクレオチド（配列番号１、２、３、７、１２、５２および５５）との相同性は、８０％以上が好ましく、約９０％以上がさらに好ましく、約９５％以上が最も好ましい。なお上記変異ポリヌクレオチドを用いてＩＲ／ＭＡＲプラスミドを構築した場合に目的遺伝子を増幅させる活性を有することはいうまでもない。
【００４４】
本発明の形質転換方法の導入工程において使用する第１ベクター（ＩＲ／ＭＡＲベクター）は、ＩＲおよびＭＡＲが具備されていればよいが、当該ＩＲ／ＭＡＲには、大腸菌内でクローニングを行うために必要な配列、選択マーカー（マーカータンパク質）としての薬剤耐性遺伝子(ブラスティサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子等)または緑色蛍光タンパク質遺伝子等が含まれていてもよい。これらの選択マーカーを指標とすることによって、第１ベクター（ＩＲ／ＭＡＲベクター）が導入された哺乳動物細胞を選別できる。
【００４５】
なお、第１ベクターは１種類のＩＲ／ＭＡＲベクターからなる場合に限定されず、複数種類のＩＲ／ＭＡＲベクターを組み合わせてからなるものであってもよい。
【００４６】
（２）第２ベクター
本発明の形質転換方法において利用する「第２ベクター」は、哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを少なくとも含むベクターである。
【００４７】
ここで上記「目的遺伝子」とは発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子のことを意味する。本発明における目的遺伝子は、分泌タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。「分泌タンパク質」とは、細胞質膜外に分泌されるタンパク質の総称である。上記目的遺伝子としては例えば、抗体などの血液タンパク質、各種消化酵素、ペプチドホルモン、乳タンパク質、卵白タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。後述する実施例においては、抗Pyrococcus kodakaraensis(KOD)ＤＮＡポリメラーゼ抗体をコードする遺伝子、またはエリスロポエチンをコードする遺伝子を目的遺伝子として用いた。なお、上記抗体としては、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）およびこれらの抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）が挙げられる。また単鎖抗体であってもよい。免疫グロブリンをコードする遺伝子を目的遺伝子として利用する場合、重鎖および軽鎖を別々に含む２つのベクターからなる第２ベクターを用いてもよいし、また抗体の重鎖と軽鎖がタンデムにつながった１つのベクターからなる第２ベクターを用いてもよい。よって本発明の形質転換方法は第２ベクターが１種類であることに限定されず、複数種類のベクターの組み合わせからなる場合も意図している。
【００４８】
また本発明の形質転換方法の導入工程において導入される、目的遺伝子はプロモーターに制御可能に連結されていることが好ましい。上記プロモーターは、導入される哺乳動物細胞において機能するものであれば特に限定されるものではなく、転写因子等による所定の操作によって、プロモーターの転写活性が活性化または不活性化されるプロモーター（本明細書においては「転写活性調節型プロモーター」という）であっても、恒常的に転写活性が活性化されている恒常型プロモーターであってもよい。「転写活性調節型プロモーター」は、上記特性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等の市販品が本発明にかかる方法において利用可能である。恒常型プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、ハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター等が利用可能である。
【００４９】
本発明の形質転換方法の導入工程において使用する第２ベクターには、上記の他、分泌シグナルペプチドをコードする分泌シグナル配列が目的遺伝子の５’末端側に含まれていてもよい。宿主細胞外に目的タンパク質を分泌させるためである。分泌シグナル配列としては、特に限定されるものではなく、分泌シグナル配列として公知の配列を適宜選択の上、採用すればよい。分泌シグナル配列としては、例えばイムノグログリン κ鎖由来のシグナル配列（Karp,S.L et al., J.Immunol.vol.150, p867-879(1993)）、イムノグロブリン 重鎖由来のシグナル配列（Castilla,J. et al., J.Virol.vol.71, p5251-5258(1997)）等が挙げられる。
【００５０】
本発明の形質転換方法の導入工程において使用する第２ベクターには、上記の他、大腸菌内でクローニングを行うために必要な配列や、ヒスチジンタグをはじめとする精製用タグ配列、選択マーカーをコードする選択マーカー遺伝子が含まれていてもよい。これらの選択マーカーを指標とすることによって、第２ベクターが導入された哺乳動物細胞を選別できる。上記選択マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン抵抗性遺伝子）、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ヒグロマイシン抵抗性遺伝子）、ブラスティサイジンＳデアミナーゼ遺伝子（ブラスティサイジン抵抗性遺伝子））、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子等が挙げられる。なお第１ベクターおよび第２ベクターのそれぞれに選択マーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入された哺乳動物細胞を選抜することができるからである。この時、第１ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子と、第２ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とが異なることが好ましい。第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入された哺乳動物細胞を、さらに確実に選抜することができるからである。
【００５１】
（３）導入工程
本発明の形質転換方法の導入工程は、上記第１ベクターと上記第２ベクターとを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入する工程である。
【００５２】
上記哺乳動物細胞（宿主細胞）は、特に限定されるものではなく、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞、入手先：例えば、ATCC CCL-61、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0285、理化学研究所バイオリソースセンター RCB0403等）、ヒト胎児腎臓細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞、入手先：例えばATCC CRL-1573、理化学研究所バイオリソースセンターRCB1637、理化学研究所バイオリソースセンターRCB2202等）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばＣＯＳ−７細胞、入手先：例えばATCC CRL-1651、理化学研究所バイオリソースセンター RCB0539等）、ヒト子宮頸部癌細胞、マウスミエローマ細胞より選択される、各種腫瘍細胞等が挙げられる。ただし、上記哺乳動物細胞としては、無限増殖能を有する腫瘍細胞が特に好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-2、ATCC CCL-2.2、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0007、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0191）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（入手先：例えばATCC CCL-2.2、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0191、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0271、理化学研究所バイオリソースセンターRCB1525等）、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220）、ヒト大腸がんCOLO 320HSR細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220.1）、ＮＳ０細胞（入手先：例えば、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0213）等が挙げられる。なおヒト大腸がんCOLO 320DM細胞については、「Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.」参照のこと。
【００５３】
なお、本発明者らが開発した高度遺伝子増幅系では、ＩＲ／ＭＡＲベクターおよび目的遺伝子を哺乳動物細胞に導入する際には、両者を連結して同一の遺伝子構築物として導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよいが、本発明の形質転換方法では特に別々の遺伝子構築物として導入する。換言すれば第１ベクターと第２ベクターとは別個の遺伝子構築物である。このようにすることで、それぞれのベクターのサイズを小さくすることができるために、発明の効果の項で記載した上記(A)〜(D)のメリットをさらに得られやすくなる。
【００５４】
また遺伝子構築物の形態については、プラスミドであってもコスミドであってもよい。また第１ベクターおよび第２ベクターの哺乳動物細胞への導入方法は、哺乳動物細胞へ同時に導入することができる方法であれば特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。
【００５５】
また本発明の形質転換方法においては、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５となるように哺乳動物細胞に導入する。第２ベクターにおけるプロモーターとして、ＳＲαプロモーターまたはヒト伸長因子１−αプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は１．５であることが特に好ましい。また第２ベクターにおけるプロモーターとして、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は３であることが特に好ましい。本発明者らの検討によって、第２ベクターに対する第１ベクターの最適なモル比が設定された。上記条件を採用することによって、目的遺伝子が高発現するクローンが取得できる。
【００５６】
なお、複数種類のベクターの組み合わせからなる第１ベクターを用いて本発明の形質転換方法を実施した場合、当該複数種類のベクターのモル数の合計を第１ベクターのモル数とすればよい。同様に、複数種類のベクターの組み合わせからなる第２ベクターを用いて本発明の形質転換方法を実施した場合、当該複数種類のベクターのモル数の合計を第２ベクターのモル数とすればよい。
【００５７】
（４）選抜工程
なお本発明の形質転換方法には、上記導入工程の他に、第１ベクターおよび第２ベクターを哺乳動物細胞に導入した後に、目的遺伝子が高発現するクローンを選抜する選抜工程が含まれていてもよい。選抜工程は、第１ベクターおよび第２ベクターのいずれか、または両方が導入されていない哺乳動物細胞、第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入されてはいるが目的遺伝子が高発現していない哺乳動物細胞、第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入されており且つ目的遺伝子が高発現している哺乳動物細胞が含まれる細胞の多クローン性集団から、第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入されており且つ目的遺伝子が高発現している哺乳動物細胞（クローン）を選抜する工程である。具体的には、導入工程後、安定形質転換細胞を取得し、限界希釈法で単クローンにする（クローニングを行う）。クローニングによって得られた種々のクローンを対象に目的遺伝子の産物の生産量を測定し、目的遺伝子が高発現するクローンを選抜すればよい。
【００５８】
本発明の形質転換方法によれば、目的遺伝子が高発現する形質転換細胞が取得し得るだけでなく、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が著しく向上するという、当業者が予想し得る以上の有利な効果が得られた（後述する実施例を参照のこと）。
【００５９】
＜２.本発明のタンパク質の生産方法、および本発明の形質転換細胞＞
上記本発明の形質転換方法によって得られた形質転換細胞は、目的遺伝子を高発現する細胞である。それゆえ、かかる形質転換細胞を培養することによって、目的遺伝子がコードする所望の分泌タンパク質を大量に生産することができる。つまり本発明は、本発明の形質転換方法によって得られた形質転換細胞を培養する培養工程を含む、タンパク質の生産方法（以下「本発明のタンパク質生産方法」という）をも包含する。また本発明のタンパク質生産方法には、培養工程によって得られた培養物から所望のタンパク質を精製する精製工程を含む方法であってもよい。以下、本発明にかかる方法を工程ごとに説明する。
【００６０】
（１）培養工程
本発明のタンパク質生産方法における「培養工程」は、上記本発明の形質転換細胞にって得られた形質転換細胞（形質転換哺乳動物細胞）を培養する工程である。かかる培養工程によって、目的遺伝子が導入され且つ高度に増幅された哺乳動物細胞を培養することができ、所定の操作（転写誘導操作等）によって、目的タンパク質を生産することができる。
【００６１】
上記培養工程の具体的方法は特に限定されるものではなく、培養する哺乳動物細胞に最適な条件を検討の上、適宜採用すればよい。例えば、浮遊培養法、担体付着培養法、ホローファイバー培養法等が好適である。特に浮遊培養法は、ジャーファーメンターを利用することができ、スケールアップが容易であるために、より好ましいといえる。形質転換細胞（形質転換哺乳動物細胞）を培養する際の培地としては、特に限定されるわけではなく、市販されている培地を利用してもよいし、適宜調製した培地を利用てもよい。培地には、アミノ酸、ビタミン類、ブドウ糖、塩類、血清等が含まれている場合がある。また、重炭酸／炭酸ガス系緩衝液がｐＨ緩衝剤として培地に含まれていてもよい。培養装置としては、公知のＣＯ2インキュベーターが適宜利用可能である。またｐＨのモニター用にフェノールレッドが培地に添加されていてもよい。培養条件は、一般的には３７℃で培養するが、細胞株によっては、２８℃、４０℃の場合がある。例えばＣＨＯ細胞は、１０％ fetal bovine serum (ＦＢＳ) を含むＦ１２ media (GIBCO BRL社)やＤＭＥＭ media(GIBCO BRL)、または無血清培地（CD-CHO(GIBCO BRL)、EX-CELL302(SAFC Bioscience)、EX-CELL CD-CHO(SAFC Bioscience)）等に必要な栄養源を添加し、５％ ＣＯ2、３７℃の条件で培養され得る。
【００６２】
（２）精製工程
本発明のタンパク質生産方法における「精製工程」は、上記培養工程によって得られた培養物から所望のタンパク質を精製する精製する工程である。上記目的遺伝子がコードするタンパク質は分泌タンパク質であるため、形質転換細胞の細胞質膜外へタンパク質が分泌される。すなわち形質転換細胞を培養すれば、その培養物（例えば培養液）内に所望のタンパク質が分泌されることになる。この培養物内に存在する所望のタンパク質を、タンパク質の精製方法として従来公知の手法を適宜採用の上、精製すればよい。
【００６３】
従来公知のタンパク質の精製方法としては、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過クロマトグラフィー等の公知のカラムクロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。また例えば、所望のタンパク質のＣ末端にヒスチジンタグが付加されるように第２ベクターを設計しておけば、ヒスチジンはニッケルに吸着する性質を利用することによって、ニッケルカラムを用いて所望のタンパク質を簡単に精製することができる。また、精製されたタンパク質溶液を適当な緩衝液に対して透析することで不要な塩を除去することもできる。なお、上記精製工程の具体的方法は、この限りではなく、公知の方法を適宜利用され得る。例えば、ＩｇＧ抗体を精製する場合、Protein AやProtein Gをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーが利用可能である。
【００６４】
さらに本発明には、本発明の形質転換方法によって得られた形質転換細胞が含まれる。本発明の形質転換細胞はクローニングされた単クローンであっても、未クローニングの多クローン性集団であってもよい。本発明の形質転換細胞は、特に限定されないが、３ヶ月以上安定して所望のタンパク質を生産し得る細胞であることが、タンパク質生産を長期間計測して行うことができるために好ましいといえる。なお、本発明の形質転換細胞に関する説明は、本発明の形質転換方法における説明を適宜援用し得る。
【実施例】
【００６５】
以下に、実施例および参考例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例および参考例に記載のＰＣＲは全てＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡株式会社製）を用いて行った。また実験の諸条件は、特記しない限り実験に使用した試薬に添付されている説明書に記載されている標準の条件で行った。
【００６６】
＜参考例＞
〔各種プラスミド〕
５’末端と３’末端とにＡｓｃ Ｉサイトを有する、ＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座（単に「ＤＨＦＲ遺伝子座」ともいう）のＩＲ遺伝子、およびｃ−ｍｙｃのＩＲ遺伝子の作製方法は以下の通りである。ＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲ（４．６ｋｂｐ）を、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載されているｐＳＦＶｄｈｆｒからＮｏｔ Ｉで制限酵素消化することによって切り出した。また、ｃ−ｍｙｃのＩＲ（２．４ｋｂｐ）は「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 18, p1233-1242 (1990)」に記載されているｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４からＮｏｔ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて制限酵素消化により切り出した。上記２つのＩＲ断片の５’と３’末端を平滑末端化した後、その平滑末端にＡｓｃ Ｉの制限酵素サイトを有するアダプターオリゴヌクレオチドを連結した。
【００６７】
またｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＢＮ．ｐｏｌｙＡ、およびｐＳＦＶ−Ｖとして、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載のプラスミドをそれぞれ用いた。
【００６８】
またｐΔＨはｐＳＦＶ−Ｖに含まれる完全長のハイグロマイシン抵抗性遺伝子カセットをＮｏｔ ＩとＮｒｕ Ｉの制限酵素を用いて取り除き、代わりにその場所にマルチクローニングサイトを含む合成オリゴヌクレオチドを挿入することで作製された。上記マルチクローニングサイトの制限酵素サイトはブラスティサイジン抵抗性遺伝子（以下、「ＢＳＲ」という）の下流に位置し、５’末端から３’末端にかけてＫｐｎ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ−Ａｓｃ Ｉ−Ｎｒｕ Ｉの順番である。
【００６９】
また図３Ｄに示されているｐΔＨｐＡは、ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列（１３５７ｂｐ）を含む遺伝子を５’末端および３’末端にＫｐｎ Ｉの制限酵素サイトが付加されるように設計したＨＳＶｐＡＫｐｎＩＲとＨＳＶｐＡＫｐｎＩＬのプライマーセットとを用いてＰＣＲ法によって増幅し、当該Ｋｐｎ Ｉの制限酵素サイトを用いて上記ｐΔＨのＫｐｎ Ｉサイトに挿入することで作製された。ＨＳＶｐＡＫｐｎＩＲおよびＨＳＶｐＡＫｐｎＩＬの各プライマーの塩基配列を配列番号９１と配列番号９２にそれぞれ示した。また、上記、ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列の塩基配列を配列番号９３で示した。
【００７０】
図３Ｅに示されているｐΔＨｐＡｄｈｆｒを、上記で作製したＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲを、そのＩＲ断片の内部に存在するＭＡＲ配列が、ＢＳＲの転写開始点よりも遠くになるようにｐΔＨｐＡのＡｓｃ Ｉサイトに挿入することで作製した。
【００７１】
また図３Ｆに示されているｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒは、平滑末端処理を施した上記ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列（図３中「ＨＳＶ ｐＡ」で示す）を含む遺伝子断片をｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒのＮｒｕ Ｉサイトに挿入することで作製された。
【００７２】
また図３ＣのｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲは下記の通りにして作製された。
（ｉ）ＡＲ１のＭＡＲ（３７５ｂｐ）断片をＨｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨ Ｉを用いて制限酵素消化することでｐＡＲ１より切り出し、当該断片の両末端を平滑末端処理した。なお、ｐＡＲ１の詳細は「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載されている。
（ｉｉ）ＳＶ４０の初期領域のＭＡＲ遺伝子を、ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４を鋳型としてＳＶ４０ＬとＳＶ４０Ｒのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により取得した。ＳＶ４０ＬおよびＳＶ４０Ｒの塩基配列を配列番号９４および９５にそれぞれ示した。また、上記ＳＶ４０の初期領域のＭＡＲ遺伝子の塩基配列を配列番号９６に示した。
（ｉｉｉ）ＲＦＢ（replication fork barrier）配列を含む遺伝子（１１８ｂｐ）は、ｐＳＶ２．ＳＢ２を鋳型として、５’末端と３’末端とにＮｏｔ Ｉの制限酵素サイトが付加されるように設計したＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＬとＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＲのプライマーセットとを用いてＰＣＲ法により取得された。上記ＲＦＢ配列は複製フォークの発生をブロックするため、当該ＲＦＢ配列が導入されたプラスミドの複製を阻害することができる。ＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＬおよびＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＲの塩基配列を配列番号９７および９８にそれぞれ示した。また、ＲＦＢ配列の塩基配列を配列番号９９で示した。
