哺乳類発現ベクター及びそれを含む組成物
【課題】IL-18は、T細胞からのIFN-γの産生を誘導し、細胞障害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞を活性化して抗腫瘍免疫効果を著しく増強するサイトカインである。しかしながら、IL-18遺伝子は、分泌に必要なシグナル配列を欠くため、IL-18遺伝子を単独で哺乳類細胞に導入しても、細胞からサイトカインタンパクを分泌させることができず、遺伝子導入による癌治療への活用が困難となっている。
【解決手段】他のサイトカイン（IL-12p40）遺伝子のシグナル配列を持った哺乳類細胞発現ベクターを作製し、そこにIL-18の成熟タンパクをコードするcDNAを連結することによって、単独遺伝子導入でもIL-18サイトカインタンパクの細胞からの分泌を可能にする。
【解決手段】他のサイトカイン（IL-12p40）遺伝子のシグナル配列を持った哺乳類細胞発現ベクターを作製し、そこにIL-18の成熟タンパクをコードするcDNAを連結することによって、単独遺伝子導入でもIL-18サイトカインタンパクの細胞からの分泌を可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類発現ベクター、特に生体の免疫効果を増幅するインターロイキン18（以下「IL-18」と略記する）を細胞に分泌させることができる哺乳類発現ベクター、及び該ベクターを含む組成物に関する。また、本発明は、該ベクターの製造方法、より詳しくはシグナルシークエンス付のIL-18遺伝子の作製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
IL-18は、Ｔ細胞からのインターフェロンガンマ（以下「IFNγ」と略記する）の産生を誘導し、免疫反応を増強するサイトカインで、細胞障害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞を活性化して抗腫瘍免疫効果を著しく増強するものとして期待されている。
【０００３】
例えばIL-18とインターロイキン12（以下「IL-12」と略記する）を含む薬剤を抗癌剤として用いたり（特許文献１参照）、免疫能力を高めるためのIL-18の産生促進剤が提案されたりしている（特許文献２参照）。また、IL-18をコードする遺伝子を癌細胞内に挿入させて癌の抑制に用いる方法の提案もある（特許文献３）。
【０００４】
IL-18を遺伝子操作技術によってクローニングすることは、すでに行われており、遺伝子組み換え手法を用いた量産化も検討されている。細胞内で遺伝子情報をもとに合成されるタンパクは、通常小胞体を経由して細胞外に分泌される。しかし、IL-18遺伝子は小胞体内にタンパクを送り込むためのシグナル配列を欠くため、細胞内から成熟タンパクとして分泌されるためには、細胞内でインターロイキン１β変換酵素（以下「ICE」と略記する）の作用を受けて変形することが必要である。
【０００５】
そのため、遺伝子導入によって動物細胞から活性のあるIL-18を分泌させるためには、IL-18遺伝子のみでなく、ICEをコードする遺伝子をも導入しなければならない。そこで、ICE遺伝子とIL-18をコードする遺伝子を結合させて、細胞内でIL-18を分泌させ、量産化を行おうという提案がある（特許文献４参照）。また、昆虫（カイコ）細胞でIL-18を産生するために、シグナル配列を含むDNAをバキュロウイルストランスファーベクターpVL1392（ファーミンジェン社）に入れ、組換えバキュロウイルスを作製した例も開示されている（特許文献４参照）。
【特許文献１】特開２００１−５２１９０６号公報
【特許文献２】特開２００１−２３３７８４号公報
【特許文献３】特開平１１−１３９９９４号公報
【特許文献４】特開２０００−７８９７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子組み換え手法を用いてIL-18を産生するのであれば、特許文献４に開示された方法でも可能である。しかし、哺乳類の細胞内でIL-18を意図的に産生させるには、ICEと共にIL-18のcDNAを導入するのでは、細胞からの分泌が十分でない。癌治療に活用するためには、癌細胞若しくはその周辺の細胞自体からIL-18を分泌させＴ細胞活性を促す必要がある。
【０００７】
また、特許文献４で開示されたシグナル配列を含むIL-18のcDNAを有するベクターは哺乳類細胞での発現はできない。
【０００８】
そこで、本発明が解決しようとする問題点は、哺乳類細胞からIL-18を分泌させるためのベクターを作成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
シグナルペプチドをコードする塩基配列と、
ＩＬ−１８をコードする塩基配列と、
前記シグナルペプチドをコードする塩基配列と前記ＩＬ−１８をコードする塩基配列とを結合する塩基配列と
を含む哺乳類発現ベクターである。
【００１０】
また、本発明は、上記の哺乳類発現ベクターと、媒体とを含む組成物でもある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の哺乳類発現ベクターを用いることにより、シグナル配列を有したIL-18のcDNAが哺乳類の細胞内に導入できるので、哺乳類の細胞自身がIL-18を多量に産生するという効果を得ることができる。IL-18の多量産生は、T細胞からのインターフェロンガンマ（IFNγ）の産生を誘導し、細胞障害性T細胞やナチュラルキラー細胞を活性化する。そのため、抗腫瘍免疫効果を著しく増強する。そのため癌細胞に対する免疫治療に利用できる期待が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のシグナル配列付のIL-18 cDNAを有した哺乳類発現ベクターは、哺乳類で発現するベクターにIL-12 p40のcDNAを付加し、そこからシグナル配列部分だけを残してIL-12のcDNAを切り取る。そして切り取った後にIL-18のcDNAを連結することにより作製できる。
【００１３】
本発明の哺乳類発現ベクターが含むシグナルペプチドは、該ベクターにより発現されるIL-18のタンパク質の細胞外への分泌を可能にするシグナルペプチドであれば、特に限定されない。好ましくは、IL-12のシグナルペプチドである。
【００１４】
本発明の哺乳類発現ベクターが含む、シグナルペプチドをコードする塩基配列とIL-18をコードする塩基配列とを結合する塩基配列は、遺伝子組み換え技術に従って上記のシグナルペプチドをコードする塩基配列とIL-18をコードする塩基配列とを連結する際に介在することが必要となる配列であり、好ましくは「ＡＴＡＴＧＧ」の配列である。
【００１５】
上記の哺乳類で発現するベクターは、当該技術において公知のものを用いることができ、例えばpcDNA3.1-Myc/His A (-)（Invitrogen社製）などの市販品を用いてもよい。
【００１６】
本発明の哺乳類発現ベクターは、適切な緩衝液を媒体とする組成物として用いることができる。該緩衝液としては、当該技術において通常用いられる緩衝剤からなるもの、例えばリン酸緩衝生理食塩水を用いることができる。
【００１７】
本発明の実施には、IL-12 p40遺伝子のシグナル配列連結したIL-18の成熟タンパクをコードするcDNAとそれらを組み込んだ哺乳類細胞用の発現ベクターを最良の形態とする。
【実施例１】
【００１８】
以下に実施例としてイヌのシグナル配列付のIL-18 cDNAを有した哺乳類ベクターの作製を述べる。
1．RNAの抽出とcDNAライブラリーの作製
以下にのべる方法によって、（１）コンカナバリンAで活性化させたイヌ末梢血単核細胞からRNAを抽出し、（２）それを逆転写してクローニングする遺伝子の素となるcDNAのライブラリーを作製した。
【００１９】
（１）リンパ球分離液（比重1.077g/ml、ナカライテスク社製）を用い、定法にしたがって、健常犬より採取した末梢血から末梢血単核細胞を回収した。ここで、定法は例えば文献（Sugiura et al., Immunobiol. (2004) 209:619-627）記載の方法である。しかし、末梢血から末梢血短核細胞を回収する方法であれば、これに限定されるものではない。
