均一インビトロＦＥＣアッセイ及び成分
均一インビトロアッセイにおいて被検出物質を検出するために適応させられた、レポーター断片、レポーター成分及び系、これらの系を使用するこのようなアッセイ、及び上記のものを作製し使用する方法を提供する。特定の実施形態には、均一インビトロアッセイでの使用のための、溶解性が向上し、凝集性が低下し、阻害剤に対する耐性を示し、安定性が向上した単離精製レポーター断片が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、分子生物学及び診断の分野に関する。とりわけ、本発明は、均一インビトロアッセイにおいて被分析物質を検出するために特異的に適応させられたレポーター断片系及び成分、これらの成分を使用するこのようなアッセイ、診断システム及び上記のものを作製及び使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
レポーター断片系に基づくアッセイは、タンパク質間相互作用検出アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）（ＰＣＡ）、強制的酵素相補性（ＦＥＣ）アッセイ（Ｆｏｒｃｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）又は相互作用依存タンパク質結合系として知られている。これらのアッセイは、全般的に、例えば、ＷＯ０１／７１７０２；米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；同第６，４２８，９５１号；同第６，３４２，３４５号、同第６，８２８，０９９号及び米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号に記載されている。本明細書中で使用される場合、強制的酵素相補性又はＦＥＣアッセイは総称的にこのようなアッセイを指す。
【０００３】
ＦＥＣの基礎となる基本原理を図１で図示する。これらのアッセイは通常、可視的な表現型の変化又は抗生物質耐性など、直接検出可能なシグナルを有するレポータータンパク質へと機能的に再構築し得る第一及び第二のメンバーからなるタンパク質断片ペアの使用を特徴とする。このアッセイの有効性の重要な態様は、レポータータンパク質の機能的再構成が、レポータータンパク質断片に連結されている断片ペアの各メンバー内に存在する部分の、相互作用、即ち結合又は吸引に依存するということである。本明細書中で使用される場合、これらの相互作用部分を「インタラクター」又は「インタラクタードメイン」と呼ぶ。インタラクタードメインは、断片ペアコンストラクトの各メンバー内に含有される個別の部分又はドメインである。インタラクタードメインは、レポーター断片ドメインへと直接連結され得るか又はリンカードメインにより連結され得る。タンパク質断片ペアメンバーは、通常、ペアの各メンバーにおけるインタラクタードメインがない場合、レポーター断片が自然には機能的に再構成しないように構築されている。このようにして、ペアの各メンバーのインタラクタードメインは、その断片からの機能的レポータータンパク質の再構成に関与する。
【０００４】
機能的なインビボＦＥＣアッセイは、いくつかの異なるレポータータンパク質を用いて構築されている。例えば、ＷＯ０１／７１７０２；米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；同第６，４２８，９５１号；同第６，３４２，３４５号、同第６，８２８，０９９号及び米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号で開示されるものを参照。
【０００５】
クラスＡβ−ラクタマーゼ（特にＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ）は、それらが単量体であり、比較的サイズが小さく、結晶構造が既知であるので、ＦＥＣアッセイの開発において特に関心が持たれてきた（ＷＯ００／７１７０２及びＪｅｌｓｃｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．（１９９３）１６：３６４ｆｆ）。β−ラクタマーゼは、原核又は真核系の何れかで発現され得る。ＦＥＣアッセイの設計及び開発におけるβ−ラクタマーゼの使用の例は、ＷＯ０１／７１７０２；米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；同第６，４２８，９５１号；同第６，３４２，３４５号、同第６，８２８，０９９号、米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号及び同第２００６００９４０１４号及びＯｏｉら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：３６２０−３６２５で見出すことができる。
【０００６】
Ｃａｎｔｏｒら（米国特許出願公開第２００６００９４０１４号）は、インタラクタードメインが核酸である標的核酸配列の検出での使用のためのＦＥＣを示唆する。効率的なＦＥＣアッセイ性能に必要な相互作用は、含まれる核酸の間での核酸相補性複合体の形成の結果によるもの（典型的なワトソン−クリック塩基対配列認識の結果）である。このようにして、Ｃａｎｔｏｒらの方法において、標的被分析物質及び各ＦＥＣ断片のインタラクタードメインは全て核酸である。このように、各断片ペアの各メンバーは、β−ラクタマーゼ由来のタンパク質レポーター断片ペアの混合コンストラクト及びそれらのレポーター断片に連結された核酸インタラクタードメインである。Ｏｏｉら（２００６）は、β−ラクタマーゼレポーター断片ペアを用いた同様の系を記載した。Ｓｔａｉｎｓら（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１０７８２−１０７８３及びＳｔａｉｎｓら（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：９７６１−９７６５は、レポーター断片ペアとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の断片を使用し、インタラクタードメインとして亜鉛フィンガー及びメチル−ＣｐＧ結合タンパク質を使用する、ＦＥＣに基づくアッセイを記載した。これらの系は、再構成されたＧＦＰの蛍光を通じて配列特異的な又はメチル化されたポリヌクレオチド配列を検出するように設計されている。
【０００７】
ＦＥＣの原理に基づく広く適用可能なインビトロ均一アッセイの作成により、必然的にＦＥＣの設計及び遂行に対する新しい問題が生じる。これらの問題は、均一アッセイ形式内で生成される特定のアッセイ環境、検出を目的とする被分析物質の性質及び源及びこのような均一アッセイの作成と関連する製造の問題から生じる。
【０００８】
均一アッセイは通常、使用における、特異性、信頼性、作製の簡便性及び使用におけるロブストな特徴を確実にするために、単離精製成分から構成される。必要な溶解性、安定性及び製造に対する従順性及び最終的な診断用途も生み出す、適切なタンパク質断片ペアの設計（適切なレポーター断片、インタラクタードメイン、連結ドメイン及び融合コンストラクト全体又はそれぞれを組み込むレポーター断片ペアを含む。）ならびにロブストなアッセイ条件は、広く適用可能な均一アッセイプラットフォームを作製するのに不可欠である。インビボＦＥＣアッセイ条件と比較して、インビトロ診断アッセイ条件は、細胞外であり、比較的厳しく、インビボで容易に起こり得る適切なタンパク質折り畳み及びタンパク質−タンパク質相互作用を促進し得ない。
【０００９】
さらなる問題は、均一アッセイプラットフォームにより起こる。均一アッセイプラットフォームの開発の中核は、洗浄段階の排除である。従って、血清又は少なくともある血清成分の存在下で、均一アッセイプラットフォームにおける診断試験を行い得る。このようにして、被分析物質を含有する試料分画を洗浄なしで処理し得る。洗浄がないと、均一プラットフォーム（特にＦＥＣに基づくもの）は、交差反応、妨害及び血清成分又はその他の夾雑物の阻害的影響が起こりやすい状態のままであると思われる。
【００１０】
例えば、β−ラクタマーゼは、β−ラクタム抗生物質（Ｃｈａｉｂｉら、１９９９、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３（４）：４４７−５８）に対する菌耐性を与える。その結果、細菌感染の治療に対して設計された薬物は、患者血清中に存在する場合、アッセイ性能を妨害し得る。実際に、ヒト投与に対して使用されるβ−ラクタム抗生物質製剤（経口及び静脈内）は、使用される抗生物質の効率を上昇させるために、β−ラクタマーゼ（ＴＥＭ−１）の不可逆的阻害剤の使用を含み得る。一般に使用される例となる阻害剤には、ペニシリンの誘導体及びペナム又はセファム誘導体が含まれる。このような阻害剤の例、それらの合成及び使用は、米国特許第６，９３６，７１１号；同第６，９００，１８４号；同第６，３９５，７２６号；同第６，２０７，６６１号；同第５，７６３，６０３号；同第５，６８６，４４１号；同第４，９５８，０２０号；同第４，９３３，４４４号；同第４，８９８，９３９号；同第４，８９５，９４１号；同第４，８９１，３６９号；同第４，６６８，５１４号；同第４，６２６，３８４号；及び同第４，５２９，５９２号（そのそれぞれはそれらの全体において参照により明確に組み込まれる。）に記載されている。抗生物質及び阻害剤の一般的組み合わせは、それらの商標名又は非公式名により知られ得る。例えば：ピペラシリン及びタゾバクタム；アンピシリンナトリウム及びスルバクタムナトリウム；及びアモキシシリン及びクラブラン酸。さらなる組み合わせ及び阻害剤が当技術分野で公知である。
【００１１】
レポーター酵素としてβ−ラクタマーゼを使用する均一アッセイは、これらのβ−ラクタマーゼ阻害剤の影響を受けやすい。例えば、抗生物質投与後に観察されるβ−ラクタマーゼ阻害剤血清Ｃｍａｘレベルは、β−ラクタマーゼを阻害するのに十分高いものであり得る。従って、一般にインビトロアッセイにおいてＦＥＣを実行する問題に加えて、インビトロ均一アッセイプラットフォームにおけるＦＥＣの実行によりさらなる問題が現れる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０１／７１７０２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，２７０，９６４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２９４，３３０号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４２８，９５１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，３４２，３４５号明細書
【特許文献６】米国特許第６，８２８，０９９号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３／０１７５８３６号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００６／００９４０１４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，９３６，７１１号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，９００，１８４号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，３９５，７２６号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，２０７，６６１号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，７６３，６０３号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，６８６，４４１号明細書
【特許文献１５】米国特許第４，９５８，０２０号明細書
【特許文献１６】米国特許第４，９３３，４４４号明細書
【特許文献１７】米国特許第４，８９８，９３９号明細書
【特許文献１８】米国特許第４，８９５，９４１号明細書
【特許文献１９】米国特許第４，８９１，３６９号明細書
【特許文献２０】米国特許第４，６６８，５１４号明細書
【特許文献２１】米国特許第４，６２６，３８４号明細書
【特許文献２２】米国特許第４，５２９，５９２号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊｅｌｓｃｈ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．１６、１９９３年、ｐ．３６４ｆｆ
【非特許文献２】Ｏｏｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５、２００６年、ｐ．３６２０−３６２５
【非特許文献３】Ｓｔａｉｎｓ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７、２００５年、ｐ．１０７８２−１０７８３
【非特許文献４】Ｓｔａｉｎｓ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８、２００６年、ｐ．９７６１−９７６５
【非特許文献５】Ｃｈａｉｂｉ他、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３（４）、１９９９年、ｐ．４４７−５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、高い、溶解性、安定性、感受性及び／又は酵素阻害剤（例えば本アッセイにおいて試験したい試料中に存在し得る阻害剤）に対する耐性など、インビトロ均一ＦＥＣアッセイでの使用に対する所望の特徴を示すＴＥＭ−１β−ラクタマーゼに基づく修飾レポーター断片（α及びω断片）を提供する。本発明のタンパク質断片により示されるこれらの所望の特徴には、レポーター断片の単離及び精製に対する高い従順性及び、操作可能なインビトロ均一アッセイの続く構成のための、レポーター断片ペアが含まれる。本発明は、さらに、具体的に、均一アッセイプラットフォーム形式及び使用でのアッセイの感受性又は特異性を維持又は向上させながら、均一インビトロアッセイ条件下で溶解性が高く凝集性が低いレポータータンパク質断片を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、ある態様において、本発明は、酵素活性の阻害剤の存在下で酵素活性を保持するポリペプチド複合体を生成させるための、少なくとも第二のポリペプチドとの会合において操作可能なポリペプチドを提供する。
【００１６】
好ましい実施形態において、本ポリペプチドは、酵素活性の阻害剤に対するポリペプチド複合体の感受性を低下させる１以上のアミノ酸配列変化を含む。
【００１７】
関連する態様において、本発明は、第一のポリペプチドサブユニットを含む第一のレポーター成分及び第二のポリペプチドサブユニットを含む第二のレポーター成分を含み、第一のサブユニット及び第二のサブユニットが、検出可能なシグナルを生成することができる酵素活性を有する活性のあるポリペプチド複合体を生成させるために会合することができ、該会合が関心のある被分析物質に対する第一及び第二のレポーター成分の結合により媒介され；
第一のポリペプチドサブユニット及び／又は第二のポリペプチドレポーターサブユニットが、阻害剤による該酵素活性の阻害に対する活性ポリペプチド複合体の感受性を低下させる１以上のアミノ酸配列変化を含む、レポーター系を提供する。
【００１８】
具体的な実施形態において、本発明は、インビトロ均一ＦＥＣアッセイでの使用に必要とされる所望の特徴を得られる断片に与える、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼのネイティブアミノ酸配列における、点突然変異、切断点及び欠失に基づく、レポーター断片ペアドメインとしての使用のためのポリペプチドコンストラクトを提供する。これらの所望の特徴には、以下に限定されないが、１以上の血液血清成分存在下で、均一形式においてβ−ラクタマーゼに基づくＦＥＣアッセイを可能にするものが含まれる。特定の実施形態において、これらの血液血清成分には、β−ラクタマーゼの阻害剤が含まれる。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、β−ラクタマーゼ阻害剤の存在下及び均一インビトロＦＥＣアッセイで使用するために断片ペアを適応させるその他の方法において、溶解性を向上させ、凝集性を低下させ、性能を向上させるために、断片ペアコンストラクトに有利に導入され得る具体的な突然変異を提供する。これらの突然変異の効果により、単独で（本発明のものではない操作可能なペアメンバーと組み合わせて使用される場合）又は本発明の操作可能なペアメンバーと組み合わせての何れかで、レポーター、リンカー又はインタラクタードメインにおいて複数の長所が与えられ得る。これらの長所には、β−ラクタマーゼの阻害剤又はこのような条件においてＦＥＣの有効性を損なう血清又はその他の生体試料に存在するその他の因子を含み得るインビトロ又は均一アッセイ条件での操作可能性が含まれる。
【００２０】
具体的な突然変異（アミノ酸配列変化）を同定することにおいて、本明細書中で従った表記法（文脈で必要とされる場合を除く。）は、ネイティブβ−ラクタマーゼアミノ酸配列からの位置情報と組み合わせてアミノ酸に対する１文字コードを使用する。例えば、Ｖ７４Ｔは、ネイティブの位置７４のバリン（付随の配列で又は代替的な配列付番スキームにおける相同位置で示される。）が、チロシンにより置換されることなどを示す。一貫性及び利便性のために、ネイティブ配列の付番は、実質的にわずかなアミノ酸の配列又はレポーター断片を指す場合でも保持される。このようにして、Ｆ２３０Ｙは、置換がより短い、例えば本発明のα又はω断片内で起こり得る場合でも、全長ネイティブ配列付番での位置２３０でのＹによるＦの置換を指す。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明のネイティブβ−ラクタマーゼ配列の突然変異は、付随する配列リストの付番において又は何らかの代替的な配列付番法での相同位置において、位置１９６のグリシンと位置１９７のグルタミン酸との連結部の間の切断点により形成されるα及びω断片と連結して提供される。本明細書中で提供される突然変異との連結において有用な、代替的なα又はω断片を生じるその他の切断点は、関連技術の通常の技術内である。
【００２２】
本発明は、次のものから選択される１又は複数のアミノ酸配列変化を含むＴＥＭ−１β−ラクタマーゼのα又はω断片を提供する：Ｍ６９Ｌ；Ｍ６９Ｉ；Ｖ７４Ｔ；Ｍ１８２Ｔ；Ｉ２０８Ｔ；Ｍ２１１Ｑ；Ｆ２３０Ｙ；及びＮ２７６Ｄ。これらの突然変異は、個々に又は組み合わせて存在し得る。ネイティブ配列に関連する突然変異の具体的な組み合わせは、完全に１個のレポータードメイン又はレポーター断片ペアメンバー内に存在し得る。具体的な突然変異又は突然変異の組み合わせは、本発明の範囲内のアッセイの必要条件を満たすため、所望のアッセイ及び突然変異の操作可能性に依存して、ＦＥＣアッセイにおいて有用な１個のレポータードメイン又は２個の相補的レポータードメイン又はレポーター断片ペアメンバーにおいて存在し得る。本発明の範囲内の１個のアミノ酸突然変異の特定の組み合わせには、α断片レポータードメインにおけるＭ１８２ＴとのＭ６９Ｌ；α断片レポータードメインにおけるＭ１８２ＴとのＭ６９Ｉ；及びω断片レポータードメインにおけるＮ２７６Ｄが含まれる。これら変化したレポータードメイン配列は、言うまでもなく、ＦＥＣアッセイの操作可能なメンバーを構成するために、適切なレポーター断片メンバーに組み込まれ得る。インタラクタードメインが、操作可能なメンバー又はＦＥＣアッセイのメンバーの操作可能なペアを構成するための本発明の改変レポータードメインの１以上に連結される、当業者が所望し得る何らかのこのようなドメインであり得ることは、本発明の範囲内である。当業者にとって当然のことながら、これらのコンストラクトは操作可能であり得、従って、インビボ又はインビトロで有用であり得る。本発明の阻害剤耐性コンストラクトのインビボでの使用が具体的にもくろまれる。
【００２３】
さらなる代表的実施形態において、本発明のレポーター断片メンバーは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列の単離又は精製ポリペプチドを含む。ある好ましい実施形態において、本発明のレポーター断片は、基本的に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列の単離又は精製ポリペプチドから構成される。具体的な好ましい実施形態において、本発明のレポーター断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列の単離又は精製ポリペプチドから構成される。
【００２４】
本発明はまた、レポーター断片ペアの対形成を含む単離又は精製された特異的断片ペアも提供し、この場合、対形成は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列（標識されたコンストラクトＰＢ１５を示す。）により例示されるように、配列の実質的な再編成を特徴とする。さらなる実施形態には、配列番号２３及び２４により例示されるものなどのこのような再編成された基本配列由来のレポーター断片が含まれる。
【００２５】
本発明と一致して、リンカードメインを本発明のレポーター断片に付加し得る。さらに、介在リンカードメイン有り又は無しでインタラクタードメインを本発明のレポーター断片に連結し得る。リンカードメインの数、例えば、Ｇ４Ｓドメイン（即ちＧＧＧＧＳ配列反復）は０、１、２、３、４、５、６以上であり得、（Ｇ４Ｓ）ｎとして特定し得る（ここでｎは０、１、２、３、４、５、６以上の整数であり得る。）。何らかの特定のインタラクター及びレポータードメインコンストラクト及び断片対形成に対する適切なリンカードメイン配列及び／又はリンカードメイン反復数の選択は、当業者による通常の実験レベル内である。
【００２６】
本発明のレポーター断片には、均一インビトロＦＥＣアッセイへと操作可能に構成され得る単離及び精製レポーター断片が含まれる。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、６６、６８、７０、７２、７４、７６、８０及び８２で示される配列から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はこれらからなる核酸など、本発明のポリペプチド実施形態をコードする核酸を提供する。
【００２８】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のレポーター断片及びインビトロＦＥＣアッセイ成分を作製し、精製し、単離し、使用する方法を提供する。
【００２９】
本発明は、さらに、本発明の単離及び精製ポリペプチド及びレポーター断片ペアを含む均一インビトロＦＥＣアッセイを提供する。
【００３０】
従って、別の態様において、本発明は、
（ａ）関心のある被分析物質の存在について試験しようとする試料を得て；
（ｂ）被分析物質に対して親和性があるインタラクタードメインを含む、精製された第一のレポーター断片ペアメンバーを得て；
（ｃ）関心のある被分析物質に対して親和性があり、関心のある被分析物質と第一及び第二のレポーター断片ペアメンバーのインタラクタードメインとの親和性を通じて第一のレポーター断片ペアメンバーとの会合に際してレポーター酵素活性を再構成することにおいて操作可能であるインタラクタードメインを含む精製された第二のレポーター断片ペアメンバーを得て；
（ｄ）第一及び第二のレポーター断片ペアメンバーが、被分析物質とのインタラクタードメインの親和性を通じて会合することを可能にするのに十分なインビトロでのアッセイ条件を提供する段階を含み、レポーター酵素活性の再構成が試料中の被分析物質の存在を示す、被分析物質の存在をアッセイする方法を提供する。
