因子ＩＸ用処方
【課題】因子IXの濃縮調製物を得るための新規組成物および方法、さらに貯蔵および投与に適した因子IXの処方の提供。
【解決手段】これらの組成物は、凍結または凍結乾燥され、因子IX、グリシンのごとき増量剤、および冷凍保護剤からなる。好ましい因子IX濃度範囲は約０.１ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌである（約２０ないし少なくとも４０００Ｕ／ｍｌに相当）。好ましい増量剤はグリシン、および／またはマグネシウム、カルシウムもしくは塩化物の塩を包含し、好ましくは、約０.５ないし３００ｍＭの濃度範囲である。適当な冷凍保護剤はマンニトールおよびスクロースのごときポリオールを包含し、好ましくは、約０.５ないし２％の濃度範囲である。
【解決手段】これらの組成物は、凍結または凍結乾燥され、因子IX、グリシンのごとき増量剤、および冷凍保護剤からなる。好ましい因子IX濃度範囲は約０.１ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌである（約２０ないし少なくとも４０００Ｕ／ｍｌに相当）。好ましい増量剤はグリシン、および／またはマグネシウム、カルシウムもしくは塩化物の塩を包含し、好ましくは、約０.５ないし３００ｍＭの濃度範囲である。適当な冷凍保護剤はマンニトールおよびスクロースのごときポリオールを包含し、好ましくは、約０.５ないし２％の濃度範囲である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、因子IXからなる新規処方に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿糖蛋白である因子IXを包含する血液凝固プロセスに関与する種々の因子が同定されている。因子IX欠乏は血友病の１のタイプ（Ｂ型）を特徴づける。伝統的には、この疾患の治療はヒト・血漿由来の因子IXの蛋白濃縮物の静脈輸液を用いる。血液濃縮物の輸液は、ウイルス性肝炎およびＨＩＶのごとき種々の感染源、または血栓閉塞因子の伝達の危険性を包含している。組み換えＤＮＡ法により因子IXを製造する別の方法が特許文献１に記載されている。ヒト・因子IXをコードしているｃＤＮＡが単離され、特徴づけられ、発現ベクター中にクローン化されている。例えば、非特許文献１〜３参照。よって、組み換えＤＮＡ法の進歩により、因子IX蛋白を製造することが可能となった。
【０００３】
貯蔵でき、蛋白の最終剤型のさらなる製造に適するバルク蛋白、例えば、因子IXの濃縮形態を得ることが望ましい。典型的には、蛋白精製プロセスは蛋白の濃縮を引き起こす。バルク蛋白としても知られるこの濃縮された蛋白は処方緩衝化剤中にあってもよい。次いで、典型的には約２ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの濃度のバルク蛋白を充填／仕上げ設備へと凍結輸送することができ、そこで適当な投与濃度に希釈され、投与用バイアルに入れられる。これらの希釈試料を、例えば、フリーズドライのごとく凍結乾燥することができる。凍結乾燥試料を長期貯蔵し、後ほど、患者に使用する直前に適当な投与用希釈剤を添加することにより復元してもよい。
【０００４】
蛋白安定性は、特に、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結／融解サイクルの繰り返し、および剪断力への曝露のごとき因子により影響されうる。変性および凝集（可溶性および不溶性凝集物双方の生成）を包含する物理的不安定性ならびに化学的不安定性、例えば、加水分解、脱アミノ化および酸化の結果（少しの例を挙げたにすぎない）として活性蛋白は消失しうる。蛋白薬剤の安定性の一般的総説としては、例えば、非特許文献４参照。
【０００５】
蛋白不安定性の生じうる発生は広く認識されているが、特定の蛋白の特定の不安定性の問題を予想することは不可能である。これらの不安定性のいずれもが、より低い活性、増大した毒性および／または増大した免疫原性を有する蛋白、蛋白副産物、または誘導体の生成を引き起こす可能性がある。実際、蛋白沈殿は、血栓症、剤型および用量の不均一性、ならびに注射器の詰まりを引き起こす。さらに、因子IXに特異的な数種の翻訳後修飾（例えば、Ｎ−末端のあるグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化および糖鎖付加）があり、それらは生物学的活性の維持において重要である可能性があり、貯蔵による変化に影響されうる。よって、いずれの蛋白の医薬処方の安全性および有効性も、その安定性に直接関係している。
【０００６】
安定性の考慮のほかに、一般的には、種々の世界的な医薬の規制機関の是認を得ているかまたは得るであろう賦形剤を選択する。溶液は等張であり、生理学的に適切な範囲のｐＨであるべきである。使用バッファーの選択および量は所望ｐＨ範囲とするのに重要である。そのうえ、因子IXの場合、凝固時間アッセイ分析および凝血能を妨害しうるため「ヘパリン」のごとき薬剤を避けるべきである。
【０００７】
現在、２種の市販のキャリヤ蛋白不含で血漿由来の因子IX処方がある。アルファ・セラピューティク・コーポレイション（Alpha Therapeutic orporation）は凍結乾燥したＡｌｐｈａＮｉｎｅ（登録商標）ＳＤを提供しており、ヘパリン、デキストロース、ポリソルベート８０、およびトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートからなる。この調製物は２ないし８℃の温度に貯蔵される。上記のごとく、ヘパリンは抗−凝血剤であるのでヘパリンが避けられ、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェートは粘膜を刺激するので、この処方は理想的とはいえない。アーマー・ファーマシューティカル・カンパニー（Armour Pharmaceutical Company）の凍結乾燥されたMononin（登録商標）はヒスチジン、塩化ナトリウムおよびマンニトールからなり、同様に２ないし８℃に貯蔵される。包装に添付された説明書には該処方を室温で１カ月以上貯蔵しないよう書かれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４,７７０,９９９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】チョー（Choo）ら、ネイチャー（Nature）第２９９巻：１７８〜１８０頁（１９８２年）