（ｖｉ）上記ＲＦＢ配列を含む遺伝子を、ＩＲからの複製フォークをブロックする方向性でｐΔＨｐＡのＮｏｔ Ｉサイトに挿入した。次に、平滑末端処理したＡＲ１とＳＶ４０との両方のＭＡＲ遺伝子を、上記プラスミドのＮｒｕ Ｉサイトに挿入した。
（ｖ）最後に、上記で作製したｃ−ｍｙｃのＩＲ遺伝子またはＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲ遺伝子と、λ―ファージのＨｉｎｄ ＩＩＩで制限酵素消化した４３６１ｂｐの断片の両末端にＡｓｃ Ｉサイトを付加した遺伝子とを、それぞれ（ｖｉ）で作製したプラスミドのＡｓｃ Ｉサイトに挿入した。
【００７３】
また図３Ｇに示されているｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、またはｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖは、上記で取得したＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲ遺伝子（４．６ｋｂｐ）を平滑末端処理したものを、ｐΔＨｐＡのＥｃｏＲ Ｉ消化物を平滑末端処理したものに対して、ＢＳＲの転写に関して同じ、または反対の方向になるように挿入してそれぞれ作製された。
【００７４】
また図３Ｈに示されているｐＥＰＩ−Ｉ（「Schaarschmidt, D., Baltin, J., Stehle, I. M., Lipps, H. J., and Knippers, R. (2004) EMBO J. 23(1), 191-201.」、および 「Jenke, A. C., Stehle, I. M., Herrmann, F., Eisenberger, T., Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. O., and Lipps, H. J. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11322-11327.」）はDaniel Schaarchmidt 氏(Department of Biology, Universitat of Konstanz)より提供された。
【００７５】
また図３Ｊに記されているｐＴＨＶは、ｐΔＨのＫｐｎ Ｉサイトに平滑末端ライゲーションでＡＲ１のＭＡＲを挿入することで作製された。
【００７６】
また図３Ｉに記されているｐＴＨ３は、上記ｐＴＨＶのＮｏｔ Ｉサイトに平滑末端ライゲーションでＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列を挿入することで作製された。
【００７７】
また２．４ｋｂｐのｃ−ｍｙｃのＩＲの部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）を含むベクターは、ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４とｐＳＦＶｄｈｆｒとを鋳型とするＰＣＲによって増幅された遺伝子を、ｐＴＨＶのＡｓｃ Ｉサイトに挿入することによって作製された。また４．６ｋｂｐのＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲの部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）を含むベクターは、ｐＳＦＶｄｈｆｒとを鋳型とするＰＣＲによって増幅された遺伝子を、ｐＴＨＶのＡｓｃ Ｉサイトに挿入することによって作製された。
【００７８】
上記のＰＣＲで用いた、Ｃ１増幅用の５’プライマー（Ｃ１−５’）の塩基配列を配列番号１８に、３’プライマー（Ｃ１−３’）の塩基配列を配列番号１９に示した。また、Ｃ２増幅用の５’プライマー（Ｃ２−５’）の塩基配列を配列番号２０に、３’プライマー（Ｃ２−３’）の塩基配列を配列番号２１に示した。また、Ｃ３増幅用の５’プライマー（Ｃ３−５’）の塩基配列を配列番号２２に、３’プライマー（Ｃ３−３’）の塩基配列を配列番号２３に示した。また、Ｃ４増幅用の５’プライマー（Ｃ４−５’）の塩基配列を配列番号２４に、３’プライマー（Ｃ４−３’）の塩基配列を配列番号２５に示した。また、Ｃ５増幅用の５’プライマー（Ｃ５−５’）の塩基配列を配列番号２６に、３’プライマー（Ｃ５−３’）の塩基配列を配列番号２７に示した。また、Ｃ６増幅用の５’プライマー（Ｃ６−５’）の塩基配列を配列番号２８に、３’プライマー（Ｃ６−３’）の塩基配列を配列番号２９に示した。また、Ｃ７増幅用の５’プライマー（Ｃ７−５’）の塩基配列を配列番号３０に、３’プライマー（Ｃ７−３’）の塩基配列を配列番号３１に示した。また、Ｃ８増幅用の５’プライマー（Ｃ８−５’）の塩基配列を配列番号３２に、３’プライマー（Ｃ８−３’）の塩基配列を配列番号３３に示した。また、Ｃ９増幅用の５’プライマー（Ｃ９−５’）の塩基配列を配列番号３４に、３’プライマー（Ｃ９−３’）の塩基配列を配列番号３５に示した。また、Ｃ１０増幅用の５’プライマー（Ｃ１０−５’）の塩基配列を配列番号３６に、３’プライマー（Ｃ１０−３’）の塩基配列を配列番号３７に示した。また、Ｃ１１増幅用の５’プライマー（Ｃ１１−５’）の塩基配列を配列番号３８に、３’プライマー（Ｃ１１−３’）の塩基配列を配列番号３９に示した。また、Ｃ１２増幅用の５’プライマー（Ｃ１２−５’）の塩基配列を配列番号４０に、３’プライマー（Ｃ１２−３’）の塩基配列を配列番号４１に示した。また、Ｃ１３増幅用の５’プライマー（Ｃ１３−５’）の塩基配列を配列番号４２に、３’プライマー（Ｃ１３−３’）の塩基配列を配列番号４３に示した。また、Ｃ１４増幅用の５’プライマー（Ｃ１４−５’）の塩基配列を配列番号４４に、３’プライマー（Ｃ１４−３’）の塩基配列を配列番号４５に示した。また、Ｃ１５増幅用の５’プライマー（Ｃ１５−５’）の塩基配列を配列番号４６に、３’プライマー（Ｃ１５−３’）の塩基配列を配列番号４７に示した。また、Ｃ１６増幅用の５’プライマー（Ｃ１６−５’）の塩基配列を配列番号４８に、３’プライマー（Ｃ１６−３’）の塩基配列を配列番号４９に示した。また、Ｃ０増幅用の５’プライマー（Ｃ０−５’）の塩基配列を配列番号５０に、３’プライマー（Ｃ０−３’）の塩基配列を配列番号５１に示した。
【００７９】
また、Ｄ１増幅用の５’プライマー（Ｄ１−５’）の塩基配列を配列番号６３に、３’プライマー（Ｄ１−３’）の塩基配列を配列番号６４に示した。また、Ｄ２増幅用の５’プライマー（Ｄ２−５’）の塩基配列を配列番号６５に、３’プライマー（Ｄ２−３’）の塩基配列を配列番号６６に示した。また、Ｄ３増幅用の５’プライマー（Ｄ３−５’）の塩基配列を配列番号６７に、３’プライマー（Ｄ３−３’）の塩基配列を配列番号６８に示した。また、Ｄ４増幅用の５’プライマー（Ｄ４−５’）の塩基配列を配列番号６９に、３’プライマー（Ｄ４−３’）の塩基配列を配列番号７０に示した。また、Ｄ５増幅用の５’プライマー（Ｄ５−５’）の塩基配列を配列番号７１に、３’プライマー（Ｄ５−３’）の塩基配列を配列番号７２に示した。また、Ｄ６増幅用の５’プライマー（Ｄ６−５’）の塩基配列を配列番号７３に、３’プライマー（Ｄ６−３’）の塩基配列を配列番号７４に示した。また、Ｄ７増幅用の５’プライマー（Ｄ７−５’）の塩基配列を配列番号７５に、３’プライマー（Ｄ７−３’）の塩基配列を配列番号７６に示した。また、Ｄ８増幅用の５’プライマー（Ｄ８−５’）の塩基配列を配列番号７７に、３’プライマー（Ｄ８−３’）の塩基配列を配列番号７８に示した。また、Ｄ９増幅用の５’プライマー（Ｄ９−５’）の塩基配列を配列番号７９に、３’プライマー（Ｄ９−３’）の塩基配列を配列番号８０に示した。また、Ｄ１０増幅用の５’プライマー（Ｄ１０−５’）の塩基配列を配列番号８１に、３’プライマー（Ｄ１０−３’）の塩基配列を配列番号８２に示した。また、Ｄ１１増幅用の５’プライマー（Ｄ１１−５’）の塩基配列を配列番号８３に、３’プライマー（Ｄ１１−３’）の塩基配列を配列番号８４に示した。
【００８０】
また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ０の塩基配列を配列番号１７に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１の塩基配列を配列番号１に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ２の塩基配列を配列番号２に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ３の塩基配列を配列番号３に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ４の塩基配列を配列番号４に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ５の塩基配列を配列番号５に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ６の塩基配列を配列番号６に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ７の塩基配列を配列番号７に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ８の塩基配列を配列番号８に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ９の塩基配列を配列番号９に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１０の塩基配列を配列番号１０に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１１の塩基配列を配列番号１１に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１２の塩基配列を配列番号１２に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１３の塩基配列を配列番号１３に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１４の塩基配列を配列番号１４に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１５の塩基配列を配列番号１５に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１６の塩基配列を配列番号１６に示した。
【００８１】
また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１の塩基配列を配列番号５２に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ２の塩基配列を配列番号５３に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ３の塩基配列を配列番号５４に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ４の塩基配列を配列番号５５に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ５の塩基配列を配列番号５６に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ６の塩基配列を配列番号５７に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ７の塩基配列を配列番号５８に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ８の塩基配列を配列番号５９に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ９の塩基配列を配列番号６０に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１０の塩基配列を配列番号６１に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１１の塩基配列を配列番号６２に示した。
【００８２】
〔実験方法〕
上記で作製したプラスミドを用いて以下の実験を行った。
【００８３】
本参考例では、上記プラスミドを細胞に遺伝子導入し、当該プラスミドで形質転換された形質転換細胞を選択し、ＦＩＳＨ法を用いて当該形質転換細胞内のＨＳＲの形成頻度を調べた。
【００８４】
本参考例で用いられている遺伝子導入方法については以下の通りである。まず遺伝子導入に用いるプラスミドをキアゲンプラスミド精製キット（Qiagen Inc., Valencia, CA）を用いて大腸菌より精製した。さらに、上記プラスミドを細胞内に導入する際には、ＤＮＡ精製の過程で混入する大腸菌由来の内毒素をMiraCLEAN（登録商標）endotoxin removalキット（Mirus., Madison,WI）を用いて除去した後に、メーカーの推薦する手法に従って、GenePorter（登録商標） 2 lipofectionキット（Gene Therapy Systems, San Diego,CA）を用いて細胞に遺伝子導入した。
【００８５】
上記の遺伝子導入される細胞は、ヒト大腸癌細胞株であるＣＯＬＯ ３２０ＤＭまたはＣＯＬＯ３２０ ＨＳＲ、若しくはヒト頸癌細胞株であるＨｅｌａである。上記細胞株は「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載の所から取得され、当該記載と同じ条件で培養された。ＣＯＬＯ ３２０ＤＭにはｃ−ｍｙｃ遺伝子の増幅によって多くの内在性のＤＭが生じており、一方、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭと同質遺伝子系統のＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲにはＤＭよりもＨＳＲが多く生じている。
【００８６】
上記形質転換細胞を、遺伝子導入から２日後に、終濃度５μｇ／ｍｌになるようにブラスティサイジンを加えた選択培地で上記細胞を培養することで選択した。選択培地は３日〜５日ごとに培養中の選択培地の半分を、新しく調製した上記選択培地と交換した。
【００８７】
上記ＦＩＳＨ法と、ＦＩＳＨ法に用いる導入遺伝子を検出するためのプローブの調製と、メタフェーズスプレッディング（metaphase spreading）とは、それぞれ培養４、６、または８週後に、培養中の細胞の一部を回収し、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載の方法に従って行われた。また、上記プローブはビオチン化されており、緑色蛍光を発するＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）が結合したストレプトアビジンによって検出することができる。また、赤色蛍光を発するＰＩ（propidium iodide）でＤＮＡを対比染色した。ＦＩＳＨ法によって蛍光標識したスライドガラス上の細胞を、蛍光色素を検出するのに適切なフィルタセットと１００倍の対物レンズ（Nikon Plan Fluor、NA1.30 oil）を設置している倒立蛍光顕微鏡（ECLIPSE TE2000-U、Nikon）を用いて観察し、上記顕微鏡とつながれているFuji FinePix S1Pro digital camera(Fuji Film Co.Tokyo)を用いて、細胞内での導入遺伝子とＤＮＡの態様の写真をデジタル画像として撮影した。得られた、それぞれの画像は画像解析ソフトAdobe（登録商標）Photpshop（登録商標）version 4.0J(Adobe Systems Inc)を用いて合成した。
【００８８】
〔参考例１〕
プラスミドｐＳＦＶｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡｘ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、またはｐＥＰＩ−ＩをＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入した。ｐＳＦＶｄｈｆｒを導入した場合には培養８週間後に、それ以外のプラスミドを導入した場合には培養６週間後に、形質転換細胞を回収した。回収されたそれぞれの形質転換細胞について、ＦＩＳＨ法によってＤＭとＨＳＲとを検出した。
【００８９】
ＤＭおよびＨＳＲをＦＩＳＨ法により検出した結果を図２に示す。図２における「Ａ」および「Ｂ」はｐＳＦＶｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｃ」はｐΔＨｐＡｘ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｄ」はｐＴＨ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｅ」はｐＥＰＩ−Ｉが導入された形質転換細胞の結果をそれぞれ示す。図２において、矢頭はＤＭを示し、矢印はＨＳＲを示す。
【００９０】
種々のＩＲとＭＡＲとの組み合わせを含むｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲを作製し、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭに遺伝子導入し、４、６、または８週間培養後に形質転換細胞を取得した。上記形質転換細胞に生じているＨＳＲをＦＩＳＨ法により調べ、ＨＳＲ発生頻度（Frequency of HSR）をもとめた。その結果を図４に示した。ＨＳＲ発生頻度は、「（ＨＳＲが発生している形質転換細胞数÷形質転換細胞数）×１００」として計算された。図４中のＩＲの欄における「（＋）」および「（−）」は、ＩＲがＢＳＲの転写方向と同じである場合および反対である場合をそれぞれ示す。また、「λ―DNA fragment」はλファージの４３６１ｂｐの遺伝子断片がＩＲの代わりに組み込まれていることを示し、「ｎｏｎｅ」はＩＲを含まないことを示す。
【００９１】
図４によれば、ＩＲとＭＡＲとを有しているプラスミドを遺伝子導入されている形質転換細胞のみにＨＳＲが生じていることが分かる。さらに、ＩＲの代わりにλファージの４３６１ｂｐの遺伝子断片を用いた場合や、ＩＲを用いない場合には、ＨＳＲがほとんど生じていないことから、ＩＲ中にＨＲＳを発生させる活性を有する塩基配列があることが示唆された。
【００９２】
プラスミド（ｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＨｐＡ、ｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖ、ｐＥＰＩ−１、またはｐＴＨ３）を、ＨｅＬａまたはＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、ＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、４週間または８週間選択培地で培養することで、形質転換細胞を選抜した。次に、選抜された形質転換細胞ＨＳＲ発生頻度を調べた。その結果を図５に示した。
【００９３】
図５によれば、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起きるように作製されたｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒを遺伝子導入した場合において、ＨＳＲが生じた。一方、ポリＡ配列を１つ追加して非コード転写と遺伝子複製との間の衝突が起きないように作成したｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒを遺伝子導入した場合には、ＨＳＲが生じなかった。このことは、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起きることでプラスミドが不安定になり、プラスミドは多量体化し、ＨＳＲを生じるということを示唆している。また、非コード転写と遺伝子複製との間の衝突が起きないように作製したｐＴＨ２．ｄｈｆｒが遺伝子導入された場合には、低頻度であるがＨＳＲが生じた。このことは、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起こっていたことが推察される。上記の結果から、ＩＲの両端にポリＡ配列を付加することで、遺伝子複製と非コード転写との間に起こる衝突をなくすことができるということが分かった。
【００９４】
また、転写領域の間に挿入されたＭＡＲが遺伝子複製と哺乳類エピソームの維持に必須であり、ＩＲは必要ではないという文献「Jenke, A. C., Stehle, I. M., Herrmann, F., Eisenberger, T., Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. O., and Lipps, H. J. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11322-11327.」がある。そこで、上記文献で用いられているプラスミド（ｐＥＰＩ−１）とｐＥＰＩ−１と同様の構成のプラスミド（ｐＴＨ３）を作製した。ｐＴＨ３はＡＲ１由来のＭＡＲがＢＳＲ転写領域の内部に存在するプラスミドである。上記プラスミドをＨｅＬａ、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、またはＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入し、ＨＳＲの発生を調べたところ、当該形質転換細胞においてＨＳＲおよびＤＭは全く発生していなかった。一方、極微小物体であるエピソームは確認することができた。このことはＩＲがＨＳＲの発生に必須であることを示唆している。またＩＲは遺伝子複製に関与し、ＨＳＲは遺伝子増幅に関与することから、ＩＲの遺伝子複製と遺伝子増幅とが関連すると考えられる。
【００９５】
〔参考例２〕
遺伝子増幅活性を有するｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片の同定を試みた。すなわち、ＰＣＲを用いてｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）を作製し、当該部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）をそれぞれｐＴＨＶ（図３Ｊ）のＡｓｃ Ｉサイトに挿入し、Ｃ０〜Ｃ１６を含むプラスミド（ｐＣ０〜ｐＣ１６）を作製した（各種プラスミドの項を参照のこと）。
【００９６】
上記各プラスミドを細胞へ導入した場合、組み込まれた部分断片に遺伝子増幅活性があると、ＭＡＲ部位で複製と転写との間で衝突が起こり、当該プラスミドで形質転換された形質転換細胞にＨＳＲが生じる。その反対に、組み込まれた部分断片に遺伝子増幅活性がないと、形質転換細胞にＨＳＲが生じない。このことを利用することによって、遺伝子増幅活性を有するｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片の同定を試みた。ここで上記の同定方法を便宜上「プラスミド安定化分析法」と称する。
【００９７】
上記ｐＣ０〜ｐＣ１６、陽性対照としてｃ−ｍｙｃのＩＲの全長を含むプラスミド（「ｐＣｆ．Ｉ」）、または陰性対照としてｃ−ｍｙｃのＩＲを含まないプラスミド（「ｐＴＨＶ」）をそれぞれＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入し６週間選択培地で培養することで形質転換細胞を取得した。取得された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度（Frequency of HSR）を既述の方法により調べた。
【００９８】