【００３１】
関連する態様において、本発明は、本発明のレポーター系と試料を接触させることと、第一及び第二のポリペプチドサブユニットの会合の結果として生じる酵素活性の有無を検出することと、を含む、試料中の関心のある被分析物質の存在を調べる方法も提供する。
【００３２】
別の関連する態様において、本発明は、試料中の関心のある被分析物質の存在を調べるための本発明のレポーター系の使用を提供する。
【００３３】
本発明はまた、特定の被分析物質に対して均一インビトロアッセイを行うために適応させられた特異的レポーター断片ペアも提供する。ある実施形態において、被分析物質はＮｉ２＋、Ｚｎ２＋又はＣｏ２＋などの２価金属陽イオンである。さらに別の実施形態において、被分析物質は抗体である。抗体被分析物質は、関心のあるアッセイに依存して、モノクローナル抗体又はその他、適切な抗体であり得る。さらなる実施形態において、被分析物質は抗原である。さらなる実施形態において、被分析物質は１以上のポリヌクレオチド又は特異的配列である。このようなポリヌクレオチドは、メチル化されていてもされていなくてもよく、それらのメチル化状態は、本発明の特定の実施形態の使用から得られる情報であり得る。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のアッセイを行うためのキット又は、材料、試薬及び本発明のアッセイ成分を調製するための又は本発明のアッセイの続く使用のための説明書を含むキットを含む。
【００３５】
本発明のその他の目的、特性及び長所は、続く詳細な説明から明らかになろう。しかし、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び変化がこの詳細な説明から当業者にとって明らかとなるので、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示す一方、単なる説明のために与えられるものであることを理解されたい。
【００３６】
次の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある一定の態様をさらに明らかにするために含まれる。本明細書中で与えられる本発明の詳細な説明及び実施例と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することにより、本発明がより詳細に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＦＥＣアッセイ及びその基本成分の概略図。
【図２】２価金属陽イオンに対する均一インビトロＦＥＣアッセイの概略図。
【図３】野生型又は突然変異β−ラクタマーゼレポーターコンストラクトを使用する２価陽イオンに対する均一インビトロＦＥＣアッセイの実行。
【図４】Ｎｉ２＋に対する均一インビトロＦＥＣアッセイにおける１０分間のＯＤ４９２試験。
【図５】抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体に対する均一インビトロＦＥＣアッセイの概略図。
【図６】抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体に対する均一インビトロＦＥＣアッセイの実行（ＯＤ４９２での吸収）。
【図７】本発明のタンパク質断片の精製。図面の左のパネルはαβ−ラクタマーゼ酵素断片の誘導発現前後及びアフィニティー精製物質のゲル電気泳動である。α断片の表示されたクロマトグラム「アフィニティー精製」及び表示されたクロマトグラム「ゲルろ過」プロファイルの両方が、精製酵素断片の実施形態を説明する。本発明のその他の断片に対して同様の結果が得られる。
【図８】被分析物質としてのＮｉ２＋に対して反応性のあるβ−ラクタマーゼ酵素断片及び本発明のα及びωβ−ラクタマーゼ断片の等モル量を用いたＦＥＣインビトロアッセイの進展の４９２ｎｍでの吸収読み取り。
【図９】マルチウェルプレート形式でのＮｉ２＋に対するインビトロアッセイ中の色の変化の強度の説明。時間点は非線形である。各ウェルの色の強度は、被分析物質の存在及び非存在下（それぞれウェルＡ１−Ａ８及びＢ１−Ｂ８）及び基質のみ（ウェルＣ１−Ｃ８）において示される。
【図１０】突然変異コンストラクトのアッセイの特徴。単位はｍＯＤ分−１である。
【図１１】ＨＳＶに対するコンストラクトのアッセイの特徴。単位はｍＯＤ分−１である。
【図１２】野生型ＴＥＭ−１（ＰＢ１１＋ＰＢ１３）ＦＥＣと比較した、最適阻害剤耐性突然変異ＴＥＭ−３３Ｍ１８２ＴＮ２７６Ｄ（ＰＢ１１．１２＋ＰＢ１３．３）の相対的耐性を示すグラフ。
【図１３】野生型ＴＥＭ−１（ＰＢ１１＋ＰＢ１３）ＦＥＣ及び全長ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼと比較した、最適阻害剤耐性突然変異ＴＥＭ−３３Ｍ１８２Ｔ Ｎ２７６Ｄ（ＰＢ１１．１２＋ＰＢ１３．３）のβ−ラクタマーゼ阻害剤添加血清アッセイの結果を示すグラフ。
【図１４】ＢＬαＰｒｏＧ／ＢＬω−ＨＳＶ１を用いたＨＳＶ−１アッセイの特徴を示すグラフ。カットオフ＝１．２０。感受性＝ＨＳＶ １＋ｖｅに対して９８％。特異性＝ＨＳＶ２＋ｖｅに対して１００％。特異性＝ＨＳＶ−ｖｅに対して１００％。
【図１５】ＢＬαＰｒｏＧ／ＢＬω−ＨＳＶ２を用いたＨＳＶ−２アッセイの特徴を示すグラフ。カットオフ＝１．１６。感受性＝ＨＳＶ２＋ｖｅに対して９４％。特異性＝ＨＳＶ１＋ｖｅに対して１００％。特異性＝ＨＳＶ−ｖｅに対して１００％。
【図１６】ＢＬαＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧを用いたＨＳＶ−１アッセイの特徴を示すグラフ。カットオフ＝１．１５。感受性＝ＨＳＶ１＋ｖｅに対して９８％。特異性＝ＨＳＶ２＋ｖｅに対して１００％。特異性＝ＨＳＶ−ｖｅに対して９６％。
【図１７】ＢＬαＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧを用いたＨＳＶ−２アッセイの特徴を示すグラフ。カットオフ＝１．２０。感受性＝ＨＳＶ２＋ｖｅに対して９８％。特異性＝ＨＳＶ１＋ｖｅに対して１００％。特異性＝ＨＳＶ−ｖｅに対して９６％。
【図１８】正常（対照）又はＨＳＶ−２高陽性患者血清の何れかの存在下でのニトロセフィン加水分解の典型的な速度を示すグラフ（１５分間の予備温置時間後、４９２ｎｍで監視）。加水分解の平均速度は０．８５ｍＯＤ分−１（ＨＳＶ陰性）及び５．１４ｍＯＤ分−１。
【図１９】β−ラクタマーゼに基づくＦＥＣのイラスト表示及びＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２特異的抗原性ペプチドの配列。（ａ）酵素断片、α及びω、は、疾患特異的抗原性ペプチド（Ｐ）及びプロテインＧの１つのドメインなど、被分析物質結合物質に連結される。被分析物質（疾患特異的抗体）の存在下で、断片を強制的に近接近させ（右）、それによりニトロセフィンの加水分解が開始されるが、それは黄色から赤への色の変化として見ることができる。（ｂ）ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２抗原性ペプチドの短縮型糖タンパク質アミノ酸配列。下線付きの太字は免疫優勢領域を表す。
【図２０】この研究で使用されるＦＥＣ断片の概略図。ＢＬはβ−ラクタマーゼα（α、青）及びω（ω、緑）断片を指す。被分析物質結合部分（赤）、ＰｒｏＧ、ＨＳＶ−Ｐ１及びＨＳＶ−Ｐ２は、それぞれプロテインＧドメイン及びＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対するＨＳＶ型特異的抗原性ペプチドを指す。ヒスチジンタグを灰色で示す。被分析物質結合部分に酵素断片を連結するために、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを使用した。
【００３８】
配列リストの簡単な説明
配列番号１。ＰＢ１１、ネイティブβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００３９】
配列番号２。ＰＢ１１、ネイティブβ−ラクタマーゼのα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４０】
配列番号３。ＰＢ１３、ネイティブβ−ラクタマーゼ配列のω断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００４１】
配列番号４。ＰＢ１３、ネイティブβ−ラクタマーゼのω断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４２】
配列番号５。ＰＢ１１．２、Ｖ７４Ｔ及びＭ１８２Ｔの置換を含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００４３】
配列番号６。ＰＢ１１．２、Ｖ７４Ｔ及びＭ１８２Ｔの置換を含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４４】
配列番号７。ＰＢ１１．１１ 置換Ｍ６９Ｌを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクト。
【００４５】
配列番号８。ＰＢ１１．１１ 置換Ｍ６９Ｌを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４６】
配列番号９。ＰＢ１１．１２ 置換Ｍ６９Ｌ及びＭ１８２Ｔを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクト。
【００４７】
配列番号１０。ＰＢ１１．１２ 置換Ｍ６９Ｌ及びＭ１８２Ｔを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４８】
配列番号１１。ＰＢ１３．１ Ｍ２１１Ｑの置換を含有するβ−ラクタマーゼ配列のω断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００４９】
配列番号１２。ＰＢ１３．１ Ｍ２１１Ｑの置換を含有するβ−ラクタマーゼ配列のω断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００５０】
配列番号１３。ＰＢ１１．１３ 置換Ｍ６９Ｉ及びＭ１８２Ｔを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００５１】
配列番号１４。ＰＢ１１．１３ 置換Ｍ６９Ｉ及びＭ１８２Ｔを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００５２】
配列番号１５。ＰＢ１１．４、（Ｇ４Ｓ）３リンカードメインを含むネイティブβ−ラクタマーゼのα断片をコードするヌクレオチド配列。
【００５３】
配列番号１６。ＰＢ１１．４、（Ｇ４Ｓ）３リンカードメインを含むネイティブβ−ラクタマーゼのα断片のアミノ酸配列。
【００５４】
配列番号１７。ＰＢ１３．２、（Ｇ４Ｓ）３リンカードメインを含むネイティブβ−ラクタマーゼのω断片をコードするヌクレオチド配列。
【００５５】
配列番号１８。ＰＢ１３．２、（Ｇ４Ｓ）３リンカードメインを含むネイティブβ−ラクタマーゼのω断片のアミノ酸配列。
【００５６】
配列番号１９。ＰＢ１３．３ 置換Ｎ２７６Ｄを含有するβ−ラクタマーゼのω断片コンストラクト。
【００５７】
配列番号２０。ＰＢ１３．３ 置換Ｎ２７６Ｄを含有するネイティブβ−ラクタマーゼのω断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００５８】
配列番号２１。ＰＢ１５、β−ラクタマーゼの再編成コンストラクトのアミノ酸配列。
【００５９】
配列番号２２。ＰＢ１５．３、β−ラクタマーゼの、及びＭ１８２Ｔ、Ｉ２０８Ｔ及びＦ２３０Ｙの置換を含む、再編成コンストラクトのアミノ酸配列。
【００６０】
配列番号２３。ＰＢ７．２、ＰＢ１５．３のα断片のアミノ酸配列。
【００６１】
配列番号２４。ＰＢ９．１、ＰＢ１５．３のω断片のアミノ酸配列。
【００６２】
配列番号２５から配列番号６５は、表１及び５で記載のとおりの合成プライマーである。
【００６３】
配列番号６６ Ｐ１−Ｉ ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−１短縮型抗原ヌクレオチド配列。
【００６４】
配列番号６７ Ｐ１−Ｉ ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−１短縮型抗原アミノ酸配列。
【００６５】
配列番号６８ ＢＬαＨＳＶ−１α断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００６６】
配列番号６９ ＢＬαＨＳＶ−１α断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００６７】
配列番号７０ ＢＬω、ＨＳＶ−１ω断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００６８】
配列番号７１ ＢＬω、ＨＳＶ−１ω断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００６９】
配列番号７２ Ｐ２−１ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−２短縮型抗原ヌクレオチド配列。
【００７０】
配列番号７３ Ｐ２−１ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−２短縮型抗原アミノ酸配列。
【００７１】
配列番号７４ ＢＬαＨＳＶ−２ α断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００７２】
配列番号７５ ＢＬαＨＳＶ−２ α断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００７３】
配列番号７６ ＢＬωＨＳＶ−２ ω断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００７４】
配列番号７７ ＢＬωＨＳＶ−２ ω断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００７５】
配列番号７８ プロテインＧヌクレオチド配列。
【００７６】
配列番号７９ プロテインＧアミノ酸配列。
【００７７】
配列番号８０ ＢＬαＰｒｏＧ、プロテインＧα断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００７８】
配列番号８１ ＢＬαＰｒｏＧ、プロテインＧα断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００７９】
配列番号８２ ＢＬωＰｒｏＧ、プロテインＧω断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００８０】
配列番号８３ ＢＬωＰｒｏＧ、プロテインＧω断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００８１】
配列番号８４ ＨＳＶ１のｇＧ１のアミノ酸９２から１４８。
【００８２】
配列番号８５ ＨＶＳ２のｇＧ２のアミノ酸又は５５１から６４１。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する（例えば、細胞生物学、化学及び分子生物学において）。分子及び生化学的方法のために使用される標準的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．及び題名「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」の完全版）で見出すことができる。
【００８４】
特定の実施形態及び実施例の次の詳細な説明は、説明を目的として与えられるものであり、限定するために与えられるものではない。禁忌であるか又は別段の断りがない限り、これらの説明において及び本明細書を通して、「ａ」及び「ａｎ」という用語は、１又は複数を意味する。同様に、「又は」は「及び／又は」を意味する。
【００８５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語に続くものを全て含むがこれらに限定されないことを意味する。従って、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語の使用は、列挙される要素が必要とされるか又は必須であるが、その他の要素は任意であり、存在してもよいししなくてもよいことを示す。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句に続くものを全て含み、それらに限定されることを意味する。従って、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句は、列挙される要素が必要であるか又は必須であり、その他の要素が存在し得ないことを示す。「基本的に、からなる（Ｃｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、この句の後に列挙される何れの要素も含まれ、列挙される要素に対する開示において指定される活性又は作用を妨害しないか又は寄与しないその他の要素に限定されることを意味する。従って、「基本的に、からなる（Ｃｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という句は、列挙される要素が必要とされるか必須であるが、その他の要素は任意であり、それらが列挙される要素の活性又は作用に影響するか否かによって、存在し得るか又はし得ないことを示す。
【００８６】
値の範囲が与えられる場合、途中にある各値、文脈からの明らかな別段の指示がない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間及び何らかのその他の規定されるか又は規定される範囲において途中にある値が本発明内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立に、このより小さい範囲に含まれ得、また本発明内に包含され、規定される範囲における何らかの具体的に除外される制限に制約される。
【００８７】
レポーター成分及びレポーターポリペプチド断片
本発明は、均一インビトロＦＥＣアッセイの単離及び精製成分としての使用に適応させられたポリペプチドを含むかそれらからなるレポーター成分を提供する。このレポーター成分はレポーター系の一部をなす。上記で考察したように、ＦＥＣアッセイにおけるレポーター系は、会合した場合に検出可能なシグナルを生じさせることができるレポータータンパク質複合体を形成する２以上のポリペプチド断片を含む。従って、各レポーター成分は、少なくとも１つのこのようなポリペプチド断片又はサブユニット（本明細書中で、「レポーター断片」と呼ばれる。）を含む。例えば、βラクタマーゼに基づく系の場合、この２つのレポーター成分がアッセイ条件下で会合する場合、結果として得られる複合体がβラクタマーゼ活性を有するように、第一のレポーター成分はβラクタマーゼのα断片を含み得、第二のレポーター成分は、βラクタマーゼのω断片を含み得る。それらの個々のレポーターポリペプチド断片（「サブユニット」とも呼ばれる。）が会合する場合に一緒になって検出可能な酵素活性を生じさせることができる第一のレポーター成分及び第二のレポーター成分の組み合わせは、本明細書中で「レポーター成分ペア」と呼ばれ、個々のレポーターポリペプチド断片はまとめて「レポーター断片ペア」と呼ばれる。
【００８８】
レポーター断片及び系に対する基礎として使用され得るレポーターポリペプチドの例には、β−ラクタマーゼ（例えばＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ：ＥＣ：３．５．２．６）β−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質（例えばホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ）及び緑色蛍光タンパク質を含む蛍光タンパク質が含まれる。レポーターポリペプチドは、通常、会合した場合に元の全長ポリペプチドの活性を再構成することができる２つの断片に分割される。例えば、β−ラクタマーゼ及びβ−ガラクトシダーゼは、通常、２つの断片、α及びω断片に分割される。２つの断片を生じさせるためのこれらの様々なタンパク質のアミノ酸配列における適切な切断点は既に述べている。
【００８９】
レポーターポリペプチド／断片は、それらがインビトロでの使用に適切であるように選択される（疑義を避けるために、本文脈において、インビトロという用語は、アッセイが生きている細胞の外で行われることを意味する。）。このレポーターポリペプチドは、通常、例えば、安定性を促進し、溶解性を向上させ及び／又は凝集性を低下させるための、インビトロでの使用に対するそれらの適合性を向上させるアミノ酸変化を有する野生型配列の変異体である。特に好ましい実施形態において、レポーターポリペプチド／断片は、野生型ポリペプチドと比較して、レポーター機能に必要とされるポリペプチドの活性、例えばβラクタマーゼ活性の、酵素阻害剤などの阻害剤に対する感受性が低下している。このような阻害剤には、試料、例えば、関心のある被分析物質の存在について試験することが必要とされる血液及び血清試料などの生体試料中で見出される化合物、が含まれる。このような阻害剤の特定の例は、血液試料を採取する個体への抗生物質の投与の結果血液中で見られるβ−ラクタマーゼ活性の阻害剤である。
【００９０】
アッセイ条件下で、レポーター活性を有する活性複合体を形成するためのレポーター断片の会合には、通常、レポーター成分のその他の領域と標的被分析物質との間の相互作用が介在する。従って、このレポーター成分は、通常、インタラクター部分又はドメインを含む。
【００９１】
インタラクタードメインは、関心のある標的被分析物質に対する結合特異性を有する。インタラクタードメインには、例えば、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、抗原、抗体及び抗体の抗原結合断片、例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）など、が含まれる。抗原には、病原体由来の抗原、例えばウイルス性又は細菌性抗原など、が含まれる。抗体／ＣＤＲには、病原体、例えばウイルス又は細菌など、由来の抗原に結合する配列が含まれる。インタラクタードメインの特定の例には、プロテインＧのＩｇＧ結合ドメイン及び単純ヘルペスウイルス抗原が含まれる（その特に好ましいものは、ＨＳＶ１からの短縮型糖タンパク質Ｇ１エンベロープタンパク質又はＨＳＶ２からの短縮型糖タンパク質Ｇ２エンベロープタンパク質、例えばｇＧ１のアミノ酸９２から１４８又はｇＧ２の５５１から６４１などである。）。
【００９２】
インタラクタードメインをレポーター断片に直接又はリンカーを介して連結し得る。適切なリンカードメインには、ペプチド、例えばグリシンリッチ反復配列（例えばＧ４Ｓ反復配列−即ちＧＧＧＧＳ配列回復）が含まれる。リンカードメイン、例えばＧ４Ｓドメイン、の数は、１、２、３、４、５、６以上であり得る。ある実施形態において、グリシンリッチ反復配列の数は好ましくは２又は３である（特にインタラクタードメインが１５０又は１００アミノ酸より少ないポリペプチドである場合）。より大きいインタラクタードメインを使用する場合、リンカー長を長くする事が望ましいものであり得る。
【００９３】
ある実施形態において、リンカードメインはフレキシブルである。別の実施形態において、リンカードメインは堅い。
【００９４】
適切なリンカードメイン配列及び／又は何らかの特定のインタラクター及びレポーター断片コンストラクト及び断片対形成に対するリンカードメイン反復の数の選択は、当業者による通常レベルの実験の範囲内である。
