固定化酵素を用いた有用物質の製造方法
【課題】固定化酵素を充填した固定床型反応塔に、２液相を形成する液体混合物を流通させて反応を行う有用物質の製造方法において、流量を低下させずに反応性を高め、生産性を向上させることにより、より効率的に有用物質の製造する方法の提供。
【解決手段】固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みが１０〜２００ｍｍである有用物質の製造方法。
【解決手段】固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みが１０〜２００ｍｍである有用物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔を用いた反応による有用物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体を固定床型反応塔に通液して行う反応として、Ｌ−アスパラギン酸生成、エステル交換油脂生成、乳糖加水分解、油脂類の加水分解等に利用されている固定化酵素を用いた反応が知られている。これらの反応は、いずれも発熱量が比較的小さい為、通常、最も単純なドラム型反応器が使用されている。
【０００３】
固定化酵素を用いた反応のうち、油脂類の加水分解のように２種類以上の液を反応塔に流通させる場合には、反応効率向上の観点から、反応液を均一に混合した状態で通液することが好ましい。この場合、加水分解に用いる油相基質と水相基質は、本来混合しても一相にならないものであるため、エマルションとするのが一般的である。一方で、エマルション粒子は担体の細孔内に吸着した酵素に到達し難いため、通液速度を、反応液が乳化しない範囲とした技術もある（特許文献１参照）。
【０００４】
また、固定床に油相基質と水相基質を流通させる方法としては、向流で流通させる方法（特許文献１、２参照）、及び並流で流通させる方法（特許文献３参照）があるが、前者は特殊な仕組みと運転方法が必要となるため、一般的には並流で流通させる方法が採られている。
【特許文献１】特開昭６１−８５１９５号公報
【特許文献２】特開平１−９８４９４号公報
【特許文献３】特開２０００−１６０１８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記固定化酵素を充填した固定床型反応塔に、２液相を形成する液体混合物を流通させて反応を行う方法においては、反応塔の径が大きくなるに従って、塔内における反応液の流れが不均一となり、効率的に反応が進まない部分が生じ、結果として反応性が低下するという問題があることを見出した。この場合、反応性を高めるために、単に固定化酵素と反応液の接触時間を長くしようとすると、生産性（流量）が低下するという問題もある。
【０００６】
従って、本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に、２液相を形成する液体混合物を流通させて反応を行う有用物質の製造方法において、流量を低下させずに反応性を高め、生産性を向上させることにより、より効率的に有用物質を製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔における反応液の流通の特徴を解析した結果、固定床型反応塔の径が大きくなると、油相と水相の流動様相の違いにより、一定の充填厚みを超えたところから塔内での反応液の不均一化が生じ、反応性が低下することを見出した。そこで、固定床型反応塔の一段あたりの固定化酵素の充填厚みを規定し、液液二相流を整流することにより、高い反応性を維持したまま、生産性を向上させることができることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みが１０〜２００ｍｍである有用物質の製造方法を提供するものである。
また本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの充填厚みが１０〜２００ｍｍである固定化酵素を充填した充填部を、充填厚み以下の厚みを有する空積部を間に挟んで、少なくとも２段以上積層した多段式固定床型反応塔を用いる有用物質の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、固定化酵素を充填した固定床型反応塔へ２液相を形成する液体混合物を供給して行う有用物質の製造方法において、塔内の反応液全体の流れを均一化することができ、その結果、反応性と生産性を向上する事ができる。特に、油脂類の加水分解においては、酵素活性を有効に発現させ、脂肪酸類を効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においては、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物（反応液）を供給する。固定床型反応塔（以下「酵素塔」ともいう）とは、固定化酵素をカラム等に充填し、固定化担体間の空隙及び固定化担体の細孔に反応液を流通させ得るようにしたものをいう。固定床型反応塔は、固定化酵素を充填した充填部を１段有する一つの固定床型反応器から構成されていてもよく、該充填部を空積部を間に挟んで２段以上積層した多段式固定床型反応塔でもよい。
２液相とは、２種類の液体が混合後にも１相にならない状態をいい、分相しているものから、均一であっても乳化状態となっているものも含む。
【００１１】
本発明の態様としては、固定化酵素として油脂分解酵素を固定化担体に吸着させたものを用い、これを充填した酵素塔に、２液相として油相基質と水相基質を流通させることによる油脂類の加水分解反応により、有用物質として脂肪酸類を製造する方法であることが好ましい。
【００１２】
本発明においては、２液相を同一方向に並流させる。この場合、２液相を予め混合して乳化状態として供給しても良く、分相したまま供給しても良い。また、２液相を一定時間毎に交互に供給しても良い。酵素塔への各基質の供給は、塔頂から塔底へ下方流で行っても、塔底から塔頂へ上方流で行っても良い。
【００１３】
本発明で用いる固定化酵素は、固定化担体に酵素を吸着等により担持させたものである。固定化担体としては、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、特に保水力が高い点からイオン交換樹脂が好ましい。また、イオン交換樹脂の中でも、大きな表面積を有することにより酵素の吸着量を高くできるという点から、多孔質であることが好ましい。
【００１４】
固定化担体として用いる樹脂の粒子径は１００〜１０００μｍが好ましく、更に２５０〜７５０μｍが好ましい。細孔径は１０〜１５０ｎｍが好ましく、更に１０〜１００ｎｍが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ社製Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８）が酵素吸着性向上の点から好ましい。
【００１５】
本発明の固定化酵素に使用する酵素は特に限定はされないが、生産性の向上効果が大きい点から、油脂類分解用酵素としてのリパーゼが好ましい。リパーゼは、動物由来、植物由来のものはもとより、微生物由来の市販リパーゼを使用することもできる。微生物由来リパーゼとしては、リゾプス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の起源のものが挙げられる。
【００１６】
