本発明は、固定された組織標本からの長い断片RNAの抽出方法に関する。特に、本発明は、オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションに基づくアッセイを含めた生物学的応用に使用するための、ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織標本からのRNAの抽出方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定された組織サンプルからの長い断片RNAの分離方法であって、以下のステップ：
a）抽出溶液中、約44〜約62℃の範囲内の温度にて3時間以上の期間、上記固定された組織サンプルを加熱し、ここで上記抽出溶液は、約0.1mM〜約20mMの濃度のキレート剤、及びプロテイナーゼKを含んでなり；そして
b）混入DNAを取り除き；そして
c）上記抽出溶液から上記RNAを分離する、
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
前記加熱が、約45〜約60℃、約48〜約58℃、約48〜約55℃、約48〜52℃、及び約50℃の温度範囲から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記加熱が、約50〜56℃である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記期間が、4時間より長い、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記期間が、8時間より長い、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記期間が、12時間より長い、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記期間が、14時間より長い、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記期間が、約16時間である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記期間が、約16時間である、請求項3に記載の方法。
【請求項１０】
前記キレート剤が、EDTA、EGTA、クエン酸塩、クエン酸、サリチル酸、サリチル酸の塩、フタル酸、2,4-ペンタンジン、ヒスチジン、ヒスチジノール二塩酸塩、8-ヒドロキシキノリン類、8-ヒドロキシキノリン、クエン酸、及びo-ヒドロキシキノンから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記キレート剤が、EDTAである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記キレート剤が、クエン酸ナトリウムである、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記キレート剤が、約0.6mM〜約5.0mMの濃度にて存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記キレート剤が、約0.6mM〜約3.6mMの濃度にて存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記キレート剤が、3.6mMの濃度にて存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
EDTAが、約3.6mMにて存在する、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
クエン酸ナトリウムが、約0.6mM〜約3.6mMにて存在する、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
前記混入DNAを取り除くステップが、1回目と2回目のフェノール抽出を用いて実施され、ここで上記2回目のフェノール抽出がカオトロピック剤を含んでなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記カオトロピック剤が、尿素、イソチオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム（NaSCN）、グアニジンHCl、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、及びトリフルオロ酢酸セシウムから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記カオトロピック剤が、イソチオシアン酸グアニジニウムである、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記固定されたサンプルが、ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織サンプルである、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記固定された、ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織サンプルが、5年前のもの又はそれより新しいものである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
DNAseを利用しない、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
固定された組織サンプルからの長い断片RNAの分離方法であって、以下のステップ：
a）抽出溶液中、約50℃〜約56℃の範囲内の温度にて約16時間の期間、固定された組織サンプルを加熱し、そして
b）少なくとも1回目及び2回目のフェノール抽出を実施して、上記抽出溶液から上記RNAを分離する、ここで上記2回目のフェノール抽出はカオトロピック剤を含んでなる、
を含んでなる前記方法。
【請求項２５】
ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織サンプルからの長い断片RNAの分離方法であって、以下のステップ：
a）抽出溶液中、約45〜約62℃の範囲内の温度にて3時間以上の期間、ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織サンプルを加熱し、ここで上記抽出溶液は、2.5mM〜約5.0mMの濃度のキレート剤、及び12.5μgのプロテイナーゼK/mLの濃度のプロテイナーゼKを含んでなり；
b）少なくとも1回目及び2回目のフェノール抽出を実施して、上記抽出溶液から上記RNAを分離する、ここで上記2回目のフェノール抽出はカオトロピック剤を含んでなる、
を含んでなる前記方法。
【請求項２６】
ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織からの長い断片RNAの抽出方法であって、以下のステップ：
a）約3.6mMの濃度のEDTA又はクエン酸ナトリウム、及び12.5μgのプロテイナーゼK/mLの濃度のプロテイナーゼKを含んでなる抽出溶液中、約50℃〜56℃の温度にて約16の期間、固定されパラフィン包埋された組織サンプルを加熱し；そして
b）少なくとも1回目及び2回目のフェノール抽出を実施して、上記抽出溶液から上記RNAを分離する、ここで上記2回目のフェノール抽出はカオトロピック剤を含んでなる、
を含んでなる前記方法。
【請求項２７】
前記長い断片RNAが、200ヌクレオチドより長い長さである、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
前記長い断片RNAが、300ヌクレオチド以上の長さである、請求項1に記載の方法。
【請求項２９】
前記抽出方法が、10%未満のDNAしか同時分離しない、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
請求項1に記載の方法によって分離した長い断片RNA。
【請求項３１】
請求項30に記載の長い断片RNAから作り出されたcDNA。
【請求項３２】
遺伝子発現解析における、請求項30に記載のRNAの使用。
【請求項３３】
固定されパラフィン包埋された組織サンプル中の標的遺伝子発現レベルの測定方法であって、以下のステップ：
（a）請求項1に記載の方法によって上記組織サンプルから長い断片RNAを分離し；
（b）上記mRNAを、標的遺伝子領域を増幅できるオリゴヌクレオチド・プライマー対を使用した増幅にかけて、増幅したmRNAを得；そして
（c）内部標準遺伝子のmRNAの数量に相対する標的遺伝子mRNAの数量を決定する、
を含んでなる前記方法。
【請求項３４】
前記標的遺伝子が、ERCC1、TS、DPD、Her2neu、Gst-pi、RRM1、又はKrasである、請求項33に記載の方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【公表番号】特表２０１０−５３０７６１（Ｐ２０１０−５３０７６１Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３４８８（Ｐ２０１０−５１３４８８）
【出願日】平成２０年６月２３日（２００８．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６７９１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００２９３７
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０９３５３７７９）レスポンス　ジェネティクス，インコーポレイティド (1)
【Ｆターム（参考）】