【００２０】
回収した末梢血単核細胞を2×106 /mlになるように牛胎子血清（FBS：Valley Biomedical社製、Winchester、VA、USA）を10%含むRPMI1640培地（日水製薬社製、東京）（10% FBS加RPMI）に浮遊し、コンカナバリンAを最終濃度20μg /mlになるように加え、37℃、5% CO2の条件下で48時間培養した。
【００２１】
培養後、細胞を回収し、細胞1×107個につき、セパゾール RNA I super（ナカライテスク社製）1 mlを加えて細胞を溶解した。その後、室温で5分間放置し、クロロフォルム200μlを加えて15秒間混和し、さらに室温で3分間放置して4 ℃、12,000×g、20分間遠心した。上部の透明層のみを1.5 ml用マイクロチューブに回収して、イソプロパノールを500μl加えて混和し、室温で10分間放置した後、4 ℃、12,000×g、20分間遠心した。
【００２２】
上清を捨て、RNA沈殿に80%エタノールを950μl加えて充分に混濁させた後、4 ℃、12,000×g、10分間遠心した。上清を捨て、沈殿を乾燥させた後、ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水10μlに沈殿を溶解させた。そのRNA溶液10μlに、DNase Buffer（TAKARA社製、草津）1.25μl、DNase I（TAKARA社製）0.5μl、RNase Inhibitor（TOYOBO社製、大阪）0.5μlを加え、軽く混和した後、ブロックインキュベーター（BI-535型、アステック社製、志免）を用いて37 ℃で30分間および80 ℃で20分間の条件で反応させた。反応後、260 nmにおける吸光度を測定することによってtotal RNAの濃度を算定した。
【００２３】
（２）DNase処理したトータルRNA 1μgに、random primer（TAKARA社製）2μl、5×RT Buffer 4μl、2.0 mM dNTP（TOYOBO社製）5μl、RTase（TOYOBO社製）0.25μl、RNase Inhibitor 0.5μlを加え、DEPC処理水で総量20μlとした。その後、ブロックインキュベーターを用いて、30℃で10分、42℃で30分および99℃で5分の条件で反応させることによりcDNAライブラリーを作製した。
【００２４】
2．イヌIL-18 cDNAのクローニング
以下に述べる方法によって、（１）末梢血単球のRNAより作製したcDNAをテンプレートとしてPCRによってIL-18 cDNAの成熟タンパクコード配列を増幅し、（２）末端平滑化ベクターを用いてIL-18 cDNAをクローニングした。
【００２５】
（１）文献１に提示された配列を基にIL-18 cDNAの成熟タンパクコード配列の5'側にNde-Iサイト、3'側にBamH-Iサイトが付加されるように2種類のプライマーを設計し、DNAシンセサイザーにて合成した。これらのプライマーを表１に示す。表１において、配列番号１はイヌIL-18 cDNAのPCR増幅のためのUpper PrimerのDNA配列を示し、その下線部は、制限酵素Nde-Iの作用部位（Nde-Iサイト）を示す。配列番号２は、イヌIL-18 cDNAのPCR増幅のためのLower PrimerのDNA配列を示し、その下線部は、BamH-Iサイトを示す。
【表１】
【００２６】
なお、ここでNde-Iサイトとは、制限酵素でNde-Iが切断する塩基配列CATATGをいう。制限酵素でNde-Iはこの塩基配列をCAとTATGに切断する。また、BamH-Iサイトとは、制限酵素BamH-Iが切断する塩基配列GGATCCをいう。制限酵素BamH-Iは、この塩基配列をGとGATCCに切断する。
【００２７】
PCRにあたっては、上記cDNAの溶液1μlに、最終濃度で10×PCR Buffer、25 mM MgSO4、2 mM dNTPs、KOD DNA Polymerase（TOYOBO社製）、senseおよびantisenseプライマー（各10 pmol）、およびDEPC処理水を加え、総量50μlとし、その後、My CyclerTM（日本バイオ・ラッドラボラトリー社製、東京）にて94 ℃で2分間加熱後、94 ℃ 15秒、55 ℃ 30秒、68 ℃ 2分の条件で35サイクル反応させた。PCRの反応終了後、反応液を、エチジウムブロマイドを加えた1%アガロースゲル内で100 Vで30分間、電気泳動した後、PRINTGRAPHTM（アート社製、東京）で目的とする約0.5KbのDNA断片のバンドを確認した。
【００２８】
（２）ゲルカッターで目的とするDNA断片を切り出し、QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit（QIAGEN社製、Hilden、Germany）を用いてcDNAを分離・精製した。精製したcDNAは、末端平滑化ベクター（pCR-Bluntベクター：Zero Blunt (登録商標) PCR Cloning Kit：Invitrogen社製、San Diego、CA、USA）に挿入した後、DH5αコンピテントセルに形質転換し、カナマイシン添加LB培地で培養して挿入DNA陽性クローンを選択した。
【００２９】
その後、QIAprep (登録商標)Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドを抽出し、BigDye (登録商標) Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製、Foster city、CA、USA）を用いたジデオキシ法により、シークエンサー（ABI PRISM 3100 Genetic Analyzers：Applied Biosystems社製）でプラスミドに挿入したDNA断片の塩基配列を決定した。
【００３０】
＜結果＞
既報（文献１）の塩基配列に照らして選択し、得られた目的とする塩基配列｛IL-18 cDNAの成熟タンパクコード配列からストップコドンを除いた471塩基 （Tyr（TAC）からSer（AGC）まで）の5'側にNde-Iサイト、3'側にBamH-IサイトをもつDNA配列｝の全配列を配列番号５に示す。これらの配列を表２に示す。配列番号５は、クローニングで得たIL-18 cDNAの成熟タンパクコード配列からストップコドンを除いた471塩基を示す。5'側に付加した（CATATGG）は、シグナル配列との連結のためのNde-Iサイト、3'側に付加した（GGATCC）は、ベクターとの連結のためのBamH-Iサイトを示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
3．イヌIL-12 p40 cDNAのクローニング
以下に述べる方法によって、（１）末梢血単球のRNAより作製したcDNAをテンプレートとしてPCRによってIL-12 p40 cDNAのコード配列を増幅し、（２）末端平滑化ベクターを用いてIL-12 p40 cDNAをクローニングした。
【００３３】
（１）文献2に提示された配列を基に5'側にXho-Iサイトサイト、3'側にBamH-Iサイトが付加されるように2種類のプライマーを設計し、DNAシンセサイザーにて合成した。これらを表3に示す。表３において配列番号３は、イヌIL-12p40 cDNAのPCR増幅のためのUpper PrimerのDNA配列を示し、その下線部は、Xho-Iサイトを示す。
配列番号４は、イヌIL-12p40 cDNAのPCR増幅のためのLower PrimerのDNA配列を示し、その下線部は、BamH-Iサイトを示す。
【表３】
【００３４】
なお、Xho-Iサイトとは、制限酵素Xho-Iが切断する塩基配列CTCGAGをいう。制限酵素Xho-Iは、この塩基配列をCとTCGAGに切断する。
【００３５】
PCRにあたっては、上記cDNAの溶液1μlに、最終濃度で10×PCR Buffer、25 mM MgSO4、2 mM dNTPs、KOD DNA Polymerase、senseおよびantisenseプライマー（各10 pmol）、およびDEPC処理水を加え、総量50μlとする。