酵素の固定化を行う温度は、酵素の特性によって決定することができるが、酵素の失活が起きない０〜６０℃、特に５〜４０℃が好ましい。また固定化時に使用する酵素溶液のｐＨは、酵素の変性が起きない範囲であればよく、温度同様酵素の特性によって決定することができるが、ｐＨ３〜９が好ましい。このｐＨを維持するためには緩衝液を使用するが、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。上記酵素溶液中の酵素濃度は、固定化効率の点から酵素の飽和溶解度以下で、かつ十分な濃度であることが好ましい。また酵素溶液は、必要に応じて不溶部を遠心分離で除去した上澄や、限外濾過等によって精製したものを使用することもできる。また用いる酵素質量はその酵素活性によっても異なるが、担体質量に対して５〜１０００質量％、特に１０〜５００質量％が好ましい。
【００１７】
酵素を固定化する場合、担体と酵素を直接吸着してもよいが、高活性を発現するような吸着状態にするため、酵素吸着前に予め担体を脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理することが好ましい。脂溶性脂肪酸又はその誘導体と担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらを直接加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体の使用質量は、担体質量に対して１〜５００質量％、特に１０〜２００質量％が好ましい。接触温度は０〜１００℃、特に２０〜６０℃が好ましく、接触時間は５分〜５時間程度が好ましい。この処理を終えた担体は、ろ過して回収するが、乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜１００℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。
【００１８】
予め担体を処理する脂溶性脂肪酸又はその誘導体のうち、脂溶性脂肪酸としては、炭素数４〜２４、好ましくは炭素数８〜１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基を有していてもよい脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、リシノール酸、イソステアリン酸等が挙げられる。また前記脂溶性脂肪酸の誘導体としては、これらの脂溶性脂肪酸と一価若しくは多価アルコール又は糖類とのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加したもの等が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセライド、ジグリセライド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これら脂溶性脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であることが酵素を担体に固定化する工程上好ましい。これら脂溶性脂肪酸又はその誘導体としては、上記２種以上を併用してもよく、菜種脂肪酸、大豆脂肪酸等の天然由来の脂肪酸を用いることもできる。
【００１９】
固定化酵素の加水分解活性は２０Ｕ／ｇ以上、更に１００〜１００００Ｕ／ｇ、特に５００〜５０００Ｕ／ｇの範囲であることが好ましい。ここで酵素の１Ｕは、４０℃において、油脂類：水＝１００：２５（質量比）の混合液を攪拌混合しながら３０分間加水分解をさせたとき、１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素の分解能を示す。油脂類の単位質量当りに付与した固定化酵素の加水分解活性（Ｕ／ｇ−ｏｉｌ）と、ある加水分解率に到達するまでの所要時間は、略反比例の関係にある。
【００２０】
固定化酵素を充填した充填層（酵素塔）を用いて加水分解を行う場合、送液条件（通液速度、温度等）により分解速度は異なるが、酵素充填層出口における油脂の加水分解率、加水分解所要時間（充填層内の滞留時間）、充填層内に存在する油脂類の質量（ｇ−ｏｉｌ）及び固定化酵素の充填質量（ｇ）から固定化酵素の見かけ活性（発現活性）（Ｕ／ｇ）が求められる。なお、充填層内に存在する油脂類の質量を求めるためには、固定化酵素充填部の容積に充填部の空隙率、反応液中の油脂類の容量比及び油脂類の比重を乗ずることにより求める。
【００２１】
本発明に使用する２液相を形成する液体混合物のうちの１つは油相基質であることが好ましい。油相基質とは主に植物油、動物油又はこれらを組み合わせた油脂類をいうが、油脂類とはトリアシルグリセロールの他、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、又は脂肪酸類を含んでいても良く、加水分解の結果得られる脂肪酸を含んでいても良い。油相基質の具体例としては、菜種油、大豆油、ヒマワリ油、パーム油及びアマニ油等の植物油、牛脂、豚脂及び魚油等の動物油等、又はこれらの組み合わせの油脂類が挙げられる。これら油脂類は、脱臭油の他、予め脱臭されていない未脱臭油脂を用いることができるが、これら油脂類の一部又は全部に未脱臭油脂を使用することが、トランス不飽和脂肪酸、共役不飽和脂肪酸を低減し、原料油脂由来の植物ステロール、植物ステロール脂肪酸エステル、トコフェロールを残存させることができる点から好ましい。油相基質中には、前記油脂類の他に脂肪酸等の油溶性成分が混合されていても良い。脂肪酸類とは、加水分解の結果得られる脂肪酸の他、上記グリセリドの１種以上を含むものも指す。
【００２２】
本発明に使用する２液相を形成する液体混合物のうちの他の１つは水相基質であることが好ましい。水相基質は水であるが、加水分解の結果得られるグリセリン等、その他の水溶性成分が混合されていても良い。
【００２３】
本発明において使用する酵素塔の形状は使用するポンプの押し込み圧に耐えられるものであれば良い。また、酵素塔の周囲にジャケットを設け、酵素塔内に流通する反応液を酵素反応に適した温度に調整できるものであることが好ましい。
【００２４】
本発明においては、円相当径が３５ｍｍφ以上である酵素塔を用いて反応を行う。酵素塔の円相当径が３５ｍｍφより大きくなるに従って、反応液の流れが不均一となり、反応性が低下するという傾向となる。酵素塔の円相当径は、反応性、生産性の点から３５〜１０，０００ｍｍφ、特に３５〜７，５００ｍｍφ、更に３５〜５，０００ｍｍφとするのが好ましい。
なお、円相当径とは、酵素塔が円形の場合はその直径を云い、多角形の場合はその投影面積と同じ面積を持つ円の直径を云い、投影面積をＡとして次式（１）により求められる。
Ｄ＝２（Ａ／π）1/2 （１）
（Ｄ：円相当径（ｍｍ）、Ａ：多角形の投影面積（ｍｍ2））
【００２５】
酵素塔内の温度は、固定化酵素の活性をより有効に引き出すために、０〜６０℃、更に２０〜４０℃とすることが好ましい。酵素塔の長さは、所望の分解率を得るのに必要な長さとすれば良いが、反応性、塔内圧力損失等の点から０．０１〜１０ｍ、好ましくは０．１〜５ｍの範囲とすることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、固定床型反応塔に、固定化酵素を一段当たり１０〜２００ｍｍとなるように充填する。このように、固定化酵素の充填厚みを規定することにより、反応液の流れが不均一になるのを防止でき、反応液の流れが整流化されるため、酵素活性を有効に発現させ、加水分解を効率的に行うことができる。固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みは、反応性の点から１０〜２００ｍｍであるが、更に１５〜２００ｍｍ、特に７５〜２００ｍｍとするのが好ましい。
【００２７】