【非特許文献２】フェア（Fair）ら、ブラッド（Blood）第６４巻：１９４〜２０４頁（１９８４年）
【非特許文献３】クラチ（Kurachi）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci,USA）第７９巻：６４６１〜６４６４頁（１９８２年）
【非特許文献４】マンニング（Manning）ら、ファーマシューティカル・リサーチ（Pharmaceutical Research）第６巻：９０３〜９１８頁（１９８９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
理想的には、開発された処方は、高濃度（例えば、≧２０ｍｇ／ｍｌ）の因子IXの大量貯蔵に関して安定であるべきであり、そのことは、適当な用量に充填／仕上げするために比較的小体積ですみ、さらに例えば、皮下投与のごとき高蛋白濃度を要求しうる別の投与方法を可能にする。したがって、濃縮プロセスおよび凍結乾燥プロセスの間の因子IX蛋白の安定性を向上させる（および活性レベルを維持する）方法、ならびに長期貯蔵中において安定な処方を提供する方法に対する必要性が当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１の態様は、バルク薬剤製品として有用な因子IXの濃縮調製物を提供するための新規組成物および方法を提供する。これらの組成物は、凍結または凍結乾燥され、因子IX、グリシンのごとき増量剤、および冷凍保護剤からなる。好ましい因子IX濃度範囲は約０.１ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌである（約２０ないし少なくとも４０００Ｕ／ｍｌに相当）。好ましい増量剤はグリシン、および／またはマグネシウム、カルシウムもしくは塩化物の塩を包含し、好ましくは、約０.５ないし３００ｍＭの濃度範囲である。適当なれ冷凍保護剤はマンニトールおよびスクロースのごときポリオールを包含し、好ましくは、約０.５ないし２％の濃度範囲である。所望により、これらのバルク薬剤製品組成物は、ポリソルベート（例えば、ツイン８０）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき界面活性剤もしくはデタージェントを含有していてもよく、それらは凍結工程における冷凍保護剤として役立ち得る。好ましくは、界面活性剤は約０.００５ないし０.０５％の範囲である。好ましくは、賦形剤濃度は約２５０ないし３５０ミリオスモラル（ｍＯｓＭ）、好ましくは、約３００ｍＯｓＭ±５０ｍＯｓＭの合成浸透圧を生じ、さらに、生理学的に適切なｐＨ、例えば、好ましくは約６.０ないし８.０の範囲に維持するために適当な緩衝剤を含有していてもよい。好ましくは、緩衝化剤はヒスチジンおよびリン酸ナトリウムもしくはカリウムを包含し、目的ｐＨは約６.５ないし７.５、すべて約５〜
５０ｍＭである。本発明のもう１つの態様は、例えば、静脈内または皮下注射用の最終剤型となった因子IXの処方を提供する。好ましい処方は、約０.１ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの範囲の因子IX濃度の因子IX、約０.５ないし２％のスクロース、約０.１ないし０.３Ｍのグリシン、および約０.００５％ないし０.０２％のポリソルベートを含み、約５ないし５０ｍＭのヒスチジンを緩衝化剤として含む。好ましい凍結乾燥処方は、約０.１ないし少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの因子IX、約２６０ｍＭのグリシン、約１％のスクロース、約０.００５％のポリルベート、および約１０ｍＭのヒスチジンからなり、ｐＨ７.０である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、因子IXの濃縮調製物を得るための新規組成物および方法、さらに貯蔵および投与に適した因子IXの処方が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に用いる用語「凍結乾燥」、「凍結乾燥された」、および「フリーズ−ドライされた」は、溶液を「凍結」し、次いで、所望により減圧で「乾燥」することを包含するプロセスを包含するがこれに限定しない。本明細書の用語「増量剤」は、良好な凍結乾燥ケーク特性を与える薬剤であって、凍結乾燥プロセスに関連する種々のストレス（例えば、剪断／凍結）に蛋白が耐えるようにし、蛋白活性レベルを維持させる薬剤である。典型的な増量剤は、グリシン、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ等を包含するが、これらに限定しない。これらの薬剤は処方の等張性に貢献する。冷凍保護剤もまた等張性に貢献する。用語「冷凍保護剤」は、一般的には、凍結により生じるストレスから蛋白を安定化する薬剤を包含するが、該用語は、例えば、貯蔵中の凍結によらないストレスからバルク薬剤処方を安定化する薬剤も包含する。典型的な冷凍保護剤は、ポリオールを包含し、スクロースおよびマンニトールのごときサッカリドを包含し、さらには、ポリソルベートのごとき界面活性剤、またはポリエチレングリコール等を包含する。用語「乾燥保護剤」は、おそらくは、水素結合により蛋白の正しいコンホーメーションを維持することにより乾燥プロセス中における系からの水分除去途中の蛋白を安定化する薬剤を包含する。冷凍保護剤は乾燥保護剤の効果を有していてもよい。好ましい冷凍保護剤濃度範囲は約０.５ないし２％であるが、比較的高濃度、例えば、５％も適当であり、臨床慣習において慣例的に用いられる浸透圧によってのみ限定されるレベルである。
【００１４】
「界面活性剤」は、一般的には、大気／溶液界面により生じるストレスおよび
溶液／界面により生じるストレス（例えば、蛋白凝集を生じる）から蛋白を保護する薬剤を包含し、ポリソルベート−８０（ツイン）のごときデタージェント（０.００５〜０.０５％（重量／体積））、または例えばＰＥＧ８０００のごときポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含しうる。所望により、比較的高濃度の、例えば０.５％までの濃度も蛋白安定性の維持に適するが、実際用いられるレベルは慣例的に臨床慣習により限定される。
【００１５】