【００３６】
その後、My CyclerTMにて94 ℃で2分間加熱後、94 ℃ 15秒、55 ℃ 30秒、68 ℃ 2分の条件で35サイクル反応させた。PCRの反応終了後、反応液を、エチジウムブロマイドを加えた1%アガロースゲル内で100 Vで30分間、電気泳動した後、PRINTGRAPHTMで目的とする約1KbのDNA断片のバンドを確認した。
【００３７】
（２）ゲルカッターで目的とするDNA断片を切り出し、QIAEX II Agarose Gel Extraction Kitを用いてcDNAを分離・精製した。精製したcDNAをpCR-Bluntベクターに挿入した後、DH5αコンピテントセルに形質転換し、カナマイシン添加LB培地で培養して挿入DNA陽性クローンを選択した。その後、QIAprep (登録商標) Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドを抽出し、BigDye (登録商標) Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kitを用いたジデオキシ法により、シークエンサー（ABI PRISM 3100 Genetic Analyzers）でプラスミドに挿入したDNA断片の塩基配列を決定した。
【００３８】
＜結果＞
既報（文献２）の塩基配列に照らして選択し、得られた目的とする塩基配列｛IL-12p40 cDNAの全990塩基（開始Metからストップコドン（TAG）まで）の5'側にXho-Iサイト、3'側にBamH-IサイトをもつDNA配列｝の全配列を配列番号６として表４に示す。配列番号６は、クローニングで得たIL-12p40 cDNAの全塩基（990塩基）配列を示す。下線部は、シグナル配列を示す。また、5'側に付加した（CTCGAG）は、ベクターとの連結のためのXho-Iサイト、3'側に付加した（GGATCC）は、ベクターとの連結のためのBamH-Iサイトを示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】
4．シグナル配列付のIL-18DNAを有した哺乳類ベクターの作製
以下に示す方法によって、（１）クローニングしたIL-12 p40 cDNAを哺乳類発現ベクターに組み込んだ後、（２）シグナル配列以外のIL-12 p40 cDNAの塩基配列を切断して除き、（３）その除外部位にIL-18の成熟タンパクをコードする塩基配列を組み入れることにより、シグナル配列付のIL-18 cDNAを有した哺乳類ベクターを作製した。
【００４１】
（１）図1（a）に示すように、クローニングしたpCR-Bluntベクターに挿入されているIL-12 p40 DNAの5'側と3'側に付加したXho-Iサイト（CTCGAG）とBamH-Iサイト（GGATCC）を制限酵素のXho-I（Toyobo社製）およびBamH-I（Toyobo社製）で処理して、ベクターから切り離した。すなわち、10μlの緩衝液（H-Buffer）中に約2μgのpCR-Blunt-IL-12 p40 DNAおよび約5UのXho-IとBamH-Iが含まれるように作製した溶液を37℃で1時間反応させた。なお、以後の説明では簡便のためセンス側の配列をつかって説明を行う。
【００４２】
図1（b）に示すように、哺乳類発現ベクターであるpcDNA3.1-Myc/His A (-)（Invitrogen社製、以下「pcDNA3.1」と略記する）をXho-IとBamH-Iによって同様に処理して環状構造を開裂し、そこに切り離したIL-12 p40 cDNAをDNA Ligation Kit Ver. 2.1（Takara社製）を用いて連結した。このようにして作製したIL-12 p40 cDNAを含む哺乳類発現ベクター（以下「IL-12 p40-pcDNA3.1」と略記する）を図1（c）に示す。
【００４３】
（２）図2（a）に示すように、IL-12 p40 DNA中のシグナル配列（配列番号：６の下線部分）とIL-12 p40タンパクコード配列の境界にあるNde-Iサイト（CATATG）を制限酵素のNde-I（Toyobo社製）で処理することによって切断した。同時にBamH-Iで処理してIL-12 p40タンパクコード配列とpcDNA3.1の境界を切断して、シグナル配列を接続したpcDNA3.1ベクター（以下「SS-pcDNA3.1」と略記する）とIL-12 p40タンパクコード配列にIL-12 p40-pcDNA3.1DNAを分離した。
【００４４】
ここでの制限酵素処理は、約5 U のNde-IとBamH-Iを用いて上記同様10μlの緩衝液（H-Buffer）中で反応を行った。反応後、アガロースゲル内での電気泳動とQIAEX II Agarose Gel Extraction Kitを用いてSS-pcDNA3.1を分離・精製した。
【００４５】
図2（ｃ）には、Nde-IとBamH-Iで切断し、シグナル配列「ＳＳ」が残ったpcDNA3.1を示す。「ＳＳ」の切り口を符号２１で、IL-12p40の切り口を符号２２で表す。
【００４６】
一方、pCR-Bluntに組み込まれたIL-18は図２（ｂ）のようになっている。組み込まれたIL-18の5'側にはNde-Iサイト(CATATGG)が付加されており、後ろ側にはBamH-Iサイト（GGATCC）が付加されている。これをNde-IとBamH-Iで切断する。切り口は符号２３および符号２４である。
【００４７】
図２（ｂ）で切り取ったIL-18を図2（c）につなげ合わせる。すなわち、IL-18の切り口２３をSS-pcDNAの切り口２１に、IL-18の切り口２４をSS-pcDNAの切り口２２に連結する。
【００４８】
その結果図2（d）に示すSS- IL-18-pcDNAを得る。このベクターはシグナル配列であるSSの部分３１とIL-18の部分３２とこれらを接続するための接続塩基配列３３である塩基配列「CATAG」を含む。
【００４９】
なお、図２（d）のNde-Iサイト（符号３３）の後に付加されているグアニンＧ（符号３４）は、IL-18のアミノ酸配列を正しくコードするために付加されたものである。すなわち、IL-12 p40のシグナル配列「ＳＳ」の部分の最後は「・・・GCCATATG」となっている。これにグアニンを加えた９つの塩基配列は、それぞれA（アラニン）、I（イソロイシン）、W（トリプトファン）をコードする塩基配列である。
【００５０】
Nde-Iは「CATATG」の配列があれば、切断できる。しかし、この配列の直後にIL-18の塩基配列をそのまま連結してしまったのでは、IL-18のアミノ酸をコードする塩基の配列がずれてしまう。すなわち、これらの塩基配列に続くIL-18が正しくコードされない。従って、「CATATG」の後にグアニンＧ（符号）３４を付け加え、その後にIL-18をコードする塩基配列を結合する。このようにすることで、ＩＬ−１２ｐ４０のシグナルペプチドをコードする塩基配列と、IL-18をコードする塩基配列を結合させ、ベクターに入れることができる。
なお、上記の９つの塩基配列のうち、アラニンをコードする「ＧＣＣ」までがＩＬ−１２ｐ４０のシグナル配列に対応する部分である。従って、シグナル配列とIL-18との間にはI（イソロイシン）、W（トリプトファン）をコードする「ＡＴＡＴＧＧ」が必ずあるとも言える。すなわち、シグナルペプチドをコードする塩基配列とIL-18をコードする塩基配列を「ＡＴＡＴＧＧ」という塩基配列で連結させたとも言える。なお、このグアニンＧは配列番号１のUpper Primerの設計時点で付加してある。
【００５１】
（３）2でのクローニングしたpCR-Bluntベクターに挿入されているIL-18 DNAを制限酵素のNde-I（Toyobo社製）およびBamH-I（Toyobo社製）で処理して、ベクターから切り離した。そのIL-18 DNAを（２）で分離したSS-pcDNA3.1にDNA Ligation Kit Ver. 2.1（Takara社製）を用いて連結し、シグナル配列付のIL-18DNAを有した哺乳類発現ベクター（以下「SS-IL-18-pcDNA3.1」と略記する）を作製した。
【００５２】
＜結果＞