また、多段式固定床型反応塔を用いる場合、固定化酵素を充填した充填部の間に設けられる空積部は、反応性、生産等の点から固定化酵素の充填厚み以下の厚みを有することが好ましく、１〜２００ｍｍ、特に５〜２００ｍｍ、更に１５〜２００ｍｍであることが好ましい。この多段式固定床型反応塔を用いることにより、逐次混合しなくてもより高い反応性を維持できる。
充填部は、反応性、生産等の点から空積部を間に挟んで２〜３０段積層することが好ましく、特に３〜２０段積層することが好ましい。
【００２８】
酵素塔へ反応液を供給する方法としては、それぞれ別々に酵素塔へ直結する配管にて行ってもよく、又は共有の配管にて供給を行っても良いが、操作性の点から、別々に酵素塔へ直結する配管にて行うことが好ましい。
酵素塔内における反応液の通液線速度は、好ましくは１〜４００ｍｍ／分、更に５〜２００ｍｍ／分であるのが好ましい。この通液線速度（ｍｍ／分）は、１分間当りの送液量（ｍｍ3／分）（又は送液速度（１０-3ｍＬ／分）ともいう）を充填層断面積（ｍｍ2）で除した商で表わされる値をいう。通液線速度を上げることによる充填塔内圧力の増大に伴ない、通液が困難となり、耐圧性の高い酵素充填塔が必要となる他に、固定化酵素が塔内圧力増加により破砕される場合が生じることもあるため、通液線速度は４００ｍｍ／分以下とすることが好ましい。また、生産性の点から通液線速度は１ｍｍ／分以上とすることが好ましい。固定化酵素の発現活性は、通液線速度により変化するため、最適な通液線速度を選定して反応条件を決定することで、所望の生産能力、製造コストに見合った反応を行うことができる。
【００２９】
酵素塔内の固定化酵素充填部における反応液の滞留時間は、加水分解反応の平衡状態を回避し、固定化酵素の活性をより有効に引き出し、生産性を向上させる点から３０秒〜６０分、更に１分〜４０分とすることが好ましい。滞留時間（分）とは、充填層の厚み（ｍｍ）に空隙率を乗じ、これを通液線速度（ｍｍ／分）で除した値で表わされる。
【００３０】
本発明においては、反応性、生産性等の兼ね合いから、酵素塔を通過した反応液をそのまま反応終了物としても良く、また、反応液を一旦油水分離し、油相を分取した後に新しい水を加えて上記と同様の方法で再度同一の酵素塔へ供給し、所望の反応率が得られるまで繰り返し通過させても良い。また、反応液を一旦油水分離し、油相を分取した後に新しい水を加えて上記と同様の方法で再度、別の酵素塔へ供給して連続反応を行っても良い。また、複数の酵素塔を用いて反応液の油水分離を行いながら、油相を次の酵素塔へ、水相を前の酵素塔へ供給する事により、より分解率の高い油相を新鮮な水相と反応させる擬似向流法で行っても良い。反応液の油水分離法としては、自然沈降型、遠心分離型等の油水分離器が一般に使用されるが、特に限定されない。
【実施例】
【００３１】
［固定化リパーゼの調整］
ＤｕｏｌｉｔｅＡ−５６８（Rohm and Hass社製、粒径分布１００〜１０００μｍ）１質量部をＮ／１０のＮａＯＨ溶液１０質量部中で１時間攪拌した。ろ過した後１０質量部のイオン交換水で洗浄し５００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０質量部でｐＨの平衡化を行った。その後５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０質量部で２時間づつ２回ｐＨの平衡化を行った。この後ろ過を行い担体を回収した後、エタノール５質量部でエタノール置換を３０分行った。ろ過した後、リシノール酸を１質量部含むエタノール５質量部を加え３０分間、リシノール酸を担体に吸着させた。ろ過によって担体を回収した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）５質量部で３０分づつ４回洗浄し、エタノールを除去し、ろ過して担体を回収した。その後市販のリパーゼ（リパーゼＡＹ、アマノ天野製薬（株））１質量部を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）９質量部に溶解した酵素液と５時間接触させ、固定化を行った。ろ過し、固定化酵素を回収して５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０質量部で洗浄を行うことにより、固定化していない酵素やタンパクを除去した。その後実際に分解を行う菜種油を４質量部加え１２時間攪拌した。以上の操作はいずれも２０℃で行った。その後ろ過して油脂と分離し、固定化酵素とした。その結果、２７００Ｕ／ｇ（乾燥質量）の加水分解活性（発現すべき活性）を示す固定化リパーゼが得られた。固定化酵素の質量基準の平均粒子径は３１１μｍであった。
【００３２】
＜参考例１＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径１０ｍｍ、高さ１４００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼ２７．０ｇ（乾燥質量）を充填し（充填高さ１２００ｍｍ）、ジャケットにて３５℃に保温した。カラム上部より菜種油と蒸留水を質量比１０：６で混合した液を１．５７mL/分で送液し、加水分解反応を行った。その結果を表１に示す。
【００３３】
＜参考例２＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径１０ｍｍ、高さ１９５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで４．８３ｇ充填した充填部（充填高さ２００ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで６段積層した以外は、参考例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表１に示す。
【００３４】
表１に示すとおり、酵素塔の径が１０ｍｍφ程度の場合は、固定化酵素の充填高さがどの程度であろうとも、固定化酵素の（見掛け）活性が有効に発現することが明らかとなった。
【００３５】
＜実施例１＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼ０．１６ｋｇ（乾燥質量）を充填し（充填高さ１５０ｍｍ）、ジャケットにて３５℃に保温した。カラム上部より菜種油と蒸留水を質量比１０：６で混合した液を７７mL/分で送液し、加水分解反応を行った。結果を表１に示す。なお、表中の分解率は、分析により求めた酸価をケン化価で除することにより算出した。酸価は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃａ ５ａ−４０に記載の方法により、またケン化価はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｄ ３ａ−９４に記載の方法により測定した。
【００３６】
＜実施例２＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．１７８２５ｋｇ充填した（充填高さ１５０ｍｍ）以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。次いで、カラムから通過した反応液を一旦油水分離して油相を分取した後、新しい水を加えて混合し再度同一形状の別のカラムへ供給し、同様の手順で計４回加水分解反応を行った。結果を表１に示す。
【００３７】
＜実施例３＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７６．４ｍｍ、高さ２５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．２１ｋｇ充填し（充填高さ１７０ｍｍ）、送液速度を９２mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。次いで、カラムから通過した反応液を一旦油水分離して油相を分取した後、新しい水を加えて混合し再度同一形状の別のカラムへ供給し、同様の手順で計８回加水分解反応を行った。結果を表１に示す。