【００９５】
レポーター成分を形成するために、レポーター断片ポリペプチド、リンカードメイン及びインタラクタードメインを共有又は非共有手段により連結し得る。
【００９６】
ある実施形態において、リンカードメイン及びインタラクタードメインはポリペプチドである。従って、レポーター成分は１つのポリペプチドであり得る。
【００９７】
別の実施形態において、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、例えばチオ−チオ、アミン−カルボキシル又はアミン−アルデヒド官能基を介した、例えば共有カップリングにより、インタラクタードメインにレポーター断片を連結する。特定の例には、炭水化物基を介した糖タンパク質へのポリペプチドの架橋；例えばアミン反応基及びスルフィドリル反応基を有するヘテロ二官能性架橋剤を用いた、一級アミンを介した架橋（Ｎ末端及びリジン残基で見られる。）；カルボキシル基を介した架橋（Ｃ末端で、及び、グルタミン酸及びアスパラギン酸残基での側基として見られる。）；遊離スルフヒドリル基を介した架橋；及びジスルフィド交換が含まれる。
【００９８】
非共有法には、アビジン−ビオチン系及びオリゴヌクレオチド−タンパク質結合のハイブリッド形成が含まれる。
【００９９】
ある態様において本発明は、本明細書中で開示される酵素ペプチドのアミノ酸配列からなるか又は基本的にそれらからなるか又はそれらを含むものなど、単離又は精製ペプチド及びタンパク質レポーター断片及びレポーター成分を提供する。図面又は配列リストにおいて、本発明の代表的な配列が提供される。提供されるペプチド配列は、本明細書中で、本発明に記載のアッセイのレポーター断片又はレポーターペアメンバー／成分と呼ばれる。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、実質的に細胞性物質不含又は化学的前駆体もしくはその他の化学物質不含であるとき、「単離されている」又は「精製されている」と言われる。本発明のペプチドは、均一になるまで又はその他の程度の純度まで精製され得る。精製レベルは使用目的に基づく。本発明における使用目的は特異的被分析物質に対する均一インビトロＦＥＣアッセイの操作可能な成分である。
【０１０１】
ある使用において、「実質的に細胞性物質不含」には、その他のタンパク質（即ち夾雑タンパク質）が約３０％（乾燥重量）未満である、その他のタンパク質が約２０％未満である、その他のタンパク質が約１０％未満である、又はその他のタンパク質が約５％未満である、ペプチドの調製品が含まれる。ペプチドが組み換え産生される場合、これは実質的に培地不含でもあり得、即ち培地はタンパク質調製品の体積の約２０％未満である。
【０１０２】
「実質的に化学的前駆体又はその他の化学物質不含」という語には、その合成に関与する化学的前駆体又はその他の化学物質からそれが分離されているペプチドの調製品が含まれる。ある実施形態において、「実質的に化学的前駆体又はその他の化学物質不含」という語には、化学的前駆体又はその他の化学物質が約３０％未満（乾燥重量）である、化学的前駆体又はその他の化学物質が約２０％未満である、化学的前駆体又はその他の化学物質が約１０％未満である、又は化学的前駆体又はその他の化学物質が約５％未満である、酵素ペプチドの調製品が含まれる。
【０１０３】
単離レポーター断片及びポリペプチドレポーター成分は、それを発現するように改変されている細胞から精製され得る（組み換え）か、又は既知のタンパク質合成方法を用いて合成され得る。例えば、酵素ペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングし、その発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞でそのタンパク質を発現させる。適切な宿主細胞を下記でさらに詳細に記載する。次に、適切なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによりこのタンパク質を細胞から単離し得る。本発明の代表的技術は下記で示す実施例で詳細に記載する。
【０１０４】
ある態様において、本発明は、提供されるアミノ酸配列からなるタンパク質を提供する。あるアミノ酸配列がタンパク質の最終アミノ酸配列である場合、タンパク質はそのアミノ酸配列からなる。さらなる態様において、本発明は、さらに、基本的に提供されるアミノ酸配列からなるタンパク質を提供する。タンパク質は、アミノ酸配列が本発明のタンパク質の機能的特徴を変化させない数個のさらなるアミノ酸残基のみを伴い存在する場合、基本的にこのようなアミノ酸配列からなる。さらなる態様において、本発明は、提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。アミノ酸配列がタンパク質の最終アミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はそのアミノ酸配列を含む。このような様式においてこのタンパク質は、そのペプチドのみであり得るか又は、それと連結されるアミノ酸残基（連続するコードされる配列）又は異種アミノ酸残基もしくはペプチド配列などのさらなるアミノ酸分子を有し得る。このようなタンパク質は、数個のさらなるアミノ酸残基を有し得るか又は数百以上のさらなるアミノ酸を含み得る。様々なタイプのこれらのタンパク質がどのようにして作製され、単離され得るかの簡単な説明は以下で与える。
【０１０５】
キメラ又は融合タンパク質を形成するために、本発明のペプチドは、異種配列に連結され得る。このようなキメラ及び融合タンパク質は、実質的に酵素ペプチドと同種ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に操作可能に連結された酵素ペプチドを含み得る。「操作可能に連結される」とは、それぞれの操作可能性が破壊されないように酵素ペプチド及び異種タンパク質が融合されることを指す。異種タンパク質を酵素ペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合させ得る。
【０１０６】
標準的組み換えＤＮＡ技術によりキメラ又は融合タンパク質を作製し得る。例えば、従来の技術に従い、様々なタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片を一緒にインフレームで連結する。別の実施形態において、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により融合遺伝子を合成し得る。あるいは、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的突出部（続いて、キメラ遺伝子配列を生成させるためにこれをアニーリングし再増幅させ得る。）を生じさせるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅又は連結（ライゲーション）を行い得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８）。さらに、既に融合部分をコードする、多くの発現ベクターが市販されている。融合部分がインフレームで酵素ペプチドに連結されるように、酵素ペプチドをコードする核酸をこのような発現ベクターにクローニングし得るが、これは、各成分の操作可能性を破壊することなく融合タンパク質を作製する１つの手段である。
【０１０７】
代替的な配列付番スキームにおける相同位置の同定
２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列の比較において相同的位置を決定するために、最適な比較のために配列を整列（アラインメント）させる（例えば、最適アラインメントのための第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列の一方又は両方においてギャップを導入し得、比較のために非相同配列を無視し得る。）。好ましい実施において、参照配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上を比較のために整列させる。次に、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置に第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドがある場合、その位置において分子は同一であり、２つにおいてその位置は相同である。２つの配列間の％同一性は、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れて（これらは、２つの配列の最適整列のために導入される必要がある。）、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である。
【０１０８】
数学的アルゴリズムを用いて、配列の比較及び２つの配列間の％同一性及び類似性を決定し得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ １、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【０１０９】
例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いて、ペアワイズアラインメント及び配列同一性及びホモロジーのレベルを計算し得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている。）を用いて２つのアミノ酸配列間の％同一性を計算し得る（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））。このアルゴリズムは通常、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスの何れか及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップウエイト及び１、２、３、４、５又は６の長さウエイトを用いて、使用される。ＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を用いて、ＮＳＷｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス及び４０、５０、６０、７０又は８０のギャップウエイト及び１、２、３、４、５又は６の長さウエイトとともに、２つのヌクレオチド配列間の％同一性を計算し得る。
【０１１０】
このようにして、アミノ酸に対する１文字表記と、それに続く関連する非置換配列又はペプチドの位置の数と、それに続く置換アミノ酸に対する１以上の１文字表記により、アミノ酸配列又はペプチドのある位置の置換が示される。例えば、添付の配列リスト及び図面で示されるようなＴＥＭ−１β−ラクタマーゼのα断片の位置７２のバリンに対するスレオニンの置換は、Ｖ７４Ｔと呼ばれる。同様の表示は、本明細書中で提供される文脈及びさらなる詳細から明らかとなろう。
【０１１１】
インビトロでのレポーター機能を向上させるためのアミノ酸修飾
本発明のアッセイでの使用のためのレポーターポリペプチド断片は、通常、このようなアッセイでの使用に対するレポーターポリペプチドの適合性を向上させるアミノ酸配列変化又は修飾を含む。特に、好ましい実施形態において、少なくとも１つのレポーターポリペプチド断片は、再構成される活性レポーターポリペプチド複合体の、非修飾（例えば野生型）アミノ酸配列の阻害剤である物質による阻害に対する感受性を低下させる、そのアミノ酸配列における変化又はそのアミノ酸配列に対する修飾を含む。
【０１１２】
このような変異体は、通常、１以上の非保存的アミノ酸の、置換、欠失、挿入、逆転もしくは短縮又は重要な残基もしくは重要な領域における、置換、挿入、逆転もしくは欠失を含有する。機能が変化した変異体はまた、結果として機能が変化しないか又は顕著に変化しない類似アミノ酸の置換も含有し得る。ある実施形態において、変異体は、１、２、３、４又は５個のアミノ酸変化を含有する。
【０１１３】
本発明は、１個のアミノ酸置換又はさらに本明細書中で例示されるように、均一インビトロＦＥＣアッセイでの使用に特に適応させられた組み合わせでの複数の置換を含む修飾β−ラクタマーゼペプチド配列を提供する。このような置換の具体例は、α断片のアミノ酸位置６９での置換（好ましくはＭ６９Ｌ又はＭ６９Ｉ）（これによりβ−ラクタマーゼ阻害剤による阻害が低下する。）及びω断片のアミノ酸位置２７６での置換（好ましくはＮ２７６Ｄ）（これによってもまた、β−ラクタマーゼ阻害剤による阻害が低下する。）である。その他の例は、アミノ酸位置７４、１８２、２０８、２１１及び２３０の１以上での置換（好ましくはＶ７４Ｔ、Ｍ１８２Ｔ、Ｉ２０８Ｔ、Ｍ２１１Ｑ及びＦ２３０Ｙの１以上）から選択される。
【０１１４】
さらなる例は、次の疎水性アミノ酸残基の、疎水性がより低いと考えられる何らかの残基への突然変異であり、アッセイを向上させ得る：Ｖ４４、Ｙ４６、Ｌ４９、Ｌ５１、Ｆ６６、Ｖ７４、Ｌ８１、Ｆ１５１、Ｐ１８３、Ｖ１８４、Ａ１８７、Ｌ１９０、Ｌ１９４、Ｌ１９８、Ｌ１９９、Ｌ２０７、１２０８、Ｗ２１０、Ｍ２１１、Ａ２３２、Ｉ２４７、Ａ２４９、Ｐ２５７、１２６０、Ｉ２６１、Ｉ２６２、Ｉ２６３、Ｙ２６４、Ｉ２８２、Ｌ２８６（特に太字及び下線付きの残基）。
【０１１５】
与えられるアミノ酸の付番は、配列番号１及び３で示される野生型ＴＥＭ−１βラクタマーゼ配列を基準にしている。しかし、当然のことながら、等価位置で相同βラクタマーゼ配列にも修飾が適用され得る（配列アラインメントによる等価位置の決定に関する先行するセクションを参照。）。
【０１１６】
様々な技術を使用して、均一アッセイなどインビトロアッセイでの使用に対する特性が向上している修飾されたレポーター断片を得ることができる。例えば、部位特異的突然変異誘発により配列変化を導入し得る。適切な部位の選択は、例えば、ｘ線結晶学又はＮＭＲなどの技術により決定された構造情報を含む一次アミノ酸配列及び／又は二次／三次構造情報が手がかりとなり得る。例えば、阻害剤に対する感受性が低下している変異体の設計を支援するために、酵素の活性部位の３Ｄ構造を使用することができる（例えば、Ｊｅｌｓｃｈ、Ｃ、Ｆ．Ｌｅｎｆａｎｔら、１９９２、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２９９（２）：１３５−４２に記載のようなＴＥＭ１の結晶構造参照）。
【０１１７】
無作為突然変異誘発又は定方向分子進化などの技術と、それに続く所望の特性を有する変異体の選択によっても、特性が向上している修飾されたレポーター断片を得ることができる（例えば非修飾タンパク質の阻害剤の存在下で酵素活性について変異体を試験することによって）。
【０１１８】
本発明において有用なさらなる修飾は、一般に２０種類の天然に存在するアミノ酸と言われる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含有する配列を含み得る。さらなる修飾には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン付加などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファー−ＲＮＡ介在付加及びユビキチン化が含まれる。
【０１１９】
従って、本発明のペプチド及びコンストラクトはまた、置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされるものではない誘導体又は類似体も包含し、これには置換基が含まれ、ここでは、成熟酵素ペプチドが、酵素ペプチドの半減期を延長させるための化合物などの別の化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合されるか、又はリーダーもしくは分泌配列もしくは成熟酵素ペプチド又はプロタンパク質配列の精製のための配列などのさらなるアミノ酸が成熟酵素ペプチドに融合させられる。
【０１２０】
核酸分子
本発明は、本明細書中に記載のようなレポーターポリペプチド断片及びレポーター成分を含む、酵素ペプチド又は本発明のタンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。特定の実施形態において、本発明は、図面及び添付の配列リストに記載のような本発明の酵素ペプチド又はタンパク質及び様々な修飾又はその断片をコードする単離核酸分子を提供する。このような核酸分子は、本発明のペプチド又はコンストラクトの１つをコードするヌクレオチド配列からなるか又は基本的にそれらからなるか又はそれらを含む。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、「単離（された）」核酸分子は、その核酸の天然の源に存在するその他の核酸から分離されているものである。さらに、転写産物又はｃＤＮＡ分子など、「単離（された）」核酸分子は、実質的にその他の細胞性物質又は、組み換え技術により産生される場合は培地又は、化学合成される場合は化学的前駆体もしくはその他の化学物質不含である。しかし、本核酸分子は、その他のコード配列又は調節配列と融合され得、それでも単離されているとみなされ得る。
【０１２２】
例えば、ベクター中に含有される組み換えＤＮＡ分子は単離されているとみなす。単離ＤＮＡ分子のさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組み換えＤＮＡ分子又は溶液中の精製（部分的又は実質的に）ＤＮＡ分子が含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明の単離ＤＮＡ分子ならびにその新規断片のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写が含まれる。本発明による単離核酸分子にはさらに、合成により作製されるこのような分子が含まれる。
【０１２３】
従って、本発明は、提供されるヌクレオチド配列からなる核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列がその核酸分子の完全ヌクレオチド配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列からなる。本発明は、基本的に提供されるヌクレオチド配列からなる核酸分子をさらに提供する。このようなヌクレオチド配列が最終核酸分子において数個のさらなる核酸残基のみとともに存在する場合、核酸分子は基本的にヌクレオチド配列からなる。
【０１２４】
本発明はさらに、提供されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の最終ヌクレオチド配列の少なくとも一部である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。このような様式において、この核酸分子は、そのヌクレオチド配列のみであるか又はそれと天然に結合される核酸残基又は異種ヌクレオチド配列などのさらなる核酸残基を有し得る。このような核酸分子は、数個のさらなるヌクレオチドを有し得るか又は数百以上のさらなるヌクレオチドを含み得る。様々なタイプのこれらの核酸分子がどのようにして容易に作製又は単離され得るかについての簡単な説明は以下で与える。
【０１２５】
単離核酸分子には、以下に限定されないが、酵素ペプチドのみをコードする配列、成熟ペプチドをコードする配列及びさらなるコード配列、例えばリーダー又は分泌配列など（例えば、プレプロ又はプロタンパク質配列）、さらなるコード配列を伴うか又は伴わない成熟ペプチドをコードする配列、さらに、さらなる非コード配列、例えばイントロン及び非コード５’及び３’配列、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含む。）、リボソーム結合及びｍＲＮＡの安定性に寄与する転写されるが翻訳されない配列などが含まれる。さらに、例えば精製を促進するペプチドをコードするマーカー配列に本核酸分子を融合させ得る。
【０１２６】
単離核酸分子は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態又はクローニングにより得られるかもしくは化学合成技術により作製されるかもしくはそれらの組み合わせにより作製されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であり得る。核酸、特にＤＮＡは、２本鎖又は１本鎖であり得る。１本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１２７】
遺伝子コードの縮重を斟酌すれば、配列は、それらが本発明のヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、通常は少なくとも約６０％、より一般的には約７０％、最も一般的には約８０％、好ましくは少なくとも約９０％及び最も好ましくは約９５％のヌクレオチドにおいて同一である場合、基本的に同じであるとみなされる。示されるものと基本的に同じである配列もまた、標準的条件下でポリヌクレオチドの相補性を含有する核酸セグメントとハイブリッド形成することができる配列として機能上定義され得る。「非常に関連のある配列」という用語は、本明細書中で、比較されているポリヌクレオチド又はポリペプチドと最小又は５０％の類似性がある配列を指すために使用される。
【０１２８】
当然、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの配列と相補的であるか又は基本的に相補的であるオリゴヌクレオチドも包含する。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補性規則に従い塩基対形成することができるものである。本明細書中で使用される場合、「相補的配列」という用語は、上記で述べた同じヌクレオチド比較により評価され得るように、又は本明細書中に記載のものなどの比較的厳しい条件下でのポリヌクレオチドの核酸セグメントとのハイブリッド形成が可能であるとして定義されるように、実質的に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。
【０１２９】
本発明の核酸の変異体は、当技術分野で周知の方法を用いて同定され得る。これらの変異体は、図面で示されるヌクレオチド配列又はこの配列の断片に対して通常は６０−７０％、７０−８０％、８０−９０％及びより一般的には少なくとも約９０−９５％以上の相同性があるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。図面で示されるヌクレオチド配列又はこの配列の断片に対して、中程度から厳しい条件下でハイブリッド形成できるものとしてこのような核酸分子を容易に同定し得る。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、及び当業者にとって周知のように、核酸ハイブリッド形成に対する「高ストリンジェンシー条件」、「中程度のストリンジェンシー条件」及び「低いストリンジェンシー条件」は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」の２．１０．１−２．１０．１６及び６．３．１−６頁で説明されている（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（１９９８））。ハイブリッド形成のストリンジェンシーを決定する的確な条件は、イオン強度（例えば、０．２ｘＳＳＣ、０．１ｘＳＳＣ）、温度（例えば、室温、４２℃、６８℃）及びホルムアミドなどの脱安定化剤又はＳＤＳなどの変性剤の濃度だけでなく、ヌクレオチド配列の長さ、塩基組成、ハイブリッド形成する配列間の％ミスマッチ及びその他の非同一配列内でのその配列のサブセットの出現頻度にも依存する。従って、高、中程度又は低ストリンジェンシー条件を実験的に決定することができる。ハイブリッド形成が起こらないストリンジェンシーレベルから、ハイブリッド形成が最初に観察されるレベルへとハイブリッド形成条件を変化させることにより、ある配列を試料中で最も類似した配列と（例えば選択的に）ハイブリッド形成させることができる条件を決定することができる。