このようにして作製した「シグナル配列付のIL-18 cDNA」の全塩基（555塩基）配列を配列番号７として表５に示す。なお、この配列は図２の符号３６の部分である。配列番号７は、シグナル配列付のIL-18 cDNAの全塩基（555塩基）配列を示す。下線部は、シグナル配列を示す。また、5'側に付加した（CTCGAG）は、ベクターとの連結のためのXho-Iサイト、3'側に付加した（GGATCC）は、ベクターとの連結のためのBamH-Iサイトを示す。
【００５３】
【表５】
【００５４】
5．SS-IL-18-pcDNA3.1の哺乳類細胞でのタンパク発現能の解析
作製したSS-IL-18-pcDNA3.1の哺乳類細胞でのタンパク発現能を確認するため、（１）SS-IL-18-pcDNA3.1をチャイニーズハムスター卵巣由来株であるCHOに導入し、（２）遺伝子挿入によって翻訳される発現ベクターpcDNA3.1中のmycエピトープの発現を蛍光抗体法によって評価した。
【００５５】
（１）SS-IL-18-pcDNA3.1をLipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いたリポフェクション法により、CHO細胞に導入した。すなわち、0.8μgの SS-IL-18-pcDNA3.1DNAと3.0μlのLipofectamine 2000をOpti-MEM培地（Invitrogen社製）中に加えて総量100μlとし、室温で20分間反応させてコンジュゲートを作製した後、24ウェルプレート（旭テクノグラス社製、東京）の1ウェルに90%飽和状態になるように0.5 mlのOpti-MEM培地で培養したCHO細胞上に滴下し、6時間反応させた。その後、1.5 mlの牛胎子血清を10%含有するF12培地（Invitrogen社製、以下10%FBS 加F12-」と略記する）を加えさらに24時間反応させた。
【００５６】
反応後、培地を2.0 mlのF12-10%FBSに交換し、ネオマイシン（Geneticin、Invitrogen社製）を500μg/mlの濃度になるように添加して培養し、SS-IL-18-pcDNA3.1 DNAが導入されたCHO細胞を選択した。この選択培養においては、pcDNA3.1 ベクターDNA中に含まれるネオマイシン耐性遺伝子の作用によって、SS-IL-18-pcDNA3.1 DNAが導入されたCHO細胞は、ネオマイシン添加培地中で生存、増殖でき、非導入細胞は、生存できずに死滅するため、培養後SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞のみを得ることができる。
【００５７】
（２）遺伝子共導入CHO細胞をチャンバースライドII（旭テクノグラス社製）で培養し、底面のスライドグラスに接着させた。4%パラホルムアルデヒドで固定した後、抗c-Myc抗体（ナカライテスク社製）で室温、40分間反応させた。その後、リン酸緩衝食塩水を用いて洗浄し、fluorescein isothiocyanate（FITC）標識ヤギ抗マウスIgG（American Qualex Manufacturers社製）で室温、40分間反応させた。リン酸緩衝食塩水を用いて洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン社、東京）にて発現を評価した。
【００５８】
＜結果＞
図３に結果を示す。白い部分は陽性の蛍光反応を示す。ほとんどの細胞に陽性の蛍光反応がみられた。この結果から、SS-IL-18-pcDNA3.1の導入によって、哺乳類細胞からタンパク発現が可能であることが証明され、このことは、IL-18 DNAに連結させたシグナル配列が正常に機能していることを示すものである。
【００５９】
6．発現タンパクのIL-18としての機能解析
IL-18は、T細胞に作用してIFNγの産生を増強する。以下に示す方法によって、SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞から分泌されたタンパクがIL-18のサイトカイン機能を持つかどうかを評価した。
【００６０】
すなわち、Okanoらの報告（文献番号３）に従い、平底96ウェルプレート（旭テクノグラス社製）の各ウェル中において、文献番号４に記載されている方法によって末梢血単核細胞から分離したT細胞（105個）を組換え体ヒトIL-2（5μg）とともに100μlの10% FBS加 RPMIに浮遊し、そこに100μlのSS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞あるいはpcDNA3.1導入細胞（コントロール）の培養上清を加えて、37 ℃、5% CO2の湿環境下で48時間反応させた。
【００６１】
その後、反応液を遠心して上清を回収し、そこに含まれるIFN-γの量をQuantikine Canine IFN-γImmunoassay Kit（R&D Systems社製）を用いたELISA法によって測定した。末梢血単核細胞からのT細胞の分離は、文献番号４に記載されている方法により、ナイロンウールファイバー（和光純薬工業）を充填したカラム（ナイロンウールカラム）を用いて行った。
【００６２】
＜結果＞
図４はSS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のSS-IL-18-pcDNA3.1）およびpcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のpcDNA3.1）をT細胞に作用させたときのIFN-γの産生量をあらわした図である。
【００６３】
図４に示すように、SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のSS-IL-18-pcDNA3.1とある値）は、コントロールであるpcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のpcDNA3.1とある値）に比べ、T細胞から極めて有意に多くのIFN-γの産生を誘導した。このことにより、SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞から機能的IL-18が分泌されることが明らかとなった。よって、シグナル配列の付加により、単独遺伝子のみによって哺乳動物細胞からIL-18サイトカインを分泌できることが証明された。なお、検定に用いたサンプル数は、それぞれ５つである。統計については、スチューデントのt検定を用いて行い、P<0.05以下を有意な差があると判定した。
【００６４】
参考文献
文献１．Argyle DJ, McGillivery C, Nicolson L, Onions DE. 1999. Cloning, sequencing, and characterization of dog interleukin-18. Immunogenetics 49:541-543.
文献２．Okano F, Satoh M, Yamada K. 1997. Cloning and expression of the cDNA for canine interleukin-12. J Interferon Cytokine Res. 17: 713-718.
文献３．Okano F, Satoh M, Ido T, Yamada K. 1999. Cloning of cDNA for canine interleukin-18 and canine interleukin-1beta converting enzyme and expression of canine interleukin-18. J Interferon Cytokine Res. 19: 27-32.
文献４．Wijewardana V, Sugiura K, Oichi T, Fujimoto M, Akazawa T, Hatoya S, Inaba M, Ikehara S, Jayaweera TS, Inaba T. 2006. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Vet Immunol Immunopathol. 114: 37-48.