【００３８】
＜実施例４＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１０５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．１７８ｋｇ充填した充填部（充填高さ１５０ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで４段積層した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表１に示す。
【００３９】
＜実施例５＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径６００ｍｍ、高さ１５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１３．３７ｋｇ充填し（充填高さ１５０ｍｍ）、送液速度を５６５５mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表２に示す。
【００４０】
＜実施例６＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径６００ｍｍ、高さ１０５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１３．３７ｋｇ充填した充填部（充填高さ１５０ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで４段積層し、送液速度を５６５５mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。結果を表２に示す。
【００４１】
＜実施例７＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径６００ｍｍ、高さ２２５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１３．３７ｋｇ充填した充填層（充填高さ１５０ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで８段積層し、送液速度を５６５５mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。結果を表２に示す。
【００４２】
＜実施例８＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１１２５ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．０８５ｋｇ充填した充填部（充填高さ７５ｍｍ）を、空積部（高さ７５ｍｍ）を間に挟んで８段積層した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表２に示す。
【００４３】
＜実施例９＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ６４５ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．１７２５ｋｇ充填した充填部（充填高さ１５０ｍｍ）を、空積部（高さ１５ｍｍ）を間に挟んで４段積層した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表２に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
＜比較例１＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ３００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．３６ｋｇ充填（充填高さ３００ｍｍ）した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表３に示す。
【００４７】
＜比較例２＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ３００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．３５ｋｇ充填（充填高さ３００ｍｍ）した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。次いで、カラムから通過した反応液を一旦油水分離して油相を分取した後、新しい水を加えて混合し再度同一形状の別のカラムへ供給し、同様の手順で計２回加水分解反応を行った。結果を表３に示す。
【００４８】
＜比較例３＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１６５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．３５ｋｇ充填した充填部（充填高さ３００ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで４段積層した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表３に示す。
【００４９】
＜比較例４＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１３００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１．２ｋｇ充填（充填高さ１１７７ｍｍ）した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表３に示す。
【００５０】
＜比較例５＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径６００ｍｍ、高さ１５００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１０３．０ｋｇ充填し（充填高さ１３００ｍｍ）、送液速度を５６５５mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
表１〜表３に示した結果から、固定床型反応塔の一段あたりの固定化酵素の充填厚みを規定することにより、固定化酵素の（見掛け）活性が有効に発現することが明らかとなった。また、反応塔として充填部と空積部を交互に有する多段式固定床型反応塔を用いることにより、固定化酵素の（見掛け）活性をより有効に発現させることができ、油脂類の加水分解率が向上することが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔を用いた反応による有用物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体を固定床型反応塔に通液して行う反応として、Ｌ−アスパラギン酸生成、エステル交換油脂生成、乳糖加水分解、油脂類の加水分解等に利用されている固定化酵素を用いた反応が知られている。これらの反応は、いずれも発熱量が比較的小さい為、通常、最も単純なドラム型反応器が使用されている。
【０００３】
固定化酵素を用いた反応のうち、油脂類の加水分解のように２種類以上の液を反応塔に流通させる場合には、反応効率向上の観点から、反応液を均一に混合した状態で通液することが好ましい。この場合、加水分解に用いる油相基質と水相基質は、本来混合しても一相にならないものであるため、エマルションとするのが一般的である。一方で、エマルション粒子は担体の細孔内に吸着した酵素に到達し難いため、通液速度を、反応液が乳化しない範囲とした技術もある（特許文献１参照）。