その結果を図６に示した。図６Ａはｃ−ｍｙｃ遺伝子座（Genbank HSMYCC; accession number X00364）の概略図である。ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のHind III-Xho I断片（２３４９ｂｐ）の相当する。図６ＢおよびＣは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲ全長と、その部分断片であるＣ０〜Ｃ１６との位置関係、並びに各部分断片が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示している。また図６中の「□（白四角）」はｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲにおけるtopoisomeraseII結合領域の位置を示し、「◆（黒ひし）」はDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）の位置を示し、「○（白丸）」はプラスミドの自己複製を助けると報告されている、ヒトの３６ｂｐのコンセンサス配列の内のコア２０ｂｐに相当する配列の位置をそれぞれ示している。また、「ｃI」はDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）を含む遺伝子増幅活性を有する塩基配列の位置、「ｃII」はtopoisomeraseII結合領域を含む遺伝子増幅活性を有する塩基配列の位置、「ｃII’」はCIIに類似した配列の位置、「N」はネガティブ領域（ＨＳＲ形成を抑制する領域）の位置をそれぞれ示している。
【００９９】
図６ＢおよびＣによれば、ｐＣ３、ｐＣ1、ｐＣ１２を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度が顕著に高く、また陽性対照のそれよりも多いことが分かった。またｐＣ２またはｐＣ７を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度は、陽性対照のそれと同等であった。またｐＣ９またはｐＣ６を遺伝子導入して得られた形質転換細胞についてＨＳＲの発生が観察された。特にこの検討によって全長のＩＲに代えてＩＲの部分断片（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ１２）を用いた場合にＨＳＲ発生頻度がさらに高くなるという、新規知見が得られた。
【０１００】
〔参考例３〕
遺伝子増幅活性を有するＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲの部分断片の同定を行った。ＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲを用いた以外は、参考例２と同様にした。すなわち、ＰＣＲを用いてＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲの部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）を作製し、当該部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）をそれぞれｐＴＨＶ（図３Ｊ）のＡｓｃ Ｉサイトに挿入し、Ｄ１〜Ｄ１１を含むプラスミド（ｐＤ１〜ｐＤ１１）を作製した（各種プラスミドの項を参照のこと）。陽性対照としてＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲの全長を含むプラスミド（「ｐＤｆ．Ｉ」）を採用し、また陰性対照としてＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲを含まないプラスミド（「ｐＴＨＶ」）を採用した。
【０１０１】
本実施例の結果を図７に示す。図７にはＤＨＦＲ遺伝子座（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の概略図が示されており、ＤＨＦＲ遺伝子座のBamHI-Hind III断片（４．６ｋｂｐ）がＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲに相当する。また図７には、ＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲ全長とその部分断片であるＤ０〜Ｄ１１との位置関係、並びに各部分断片が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す。
【０１０２】
図７によれば、ｐＤ１を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度が最も高く、また陽性対照のそれよりも多いことが分かった。またｐＤ４を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度は、陽性対照のそれと同等であった。またｐＤ８、ｐＤ９、ｐＤ２またはｐＤ３を遺伝子導入して得られた形質転換細胞についてＨＳＲの発生が観察された。特にこの検討によって全長のＩＲに代えてＩＲの部分断片（Ｄ１）を用いた場合にＨＳＲ発生頻度がさらに高くなるという、新規知見が得られた。
【０１０３】
なお、図７中□（白四角）はtopoisomeraseII結合領域を示し、図７中◆（黒ひし形）はDuplex Unwinding Elementを示し、図７中＝（二重線）は湾曲ＤＮＡ（ｂｅｎｔ ＤＮＡ）を示し、図７中△（白三角）はＲＩＰ６０結合領域を示し、図７中「ＡＴ」はＡＴ−ｒｉｃｈエレメントを示す。
【０１０４】
＜実施例＞
〔実施例１〕
特開昭６３−１８５３９６号公報に記載のEPO782SVBPVプラスミドに含まれるエリスロポエチン遺伝子を、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターを有するプラスミド（pCMV Vector（4.01kbp）、参考文献：米国特許5168062号、米国特許5385839号、またはBoshart,M.,et al., Cell vol.41,p521-530(1985)）、ＳＲαプロモーターを有するプラスミド（pSRα Vector（5.22kbp）、参考文献：YUTAKA TATEBE et al., Mol.Cell.Biol.vol.8, p466-472(1988)）、シミアンウイルス４０初期プロモーターを有するプラスミド（pSV40 Vector（14.09kbp）、参考文献：Buchman,A.R. et al., Mol.Cell.Biol.vol4, p1900-1914(1984)）のＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトにそれぞれ連結してpCMV-EPO(4.78kbp)、pSRα-EPO(5.99kbp)、pSV40-EPO(4.40kbp)をそれぞれ構築した（図８を参照のこと）。
【０１０５】
ＩＲ／ＭＡＲベクターとして特開２００４−３３７０６６号公報に記載されているpΔBN.AR1(8.92kbp)を用いた（図９を参照のこと）。pΔBN.AR1(8.92kbp)は、ブラスティサイジン耐性遺伝子とブラスティサイジン耐性遺伝子の下流に強いＭＡＲ活性を示す配列(ＡＲ１)およびＤＨＦＲ由来の全長ＩＲを有しており、このプラスミドで哺乳動物細胞をコトランスフェクトすることによって、目的遺伝子が染色体に組み込まれたＨＳＲ産生が増大することが明らかになっている。
【０１０６】
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞、入手先：理化学研究所バイオリソースセンター: RCB0285）を、２４穴培養プレート（SUMILON社製:MS-80240）で４×１０4cells/wellになるまで培養した。その際DMEM/F-12培地(GIBCO社製:12400-024)に１０％牛胎児血清(GIBCO社製:2614-079)を添加した培地を使用した。
【０１０７】
エリスロポエチン遺伝子を含むプラスミド（pCMV-EPO(4.78kbp)、pSRα-EPO(5.99kbp)、またはpSV40-EPO(4.40kbp)）に対するpΔBN.AR1のモル比がそれぞれ０．３、１．５、３、５となるような条件で、エリスロポエチン遺伝子を含むプラスミド（pCMV-EPO(4.78kbp)、pSRα-EPO(5.99kbp)、またはpSV40-EPO(4.40kbp)）とpΔBN.AR1とをLipofectamine2000試薬(Invitrogen社製：11668-019)を用いて、上記ＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクションで導入した。
【０１０８】
トランスフェクションから２日後にブラスティサイジン(Invivogen社製:ant-bl-1)を５μg/mlの濃度となるように培地に添加し、２週間、３７℃で培養し安定な形質転換細胞を取得した。次に、細胞培養シャーレ内径６０ｍｍ(SUMILON社製:MS-11600)レベルまで、拡大培養後、段階的にブラスティサイジン濃度を高めていき、最終濃度３２０μg/mlで安定して生育できる細胞が得られるまで培養を続けた。
【０１０９】
このようにして得られた細胞からゲノムＤＮＡを取得し、エリスロポエチン遺伝子のＤＮＡコピー数の増加を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ABI社製:7900HT）を用いて確認した。測定試薬にはSYBR Green Realtime PCR Master Mix(東洋紡社製:QPK-201)を使用した。
【０１１０】
上記のようにして遺伝子増幅を確認した後、ブライスティサイジン３２０μg/mlを添加して３日間培養した上清を取得し、イムノエリット・ＥＰＯ測定キット(東洋紡社製: LEPO-592)を用いてＥＩＡ法でエリスロポエチン濃度を測定した。具体的には、培養上清をイムノエリット・ＥＰＯ測定キット付属の希釈液で１０００倍希釈し、抗エリスロポエチン抗体結合プレートに２５μl/well添加した。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗エリスロポエチン抗体を７５μl/well添加し、３０℃で２時間インキュベートした。その後、プレートをイムノエリット・ＥＰＯキット付属の洗浄液で３回洗浄し完全に水分を除き、発色試薬１００μl/wellを添加して室温で３０分間反応させた。反応停止液１００μl/wellを添加して反応を止め、プレートリーダー（主波長４９０ｎｍ、副波長６５０ｎｍ）で吸光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとにエリスロポエチン濃度を算出した。
【０１１１】
その結果を図１０および表１に示す。なお図１０は、表１のデータを棒グラフで示したものである。図１０および表１中の「モル比」は第２ベクターに対する第１ベクターのモル比を示し、「ＥＰＯ濃度(U/ml)」はエリスロポエチン濃度を示す。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
pSRα-EPOとpΔBN.AR1とをＣＨＯ-Ｋ１細胞に導入した場合、pSRα-EPOに対するpΔBN.AR1のモル比が１．５の時にエリスロポエチン濃度が最高値を示した。また、pCMV-EPOとpΔBN.ARとをＣＨＯ-Ｋ１細胞に導入した場合は、pCMV-EPO に対するpΔBN.AR1のモル比が３．０の時にエリスロポエチン濃度が最高値を示した。また、pSV40-EPOとpΔBN.ARとをＣＨＯ-Ｋ１細胞に導入した場合は、pSV40-EPOに対するpΔBN.AR1のモル比が３．０の時にエリスロポエチン濃度が最高値を示した。
【０１１４】
よって、エリスロポエチン遺伝子を含むベクター（第２ベクターに相当する）に対するＩＲ／ＭＡＲベクター（第１ベクターに相当する）のモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入することが極めて有効であることが確認できた。
【０１１５】
〔実施例２〕
実施例１においてpSRα-EPOに対するpΔBN.AR1のモル比が１．５となるような条件で遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を限界希釈法でクローニング行い、１４日間培養後、比較的増殖能の良好なクローンを選抜した。そのクローンを細胞培養シャーレ内径６０ｍｍ(SUMILON社製:MS-11600)レベルまで拡大培養し、拡大培養３日間後、イムノエリット・ＥＰＯ測定キット(東洋紡社製: LEPO-592)を用いてＥＩＡ法でエリスロポエチン濃度を測定した。なお、pSRα-EPOを単独で導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陰性対照とした。
【０１１６】
その結果を図１１、並びに表２および３に示した。なお図１１（Ａ）および表２はpSRα-EPOとpΔBN.AR1とを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞の結果を示し、図１１（Ｂ）および表３は陰性対照の結果を示す。図１１、並びに表２および３中の「Clone」はクローニングされたクローン名を示し、「ＥＰＯ濃度(U/ml)」はエリスロポエチン濃度を示す。また表２および３中の「copy数」はエリスロポエチン遺伝子のコピー数を示す。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
クローニング前の未クロ−ニング細胞のエリスロポエチン濃度レベルを図１１中矢印で示した。図１１、並びに表２および３によればpΔBN.AR1とpSRα-EPOとをコトランスフェクションで導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、未クローニング細胞よりも高いエリスロポエチン発現量を示すクローン（「高発現クローン」という）の出現率が６０％（＝９÷１５×１００）であった。これに対して陰性対象の場合は高発現クローンの出現率が２０％（＝３÷１５×１００）であった。よってpΔBN.AR1とpSRα-EPOとを所定の条件でコトランスフェクションすることによって、高確率で高発現クローンを取得できるということが判明した。
【０１２０】
次に実施例１においてpCMV-EPOに対するpΔBN.AR1のモル比が３となるような条件で遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞についても上記と同様にして、限界希釈法によるクローニングおよび培養後、エリスロポエチン濃度を測定した。なお、pSRα-EPOが単独で導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陰性対照とした。
【０１２１】
その結果を図１２、並びに表４および５に示した。なお図１２（Ａ）および表４はpCMV-EPO とpΔBN.AR1とを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞の結果を示し、図１２（Ｂ）および表５は陰性対照の結果を示す。図１２、並びに表４および５中の「Clone」はクローニングされたクローン名を示し、「ＥＰＯ濃度(U/ml)」はエリスロポエチン濃度を示す。また表４および５中の「copy数」はエリスロポエチン遺伝子のコピー数を示す。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
クローニング前の未クロ−ニング細胞のエリスロポエチン濃度レベルを図１２中矢印で示した。図１２、並びに表４および５によればpΔBN.AR1とpSRα-EPOとをコトランスフェクションで導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、未クローニング細胞よりも高いエリスロポエチン発現量を示すクローン（「高発現クローン」という）の出現率が３０％（＝６÷２０×１００）であった。これに対して陰性対象の場合は高発現クローンの出現率が１５％（＝３÷２０×１００）であった。よってpΔBN.AR1とpCMV-EPとを所定の条件でコトランスフェクションすることによって、高確率で高発現クローンを取得できることが判明した。
【０１２５】
〔実施例３〕
本実施例では、参考例２において使用したｐＣ１２（図１４（Ａ）を参照のこと）におけるＳＲαプロモーター（図１４（Ａ）において「ＰＳＲα」で示す）を、ＳＶ４０初期領域由来プロモーター領域（以下、単に「ＳＶ４０プロモーター」という）に置換したｐＣ１２.Ｐｓｖ４０（図１４（Ｂ）に示す）を使用した。図１４（Ｂ）においてＳＶ４０プロモーターを「Ｐｓｖ４０」として示す。ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０の作製方法は以下の通りである。
【０１２６】
まずｐＣ１２をＥｃｏ ＲＩおよびＸｈｏ Ｉで制限酵素消化することによりＳＲαプロモーター領域を切り出した。切り出した部位へ、マルチクローニングサイトを含む合成オリゴヌクレオチド（ＥＳＭＸリンカー）を挿入した。このマルチクローニングサイトの制限酵素サイトはアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐR）の下流(すなわちＳＲαプロモーターがあった部位)に位置しており、制限酵素サイトが５’末端から３’末端にかけてＥｃｏ ＲＩ−Ｓａｌ Ｉ−Ｍｌｕ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉの順番で配列している。なおＥＳＭＸリンカーの塩基配列を、表６および配列番号８５および配列番号８６に示した。上記のようにして作製したプラスミドをＳａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化した。その後、Ｓａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化したＳＶ４０プロモーターを、上記プラスミドに挿入し、ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０を構築した。ＳＶ４０プロモーターは、ＢＳＲを転写する方向でプラスミドに挿入された。
【０１２７】
なお、ＳＶ４０プロモーターは下記のようにして作製された。ｐＭＡＣＳ４．１(Mitenyi Biotech社製)を鋳型として、ＳＶ４０プロモーター増幅用プライマー（MACS4.1 4288LおよびMACS4.1 1454R）を用い、ＰＣＲ法により増幅した。増幅されたＳＶ４０プロモーターは、Ｓａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化して使用した。ＳＶ４０プロモーター増幅用プライマーであるMACS4.1 4288L（配列番号８７）およびMACS4.1 1454R（配列番号８８）の塩基配列を表１に示す。ＳＶ４０プロモーターの塩基配列を配列番号８９に示し、ＳＲαプロモーターの塩基配列を配列番号９０に示した。
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
抗Pyrococcus kodakaraensis KOD1株由来のDNAポリメラーゼに対する抗体（「抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体」という）を産生するマウスハイブリドーマ細胞（入手先：生命工学工業技術研究所、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５７）から、RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製、74134)を用いてトータルＲＮＡを抽出し、Rever Tra Ace-α-(東洋紡社製、FSK-101)を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。抗ＫＯＤ ＤＮＡ ポリメラーゼ抗体のシグナル配列を除く重鎖と軽鎖を特異的に増幅するプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、それぞれの増幅産物にイムノグログリン κ鎖由来のシグナル配列を付加した後、ＣＭＶプロモーターを有するプラスミドのＸｂａ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉサイトに連結してpCMV-H（図１３（Ａ）を参照のこと）およびpCMV-L（図１３（Ｂ）を参照のこと）を構築した。
【０１３０】
pCMV-HおよびpCMV-Lを、ＩＲ／ＭＡＲベクターとともにＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクトした。この時、pCMV-HおよびpCMV-Lの合計のモル数に対するＩＲ／ＭＡＲベクターのモル比は３であった。トランスフェクションは、Lipofectamine2000試薬(Invitrogen社製：11668-019)を用いて行われた。なおＩＲ／ＭＡＲベクターにはpΔBN.AR1またはpC12.Psv40（4920bp）を用いた（図１４を参照のこと）。
【０１３１】
トランスフェクションから２日後にブラスティサイジン(Invivogen社製:ant-bl-1)を５μg/mlの濃度となるように培地に添加し、２週間、３７℃で培養し安定な形質転換細胞を取得した。
【０１３２】
次に、細胞培養シャーレ内径６０ｍｍ(SUMILON社製:MS-11600)レベルまで、拡大培養後、段階的にブラスティサイジン濃度を高めていき、最終濃度３２０μg/mlで安定して生育できる細胞が得られるまで培養を続けた。
【０１３３】
上記で取得した細胞集団を限界希釈法でクローニングした後、培養上清を取得しＥＩＡ法で抗体濃度を測定した。詳細には、ヤギ抗マウス抗体を固相化したＥＬＩＳＡ用プレート(SUMILON社製:MS-8896F)に、１０ｍＭ ＰＢＳ(−)で５倍希釈した培養上清を添加し３５℃で２時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１０％ヤギ血清で４０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体を、５０μl/wellとなるようにＥＬＩＳＡ用プレートに添加し３５℃で２時間インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡ用プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し完全に水分を除き、発色試薬５０μl/wellを添加して室温で１５分間反応させた。１Ｎ硫酸溶液５０μl/wellを添加して反応を止め、プレートリーダー（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。
【０１３４】
その結果を図１５、並びに表７〜９に示す。なお、ＩＲ／ＭＡＲベクターが導入されずにpCMV-HおよびpCMV-Lのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陰性対照とした。図１５（Ａ）および表７はＩＲ／ＭＡＲベクターとしてpΔBN.AR1を用いた場合の結果を示し、図１５（Ｂ）および表８はＩＲ／ＭＡＲベクターとしてpC12.Psv40を用いた場合の結果を示し、図１５（Ｃ）および表９は陰性対照の結果を示す。図１５、並びに表７〜９中の「Clone」はクローニングされたクローン名を示し、「抗体濃度(μｇ/L)」は抗体濃度を示す。
【０１３５】
【表７】
【０１３６】
【表８】
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
クローニング前の未クロ−ニング細胞の抗体濃度レベルを図１５中矢印で示した。図１５、並び表７〜９によれば、pCMV-HおよびpCMV-LをＩＲ／ＭＡＲベクターとともに導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、未クローニング細胞よりも高い抗体発現量を示すクローン（「高発現クローン」という）の出現率が９５％（＝１９÷２０×１００）であった。これは、ＩＲ／ＭＡＲベクターとして、全長のＩＲを備えるpΔBN.AR1、および遺伝子増幅活性部位を有するＩＲの部分断片を備えるpC12.Psv40のいずれを採用した場合も同じであった。これに対して陰性対象の場合は高発現クローンの出現率が２５％（＝５÷２０×１００）であった。よってpCMV-HおよびpCMV-Lを、ＩＲ／ＭＡＲベクターとをコトランスフェクションすることによって、高確率で高発現クローンを取得できることが判明した。特にpC12.Psv40を用いた場合は、pΔBN.AR1場合に比して、抗体の生産量が高いクローンを多く取得することができるという興味深い結果が得られた。
【０１３９】
〔実施例４〕