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は哺乳類の細胞にIL-18を産生させることができるベクターを得る。IL-18はＩＬ−１２と相まってIFN-γの産生を促す。そのため、癌細胞や癌細胞周辺の細胞にこの塩基配列をベクターなどで導入することで、癌抑制剤などに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】IL-12p40 cDNAを哺乳類発現ベクターへ導入する過程を示す模式図である。
【図２】シグナル配列を付加したIL-18 cDNAを哺乳類発現ベクターに導入する過程を示す模式図である。
【図３】SS-IL-18-pcDNA3.1の哺乳類細胞でのタンパク発現を表した図である。
【図４】SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のSS-IL-18-pcDNA3.1）およびpcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のpcDNA3.1）をT細胞に作用させたときのIFN-γの産生量をあらわした図である。
【符号の説明】
【００６７】
１０ Xho-Iサイト、矢印は、Xho-Iによって切断される箇所
１１ BamH-Iサイト、矢印は、BamH-Iによって切断される箇所
１２ Xho-Iサイト位、矢印は、Xho-Iによって切断される箇所
１３ BamH-Iサイト、矢印は、BamH-Iによって切断される箇所
２１ Nde-Iによって切断されたシグナル配列の断端
２２ BamH-Iによって切断されたpcDNA3.1の断端
２３ Nde-Iサイト、矢印は、Nde-Iによって切断される箇所
２４ BamH-Iのサイト、矢印は、BamH-Iによって切断される箇所
３１ シグナル配列部分
３２ IL-18 cDNAとpcDNA3.1の接続部位（BamH-Iサイト）
３３ シグナル配列とIL-18 cDNAの接続部位（Nde-Iサイト）
３４ 塩基配列のずれを矯正するために挿入したグアニン
３６ SS-IL-18-pcDNA3.1
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類発現ベクター、特に生体の免疫効果を増幅するインターロイキン18（以下「IL-18」と略記する）を細胞に分泌させることができる哺乳類発現ベクター、及び該ベクターを含む組成物に関する。また、本発明は、該ベクターの製造方法、より詳しくはシグナルシークエンス付のIL-18遺伝子の作製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
IL-18は、Ｔ細胞からのインターフェロンガンマ（以下「IFNγ」と略記する）の産生を誘導し、免疫反応を増強するサイトカインで、細胞障害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞を活性化して抗腫瘍免疫効果を著しく増強するものとして期待されている。
【０００３】
例えばIL-18とインターロイキン12（以下「IL-12」と略記する）を含む薬剤を抗癌剤として用いたり（特許文献１参照）、免疫能力を高めるためのIL-18の産生促進剤が提案されたりしている（特許文献２参照）。また、IL-18をコードする遺伝子を癌細胞内に挿入させて癌の抑制に用いる方法の提案もある（特許文献３）。
【０００４】
IL-18を遺伝子操作技術によってクローニングすることは、すでに行われており、遺伝子組み換え手法を用いた量産化も検討されている。細胞内で遺伝子情報をもとに合成されるタンパクは、通常小胞体を経由して細胞外に分泌される。しかし、IL-18遺伝子は小胞体内にタンパクを送り込むためのシグナル配列を欠くため、細胞内から成熟タンパクとして分泌されるためには、細胞内でインターロイキン１β変換酵素（以下「ICE」と略記する）の作用を受けて変形することが必要である。
【０００５】
そのため、遺伝子導入によって動物細胞から活性のあるIL-18を分泌させるためには、IL-18遺伝子のみでなく、ICEをコードする遺伝子をも導入しなければならない。そこで、ICE遺伝子とIL-18をコードする遺伝子を結合させて、細胞内でIL-18を分泌させ、量産化を行おうという提案がある（特許文献４参照）。また、昆虫（カイコ）細胞でIL-18を産生するために、シグナル配列を含むDNAをバキュロウイルストランスファーベクターpVL1392（ファーミンジェン社）に入れ、組換えバキュロウイルスを作製した例も開示されている（特許文献４参照）。
【特許文献１】特開２００１−５２１９０６号公報
【特許文献２】特開２００１−２３３７８４号公報
【特許文献３】特開平１１−１３９９９４号公報
【特許文献４】特開２０００−７８９７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子組み換え手法を用いてIL-18を産生するのであれば、特許文献４に開示された方法でも可能である。しかし、哺乳類の細胞内でIL-18を意図的に産生させるには、ICEと共にIL-18のcDNAを導入するのでは、細胞からの分泌が十分でない。癌治療に活用するためには、癌細胞若しくはその周辺の細胞自体からIL-18を分泌させＴ細胞活性を促す必要がある。
【０００７】
また、特許文献４で開示されたシグナル配列を含むIL-18のcDNAを有するベクターは哺乳類細胞での発現はできない。
【０００８】
そこで、本発明が解決しようとする問題点は、哺乳類細胞からIL-18を分泌させるためのベクターを作成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
シグナルペプチドをコードする塩基配列と、
ＩＬ−１８をコードする塩基配列と、
前記シグナルペプチドをコードする塩基配列と前記ＩＬ−１８をコードする塩基配列とを結合する塩基配列と
を含む哺乳類発現ベクターである。
【００１０】
また、本発明は、上記の哺乳類発現ベクターと、媒体とを含む組成物でもある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の哺乳類発現ベクターを用いることにより、シグナル配列を有したIL-18のcDNAが哺乳類の細胞内に導入できるので、哺乳類の細胞自身がIL-18を多量に産生するという効果を得ることができる。IL-18の多量産生は、T細胞からのインターフェロンガンマ（IFNγ）の産生を誘導し、細胞障害性T細胞やナチュラルキラー細胞を活性化する。そのため、抗腫瘍免疫効果を著しく増強する。そのため癌細胞に対する免疫治療に利用できる期待が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のシグナル配列付のIL-18 cDNAを有した哺乳類発現ベクターは、哺乳類で発現するベクターにIL-12 p40のcDNAを付加し、そこからシグナル配列部分だけを残してIL-12のcDNAを切り取る。そして切り取った後にIL-18のcDNAを連結することにより作製できる。
【００１３】
本発明の哺乳類発現ベクターが含むシグナルペプチドは、該ベクターにより発現されるIL-18のタンパク質の細胞外への分泌を可能にするシグナルペプチドであれば、特に限定されない。好ましくは、IL-12のシグナルペプチドである。
【００１４】
本発明の哺乳類発現ベクターが含む、シグナルペプチドをコードする塩基配列とIL-18をコードする塩基配列とを結合する塩基配列は、遺伝子組み換え技術に従って上記のシグナルペプチドをコードする塩基配列とIL-18をコードする塩基配列とを連結する際に介在することが必要となる配列であり、好ましくは「ＡＴＡＴＧＧ」の配列である。
【００１５】
上記の哺乳類で発現するベクターは、当該技術において公知のものを用いることができ、例えばpcDNA3.1-Myc/His A (-)（Invitrogen社製）などの市販品を用いてもよい。
【００１６】
本発明の哺乳類発現ベクターは、適切な緩衝液を媒体とする組成物として用いることができる。該緩衝液としては、当該技術において通常用いられる緩衝剤からなるもの、例えばリン酸緩衝生理食塩水を用いることができる。
【００１７】
本発明の実施には、IL-12 p40遺伝子のシグナル配列連結したIL-18の成熟タンパクをコードするcDNAとそれらを組み込んだ哺乳類細胞用の発現ベクターを最良の形態とする。
【実施例１】
【００１８】
以下に実施例としてイヌのシグナル配列付のIL-18 cDNAを有した哺乳類ベクターの作製を述べる。
1．RNAの抽出とcDNAライブラリーの作製
以下にのべる方法によって、（１）コンカナバリンAで活性化させたイヌ末梢血単核細胞からRNAを抽出し、（２）それを逆転写してクローニングする遺伝子の素となるcDNAのライブラリーを作製した。
【００１９】
（１）リンパ球分離液（比重1.077g/ml、ナカライテスク社製）を用い、定法にしたがって、健常犬より採取した末梢血から末梢血単核細胞を回収した。ここで、定法は例えば文献（Sugiura et al., Immunobiol. (2004) 209:619-627）記載の方法である。しかし、末梢血から末梢血短核細胞を回収する方法であれば、これに限定されるものではない。
【００２０】
回収した末梢血単核細胞を2×106 /mlになるように牛胎子血清（FBS：Valley Biomedical社製、Winchester、VA、USA）を10%含むRPMI1640培地（日水製薬社製、東京）（10% FBS加RPMI）に浮遊し、コンカナバリンAを最終濃度20μg /mlになるように加え、37℃、5% CO2の条件下で48時間培養した。