【０００４】
また、固定床に油相基質と水相基質を流通させる方法としては、向流で流通させる方法（特許文献１、２参照）、及び並流で流通させる方法（特許文献３参照）があるが、前者は特殊な仕組みと運転方法が必要となるため、一般的には並流で流通させる方法が採られている。
【特許文献１】特開昭６１−８５１９５号公報
【特許文献２】特開平１−９８４９４号公報
【特許文献３】特開２０００−１６０１８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記固定化酵素を充填した固定床型反応塔に、２液相を形成する液体混合物を流通させて反応を行う方法においては、反応塔の径が大きくなるに従って、塔内における反応液の流れが不均一となり、効率的に反応が進まない部分が生じ、結果として反応性が低下するという問題があることを見出した。この場合、反応性を高めるために、単に固定化酵素と反応液の接触時間を長くしようとすると、生産性（流量）が低下するという問題もある。
【０００６】
従って、本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に、２液相を形成する液体混合物を流通させて反応を行う有用物質の製造方法において、流量を低下させずに反応性を高め、生産性を向上させることにより、より効率的に有用物質を製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔における反応液の流通の特徴を解析した結果、固定床型反応塔の径が大きくなると、油相と水相の流動様相の違いにより、一定の充填厚みを超えたところから塔内での反応液の不均一化が生じ、反応性が低下することを見出した。そこで、固定床型反応塔の一段あたりの固定化酵素の充填厚みを規定し、液液二相流を整流することにより、高い反応性を維持したまま、生産性を向上させることができることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みが１０〜２００ｍｍである有用物質の製造方法を提供するものである。
また本発明は、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの充填厚みが１０〜２００ｍｍである固定化酵素を充填した充填部を、充填厚み以下の厚みを有する空積部を間に挟んで、少なくとも２段以上積層した多段式固定床型反応塔を用いる有用物質の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、固定化酵素を充填した固定床型反応塔へ２液相を形成する液体混合物を供給して行う有用物質の製造方法において、塔内の反応液全体の流れを均一化することができ、その結果、反応性と生産性を向上する事ができる。特に、油脂類の加水分解においては、酵素活性を有効に発現させ、脂肪酸類を効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においては、固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物（反応液）を供給する。固定床型反応塔（以下「酵素塔」ともいう）とは、固定化酵素をカラム等に充填し、固定化担体間の空隙及び固定化担体の細孔に反応液を流通させ得るようにしたものをいう。固定床型反応塔は、固定化酵素を充填した充填部を１段有する一つの固定床型反応器から構成されていてもよく、該充填部を空積部を間に挟んで２段以上積層した多段式固定床型反応塔でもよい。
２液相とは、２種類の液体が混合後にも１相にならない状態をいい、分相しているものから、均一であっても乳化状態となっているものも含む。
【００１１】
本発明の態様としては、固定化酵素として油脂分解酵素を固定化担体に吸着させたものを用い、これを充填した酵素塔に、２液相として油相基質と水相基質を流通させることによる油脂類の加水分解反応により、有用物質として脂肪酸類を製造する方法であることが好ましい。
【００１２】
本発明においては、２液相を同一方向に並流させる。この場合、２液相を予め混合して乳化状態として供給しても良く、分相したまま供給しても良い。また、２液相を一定時間毎に交互に供給しても良い。酵素塔への各基質の供給は、塔頂から塔底へ下方流で行っても、塔底から塔頂へ上方流で行っても良い。
【００１３】
本発明で用いる固定化酵素は、固定化担体に酵素を吸着等により担持させたものである。固定化担体としては、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、特に保水力が高い点からイオン交換樹脂が好ましい。また、イオン交換樹脂の中でも、大きな表面積を有することにより酵素の吸着量を高くできるという点から、多孔質であることが好ましい。
【００１４】
固定化担体として用いる樹脂の粒子径は１００〜１０００μｍが好ましく、更に２５０〜７５０μｍが好ましい。細孔径は１０〜１５０ｎｍが好ましく、更に１０〜１００ｎｍが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ社製Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ−５６８）が酵素吸着性向上の点から好ましい。
【００１５】
本発明の固定化酵素に使用する酵素は特に限定はされないが、生産性の向上効果が大きい点から、油脂類分解用酵素としてのリパーゼが好ましい。リパーゼは、動物由来、植物由来のものはもとより、微生物由来の市販リパーゼを使用することもできる。微生物由来リパーゼとしては、リゾプス（Ｒｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の起源のものが挙げられる。
【００１６】
酵素の固定化を行う温度は、酵素の特性によって決定することができるが、酵素の失活が起きない０〜６０℃、特に５〜４０℃が好ましい。また固定化時に使用する酵素溶液のｐＨは、酵素の変性が起きない範囲であればよく、温度同様酵素の特性によって決定することができるが、ｐＨ３〜９が好ましい。このｐＨを維持するためには緩衝液を使用するが、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。上記酵素溶液中の酵素濃度は、固定化効率の点から酵素の飽和溶解度以下で、かつ十分な濃度であることが好ましい。また酵素溶液は、必要に応じて不溶部を遠心分離で除去した上澄や、限外濾過等によって精製したものを使用することもできる。また用いる酵素質量はその酵素活性によっても異なるが、担体質量に対して５〜１０００質量％、特に１０〜５００質量％が好ましい。
【００１７】
酵素を固定化する場合、担体と酵素を直接吸着してもよいが、高活性を発現するような吸着状態にするため、酵素吸着前に予め担体を脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理することが好ましい。脂溶性脂肪酸又はその誘導体と担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらを直接加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体の使用質量は、担体質量に対して１〜５００質量％、特に１０〜２００質量％が好ましい。接触温度は０〜１００℃、特に２０〜６０℃が好ましく、接触時間は５分〜５時間程度が好ましい。この処理を終えた担体は、ろ過して回収するが、乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜１００℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。