用語「緩衝化剤」は、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容範囲に維持する薬剤を包含し、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム塩）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ジエタノールアミン等を包含しうる。一般的には、濃度上限は、容易に当業者に理解されるように、「バルク」蛋白については「投与」蛋白形態よりも高い。例えば、緩衝剤濃度は、数ミリモラーないしその溶解度の上限までであってよく、例えば、ヒスチジンは２００ｍＭ程度であってよく、当業者は、適切な生理学的適当濃度の達成／維持を考慮するであろう。パーセンテージは、固体をいう場合には重量／重量であり、液体をいう場合には重量／体積である。用語「等張」、３００±５０ｍＯｓＭは、凍結乾燥前の蛋白溶液の浸透圧の測定値を意味し、典型的には、注射用水（ＷＦＩ）で復元を行う。生理学的浸透圧の維持は投与処方について重要である。しかしながら、バルク処方については、使用前に溶液が等張にされる限り、より高濃度が有効に用いられうる。用語「賦形剤」は、良好な凍結乾燥ケーク特性を与える医薬上許容される薬剤（増量剤）、並びに、蛋白の乾燥保護および凍結保護を行い、ｐＨの維持を行い、生物学的活性（蛋白安定性）の実質的保持を維持しておくために貯蔵中に蛋白の正しいコンホーメーションを提供する薬剤を包含する。
【００１６】
用語「因子IX濃度」は、慣用的には、ｍｇ／ｍｌまたはＵ／ｍｌで表現され、１ｍｇは２００Ｕ／ｍｌ±１００Ｕ／ｍｌにほぼ等しい。
【００１７】
以下の実施例は本発明の実施を説明する。これらの実施例は説明目的のみであって、権利請求されている本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例１は、その後凍結乾燥され、３つの異なる温度で１カ月貯蔵される種々の処方（すべて等張）中の組み換え型因子IXを説明する。組成物は水で復元され、粒子生成、蛋白回収率、比活性、および凝集物生成パーセンテージについて評価される。実施例２はさらなる処方を説明し、実施例３は比較的高濃度の因子IXのバルク貯蔵安定性に関する。
【実施例１】
【００１８】
組み換え型因子IX蛋白濃度〜０.５ｍｇ／ｍｌ（１００Ｕ／ｍｌ）で浸透圧３００±５０ｍＯｓＭである、下表Ｉに示す処方を調製する。すべての試料は、コンホーメーション特異的モノクローナル抗体カラムにより精製された組み換え型因子IXを含有する。組み換え型因子IXの調製はＵＳＰＮ４,７７０,９９９（カウフマン（Kaufman）ら）に記載されている。１の適当な精製方法は、フリンダ（Hrinda）ら、プレクリニカル・スタディーズ・オブ・ア・モノクローナル・アンチボディー−ピューリファイド・ファクターIX、モノミン（登録商標）セミナーズ・イン・ヘマトロジー（Preclinical Studies of a Monoclonal Antibody-Purified Factor IX, MononineＴＭ Seminars in Hematology）、第２８巻（３）:６頁（１９９１年７月）に記載の方法である。他の調製方法は、タラカン（Tharakan）ら、「フィジカル・アンド・バイオケミカル・プロパティーズ・オブ・ファイブ・コマーシャル・レジンズ・フォー・イムノアフィニティー・ピューリフィケイション・オブ・ファクターIX（Physical and Biochemical properties of five commercial resins for immunoaffinity purification of factor IX）」、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）第５９５巻：１０３〜１１１頁（１９９２年）；およびリープマン（Liebman）ら、「イムノアフィニティー・ピューリフィケイション・オブ・ファクターIX（クリスマス・ファクター）・バイ・ユージング・コンホーメイション−スペシフィック・アンチボディーズ・ディレクテッド・アゲインスト・ザ・ファクターIX−メタル・コンプレックス（Immunoaffinity purification of factor IX (Christmas factor) by using conformation-specific antibodies against the factor IX-metal complex）」、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Nat'l.Acad.Sci.,USA）第８２巻：３８７９〜３８８３頁（１９８５年）に記載の方法を包含し、さらに、慣用的クロマトグラフィー法、例えば、ハシモト（Hashimoto）ら、「ア・メソッド・フォー・システマチック・ピューリフィケイション・フロム・ババイン・プラズマ・オブ・シックス・ビタミン Ｋ−ディペンデント・コアギュレイション・ファクターズ：プロスロンビン、ファクターＸ、ファクターIX、プロテインＣ・アンド・プロテインＺ（A Method for Systematic Purification from Bovine Plasma of Six Vitamin K-Dependent Coagulation Factors: Prothrombin,Factor X,Factor IX,Protein C,and Protein Z）」、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）第９７巻：１３４７〜１３３５頁（１９８５年）、およびバジャジ,ピー（Bajaj,P.）ら、プレパ・バイオケミ（Prep.Biochem.）第１１巻：３９７頁（１９８１年）記載の方法を包含する。
【００１９】
【表１】
【００２０】
１５個の試料からなるもう１つのセットを上記のごとく調製するが、さらに、界面活性剤（０.００５％ツイン−８０）を含有している。試料１の処方は、市販の血漿由来の因子IX（モノニン（登録商標））について用いられるものである。
【００２１】
Ａ.凍結／融解サイクルの影響
統括乾燥前に、各処方思慮を５回の凍結／融解サイクルに供して凍結により生じる変性に対する感受性を調べる。凍結乾燥前の一連の−８０℃／３７℃の凍結／融解サイクル（例えば、５回）は、凍結乾燥プロセスおよび／または長期貯蔵の間に観察されうる凝集の形成の増大に対する蛋白の感受性の有用な「指示」である。試料を、存在する「高分子量種（ＨＭＷ）」の量についてアッセイし、ＨＭＷは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）により測定される共有および非共有凝集体を包含する。ツイン８０（０.００５％）を添加した試料は凝集の形成が最少である（０.１％未満のＨＭＷ増加）。界面活性剤を添加しない場合、処方１、６、１１および１５は６％よりも多いＨＭＷ生成を示し、他の処方は４％未満のＨＭＷ増加であった。