６×ヒスチジンタグに対する抗体（「抗ヒスチジンタグ抗体」）を産生するマウスハイブリドーマ細胞構築し、当該ハイブリドーマ細胞からRNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製: 74134)を用いてトータルRNAを抽出しRever Tra Ace-α-（東洋紡社製: FSK-101）を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。Mouse Ig-Primer Sets(Novagen社製: 69831-3)の5’プライマーと、抗体遺伝子全長を増幅する3’プライマーを用いてＰＣＲ増幅し増幅産物を得た。なお、ＰＣＲにはＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製：KFX-101）を使用した。
【０１４０】
ヒト伸長因子１−αプロモーター（「ＥＦ１αプロモーター」）を含む発現ベクター（ｐＥＦ１α）に、抗ヒスチジンタグ抗体のＨ鎖をコードする遺伝子およびびＬ鎖コードする遺伝子をタンデムに連結し、抗ヒスチジンタグ抗体遺伝子を増幅するベクターｐＥＦ１α-ＨＬを構築した（図１６を参照）。なおｐＥＦ１αは、特許文献 特許第３０５１４１１号公報に記載のＥＦ１αプロモーターを、ｐＣＩ−ｎｅｏ(Promega社)ベクターのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに導入することで構築された。
【０１４１】
ＩＲ／ＭＡＲベクターとしてpC12.Psv40を用い、抗ヒスチジンタグ抗体の遺伝子を含むプラスミドｐＥＦ１α-ＨＬに対するpC12.Psv40のモル比がそれぞれ０．３、１．５、３、５となるような条件で、抗ヒスチジンタグ抗体の遺伝子を含むプラスミドｐＥＦ１α-ＨＬとpC12.Psv40とをLipofectamine2000試薬(Invitrogen社製：11668-019)を用いて、上記ＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクションで導入した。
【０１４２】
トランスフェクションから２４時間後に培養上清を回収しＥＬＩＳＡ法で抗体生産性を調べた。１０μg/mlの６×ヒスチジンタグを付加したサルコシンオキシダーゼ抗原を５０μl/wellとなるようにＥＬＩＳＡ用プレート(SUMILON社製:MS-8896F)に分注し、３５℃で２時間インキュベートした後、０．１％（ｗ/ｖ）Tween入りＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で３回洗浄した。３００μl/wellの１％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ入りＰＢＳをＥＬＩＳＡ用プレートに分注し、４℃で一晩放置して、抗原固相化プレートを作製した。
【０１４３】
０．１％（ｗ/ｖ）Tween入りＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で３回洗浄後、ＰＢＳで５倍希釈した細胞培養液上清５０μl/wellをＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、３５℃で２時間インキュベートした。続いて０．１％（ｗ/ｖ）Tween入りＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で３回洗浄後、１％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ入りＰＢＳで４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗体(DAKO社製: P0161)を５０μl/wellとなるようにＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、３５℃で２時間インキュベートした。０．１％（ｗ/ｖ）Tween入りＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で４回洗浄後、ＴＭＢ発色試薬５０μl/wellをＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、室温で５分間反応させた。１Ｎ硫酸溶液５０μl/wellを添加して反応を止め、プレートリーダー（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。
【０１４４】
その結果を図１７に示す。なお図１７中の「モル比」は第２ベクターに対する第１ベクターのモル比を示し、「抗体濃度(μｇ/L)」は抗体濃度を示す。図１７によれば、抗ヒスチジンタグ抗体遺伝子を増幅するベクターｐＥＦ１α-ＨＬとpC12.Psv40とをＣＨＯ-Ｋ１細胞に導入した場合、ｐＥＦ１α-ＨＬに対するpC12.Psv40のモル比が１．５の時に抗ヒスチジンタグ抗体の濃度が最高値を示したことがわかる。
【０１４５】
〔実施例５〕
実施例３に記載の抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から、RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製：74134)を用いてトータルＲＮＡを抽出し、Rever Tra Ace-α-(東洋紡社製：FSK-101)を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体のシグナル配列を除くＨ鎖とＬ鎖とを特異的に増幅し得るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。それぞれのＰＣＲ増幅産物にイムノグログリン κ鎖由来のシグナル配列を付加した後、ＳＲαプロモーターを有するプラスミド（pSRα Vector（5.22kbp）のＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに連結してpSRα-HおよびpSRα-Lを構築した。
【０１４６】
pSRα-HおよびpSRα-LをpΔBN.AR1とともにチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞、入手先：理化学研究所バイオリソースセンター RCB1637）、ヒト子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ Ｓ３細胞、入手先：理化学研究所バイオリソースセンター RCB0191）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−７細胞、入手先：理化学研究所バイオリソースセンター RCB0539）それぞれにコトランスフェクトした。この時、pSRα-HおよびpSRα-Lの合計のモル数に対するＩＲ／ＭＡＲベクターのモル比は１．５であった。また実施例３で構築したpCMV-HおよびpCMV-Lについても上記と同様にコトランスフェクトした。この時、pCMV-HおよびpCMV-Lの合計のモル数に対するＩＲ／ＭＡＲベクターのモル比は３であったなお、ＩＲ／ＭＡＲベクターが導入されずにpCMV-HおよびpCMV-Lのみを導入した場合を陰性対照とした。
【０１４７】
トランスフェクション２日後にブラスティサイジン(Invivogen社製:ant-bl-1)を5μg/mlの濃度で培地に添加して、３〜４日間隔で培地を入れ替えながら２週間培養し、安定な形質転換体を得た。次に、細胞培養シャーレ内径６０ｍｍ(SUMILON社製:MS-11600)レベルまで、拡大培養後、段階的にブラスティサイジン濃度を高めていき、最終濃度３２０μg/mlで安定して生育できる細胞が得られるまで培養を続けた。
【０１４８】
このようにして得られた未クローニング細胞にブライスティサイジン320μg/mlを培地に添加して４日間培養した。この培養液上清を取得し、実施例３に記載した方法と同様にしてＥＬＩＳＡ法で抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体の濃度を測定した。
【０１４９】
その結果を図１８および表１０に示した。図１８および表１０中「pCMV−HL(without IR/MAR)」は陰性対照の結果を示し、「pCMV−HL(with IR/MAR)」はpCMV-HおよびpCMV-LをpΔBN.AR1とともに各種細胞へ導入した結果を示し、「pSRα−HL(with IR/MAR)」はpSRα−HおよびpSRα−LをpΔBN.AR1とともに各種細胞へ導入した結果を示す。図１８の「抗体濃度(μｇ/L)」および表１０中の数値は、抗体濃度を示す。
【０１５０】
【表１０】
【０１５１】
図１８および表１０の結果から、ＩＲ／ＭＡＲベクターと抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体遺伝子を含むプラスミドとを用いた遺伝子発現は、様々な哺乳類宿主細胞に適用可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
上記説示したように、本発明によれば、目的遺伝子の導入効率および発現効率が高く、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が高い哺乳動物細胞の形質転換方法を提供し、医薬品等の有用タンパク質の生産コストを低下させることができる。なお、本発明において利用するＩＲ／ＭＡＲベクターを用いた高度遺伝子増幅系は、宿主細胞は特に限定されず、広範な哺乳動物細胞を利用することができる。
【０１５３】
したがって、本発明はタンパク質の生産を行う産業、例えば、医薬品、化学、食品、化粧品、繊維等種々広範な産業において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ＩＲ／ＭＡＲベクターによってＤＭおよびＨＳＲが生じるメカニズムを示す模式図である。
【図２】ベクターによって形質転換されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭに生じたＤＭおよびＨＳＲをＦＩＳＨ法によって検出した蛍光顕微鏡像であり、ＡおよびＢはｐＳＦＶｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＣはｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＤはｐＴＨ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＥはｐＥＰＩ−Ｉが導入された形質転換細胞の結果を示す。
【図３】実施例および参考例において使用されている各種プラスミドの概略図である。
【図４】参考例１においてｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲプラスミドが遺伝子導入されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭに生じたＨＳＲの頻度を示す棒グラフである。
【図５】プラスミド（ｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＨｐＡ、ｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖ、ｐＥＰＩ−１、またはｐＴＨ３）が導入された、ＨｅＬａ（図５（Ａ））、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ（図５（Ｂ））、またはＣＯＬＯ３２０ＤＭ（図５（Ｃ））のＨＳＲ発生頻度を示す棒グラフである。
【図６】参考例２の結果を示す図であり、（Ａ）はｃ−ｍｙｃ遺伝子座（GenBank HSMYCC; accession number X00364）の概略図であり、（Ｂ）および（Ｃ）はｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲ全長とその部分断片Ｃ０〜Ｃ１６との位置関係を示す図、並びに上記部分断片を含むプラスミド（ｐＣ０〜ｐＣ１６）が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す図である。
【図７】参考例３の結果を示す図であり、ＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の概略図、ＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲ全長とその部分断片Ｃ０〜Ｃ１１との位置関係を示す図、および各部分断片を含むプラスミドが導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す図である。
【図８】実施例において使用したベクターの構築方法の概略を示す図である。
【図９】pΔBN.AR1の模式図である。
【図１０】エリスロポエチン遺伝子を含むプラスミド（pCMV-EPO(4.78kbp)、pSRα-EPO(5.99kbp)、またはpSV40-EPO(4.40kbp)）およびpΔBN.AR1がコトランスフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞のエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフである。
【図１１】（Ａ）はpSRα-EPOおよびpΔBN.AR1がコトランフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンのエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフであり、（Ｂ）はpSRα-EPOのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンのエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフである。
【図１２】（Ａ）はpCMV-EPOおよびpΔBN.AR1がコトランフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンのエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフであり、（Ｂ）はpCMV-EPOのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンのエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフである。
【図１３】（Ａ）はpCMV-Hの模式図であり、（Ｂ）はpCMV-Lの模式図である。
【図１４】（Ａ）はpc12の模式図であり、（Ｂ）はpC12.Psv40の模式図である。
【図１５】（Ａ）はpCMV-HおよびpCMV-LとpΔBN.AR1とがコトランスフェクションによりＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンの抗体生産量を示す棒グラフであり、（Ｂ）はpCMV-HおよびpCMV-LとpC12.Psv40とがコトランスフェクションによりＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンの抗体生産量を示す棒グラフであり、（Ｃ）はpCMV-HおよびpCMV-Lのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンの抗体生産量を示す棒グラフである。
【図１６】ｐＥＦ１α-ＨＬの模式図である。
【図１７】ｐＥＦ１α-ＨＬとpC12.Psv40とがコトランスフェクションにより導入されたＣＨＯ-Ｋ１細胞の抗体生産量を示す棒グラフである。
【図１８】pSRα-HおよびpSRα-Lと、pΔBN.AR1とがコトランスフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞、またはＣＯＳ−７細胞の抗体生産量；pCMV-HおよびpCMV-Lと、pΔBN.AR1とがコトランスフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞、またはＣＯＳ−７細胞の抗体生産量；並びにpCMV-HおよびpCMV-Lのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞、またはＣＯＳ−７細胞の抗体生産量を示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞を用いて、所望の分泌タンパク質をを高度に生産するための技術に関する。より具体的には、本発明者らが開発した「高度遺伝子増幅系」を用いて所望の目的遺伝子（所望の分泌タンパク質をコードする遺伝子）を増幅および発現させ、所望の分泌タンパク質を生産する際に、遺伝子導入効率および遺伝子増幅効率を向上させることができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、微生物、植物、酵母、昆虫細胞、及び哺乳類細胞が、大量の望ましいタンパク質の発現の宿主として使用されている。多くの種類の発現系の中で、微生物は発現系として最も容易に使用され、多くの種類の微生物系が研究され利用されている。しかしながら、微生物発現系の使用はいくつかの問題点が存在する。まず、遺伝子は微生物において発現され得るが、微生物はタンパク質発現や、例えばグリコシル化、リン酸化及びアミジル化のようなタンパク質修飾機序に関して異なる機序を有するため、発現されたタンパク質の構造および特性は動物タンパク質の構造および特性とは大きく異なる。よって、微生物を用いた組換えタンパク質生産は、元来修飾をほとんどされていないタンパク質、またはタンパク質の修飾や構造がその機能にあまり影響を受けないタンパク質の生産に限定されていた。
【０００３】
そのため、動物のタンパク質生産には哺乳動物細胞が適している。外来性遺伝子が哺乳動物細胞で発現される場合、外来性遺伝子は選抜マーカーを有するベクターとコトランスフェクトされ、形質転換された細胞を選択培地で長時間培養することにより選別する。しかしながら高度に発現する細胞クローンを取得する頻度は低いというのが現状である。外来遺伝子は染色体への挿入されるものの、遺伝子の発現は挿入部位に依存するので、外来遺伝子の発現が予測できない（非特許文献１〜３を参照のこと）。よって、外来性遺伝子は安定して染色体に挿入されたとしても、哺乳動物細胞において多くの外来性遺伝子発現は近隣の核酸により阻止されてしまうために、少量しか発現できない場合がある（非特許文献４および５を参照のこと。）。
【０００４】
上述のごとく、哺乳動物細胞では外来性遺伝子の発現量が少ないとい問題を解決するために、種々の遺伝子発現系が開発された。例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸リダクターゼ）に対する阻害剤であるメトトレキセート（以下「ＭＴＸ」という）を含有する培地でチャイニーズハムスター卵巣細胞（以下「ＣＨＯ細胞」という）の細胞株を培養し、ＭＴＸの濃度に依存して生存し、遺伝子のコピー数の増加によりタンパク質を高度に発現するＣＨＯ細胞株を得る方法が知られている（例えば非特許文献７および８、特許文献２および３を参考のこと）。この方法は、現在広く利用され重要な技術となっているが、適用できる宿主細胞がＣＨＯ細胞に限られ、汎用性に欠けるという問題点がある。この問題点は、哺乳動物細胞内において医薬品等の有用タンパク質を生産する上での大きな障害となる。
【０００５】
さらに上述した従来技術は、取り扱いが困難なＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等の特殊なＣＨＯ細胞に宿主細胞が限られる上に、選択薬剤であるＭＴＸの毒性作用を考慮しつつ濃度を少しずつ増加させながら細胞を選択していかなければなければならない等の配慮が必要であるため、経験および熟練を必要とする。しかも、発現させたいタンパク質を細胞内に蓄積させた場合には、細胞内に蓄積したタンパク質を取得するために細胞破砕の工程が必要な上、破砕の際にタンパク質が変性する恐れもある。
【０００６】
さらに哺乳動物細胞を用いた組換えタンパク質の発現は、微生物を用いた組換えタンパク質の発現に比して発現効率が低く、さらに培地コストが高いためにタンパク質の生産コストがより高くなるという問題がある。さらに、有用タンパク質を高生産する哺乳動物細胞クローンを選抜するには莫大な時間を必要としていた。このため、哺乳動物細胞を用いた組換えタンパク質の生産においては、少しでもタンパク質の発現効率、および所望のタンパク質を高生産するクローンの選択効率を高めることによって、タンパク質の生産コストを下げる必要があった。
【０００７】
ところで本発明者らは、哺乳動物の複製開始領域（ＩＲ；Initiation Region）と核マトリックス結合領域（ＭＡＲ； Matrix Attachment Region）とを持つプラスミド（以下「ＩＲ／ＭＡＲベクター」または「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」という）をヒト由来がん細胞（COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（ブラスティサイジン（Blasticidine）あるいはネオマイシン（Neomycine））を利用して選択するだけで、
(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子（以下「目的遺伝子」という）の細胞内コピー数を１万コピー程度にまで増幅できること、および、
(2)目的遺伝子はＩＲ／ＭＡＲベクターに対して同一の遺伝子構築物（シス）として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物（トランス）として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを発見した（特許文献１および非特許文献６参照）。そして、本発明者は当該知見に基づいて、ＩＲ／ＭＡＲベクターと目的遺伝子とを、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来がん細胞（COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株）、ＣＨＯ細胞等）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（BlasticidineあるいはNeomycine）を利用して選択するだけで、目的遺伝子を１万コピー程度に増幅できる系（「高度遺伝子増幅系」という）を完成させるに至った。
【０００８】
ここで、染色体外のダブルマイニュート染色体（以下「ＤＭ」という）と染色体の均一染色領域（以下「ＨＳＲ」という）がＩＲ／ＭＡＲベクターによって生じるメカニズムを図１に示す。ＩＲ／ＭＡＲベクターは宿主細胞内で直列に反復してつながることで多量体化する（Ｓｔｅｐ１）。この多量体は細胞が成長している間は宿主細胞内で安定して存在し、自己複製を行う。上記多量体がそのまま大きくなるか、宿主細胞内に元から存在するＤＭに取り込まれることでＤＭが発生する。また、Ｓｔｅｐ２のように多量体の環状ＤＮＡは宿主細胞内でＤＮＡ２本鎖が切断され（ＤＳＢ;double strand breakage）、直鎖状ＤＮＡになる。すると、当該直鎖状ＤＮＡはクロモソームに組み込まれ、Ｓｔｅｐ３のようなＢＦＢ（Breakage-Fusion-Bridge）サイクルが開始され、ＨＳＲが生じる。
【特許文献１】特開２００３−２４５０８３号公報（公開日：平成１５（２００３）年９月２日）
【特許文献２】国際公開第９６／０９３８３号パンフレット（国際公開日：１９９６年３月２８日）
【特許文献３】特表平８−５０３６１５号公報（公表日：平成８年（１９９６）４月２３日）
【非特許文献１】Grindley et al. Trends Genet.3:16-22(1987)
【非特許文献２】Kucherlapati et al. Crit.Rev.Biochem.16:349-381(1984)
【非特許文献３】Palmiter et al. Annu.Rev.Genet.20:465-499(1986)
【非特許文献４】Eissenberg et al. Trends Genet.7:335-340(1991)
【非特許文献５】Palmiter et al. Annu.Rev.Genet.20:465-499(1986)
【非特許文献６】Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.