【００１８】
予め担体を処理する脂溶性脂肪酸又はその誘導体のうち、脂溶性脂肪酸としては、炭素数４〜２４、好ましくは炭素数８〜１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基を有していてもよい脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、リシノール酸、イソステアリン酸等が挙げられる。また前記脂溶性脂肪酸の誘導体としては、これらの脂溶性脂肪酸と一価若しくは多価アルコール又は糖類とのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加したもの等が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセライド、ジグリセライド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これら脂溶性脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であることが酵素を担体に固定化する工程上好ましい。これら脂溶性脂肪酸又はその誘導体としては、上記２種以上を併用してもよく、菜種脂肪酸、大豆脂肪酸等の天然由来の脂肪酸を用いることもできる。
【００１９】
固定化酵素の加水分解活性は２０Ｕ／ｇ以上、更に１００〜１００００Ｕ／ｇ、特に５００〜５０００Ｕ／ｇの範囲であることが好ましい。ここで酵素の１Ｕは、４０℃において、油脂類：水＝１００：２５（質量比）の混合液を攪拌混合しながら３０分間加水分解をさせたとき、１分間に１μｍｏｌの遊離脂肪酸を生成する酵素の分解能を示す。油脂類の単位質量当りに付与した固定化酵素の加水分解活性（Ｕ／ｇ−ｏｉｌ）と、ある加水分解率に到達するまでの所要時間は、略反比例の関係にある。
【００２０】
固定化酵素を充填した充填層（酵素塔）を用いて加水分解を行う場合、送液条件（通液速度、温度等）により分解速度は異なるが、酵素充填層出口における油脂の加水分解率、加水分解所要時間（充填層内の滞留時間）、充填層内に存在する油脂類の質量（ｇ−ｏｉｌ）及び固定化酵素の充填質量（ｇ）から固定化酵素の見かけ活性（発現活性）（Ｕ／ｇ）が求められる。なお、充填層内に存在する油脂類の質量を求めるためには、固定化酵素充填部の容積に充填部の空隙率、反応液中の油脂類の容量比及び油脂類の比重を乗ずることにより求める。
【００２１】
本発明に使用する２液相を形成する液体混合物のうちの１つは油相基質であることが好ましい。油相基質とは主に植物油、動物油又はこれらを組み合わせた油脂類をいうが、油脂類とはトリアシルグリセロールの他、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、又は脂肪酸類を含んでいても良く、加水分解の結果得られる脂肪酸を含んでいても良い。油相基質の具体例としては、菜種油、大豆油、ヒマワリ油、パーム油及びアマニ油等の植物油、牛脂、豚脂及び魚油等の動物油等、又はこれらの組み合わせの油脂類が挙げられる。これら油脂類は、脱臭油の他、予め脱臭されていない未脱臭油脂を用いることができるが、これら油脂類の一部又は全部に未脱臭油脂を使用することが、トランス不飽和脂肪酸、共役不飽和脂肪酸を低減し、原料油脂由来の植物ステロール、植物ステロール脂肪酸エステル、トコフェロールを残存させることができる点から好ましい。油相基質中には、前記油脂類の他に脂肪酸等の油溶性成分が混合されていても良い。脂肪酸類とは、加水分解の結果得られる脂肪酸の他、上記グリセリドの１種以上を含むものも指す。
【００２２】
本発明に使用する２液相を形成する液体混合物のうちの他の１つは水相基質であることが好ましい。水相基質は水であるが、加水分解の結果得られるグリセリン等、その他の水溶性成分が混合されていても良い。
【００２３】
本発明において使用する酵素塔の形状は使用するポンプの押し込み圧に耐えられるものであれば良い。また、酵素塔の周囲にジャケットを設け、酵素塔内に流通する反応液を酵素反応に適した温度に調整できるものであることが好ましい。
【００２４】
本発明においては、円相当径が３５ｍｍφ以上である酵素塔を用いて反応を行う。酵素塔の円相当径が３５ｍｍφより大きくなるに従って、反応液の流れが不均一となり、反応性が低下するという傾向となる。酵素塔の円相当径は、反応性、生産性の点から３５〜１０，０００ｍｍφ、特に３５〜７，５００ｍｍφ、更に３５〜５，０００ｍｍφとするのが好ましい。
なお、円相当径とは、酵素塔が円形の場合はその直径を云い、多角形の場合はその投影面積と同じ面積を持つ円の直径を云い、投影面積をＡとして次式（１）により求められる。
Ｄ＝２（Ａ／π）1/2 （１）
（Ｄ：円相当径（ｍｍ）、Ａ：多角形の投影面積（ｍｍ2））
【００２５】
酵素塔内の温度は、固定化酵素の活性をより有効に引き出すために、０〜６０℃、更に２０〜４０℃とすることが好ましい。酵素塔の長さは、所望の分解率を得るのに必要な長さとすれば良いが、反応性、塔内圧力損失等の点から０．０１〜１０ｍ、好ましくは０．１〜５ｍの範囲とすることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、固定床型反応塔に、固定化酵素を一段当たり１０〜２００ｍｍとなるように充填する。このように、固定化酵素の充填厚みを規定することにより、反応液の流れが不均一になるのを防止でき、反応液の流れが整流化されるため、酵素活性を有効に発現させ、加水分解を効率的に行うことができる。固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みは、反応性の点から１０〜２００ｍｍであるが、更に１５〜２００ｍｍ、特に７５〜２００ｍｍとするのが好ましい。
【００２７】
また、多段式固定床型反応塔を用いる場合、固定化酵素を充填した充填部の間に設けられる空積部は、反応性、生産等の点から固定化酵素の充填厚み以下の厚みを有することが好ましく、１〜２００ｍｍ、特に５〜２００ｍｍ、更に１５〜２００ｍｍであることが好ましい。この多段式固定床型反応塔を用いることにより、逐次混合しなくてもより高い反応性を維持できる。
充填部は、反応性、生産等の点から空積部を間に挟んで２〜３０段積層することが好ましく、特に３〜２０段積層することが好ましい。
【００２８】
酵素塔へ反応液を供給する方法としては、それぞれ別々に酵素塔へ直結する配管にて行ってもよく、又は共有の配管にて供給を行っても良いが、操作性の点から、別々に酵素塔へ直結する配管にて行うことが好ましい。
酵素塔内における反応液の通液線速度は、好ましくは１〜４００ｍｍ／分、更に５〜２００ｍｍ／分であるのが好ましい。この通液線速度（ｍｍ／分）は、１分間当りの送液量（ｍｍ3／分）（又は送液速度（１０-3ｍＬ／分）ともいう）を充填層断面積（ｍｍ2）で除した商で表わされる値をいう。通液線速度を上げることによる充填塔内圧力の増大に伴ない、通液が困難となり、耐圧性の高い酵素充填塔が必要となる他に、固定化酵素が塔内圧力増加により破砕される場合が生じることもあるため、通液線速度は４００ｍｍ／分以下とすることが好ましい。また、生産性の点から通液線速度は１ｍｍ／分以上とすることが好ましい。固定化酵素の発現活性は、通液線速度により変化するため、最適な通液線速度を選定して反応条件を決定することで、所望の生産能力、製造コストに見合った反応を行うことができる。
【００２９】