【００２２】
Ｂ.期間中の温度および界面活性剤の影響
凍結乾燥前に、各試料（界面活性剤（ツイン８０、０.００５％）添加および無添加）を０.２μｍフィルターで滅菌する。体積０.５ｍｌを２ｍｌの凍結乾燥バイアルに入れ、凍結乾燥機に供する。バイアルを−５０℃で５.５時間凍結する。温度を−３０℃に上げて初期乾燥を開始し、４２時間保持する。温度を＋２５℃に上げて１時間置き、第２乾燥を開始し、１５時間保持する。第２乾燥の終了時にバイアルに栓をする。すべての処方は良好なケーク特性を示し、水添加後３０分以内に容易に復元される。凍結乾燥直後、試料をＨＭＷ増加について評価する。大部分のツイン不含のものは〜１ないし２％の増加であった。次いで、試料を３つの異なる温度（−８０℃、４℃および３０℃）に１カ月間貯蔵する。ＨＭＷ増加パーセンテージを、凍結乾燥後のＳＥＣ−ＨＰＬＣから得られる面積（２８０ｎｍの吸光度）として表現する（表II）。１カ月の貯蔵後、多くの界面活性剤不含処方は０ないし２５％の範囲の高いＨＭＷ増加パーセンテージを示し、このことは３０℃での貯蔵において最も明確である。詳細には、試料１〜３、１２および１４は最高の増加パーセンテージを示す。
【００２３】
界面活性剤含有処方は、一般的に、低いＨＭＷ増加パーセンテージを示し、すなわち、凍結乾燥プロセス自体に起因する凍結により生じる凝集が最少であり、長期貯蔵はさらに他の賦形剤の存在に依存する。例えば、マンニトールよりもスクロースを添加した処方はＨＭＷ増加パーセンテージが低い。よって、界面活性剤添加または無添加のマンニトール処方１、２、３、１２および１４は３６％までのＨＭＷ増加を示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】
−８０℃、４℃および３０℃で１カ月の試料の凝血活性および比活性の値を測定する。ピットマン,ディー（Pittman,D.）ら、ブラッド（Blood）第７９巻：
３８９〜３９７頁（１９９２年）の方法に従い、因子IX欠損血液を用いて因子IX活性を測定する。
活性または比活性の回収率のわずかな相違が−８０℃または４℃で１カ月後（界面活性剤添加または無添加）に観察されるが；３０℃においては、活性および比活性の回収率は、一般的に、凝集の結果と相関がある。言い換えると、活性の損失は、一般的に、凝集の増加に伴って観察され、最も著しくは、処方１、２、３、１２および１４において観察され、それらの処方においては、界面活性剤の添加によって期間中の凝集を防止することができなかった。
【実施例２】
【００２６】
さらに、ヒスチジン、グリシン（界面活性剤添加および無添加）、および２％スクロースからなる２種の処方を評価すると、因子IX活性の維持が見いだされる。
【００２７】
１０種の処方からなるもう１つのセットを表IIIに示すように調製し（浸透圧３００±５０ｍＯｓＭ）、上記のごとく凍結乾燥し、次いで、−８０℃、４℃、および３０℃に貯蔵のために置き、１カ月、３カ月および４カ月において安定性分析を行う。
【００２８】
【表３】
【００２９】
すべての処方は良好な凍結乾燥ケークを形成し、２０〜３０秒以内に復元される。
【００３０】
表IVは、数カ月後の３種の貯蔵温度における活性および比活性の回収率をまとめる。３カ月後の４℃の試料に関するデータは、活性を消失した処方８および１０を除く大部分の処方と同様である。３０℃で３カ月後、処方２、８、９ および１０は活性を消失した。活性および比活性の最大の回収率は処方１、３、５、６および７について見られる。
【００３１】
表Ｖは、期間中の凝集の増加をまとめる。４℃において３カ月後、処方１〜７はＨＭＷ増加が４％未満であり、処方８、９ および１０は最大の凝集体形成を示す。３０℃において、処方１は４カ月後でさえもＨＭＷ増加を示さないが、他のすべての処方は３％より大きいＨＭＷ増加を示す。処方２、８、９ および１０（すべてスクロース不含）は凝集体形成増加が見られる。
【００３２】
【表４】
【００３３】
【表５】
【実施例３】
【００３４】
実施例３
輸送容器の体積要求を最小にするために、充填／仕上げの設備に輸送する前にバルク蛋白をできるかぎり濃縮（例えば、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌまで）することが好ましい。そのうえ、バルク薬剤製品および最終製品が同様の処方であることが望ましい。
【００３５】
バルク薬剤製品として有用な因子IXの濃縮調製物を評価するために、高い（１０ｍｇ／ｍｌ以上）因子IX濃度であること以外は下表VIに示すように１２種の処方を調製した。界面活性剤濃度は約０.００５または０.０２％のツイン−８０である（ツイン最適化研究として有用）。すべての試料は１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の因子IXおよび１％のスクロースを含有している。すべての試料の浸透圧は３００±５０ｍＯｓＭであった。
【００３６】
【表６】
【００３７】
試料を−８０℃で凍結し、次いで、３７℃で融解するする５回の凍結−融解サイクルに供し、全因子IX濃度、活性、および比活性の回収率に関して分析する。因子IXのレベル（ｍｇ／ｍｌ）は１０.４０ないし１５.２１ｍｇ／ｍｌである。初期ＨＭＷパーセントは０.５％未満である。１２種の処方について、蛋白または活性の損失はなく、凍結／融解サイクルによる凝集体形成の有意な増加もない。表Ｖのいくつかの処方に関して、高濃度に処方されたバルク製品を、−８０℃で１カ月貯蔵後の安定性について分析する。ＨＭＷ％の増加は観察されず、比活性は維持されている。
【００３８】
特定の方法、処方、および組成物に関して本発明を説明したが、本発明を考慮して当業者が変化および変更を行うであろうことが理解される。
【００３９】