【００２１】
培養後、細胞を回収し、細胞1×107個につき、セパゾール RNA I super（ナカライテスク社製）1 mlを加えて細胞を溶解した。その後、室温で5分間放置し、クロロフォルム200μlを加えて15秒間混和し、さらに室温で3分間放置して4 ℃、12,000×g、20分間遠心した。上部の透明層のみを1.5 ml用マイクロチューブに回収して、イソプロパノールを500μl加えて混和し、室温で10分間放置した後、4 ℃、12,000×g、20分間遠心した。
【００２２】
上清を捨て、RNA沈殿に80%エタノールを950μl加えて充分に混濁させた後、4 ℃、12,000×g、10分間遠心した。上清を捨て、沈殿を乾燥させた後、ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水10μlに沈殿を溶解させた。そのRNA溶液10μlに、DNase Buffer（TAKARA社製、草津）1.25μl、DNase I（TAKARA社製）0.5μl、RNase Inhibitor（TOYOBO社製、大阪）0.5μlを加え、軽く混和した後、ブロックインキュベーター（BI-535型、アステック社製、志免）を用いて37 ℃で30分間および80 ℃で20分間の条件で反応させた。反応後、260 nmにおける吸光度を測定することによってtotal RNAの濃度を算定した。
【００２３】
（２）DNase処理したトータルRNA 1μgに、random primer（TAKARA社製）2μl、5×RT Buffer 4μl、2.0 mM dNTP（TOYOBO社製）5μl、RTase（TOYOBO社製）0.25μl、RNase Inhibitor 0.5μlを加え、DEPC処理水で総量20μlとした。その後、ブロックインキュベーターを用いて、30℃で10分、42℃で30分および99℃で5分の条件で反応させることによりcDNAライブラリーを作製した。
【００２４】
2．イヌIL-18 cDNAのクローニング
以下に述べる方法によって、（１）末梢血単球のRNAより作製したcDNAをテンプレートとしてPCRによってIL-18 cDNAの成熟タンパクコード配列を増幅し、（２）末端平滑化ベクターを用いてIL-18 cDNAをクローニングした。
【００２５】
（１）文献１に提示された配列を基にIL-18 cDNAの成熟タンパクコード配列の5'側にNde-Iサイト、3'側にBamH-Iサイトが付加されるように2種類のプライマーを設計し、DNAシンセサイザーにて合成した。これらのプライマーを表１に示す。表１において、配列番号１はイヌIL-18 cDNAのPCR増幅のためのUpper PrimerのDNA配列を示し、その下線部は、制限酵素Nde-Iの作用部位（Nde-Iサイト）を示す。配列番号２は、イヌIL-18 cDNAのPCR増幅のためのLower PrimerのDNA配列を示し、その下線部は、BamH-Iサイトを示す。
【表１】
【００２６】
なお、ここでNde-Iサイトとは、制限酵素でNde-Iが切断する塩基配列CATATGをいう。制限酵素でNde-Iはこの塩基配列をCAとTATGに切断する。また、BamH-Iサイトとは、制限酵素BamH-Iが切断する塩基配列GGATCCをいう。制限酵素BamH-Iは、この塩基配列をGとGATCCに切断する。
【００２７】
PCRにあたっては、上記cDNAの溶液1μlに、最終濃度で10×PCR Buffer、25 mM MgSO4、2 mM dNTPs、KOD DNA Polymerase（TOYOBO社製）、senseおよびantisenseプライマー（各10 pmol）、およびDEPC処理水を加え、総量50μlとし、その後、My CyclerTM（日本バイオ・ラッドラボラトリー社製、東京）にて94 ℃で2分間加熱後、94 ℃ 15秒、55 ℃ 30秒、68 ℃ 2分の条件で35サイクル反応させた。PCRの反応終了後、反応液を、エチジウムブロマイドを加えた1%アガロースゲル内で100 Vで30分間、電気泳動した後、PRINTGRAPHTM（アート社製、東京）で目的とする約0.5KbのDNA断片のバンドを確認した。
【００２８】
（２）ゲルカッターで目的とするDNA断片を切り出し、QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit（QIAGEN社製、Hilden、Germany）を用いてcDNAを分離・精製した。精製したcDNAは、末端平滑化ベクター（pCR-Bluntベクター：Zero Blunt (登録商標) PCR Cloning Kit：Invitrogen社製、San Diego、CA、USA）に挿入した後、DH5αコンピテントセルに形質転換し、カナマイシン添加LB培地で培養して挿入DNA陽性クローンを選択した。
【００２９】
その後、QIAprep (登録商標)Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドを抽出し、BigDye (登録商標) Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製、Foster city、CA、USA）を用いたジデオキシ法により、シークエンサー（ABI PRISM 3100 Genetic Analyzers：Applied Biosystems社製）でプラスミドに挿入したDNA断片の塩基配列を決定した。
【００３０】
＜結果＞
既報（文献１）の塩基配列に照らして選択し、得られた目的とする塩基配列｛IL-18 cDNAの成熟タンパクコード配列からストップコドンを除いた471塩基 （Tyr（TAC）からSer（AGC）まで）の5'側にNde-Iサイト、3'側にBamH-IサイトをもつDNA配列｝の全配列を配列番号５に示す。これらの配列を表２に示す。配列番号５は、クローニングで得たIL-18 cDNAの成熟タンパクコード配列からストップコドンを除いた471塩基を示す。5'側に付加した（CATATGG）は、シグナル配列との連結のためのNde-Iサイト、3'側に付加した（GGATCC）は、ベクターとの連結のためのBamH-Iサイトを示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
3．イヌIL-12 p40 cDNAのクローニング
以下に述べる方法によって、（１）末梢血単球のRNAより作製したcDNAをテンプレートとしてPCRによってIL-12 p40 cDNAのコード配列を増幅し、（２）末端平滑化ベクターを用いてIL-12 p40 cDNAをクローニングした。
【００３３】
（１）文献2に提示された配列を基に5'側にXho-Iサイトサイト、3'側にBamH-Iサイトが付加されるように2種類のプライマーを設計し、DNAシンセサイザーにて合成した。これらを表3に示す。表３において配列番号３は、イヌIL-12p40 cDNAのPCR増幅のためのUpper PrimerのDNA配列を示し、その下線部は、Xho-Iサイトを示す。
配列番号４は、イヌIL-12p40 cDNAのPCR増幅のためのLower PrimerのDNA配列を示し、その下線部は、BamH-Iサイトを示す。
【表３】
【００３４】
なお、Xho-Iサイトとは、制限酵素Xho-Iが切断する塩基配列CTCGAGをいう。制限酵素Xho-Iは、この塩基配列をCとTCGAGに切断する。
【００３５】
PCRにあたっては、上記cDNAの溶液1μlに、最終濃度で10×PCR Buffer、25 mM MgSO4、2 mM dNTPs、KOD DNA Polymerase、senseおよびantisenseプライマー（各10 pmol）、およびDEPC処理水を加え、総量50μlとする。
【００３６】
その後、My CyclerTMにて94 ℃で2分間加熱後、94 ℃ 15秒、55 ℃ 30秒、68 ℃ 2分の条件で35サイクル反応させた。PCRの反応終了後、反応液を、エチジウムブロマイドを加えた1%アガロースゲル内で100 Vで30分間、電気泳動した後、PRINTGRAPHTMで目的とする約1KbのDNA断片のバンドを確認した。
【００３７】
（２）ゲルカッターで目的とするDNA断片を切り出し、QIAEX II Agarose Gel Extraction Kitを用いてcDNAを分離・精製した。精製したcDNAをpCR-Bluntベクターに挿入した後、DH5αコンピテントセルに形質転換し、カナマイシン添加LB培地で培養して挿入DNA陽性クローンを選択した。その後、QIAprep (登録商標) Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドを抽出し、BigDye (登録商標) Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kitを用いたジデオキシ法により、シークエンサー（ABI PRISM 3100 Genetic Analyzers）でプラスミドに挿入したDNA断片の塩基配列を決定した。
【００３８】
＜結果＞