酵素塔内の固定化酵素充填部における反応液の滞留時間は、加水分解反応の平衡状態を回避し、固定化酵素の活性をより有効に引き出し、生産性を向上させる点から３０秒〜６０分、更に１分〜４０分とすることが好ましい。滞留時間（分）とは、充填層の厚み（ｍｍ）に空隙率を乗じ、これを通液線速度（ｍｍ／分）で除した値で表わされる。
【００３０】
本発明においては、反応性、生産性等の兼ね合いから、酵素塔を通過した反応液をそのまま反応終了物としても良く、また、反応液を一旦油水分離し、油相を分取した後に新しい水を加えて上記と同様の方法で再度同一の酵素塔へ供給し、所望の反応率が得られるまで繰り返し通過させても良い。また、反応液を一旦油水分離し、油相を分取した後に新しい水を加えて上記と同様の方法で再度、別の酵素塔へ供給して連続反応を行っても良い。また、複数の酵素塔を用いて反応液の油水分離を行いながら、油相を次の酵素塔へ、水相を前の酵素塔へ供給する事により、より分解率の高い油相を新鮮な水相と反応させる擬似向流法で行っても良い。反応液の油水分離法としては、自然沈降型、遠心分離型等の油水分離器が一般に使用されるが、特に限定されない。
【実施例】
【００３１】
［固定化リパーゼの調整］
ＤｕｏｌｉｔｅＡ−５６８（Rohm and Hass社製、粒径分布１００〜１０００μｍ）１質量部をＮ／１０のＮａＯＨ溶液１０質量部中で１時間攪拌した。ろ過した後１０質量部のイオン交換水で洗浄し５００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０質量部でｐＨの平衡化を行った。その後５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０質量部で２時間づつ２回ｐＨの平衡化を行った。この後ろ過を行い担体を回収した後、エタノール５質量部でエタノール置換を３０分行った。ろ過した後、リシノール酸を１質量部含むエタノール５質量部を加え３０分間、リシノール酸を担体に吸着させた。ろ過によって担体を回収した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）５質量部で３０分づつ４回洗浄し、エタノールを除去し、ろ過して担体を回収した。その後市販のリパーゼ（リパーゼＡＹ、アマノ天野製薬（株））１質量部を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）９質量部に溶解した酵素液と５時間接触させ、固定化を行った。ろ過し、固定化酵素を回収して５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０質量部で洗浄を行うことにより、固定化していない酵素やタンパクを除去した。その後実際に分解を行う菜種油を４質量部加え１２時間攪拌した。以上の操作はいずれも２０℃で行った。その後ろ過して油脂と分離し、固定化酵素とした。その結果、２７００Ｕ／ｇ（乾燥質量）の加水分解活性（発現すべき活性）を示す固定化リパーゼが得られた。固定化酵素の質量基準の平均粒子径は３１１μｍであった。
【００３２】
＜参考例１＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径１０ｍｍ、高さ１４００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼ２７．０ｇ（乾燥質量）を充填し（充填高さ１２００ｍｍ）、ジャケットにて３５℃に保温した。カラム上部より菜種油と蒸留水を質量比１０：６で混合した液を１．５７mL/分で送液し、加水分解反応を行った。その結果を表１に示す。
【００３３】
＜参考例２＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径１０ｍｍ、高さ１９５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで４．８３ｇ充填した充填部（充填高さ２００ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで６段積層した以外は、参考例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表１に示す。
【００３４】
表１に示すとおり、酵素塔の径が１０ｍｍφ程度の場合は、固定化酵素の充填高さがどの程度であろうとも、固定化酵素の（見掛け）活性が有効に発現することが明らかとなった。
【００３５】
＜実施例１＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼ０．１６ｋｇ（乾燥質量）を充填し（充填高さ１５０ｍｍ）、ジャケットにて３５℃に保温した。カラム上部より菜種油と蒸留水を質量比１０：６で混合した液を７７mL/分で送液し、加水分解反応を行った。結果を表１に示す。なお、表中の分解率は、分析により求めた酸価をケン化価で除することにより算出した。酸価は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃａ ５ａ−４０に記載の方法により、またケン化価はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｄ ３ａ−９４に記載の方法により測定した。
【００３６】
＜実施例２＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．１７８２５ｋｇ充填した（充填高さ１５０ｍｍ）以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。次いで、カラムから通過した反応液を一旦油水分離して油相を分取した後、新しい水を加えて混合し再度同一形状の別のカラムへ供給し、同様の手順で計４回加水分解反応を行った。結果を表１に示す。
【００３７】
＜実施例３＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７６．４ｍｍ、高さ２５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．２１ｋｇ充填し（充填高さ１７０ｍｍ）、送液速度を９２mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。次いで、カラムから通過した反応液を一旦油水分離して油相を分取した後、新しい水を加えて混合し再度同一形状の別のカラムへ供給し、同様の手順で計８回加水分解反応を行った。結果を表１に示す。
【００３８】
＜実施例４＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１０５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．１７８ｋｇ充填した充填部（充填高さ１５０ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで４段積層した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表１に示す。
【００３９】
＜実施例５＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径６００ｍｍ、高さ１５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１３．３７ｋｇ充填し（充填高さ１５０ｍｍ）、送液速度を５６５５mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表２に示す。
【００４０】