上記説明的実施例に記載された本発明における多くの変更および変化が当業者によりなされると考えられ、したがって、添付した請求の範囲にある限定のみが課せられるべきである。よって、権利請求されている発明の範囲内にあるすべてのかかる均等な変化が添付した請求の範囲に包含されると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、医薬品の製造分野等において利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、因子IXからなる新規処方に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿糖蛋白である因子IXを包含する血液凝固プロセスに関与する種々の因子が同定されている。因子IX欠乏は血友病の１のタイプ（Ｂ型）を特徴づける。伝統的には、この疾患の治療はヒト・血漿由来の因子IXの蛋白濃縮物の静脈輸液を用いる。血液濃縮物の輸液は、ウイルス性肝炎およびＨＩＶのごとき種々の感染源、または血栓閉塞因子の伝達の危険性を包含している。組み換えＤＮＡ法により因子IXを製造する別の方法が特許文献１に記載されている。ヒト・因子IXをコードしているｃＤＮＡが単離され、特徴づけられ、発現ベクター中にクローン化されている。例えば、非特許文献１〜３参照。よって、組み換えＤＮＡ法の進歩により、因子IX蛋白を製造することが可能となった。
【０００３】
貯蔵でき、蛋白の最終剤型のさらなる製造に適するバルク蛋白、例えば、因子IXの濃縮形態を得ることが望ましい。典型的には、蛋白精製プロセスは蛋白の濃縮を引き起こす。バルク蛋白としても知られるこの濃縮された蛋白は処方緩衝化剤中にあってもよい。次いで、典型的には約２ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの濃度のバルク蛋白を充填／仕上げ設備へと凍結輸送することができ、そこで適当な投与濃度に希釈され、投与用バイアルに入れられる。これらの希釈試料を、例えば、フリーズドライのごとく凍結乾燥することができる。凍結乾燥試料を長期貯蔵し、後ほど、患者に使用する直前に適当な投与用希釈剤を添加することにより復元してもよい。
【０００４】
蛋白安定性は、特に、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結／融解サイクルの繰り返し、および剪断力への曝露のごとき因子により影響されうる。変性および凝集（可溶性および不溶性凝集物双方の生成）を包含する物理的不安定性ならびに化学的不安定性、例えば、加水分解、脱アミノ化および酸化の結果（少しの例を挙げたにすぎない）として活性蛋白は消失しうる。蛋白薬剤の安定性の一般的総説としては、例えば、非特許文献４参照。
【０００５】
蛋白不安定性の生じうる発生は広く認識されているが、特定の蛋白の特定の不安定性の問題を予想することは不可能である。これらの不安定性のいずれもが、より低い活性、増大した毒性および／または増大した免疫原性を有する蛋白、蛋白副産物、または誘導体の生成を引き起こす可能性がある。実際、蛋白沈殿は、血栓症、剤型および用量の不均一性、ならびに注射器の詰まりを引き起こす。さらに、因子IXに特異的な数種の翻訳後修飾（例えば、Ｎ−末端のあるグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化および糖鎖付加）があり、それらは生物学的活性の維持において重要である可能性があり、貯蔵による変化に影響されうる。よって、いずれの蛋白の医薬処方の安全性および有効性も、その安定性に直接関係している。
【０００６】
安定性の考慮のほかに、一般的には、種々の世界的な医薬の規制機関の是認を得ているかまたは得るであろう賦形剤を選択する。溶液は等張であり、生理学的に適切な範囲のｐＨであるべきである。使用バッファーの選択および量は所望ｐＨ範囲とするのに重要である。そのうえ、因子IXの場合、凝固時間アッセイ分析および凝血能を妨害しうるため「ヘパリン」のごとき薬剤を避けるべきである。
【０００７】
現在、２種の市販のキャリヤ蛋白不含で血漿由来の因子IX処方がある。アルファ・セラピューティク・コーポレイション（Alpha Therapeutic orporation）は凍結乾燥したＡｌｐｈａＮｉｎｅ（登録商標）ＳＤを提供しており、ヘパリン、デキストロース、ポリソルベート８０、およびトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートからなる。この調製物は２ないし８℃の温度に貯蔵される。上記のごとく、ヘパリンは抗−凝血剤であるのでヘパリンが避けられ、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェートは粘膜を刺激するので、この処方は理想的とはいえない。アーマー・ファーマシューティカル・カンパニー（Armour Pharmaceutical Company）の凍結乾燥されたMononin（登録商標）はヒスチジン、塩化ナトリウムおよびマンニトールからなり、同様に２ないし８℃に貯蔵される。包装に添付された説明書には該処方を室温で１カ月以上貯蔵しないよう書かれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４,７７０,９９９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】チョー（Choo）ら、ネイチャー（Nature）第２９９巻：１７８〜１８０頁（１９８２年）
【非特許文献２】フェア（Fair）ら、ブラッド（Blood）第６４巻：１９４〜２０４頁（１９８４年）
【非特許文献３】クラチ（Kurachi）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci,USA）第７９巻：６４６１〜６４６４頁（１９８２年）
【非特許文献４】マンニング（Manning）ら、ファーマシューティカル・リサーチ（Pharmaceutical Research）第６巻：９０３〜９１８頁（１９８９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