【０１３１】
代表的な条件はまた、Ｋｒａｕｓｅ、Ｍ．Ｈ．及びＳ．Ａ．Ａａｒｏｎｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２００：５４６−５５６ （１９９１）にも記載されている。Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（１９９８）（これは、中程度又は低ストリンジェンシー条件に対する洗浄条件の決定を記載する。）も参照のこと。洗浄は、通常はハイブリッドの相補性の最小レベルを決定するように条件が設定される段階である。一般に、相同のハイブリッド形成のみが起こる最低温度から開始して、最終洗浄温度を１℃低下させることにより（ＳＳＣ濃度を一定に保持）、ハイブリッド形成する配列間でミスマッチする程度を最大で１％上昇させることができる。一般に、ＳＳＣの濃度を倍にすると、Ｔｍが約１７℃上昇する。これらのガイドラインを使用して、求められるミスマッチのレベルに依存して、高、中程度又は低ストリンジェンシーに対して実験的に洗浄温度を決定することができる。
【０１３２】
例えば、低ストリンジェンシー洗浄は、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する溶液中での室温にて１０分間の洗浄を含み得；中程度のストリンジェンシー洗浄は、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する前もって加温した溶液（４２℃）中での４２℃にて１５分間の洗浄を含み得；高ストリンジェンシー洗浄は、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する前もって加温した（６８℃）溶液中での６８℃にて１５分間の洗浄を含み得る。さらに、当技術分野で公知のように所望の結果を得るために洗浄を繰り返して又は連続して行い得る。当技術分野で公知のように、標的核酸分子と使用されるプライマー又はプローブとの間の同一性又は類似性の程度を同様に維持しながら、例として与えられるパラメーターの１以上を変化させることにより、同等の条件を決定することができる。
【０１３３】
ベクター／宿主細胞
本発明はまた、本明細書中に記載の核酸分子を含有するベクターも提供する。「ベクター」という用語は、ビヒクル、好ましくは核酸分子を指し、これは核酸分子を輸送し得る。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクター核酸に共有結合される。本発明のこの態様により、ベクターには、プラスミド、１本鎖もしくは２本鎖ファージ、１本鎖もしくは２本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクター又は人工染色体、例えばＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲ ＭＡＣなど、が含まれる。
【０１３４】
ベクターは、染色体外エレメントとして宿主細胞中に維持され、ここでベクター核酸分子のさらなるコピーを複製し産生し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに一体化され得、宿主細胞が複製する場合、核酸分子のさらなるコピーを産生し得る。
【０１３５】
本発明は、核酸分子の、維持のためのベクター（クローニングベクター）又は発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核又は真核細胞又は両方（シャトルベクター）で機能し得る。
【０１３６】
発現ベクターは、核酸分子の転写が宿主細胞中で可能となるように、ベクターにおいて核酸分子に操作可能に連結されるシス作用調節領域を含有する。転写に影響を与えることができる別個の核酸分子とともに宿主細胞に核酸分子を導入し得る。このようにして、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を可能とするために、シス調節制御領域と相互作用するトランス作用因子を提供し得る。あるいは、宿主細胞によりトランス作用因子が供給され得る。最後に、ベクターそのものからトランス作用因子が産生され得る。しかし、ある実施形態において、核酸分子の転写又は翻訳が細胞不含系で起こり得ることを理解されたい。
【０１３７】
本明細書中に記載の核酸分子が操作可能に連結され得る調節配列には、ｍＲＮＡ転写を支配するためのプロモーターが含まれる。これらには、以下に限定されないが、バクテリオファージＸからの左プロモーター、Ｅ．コリからの、ｌａｃ、ＴＲＰ及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター及びレトロウイルスの長い末端反復が含まれる。
【０１３８】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターにはまた、リプレッサー結合部位及びエンハンサーなど、転写を調節する領域も含まれ得る。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー及びレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
【０１３９】
転写開始及び制御のための部位を含有することに加えて、発現ベクターはまた、転写終結に必要な配列及び、転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位も含有し得る。発現のためのその他の調節制御エレメントには、開始及び終結コドンならびにポリアデニル化シグナルが含まれる。当業者は、発現ベクターにおいて有用である多くの調節配列を知っている。このような調節配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【０１４０】
核酸分子を発現させるために、様々な発現ベクターを使用し得る。このようなベクターには、染色体、エピソーム及びウイル由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来（酵母人工染色体を含む。）、ウイルス由来（バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルスなど）などのベクターが含まれる。ベクターはまた、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素由来のものなどのこれらの源の組み合わせ由来でもあり得る（例えばコスミド及びファージミド）。原核及び真核宿主に対する適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記箇所、に記載されている。
【０１４１】
調節配列は、１以上の宿主細胞において構成的な発現を与え得る（即ち組織特異的）か又は、１以上の細胞型において、温度、栄養素添加物又は外生要因（ホルモン又はその他のリガンドなど）などによる誘導性発現を与え得る。原核及び真核宿主において構成的で誘導性である発現を与える様々なベクターは、当業者にとって周知である。
【０１４２】
周知の方法によって核酸分子をベクター核酸に挿入し得る。一般に、１以上の制限酵素を用いてＤＮＡ配列及び発現ベクターを切断し、次いで断片を一緒に連結することにより、最終的に発現されるＤＮＡ配列を発現ベクターに連結する。
【０１４３】
制限酵素消化及びライゲーションのための手順は当業者にとって周知である。
【０１４４】
周知の技術を用いて増殖又は発現のために、適切な核酸分子を含有するベクターを適切な宿主細胞導入し得る。細菌細胞には、以下に限定されないが、Ｅ．コリ、ストレプトミセス及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌）が含まれる。真核細胞には、以下に限定されないが、酵母、昆虫細胞（ショウジョウバエなど）、動物細胞（ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞など）及び植物細胞が含まれる。
【０１４５】
本明細書中に記載のように、特に完全レポーター断片ペアメンバーコンストラクトを発現する場合、融合タンパク質として本発明のペプチドを発現することが望まれ得る。従って、本発明は、このようなペプチドの産生を可能にするベクターを提供する。これらのベクターは、組み換えタンパク質の発現を増加させ、組み換えタンパク質の溶解性を向上させ、例えばアフィニティー精製に対するリガンドとして作用することによりタンパク質の精製を促進し得る。所望のペプチドが最終的に融合部分から分離され得るように融合部分の連結点にタンパク質分解性切断部位を導入し得る。タンパク質分解酵素には、以下に限定されないが、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロ酵素（ｅｎｔｅｒｏｅｎｚｙｍｅ）が含まれる。典型的な融合発現ベクターには、標的組み換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はプロテインＡを融合する、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ．）が含まれる。適切な誘導性の非融合Ｅ．コリ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５（１９８８））及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９（１９９０））が含まれる。
【０１４６】
タンパク質分解により組み換えタンパク質を切断する能力を宿主細胞が損なう遺伝的背景を与えることによって、宿主細菌において組み換えタンパク質発現を最大限にし得る（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｓ．、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８）。あるいは、特異的な宿主細胞、例えばＥ．コリに対して選択的なコドンをもたらすために、関心のある核酸分子の配列を変化させ得る（Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８（１９９２））。
【０１４７】
酵母において操作可能である発現ベクターによって、核酸分子を発現させることもできる。酵母、例えば、Ｓ．セレビシエにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｊａｎら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３（１９８７））及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
【０１４８】
例えばバキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において核酸分子を発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５（１９８３））及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９））が含まれる。
【０１４９】
本発明のある実施形態において、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において本明細書中に記載の核酸分子を発現させる。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５（１９８７））が含まれる。
【０１５０】
核酸分子を発現させるために有用である当業者にとって利用可能な周知のベクターのほんの一例として、本明細書中で列挙される発現ベクターが与えられる。当業者は、本明細書中に記載の核酸分子の維持増殖又は発現に適切なその他のベクターを知っている。これらは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前記箇所、で見出される。
【０１５１】
本発明はまた、本明細書中に記載のヌクレオチド配列がベクターに逆方向でクローニングされるが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にする調節配列へ操作可能に連結されるベクターも包含する。このようにして、コード及び非コード領域の両方を含め、本明細書中に記載の核酸分子配列の全て又は一部に対して、アンチセンス転写産物が産生され得る。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現と関連する上述のパラメータのそれぞれに影響を受ける（調節配列、構成的又は誘導性発現、組織特異性発現）。
【０１５２】
本発明は、本明細書中に記載のベクターを含有する組み換え宿主細胞にも関する。従って、宿主細胞には、原核細胞、下等な真核細胞（酵母など）、その他の真核細胞（昆虫細胞など）及び高等真核細胞（哺乳動物細胞など）が含まれる。宿主細胞には、以下に限定されないが、カイコ幼虫、ＣＨＯ細胞、Ｅ．コリ及び酵母が含まれ得る。
【０１５３】
当業者にとって容易に利用可能な技術により細胞に本明細書中に記載のベクターコンストラクトを導入することによって、組み換え宿主細胞を調製する。これらには、以下に限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション（遺伝子移入）、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、陽イオン脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション及びその他の技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記箇所、で見出されるものなど）が含まれる。
【０１５４】
宿主細胞は、複数のベクターを含有し得る。このようにして、同じ細胞の様々なベクターにおいて様々なヌクレオチド配列を導入し得る。同様に、単独で又はその核酸分子と関連のないその他の核酸分子（発現ベクターに対するトランス作用因子を与えるものなど）とともに、の何れかで、核酸分子を導入し得る。複数のベクターを細胞に導入する場合、ベクターを独立に導入するか、同時に導入するか又は核酸分子ベクターに連結し得る。
【０１５５】
バクテリオファージ及びウイルスベクターの場合、感染及び形質導入のための標準的手順によって、パッケージされるか又はカプセル封入されたウイルスとして細胞にこれらを導入し得る。ウイルスベクターは、複製可能であるか又は複製欠損性であり得る。ウイルス複製が欠損している場合、欠損を補完する機能を与える宿主細胞で複製が起こる。
【０１５６】
ベクターは、一般に、組み換えベクターコンストラクトを含有する細胞のサブ集団の選択を可能にする選択可能マーカーを含む。このマーカーは、本明細書中に記載の核酸分子を含有する同じベクター中に含有され得るか又は別個のベクター上にあり得る。マーカーには、原核宿主細胞に対するテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子及び真核宿主細胞に対するジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性が含まれる。しかし、表現型形質に対する選択を可能にする何らかのマーカーが有効である。
【０１５７】
適切な調節配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳動物細胞及びその他の細胞で成熟タンパク質が産生され得る一方、本明細書中に記載のＤＮＡコンストラクト由来のＲＮＡを用いてこれらのタンパク質を産生させるために細胞不含転写及び翻訳系も使用し得る。
【０１５８】
ペプチドの分泌が所望され、酵素などの複数膜貫通ドメイン含有タンパク質によって達成することが困難である場合、適切な分泌シグナルをベクターに組み込む。シグナル配列は、これらのペプチドにとって内在性であるかこれらのペプチドにとって異種性であり得る。
【０１５９】
ペプチドが培地に分泌されない場合、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、溶解剤の使用などを含む標準的破壊手順によって宿主細胞からタンパク質を単離し得る。次に、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィーを含む周知の精製法により、ペプチドを回収し、精製し得る。
【０１６０】
ある実施形態において、Ｅ．コリなどの細菌宿主細胞においてポリペプチドを発現させ、タンパク質を可溶化するためにグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）又は尿素などのカオトロピック剤を用いて宿主細胞に存在する封入体からタンパク質を抽出する。次に、ポリペプチドにおいて存在する融合タグ（例えば６ｘＨｉｓタグ）を介してクロマトグラフィーマトリクスなどの固相にポリペプチドを結合させる。夾雑物を除去するために固相を洗浄したら、カオトロピック剤の濃度勾配を適用することにより、固相に結合したままポリペプチドを好ましくは再び折り畳ませる（試薬の濃度が低下するにれてポリペプチドが再び折り畳まれる。）。発明者らは、この方法を用いることで、結果として均一アッセイにおいてレポーター断片が優れたインビトロ活性を有するようになることを見出した。
【０１６１】
本明細書中に記載のペプチドの組み換え産生における宿主細胞に依存して、ペプチドが様々なグリコシル化パターンを有し得、細胞によっては、細菌で産生される場合グリコシル化されない可能性があることも理解されたい。さらに、ペプチドは、宿主が介在するプロセスの結果、ある場合においては、最初の修飾メチオニンを含み得る。
【０１６２】
本明細書中に記載のペプチドを発現する組み換え宿主細胞には様々な用途がある。最初に、この細胞は、酵素タンパク質又は断片の所望の量を産生させるためにさらに精製され得る酵素タンパク質又はペプチドを産生させるのに有用である。このようにして、発現ベクターを含有する宿主細胞はペプチド産生にとって有用である。
【０１６３】
宿主細胞はまた、上述のものならびに当技術分野で公知のその他の形式など、酵素タンパク質又は酵素タンパク質断片を含む細胞を利用したアッセイを遂行するのにも有用である。このようにして、ネイティブ酵素タンパク質を発現する組み換え宿主細胞は、酵素タンパク質機能を刺激又は阻害する化合物をアッセイするために有用である。
【０１６４】
宿主細胞はまた、これらの機能が影響を受けている酵素タンパク質突然変異を同定するためにも有用である。この突然変異が天然のものであり、病原性を生じさせる場合、突然変異を含有する宿主細胞は、ネイティブ酵素タンパク質におけるそれらの影響により示され得ない突然変異酵素タンパク質における所望の効果（例えば、刺激又は阻害機能）を有する化合物をアッセイするために有用である。
【０１６５】
均一アッセイ
関心のある標的被分析物質の存在を調べるために、インビトロアッセイにおいて、本発明の、レポーター断片、ポリペプチド及びレポーター成分を使用することができる。関心のある被分析物質には、環境又は生体試料中に存在するものが含まれる。生体試料には、全血、血清、唾液及び尿が含まれる。「インビトロ」という用語は、この背景中で、細胞不含アッセイなど、生きている細胞の外でアッセイが行われることを意味する。
【０１６６】
本発明のアッセイ法は、通常、レポーター成分と試料を混合することと、関心のある被分析物質へのレポーター成分の結合が介在するレポーター断片／レポーター成分の会合の結果として得られる検出可能なシグナルの有無（又は程度）を調べることと、を含む。
【０１６７】
検出可能なシグナルは、例えば、比色シグナル、蛍光シグナル又は化学発光シグナルであり得る。例として、β−ラクタマーゼはニトロセフィンを切断して、黄色から赤への色の変化を生じさせ得る。ルシフェラーゼは、基質ルシフェリンにおいて作用して、化学発光シグナルを生じさせる。
【０１６８】
インビトロアッセイに必要とされるレポーターポリペプチドの量は、通常、インビボで見出されるものより多い。例えば、反応混合液中のレポートポリペプチドの濃度は、少なくとも１ｐＭ、例えば少なくとも１０又は１００ｐＭなど、又は１ｎＭであり得る。従って、レポーター複合体のメンバー間の自発的会合の可能性を低下させる反応混合液中に試薬を含むことが望ましいものであり得る。このような試薬には、カオトロピック剤／タンパク質変性剤、例えば尿素など（例えば２００から７００ｍＭの濃度、約５００ｍＭなど）、が含まれる。低濃度の尿素で酵素断片が部分的に変性し、それにより互いにそれらの天然の親和性（自然発生的相補性）が低下し、一方で、被分析物質により近接近へと方向付けされた場合（強制的相補性）、相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが、実施例１で特定された。
【０１６９】
バックグラウンドの低下／ノイズに対するシグナル比の増加を促進するために含まれることが望ましいものであり得るその他の試薬は、（ｉ）エタノールなどの溶媒（好ましくは２％から１０％ｖ／ｖ、例えば３％から８％ｖ／ｖなど）；イソプロパノール（好ましくは２％から１０％ｖ／ｖ、例えば３％から８％ｖ／ｖなど）；メタノール（好ましくは５％から１０％ｖ／ｖ）；ＤＭＳＯ（好ましくは１０％から２０％ｖ／ｖ）又はアセトニトリル（好ましくは２％から１０％ｖ／ｖ、例えば３％から８％ｖ／ｖなど）；（ｉｉ）ＢＳＡ；（ｉｉｉ）Ｔｗｅｅｎ−２０などの界面活性剤（例えば０．１％から０．２５％ｖ／ｖ又はＴｒｉｔｏｎＸ１００（好ましくは０．２％超、例えば０．２％から０．４％ｖ／ｖなど）；（ｉｖ）塩、例えばＮａＣｌ、Ｋ２ＳＯ４又は（ＮＨ４）２ＳＯ４；及び／又は（ｖ）イミダゾール（好ましくは５から２０ｍＭ、例えば５から１５ｍＭなど）である。
【０１７０】
本発明のレポーターポリペプチド及びレポーター成分は、インビトロ均一アッセイでの使用に限定されない。これらはまた、少なくとも１つのレポーター断片又はレポーター成分が固相に固定化されるインビトロ不均一アッセイでも使用され得る。これらは、適切な条件下で細胞においてレポーターポリペプチドの発現を支配することができる本発明のヌクレオチドコンストラクトで細胞に対して形質転換／遺伝子移入を行うことにより細胞に一般には導入されている成分とともにインビボアッセイでも使用され得る。
【０１７１】
キット
本発明はまた、キットとしてもレポーター断片及び／又はレポーター成分を提供する。試料中の被分析物質の存在及び／又は量を調べるためのインビトロアッセイなどＦＥＣアッセイに対してこのようなキットを使用し得る。キットは、本発明の１以上のレポーターポリペプチド断片及び／又はレポーター成分を含む。このキットは、通常、関心のある被分析物質の存在下で検出可能なシグナルを生成させることができる活性ポリペプチド複合体を一緒に形成することができるペアなど、本発明の複数のポリペプチド断片及び／又はレポーター成分を含む。
【０１７２】
キットはまた使用説明書も含み得る。その他の任意の成分には、緩衝液、標準物質、検出試薬などが含まれる。
【０１７３】
実施例
次の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。当業者にとって当然のことながら、続く実施例で開示される技術は、本発明の実施においてよく機能することが発明者により発見された技術を表し、従って、その実施に対して好ましい様式を構成すると考えられ得る。しかし、当業者は、本発明の開示に照らして、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において多くの変更がなされ得、依然として同様又は類似の結果が得られ得ることを認めよう。
【実施例１】
【０１７４】
２価陽イオンに対する均一インビトロＦＥＣアッセイ