＜実施例６＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径６００ｍｍ、高さ１０５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１３．３７ｋｇ充填した充填部（充填高さ１５０ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで４段積層し、送液速度を５６５５mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。結果を表２に示す。
【００４１】
＜実施例７＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径６００ｍｍ、高さ２２５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１３．３７ｋｇ充填した充填層（充填高さ１５０ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで８段積層し、送液速度を５６５５mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。結果を表２に示す。
【００４２】
＜実施例８＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１１２５ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．０８５ｋｇ充填した充填部（充填高さ７５ｍｍ）を、空積部（高さ７５ｍｍ）を間に挟んで８段積層した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表２に示す。
【００４３】
＜実施例９＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ６４５ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．１７２５ｋｇ充填した充填部（充填高さ１５０ｍｍ）を、空積部（高さ１５ｍｍ）を間に挟んで４段積層した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表２に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
＜比較例１＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ３００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．３６ｋｇ充填（充填高さ３００ｍｍ）した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表３に示す。
【００４７】
＜比較例２＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ３００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．３５ｋｇ充填（充填高さ３００ｍｍ）した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。次いで、カラムから通過した反応液を一旦油水分離して油相を分取した後、新しい水を加えて混合し再度同一形状の別のカラムへ供給し、同様の手順で計２回加水分解反応を行った。結果を表３に示す。
【００４８】
＜比較例３＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１６５０ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで０．３５ｋｇ充填した充填部（充填高さ３００ｍｍ）を、空積部（高さ１５０ｍｍ）を間に挟んで４段積層した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表３に示す。
【００４９】
＜比較例４＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径７０ｍｍ、高さ１３００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１．２ｋｇ充填（充填高さ１１７７ｍｍ）した以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表３に示す。
【００５０】
＜比較例５＞
ジャケット付きのステンレス製カラム（内径６００ｍｍ、高さ１５００ｍｍ）に、前記固定化リパーゼを乾燥ベースで１０３．０ｋｇ充填し（充填高さ１３００ｍｍ）、送液速度を５６５５mL/分にした以外は、実施例１と同様の手順で加水分解反応を行った。その結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
表１〜表３に示した結果から、固定床型反応塔の一段あたりの固定化酵素の充填厚みを規定することにより、固定化酵素の（見掛け）活性が有効に発現することが明らかとなった。また、反応塔として充填部と空積部を交互に有する多段式固定床型反応塔を用いることにより、固定化酵素の（見掛け）活性をより有効に発現させることができ、油脂類の加水分解率が向上することが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みが１０〜２００ｍｍである有用物質の製造方法。
【請求項２】
固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの充填厚みが１０〜２００ｍｍである固定化酵素を充填した充填部を、充填厚み以下の厚みを有する空積部を間に挟んで、少なくとも２段以上積層した多段式固定床型反応塔を用いる有用物質の製造方法。
【請求項３】
前記液体混合物のうち一種が油相基質である請求項１又は２記載の有用物質の製造方法。
【請求項４】
前記液体混合物のうち一種が水相基質である請求項１〜３のいずれか１項記載の有用物質の製造方法。
【請求項５】
前記反応が固定化リパーゼを用いた油脂類の加水分解反応である請求項１〜４のいずれか１項記載の有用物質の製造方法。
【請求項６】
有用物質が脂肪酸類である請求項１〜５のいずれか１項記載の有用物質の製造方法。
【請求項１】
固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの固定化酵素の充填厚みが１０〜２００ｍｍである有用物質の製造方法。
【請求項２】
固定化酵素を充填した固定床型反応塔に２液相を形成する液体混合物を供給し、同一方向に並流させて反応を行う有用物質の製造方法において、円相当径が３５ｍｍφ以上である固定床型反応塔の一段当たりの充填厚みが１０〜２００ｍｍである固定化酵素を充填した充填部を、充填厚み以下の厚みを有する空積部を間に挟んで、少なくとも２段以上積層した多段式固定床型反応塔を用いる有用物質の製造方法。
【請求項３】
前記液体混合物のうち一種が油相基質である請求項１又は２記載の有用物質の製造方法。
【請求項４】
前記液体混合物のうち一種が水相基質である請求項１〜３のいずれか１項記載の有用物質の製造方法。
【請求項５】
前記反応が固定化リパーゼを用いた油脂類の加水分解反応である請求項１〜４のいずれか１項記載の有用物質の製造方法。
【請求項６】
有用物質が脂肪酸類である請求項１〜５のいずれか１項記載の有用物質の製造方法。
【公開番号】特開２００８−１４８５９６（Ｐ２００８−１４８５９６Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３７８９０（Ｐ２００６−３３７８９０）
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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