理想的には、開発された処方は、高濃度（例えば、≧２０ｍｇ／ｍｌ）の因子IXの大量貯蔵に関して安定であるべきであり、そのことは、適当な用量に充填／仕上げするために比較的小体積ですみ、さらに例えば、皮下投与のごとき高蛋白濃度を要求しうる別の投与方法を可能にする。したがって、濃縮プロセスおよび凍結乾燥プロセスの間の因子IX蛋白の安定性を向上させる（および活性レベルを維持する）方法、ならびに長期貯蔵中において安定な処方を提供する方法に対する必要性が当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１の態様は、バルク薬剤製品として有用な因子IXの濃縮調製物を提供するための新規組成物および方法を提供する。これらの組成物は、凍結または凍結乾燥され、因子IX、グリシンのごとき増量剤、および冷凍保護剤からなる。好ましい因子IX濃度範囲は約０.１ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌである（約２０ないし少なくとも４０００Ｕ／ｍｌに相当）。好ましい増量剤はグリシン、および／またはマグネシウム、カルシウムもしくは塩化物の塩を包含し、好ましくは、約０.５ないし３００ｍＭの濃度範囲である。適当なれ冷凍保護剤はマンニトールおよびスクロースのごときポリオールを包含し、好ましくは、約０.５ないし２％の濃度範囲である。所望により、これらのバルク薬剤製品組成物は、ポリソルベート（例えば、ツイン８０）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき界面活性剤もしくはデタージェントを含有していてもよく、それらは凍結工程における冷凍保護剤として役立ち得る。好ましくは、界面活性剤は約０.００５ないし０.０５％の範囲である。好ましくは、賦形剤濃度は約２５０ないし３５０ミリオスモラル（ｍＯｓＭ）、好ましくは、約３００ｍＯｓＭ±５０ｍＯｓＭの合成浸透圧を生じ、さらに、生理学的に適切なｐＨ、例えば、好ましくは約６.０ないし８.０の範囲に維持するために適当な緩衝剤を含有していてもよい。好ましくは、緩衝化剤はヒスチジンおよびリン酸ナトリウムもしくはカリウムを包含し、目的ｐＨは約６.５ないし７.５、すべて約５〜
５０ｍＭである。本発明のもう１つの態様は、例えば、静脈内または皮下注射用の最終剤型となった因子IXの処方を提供する。好ましい処方は、約０.１ないし少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの範囲の因子IX濃度の因子IX、約０.５ないし２％のスクロース、約０.１ないし０.３Ｍのグリシン、および約０.００５％ないし０.０２％のポリソルベートを含み、約５ないし５０ｍＭのヒスチジンを緩衝化剤として含む。好ましい凍結乾燥処方は、約０.１ないし少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの因子IX、約２６０ｍＭのグリシン、約１％のスクロース、約０.００５％のポリルベート、および約１０ｍＭのヒスチジンからなり、ｐＨ７.０である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、因子IXの濃縮調製物を得るための新規組成物および方法、さらに貯蔵および投与に適した因子IXの処方が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に用いる用語「凍結乾燥」、「凍結乾燥された」、および「フリーズ−ドライされた」は、溶液を「凍結」し、次いで、所望により減圧で「乾燥」することを包含するプロセスを包含するがこれに限定しない。本明細書の用語「増量剤」は、良好な凍結乾燥ケーク特性を与える薬剤であって、凍結乾燥プロセスに関連する種々のストレス（例えば、剪断／凍結）に蛋白が耐えるようにし、蛋白活性レベルを維持させる薬剤である。典型的な増量剤は、グリシン、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ等を包含するが、これらに限定しない。これらの薬剤は処方の等張性に貢献する。冷凍保護剤もまた等張性に貢献する。用語「冷凍保護剤」は、一般的には、凍結により生じるストレスから蛋白を安定化する薬剤を包含するが、該用語は、例えば、貯蔵中の凍結によらないストレスからバルク薬剤処方を安定化する薬剤も包含する。典型的な冷凍保護剤は、ポリオールを包含し、スクロースおよびマンニトールのごときサッカリドを包含し、さらには、ポリソルベートのごとき界面活性剤、またはポリエチレングリコール等を包含する。用語「乾燥保護剤」は、おそらくは、水素結合により蛋白の正しいコンホーメーションを維持することにより乾燥プロセス中における系からの水分除去途中の蛋白を安定化する薬剤を包含する。冷凍保護剤は乾燥保護剤の効果を有していてもよい。好ましい冷凍保護剤濃度範囲は約０.５ないし２％であるが、比較的高濃度、例えば、５％も適当であり、臨床慣習において慣例的に用いられる浸透圧によってのみ限定されるレベルである。
【００１４】
「界面活性剤」は、一般的には、大気／溶液界面により生じるストレスおよび
溶液／界面により生じるストレス（例えば、蛋白凝集を生じる）から蛋白を保護する薬剤を包含し、ポリソルベート−８０（ツイン）のごときデタージェント（０.００５〜０.０５％（重量／体積））、または例えばＰＥＧ８０００のごときポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含しうる。所望により、比較的高濃度の、例えば０.５％までの濃度も蛋白安定性の維持に適するが、実際用いられるレベルは慣例的に臨床慣習により限定される。
【００１５】
用語「緩衝化剤」は、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容範囲に維持する薬剤を包含し、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム塩）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ジエタノールアミン等を包含しうる。一般的には、濃度上限は、容易に当業者に理解されるように、「バルク」蛋白については「投与」蛋白形態よりも高い。例えば、緩衝剤濃度は、数ミリモラーないしその溶解度の上限までであってよく、例えば、ヒスチジンは２００ｍＭ程度であってよく、当業者は、適切な生理学的適当濃度の達成／維持を考慮するであろう。パーセンテージは、固体をいう場合には重量／重量であり、液体をいう場合には重量／体積である。用語「等張」、３００±５０ｍＯｓＭは、凍結乾燥前の蛋白溶液の浸透圧の測定値を意味し、典型的には、注射用水（ＷＦＩ）で復元を行う。生理学的浸透圧の維持は投与処方について重要である。しかしながら、バルク処方については、使用前に溶液が等張にされる限り、より高濃度が有効に用いられうる。用語「賦形剤」は、良好な凍結乾燥ケーク特性を与える医薬上許容される薬剤（増量剤）、並びに、蛋白の乾燥保護および凍結保護を行い、ｐＨの維持を行い、生物学的活性（蛋白安定性）の実質的保持を維持しておくために貯蔵中に蛋白の正しいコンホーメーションを提供する薬剤を包含する。
【００１６】