既報（文献２）の塩基配列に照らして選択し、得られた目的とする塩基配列｛IL-12p40 cDNAの全990塩基（開始Metからストップコドン（TAG）まで）の5'側にXho-Iサイト、3'側にBamH-IサイトをもつDNA配列｝の全配列を配列番号６として表４に示す。配列番号６は、クローニングで得たIL-12p40 cDNAの全塩基（990塩基）配列を示す。下線部は、シグナル配列を示す。また、5'側に付加した（CTCGAG）は、ベクターとの連結のためのXho-Iサイト、3'側に付加した（GGATCC）は、ベクターとの連結のためのBamH-Iサイトを示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】
4．シグナル配列付のIL-18DNAを有した哺乳類ベクターの作製
以下に示す方法によって、（１）クローニングしたIL-12 p40 cDNAを哺乳類発現ベクターに組み込んだ後、（２）シグナル配列以外のIL-12 p40 cDNAの塩基配列を切断して除き、（３）その除外部位にIL-18の成熟タンパクをコードする塩基配列を組み入れることにより、シグナル配列付のIL-18 cDNAを有した哺乳類ベクターを作製した。
【００４１】
（１）図1（a）に示すように、クローニングしたpCR-Bluntベクターに挿入されているIL-12 p40 DNAの5'側と3'側に付加したXho-Iサイト（CTCGAG）とBamH-Iサイト（GGATCC）を制限酵素のXho-I（Toyobo社製）およびBamH-I（Toyobo社製）で処理して、ベクターから切り離した。すなわち、10μlの緩衝液（H-Buffer）中に約2μgのpCR-Blunt-IL-12 p40 DNAおよび約5UのXho-IとBamH-Iが含まれるように作製した溶液を37℃で1時間反応させた。なお、以後の説明では簡便のためセンス側の配列をつかって説明を行う。
【００４２】
図1（b）に示すように、哺乳類発現ベクターであるpcDNA3.1-Myc/His A (-)（Invitrogen社製、以下「pcDNA3.1」と略記する）をXho-IとBamH-Iによって同様に処理して環状構造を開裂し、そこに切り離したIL-12 p40 cDNAをDNA Ligation Kit Ver. 2.1（Takara社製）を用いて連結した。このようにして作製したIL-12 p40 cDNAを含む哺乳類発現ベクター（以下「IL-12 p40-pcDNA3.1」と略記する）を図1（c）に示す。
【００４３】
（２）図2（a）に示すように、IL-12 p40 DNA中のシグナル配列（配列番号：６の下線部分）とIL-12 p40タンパクコード配列の境界にあるNde-Iサイト（CATATG）を制限酵素のNde-I（Toyobo社製）で処理することによって切断した。同時にBamH-Iで処理してIL-12 p40タンパクコード配列とpcDNA3.1の境界を切断して、シグナル配列を接続したpcDNA3.1ベクター（以下「SS-pcDNA3.1」と略記する）とIL-12 p40タンパクコード配列にIL-12 p40-pcDNA3.1DNAを分離した。
【００４４】
ここでの制限酵素処理は、約5 U のNde-IとBamH-Iを用いて上記同様10μlの緩衝液（H-Buffer）中で反応を行った。反応後、アガロースゲル内での電気泳動とQIAEX II Agarose Gel Extraction Kitを用いてSS-pcDNA3.1を分離・精製した。
【００４５】
図2（ｃ）には、Nde-IとBamH-Iで切断し、シグナル配列「ＳＳ」が残ったpcDNA3.1を示す。「ＳＳ」の切り口を符号２１で、IL-12p40の切り口を符号２２で表す。
【００４６】
一方、pCR-Bluntに組み込まれたIL-18は図２（ｂ）のようになっている。組み込まれたIL-18の5'側にはNde-Iサイト(CATATGG)が付加されており、後ろ側にはBamH-Iサイト（GGATCC）が付加されている。これをNde-IとBamH-Iで切断する。切り口は符号２３および符号２４である。
【００４７】
図２（ｂ）で切り取ったIL-18を図2（c）につなげ合わせる。すなわち、IL-18の切り口２３をSS-pcDNAの切り口２１に、IL-18の切り口２４をSS-pcDNAの切り口２２に連結する。
【００４８】
その結果図2（d）に示すSS- IL-18-pcDNAを得る。このベクターはシグナル配列であるSSの部分３１とIL-18の部分３２とこれらを接続するための接続塩基配列３３である塩基配列「CATAG」を含む。
【００４９】
なお、図２（d）のNde-Iサイト（符号３３）の後に付加されているグアニンＧ（符号３４）は、IL-18のアミノ酸配列を正しくコードするために付加されたものである。すなわち、IL-12 p40のシグナル配列「ＳＳ」の部分の最後は「・・・GCCATATG」となっている。これにグアニンを加えた９つの塩基配列は、それぞれA（アラニン）、I（イソロイシン）、W（トリプトファン）をコードする塩基配列である。
【００５０】
Nde-Iは「CATATG」の配列があれば、切断できる。しかし、この配列の直後にIL-18の塩基配列をそのまま連結してしまったのでは、IL-18のアミノ酸をコードする塩基の配列がずれてしまう。すなわち、これらの塩基配列に続くIL-18が正しくコードされない。従って、「CATATG」の後にグアニンＧ（符号）３４を付け加え、その後にIL-18をコードする塩基配列を結合する。このようにすることで、ＩＬ−１２ｐ４０のシグナルペプチドをコードする塩基配列と、IL-18をコードする塩基配列を結合させ、ベクターに入れることができる。
なお、上記の９つの塩基配列のうち、アラニンをコードする「ＧＣＣ」までがＩＬ−１２ｐ４０のシグナル配列に対応する部分である。従って、シグナル配列とIL-18との間にはI（イソロイシン）、W（トリプトファン）をコードする「ＡＴＡＴＧＧ」が必ずあるとも言える。すなわち、シグナルペプチドをコードする塩基配列とIL-18をコードする塩基配列を「ＡＴＡＴＧＧ」という塩基配列で連結させたとも言える。なお、このグアニンＧは配列番号１のUpper Primerの設計時点で付加してある。
【００５１】
（３）2でのクローニングしたpCR-Bluntベクターに挿入されているIL-18 DNAを制限酵素のNde-I（Toyobo社製）およびBamH-I（Toyobo社製）で処理して、ベクターから切り離した。そのIL-18 DNAを（２）で分離したSS-pcDNA3.1にDNA Ligation Kit Ver. 2.1（Takara社製）を用いて連結し、シグナル配列付のIL-18DNAを有した哺乳類発現ベクター（以下「SS-IL-18-pcDNA3.1」と略記する）を作製した。
【００５２】
＜結果＞
このようにして作製した「シグナル配列付のIL-18 cDNA」の全塩基（555塩基）配列を配列番号７として表５に示す。なお、この配列は図２の符号３６の部分である。配列番号７は、シグナル配列付のIL-18 cDNAの全塩基（555塩基）配列を示す。下線部は、シグナル配列を示す。また、5'側に付加した（CTCGAG）は、ベクターとの連結のためのXho-Iサイト、3'側に付加した（GGATCC）は、ベクターとの連結のためのBamH-Iサイトを示す。
【００５３】
【表５】
【００５４】
5．SS-IL-18-pcDNA3.1の哺乳類細胞でのタンパク発現能の解析
作製したSS-IL-18-pcDNA3.1の哺乳類細胞でのタンパク発現能を確認するため、（１）SS-IL-18-pcDNA3.1をチャイニーズハムスター卵巣由来株であるCHOに導入し、（２）遺伝子挿入によって翻訳される発現ベクターpcDNA3.1中のmycエピトープの発現を蛍光抗体法によって評価した。
【００５５】
（１）SS-IL-18-pcDNA3.1をLipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いたリポフェクション法により、CHO細胞に導入した。すなわち、0.8μgの SS-IL-18-pcDNA3.1DNAと3.0μlのLipofectamine 2000をOpti-MEM培地（Invitrogen社製）中に加えて総量100μlとし、室温で20分間反応させてコンジュゲートを作製した後、24ウェルプレート（旭テクノグラス社製、東京）の1ウェルに90%飽和状態になるように0.5 mlのOpti-MEM培地で培養したCHO細胞上に滴下し、6時間反応させた。その後、1.5 mlの牛胎子血清を10%含有するF12培地（Invitrogen社製、以下10%FBS 加F12-」と略記する）を加えさらに24時間反応させた。
【００５６】
反応後、培地を2.0 mlのF12-10%FBSに交換し、ネオマイシン（Geneticin、Invitrogen社製）を500μg/mlの濃度になるように添加して培養し、SS-IL-18-pcDNA3.1 DNAが導入されたCHO細胞を選択した。この選択培養においては、pcDNA3.1 ベクターDNA中に含まれるネオマイシン耐性遺伝子の作用によって、SS-IL-18-pcDNA3.1 DNAが導入されたCHO細胞は、ネオマイシン添加培地中で生存、増殖でき、非導入細胞は、生存できずに死滅するため、培養後SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞のみを得ることができる。
【００５７】
（２）遺伝子共導入CHO細胞をチャンバースライドII（旭テクノグラス社製）で培養し、底面のスライドグラスに接着させた。4%パラホルムアルデヒドで固定した後、抗c-Myc抗体（ナカライテスク社製）で室温、40分間反応させた。その後、リン酸緩衝食塩水を用いて洗浄し、fluorescein isothiocyanate（FITC）標識ヤギ抗マウスIgG（American Qualex Manufacturers社製）で室温、40分間反応させた。リン酸緩衝食塩水を用いて洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン社、東京）にて発現を評価した。