本明細書中で概説される手順は、アミノ酸１９６／１９７で全長親酵素を分割し、次いで切断点末端でフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）を導入することにより生成されるＴＥＭ１断片の合成及び特性決定を述べる。疎水性相互作用及び凝集性を低下させ、タンパク質安定性を向上させるために、次のα断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）を使用して点突然変異を導入した。断片のアミノ酸配列に対するこれらの変化の結果、αＶ７４ＴＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．２）及びωＭ２１１Ｑ断片（ＰＢ１３：１）が得られた。
【０１７５】
フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）及びインタラクタードメイン（ポリヒスチジンタグ（６ｘＨ））を含むレポーター断片ペアメンバーを構築するために、これらのペプチド及びそれらをコードする核酸を使用した。フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）、ポリヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）及び点突然変異の位置を示すＤＮＡ配列データを提供する。これらの断片ペアメンバーを単離し、精製し、被分析物質の存在に関する操作可能な均一インビトロＦＥＣアッセイを構成するために使用した。
【０１７６】
α及びω断片をコードするＴＥＭ１遺伝子のＰＣＲ
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてｐＵＣ１８からＴＥＭ１βラクタマーゼをコードするｂｌａ遺伝子を増幅した。製造者の推奨に従い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．１１７０８−０２１）を用いて全ての増幅を行った。ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）からカスタムメードのオリゴヌクレオチドプライマーを購入した。フォワードプライマーＦＥＣ１６及びリバースプライマーＦＥＣ２７を用いて、Ｃ末端Ｇ４Ｓリンカー及びヒスチジンタグを有するＴＥＭ１のα断片を増幅した。
【０１７７】
フォワードプライマーＦＥＣ２４及びリバースプライマーＦＥＣ２９（表１参照−ＰＣＲ、配列決定及び突然変異誘発のために使用されるプライマーの説明のためのプライマー配列）を用いて、Ｎ−末端ヒスチジンタグ及びＧ４Ｓリンカーを有するＴＥＭ１のω断片を増幅した。ｐＥＴ−２６ｂ（＋）へのＰＣＲ産物のクローニングのために、フォワードプライマーの５’末端に目的ベクターＮｄｅＩ制限部位を組み込み、ＸｈｏＩ制限部位をリバースプライマーの５’末端に組み込んだ。
【０１７８】
１％ＴＡＥアガロースゲル上で各ＰＣＲ反応液４μＬアリコートを分析した（１００Ｖで３０分間）。
【０１７９】
【表１】
【０１８０】
ＰＣＲ産物の精製及びＥ．コリ宿主細胞へのクローニング
製造者の説明書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｃａｔ．２８１０４）を用いて反応チューブからＰＣＲ産物を直接精製した。
【０１８１】
ｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ．６９８６２−３）、Ｅ．コリでの組み換えタンパク質の誘導性発現を可能にする原核発現ベクターのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にＰＣＲ産物をクローニングした。製造者の説明書に従い、連結したプラスミドをＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ．２３０１３２）へと形質転換した。既に述べたようなＮｄｅＩ／ＸｈｏＩでの制限消化及びゲル電気泳動による消化産物の分析により、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター内のクローニング挿入配列の存在を確認するために各形質転換体からの５から１０個のコロニーをスクリーニングした。突然変異が起こっていることを確認するために、ＤＮＡ配列決定（プライマーＦＥＣ１０及びＦＥＣ１１−表１を用いて）によっても特定のクローンをチェックした。
【０１８２】
部位特異的突然変異誘発
製造者の説明書（Ｒｅｖ＃１２４００１ｅ）に記載のように、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ．２００５２２）を用いて、α断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）の部位特異的突然変異誘発を行った。Ｅ．コリのコドン使用頻度を考慮に入れて（ｗｗｗ．ｋａｚＵＳＡ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎでアクセス可能）、ベクターＮＴＩ９．０．０（２００３年９月２日）を用いて、配列操作及びプライマー設計を行った。プライマー（使用されるフォワード及びリバースプライマーの詳細な説明については表１を参照。）は、ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により、合成され、ＨＰＬＣを使用して精製された。
【０１８３】
簡潔に述べると、次のようなＰＣＲ増幅突然変異誘発反応において、鋳型として、既に述べたように単離し定量したα断片及びω断片プラスミドＤＮＡを使用した；１２５ｎｇフォワードプライマー（ＦＥＣ４７又はＦＥＣ４９）、１２５ｎｇリバースプライマー（ＦＥＣ４８又はＦＥＣ５０）、１ｘ反応緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ混合液、３μＬ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ及び超純水に、２５ｎｇ鋳型ＤＮＡを５０μＬの最終体積まで添加した。次に１μＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）を添加し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ勾配サーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で温度サイクルを行った。Ｖ７４Ｔ及びＭ２１１Ｑ点突然変異の導入のために、次のようにＰＣＲサイクルを行った；９５℃ｘ１分で変性及び、９５℃ｘ５０秒（変性）、６０℃ｘ５０秒（アニーリング）及び６８℃ｘ６分（伸長）を１８サイクル、サイクル完了時に６８℃ｘ６分の最終伸長段階。Ｍ１８２Ｔ突然変異の導入のためのＰＣＲサイクル条件は少し異なり、鋳型としてαＶ７４Ｔ断片を用い、それぞれＦＥＣ５５及びＦＥＣ５６フォワード及びリバースプライマーを用いて、６５℃ｘ５０秒でアニーリングを行った。続いて、非突然変異親ＤＮＡを消化するために、ＰＣＲ増幅された突然変異誘発反応物を１μＬ ＤｐｎＩ制限酵素（１０Ｕ／μＬ）（各反応に直接添加）で消化し、３７℃で１時間温置した。次に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キットの製造者の説明書（Ｒｅｖ＃１２４００１ｅ）で概説されるようにＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｕｌｔｒａコンピーテント細胞を形質転換するために、各試料反応液からのＤｐｎＩ処理ＤＮＡ ２μＬを使用した。既に概説されているように、点突然変異の正しい挿入を確認するために、得られたプラスミドＤＮＡの配列決定を行ってＥ．コリ形質転換体をスクリーニングした。次に、タンパク質発現及び精製に対して述べられているように、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞を形質転換するために、所望の突然変異を組み込んでいるプラスミドＤＮＡを使用した。
【０１８４】
これらの点突然変異の導入の結果、断片の溶解性が向上し、最終産物の凝集性が低下し、これらは、均一インビトロＦＥＣアッセイならびに製造プロセスでの使用に非常に有利である（例えば表２）。
【０１８５】
【表２】
【０１８６】
α及びω断片の精製及び特性決定
下記で述べるように、触媒作用の速度及びＮｉとの強制的酵素相補性におけるノイズに対するシグナル比を直接比較するために、同様にして、全ての４つの酵素断片［α断片（ＰＢ１１）、ω断片（ＰＢ１３）、αＶ７４ＴＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．２）及びωＭ２１１Ｑ断片（ＰＢ１３．１）］を発現させ、精製し、特性決定を行った。
【０１８７】
α断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）の発現
次のようにＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）での断片の発現を行った；カナマイシン５０μｇ／ｍＬを添加したＬＢブロス１０ｍＬに関心のある１個のコロニーを接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら液体培地を一晩（〜１４時間）３７℃で温置した。次に、２Ｌコニカルフラスコ中のカナマイシン５０μｇ／ｍＬを添加した２５０ｍＬ Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ．７１４９１−４）に接種するために、この培養物を使用した。２５０ｒｐｍで一晩振盪しながら、３７℃で２４時間、この培養物を温置した。ここで使用したＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ培地により、高細菌密度でのタンパク質発現の自己誘導が可能となる（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｕｓｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＴＢ３８３ Ｒｅｖ．Ｆ０５０５を参照）。細菌培養物が静止期に到達すると最適タンパク質発現が起こるが、これは、６００ｎｍで行った光学密度読み取りに基づき、２４時間以内に起こることが分かった。続いて、３，２２０ｘｇで３０分間（４℃）、細胞を沈殿させ、上清を廃棄した。タンパク質精製まで−２０℃で細胞ペレットを保存した。
【０１８８】
変性条件下での組み換えタンパク質の抽出
［６Ｍ ＧｕＨＣｌ １００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８］２５ｍＬ中で、一晩誘導した２５０ｍＬからのペレットを溶解し、続いて１００ｒｐｍで振盪しながら、４℃で１時間温置した。溶解を促進するために、Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクルで懸濁液を超音波処理した。超音波処理後、１２，０００ｘｇで３０分間（４℃）溶解液を遠心し、次いで細胞残屑を除去するために０．２μｍフィルターに通した。
【０１８９】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＲａｄ ｃａｔ．７６０−００３７）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換えＨｉｓタグ付加タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で、８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ １０カラム体積（ＣＶ）によりＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。次に、０．５ｍＬ／分でモデルＥＰ−１ Ｅｃｏｎｏｐｕｍｐ（ＢｉｏＲａｄ ｃａｔ．７３１−８１４２）を使用して、透明化したＥ．コリ溶解液をカラムに載せた。８Ｍ 尿素 １００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．３ １０ＣＶでカラムを洗浄した。１ｍＬ／分の、８Ｍ 尿素 １００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ２００ｍＭ Ｌ−アルギニン １００μＭ ＧＳＳＧ ｐＨ７．５から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ２００ｍＭ Ｌ−アルギニン １００μＭ ＧＳＳＧ ｐＨ７．５ ６０ＣＶ勾配で、結合タンパク質を再び折り畳ませた。２５０ｍＭイミダゾール ５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ゲルろ過及び質量分析により分析した。
【０１９０】
変性断片のカラム上再折り畳みがβ−ラクタマーゼのα及びω断片（野生型及び突然変異があるもの）の両方の産生において非常に効果的であることが分かった。この方法は、ネイティブ物質の精製法を凌ぐ利点があり、大規模の製造プロセスに適切である。
【０１９１】
ゲルろ過
場合によって、酵素断片のアフィニティー精製後、ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＲａｄ Ｃａｔ．７６０−００３７）の制御下で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５１７５−０１）を用いて、プール溶出物をサイズ排除クロマトグラフィーに供した。精製酵素断片のさらなる精製（夾雑タンパク質の除去）又はカラム上での再折り畳み後の凝集酵素断片に対する単量体の割合の決定の何れかのために、ゲルろ過を使用した。プロトコールは次のとおりである：０．６ｍＬ／分での５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７ ２ＣＶによる平衡化；０．６ｍＬ／分での試料２５０−５００μＬの注入；及び０．６ｍＬ／分での５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７ １ＣＶの定組成フロー。典型的な結果については図７参照。
【０１９２】
質量分析
Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、ＡｕｓｔｒａｌｉａのＨＰＬＣ／ＴＯＦ質量分析サービスを利用してゲルろ過精製されたα及びω断片の分子量を調べた。個々の実験データを回収し、理論的分子量値との比較のために分析した。
【０１９３】
酵素断片相補性
動態研究のために６−ヒスチジン−タグを含有する精製α及びω断片を使用して、ノイズ（Ｎｉ２＋なしでの自発的酵素相補性）に対するシグナル（Ｎｉ２＋強制的酵素相補性）比を計算した。強制的酵素相補性のノイズに対するシグナル比を調べ、評価するために、様々な基質、緩衝添加物及び阻害剤を使用した。本発明のα及びω断片の等モル量を用いたある実施形態における代表的な結果は、図８及び図９で与える。
【０１９４】
ニトロセフィン活性アッセイ
ニトロセフィン（Ｍｅｒｃｋ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）は、β−ラクタム環の加水分解後黄色から赤（ＯＤ４９２）に色を変化させるＴＥＭ−１β−ラクタマーゼの比色基質である。ゆえに、酵素断片相補性の酵素活性を評価するためにニトロセフィンアッセイを行った。９６ウェル平底細胞培養プレート（ＴＰＰ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてアッセイを行った。５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）ｐＨ７中で２００又は６００μＭのニトロセフィン保存溶液を調製した。各２００μＬの反応液に対して、ニトロセフィン保存液１００μＬを５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７中の酵素断片１００μＬ（Ｎｉ２＋あり又はなし）に添加した。必要とされる最終的シグナルに依存して、使用されたウェルあたりの酵素断片の濃度は４０ｎＭから２００ｎＭの範囲であり、Ｎｉ２＋被分析物質の最終濃度は１００μＭ又は２００μＭであった。ピペッティングによりアッセイ成分をよく混合し、室温で５分間温置した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０を用いてニトロセフィン加水分解の動態を４９２ｎｍで読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）。
【０１９５】
様々な緩衝添加物の影響
強制α及びω断片相補性のノイズに対するシグナル比を向上させるために、溶媒、ＢＳＡ、界面活性剤、タンパク質変性剤及び塩などの様々な緩衝添加物の影響を調べた。停止溶液タゾバクタムも調べた。本明細書中に記載のようにアッセイを行った。
【０１９６】
溶媒
低濃度の溶媒は酵素断片を部分的に変性させ得るので、少量のエタノール、イソプロパノール、メタノール、ＤＭＳＯ及びアセトニトリルが、天然の断片相補性を低下させ、ノイズに対するシグナル比を上昇させるか否かを調べた。試験した各溶媒の最終濃度は、１５％、７．５％、３．７５％、１．８７５％、０．９８７５％及び０％であった。４９２ｎｍで３０分間、相補性アッセイの動態を読み取った。次に、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏからの最大速度（ｍＯＤ分−１）に照らしてシグナル／ノイズ比を計算した。最適な、ノイズに対するシグナル比が、それぞれ３．７５％、３．７５％、７．５％、１５％及び３．７５％の濃度の、エタノール、イソプロパノール、メタノール、ＤＭＳＯ及びアセトニトリルで達成されることが分かった。例えば、最終濃度でのエタノールの効果は、１５％、７．５％、３．７５％、１．８７５％及び０％の範囲であり、シグナル／ノイズ比はそれぞれ７．１、８．４、８．５、５．４及び３．７であった。
【０１９７】
溶媒のある範囲の濃度で酵素断片が部分的に変性し、それにより互いに対するその天然の親和性（自発的相補性）が低下する一方で、Ｎｉ２＋被分析物質（強制的相補性）により近接近に向かわせられた場合に相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが分かった。
【０１９８】
ＢＳＡ
ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）はタンパク質安定化剤として広く使用されており；ＢＳＡを使用することで、２つの断片の密接な接触を妨害することにより天然の断片の相補性の阻止が促進され、シグナル／ノイズ比が上昇し得る。最終濃度範囲（ｍｇ／ｍＬ）は、０．６、０．３、０．１５、０．０７５、０．０３７５、０．０１８７５及び０であった。読み取りデータ回収時間は３０分であった。次に、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏからの最大速度（ｍＯＤ／分）により、シグナル／ノイズ比を計算した。ＢＳＡを添加することにより、シグナル及びバックグラウンドの両方が上昇したので、最終的シグナル／ノイズ比は顕著には変化しなかったが、シグナル出力はほぼ２倍増幅された。ＢＳＡが、シグナル及びバックグラウンドの両方を増幅するために、アッセイ溶液中で込み合い効果を与えることが分かった。
【０１９９】
界面活性剤
界面活性剤は、タンパク質−タンパク質相互作用又はＥＬＩＳＡバックグラウンドを減少させるために広く使用され；少量を使用することにより、２つの断片を離しておくことによって天然の断片相補性の阻止が促進され得、シグナル／ノイズ比が上昇する。Ｔｗｅｅｎ−２０及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を使用し、最終濃度範囲は、０．３％、０．１５％、０．０７５％、０．０３７５％、０．０１８７５％及び０％であった。読み取りデータ回収時間は３０分であった。次に、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏからの最大速度（ｍＯＤ分−１）に照らして、シグナル／ノイズ比を計算した。
【０２００】
それぞれ０．１５％及び０．３％の濃度のＴｗｅｅｎ−２０及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で最適な、ノイズに対するシグナル比が達成されることが分かった。例えば、０．３％、０．１５％、０．０７５％、０．０３７５％、０．０１８７５％及び０％からの最終濃度範囲で試験したＴＸ−１００の効果において、シグナル／ノイズ比は、それぞれ１４．１、６．９、３．８、２．７、１．８及び３．９であった。界面活性剤濃度が上昇すると活性が低下することに注意すること。
【０２０１】
界面活性剤のある範囲の濃度で酵素断片が部分的に変性し、それにより互いに対するその天然の親和性（自発的相補性）が低下する一方で、Ｎｉ２＋被分析物質（強制的相補性）により近接近に向かわせられた場合に相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが分かった。
【０２０２】
変性剤
酵素断片相補性におけるタンパク質変性剤の効果を試験するために、尿素又はグアニジン塩酸塩の存在下で、断片、基質及びＮｉＳＯ４濃度のマトリクスを使用してニトロセフィン活性アッセイを行った。予備アッセイにおいて、２Ｍから６２．５ｍＭの範囲の尿素濃度及び１Ｍから３１．２５ｍＭの範囲のＧｕＨＣｌ濃度で４０ｎＭ断片の相補性を試験した。アッセイを次のように準備した：尿素［２Ｍ尿素、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７から６２．５ｍＭ 尿素、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７］又はグアニジン塩酸塩［１Ｍ ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７から３１．２５ｍＭ ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７］の連続２倍希釈液に各断片４０ｎＭを添加した（２回ずつ試験）。第一セットのウェルに１００μＭの最終濃度までＮｉＳＯ４を添加し、一方で第二セットのウェルにはＮｉＳＯ４は添加しなかった。プレートを５分間温置し、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘリーダーを用いて４９２ｎｍで動態の読み取りを行った。最適な、ノイズに対するシグナル比が０．５Ｍの濃度の尿素で達成されることが分かり、低バックグラウンドで可能な最大のシグナルを達成するために、続く実験において断片の量を２００ｎＭまで増加させ、ＮｉＳＯ４及び基質濃度をそれぞれ２００μＭ及び３００μＭまで増加させた。
【０２０３】
低濃度の尿素で酵素断片が部分的に変性し、それにより互いに対するその天然の親和性（自発的相補性）が低下する一方で、Ｎｉ２＋被分析物質（強制的相補性）により近接近に向かわせられた場合に相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが分かった。
【０２０４】
塩