用語「因子IX濃度」は、慣用的には、ｍｇ／ｍｌまたはＵ／ｍｌで表現され、１ｍｇは２００Ｕ／ｍｌ±１００Ｕ／ｍｌにほぼ等しい。
【００１７】
以下の実施例は本発明の実施を説明する。これらの実施例は説明目的のみであって、権利請求されている本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例１は、その後凍結乾燥され、３つの異なる温度で１カ月貯蔵される種々の処方（すべて等張）中の組み換え型因子IXを説明する。組成物は水で復元され、粒子生成、蛋白回収率、比活性、および凝集物生成パーセンテージについて評価される。実施例２はさらなる処方を説明し、実施例３は比較的高濃度の因子IXのバルク貯蔵安定性に関する。
【実施例１】
【００１８】
組み換え型因子IX蛋白濃度〜０.５ｍｇ／ｍｌ（１００Ｕ／ｍｌ）で浸透圧３００±５０ｍＯｓＭである、下表Ｉに示す処方を調製する。すべての試料は、コンホーメーション特異的モノクローナル抗体カラムにより精製された組み換え型因子IXを含有する。組み換え型因子IXの調製はＵＳＰＮ４,７７０,９９９（カウフマン（Kaufman）ら）に記載されている。１の適当な精製方法は、フリンダ（Hrinda）ら、プレクリニカル・スタディーズ・オブ・ア・モノクローナル・アンチボディー−ピューリファイド・ファクターIX、モノミン（登録商標）セミナーズ・イン・ヘマトロジー（Preclinical Studies of a Monoclonal Antibody-Purified Factor IX, MononineＴＭ Seminars in Hematology）、第２８巻（３）:６頁（１９９１年７月）に記載の方法である。他の調製方法は、タラカン（Tharakan）ら、「フィジカル・アンド・バイオケミカル・プロパティーズ・オブ・ファイブ・コマーシャル・レジンズ・フォー・イムノアフィニティー・ピューリフィケイション・オブ・ファクターIX（Physical and Biochemical properties of five commercial resins for immunoaffinity purification of factor IX）」、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）第５９５巻：１０３〜１１１頁（１９９２年）；およびリープマン（Liebman）ら、「イムノアフィニティー・ピューリフィケイション・オブ・ファクターIX（クリスマス・ファクター）・バイ・ユージング・コンホーメイション−スペシフィック・アンチボディーズ・ディレクテッド・アゲインスト・ザ・ファクターIX−メタル・コンプレックス（Immunoaffinity purification of factor IX (Christmas factor) by using conformation-specific antibodies against the factor IX-metal complex）」、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Nat'l.Acad.Sci.,USA）第８２巻：３８７９〜３８８３頁（１９８５年）に記載の方法を包含し、さらに、慣用的クロマトグラフィー法、例えば、ハシモト（Hashimoto）ら、「ア・メソッド・フォー・システマチック・ピューリフィケイション・フロム・ババイン・プラズマ・オブ・シックス・ビタミン Ｋ−ディペンデント・コアギュレイション・ファクターズ：プロスロンビン、ファクターＸ、ファクターIX、プロテインＣ・アンド・プロテインＺ（A Method for Systematic Purification from Bovine Plasma of Six Vitamin K-Dependent Coagulation Factors: Prothrombin,Factor X,Factor IX,Protein C,and Protein Z）」、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）第９７巻：１３４７〜１３３５頁（１９８５年）、およびバジャジ,ピー（Bajaj,P.）ら、プレパ・バイオケミ（Prep.Biochem.）第１１巻：３９７頁（１９８１年）記載の方法を包含する。
【００１９】
【表１】
【００２０】
１５個の試料からなるもう１つのセットを上記のごとく調製するが、さらに、界面活性剤（０.００５％ツイン−８０）を含有している。試料１の処方は、市販の血漿由来の因子IX（モノニン（登録商標））について用いられるものである。
【００２１】
Ａ.凍結／融解サイクルの影響
統括乾燥前に、各処方思慮を５回の凍結／融解サイクルに供して凍結により生じる変性に対する感受性を調べる。凍結乾燥前の一連の−８０℃／３７℃の凍結／融解サイクル（例えば、５回）は、凍結乾燥プロセスおよび／または長期貯蔵の間に観察されうる凝集の形成の増大に対する蛋白の感受性の有用な「指示」である。試料を、存在する「高分子量種（ＨＭＷ）」の量についてアッセイし、ＨＭＷは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）により測定される共有および非共有凝集体を包含する。ツイン８０（０.００５％）を添加した試料は凝集の形成が最少である（０.１％未満のＨＭＷ増加）。界面活性剤を添加しない場合、処方１、６、１１および１５は６％よりも多いＨＭＷ生成を示し、他の処方は４％未満のＨＭＷ増加であった。
【００２２】
Ｂ.期間中の温度および界面活性剤の影響
凍結乾燥前に、各試料（界面活性剤（ツイン８０、０.００５％）添加および無添加）を０.２μｍフィルターで滅菌する。体積０.５ｍｌを２ｍｌの凍結乾燥バイアルに入れ、凍結乾燥機に供する。バイアルを−５０℃で５.５時間凍結する。温度を−３０℃に上げて初期乾燥を開始し、４２時間保持する。温度を＋２５℃に上げて１時間置き、第２乾燥を開始し、１５時間保持する。第２乾燥の終了時にバイアルに栓をする。すべての処方は良好なケーク特性を示し、水添加後３０分以内に容易に復元される。凍結乾燥直後、試料をＨＭＷ増加について評価する。大部分のツイン不含のものは〜１ないし２％の増加であった。次いで、試料を３つの異なる温度（−８０℃、４℃および３０℃）に１カ月間貯蔵する。ＨＭＷ増加パーセンテージを、凍結乾燥後のＳＥＣ−ＨＰＬＣから得られる面積（２８０ｎｍの吸光度）として表現する（表II）。１カ月の貯蔵後、多くの界面活性剤不含処方は０ないし２５％の範囲の高いＨＭＷ増加パーセンテージを示し、このことは３０℃での貯蔵において最も明確である。詳細には、試料１〜３、１２および１４は最高の増加パーセンテージを示す。