【非特許文献７】Nunberg et al., Proc.Natl.Acad.Sci,75:5553-5556(1978)
【非特許文献８】Page et al., Biotechnology, 9:64-68(1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のごとく、従来公知の哺乳動物細胞を用いたタンパク質生産系では、宿主細胞が限定される、操作が煩雑で熟練を要する等の様々の問題点があった。
【００１０】
そこで本発明は、かかる従来技術の課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明の目的は、広範な哺乳動物細胞を宿主細胞として利用することができ、遺伝子の導入効率および発現効率が高く、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が高い哺乳動物細胞の形質転換方法を提供し、医薬品等の有用タンパク質の生産コストを低下させることである。また本発明は、目的タンパク質（発現させる所望のタンパク質）の精製を容易にして有用タンパク質の生産コストをさらに低下させるため、目的タンパク質を細胞内に蓄積させずに細胞外に分泌させることを画した哺乳動物細胞の形質転換方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、高度遺伝子増幅系を用いた目的タンパク質の生産条件について鋭意検討を行ったところ、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子を含むベクターとＩＲ／ＭＡＲベクターとのモル比を所定の範囲となるようにしつつ、哺乳動物細胞へ同時に導入することよって、上記課題を全て解決し得ることを発見し本発明を完成させるに至った。
【００１２】
さらに驚くべきことに、本発明を採用することによって、目的遺伝子が高発現するだけでなく、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が著しく向上するという、当業者が予想し得る以上の有利な効果が得られた。
【００１３】
本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。すなわち本発明にかかる方法は、哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物核マトリックス結合領域とを含む第１ベクター、および哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターとを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入することを特徴とする、哺乳動物細胞の形質転換方法である。
【００１４】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記哺乳動物複製開始領域が、遺伝子増幅活性部位を有する哺乳動物複製開始領域の部分断片であってもよい。
【００１５】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座由来の複製開始領域、β−グロビン遺伝子座由来の複製開始領域、およびエプスタイン・バーウイルス潜在複製開始領域からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
【００１６】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記哺乳動物核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。
【００１７】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、およびハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーターからなる群から選択されるのいずれかであってもよい。
【００１８】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記プロモーターが、ＳＲαプロモーターまたはヒト伸長因子１−αプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は１．５であることが好ましい。
【００１９】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は３であることが好ましい。
【００２０】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、目的遺伝子の５’末端側に分泌シグナル配列を含むことが好ましい。
【００２１】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記第１ベクターおよび／または第２ベクターに、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００２２】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ブラスチシジンＳデアミナーゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質遺伝子からなる群より選択されるものであってもよい。
【００２３】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、上記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胎児腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト子宮頸部癌細胞、およびマウスミエローマ細胞からなる群から選択されるものであってもよい。
【００２４】
また本発明にかかる哺乳動物細胞の形質転換方法は、第１ベクターおよび第２ベクターを哺乳動物細胞に導入した後に、目的遺伝子が高発現するクローンを選抜する選抜工程を含む方法であってもよい。
【００２５】
一方、本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記本発明にかかる形質転換方法によって得られた形質転換細胞を培養する培養工程を含む方法である。
【００２６】
本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記培養工程によって得られた培養物から所望のタンパク質を精製する精製工程を含む方法であってもよい。
【００２７】
また本発明は、上記本発明にかかる形質転換方法によって得られた形質転換細胞をも包含する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、目的遺伝子の導入効率および発現効率が高く、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が高い哺乳動物細胞の形質転換方法を提供し、医薬品等の有用タンパク質の生産コストを低下させることができる。なお、本発明において利用するＩＲ／ＭＡＲベクターを用いた高度遺伝子増幅系は、宿主細胞は特に限定されず、広範な哺乳動物細胞を利用することができる。
【００２９】
さらに、本発明の形質転換方法において、ＩＲの全長の代わりに遺伝子増幅活性を有するＩＲの部分断片を適用した場合は、従来の高度遺伝子増幅系で用いられていたＩＲ／ＭＡＲベクターと比べてサイズが小さいために、下記のメリットをさらに享受できる。
(A)哺乳動物細胞への遺伝子導入効率がさらに向上する。
(B)さらにサイズの大きい目的遺伝子を高度遺伝子増幅系へ適用することが可能となる。
(C)タグタンパク質やシグナルペプチド等のその他のエレメントをコードするポリヌクレオチドを、ＩＲ／ＭＡＲベクターに容易に組み込むことができるようになり、より複雑なベクターを構築することも可能になる。
【００３０】
また上記に加え、下記の効果が得られるということを本発明者らは偶然にも見出した。この効果は当業者が予想し得る以上の有利な効果であるといえる。
(D)全長のＩＲを用いた従来法よりもＨＳＲの発生頻度が著しく向上する。
【００３１】
したがって本発明によれば、所望のタンパク質を大量かつ容易に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００３３】
＜１.本発明の形質転換方法＞
本発明の一実施形態は、哺乳動物細胞の形質転換方法に関する。上記方法のことを「本発明の形質転換方法」と称する。
【００３４】
ここで本発明の形質転換方法は、哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物核マトリックス結合領域とを含む第１ベクター、
および哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入する工程（以下、「導入工程」という）を含むことを特徴としている。
【００３５】
（１）第１ベクター
本発明の形質転換方法において利用する「第１ベクター」は、哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）と、哺乳動物核マトリックス結合領域（ＭＡＲ）とを少なくとも含むベクター（すなわち「ＩＲ／ＭＡＲベクター」）である。かかる第１ベクターに含まれるＩＲおよびＭＡＲは、哺乳動物をはじめとする真核生物細胞内で機能するＩＲおよびＭＡＲであれば特に限定されるものではない。
【００３６】
上記ＩＲとしては、例えばｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子座由来、β-グロビン遺伝子座由来等の複製開始領域、やエプスタイン・バーウイルス潜在複製開始領域等が挙げられる。なおｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域については、「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242 (1990)」を参照のこと。またＤＨＦＲ遺伝子座の複製開始領域については、「Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409 (1988) 」を参照のこと。またβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域については、「Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009 (1998) 」を参照のこと。またエプスタイン・バーウイルス潜在複製開始領域については「Baer, R. et al., Nature vol.310, p207-211(1984)」を参照のこと。
【００３７】
また上記ＭＡＲとしては、例えば、Igκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座等の核マトリックス結合領域に由来するポリヌクレオチドが挙げられる。なお、Igκ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、「Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem. vol. 268, p12886-12894 (1993) 」参照のこと。またＳＶ４０初期領域の核マトリックス結合領域については、「Pommier, Y. et al., J. Virol., vol 64, p419-423 (1990) 」を参照のこと。またジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、「Shimizu N. et al., Cancer Res. vol. 61, p6987-6990 」を参照のこと。
【００３８】
なお本明細書において特に言及しない場合においては、哺乳動物複製開始領域を「ＩＲ」と表記し、哺乳動物各マトリクス結合領域を「ＭＡＲ」と表記する。また全長のＩＲおよびＭＡＲのみならず、これらの部分断片により構成されているベクターも「ＩＲ／ＭＡＲベクター」と称する。
【００３９】
なお本発明の形質転換方法では、第１ベクター（ＩＲ／ＭＡＲベクター）のサイズを小さくするために、全長のＩＲの代わりに遺伝子増幅活性部位を有するＩＲの部分断片（「増幅活性断片」という）を用いてもよい。ここで上記「哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）の部分断片」とは全長のＩＲを除くＩＲの一部分であることを意味する。ＩＲの部分断片の長さは特に限定されるものではないが、約２．４ｋｂｐであるｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来のＩＲの場合は、部分断片の長さは０．５ｋｂｐ以上２．０ｋｂｐ以下であることが好ましく、０．５ｋｂｐ以上１．５ｋｂｐ以下であることがさらに好ましく、０．５ｋｂｐ以上１．３ｋｂｐ以下であることが最も好ましい。また約４．６ｋｂｐであるＤＨＦＲ遺伝子座由来のＩＲの場合は、部分断片の長さは１．７ｋｂｐ以上３．５ｋｂｐ以下であることが好ましく、１．７ｋｂｐ以上３．１ｋｂｐ以下であることがさらに好ましい。上記好ましい範囲を満たす場合は、発明の効果の項で記載した(A)〜(D)の効果が得られやすい。
【００４０】
ここで「遺伝子増幅活性部位」とは、高度遺伝子増幅系における遺伝子増幅が起こるために必須なエレメントのことを意味する。たとえばあるＩＲの部分断片が、上記遺伝子増幅活性部位を有しているか否かは、例えば、当該部分断片とＭＡＲとを用いてＩＲ／ＭＡＲベクターを調製し、当該ＩＲ／ＭＡＲベクターと目的遺伝子とを哺乳動物細胞へ導入した際に遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）の発生頻度を検討することによって判断することができる。すなわち上記検討において遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）の発生頻度が全長のＩＲを用いた場合に比して著しく低下する、または遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）が発生しなくなれば、その検討に用いたＩＲの部分断片には遺伝子増幅活性部位が含まれていないと判断できる。逆に、ＩＲの部分断片を用いた場合の遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）の発生頻度が、全長のＩＲを用いた場合のそれに比して、同等か若しくはそれ以上であれば、当該ＩＲの部分断片が遺伝子増幅活性部位を有するＩＲの部分断片（増幅活性断片）であると判断することができる。形質転換細胞のクローンにおいて上記増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）が形成されたか否かを検出する方法については、特に限定されるものではないが、例えば分裂期の染色体について公知のＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）を行い、哺乳動物細胞へ導入した遺伝子を検出することによって判断し得る。上記判断は、当業者であれば容易に行い得る。なおＦＩＳＨ法を実施する際の具体的な方法については特に限定されるものではなく、従来公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。
【００４１】
本発明者らの検討によれば、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲの場合、配列番号１、２、３、７、および１２に示される塩基配列からなるＩＲの部分断片が遺伝子増幅活性部位を有していることが明らかとなった。特に配列番号１、３、および１２に示される塩基配列からなるＩＲの部分断片をＩＲ／ＭＡＲベクターの全長ＩＲの代わりに使用することで、全長ＩＲを使用した場合に比して目的遺伝子の増幅効率が向上するという驚くべき知見が得られた。なお、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲの塩基配列は、例えばGenbank HSMYCC(accession number X00364)の第１〜２３４９位に相当するものが挙げられる。
【００４２】
またＤＨＦＲ由来ＩＲの場合、配列番号５２および５５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが増幅活性断片に該当することを本発明者らは確認した。なおＤＨＦＲ由来ＩＲの塩基配列としては、Genbank CFORIDHFR(accession number X94372)の第１５３２〜６１６６位に示される塩基配列がその一例として挙げられる。特に配列番号５２に示される塩基配列からなるＩＲの部分断片をＩＲ／ＭＡＲベクターの全長ＩＲの代わりに使用することで、全長ＩＲを使用した場合に比して目的遺伝子の増幅効率が向上するという驚くべき知見が得られた。
【００４３】
増幅活性断片として機能するものであれば、配列番号１、２、３、７、１２、５２および５５に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドもＩＲの部分断片の好ましい実施形態に該当するということを、当業者は容易に理解する。上記変異ポリヌクレオチドとオリジナルのポリヌクレオチド（配列番号１、２、３、７、１２、５２および５５）との相同性は、８０％以上が好ましく、約９０％以上がさらに好ましく、約９５％以上が最も好ましい。なお上記変異ポリヌクレオチドを用いてＩＲ／ＭＡＲプラスミドを構築した場合に目的遺伝子を増幅させる活性を有することはいうまでもない。
【００４４】
本発明の形質転換方法の導入工程において使用する第１ベクター（ＩＲ／ＭＡＲベクター）は、ＩＲおよびＭＡＲが具備されていればよいが、当該ＩＲ／ＭＡＲには、大腸菌内でクローニングを行うために必要な配列、選択マーカー（マーカータンパク質）としての薬剤耐性遺伝子(ブラスティサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子等)または緑色蛍光タンパク質遺伝子等が含まれていてもよい。これらの選択マーカーを指標とすることによって、第１ベクター（ＩＲ／ＭＡＲベクター）が導入された哺乳動物細胞を選別できる。
【００４５】
なお、第１ベクターは１種類のＩＲ／ＭＡＲベクターからなる場合に限定されず、複数種類のＩＲ／ＭＡＲベクターを組み合わせてからなるものであってもよい。
【００４６】
（２）第２ベクター
本発明の形質転換方法において利用する「第２ベクター」は、哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを少なくとも含むベクターである。
【００４７】
ここで上記「目的遺伝子」とは発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子のことを意味する。本発明における目的遺伝子は、分泌タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。「分泌タンパク質」とは、細胞質膜外に分泌されるタンパク質の総称である。上記目的遺伝子としては例えば、抗体などの血液タンパク質、各種消化酵素、ペプチドホルモン、乳タンパク質、卵白タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。後述する実施例においては、抗Pyrococcus kodakaraensis(KOD)ＤＮＡポリメラーゼ抗体をコードする遺伝子、またはエリスロポエチンをコードする遺伝子を目的遺伝子として用いた。なお、上記抗体としては、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）およびこれらの抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）が挙げられる。また単鎖抗体であってもよい。免疫グロブリンをコードする遺伝子を目的遺伝子として利用する場合、重鎖および軽鎖を別々に含む２つのベクターからなる第２ベクターを用いてもよいし、また抗体の重鎖と軽鎖がタンデムにつながった１つのベクターからなる第２ベクターを用いてもよい。よって本発明の形質転換方法は第２ベクターが１種類であることに限定されず、複数種類のベクターの組み合わせからなる場合も意図している。
【００４８】
また本発明の形質転換方法の導入工程において導入される、目的遺伝子はプロモーターに制御可能に連結されていることが好ましい。上記プロモーターは、導入される哺乳動物細胞において機能するものであれば特に限定されるものではなく、転写因子等による所定の操作によって、プロモーターの転写活性が活性化または不活性化されるプロモーター（本明細書においては「転写活性調節型プロモーター」という）であっても、恒常的に転写活性が活性化されている恒常型プロモーターであってもよい。「転写活性調節型プロモーター」は、上記特性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等の市販品が本発明にかかる方法において利用可能である。恒常型プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、ハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター等が利用可能である。
【００４９】
本発明の形質転換方法の導入工程において使用する第２ベクターには、上記の他、分泌シグナルペプチドをコードする分泌シグナル配列が目的遺伝子の５’末端側に含まれていてもよい。宿主細胞外に目的タンパク質を分泌させるためである。分泌シグナル配列としては、特に限定されるものではなく、分泌シグナル配列として公知の配列を適宜選択の上、採用すればよい。分泌シグナル配列としては、例えばイムノグログリン κ鎖由来のシグナル配列（Karp,S.L et al., J.Immunol.vol.150, p867-879(1993)）、イムノグロブリン 重鎖由来のシグナル配列（Castilla,J. et al., J.Virol.vol.71, p5251-5258(1997)）等が挙げられる。
【００５０】
本発明の形質転換方法の導入工程において使用する第２ベクターには、上記の他、大腸菌内でクローニングを行うために必要な配列や、ヒスチジンタグをはじめとする精製用タグ配列、選択マーカーをコードする選択マーカー遺伝子が含まれていてもよい。これらの選択マーカーを指標とすることによって、第２ベクターが導入された哺乳動物細胞を選別できる。上記選択マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン抵抗性遺伝子）、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ヒグロマイシン抵抗性遺伝子）、ブラスティサイジンＳデアミナーゼ遺伝子（ブラスティサイジン抵抗性遺伝子））、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子等が挙げられる。なお第１ベクターおよび第２ベクターのそれぞれに選択マーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入された哺乳動物細胞を選抜することができるからである。この時、第１ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子と、第２ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とが異なることが好ましい。第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入された哺乳動物細胞を、さらに確実に選抜することができるからである。
【００５１】
（３）導入工程
本発明の形質転換方法の導入工程は、上記第１ベクターと上記第２ベクターとを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入する工程である。
【００５２】
上記哺乳動物細胞（宿主細胞）は、特に限定されるものではなく、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞、入手先：例えば、ATCC CCL-61、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0285、理化学研究所バイオリソースセンター RCB0403等）、ヒト胎児腎臓細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞、入手先：例えばATCC CRL-1573、理化学研究所バイオリソースセンターRCB1637、理化学研究所バイオリソースセンターRCB2202等）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばＣＯＳ−７細胞、入手先：例えばATCC CRL-1651、理化学研究所バイオリソースセンター RCB0539等）、ヒト子宮頸部癌細胞、マウスミエローマ細胞より選択される、各種腫瘍細胞等が挙げられる。ただし、上記哺乳動物細胞としては、無限増殖能を有する腫瘍細胞が特に好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-2、ATCC CCL-2.2、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0007、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0191）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（入手先：例えばATCC CCL-2.2、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0191、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0271、理化学研究所バイオリソースセンターRCB1525等）、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220）、ヒト大腸がんCOLO 320HSR細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220.1）、ＮＳ０細胞（入手先：例えば、理化学研究所バイオリソースセンターRCB0213）等が挙げられる。なおヒト大腸がんCOLO 320DM細胞については、「Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.」参照のこと。
【００５３】
なお、本発明者らが開発した高度遺伝子増幅系では、ＩＲ／ＭＡＲベクターおよび目的遺伝子を哺乳動物細胞に導入する際には、両者を連結して同一の遺伝子構築物として導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよいが、本発明の形質転換方法では特に別々の遺伝子構築物として導入する。換言すれば第１ベクターと第２ベクターとは別個の遺伝子構築物である。このようにすることで、それぞれのベクターのサイズを小さくすることができるために、発明の効果の項で記載した上記(A)〜(D)のメリットをさらに得られやすくなる。
【００５４】
また遺伝子構築物の形態については、プラスミドであってもコスミドであってもよい。また第１ベクターおよび第２ベクターの哺乳動物細胞への導入方法は、哺乳動物細胞へ同時に導入することができる方法であれば特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。
【００５５】
また本発明の形質転換方法においては、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５となるように哺乳動物細胞に導入する。第２ベクターにおけるプロモーターとして、ＳＲαプロモーターまたはヒト伸長因子１−αプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は１．５であることが特に好ましい。また第２ベクターにおけるプロモーターとして、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は３であることが特に好ましい。本発明者らの検討によって、第２ベクターに対する第１ベクターの最適なモル比が設定された。上記条件を採用することによって、目的遺伝子が高発現するクローンが取得できる。
【００５６】
なお、複数種類のベクターの組み合わせからなる第１ベクターを用いて本発明の形質転換方法を実施した場合、当該複数種類のベクターのモル数の合計を第１ベクターのモル数とすればよい。同様に、複数種類のベクターの組み合わせからなる第２ベクターを用いて本発明の形質転換方法を実施した場合、当該複数種類のベクターのモル数の合計を第２ベクターのモル数とすればよい。