静電効果は、酵素触媒作用及びタンパク質−タンパク質相互作用の両方において重要な機能を有し、様々な塩を使用してこれらの効果が調節されるか又は変化し得る。強制的酵素相補性におけるその影響について３種類の異なる塩：ＮａＣｌ、Ｋ２ＳＯ４及び（ＮＨ４）２ＳＯ４を試験した。アッセイを次のように準備した：ＮａＣｌ［２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７から６２．５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７］、Ｋ２ＳＯ４［０．４Ｍ Ｋ２ＳＯ４、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７から２５ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７］又は（ＮＨ４）２ＳＯ４［０．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７から５０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７］の連続２倍希釈液に各断片４０ｎＭを添加した（２回ずつ試験）。第一セットのウェルにＮｉＳＯ４ １００μＭを添加し、一方で第二セットにはＮｉＳＯ４は添加しなかった。プレートを５分間温置し、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ１９０リーダーを用いて４９２ｎｍで動態の読み取りを行った。
【０２０５】
ＦＥＣアッセイに塩を添加することにより、シグナル及びバックグラウンドの両方が上昇したので、最終的シグナル／ノイズ比は顕著には変化しなかったが、シグナル出力が増幅された。
【０２０６】
イミダゾール
ヒスチジンタグ付加タンパク質精製（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）において、洗浄緩衝液として少量（２０ｍＭ）のイミダゾール（ＩＣＮ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用したが、イミダゾールは、断片表面のヒスチジン相互作用を妨害することによって天然の断片相補性を妨げ、シグナル／ノイズ比の上昇を促進し得る。イミダゾール最終濃度の範囲は、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ及び０ｍＭであった。読み取りデータ回収時間は３０分であった。次に、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏからの最大速度（ｍＯＤ分−１）に照らして、シグナル／ノイズ比を計算した。
【０２０７】
それぞれ１２．５ｍＭの濃度のイミダゾールで最適な、ノイズに対するシグナル比が達成されることが分かった。例えば、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、６．２５ｍＭ及び０ｍＭからの最終濃度範囲でのイミダゾールの効果、シグナル／ノイズ比はそれぞれ０．８、２．１、３．７、５．３、５．２及び４．０であった。イミダゾール濃度が上昇すると活性が低下することに注意すること。
【０２０８】
イミダゾールのある範囲の濃度において、互いに対するその天然の親和性（自発的相補性）が低下する一方で、Ｎｉ２＋被分析物質により近接近に向かわせられた場合（強制的相補性）に相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが分かった。
【０２０９】
停止溶液（タゾバクタム）
（Ｓｉｇｍａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）は、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼに対する最も効果的な阻害剤の１つであり、ＩＣ５０が２０−５０ｎｍであることが報告されている。タゾバクタムのＩＣ５０は、５０ｎＭの濃度で、全長及び相補断片において社内で計算された。従って、２５から５０μＭ（ＩＣ５０より５００−１０００倍大きい。）の間のタゾバクタム最終濃度は、ＯＤ４９２の値を変化させることなく速やかに反応を停止させるのに十分であるはずである。阻害の有効性を試験するために、タゾバクタム２５又は５０μＭを使用し、０．５から３時間、タゾバクタム添加後のＯＤ４９２値の連続モニタリングを行った。得られたＯＤ４９２の変化を比較し、評価した。
【実施例２】
【０２１０】
抗ヒスチジンモノクローナル抗体に対する均一インビトロＦＥＣアッセイ
ここで概説する手順は、切断点末端において長いフレキシブルリンカー［（Ｇ４Ｓ）３］及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）を組み込むα断片（ＰＢ１１．４）及びω断片（ＰＢ１３．２）の合成及び特性決定を説明する。ＤＮＡ配列データにより、長いリンカー［（Ｇ４Ｓ）３］及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）の存在が確認された。均一インビトロ方式アッセイにおいて抗体（ヒスチジンタグに結合するペンタ−ヒスチジンモノクローナル抗体）との強制的酵素相補性を示すために、この断片ペアを使用した。
【０２１１】
部位特異的突然変異誘発
既存のコンストラクト（既にその切断点末端に５アミノ酸のフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）を含有する。）にさらなる１０アミノ酸リンカー［（Ｇ４Ｓ）２］を導入するために、α（ＰＢ１１）及びω（ＰＢ１３）断片のＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発を行い、１５アミノ酸長のリンカーを作製した（ＰＣＲプライマー配列は表１で与える。）。
【０２１２】
簡潔に述べると、長いリンカーを有するα断片（ＰＢ１１．４）を作製するために、５０μＬの最終体積になるように、１２５ｎｇフォワードプライマー（ＦＥＣ６７）、１２５ｎｇリバースプライマー（ＦＥＣ６８）、１ｘ反応緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ混合液、３μＬ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ及び超純水に鋳型ＤＮＡ２５ｎｇを添加した。次に、１μＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）を添加し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ勾配サーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で温度サイクルを行った。次のようにＰＣＲサイクルを行った；９５℃ｘ１分で変性及び、９５℃ｘ５０秒（変性）、６０℃ｘ３０秒（アニーリング）、６５℃ｘ３０秒（アニーリング）及び６８℃ｘ１０分（伸長）を２５サイクルと、サイクル完了時に６８℃ｘ６分で最終伸長段階。
【０２１３】
長いリンカーを有するω断片（ＰＢ１３．２）を作製するために、５０μＬの最終体積になるように、１２５ｎｇフォワードプライマー（ＦＥＣ７５）、１２５ｎｇリバースプライマー（ＦＥＣ７６）、１ｘ反応緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ混合液、３μＬ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ及び超純水に鋳型ＤＮＡ５０ｎｇを添加した。次に、１μＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）を添加し、次のようにＰＣＲサイクルを行った；９５℃ｘ１分で変性及び、９５℃ｘ５０秒（変性）、６０℃ｘ３０秒（アニーリング）、６５℃ｘ１５秒（アニーリング）及び６８℃ｘ１０分（伸長）を２５サイクルと、サイクル完了時に６８℃ｘ７分で最終伸長段階。
【０２１４】
上述のように１μＬ ＤｐｎＩでＰＣＲ増幅突然変異誘発反応物を消化した。製造者の説明書に従い、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ．２３０１３２）を形質転換するために、ＤｐｎＩ処理したＰＢ１１．４ ＤＮＡ及びＤｐｎＩ処理したＰＢ１３．２ ＤＮＡを使用した。既に概説したように、長いリンカーの正しい挿入を確認するために、得られたプラスミドＤＮＡの配列決定を行ってＥ．コリ形質転換体をスクリーニングした（プライマー ＦＥＣ１０及びＦＥＣ１１−表１を用いて）。
【０２１５】
酵素断片相補性
上記で概説したように、酵素断片を発現させ、精製し、特性を調べた。ノイズ（Ａｂなしでの自発的酵素相補性）に対するシグナル（Ａｂ強制的酵素相補性）比を計算するための動態実験のために、１５アミノ酸の長いフレキシブルリンカー及びペンタ−ヒスチジンモノクローナル抗体（Ａｂ）に結合し得る６−ヒスチジンタグを含有する精製α及びω断片を使用した。
【０２１６】
Ａｂ強制ＦＥＣアッセイの酵素活性を測定するために、ニトロセフィン加水分解を使用した。９６ウェル平底細胞培養プレート（ＴＰＰ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてアッセイを行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）プレートリーダーを用いてニトロセフィン加水分解を４９２ｎｍで読み取った。簡潔に述べると、２００μＬの反応体積中０．５Ｍ尿素、０．６２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１２．５ｍＭ Ｌ−アルギニン、６．２５μＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７中でα（ＰＢ１１．４）及びω（ＰＢ１３．２）断片２０ｎＭ及び３３ｎＭ Ｈｉｓ−Ｔａｇモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ．７０７９６−３）を希釈し、室温で２０分間温置した。次に、反応溶液にニトロセフィン（ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍＬ、２μＬ）を添加し、１時間にわたりプレートリーダーを用いて４９２ｎｍで監視した。
【０２１７】
本発明のα及びω断片の等モル量を使用する代表的な実施形態の結果を図６で与える。
【０２１８】
図６で、均一インビボＦＥＣが、３３ｎＭの濃度でモノクローナル抗体（１５０ｋＤａ）などの大きな被分析物質をうまく検出することができることが示される。Ａｂ濃度のＫＤが１８．４３ｎＭであることがさらに分かった。
【実施例３】
【０２１９】
β−ラクタマーゼＴＥＭ１阻害剤耐性強制的酵素相補性（ＦＥＣ）均一アッセイ
この実施例中で概説する手順は、アミノ酸１９６／１９７で全長親酵素を分割し、続いて切断点末端にフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）を導入することにより作製されるＴＥＭ１断片の合成及び特性決定を説明する。β−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性を向上させるために、次のα断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）を使用して点突然変異を導入し、結果としてαＭ６９ＬＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１２）及びωＮ２７６Ｄ断片（ＰＢ１３．３）が得られた。ＤＮＡ配列データにより、フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）ヒスチジンタグ（６ｘＨ）及び点突然変異の存在を確認した。β−ラクタマーゼ阻害剤の存在下で、被分析物質（Ｎｉ２＋）を用いて強制的酵素相補性を示すために、これらの断片ペアを使用した。
【０２２０】
部位特異的突然変異誘発
ＰＢ１１．１（αＭ６９Ｌ）、ＰＢ１１．１２（αＭ６９ＬＭ１８２Ｔ）、ＰＢ１１．１３（αＭ６９ＩＭ１８２Ｔ）及びＰＢ１３．３（ωＮ２７６Ｄ）コンストラクトを作製するために、α（ＰＢ１１）及びω（ＰＢ１３）断片の部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発を行った。
【０２２１】
簡潔に述べると、α及びω断片プラスミドＤＮＡを単離し、実施例１に記載のように定量し、次のようにＰＣＲ増幅突然変異誘発反応において鋳型として使用した：５０μＬの最終濃度になるように、１２５ｎｇフォワードプライマー（ＦＥＣ５５、ＦＥＣ１４３、ＦＥＣ１４５又はＦＥＣ１４７）、１２５ｎｇリバースプライマー（ＦＥＣ５６、ＦＥＣ１４４、ＦＥＣ１４６又はＦＥＣ１４８）、１ｘ反応緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ混合液、３μＬ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ及び超純水に鋳型ＤＮＡ２５ｎｇを添加した。次に、ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）を添加し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ勾配サーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で温度サイクルを行った。Ｍ６９Ｌ、Ｍ６９Ｉ及びＮ２７６Ｄ点突然変異の導入のために、ＰＣＲサイクルを次のように行った：９５℃ｘ１分で変性、及び９５℃ｘ５０秒（変性）、６０℃ｘ５０秒（アニーリング）及び６８℃ｘ６分（伸長）を１８サイクルと、サイクル完了時に６８℃ｘ６分で最終伸長段階。Ｍ１８２Ｔ突然変異の導入に対するＰＣＲサイクル条件は僅かに変化し、鋳型としてαＭ６９Ｌ及びαＭ６９Ｉ断片を、及びＦＥＣ５５及びＦＥＣ５６フォワード及びリバースプライマーをそれぞれ用いて６５℃ｘ５０秒でアニーリングを行った。続いて、非突然変異親ＤＮＡを消化するために、各反応物に１μＬ ＤｐｎＩ制限酵素（１０Ｕ／μＬ）を直接添加して３７℃で１時間温置し、ＰＣＲ増幅突然変異誘発反応物を消化した。次に、ＱｕｉｘｋＣｈａｎｇｅＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キットの製造者の説明書（Ｒｅｖ＃１２４００１ｅ）で概説されるように、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ ＵＬＴＲＡコンピーテント細胞を形質転換するために、各試料反応物からのＤｐｎＩ処理ＤＮＡ２μＬを使用した。点突然変異の正しい挿入を確認するために、得られたプラスミドＤＮＡの配列決定を行い、既に概説したようにＥ．コリ形質転換体をスクリーニングした。
【０２２２】
次に、タンパク質発現及び精製について記載されるように、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞を形質転換するために、所望の突然変異を組み込むプラスミドＤＮＡを使用した。
【０２２３】
α及びω断片の精製及び特性決定
β−ラクタマーゼ阻害剤の非存在下及び存在下でのその動態特性を直接比較し、下記のようにＮｉ２＋（被分析物質）を用いて強制的酵素相補性におけるノイズに対するそのシグナル比を決定するために、同様にして、全ての６種類の酵素断片［α（ＰＢ１１）、αＭ６９Ｌ（ＰＢ１１．１１）、αＭ６９ＬＭ１８２Ｔ（ＰＢ１１．１２）、αＭ６９ＩＭ１８２Ｔ（ＰＢ１１．１３）、ω（ＰＢ１３）及びωＮ２７６Ｄ（ＰＢ１３．３）］を発現させ、精製し、特性決定した。
【０２２４】
α及びω断片の発現
実施例１に記載のようにＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）における断片の発現を行った。
【０２２５】
変性条件下での組み換えタンパク質の抽出
溶解緩衝液（α断片に対して６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８又はω断片に対して６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）１０ｍＬ／ｇ（ペレット湿重量）中で、一晩誘導した２５０ｍＬからのペレットを溶解し、続いて１００ｒｐｍで振盪しながら４℃にて１時間温置した。溶解を促進するために、Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクルで懸濁液を超音波処理した。超音波処理後、１２，０００ｘｇで３０分間（４℃）溶解液を遠心し、次いで細胞残屑を除去するために０．２μｍフィルターに通した。
【０２２６】
α断片の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換えＨｉｓタグ付加タンパク質を精製した。勾配緩衝液（８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ８）１０カラム体積（ＣＶ）で１ｍＬ／分の流速でＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分での、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ８から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８の５０カラム体積（ＣＶ）勾配にわたり結合タンパク質を再び折り畳ませた。２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶでカラムから夾雑タンパク質を洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８の１０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ゲルろ過及び質量分析により分析した。
【０２２７】
ω断片の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換えＨｉｓタグ付加タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で勾配緩衝液１０ＣＶ（８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５）でＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ 尿素 １００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５の５０ＣＶ勾配にわたり結合タンパク質を再び折り畳んだ。２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶで夾雑タンパク質をカラムから洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８の１０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ゲルろ過及び質量分析により分析した。
【０２２８】
酵素断片相補性
動態研究のためにＮｉ２＋に結合することができる６−ヒスチジン−タグを含有する精製α及びω断片を使用して、ノイズ（Ｎｉ２＋なしでの自発的酵素相補性）に対するシグナル（Ｎｉ２＋強制的酵素相補性）比を計算した。強制的酵素相補性のノイズに対するシグナル比を調べ、評価するために、様々な基質、緩衝添加物及び阻害剤を使用した。
【０２２９】
ニトロセフィン活性アッセイ及びパネル血清スクリーニング
１９０μＬ反応混合液にニトロセフィン（１００％ＤＭＳＯ中で調製した４ｍＭ保存溶液の１０μＭ）を添加し、０．７５Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ＰＨ７、各酵素断片（α及びω）１０−２０ｎＭ及び適切な場合には２００μＭ Ｎｉ２＋の最終濃度にした。ピペッティングによりアッセイ成分をよく混合し、基質添加前に室温で５分間温置した。３０分間の時間枠にわたり、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いてニトロセフィン加水分解の速度を４９２ｎｍで測定した。血清アッセイの場合、Ｎｉ２＋ではなく、１／２００の最終希釈での血清を添加し、上記のように５０検体の個々の血清のパネルをスクリーニングした。血清アッセイの最終濃度は次のとおりであった：各α及びω断片１０ｎＭを添加して、０．６Ｍ尿素、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７。適切な場合には、血清アッセイに１．１μＭ タゾバクタム及び２．８μＭ タゾバクタムを添加した［静脈内タゾバクタム投与後の２ｘ及び５ｘ予想Ｃｍａｘ血清濃度（Ｗｉｓｅ、Ｒ．、Ｍ．Ｌｏｇａｎら、１９９１、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３５（６）：１０８１−４）。
【０２３０】
阻害剤耐性突然変異の酵素反応速度
次を例外として、上述のようにＮｉ２＋を用いた活性アッセイを行った：ニトロセフィン（０ｍＭから１．６ｍＭの範囲の最終基質濃度とするための様々な連続希釈液１００μＬ）を反応混合液１００μＬ（尿素なし）に添加した。室温で１０分間にわたりＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０を用いて４９２ｎｍで反応を監視することにより、ニトロセフィン加水分解を測定した。基質濃度に対して反応初速度（最初の１０回の読み取り、ｍＯＤ／分）をプロットし、各α及びω断片ペアに対してＫｍ及びＫｃａｔを決定した。Ｎｉ２＋アッセイにおいて阻害剤ＩＣ５０値を決定するために、各阻害剤の連続希釈液を含有する反応混合液にニトロセフィン（１００％ＤＭＳＯ中の２ｍＭ ニトロセフィン１０μＬ）を添加し、２００μＬの最終体積中５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７、１０μＭ タゾバクタム（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ｔ２８２０）、０−１００μＭスルバクタム（Ｍｏｌｅｋｕｌａ Ｐｒｏｄ＃１９５９０２９９）又は０−１００μＭクラブラン酸（Ｍｏｌｅｋｕｌａ Ｐｒｏｄ＃８７６４４０４８）、各α及びω断片２５ｎＭ、１００μＭニトロセフィン及び２００μＭ Ｎｉ２＋の最終濃度を得た。室温で１０分間、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０を用いて４９２ｎｍでニトロセフィン加水分解の速度を測定した。次に、各阻害剤濃度に対して反応初速度（最初の１０回の読み取り、ｍＯＤ／分）をプロットし、各α及びω断片ペアに対して阻害剤ＩＣ５０を決定した。
【０２３１】
結果
【０２３２】
【表３】
【０２３３】
【表４】
【０２３４】
これらの結果から、上記の突然変異を組み込むβ−ラクタマーゼ断片が阻害剤に対する耐性を向上させたことが分かった。これらの知見は、血清試料中のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ ＩｇＧの検出のための均一インビトロＦＥＣアッセイにおいて使用しようとする次のβ−ラクタマーゼ断片にも当てはまる（実施例４）。
【実施例４】
【０２３５】
患者血清における疾患特異的ＩｇＧの検出のためのβ−ラクタマーゼＴＥＭ１阻害剤耐性強制的酵素相補性（ＦＥＣ）アッセイ
実施例１、２及び３は、アミノ酸１９６／１９７で全長親酵素（ＰＢ３）を分割し、続いて切断末端にフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）を導入することにより作製されるＴＥＭ１断片の合成及び特性決定を説明する。β−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性を向上させるために、次のα断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）を使用して点突然変異を導入し、結果として、αＭ６９Ｌ断片（ＰＢ１１．１１）、αＭ６９ＬＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１２）、αＭ６９Ｍ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１３）及びωＮ２７６Ｄ断片（ＰＢ１３．３）が得られた。ＤＮＡ配列データから、フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）ヒスチジンタグ（６ｘＨ）及び点突然変異の存在が確認された。β−ラクタマーゼ阻害剤（抗生物質を投与されている患者の血清中に存在する可能性がある。）存在下で被分析物質（ヒスチジンタグに結合するＮｉ２＋、Ｚｎ２＋又は６ｘＨモノクローナル抗体）との強制的酵素相補性（ＦＥＣ）を明らかにするために、これらの断片ペアを使用した。