【００２３】
界面活性剤含有処方は、一般的に、低いＨＭＷ増加パーセンテージを示し、すなわち、凍結乾燥プロセス自体に起因する凍結により生じる凝集が最少であり、長期貯蔵はさらに他の賦形剤の存在に依存する。例えば、マンニトールよりもスクロースを添加した処方はＨＭＷ増加パーセンテージが低い。よって、界面活性剤添加または無添加のマンニトール処方１、２、３、１２および１４は３６％までのＨＭＷ増加を示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】
−８０℃、４℃および３０℃で１カ月の試料の凝血活性および比活性の値を測定する。ピットマン,ディー（Pittman,D.）ら、ブラッド（Blood）第７９巻：
３８９〜３９７頁（１９９２年）の方法に従い、因子IX欠損血液を用いて因子IX活性を測定する。
活性または比活性の回収率のわずかな相違が−８０℃または４℃で１カ月後（界面活性剤添加または無添加）に観察されるが；３０℃においては、活性および比活性の回収率は、一般的に、凝集の結果と相関がある。言い換えると、活性の損失は、一般的に、凝集の増加に伴って観察され、最も著しくは、処方１、２、３、１２および１４において観察され、それらの処方においては、界面活性剤の添加によって期間中の凝集を防止することができなかった。
【実施例２】
【００２６】
さらに、ヒスチジン、グリシン（界面活性剤添加および無添加）、および２％スクロースからなる２種の処方を評価すると、因子IX活性の維持が見いだされる。
【００２７】
１０種の処方からなるもう１つのセットを表IIIに示すように調製し（浸透圧３００±５０ｍＯｓＭ）、上記のごとく凍結乾燥し、次いで、−８０℃、４℃、および３０℃に貯蔵のために置き、１カ月、３カ月および４カ月において安定性分析を行う。
【００２８】
【表３】
【００２９】
すべての処方は良好な凍結乾燥ケークを形成し、２０〜３０秒以内に復元される。
【００３０】
表IVは、数カ月後の３種の貯蔵温度における活性および比活性の回収率をまとめる。３カ月後の４℃の試料に関するデータは、活性を消失した処方８および１０を除く大部分の処方と同様である。３０℃で３カ月後、処方２、８、９ および１０は活性を消失した。活性および比活性の最大の回収率は処方１、３、５、６および７について見られる。
【００３１】
表Ｖは、期間中の凝集の増加をまとめる。４℃において３カ月後、処方１〜７はＨＭＷ増加が４％未満であり、処方８、９ および１０は最大の凝集体形成を示す。３０℃において、処方１は４カ月後でさえもＨＭＷ増加を示さないが、他のすべての処方は３％より大きいＨＭＷ増加を示す。処方２、８、９ および１０（すべてスクロース不含）は凝集体形成増加が見られる。
【００３２】
【表４】
【００３３】
【表５】
【実施例３】
【００３４】
実施例３
輸送容器の体積要求を最小にするために、充填／仕上げの設備に輸送する前にバルク蛋白をできるかぎり濃縮（例えば、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌまで）することが好ましい。そのうえ、バルク薬剤製品および最終製品が同様の処方であることが望ましい。
【００３５】
バルク薬剤製品として有用な因子IXの濃縮調製物を評価するために、高い（１０ｍｇ／ｍｌ以上）因子IX濃度であること以外は下表VIに示すように１２種の処方を調製した。界面活性剤濃度は約０.００５または０.０２％のツイン−８０である（ツイン最適化研究として有用）。すべての試料は１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の因子IXおよび１％のスクロースを含有している。すべての試料の浸透圧は３００±５０ｍＯｓＭであった。
【００３６】
【表６】
【００３７】
試料を−８０℃で凍結し、次いで、３７℃で融解するする５回の凍結−融解サイクルに供し、全因子IX濃度、活性、および比活性の回収率に関して分析する。因子IXのレベル（ｍｇ／ｍｌ）は１０.４０ないし１５.２１ｍｇ／ｍｌである。初期ＨＭＷパーセントは０.５％未満である。１２種の処方について、蛋白または活性の損失はなく、凍結／融解サイクルによる凝集体形成の有意な増加もない。表Ｖのいくつかの処方に関して、高濃度に処方されたバルク製品を、−８０℃で１カ月貯蔵後の安定性について分析する。ＨＭＷ％の増加は観察されず、比活性は維持されている。
【００３８】
特定の方法、処方、および組成物に関して本発明を説明したが、本発明を考慮して当業者が変化および変更を行うであろうことが理解される。
【００３９】
上記説明的実施例に記載された本発明における多くの変更および変化が当業者によりなされると考えられ、したがって、添付した請求の範囲にある限定のみが課せられるべきである。よって、権利請求されている発明の範囲内にあるすべてのかかる均等な変化が添付した請求の範囲に包含されると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、医薬品の製造分野等において利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
因子IX、グリシン、および冷凍保護剤からなる組成物。
【請求項１】
因子IX、グリシン、および冷凍保護剤からなる組成物。
【公開番号】特開２０１０−７７１４８（Ｐ２０１０−７７１４８Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６７７９７（Ｐ２００９−２６７７９７）
【出願日】平成２１年１１月２５日（２００９．１１．２５）
【分割の表示】特願２００６−１４１７８０（Ｐ２００６−１４１７８０）の分割
【原出願日】平成７年４月６日（１９９５．４．６）
【出願人】（５０１４１８２１４）ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２５日（２００９．１１．２５）
【分割の表示】特願２００６−１４１７８０（Ｐ２００６−１４１７８０）の分割
【原出願日】平成７年４月６日（１９９５．４．６）
【出願人】（５０１４１８２１４）ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー (35)
【Ｆターム（参考）】
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