【００５７】
（４）選抜工程
なお本発明の形質転換方法には、上記導入工程の他に、第１ベクターおよび第２ベクターを哺乳動物細胞に導入した後に、目的遺伝子が高発現するクローンを選抜する選抜工程が含まれていてもよい。選抜工程は、第１ベクターおよび第２ベクターのいずれか、または両方が導入されていない哺乳動物細胞、第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入されてはいるが目的遺伝子が高発現していない哺乳動物細胞、第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入されており且つ目的遺伝子が高発現している哺乳動物細胞が含まれる細胞の多クローン性集団から、第１ベクターおよび第２ベクターがともに導入されており且つ目的遺伝子が高発現している哺乳動物細胞（クローン）を選抜する工程である。具体的には、導入工程後、安定形質転換細胞を取得し、限界希釈法で単クローンにする（クローニングを行う）。クローニングによって得られた種々のクローンを対象に目的遺伝子の産物の生産量を測定し、目的遺伝子が高発現するクローンを選抜すればよい。
【００５８】
本発明の形質転換方法によれば、目的遺伝子が高発現する形質転換細胞が取得し得るだけでなく、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が著しく向上するという、当業者が予想し得る以上の有利な効果が得られた（後述する実施例を参照のこと）。
【００５９】
＜２.本発明のタンパク質の生産方法、および本発明の形質転換細胞＞
上記本発明の形質転換方法によって得られた形質転換細胞は、目的遺伝子を高発現する細胞である。それゆえ、かかる形質転換細胞を培養することによって、目的遺伝子がコードする所望の分泌タンパク質を大量に生産することができる。つまり本発明は、本発明の形質転換方法によって得られた形質転換細胞を培養する培養工程を含む、タンパク質の生産方法（以下「本発明のタンパク質生産方法」という）をも包含する。また本発明のタンパク質生産方法には、培養工程によって得られた培養物から所望のタンパク質を精製する精製工程を含む方法であってもよい。以下、本発明にかかる方法を工程ごとに説明する。
【００６０】
（１）培養工程
本発明のタンパク質生産方法における「培養工程」は、上記本発明の形質転換細胞にって得られた形質転換細胞（形質転換哺乳動物細胞）を培養する工程である。かかる培養工程によって、目的遺伝子が導入され且つ高度に増幅された哺乳動物細胞を培養することができ、所定の操作（転写誘導操作等）によって、目的タンパク質を生産することができる。
【００６１】
上記培養工程の具体的方法は特に限定されるものではなく、培養する哺乳動物細胞に最適な条件を検討の上、適宜採用すればよい。例えば、浮遊培養法、担体付着培養法、ホローファイバー培養法等が好適である。特に浮遊培養法は、ジャーファーメンターを利用することができ、スケールアップが容易であるために、より好ましいといえる。形質転換細胞（形質転換哺乳動物細胞）を培養する際の培地としては、特に限定されるわけではなく、市販されている培地を利用してもよいし、適宜調製した培地を利用てもよい。培地には、アミノ酸、ビタミン類、ブドウ糖、塩類、血清等が含まれている場合がある。また、重炭酸／炭酸ガス系緩衝液がｐＨ緩衝剤として培地に含まれていてもよい。培養装置としては、公知のＣＯ2インキュベーターが適宜利用可能である。またｐＨのモニター用にフェノールレッドが培地に添加されていてもよい。培養条件は、一般的には３７℃で培養するが、細胞株によっては、２８℃、４０℃の場合がある。例えばＣＨＯ細胞は、１０％ fetal bovine serum (ＦＢＳ) を含むＦ１２ media (GIBCO BRL社)やＤＭＥＭ media(GIBCO BRL)、または無血清培地（CD-CHO(GIBCO BRL)、EX-CELL302(SAFC Bioscience)、EX-CELL CD-CHO(SAFC Bioscience)）等に必要な栄養源を添加し、５％ ＣＯ2、３７℃の条件で培養され得る。
【００６２】
（２）精製工程
本発明のタンパク質生産方法における「精製工程」は、上記培養工程によって得られた培養物から所望のタンパク質を精製する精製する工程である。上記目的遺伝子がコードするタンパク質は分泌タンパク質であるため、形質転換細胞の細胞質膜外へタンパク質が分泌される。すなわち形質転換細胞を培養すれば、その培養物（例えば培養液）内に所望のタンパク質が分泌されることになる。この培養物内に存在する所望のタンパク質を、タンパク質の精製方法として従来公知の手法を適宜採用の上、精製すればよい。
【００６３】
従来公知のタンパク質の精製方法としては、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過クロマトグラフィー等の公知のカラムクロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。また例えば、所望のタンパク質のＣ末端にヒスチジンタグが付加されるように第２ベクターを設計しておけば、ヒスチジンはニッケルに吸着する性質を利用することによって、ニッケルカラムを用いて所望のタンパク質を簡単に精製することができる。また、精製されたタンパク質溶液を適当な緩衝液に対して透析することで不要な塩を除去することもできる。なお、上記精製工程の具体的方法は、この限りではなく、公知の方法を適宜利用され得る。例えば、ＩｇＧ抗体を精製する場合、Protein AやProtein Gをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーが利用可能である。
【００６４】
さらに本発明には、本発明の形質転換方法によって得られた形質転換細胞が含まれる。本発明の形質転換細胞はクローニングされた単クローンであっても、未クローニングの多クローン性集団であってもよい。本発明の形質転換細胞は、特に限定されないが、３ヶ月以上安定して所望のタンパク質を生産し得る細胞であることが、タンパク質生産を長期間計測して行うことができるために好ましいといえる。なお、本発明の形質転換細胞に関する説明は、本発明の形質転換方法における説明を適宜援用し得る。
【実施例】
【００６５】
以下に、実施例および参考例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例および参考例に記載のＰＣＲは全てＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡株式会社製）を用いて行った。また実験の諸条件は、特記しない限り実験に使用した試薬に添付されている説明書に記載されている標準の条件で行った。
【００６６】
＜参考例＞
〔各種プラスミド〕
５’末端と３’末端とにＡｓｃ Ｉサイトを有する、ＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座（単に「ＤＨＦＲ遺伝子座」ともいう）のＩＲ遺伝子、およびｃ−ｍｙｃのＩＲ遺伝子の作製方法は以下の通りである。ＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲ（４．６ｋｂｐ）を、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載されているｐＳＦＶｄｈｆｒからＮｏｔ Ｉで制限酵素消化することによって切り出した。また、ｃ−ｍｙｃのＩＲ（２．４ｋｂｐ）は「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 18, p1233-1242 (1990)」に記載されているｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４からＮｏｔ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて制限酵素消化により切り出した。上記２つのＩＲ断片の５’と３’末端を平滑末端化した後、その平滑末端にＡｓｃ Ｉの制限酵素サイトを有するアダプターオリゴヌクレオチドを連結した。
【００６７】
またｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＢＮ．ｐｏｌｙＡ、およびｐＳＦＶ−Ｖとして、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載のプラスミドをそれぞれ用いた。
【００６８】
またｐΔＨはｐＳＦＶ−Ｖに含まれる完全長のハイグロマイシン抵抗性遺伝子カセットをＮｏｔ ＩとＮｒｕ Ｉの制限酵素を用いて取り除き、代わりにその場所にマルチクローニングサイトを含む合成オリゴヌクレオチドを挿入することで作製された。上記マルチクローニングサイトの制限酵素サイトはブラスティサイジン抵抗性遺伝子（以下、「ＢＳＲ」という）の下流に位置し、５’末端から３’末端にかけてＫｐｎ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ−Ａｓｃ Ｉ−Ｎｒｕ Ｉの順番である。
【００６９】
また図３Ｄに示されているｐΔＨｐＡは、ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列（１３５７ｂｐ）を含む遺伝子を５’末端および３’末端にＫｐｎ Ｉの制限酵素サイトが付加されるように設計したＨＳＶｐＡＫｐｎＩＲとＨＳＶｐＡＫｐｎＩＬのプライマーセットとを用いてＰＣＲ法によって増幅し、当該Ｋｐｎ Ｉの制限酵素サイトを用いて上記ｐΔＨのＫｐｎ Ｉサイトに挿入することで作製された。ＨＳＶｐＡＫｐｎＩＲおよびＨＳＶｐＡＫｐｎＩＬの各プライマーの塩基配列を配列番号９１と配列番号９２にそれぞれ示した。また、上記、ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列の塩基配列を配列番号９３で示した。
【００７０】
図３Ｅに示されているｐΔＨｐＡｄｈｆｒを、上記で作製したＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲを、そのＩＲ断片の内部に存在するＭＡＲ配列が、ＢＳＲの転写開始点よりも遠くになるようにｐΔＨｐＡのＡｓｃ Ｉサイトに挿入することで作製した。
【００７１】
また図３Ｆに示されているｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒは、平滑末端処理を施した上記ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列（図３中「ＨＳＶ ｐＡ」で示す）を含む遺伝子断片をｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒのＮｒｕ Ｉサイトに挿入することで作製された。
【００７２】
また図３ＣのｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲは下記の通りにして作製された。
（ｉ）ＡＲ１のＭＡＲ（３７５ｂｐ）断片をＨｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨ Ｉを用いて制限酵素消化することでｐＡＲ１より切り出し、当該断片の両末端を平滑末端処理した。なお、ｐＡＲ１の詳細は「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載されている。
（ｉｉ）ＳＶ４０の初期領域のＭＡＲ遺伝子を、ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４を鋳型としてＳＶ４０ＬとＳＶ４０Ｒのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により取得した。ＳＶ４０ＬおよびＳＶ４０Ｒの塩基配列を配列番号９４および９５にそれぞれ示した。また、上記ＳＶ４０の初期領域のＭＡＲ遺伝子の塩基配列を配列番号９６に示した。
（ｉｉｉ）ＲＦＢ（replication fork barrier）配列を含む遺伝子（１１８ｂｐ）は、ｐＳＶ２．ＳＢ２を鋳型として、５’末端と３’末端とにＮｏｔ Ｉの制限酵素サイトが付加されるように設計したＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＬとＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＲのプライマーセットとを用いてＰＣＲ法により取得された。上記ＲＦＢ配列は複製フォークの発生をブロックするため、当該ＲＦＢ配列が導入されたプラスミドの複製を阻害することができる。ＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＬおよびＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＲの塩基配列を配列番号９７および９８にそれぞれ示した。また、ＲＦＢ配列の塩基配列を配列番号９９で示した。
（ｖｉ）上記ＲＦＢ配列を含む遺伝子を、ＩＲからの複製フォークをブロックする方向性でｐΔＨｐＡのＮｏｔ Ｉサイトに挿入した。次に、平滑末端処理したＡＲ１とＳＶ４０との両方のＭＡＲ遺伝子を、上記プラスミドのＮｒｕ Ｉサイトに挿入した。
（ｖ）最後に、上記で作製したｃ−ｍｙｃのＩＲ遺伝子またはＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲ遺伝子と、λ―ファージのＨｉｎｄ ＩＩＩで制限酵素消化した４３６１ｂｐの断片の両末端にＡｓｃ Ｉサイトを付加した遺伝子とを、それぞれ（ｖｉ）で作製したプラスミドのＡｓｃ Ｉサイトに挿入した。
【００７３】
また図３Ｇに示されているｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、またはｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖは、上記で取得したＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲ遺伝子（４．６ｋｂｐ）を平滑末端処理したものを、ｐΔＨｐＡのＥｃｏＲ Ｉ消化物を平滑末端処理したものに対して、ＢＳＲの転写に関して同じ、または反対の方向になるように挿入してそれぞれ作製された。
【００７４】
また図３Ｈに示されているｐＥＰＩ−Ｉ（「Schaarschmidt, D., Baltin, J., Stehle, I. M., Lipps, H. J., and Knippers, R. (2004) EMBO J. 23(1), 191-201.」、および 「Jenke, A. C., Stehle, I. M., Herrmann, F., Eisenberger, T., Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. O., and Lipps, H. J. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11322-11327.」）はDaniel Schaarchmidt 氏(Department of Biology, Universitat of Konstanz)より提供された。
【００７５】
また図３Ｊに記されているｐＴＨＶは、ｐΔＨのＫｐｎ Ｉサイトに平滑末端ライゲーションでＡＲ１のＭＡＲを挿入することで作製された。
【００７６】
また図３Ｉに記されているｐＴＨ３は、上記ｐＴＨＶのＮｏｔ Ｉサイトに平滑末端ライゲーションでＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列を挿入することで作製された。
【００７７】
また２．４ｋｂｐのｃ−ｍｙｃのＩＲの部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）を含むベクターは、ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４とｐＳＦＶｄｈｆｒとを鋳型とするＰＣＲによって増幅された遺伝子を、ｐＴＨＶのＡｓｃ Ｉサイトに挿入することによって作製された。また４．６ｋｂｐのＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲの部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）を含むベクターは、ｐＳＦＶｄｈｆｒとを鋳型とするＰＣＲによって増幅された遺伝子を、ｐＴＨＶのＡｓｃ Ｉサイトに挿入することによって作製された。
【００７８】
上記のＰＣＲで用いた、Ｃ１増幅用の５’プライマー（Ｃ１−５’）の塩基配列を配列番号１８に、３’プライマー（Ｃ１−３’）の塩基配列を配列番号１９に示した。また、Ｃ２増幅用の５’プライマー（Ｃ２−５’）の塩基配列を配列番号２０に、３’プライマー（Ｃ２−３’）の塩基配列を配列番号２１に示した。また、Ｃ３増幅用の５’プライマー（Ｃ３−５’）の塩基配列を配列番号２２に、３’プライマー（Ｃ３−３’）の塩基配列を配列番号２３に示した。また、Ｃ４増幅用の５’プライマー（Ｃ４−５’）の塩基配列を配列番号２４に、３’プライマー（Ｃ４−３’）の塩基配列を配列番号２５に示した。また、Ｃ５増幅用の５’プライマー（Ｃ５−５’）の塩基配列を配列番号２６に、３’プライマー（Ｃ５−３’）の塩基配列を配列番号２７に示した。また、Ｃ６増幅用の５’プライマー（Ｃ６−５’）の塩基配列を配列番号２８に、３’プライマー（Ｃ６−３’）の塩基配列を配列番号２９に示した。また、Ｃ７増幅用の５’プライマー（Ｃ７−５’）の塩基配列を配列番号３０に、３’プライマー（Ｃ７−３’）の塩基配列を配列番号３１に示した。また、Ｃ８増幅用の５’プライマー（Ｃ８−５’）の塩基配列を配列番号３２に、３’プライマー（Ｃ８−３’）の塩基配列を配列番号３３に示した。また、Ｃ９増幅用の５’プライマー（Ｃ９−５’）の塩基配列を配列番号３４に、３’プライマー（Ｃ９−３’）の塩基配列を配列番号３５に示した。また、Ｃ１０増幅用の５’プライマー（Ｃ１０−５’）の塩基配列を配列番号３６に、３’プライマー（Ｃ１０−３’）の塩基配列を配列番号３７に示した。また、Ｃ１１増幅用の５’プライマー（Ｃ１１−５’）の塩基配列を配列番号３８に、３’プライマー（Ｃ１１−３’）の塩基配列を配列番号３９に示した。また、Ｃ１２増幅用の５’プライマー（Ｃ１２−５’）の塩基配列を配列番号４０に、３’プライマー（Ｃ１２−３’）の塩基配列を配列番号４１に示した。また、Ｃ１３増幅用の５’プライマー（Ｃ１３−５’）の塩基配列を配列番号４２に、３’プライマー（Ｃ１３−３’）の塩基配列を配列番号４３に示した。また、Ｃ１４増幅用の５’プライマー（Ｃ１４−５’）の塩基配列を配列番号４４に、３’プライマー（Ｃ１４−３’）の塩基配列を配列番号４５に示した。また、Ｃ１５増幅用の５’プライマー（Ｃ１５−５’）の塩基配列を配列番号４６に、３’プライマー（Ｃ１５−３’）の塩基配列を配列番号４７に示した。また、Ｃ１６増幅用の５’プライマー（Ｃ１６−５’）の塩基配列を配列番号４８に、３’プライマー（Ｃ１６−３’）の塩基配列を配列番号４９に示した。また、Ｃ０増幅用の５’プライマー（Ｃ０−５’）の塩基配列を配列番号５０に、３’プライマー（Ｃ０−３’）の塩基配列を配列番号５１に示した。
【００７９】
また、Ｄ１増幅用の５’プライマー（Ｄ１−５’）の塩基配列を配列番号６３に、３’プライマー（Ｄ１−３’）の塩基配列を配列番号６４に示した。また、Ｄ２増幅用の５’プライマー（Ｄ２−５’）の塩基配列を配列番号６５に、３’プライマー（Ｄ２−３’）の塩基配列を配列番号６６に示した。また、Ｄ３増幅用の５’プライマー（Ｄ３−５’）の塩基配列を配列番号６７に、３’プライマー（Ｄ３−３’）の塩基配列を配列番号６８に示した。また、Ｄ４増幅用の５’プライマー（Ｄ４−５’）の塩基配列を配列番号６９に、３’プライマー（Ｄ４−３’）の塩基配列を配列番号７０に示した。また、Ｄ５増幅用の５’プライマー（Ｄ５−５’）の塩基配列を配列番号７１に、３’プライマー（Ｄ５−３’）の塩基配列を配列番号７２に示した。また、Ｄ６増幅用の５’プライマー（Ｄ６−５’）の塩基配列を配列番号７３に、３’プライマー（Ｄ６−３’）の塩基配列を配列番号７４に示した。また、Ｄ７増幅用の５’プライマー（Ｄ７−５’）の塩基配列を配列番号７５に、３’プライマー（Ｄ７−３’）の塩基配列を配列番号７６に示した。また、Ｄ８増幅用の５’プライマー（Ｄ８−５’）の塩基配列を配列番号７７に、３’プライマー（Ｄ８−３’）の塩基配列を配列番号７８に示した。また、Ｄ９増幅用の５’プライマー（Ｄ９−５’）の塩基配列を配列番号７９に、３’プライマー（Ｄ９−３’）の塩基配列を配列番号８０に示した。また、Ｄ１０増幅用の５’プライマー（Ｄ１０−５’）の塩基配列を配列番号８１に、３’プライマー（Ｄ１０−３’）の塩基配列を配列番号８２に示した。また、Ｄ１１増幅用の５’プライマー（Ｄ１１−５’）の塩基配列を配列番号８３に、３’プライマー（Ｄ１１−３’）の塩基配列を配列番号８４に示した。
【００８０】
また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ０の塩基配列を配列番号１７に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１の塩基配列を配列番号１に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ２の塩基配列を配列番号２に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ３の塩基配列を配列番号３に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ４の塩基配列を配列番号４に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ５の塩基配列を配列番号５に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ６の塩基配列を配列番号６に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ７の塩基配列を配列番号７に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ８の塩基配列を配列番号８に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ９の塩基配列を配列番号９に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１０の塩基配列を配列番号１０に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１１の塩基配列を配列番号１１に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１２の塩基配列を配列番号１２に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１３の塩基配列を配列番号１３に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１４の塩基配列を配列番号１４に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１５の塩基配列を配列番号１５に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１６の塩基配列を配列番号１６に示した。
【００８１】
また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１の塩基配列を配列番号５２に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ２の塩基配列を配列番号５３に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ３の塩基配列を配列番号５４に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ４の塩基配列を配列番号５５に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ５の塩基配列を配列番号５６に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ６の塩基配列を配列番号５７に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ７の塩基配列を配列番号５８に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ８の塩基配列を配列番号５９に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ９の塩基配列を配列番号６０に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１０の塩基配列を配列番号６１に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１１の塩基配列を配列番号６２に示した。
【００８２】
〔実験方法〕
上記で作製したプラスミドを用いて以下の実験を行った。
【００８３】
本参考例では、上記プラスミドを細胞に遺伝子導入し、当該プラスミドで形質転換された形質転換細胞を選択し、ＦＩＳＨ法を用いて当該形質転換細胞内のＨＳＲの形成頻度を調べた。
【００８４】
本参考例で用いられている遺伝子導入方法については以下の通りである。まず遺伝子導入に用いるプラスミドをキアゲンプラスミド精製キット（Qiagen Inc., Valencia, CA）を用いて大腸菌より精製した。さらに、上記プラスミドを細胞内に導入する際には、ＤＮＡ精製の過程で混入する大腸菌由来の内毒素をMiraCLEAN（登録商標）endotoxin removalキット（Mirus., Madison,WI）を用いて除去した後に、メーカーの推薦する手法に従って、GenePorter（登録商標） 2 lipofectionキット（Gene Therapy Systems, San Diego,CA）を用いて細胞に遺伝子導入した。
【００８５】
上記の遺伝子導入される細胞は、ヒト大腸癌細胞株であるＣＯＬＯ ３２０ＤＭまたはＣＯＬＯ３２０ ＨＳＲ、若しくはヒト頸癌細胞株であるＨｅｌａである。上記細胞株は「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載の所から取得され、当該記載と同じ条件で培養された。ＣＯＬＯ ３２０ＤＭにはｃ−ｍｙｃ遺伝子の増幅によって多くの内在性のＤＭが生じており、一方、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭと同質遺伝子系統のＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲにはＤＭよりもＨＳＲが多く生じている。
【００８６】
上記形質転換細胞を、遺伝子導入から２日後に、終濃度５μｇ／ｍｌになるようにブラスティサイジンを加えた選択培地で上記細胞を培養することで選択した。選択培地は３日〜５日ごとに培養中の選択培地の半分を、新しく調製した上記選択培地と交換した。
【００８７】
上記ＦＩＳＨ法と、ＦＩＳＨ法に用いる導入遺伝子を検出するためのプローブの調製と、メタフェーズスプレッディング（metaphase spreading）とは、それぞれ培養４、６、または８週後に、培養中の細胞の一部を回収し、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載の方法に従って行われた。また、上記プローブはビオチン化されており、緑色蛍光を発するＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）が結合したストレプトアビジンによって検出することができる。また、赤色蛍光を発するＰＩ（propidium iodide）でＤＮＡを対比染色した。ＦＩＳＨ法によって蛍光標識したスライドガラス上の細胞を、蛍光色素を検出するのに適切なフィルタセットと１００倍の対物レンズ（Nikon Plan Fluor、NA1.30 oil）を設置している倒立蛍光顕微鏡（ECLIPSE TE2000-U、Nikon）を用いて観察し、上記顕微鏡とつながれているFuji FinePix S1Pro digital camera(Fuji Film Co.Tokyo)を用いて、細胞内での導入遺伝子とＤＮＡの態様の写真をデジタル画像として撮影した。得られた、それぞれの画像は画像解析ソフトAdobe（登録商標）Photpshop（登録商標）version 4.0J(Adobe Systems Inc)を用いて合成した。
【００８８】
〔参考例１〕
プラスミドｐＳＦＶｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡｘ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、またはｐＥＰＩ−ＩをＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入した。ｐＳＦＶｄｈｆｒを導入した場合には培養８週間後に、それ以外のプラスミドを導入した場合には培養６週間後に、形質転換細胞を回収した。回収されたそれぞれの形質転換細胞について、ＦＩＳＨ法によってＤＭとＨＳＲとを検出した。
【００８９】
ＤＭおよびＨＳＲをＦＩＳＨ法により検出した結果を図２に示す。図２における「Ａ」および「Ｂ」はｐＳＦＶｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｃ」はｐΔＨｐＡｘ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｄ」はｐＴＨ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｅ」はｐＥＰＩ−Ｉが導入された形質転換細胞の結果をそれぞれ示す。図２において、矢頭はＤＭを示し、矢印はＨＳＲを示す。
【００９０】
種々のＩＲとＭＡＲとの組み合わせを含むｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲを作製し、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭに遺伝子導入し、４、６、または８週間培養後に形質転換細胞を取得した。上記形質転換細胞に生じているＨＳＲをＦＩＳＨ法により調べ、ＨＳＲ発生頻度（Frequency of HSR）をもとめた。その結果を図４に示した。ＨＳＲ発生頻度は、「（ＨＳＲが発生している形質転換細胞数÷形質転換細胞数）×１００」として計算された。図４中のＩＲの欄における「（＋）」および「（−）」は、ＩＲがＢＳＲの転写方向と同じである場合および反対である場合をそれぞれ示す。また、「λ―DNA fragment」はλファージの４３６１ｂｐの遺伝子断片がＩＲの代わりに組み込まれていることを示し、「ｎｏｎｅ」はＩＲを含まないことを示す。
【００９１】
図４によれば、ＩＲとＭＡＲとを有しているプラスミドを遺伝子導入されている形質転換細胞のみにＨＳＲが生じていることが分かる。さらに、ＩＲの代わりにλファージの４３６１ｂｐの遺伝子断片を用いた場合や、ＩＲを用いない場合には、ＨＳＲがほとんど生じていないことから、ＩＲ中にＨＲＳを発生させる活性を有する塩基配列があることが示唆された。
【００９２】
プラスミド（ｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＨｐＡ、ｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖ、ｐＥＰＩ−１、またはｐＴＨ３）を、ＨｅＬａまたはＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、ＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、４週間または８週間選択培地で培養することで、形質転換細胞を選抜した。次に、選抜された形質転換細胞ＨＳＲ発生頻度を調べた。その結果を図５に示した。
【００９３】
図５によれば、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起きるように作製されたｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒを遺伝子導入した場合において、ＨＳＲが生じた。一方、ポリＡ配列を１つ追加して非コード転写と遺伝子複製との間の衝突が起きないように作成したｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒを遺伝子導入した場合には、ＨＳＲが生じなかった。このことは、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起きることでプラスミドが不安定になり、プラスミドは多量体化し、ＨＳＲを生じるということを示唆している。また、非コード転写と遺伝子複製との間の衝突が起きないように作製したｐＴＨ２．ｄｈｆｒが遺伝子導入された場合には、低頻度であるがＨＳＲが生じた。このことは、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起こっていたことが推察される。上記の結果から、ＩＲの両端にポリＡ配列を付加することで、遺伝子複製と非コード転写との間に起こる衝突をなくすことができるということが分かった。
【００９４】
また、転写領域の間に挿入されたＭＡＲが遺伝子複製と哺乳類エピソームの維持に必須であり、ＩＲは必要ではないという文献「Jenke, A. C., Stehle, I. M., Herrmann, F., Eisenberger, T., Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. O., and Lipps, H. J. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11322-11327.」がある。そこで、上記文献で用いられているプラスミド（ｐＥＰＩ−１）とｐＥＰＩ−１と同様の構成のプラスミド（ｐＴＨ３）を作製した。ｐＴＨ３はＡＲ１由来のＭＡＲがＢＳＲ転写領域の内部に存在するプラスミドである。上記プラスミドをＨｅＬａ、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、またはＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入し、ＨＳＲの発生を調べたところ、当該形質転換細胞においてＨＳＲおよびＤＭは全く発生していなかった。一方、極微小物体であるエピソームは確認することができた。このことはＩＲがＨＳＲの発生に必須であることを示唆している。またＩＲは遺伝子複製に関与し、ＨＳＲは遺伝子増幅に関与することから、ＩＲの遺伝子複製と遺伝子増幅とが関連すると考えられる。
【００９５】
〔参考例２〕
遺伝子増幅活性を有するｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片の同定を試みた。すなわち、ＰＣＲを用いてｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）を作製し、当該部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）をそれぞれｐＴＨＶ（図３Ｊ）のＡｓｃ Ｉサイトに挿入し、Ｃ０〜Ｃ１６を含むプラスミド（ｐＣ０〜ｐＣ１６）を作製した（各種プラスミドの項を参照のこと）。
【００９６】
上記各プラスミドを細胞へ導入した場合、組み込まれた部分断片に遺伝子増幅活性があると、ＭＡＲ部位で複製と転写との間で衝突が起こり、当該プラスミドで形質転換された形質転換細胞にＨＳＲが生じる。その反対に、組み込まれた部分断片に遺伝子増幅活性がないと、形質転換細胞にＨＳＲが生じない。このことを利用することによって、遺伝子増幅活性を有するｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片の同定を試みた。ここで上記の同定方法を便宜上「プラスミド安定化分析法」と称する。
【００９７】
上記ｐＣ０〜ｐＣ１６、陽性対照としてｃ−ｍｙｃのＩＲの全長を含むプラスミド（「ｐＣｆ．Ｉ」）、または陰性対照としてｃ−ｍｙｃのＩＲを含まないプラスミド（「ｐＴＨＶ」）をそれぞれＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入し６週間選択培地で培養することで形質転換細胞を取得した。取得された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度（Frequency of HSR）を既述の方法により調べた。
【００９８】
その結果を図６に示した。図６Ａはｃ−ｍｙｃ遺伝子座（Genbank HSMYCC; accession number X00364）の概略図である。ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のHind III-Xho I断片（２３４９ｂｐ）の相当する。図６ＢおよびＣは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲ全長と、その部分断片であるＣ０〜Ｃ１６との位置関係、並びに各部分断片が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示している。また図６中の「□（白四角）」はｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲにおけるtopoisomeraseII結合領域の位置を示し、「◆（黒ひし）」はDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）の位置を示し、「○（白丸）」はプラスミドの自己複製を助けると報告されている、ヒトの３６ｂｐのコンセンサス配列の内のコア２０ｂｐに相当する配列の位置をそれぞれ示している。また、「ｃI」はDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）を含む遺伝子増幅活性を有する塩基配列の位置、「ｃII」はtopoisomeraseII結合領域を含む遺伝子増幅活性を有する塩基配列の位置、「ｃII’」はCIIに類似した配列の位置、「N」はネガティブ領域（ＨＳＲ形成を抑制する領域）の位置をそれぞれ示している。
【００９９】
図６ＢおよびＣによれば、ｐＣ３、ｐＣ1、ｐＣ１２を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度が顕著に高く、また陽性対照のそれよりも多いことが分かった。またｐＣ２またはｐＣ７を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度は、陽性対照のそれと同等であった。またｐＣ９またはｐＣ６を遺伝子導入して得られた形質転換細胞についてＨＳＲの発生が観察された。特にこの検討によって全長のＩＲに代えてＩＲの部分断片（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ１２）を用いた場合にＨＳＲ発生頻度がさらに高くなるという、新規知見が得られた。
【０１００】
〔参考例３〕
遺伝子増幅活性を有するＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲの部分断片の同定を行った。ＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲを用いた以外は、参考例２と同様にした。すなわち、ＰＣＲを用いてＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲの部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）を作製し、当該部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）をそれぞれｐＴＨＶ（図３Ｊ）のＡｓｃ Ｉサイトに挿入し、Ｄ１〜Ｄ１１を含むプラスミド（ｐＤ１〜ｐＤ１１）を作製した（各種プラスミドの項を参照のこと）。陽性対照としてＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲの全長を含むプラスミド（「ｐＤｆ．Ｉ」）を採用し、また陰性対照としてＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲを含まないプラスミド（「ｐＴＨＶ」）を採用した。
【０１０１】
本実施例の結果を図７に示す。図７にはＤＨＦＲ遺伝子座（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の概略図が示されており、ＤＨＦＲ遺伝子座のBamHI-Hind III断片（４．６ｋｂｐ）がＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲに相当する。また図７には、ＤＨＦＲ遺伝子座のＩＲ全長とその部分断片であるＤ０〜Ｄ１１との位置関係、並びに各部分断片が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す。
【０１０２】
図７によれば、ｐＤ１を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度が最も高く、また陽性対照のそれよりも多いことが分かった。またｐＤ４を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度は、陽性対照のそれと同等であった。またｐＤ８、ｐＤ９、ｐＤ２またはｐＤ３を遺伝子導入して得られた形質転換細胞についてＨＳＲの発生が観察された。特にこの検討によって全長のＩＲに代えてＩＲの部分断片（Ｄ１）を用いた場合にＨＳＲ発生頻度がさらに高くなるという、新規知見が得られた。
【０１０３】
なお、図７中□（白四角）はtopoisomeraseII結合領域を示し、図７中◆（黒ひし形）はDuplex Unwinding Elementを示し、図７中＝（二重線）は湾曲ＤＮＡ（ｂｅｎｔ ＤＮＡ）を示し、図７中△（白三角）はＲＩＰ６０結合領域を示し、図７中「ＡＴ」はＡＴ−ｒｉｃｈエレメントを示す。
【０１０４】
＜実施例＞
〔実施例１〕
特開昭６３−１８５３９６号公報に記載のEPO782SVBPVプラスミドに含まれるエリスロポエチン遺伝子を、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターを有するプラスミド（pCMV Vector（4.01kbp）、参考文献：米国特許5168062号、米国特許5385839号、またはBoshart,M.,et al., Cell vol.41,p521-530(1985)）、ＳＲαプロモーターを有するプラスミド（pSRα Vector（5.22kbp）、参考文献：YUTAKA TATEBE et al., Mol.Cell.Biol.vol.8, p466-472(1988)）、シミアンウイルス４０初期プロモーターを有するプラスミド（pSV40 Vector（14.09kbp）、参考文献：Buchman,A.R. et al., Mol.Cell.Biol.vol4, p1900-1914(1984)）のＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトにそれぞれ連結してpCMV-EPO(4.78kbp)、pSRα-EPO(5.99kbp)、pSV40-EPO(4.40kbp)をそれぞれ構築した（図８を参照のこと）。
【０１０５】
ＩＲ／ＭＡＲベクターとして特開２００４−３３７０６６号公報に記載されているpΔBN.AR1(8.92kbp)を用いた（図９を参照のこと）。pΔBN.AR1(8.92kbp)は、ブラスティサイジン耐性遺伝子とブラスティサイジン耐性遺伝子の下流に強いＭＡＲ活性を示す配列(ＡＲ１)およびＤＨＦＲ由来の全長ＩＲを有しており、このプラスミドで哺乳動物細胞をコトランスフェクトすることによって、目的遺伝子が染色体に組み込まれたＨＳＲ産生が増大することが明らかになっている。
【０１０６】
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞、入手先：理化学研究所バイオリソースセンター: RCB0285）を、２４穴培養プレート（SUMILON社製:MS-80240）で４×１０4cells/wellになるまで培養した。その際DMEM/F-12培地(GIBCO社製:12400-024)に１０％牛胎児血清(GIBCO社製:2614-079)を添加した培地を使用した。
【０１０７】
エリスロポエチン遺伝子を含むプラスミド（pCMV-EPO(4.78kbp)、pSRα-EPO(5.99kbp)、またはpSV40-EPO(4.40kbp)）に対するpΔBN.AR1のモル比がそれぞれ０．３、１．５、３、５となるような条件で、エリスロポエチン遺伝子を含むプラスミド（pCMV-EPO(4.78kbp)、pSRα-EPO(5.99kbp)、またはpSV40-EPO(4.40kbp)）とpΔBN.AR1とをLipofectamine2000試薬(Invitrogen社製：11668-019)を用いて、上記ＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクションで導入した。
【０１０８】
トランスフェクションから２日後にブラスティサイジン(Invivogen社製:ant-bl-1)を５μg/mlの濃度となるように培地に添加し、２週間、３７℃で培養し安定な形質転換細胞を取得した。次に、細胞培養シャーレ内径６０ｍｍ(SUMILON社製:MS-11600)レベルまで、拡大培養後、段階的にブラスティサイジン濃度を高めていき、最終濃度３２０μg/mlで安定して生育できる細胞が得られるまで培養を続けた。
【０１０９】
このようにして得られた細胞からゲノムＤＮＡを取得し、エリスロポエチン遺伝子のＤＮＡコピー数の増加を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ABI社製:7900HT）を用いて確認した。測定試薬にはSYBR Green Realtime PCR Master Mix(東洋紡社製:QPK-201)を使用した。
【０１１０】
上記のようにして遺伝子増幅を確認した後、ブライスティサイジン３２０μg/mlを添加して３日間培養した上清を取得し、イムノエリット・ＥＰＯ測定キット(東洋紡社製: LEPO-592)を用いてＥＩＡ法でエリスロポエチン濃度を測定した。具体的には、培養上清をイムノエリット・ＥＰＯ測定キット付属の希釈液で１０００倍希釈し、抗エリスロポエチン抗体結合プレートに２５μl/well添加した。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗エリスロポエチン抗体を７５μl/well添加し、３０℃で２時間インキュベートした。その後、プレートをイムノエリット・ＥＰＯキット付属の洗浄液で３回洗浄し完全に水分を除き、発色試薬１００μl/wellを添加して室温で３０分間反応させた。反応停止液１００μl/wellを添加して反応を止め、プレートリーダー（主波長４９０ｎｍ、副波長６５０ｎｍ）で吸光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとにエリスロポエチン濃度を算出した。
【０１１１】
その結果を図１０および表１に示す。なお図１０は、表１のデータを棒グラフで示したものである。図１０および表１中の「モル比」は第２ベクターに対する第１ベクターのモル比を示し、「ＥＰＯ濃度(U/ml)」はエリスロポエチン濃度を示す。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
pSRα-EPOとpΔBN.AR1とをＣＨＯ-Ｋ１細胞に導入した場合、pSRα-EPOに対するpΔBN.AR1のモル比が１．５の時にエリスロポエチン濃度が最高値を示した。また、pCMV-EPOとpΔBN.ARとをＣＨＯ-Ｋ１細胞に導入した場合は、pCMV-EPO に対するpΔBN.AR1のモル比が３．０の時にエリスロポエチン濃度が最高値を示した。また、pSV40-EPOとpΔBN.ARとをＣＨＯ-Ｋ１細胞に導入した場合は、pSV40-EPOに対するpΔBN.AR1のモル比が３．０の時にエリスロポエチン濃度が最高値を示した。
【０１１４】
よって、エリスロポエチン遺伝子を含むベクター（第２ベクターに相当する）に対するＩＲ／ＭＡＲベクター（第１ベクターに相当する）のモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入することが極めて有効であることが確認できた。
【０１１５】
〔実施例２〕
実施例１においてpSRα-EPOに対するpΔBN.AR1のモル比が１．５となるような条件で遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を限界希釈法でクローニング行い、１４日間培養後、比較的増殖能の良好なクローンを選抜した。そのクローンを細胞培養シャーレ内径６０ｍｍ(SUMILON社製:MS-11600)レベルまで拡大培養し、拡大培養３日間後、イムノエリット・ＥＰＯ測定キット(東洋紡社製: LEPO-592)を用いてＥＩＡ法でエリスロポエチン濃度を測定した。なお、pSRα-EPOを単独で導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陰性対照とした。
【０１１６】
その結果を図１１、並びに表２および３に示した。なお図１１（Ａ）および表２はpSRα-EPOとpΔBN.AR1とを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞の結果を示し、図１１（Ｂ）および表３は陰性対照の結果を示す。図１１、並びに表２および３中の「Clone」はクローニングされたクローン名を示し、「ＥＰＯ濃度(U/ml)」はエリスロポエチン濃度を示す。また表２および３中の「copy数」はエリスロポエチン遺伝子のコピー数を示す。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
クローニング前の未クロ−ニング細胞のエリスロポエチン濃度レベルを図１１中矢印で示した。図１１、並びに表２および３によればpΔBN.AR1とpSRα-EPOとをコトランスフェクションで導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、未クローニング細胞よりも高いエリスロポエチン発現量を示すクローン（「高発現クローン」という）の出現率が６０％（＝９÷１５×１００）であった。これに対して陰性対象の場合は高発現クローンの出現率が２０％（＝３÷１５×１００）であった。よってpΔBN.AR1とpSRα-EPOとを所定の条件でコトランスフェクションすることによって、高確率で高発現クローンを取得できるということが判明した。
【０１２０】
次に実施例１においてpCMV-EPOに対するpΔBN.AR1のモル比が３となるような条件で遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞についても上記と同様にして、限界希釈法によるクローニングおよび培養後、エリスロポエチン濃度を測定した。なお、pSRα-EPOが単独で導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陰性対照とした。
【０１２１】
その結果を図１２、並びに表４および５に示した。なお図１２（Ａ）および表４はpCMV-EPO とpΔBN.AR1とを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞の結果を示し、図１２（Ｂ）および表５は陰性対照の結果を示す。図１２、並びに表４および５中の「Clone」はクローニングされたクローン名を示し、「ＥＰＯ濃度(U/ml)」はエリスロポエチン濃度を示す。また表４および５中の「copy数」はエリスロポエチン遺伝子のコピー数を示す。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
クローニング前の未クロ−ニング細胞のエリスロポエチン濃度レベルを図１２中矢印で示した。図１２、並びに表４および５によればpΔBN.AR1とpSRα-EPOとをコトランスフェクションで導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、未クローニング細胞よりも高いエリスロポエチン発現量を示すクローン（「高発現クローン」という）の出現率が３０％（＝６÷２０×１００）であった。これに対して陰性対象の場合は高発現クローンの出現率が１５％（＝３÷２０×１００）であった。よってpΔBN.AR1とpCMV-EPとを所定の条件でコトランスフェクションすることによって、高確率で高発現クローンを取得できることが判明した。
【０１２５】
〔実施例３〕
本実施例では、参考例２において使用したｐＣ１２（図１４（Ａ）を参照のこと）におけるＳＲαプロモーター（図１４（Ａ）において「ＰＳＲα」で示す）を、ＳＶ４０初期領域由来プロモーター領域（以下、単に「ＳＶ４０プロモーター」という）に置換したｐＣ１２.Ｐｓｖ４０（図１４（Ｂ）に示す）を使用した。図１４（Ｂ）においてＳＶ４０プロモーターを「Ｐｓｖ４０」として示す。ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０の作製方法は以下の通りである。
【０１２６】
まずｐＣ１２をＥｃｏ ＲＩおよびＸｈｏ Ｉで制限酵素消化することによりＳＲαプロモーター領域を切り出した。切り出した部位へ、マルチクローニングサイトを含む合成オリゴヌクレオチド（ＥＳＭＸリンカー）を挿入した。このマルチクローニングサイトの制限酵素サイトはアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐR）の下流(すなわちＳＲαプロモーターがあった部位)に位置しており、制限酵素サイトが５’末端から３’末端にかけてＥｃｏ ＲＩ−Ｓａｌ Ｉ−Ｍｌｕ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉの順番で配列している。なおＥＳＭＸリンカーの塩基配列を、表６および配列番号８５および配列番号８６に示した。上記のようにして作製したプラスミドをＳａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化した。その後、Ｓａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化したＳＶ４０プロモーターを、上記プラスミドに挿入し、ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０を構築した。ＳＶ４０プロモーターは、ＢＳＲを転写する方向でプラスミドに挿入された。
【０１２７】
なお、ＳＶ４０プロモーターは下記のようにして作製された。ｐＭＡＣＳ４．１(Mitenyi Biotech社製)を鋳型として、ＳＶ４０プロモーター増幅用プライマー（MACS4.1 4288LおよびMACS4.1 1454R）を用い、ＰＣＲ法により増幅した。増幅されたＳＶ４０プロモーターは、Ｓａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化して使用した。ＳＶ４０プロモーター増幅用プライマーであるMACS4.1 4288L（配列番号８７）およびMACS4.1 1454R（配列番号８８）の塩基配列を表１に示す。ＳＶ４０プロモーターの塩基配列を配列番号８９に示し、ＳＲαプロモーターの塩基配列を配列番号９０に示した。
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
抗Pyrococcus kodakaraensis KOD1株由来のDNAポリメラーゼに対する抗体（「抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体」という）を産生するマウスハイブリドーマ細胞（入手先：生命工学工業技術研究所、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５７）から、RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製、74134)を用いてトータルＲＮＡを抽出し、Rever Tra Ace-α-(東洋紡社製、FSK-101)を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。抗ＫＯＤ ＤＮＡ ポリメラーゼ抗体のシグナル配列を除く重鎖と軽鎖を特異的に増幅するプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、それぞれの増幅産物にイムノグログリン κ鎖由来のシグナル配列を付加した後、ＣＭＶプロモーターを有するプラスミドのＸｂａ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉサイトに連結してpCMV-H（図１３（Ａ）を参照のこと）およびpCMV-L（図１３（Ｂ）を参照のこと）を構築した。
【０１３０】