【０２３６】
この実施例において、患者血清中の疾患特異的ＩｇＧ抗体の検出のために、被分析物質結合部分（ＨＳＶ−１短縮型抗原、ＨＳＶ−２短縮型抗原及びタンパク質−Ｇサブユニット）に酵素断片を融合させた。
【０２３７】
方法
ＤＮＡコンストラクト
この実験で使用されるβ−ラクタマーゼコンストラクトの概略図を図２０で示す。全てのプラスミドの構築のために使用される対応するオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）を表５で列挙する。ＰＡＮ１及びＰＡＮ２プライマーを用いたｐＵＣ１８ Ｂｌａ遺伝子のＰＣＲ増幅によって、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ付加（ＣＨｉｓ）全長β−ラクタマーゼ（Ｎ末端分泌配列を含まない。）を発現する第一のコンストラクトを作製した。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩでＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ）に連結して、ｐＥＴ−ＢＬを得た。鋳型としてこのコンストラクトを使用して、Ｇ４Ｓリンカーを介して融合されたＣＨｉｓタグを有するＢＬα（残基２５−１９６）；及びＮ末端ヘキサヒスチジンタグを有するＢＬω（残基１９７−２９０）（これもＧ４Ｓリンカーを介して連結）の発現のためのｂｌａ遺伝子の２つの隣接領域を増幅するためにＰＡＮ１／ＰＡＮ３及びＰＡＮ４／ＰＡＮ５を使用した。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで各ＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）に連結して、ｐＥＴ−ＢＬα及びｐＥＴ−ＢＬωを得た。将来のコンストラクトのために前駆体として使用するために、ｐＥＴ−ＢＬα及びｐＥＴ−ＢＬωの両方に、より長い（Ｇ４Ｓ）３リンカーを発現する配列を組み込み、ｐＥＴ−ＢＬα（Ｇ４Ｓ）３及びｐＥＴ−ＢＬω（Ｇ４Ｓ）３を得た。それぞれプライマーＰＡＮ６／ＰＡＮ７及びＰＡＮ８／ＰＡＮ９を使用して、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キット）によりこれらを導入した。
【０２３８】
３つの異なるタイプの被分析物質結合部分：糖タンパク質Ｇ１（ｇＧ１；ＨＳＶ−１抗原；図１９ｂ）又は糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２；ＨＳＶ−２抗原；図１９ｂ）の何れかのエピトープを含むペプチド及びプロテインＧ（ＰｒｏＧ）のＣ２ドメインを有するようにβラクタマーゼの続く断片を改変した。作製された第一の２つのＤＮＡコンストラクトは、ＨＳＶ−１（ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ１）又はＨＳＶ−２特異的抗原性ペプチド（ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ２）の何れかに融合されたＢＬαを発現する。これらの断片の構築を次のように説明する。最初に、ＨＳＶ−１抗原をコードするメガプライマーを作製するために、オリゴヌクレオチドＰＡＮ１０、ＰＡＮ１１、ＰＡＮ１２及びＰＡＮ１３（表５）を用いた重複伸長ＰＣＲを行った。第二のＰＣＲでは、ＢＬα−ＨＳＶ１遺伝子を与えるために、鋳型としてｐＥＴ−ＢＬα（Ｇ４Ｓ）３、第一のＰＣＲからのメガプライマー及びＰＡＮ１４を用いた。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩでこの第二のＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）に連結した。重複伸長ＰＣＲのためにオリゴヌクレオチドＰＡＮ１０、ＰＡＮ１５、ＰＡＮ１６、ＰＡＮ１７、ＰＡＮ１８及びＰＡＮ１９を用いて、同様にして、ＢＬα−ＨＳＶ２をコードするコンストラクト ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ２を作製した。
【０２３９】
続く融合コンストラクトの改変を簡素化するために、様々なドメイン配列の置換を可能にするため、酵素断片、リンカー及び結合部分の間に制限エンドヌクレアーゼ部位が組み込まれたＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によってユニバーサルＢＬα及びＢＬω融合遺伝子を合成した。ｐＥＴ−２６ｂ（＋）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位への連結（ライゲーション）のために、何れかの末端において、ＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩ部位が、ＰｒｏＧ、（Ｇ４Ｓ）３リンカー及びＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位があるＢＬωコードドメインの間に挿入されるように、ユニバーサルＢＬωコンストラクト、ｐＥＴ−ＢＬω−ＰｒｏＧを設計した。Ｅ．コリのコドン使用表により、ベクターＮＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、公開されているアミノ酸配列（Ｇｕｌｉｃｈら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１５（１０）：８３５−４２）の戻し翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）により、連鎖球菌株Ｇ１４８プロテインＧのＣ２ ＩｇＧ−結合ドメインをコードする配列を得た。同様のアプローチを用いてユニバーサルＢＬαコンストラクト、ｐＥＴ−ＢＬα−ＰｒｏＧを作製した。ｐＥＴ−２６ｂ（＋）のＮｄｅＩ ＸｈｏＩ部位への連結（ライゲーション）のために、何れかの末端において、ＢＬα配列、（Ｇ４Ｓ）３リンカー及びＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位を有する部分をコードする抗原の間にＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ部位を有するように遺伝子配列を設計した。このコンストラクトに対して、ｐＥＴ−ＢＬω−ＰｒｏＧからＰｒｏＧをコードする配列を切り出し、ユニバーサルＢＬαコンストラクトのＢａｍＨＩ ＳｐｅＩ部位に連結した。
【０２４０】
ＢＬα−ＨＳＶ１及びＢＬα−ＨＳＶ２に対する代替物として、発明者らは、ユニバーサルＢＬωコンストラクトを使用し、個々のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２抗原性ペプチド配列でＰｒｏＧ配列を置換することにより、相補的ＢＬω−ＨＳＶ１及びＢＬω−ＨＳＶ２コンストラクトを作製した。隣接するＢｇｌＩＩ及びＳｐｅＩ部位を組み込むためにオリゴヌクレオチドＰＡＮ２０及びＰＡＮ２１を用いて、ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ１からＨＳＶ−１ペプチドをコードする配列をＰＣＲ増幅した。同様に、隣接するＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ部位を組み込むためにオリゴヌクレオチドＰＡＮ２２及びＰＡＮ２３を用いて、ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ２からＨＳＶ−２ペプチド配列をＰＣＲ増幅した。次に、ｐＥＴ−ＢＬω−ＨＳＶ１及びｐＥＴ−ＢＬω−ＨＳＶ２を得るために、ｐＥＴ−ＢＬω−ＰｒｏＧのＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ部位にＰＣＲ産物を連結した。
【０２４１】
オリゴヌクレオチド、ＰＡＮ２４及びＰＡＮ２５を使用して、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キット）により、ｐＥＴ−ＢＬω−ＰｒｏＧ、ｐＥＴ−ＢＬω−ＨＳＶ１及びｐＥＴ−ＢＬω−ＨＳＶ２のω断片配列に、点突然変異Ｎ２７６Ｄを導入した。Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＡＧＲＦ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により、クローニングされ突然変異を導入された全ての挿入物の配列決定が行われた。
【０２４２】
【表５】
【０２４３】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２抗原性ペプチド設計
血清中のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する抗体を検出しそれを差別化するために、被分析物質結合部分として２種類の特異的ＨＳＶ抗原性ペプチドを設計した。ＨＳＶ−１特異的ペプチド（図１９ｂ）は、糖タンパク質Ｇ１（ｇＧ１）の残基９２−１４８からなる。ｇＧ１のこの領域は、免疫優勢エピトープ（残基１１２−１２７）及び、ヒトにおいてＨＳＶタイプ−１特異的反応を与えることが知られている第二のエピトープ内に２つのキーとなるアミノ酸を含有する。ＨＳＶ−２特異的ペプチド（図１９ｂ）は、糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）の残基５５１−６４１から構成され、ヒトにおいてＨＳＶタイプ−２特異的反応を与えることが知られている２つの免疫優勢エピトープ（残基５６１−５７８及び６２６−６４０）からなる。
【０２４４】
α及びωレポーター断片の発現及び精製
全ての酵素断片［α断片（ＰＢ１１）、αＭ６９Ｌ断片（ＰＢ１１．１１）、αＭ６９ＬＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１２）、αＭ６９ＩＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１３）、α−ＨＳＶ−１断片、α−ＨＳＶ−２断片、α−タンパク質−Ｇ断片及びω断片（ＰＢ１３）、ωＮ２７６Ｄ断片（ＰＢ１３．３）、ＨＳＶ−１−ω断片及びＨＳＶ−２−ω断片］を発現させ（実施例１に記載のように）、変性条件下で精製した。ネイティブ条件下でタンパク質−Ｇ−ω断片を精製した。精製した全てのタンパク質の特性を同様にして調べ、アッセイした。
【０２４５】
変性条件下での組み換えタンパク質の抽出
α断片（ＰＢ１１、ＰＢ１１．１１、ＰＢ１１．１２及びＰＢ１１．１３）に対する溶解緩衝液（６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８）及びω断片（ＰＢ１３及びＰＢ１３．３）に対する（６ＭＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）の１０ｍＬ／ｇ（ペレット湿重量）で、一晩誘導した２５０ｍＬからのペレットを溶解した。６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８中でα断片−被分析物質結合部分融合物（ＢＬαＨＳＶ−１、ＢＬαＨＳＶ−２及びＢＬαＰｒｏＧ）を溶解した。６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８中で被分析物質結合部分−ω−断片融合物（ＢＬωＨＳＶ１及びＢＬωＨＳＶ２）を溶解した。１００ｒｐｍで振盪しながら４℃にて１時間温置した後、溶解を促進するために、Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクルで各懸濁液を超音波処理した。超音波処理後、１２，０００ｘｇで３０分間（４℃）溶解液を遠心し、次いで０．２μｍフィルターに通した。
【０２４６】
ネイティブ条件下でのＢＬωＰｒｏＧの抽出及び精製
５ｍＬ／ｇ（湿重量）で、ネイティブ溶解緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中で、一晩誘導した２５０ｍＬからのペレットを再懸濁した。リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇ／ｍＬになるように添加し、氷上で３０分間、懸濁液を温置した。Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクルで溶解液を超音波処理した（出力６及び７０％負荷）。１０，０００ｘｇで３０分間、４℃にて溶解液を遠心した。容器を傾けて上清を取り、０．２μｍフィルターに通した。製造者により指示されるように、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）をろ過液に添加した。Ｎｉ−ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ＃３０２１０）を用いてネイティブ条件下でＢＬωＰｒｏＧを精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ １ｍＬを溶解液に添加し、４℃で１時間振盪（１００ｒｐｍ）することにより穏やかに混合した。溶解液−Ｎｉ−ＮＴＡ混合液を１ｘ１０ｃｍカラムに注ぎ、ネイティブ洗浄緩衝液（２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）１６ｍＬで洗浄した。ネイティブ溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８）１０ｍＬにより１ｍＬ分画になるように結合タンパク質を溶出した。
【０２４７】
ＰＢ１１、ＰＢ１１．１１、ＰＢ１１．１２及びＰＢ１１．１３の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換え６ｘＨタグ付加タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で、勾配緩衝液（８Ｍ尿素１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ８）１０カラム体積（ＣＶ）でＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ８から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８ ５０ＣＶ勾配にわたり結合したタンパク質を再び折り畳ませた。２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶで夾雑タンパク質をカラムから洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、ＦＲＡＣ９５０分画回収装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１ｍＬ分画になるように回収した。ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ゲルろ過及び質量分析により、タンパク質をさらに分析した。
【０２４８】
ＰＢ１３及びＰＢ１３．３の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換え６ｘＨタグ付加タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で、勾配緩衝液（８Ｍ尿素１００ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５）１０ＣＶでＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５ ５０ＣＶ勾配にわたり結合タンパク質を再び折り畳ませた。２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶで夾雑タンパク質をカラムから洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、１ｍＬ分画になるように回収した。
【０２４９】
ＢＬα−ＨＳＶ１、ＢＬα−ＨＳＶ２、ＢＬω−ＨＳＶ１、ＢＬω−ＨＳＶ２及びＢＬαＰｒｏＧの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＡＫＴＡ−Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラムを用いて、融合タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で、勾配緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８）１０ＣＶでＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８の２０ＣＶ勾配にわたり、結合タンパク質を再び折り畳ませた。５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５ １０ＣＶとそれに続く１００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の第二の１０ＣＶで夾雑タンパク質をカラムから洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、１ｍＬ分画になるように回収した。タンパク質ピーク（２．５ｍＬ）を含有する分画をプールし、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５０％グリセロールに緩衝液を交換し、−２０℃で保存した。
【０２５０】
ＢＬω−ＰｒｏＧ融合コンストラクトに対するリンカー長の最適化
より短い（Ｇ４Ｓ）２又はより長い（Ｇ４Ｓ）４ドメイン間リンカーを有するＢＬω−ＰｒｏＧコンストラクトを作製するために、ＤＮＡ２．０により個々の遺伝子配列を合成し、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に連結した。元のＢＬω−ＰｒｏＧのようにネイティブ条件下で両断片を精製した。被分析物質の源として、ＨＳＶ１陽性の個体からのプール血清又はＨＳＶ１抗原性ペプチドで免疫付与したウサギからの過免疫血清の何れかを用いて、ＢＬα−ＨＳＶ１と組み合わせて３種類のＢＬω−ＰｒｏＧ断片を用いてアッセイを行った。両アッセイに対して、バックグラウンド相補性のレベルを示すために、ＨＳＶ−１／２陰性血清を加えた。ＢＬα−ＨＳＶ１（５ｎＭ）、ＢＬω−ＰｒｏＧ（５ｎＭ）、０．５Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７及び１００μＭニトロセフィンからなる２００μＬ反応液中で１：１００の最終濃度になるように血清を添加した。ＲＴで４０分間にわたりニトロセフィン加水分解の動態を４９２ｎｍで測定する前に、ＲＴで１０分間、反応液を温置した。
【０２５１】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２特異的ＩｇＧに対するβ−ラクタマーゼに基づくＦＥＣアッセイ
正常個体又はＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２感染が証明された個体の何れかからの５０検体の血清試料を試験した。１５０検体の患者血清（５０検体のＨＳＶ−２陽性／ＨＳＶ−１陰性；５０検体のＨＳＶ−１陽性／ＨＳＶ−２陰性；５０検体のＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２陰性）のそれぞれとともに、（１）ＢＬα−ＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧ、（２）ＢＬα−ＨＳＶ２／ＢＬ−ＰｒｏＧ、（３）ＢＬω−ＨＳＶ１／ＢＬα−ＰｒｏＧ及び（４）ＢＬω−ＨＳＶ２／ＢＬα−ＰｒｏＧを含む断片の４種類の異なる組み合わせを試験した。血清（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中の１：２０希釈液の２０μＬ）、続いてニトロセフィン（Ｍｅｒｃｋ）（５％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中の１ｍＭニトロセフィン２０μＬ）を、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の均一反応混合液１６０μＬに添加し、１：２００患者血清、１００μＭニトロセフィン、０．５％ＤＭＳＯ、５ｎＭ ＢＬα、５ｎＭ ＢＬω、０．５Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７の最終濃度を得た。プラットフォームロッカー上でＲＴで１５分間、反応混合液を温置し、その後、４９２ｎｍでＲＴにて６０分間にわたりニトロセフィン加水分解の速度を測定した。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて速度測定の結果を得て、分析した。アッセイの最初の２０分間において速度（ｍＯＤ分−１）を計算した。
【０２５２】
結果
ＢＬω−ＰｒｏＧに対するリンカー長の最適化
発明者らは、ＢＬω−ＰｒｏＧ内での（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３又は（Ｇ４Ｓ）４ドメイン間リンカーの何れかの使用の効率を比較した。それぞれモデル被分析物質及びその対照としてウサギ過免疫血清（抗ＨＳＶ−１ペプチド）又はＨＳＶ−１／２陰性血清の何れかと３種類のＢＬω−ＰｒｏＧ変異体及びＢＬα−ＨＳＶ１を組み合わせた、相補性アッセイを行った。過免疫血清を用いたアッセイにより、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを有するＢＬω−ＰｒｏＧで活性レベルが最大となり、従ってバックグラウンドに対するシグナルの比が最大となることが示された。これらのアッセイから、より大きい（Ｇ４Ｓ）４リンカーを有するものと比較して（Ｇ４Ｓ）２及び（Ｇ４Ｓ）３リンカーを有するＢＬω−ＰｒｏＧで活性レベルが高くなることが示される。この実験においてＦＥＣアッセイに対して使用される全てのその他のＢＬω−ＰｒｏＧ断片には（Ｇ４Ｓ）３リンカーが組み込まれた。
【０２５３】
ＢＬω−ＰｒｏＧの特異性
ＢＬω−ＰｒｏＧのプロテインＧ部分が機能的であり、発明者らのＨＡ形式で試験するのに適切であることを確認するために、発明者らは、表面プラズモン共鳴を用いてヒトＩｇＧに対するその結合速度を評価した。センソグラムデータの分析から、ＢＬω−ＰｒｏＧが８１ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有することが示されたが、これは公開されているプロテインＧのＣ２ドメインの親和性（９３ｎＭ）（これもまたＳＰＲを用いて決定された。）と同等である。ＢＬω−ＰｒｏＧはＣ２ドメインよりも会合速度が遅いが、これは解離速度がより遅いことにより補正される。ヒト血清アルブミンへの結合を除外するために、短縮型市販の組み換えプロテインＧを陽性対照として含めた。この組み換えプロテインＧは、同じ条件下で試験された場合、ＢＬω−ＰｒｏＧよりもヒトＩｇＧへの結合親和性が低かった（ＫＤ＝４８３ｎＭ）。
【０２５４】
β−ラクタマーゼに基づくＦＥＣを用いた被分析物質定量