【００５８】
＜結果＞
図３に結果を示す。白い部分は陽性の蛍光反応を示す。ほとんどの細胞に陽性の蛍光反応がみられた。この結果から、SS-IL-18-pcDNA3.1の導入によって、哺乳類細胞からタンパク発現が可能であることが証明され、このことは、IL-18 DNAに連結させたシグナル配列が正常に機能していることを示すものである。
【００５９】
6．発現タンパクのIL-18としての機能解析
IL-18は、T細胞に作用してIFNγの産生を増強する。以下に示す方法によって、SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞から分泌されたタンパクがIL-18のサイトカイン機能を持つかどうかを評価した。
【００６０】
すなわち、Okanoらの報告（文献番号３）に従い、平底96ウェルプレート（旭テクノグラス社製）の各ウェル中において、文献番号４に記載されている方法によって末梢血単核細胞から分離したT細胞（105個）を組換え体ヒトIL-2（5μg）とともに100μlの10% FBS加 RPMIに浮遊し、そこに100μlのSS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞あるいはpcDNA3.1導入細胞（コントロール）の培養上清を加えて、37 ℃、5% CO2の湿環境下で48時間反応させた。
【００６１】
その後、反応液を遠心して上清を回収し、そこに含まれるIFN-γの量をQuantikine Canine IFN-γImmunoassay Kit（R&D Systems社製）を用いたELISA法によって測定した。末梢血単核細胞からのT細胞の分離は、文献番号４に記載されている方法により、ナイロンウールファイバー（和光純薬工業）を充填したカラム（ナイロンウールカラム）を用いて行った。
【００６２】
＜結果＞
図４はSS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のSS-IL-18-pcDNA3.1）およびpcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のpcDNA3.1）をT細胞に作用させたときのIFN-γの産生量をあらわした図である。
【００６３】
図４に示すように、SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のSS-IL-18-pcDNA3.1とある値）は、コントロールであるpcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のpcDNA3.1とある値）に比べ、T細胞から極めて有意に多くのIFN-γの産生を誘導した。このことにより、SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞から機能的IL-18が分泌されることが明らかとなった。よって、シグナル配列の付加により、単独遺伝子のみによって哺乳動物細胞からIL-18サイトカインを分泌できることが証明された。なお、検定に用いたサンプル数は、それぞれ５つである。統計については、スチューデントのt検定を用いて行い、P<0.05以下を有意な差があると判定した。
【００６４】
参考文献
文献１．Argyle DJ, McGillivery C, Nicolson L, Onions DE. 1999. Cloning, sequencing, and characterization of dog interleukin-18. Immunogenetics 49:541-543.
文献２．Okano F, Satoh M, Yamada K. 1997. Cloning and expression of the cDNA for canine interleukin-12. J Interferon Cytokine Res. 17: 713-718.
文献３．Okano F, Satoh M, Ido T, Yamada K. 1999. Cloning of cDNA for canine interleukin-18 and canine interleukin-1beta converting enzyme and expression of canine interleukin-18. J Interferon Cytokine Res. 19: 27-32.
文献４．Wijewardana V, Sugiura K, Oichi T, Fujimoto M, Akazawa T, Hatoya S, Inaba M, Ikehara S, Jayaweera TS, Inaba T. 2006. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Vet Immunol Immunopathol. 114: 37-48.
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は哺乳類の細胞にIL-18を産生させることができるベクターを得る。IL-18はＩＬ−１２と相まってIFN-γの産生を促す。そのため、癌細胞や癌細胞周辺の細胞にこの塩基配列をベクターなどで導入することで、癌抑制剤などに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】IL-12p40 cDNAを哺乳類発現ベクターへ導入する過程を示す模式図である。
【図２】シグナル配列を付加したIL-18 cDNAを哺乳類発現ベクターに導入する過程を示す模式図である。
【図３】SS-IL-18-pcDNA3.1の哺乳類細胞でのタンパク発現を表した図である。
【図４】SS-IL-18-pcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のSS-IL-18-pcDNA3.1）およびpcDNA3.1導入細胞の培養上清（図中のpcDNA3.1）をT細胞に作用させたときのIFN-γの産生量をあらわした図である。
【符号の説明】
【００６７】
１０ Xho-Iサイト、矢印は、Xho-Iによって切断される箇所
１１ BamH-Iサイト、矢印は、BamH-Iによって切断される箇所
１２ Xho-Iサイト位、矢印は、Xho-Iによって切断される箇所
１３ BamH-Iサイト、矢印は、BamH-Iによって切断される箇所
２１ Nde-Iによって切断されたシグナル配列の断端
２２ BamH-Iによって切断されたpcDNA3.1の断端
２３ Nde-Iサイト、矢印は、Nde-Iによって切断される箇所
２４ BamH-Iのサイト、矢印は、BamH-Iによって切断される箇所
３１ シグナル配列部分
３２ IL-18 cDNAとpcDNA3.1の接続部位（BamH-Iサイト）
３３ シグナル配列とIL-18 cDNAの接続部位（Nde-Iサイト）
３４ 塩基配列のずれを矯正するために挿入したグアニン
３６ SS-IL-18-pcDNA3.1
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルペプチドをコードする塩基配列と、
ＩＬ−１８をコードする塩基配列と、
前記シグナルペプチドをコードする塩基配列と前記ＩＬ−１８をコードする塩基配列とを結合する塩基配列とを含む哺乳類発現ベクター。
【請求項２】
前記シグナルペプチドはＩＬ−１２から得たものである請求項１記載の哺乳類発現ベクター。
【請求項３】
前記結合する塩基配列は、「ＡＴＡＴＧＧ」である請求項１又は２に記載された哺乳類発現ベクター。
【請求項４】
配列番号７で示す塩基配列を有する請求項１〜３のいずれか１つに記載された哺乳類発現ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載された哺乳類発現ベクターと、媒体と含む組成物。
【請求項６】
前記媒体は緩衝液である請求項５に記載された組成物。
【請求項１】
シグナルペプチドをコードする塩基配列と、
ＩＬ−１８をコードする塩基配列と、
前記シグナルペプチドをコードする塩基配列と前記ＩＬ−１８をコードする塩基配列とを結合する塩基配列とを含む哺乳類発現ベクター。
【請求項２】
前記シグナルペプチドはＩＬ−１２から得たものである請求項１記載の哺乳類発現ベクター。
【請求項３】
前記結合する塩基配列は、「ＡＴＡＴＧＧ」である請求項１又は２に記載された哺乳類発現ベクター。
【請求項４】
配列番号７で示す塩基配列を有する請求項１〜３のいずれか１つに記載された哺乳類発現ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載された哺乳類発現ベクターと、媒体と含む組成物。
【請求項６】
前記媒体は緩衝液である請求項５に記載された組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１８７９５６（Ｐ２００８−１８７９５６Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５９３１（Ｐ２００７−２５９３１）
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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