pCMV-HおよびpCMV-Lを、ＩＲ／ＭＡＲベクターとともにＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクトした。この時、pCMV-HおよびpCMV-Lの合計のモル数に対するＩＲ／ＭＡＲベクターのモル比は３であった。トランスフェクションは、Lipofectamine2000試薬(Invitrogen社製：11668-019)を用いて行われた。なおＩＲ／ＭＡＲベクターにはpΔBN.AR1またはpC12.Psv40（4920bp）を用いた（図１４を参照のこと）。
【０１３１】
トランスフェクションから２日後にブラスティサイジン(Invivogen社製:ant-bl-1)を５μg/mlの濃度となるように培地に添加し、２週間、３７℃で培養し安定な形質転換細胞を取得した。
【０１３２】
次に、細胞培養シャーレ内径６０ｍｍ(SUMILON社製:MS-11600)レベルまで、拡大培養後、段階的にブラスティサイジン濃度を高めていき、最終濃度３２０μg/mlで安定して生育できる細胞が得られるまで培養を続けた。
【０１３３】
上記で取得した細胞集団を限界希釈法でクローニングした後、培養上清を取得しＥＩＡ法で抗体濃度を測定した。詳細には、ヤギ抗マウス抗体を固相化したＥＬＩＳＡ用プレート(SUMILON社製:MS-8896F)に、１０ｍＭ ＰＢＳ(−)で５倍希釈した培養上清を添加し３５℃で２時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１０％ヤギ血清で４０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体を、５０μl/wellとなるようにＥＬＩＳＡ用プレートに添加し３５℃で２時間インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡ用プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し完全に水分を除き、発色試薬５０μl/wellを添加して室温で１５分間反応させた。１Ｎ硫酸溶液５０μl/wellを添加して反応を止め、プレートリーダー（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。
【０１３４】
その結果を図１５、並びに表７〜９に示す。なお、ＩＲ／ＭＡＲベクターが導入されずにpCMV-HおよびpCMV-Lのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陰性対照とした。図１５（Ａ）および表７はＩＲ／ＭＡＲベクターとしてpΔBN.AR1を用いた場合の結果を示し、図１５（Ｂ）および表８はＩＲ／ＭＡＲベクターとしてpC12.Psv40を用いた場合の結果を示し、図１５（Ｃ）および表９は陰性対照の結果を示す。図１５、並びに表７〜９中の「Clone」はクローニングされたクローン名を示し、「抗体濃度(μｇ/L)」は抗体濃度を示す。
【０１３５】
【表７】
【０１３６】
【表８】
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
クローニング前の未クロ−ニング細胞の抗体濃度レベルを図１５中矢印で示した。図１５、並び表７〜９によれば、pCMV-HおよびpCMV-LをＩＲ／ＭＡＲベクターとともに導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、未クローニング細胞よりも高い抗体発現量を示すクローン（「高発現クローン」という）の出現率が９５％（＝１９÷２０×１００）であった。これは、ＩＲ／ＭＡＲベクターとして、全長のＩＲを備えるpΔBN.AR1、および遺伝子増幅活性部位を有するＩＲの部分断片を備えるpC12.Psv40のいずれを採用した場合も同じであった。これに対して陰性対象の場合は高発現クローンの出現率が２５％（＝５÷２０×１００）であった。よってpCMV-HおよびpCMV-Lを、ＩＲ／ＭＡＲベクターとをコトランスフェクションすることによって、高確率で高発現クローンを取得できることが判明した。特にpC12.Psv40を用いた場合は、pΔBN.AR1場合に比して、抗体の生産量が高いクローンを多く取得することができるという興味深い結果が得られた。
【０１３９】
〔実施例４〕
６×ヒスチジンタグに対する抗体（「抗ヒスチジンタグ抗体」）を産生するマウスハイブリドーマ細胞構築し、当該ハイブリドーマ細胞からRNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製: 74134)を用いてトータルRNAを抽出しRever Tra Ace-α-（東洋紡社製: FSK-101）を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。Mouse Ig-Primer Sets(Novagen社製: 69831-3)の5’プライマーと、抗体遺伝子全長を増幅する3’プライマーを用いてＰＣＲ増幅し増幅産物を得た。なお、ＰＣＲにはＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製：KFX-101）を使用した。
【０１４０】
ヒト伸長因子１−αプロモーター（「ＥＦ１αプロモーター」）を含む発現ベクター（ｐＥＦ１α）に、抗ヒスチジンタグ抗体のＨ鎖をコードする遺伝子およびびＬ鎖コードする遺伝子をタンデムに連結し、抗ヒスチジンタグ抗体遺伝子を増幅するベクターｐＥＦ１α-ＨＬを構築した（図１６を参照）。なおｐＥＦ１αは、特許文献 特許第３０５１４１１号公報に記載のＥＦ１αプロモーターを、ｐＣＩ−ｎｅｏ(Promega社)ベクターのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに導入することで構築された。
【０１４１】
ＩＲ／ＭＡＲベクターとしてpC12.Psv40を用い、抗ヒスチジンタグ抗体の遺伝子を含むプラスミドｐＥＦ１α-ＨＬに対するpC12.Psv40のモル比がそれぞれ０．３、１．５、３、５となるような条件で、抗ヒスチジンタグ抗体の遺伝子を含むプラスミドｐＥＦ１α-ＨＬとpC12.Psv40とをLipofectamine2000試薬(Invitrogen社製：11668-019)を用いて、上記ＣＨＯ−Ｋ１細胞にコトランスフェクションで導入した。
【０１４２】
トランスフェクションから２４時間後に培養上清を回収しＥＬＩＳＡ法で抗体生産性を調べた。１０μg/mlの６×ヒスチジンタグを付加したサルコシンオキシダーゼ抗原を５０μl/wellとなるようにＥＬＩＳＡ用プレート(SUMILON社製:MS-8896F)に分注し、３５℃で２時間インキュベートした後、０．１％（ｗ/ｖ）Tween入りＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で３回洗浄した。３００μl/wellの１％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ入りＰＢＳをＥＬＩＳＡ用プレートに分注し、４℃で一晩放置して、抗原固相化プレートを作製した。
【０１４３】
０．１％（ｗ/ｖ）Tween入りＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で３回洗浄後、ＰＢＳで５倍希釈した細胞培養液上清５０μl/wellをＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、３５℃で２時間インキュベートした。続いて０．１％（ｗ/ｖ）Tween入りＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で３回洗浄後、１％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ入りＰＢＳで４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗体(DAKO社製: P0161)を５０μl/wellとなるようにＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、３５℃で２時間インキュベートした。０．１％（ｗ/ｖ）Tween入りＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で４回洗浄後、ＴＭＢ発色試薬５０μl/wellをＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、室温で５分間反応させた。１Ｎ硫酸溶液５０μl/wellを添加して反応を止め、プレートリーダー（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。
【０１４４】
その結果を図１７に示す。なお図１７中の「モル比」は第２ベクターに対する第１ベクターのモル比を示し、「抗体濃度(μｇ/L)」は抗体濃度を示す。図１７によれば、抗ヒスチジンタグ抗体遺伝子を増幅するベクターｐＥＦ１α-ＨＬとpC12.Psv40とをＣＨＯ-Ｋ１細胞に導入した場合、ｐＥＦ１α-ＨＬに対するpC12.Psv40のモル比が１．５の時に抗ヒスチジンタグ抗体の濃度が最高値を示したことがわかる。
【０１４５】
〔実施例５〕
実施例３に記載の抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から、RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製：74134)を用いてトータルＲＮＡを抽出し、Rever Tra Ace-α-(東洋紡社製：FSK-101)を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体のシグナル配列を除くＨ鎖とＬ鎖とを特異的に増幅し得るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。それぞれのＰＣＲ増幅産物にイムノグログリン κ鎖由来のシグナル配列を付加した後、ＳＲαプロモーターを有するプラスミド（pSRα Vector（5.22kbp）のＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに連結してpSRα-HおよびpSRα-Lを構築した。
【０１４６】
pSRα-HおよびpSRα-LをpΔBN.AR1とともにチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞、入手先：理化学研究所バイオリソースセンター RCB1637）、ヒト子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ Ｓ３細胞、入手先：理化学研究所バイオリソースセンター RCB0191）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−７細胞、入手先：理化学研究所バイオリソースセンター RCB0539）それぞれにコトランスフェクトした。この時、pSRα-HおよびpSRα-Lの合計のモル数に対するＩＲ／ＭＡＲベクターのモル比は１．５であった。また実施例３で構築したpCMV-HおよびpCMV-Lについても上記と同様にコトランスフェクトした。この時、pCMV-HおよびpCMV-Lの合計のモル数に対するＩＲ／ＭＡＲベクターのモル比は３であったなお、ＩＲ／ＭＡＲベクターが導入されずにpCMV-HおよびpCMV-Lのみを導入した場合を陰性対照とした。
【０１４７】
トランスフェクション２日後にブラスティサイジン(Invivogen社製:ant-bl-1)を5μg/mlの濃度で培地に添加して、３〜４日間隔で培地を入れ替えながら２週間培養し、安定な形質転換体を得た。次に、細胞培養シャーレ内径６０ｍｍ(SUMILON社製:MS-11600)レベルまで、拡大培養後、段階的にブラスティサイジン濃度を高めていき、最終濃度３２０μg/mlで安定して生育できる細胞が得られるまで培養を続けた。
【０１４８】
このようにして得られた未クローニング細胞にブライスティサイジン320μg/mlを培地に添加して４日間培養した。この培養液上清を取得し、実施例３に記載した方法と同様にしてＥＬＩＳＡ法で抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体の濃度を測定した。
【０１４９】
その結果を図１８および表１０に示した。図１８および表１０中「pCMV−HL(without IR/MAR)」は陰性対照の結果を示し、「pCMV−HL(with IR/MAR)」はpCMV-HおよびpCMV-LをpΔBN.AR1とともに各種細胞へ導入した結果を示し、「pSRα−HL(with IR/MAR)」はpSRα−HおよびpSRα−LをpΔBN.AR1とともに各種細胞へ導入した結果を示す。図１８の「抗体濃度(μｇ/L)」および表１０中の数値は、抗体濃度を示す。
【０１５０】
【表１０】
【０１５１】
図１８および表１０の結果から、ＩＲ／ＭＡＲベクターと抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体遺伝子を含むプラスミドとを用いた遺伝子発現は、様々な哺乳類宿主細胞に適用可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
上記説示したように、本発明によれば、目的遺伝子の導入効率および発現効率が高く、目的遺伝子を高発現するクローンの選択効率が高い哺乳動物細胞の形質転換方法を提供し、医薬品等の有用タンパク質の生産コストを低下させることができる。なお、本発明において利用するＩＲ／ＭＡＲベクターを用いた高度遺伝子増幅系は、宿主細胞は特に限定されず、広範な哺乳動物細胞を利用することができる。
【０１５３】
したがって、本発明はタンパク質の生産を行う産業、例えば、医薬品、化学、食品、化粧品、繊維等種々広範な産業において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ＩＲ／ＭＡＲベクターによってＤＭおよびＨＳＲが生じるメカニズムを示す模式図である。
【図２】ベクターによって形質転換されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭに生じたＤＭおよびＨＳＲをＦＩＳＨ法によって検出した蛍光顕微鏡像であり、ＡおよびＢはｐＳＦＶｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＣはｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＤはｐＴＨ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＥはｐＥＰＩ−Ｉが導入された形質転換細胞の結果を示す。
【図３】実施例および参考例において使用されている各種プラスミドの概略図である。
【図４】参考例１においてｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲプラスミドが遺伝子導入されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭに生じたＨＳＲの頻度を示す棒グラフである。
【図５】プラスミド（ｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＨｐＡ、ｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖ、ｐＥＰＩ−１、またはｐＴＨ３）が導入された、ＨｅＬａ（図５（Ａ））、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ（図５（Ｂ））、またはＣＯＬＯ３２０ＤＭ（図５（Ｃ））のＨＳＲ発生頻度を示す棒グラフである。
【図６】参考例２の結果を示す図であり、（Ａ）はｃ−ｍｙｃ遺伝子座（GenBank HSMYCC; accession number X00364）の概略図であり、（Ｂ）および（Ｃ）はｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲ全長とその部分断片Ｃ０〜Ｃ１６との位置関係を示す図、並びに上記部分断片を含むプラスミド（ｐＣ０〜ｐＣ１６）が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す図である。
【図７】参考例３の結果を示す図であり、ＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の概略図、ＤＨＦＲβ―Ｏｒｉ遺伝子座のＩＲ全長とその部分断片Ｃ０〜Ｃ１１との位置関係を示す図、および各部分断片を含むプラスミドが導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す図である。
【図８】実施例において使用したベクターの構築方法の概略を示す図である。
【図９】pΔBN.AR1の模式図である。
【図１０】エリスロポエチン遺伝子を含むプラスミド（pCMV-EPO(4.78kbp)、pSRα-EPO(5.99kbp)、またはpSV40-EPO(4.40kbp)）およびpΔBN.AR1がコトランスフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞のエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフである。
【図１１】（Ａ）はpSRα-EPOおよびpΔBN.AR1がコトランフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンのエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフであり、（Ｂ）はpSRα-EPOのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンのエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフである。
【図１２】（Ａ）はpCMV-EPOおよびpΔBN.AR1がコトランフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンのエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフであり、（Ｂ）はpCMV-EPOのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンのエリスロポエチンの生産量を示す棒グラフである。
【図１３】（Ａ）はpCMV-Hの模式図であり、（Ｂ）はpCMV-Lの模式図である。
【図１４】（Ａ）はpc12の模式図であり、（Ｂ）はpC12.Psv40の模式図である。
【図１５】（Ａ）はpCMV-HおよびpCMV-LとpΔBN.AR1とがコトランスフェクションによりＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンの抗体生産量を示す棒グラフであり、（Ｂ）はpCMV-HおよびpCMV-LとpC12.Psv40とがコトランスフェクションによりＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンの抗体生産量を示す棒グラフであり、（Ｃ）はpCMV-HおよびpCMV-Lのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の各クローンの抗体生産量を示す棒グラフである。
【図１６】ｐＥＦ１α-ＨＬの模式図である。
【図１７】ｐＥＦ１α-ＨＬとpC12.Psv40とがコトランスフェクションにより導入されたＣＨＯ-Ｋ１細胞の抗体生産量を示す棒グラフである。
【図１８】pSRα-HおよびpSRα-Lと、pΔBN.AR1とがコトランスフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞、またはＣＯＳ−７細胞の抗体生産量；pCMV-HおよびpCMV-Lと、pΔBN.AR1とがコトランスフェクションにより導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞、またはＣＯＳ−７細胞の抗体生産量；並びにpCMV-HおよびpCMV-Lのみが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞、またはＣＯＳ−７細胞の抗体生産量を示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物核マトリックス結合領域とを含む第１ベクター、
および哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入することを特徴とする、哺乳動物細胞の形質転換方法。
【請求項２】
上記哺乳動物複製開始領域が、遺伝子増幅活性部位を有する哺乳動物複製開始領域の部分断片である、請求項１に記載の形質転換方法。
【請求項３】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座由来の複製開始領域、β−グロビン遺伝子座由来の複製開始領域、およびエプスタイン・バーウイルス潜在複製開始領域からなる群から選択される、請求項１または２に記載の形質転換方法。
【請求項４】
上記哺乳動物核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項５】
上記プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、およびハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーターからなる群から選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項６】
上記プロモーターが、ＳＲαプロモーターまたはヒト伸長因子１−αプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は１．５であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項７】
上記プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は３であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか1項に記載の形質転換方法。
【請求項８】
目的遺伝子の５’末端側に分泌シグナル配列を含むことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか1項に記載の形質転換方法。
【請求項９】
上記第１ベクターおよび／または第２ベクターに、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子が含まれていることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項１０】
上記選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ブラスチシジンＳデアミナーゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質遺伝子からなる群より選択される、請求項９に記載の形質転換方法。
【請求項１１】
上記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胎児腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト子宮頸部癌細胞、およびマウスミエローマ細胞からなる群より選択される、請求項１ないし１０のいずれか1項に記載の形質転換方法。
【請求項１２】
第１ベクターおよび第２ベクターを哺乳動物細胞に導入した後に、目的遺伝子が高発現するクローンを選抜する選抜工程を含む、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の形質転換方法によって得られた形質転換細胞を培養する培養工程を含む、タンパク質の生産方法。
【請求項１４】
上記培養工程によって得られた培養物から所望のタンパク質を精製する精製工程を含む、請求項１３に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の形質転換方法によって得られた形質転換細胞。
【請求項１】
哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物核マトリックス結合領域とを含む第１ベクター、
および哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入することを特徴とする、哺乳動物細胞の形質転換方法。
【請求項２】
上記哺乳動物複製開始領域が、遺伝子増幅活性部位を有する哺乳動物複製開始領域の部分断片である、請求項１に記載の形質転換方法。
【請求項３】
上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座由来の複製開始領域、β−グロビン遺伝子座由来の複製開始領域、およびエプスタイン・バーウイルス潜在複製開始領域からなる群から選択される、請求項１または２に記載の形質転換方法。
【請求項４】
上記哺乳動物核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項５】
上記プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、およびハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーターからなる群から選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項６】
上記プロモーターが、ＳＲαプロモーターまたはヒト伸長因子１−αプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は１．５であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項７】
上記プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターを使用した場合において、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比は３であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか1項に記載の形質転換方法。
【請求項８】
目的遺伝子の５’末端側に分泌シグナル配列を含むことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか1項に記載の形質転換方法。
【請求項９】
上記第１ベクターおよび／または第２ベクターに、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子が含まれていることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項１０】
上記選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ブラスチシジンＳデアミナーゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質遺伝子からなる群より選択される、請求項９に記載の形質転換方法。
【請求項１１】
上記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胎児腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト子宮頸部癌細胞、およびマウスミエローマ細胞からなる群より選択される、請求項１ないし１０のいずれか1項に記載の形質転換方法。
【請求項１２】
第１ベクターおよび第２ベクターを哺乳動物細胞に導入した後に、目的遺伝子が高発現するクローンを選抜する選抜工程を含む、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の形質転換方法によって得られた形質転換細胞を培養する培養工程を含む、タンパク質の生産方法。
【請求項１４】
上記培養工程によって得られた培養物から所望のタンパク質を精製する精製工程を含む、請求項１３に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の形質転換方法によって得られた形質転換細胞。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１９５１９７（Ｐ２００９−１９５１９７Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４２０２２（Ｐ２００８−４２０２２）
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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