本明明細書中に記載のインビトロＦＥＣ方式の濃度−反応を調べるために、モデル被分析物質の存在下で一緒にＢＬα−ＨＳＶ１及びＢＬω−ＰｒｏＧをアッセイした。この場合、β−ラクタマーゼ分割点末端の近接端部に両酵素断片がヘキサヒスチジンタグを有するので、モデル被分析物質としてマウスモノクローナル抗ヒスチジンＡｂ（抗Ｈｉｓ ＭＡｂ）を使用した。得られた曲線（データは示さず。）は、単一部位飽和結合に相応する古典的なシグモイド型を示し、このアッセイ形式が、比例して高い被分析物質濃度と低い被分析物質濃度とを区別できることが確認される。これは、被分析物質濃度が検出範囲に入る限り被分析物質濃度を定量するために本アッセイを使用することができることを示唆する。予想されるように、対照被分析物質（モノクローナル抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡｂ；抗−ＧＳＴ ＭＡｂ）は反応曲線をなさず、このことから、抗体の存在下での本アッセイの忠実性が示される。
【０２５５】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の検出のためのβ−ラクタマーゼに基づくＦＥＣを用いた均一アッセイ
発明者らの均一アッセイの性能を試験するために、発明者らは、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａからの１５０検体の患者血清試料（５０検体のＨＳＶ−１陽性／ＨＳＶ−２陰性；５０検体のＨＳＶ−２陽性／ＨＳＶ−１陰性；５０検体のＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２陰性）をアッセイし、内部標準として使用した既存の市販アッセイ、ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ１及び２ ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ（Ｆｏｃｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）と発明者らの結果を比較した。図１４から１７は、β−ラクタマーゼに基づくＦＥＣが高い感受性及び特異性で首尾よくタイプ特異的ＨＳＶ抗体を検出することができることを示す。ＨＳＶ−１／２に対する試験で陰性であるプール血清の試料（ｎ＝４）に対して、５０アッセイの各セットに対する結果（断片の４種類の異なる組み合わせのそれぞれに対して３セットのアッセイ−３日間にわたり３回ずつ行う。）を正規化した。図１８は、ＨＳＶ陰性患者から（０．８５ｍＯＤ分−１）又は高ＨＳＶ−２陽性血清の個体から（５．１４ｍＯＤ分−１）の血清中でのＢＬα−ＨＳＶ２／ＢＬω−ＰｒｏＧによるニトロセフィン加水分解の典型的な速度を示す。ＨＳＶ−１高陽性血清中でＢＬα−ＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧにより同様の加水分解速度が得られた。ＢＬα−ＰｒｏＧ／ＢＬω−ＨＳＶ１の活性（図１４）は全体的にＢＬα−ＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧ（図１７）よりも僅かに高いが、ある種の融合パートナー（ＰｒｏＧ、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２特異的ペプチド）に対する断片（ＢＬα又はＢＬω）の選択はアッセイの全体的結果にはあまり影響がなかった。対照試料（ＨＳＶ陰性血清）において低バックグラウンド活性を維持するために、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５Ｍ尿素を含有するアッセイ中で低断片濃度（５ｎＭ）と組み合わせた高血清希釈液（１：２００）を使用した。７５分間（基質添加後１５分間の遅延時間を含む。）にわたり血清試料をアッセイしたが、試料によっては、基質添加後、最初の２５分間内に色の変化が観察され得る。
【０２５６】
考察
発明者らは、多岐にわたる生体指標の検出のために使用することができる可能性がある新しいＦＥＣに基づく均一アッセイを開発した。この系は、専用の機器を必要とせず、単純であるため、ポイントオブケアの用途のためにさらに開発することができる。実際に可能であることを示すために、発明者らは、Ｅ．コリβ−ラクタマーゼを用いたタイプ特異的ＨＳＶ ＩｇＧの検出のためのアッセイを開発した。この遺伝子を２つに分割し、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２−特異的ペプチド抗原の何れかに融合させた一方の断片；プロテインＧの１つのドメインに融合させた他方の断片を発現するように改変した。β−ラクタマーゼ断片の全てを大量に容易に精製し、単に被分析物質及び基質存在下で２つの相補的断片を一緒に混合することにより緩衝液中でアッセイした。発明者らは、β−ラクタマーゼに基づくＦＥＣアッセイは、高感受性及び特異性で、ヒト血清中でのＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する抗体を同定することにより、限られた交差反応性、妨害及び阻害で、血清中の大きな被分析物質を検出することができることを明らかにした。
【０２５７】
同じ又は異なるレポーター酵素の何れかを用いたＰＣＡの先行報告に相反して、発明者らは、一貫して、被分析物質の存在下で、相補性断片の自発的アセンブリーの結果として、バックグラウンド活性を観察した。この見解の相違は、これら２つのアッセイの基礎となる性質が異なることによって説明することができる。ＰＣＡは、インビボで（酵素断片の濃度は細胞あたり２５分子程度であり得る。）（〜ｆＭの範囲）タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、最も一般的に使用される。一方、発明者らのインビトロでのＦＥＣに基づくアッセイは、５ｎＭという高い断片濃度を有し、それにより、自発的再会合の可能性が向上する。それにもかかわらず、本明細書中で報告される予備アッセイは、平均でバックグラウンドよりも少なくとも２倍高いシグナルを生じさせ、溶液中の被分析物質の濃度によっては、発明者らは、ヒト血清において１５という高いノイズに対するシグナル比を達成することができる。将来、発明者らは、互いに対して親和性が非常に低い、つまり、アッセイのダイナミックレンジを向上させながら、被分析物質検出及びバックグラウンドノイズの限界の両方を低くする断片を作製することに焦点を当てることを目標としている。
【０２５８】
ＨＳＶ感染の診断のための信頼できる市販のタイプ特異的血清学試験はあまりなく、これらのうち最も一般的であるものはＥＬＩＳＡに基づく。発明者らのアッセイ開発ストラテジーの一部として、発明者らは、レポーター酵素断片に融合させた際にＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２に対する抗体の検出に対して感度が高く特異性が高い新規ＨＳＶタイプ特異的抗原を設計することに成功した。ＨＳＶ−１特異的ペプチドは、ヒトにおいてＨＳＶタイプ−１特異的反応を誘発することが知られている２つのキーとなるアミノ酸に加えて、ｇＧ１の免疫優勢領域を含有する。同様に、ＨＳＶ−２特異的ペプチドは、ヒトにおいてＨＳＶタイプ−２特異的反応を誘発することが知られているｇＧ２の２つの免疫優勢エピトープを含有する。
【０２５９】
本明細書中で報告されるＦＥＣに基づく均一ＥＩＡは単純であり、リアルタイムでの疾患特異的生体指標の検出のために容易に自動化し得る。リアルタイム被分析物質検出（センサー）により、エンドポイント検出よりも大きいダイナミックレンジが得られ、ライフサイエンスでの応用に対して本質的に定量的である。
【０２６０】
上記の個々のセクションで言及された本発明の様々な特性及び実施形態は、必要に応じて、変更すべき部分は変更して、他のセクションに適用される。従って、必要に応じて、あるセクションで述べられる特性を他のセクションで述べられる特性と組み合わせ得る。
【０２６１】
本明細書中で開示され主張される全ての組成物及び方法は、本開示に照らして、不必要な実験を行わずに為し、実行することができる。好ましい実施形態の観点から本発明の組成物及び方法を説明してきたが、当業者にとって当然のことながら、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び方法に対して、及び本明細書中に記載の方法段階において又は段階の順番において、変更を適用し得る。さらに具体的には、同じ又は同様の結果が達成されると同時に、化学的かつ物理学的に関連のあるある一定の作用物質で本明細書中に記載の作用物質を置き換えることができることが明らかである。当業者にとって明らかである全てのこのような類似の置換及び変更は、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の精神、範囲及び概念内にあるものとみなされる。
【０２６２】
参考文献
上記文章で特定される参考文献は、それらが、本明細書中で使用される、方法、技術及び／又は組成物の背景を、補足し、説明し、提供するか又はそれらを教示する程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、分子生物学及び診断の分野に関する。とりわけ、本発明は、均一インビトロアッセイにおいて被分析物質を検出するために特異的に適応させられたレポーター断片系及び成分、これらの成分を使用するこのようなアッセイ、診断システム及び上記のものを作製及び使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
レポーター断片系に基づくアッセイは、タンパク質間相互作用検出アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）（ＰＣＡ）、強制的酵素相補性（ＦＥＣ）アッセイ（Ｆｏｒｃｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）又は相互作用依存タンパク質結合系として知られている。これらのアッセイは、全般的に、例えば、ＷＯ０１／７１７０２；米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；同第６，４２８，９５１号；同第６，３４２，３４５号、同第６，８２８，０９９号及び米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号に記載されている。本明細書中で使用される場合、強制的酵素相補性又はＦＥＣアッセイは総称的にこのようなアッセイを指す。
【０００３】
ＦＥＣの基礎となる基本原理を図１で図示する。これらのアッセイは通常、可視的な表現型の変化又は抗生物質耐性など、直接検出可能なシグナルを有するレポータータンパク質へと機能的に再構築し得る第一及び第二のメンバーからなるタンパク質断片ペアの使用を特徴とする。このアッセイの有効性の重要な態様は、レポータータンパク質の機能的再構成が、レポータータンパク質断片に連結されている断片ペアの各メンバー内に存在する部分の、相互作用、即ち結合又は吸引に依存するということである。本明細書中で使用される場合、これらの相互作用部分を「インタラクター」又は「インタラクタードメイン」と呼ぶ。インタラクタードメインは、断片ペアコンストラクトの各メンバー内に含有される個別の部分又はドメインである。インタラクタードメインは、レポーター断片ドメインへと直接連結され得るか又はリンカードメインにより連結され得る。タンパク質断片ペアメンバーは、通常、ペアの各メンバーにおけるインタラクタードメインがない場合、レポーター断片が自然には機能的に再構成しないように構築されている。このようにして、ペアの各メンバーのインタラクタードメインは、その断片からの機能的レポータータンパク質の再構成に関与する。
【０００４】
機能的なインビボＦＥＣアッセイは、いくつかの異なるレポータータンパク質を用いて構築されている。例えば、ＷＯ０１／７１７０２；米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；同第６，４２８，９５１号；同第６，３４２，３４５号、同第６，８２８，０９９号及び米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号で開示されるものを参照。
【０００５】
クラスＡβ−ラクタマーゼ（特にＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ）は、それらが単量体であり、比較的サイズが小さく、結晶構造が既知であるので、ＦＥＣアッセイの開発において特に関心が持たれてきた（ＷＯ００／７１７０２及びＪｅｌｓｃｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．（１９９３）１６：３６４ｆｆ）。β−ラクタマーゼは、原核又は真核系の何れかで発現され得る。ＦＥＣアッセイの設計及び開発におけるβ−ラクタマーゼの使用の例は、ＷＯ０１／７１７０２；米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；同第６，４２８，９５１号；同第６，３４２，３４５号、同第６，８２８，０９９号、米国特許出願公開第２００３０１７５８３６号及び同第２００６００９４０１４号及びＯｏｉら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：３６２０−３６２５で見出すことができる。
【０００６】
Ｃａｎｔｏｒら（米国特許出願公開第２００６００９４０１４号）は、インタラクタードメインが核酸である標的核酸配列の検出での使用のためのＦＥＣを示唆する。効率的なＦＥＣアッセイ性能に必要な相互作用は、含まれる核酸の間での核酸相補性複合体の形成の結果によるもの（典型的なワトソン−クリック塩基対配列認識の結果）である。このようにして、Ｃａｎｔｏｒらの方法において、標的被分析物質及び各ＦＥＣ断片のインタラクタードメインは全て核酸である。このように、各断片ペアの各メンバーは、β−ラクタマーゼ由来のタンパク質レポーター断片ペアの混合コンストラクト及びそれらのレポーター断片に連結された核酸インタラクタードメインである。Ｏｏｉら（２００６）は、β−ラクタマーゼレポーター断片ペアを用いた同様の系を記載した。Ｓｔａｉｎｓら（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１０７８２−１０７８３及びＳｔａｉｎｓら（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：９７６１−９７６５は、レポーター断片ペアとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の断片を使用し、インタラクタードメインとして亜鉛フィンガー及びメチル−ＣｐＧ結合タンパク質を使用する、ＦＥＣに基づくアッセイを記載した。これらの系は、再構成されたＧＦＰの蛍光を通じて配列特異的な又はメチル化されたポリヌクレオチド配列を検出するように設計されている。
【０００７】
ＦＥＣの原理に基づく広く適用可能なインビトロ均一アッセイの作成により、必然的にＦＥＣの設計及び遂行に対する新しい問題が生じる。これらの問題は、均一アッセイ形式内で生成される特定のアッセイ環境、検出を目的とする被分析物質の性質及び源及びこのような均一アッセイの作成と関連する製造の問題から生じる。
【０００８】
均一アッセイは通常、使用における、特異性、信頼性、作製の簡便性及び使用におけるロブストな特徴を確実にするために、単離精製成分から構成される。必要な溶解性、安定性及び製造に対する従順性及び最終的な診断用途も生み出す、適切なタンパク質断片ペアの設計（適切なレポーター断片、インタラクタードメイン、連結ドメイン及び融合コンストラクト全体又はそれぞれを組み込むレポーター断片ペアを含む。）ならびにロブストなアッセイ条件は、広く適用可能な均一アッセイプラットフォームを作製するのに不可欠である。インビボＦＥＣアッセイ条件と比較して、インビトロ診断アッセイ条件は、細胞外であり、比較的厳しく、インビボで容易に起こり得る適切なタンパク質折り畳み及びタンパク質−タンパク質相互作用を促進し得ない。
【０００９】
さらなる問題は、均一アッセイプラットフォームにより起こる。均一アッセイプラットフォームの開発の中核は、洗浄段階の排除である。従って、血清又は少なくともある血清成分の存在下で、均一アッセイプラットフォームにおける診断試験を行い得る。このようにして、被分析物質を含有する試料分画を洗浄なしで処理し得る。洗浄がないと、均一プラットフォーム（特にＦＥＣに基づくもの）は、交差反応、妨害及び血清成分又はその他の夾雑物の阻害的影響が起こりやすい状態のままであると思われる。
【００１０】
例えば、β−ラクタマーゼは、β−ラクタム抗生物質（Ｃｈａｉｂｉら、１９９９、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３（４）：４４７−５８）に対する菌耐性を与える。その結果、細菌感染の治療に対して設計された薬物は、患者血清中に存在する場合、アッセイ性能を妨害し得る。実際に、ヒト投与に対して使用されるβ−ラクタム抗生物質製剤（経口及び静脈内）は、使用される抗生物質の効率を上昇させるために、β−ラクタマーゼ（ＴＥＭ−１）の不可逆的阻害剤の使用を含み得る。一般に使用される例となる阻害剤には、ペニシリンの誘導体及びペナム又はセファム誘導体が含まれる。このような阻害剤の例、それらの合成及び使用は、米国特許第６，９３６，７１１号；同第６，９００，１８４号；同第６，３９５，７２６号；同第６，２０７，６６１号；同第５，７６３，６０３号；同第５，６８６，４４１号；同第４，９５８，０２０号；同第４，９３３，４４４号；同第４，８９８，９３９号；同第４，８９５，９４１号；同第４，８９１，３６９号；同第４，６６８，５１４号；同第４，６２６，３８４号；及び同第４，５２９，５９２号（そのそれぞれはそれらの全体において参照により明確に組み込まれる。）に記載されている。抗生物質及び阻害剤の一般的組み合わせは、それらの商標名又は非公式名により知られ得る。例えば：ピペラシリン及びタゾバクタム；アンピシリンナトリウム及びスルバクタムナトリウム；及びアモキシシリン及びクラブラン酸。さらなる組み合わせ及び阻害剤が当技術分野で公知である。
【００１１】
レポーター酵素としてβ−ラクタマーゼを使用する均一アッセイは、これらのβ−ラクタマーゼ阻害剤の影響を受けやすい。例えば、抗生物質投与後に観察されるβ−ラクタマーゼ阻害剤血清Ｃｍａｘレベルは、β−ラクタマーゼを阻害するのに十分高いものであり得る。従って、一般にインビトロアッセイにおいてＦＥＣを実行する問題に加えて、インビトロ均一アッセイプラットフォームにおけるＦＥＣの実行によりさらなる問題が現れる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０１／７１７０２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，２７０，９６４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２９４，３３０号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４２８，９５１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，３４２，３４５号明細書
【特許文献６】米国特許第６，８２８，０９９号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３／０１７５８３６号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００６／００９４０１４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，９３６，７１１号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，９００，１８４号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，３９５，７２６号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，２０７，６６１号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，７６３，６０３号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，６８６，４４１号明細書
【特許文献１５】米国特許第４，９５８，０２０号明細書
【特許文献１６】米国特許第４，９３３，４４４号明細書
【特許文献１７】米国特許第４，８９８，９３９号明細書
【特許文献１８】米国特許第４，８９５，９４１号明細書
【特許文献１９】米国特許第４，８９１，３６９号明細書
【特許文献２０】米国特許第４，６６８，５１４号明細書
【特許文献２１】米国特許第４，６２６，３８４号明細書
【特許文献２２】米国特許第４，５２９，５９２号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊｅｌｓｃｈ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．１６、１９９３年、ｐ．３６４ｆｆ
【非特許文献２】Ｏｏｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５、２００６年、ｐ．３６２０−３６２５
【非特許文献３】Ｓｔａｉｎｓ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７、２００５年、ｐ．１０７８２−１０７８３
【非特許文献４】Ｓｔａｉｎｓ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８、２００６年、ｐ．９７６１−９７６５
【非特許文献５】Ｃｈａｉｂｉ他、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３（４）、１９９９年、ｐ．４４７−５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、高い、溶解性、安定性、感受性及び／又は酵素阻害剤（例えば本アッセイにおいて試験したい試料中に存在し得る阻害剤）に対する耐性など、インビトロ均一ＦＥＣアッセイでの使用に対する所望の特徴を示すＴＥＭ−１β−ラクタマーゼに基づく修飾レポーター断片（α及びω断片）を提供する。本発明のタンパク質断片により示されるこれらの所望の特徴には、レポーター断片の単離及び精製に対する高い従順性及び、操作可能なインビトロ均一アッセイの続く構成のための、レポーター断片ペアが含まれる。本発明は、さらに、具体的に、均一アッセイプラットフォーム形式及び使用でのアッセイの感受性又は特異性を維持又は向上させながら、均一インビトロアッセイ条件下で溶解性が高く凝集性が低いレポータータンパク質断片を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、ある態様において、本発明は、酵素活性の阻害剤の存在下で酵素活性を保持するポリペプチド複合体を生成させるための、少なくとも第二のポリペプチドとの会合において操作可能なポリペプチドを提供する。
【００１６】
好ましい実施形態において、本ポリペプチドは、酵素活性の阻害剤に対するポリペプチド複合体の感受性を低下させる１以上のアミノ酸配列変化を含む。
【００１７】
関連する態様において、本発明は、第一のポリペプチドサブユニットを含む第一のレポーター成分及び第二のポリペプチドサブユニットを含む第二のレポーター成分を含み、第一のサブユニット及び第二のサブユニットが、検出可能なシグナルを生成することができる酵素活性を有する活性のあるポリペプチド複合体を生成させるために会合することができ、該会合が関心のある被分析物質に対する第一及び第二のレポーター成分の結合により媒介され；
第一のポリペプチドサブユニット及び／又は第二のポリペプチドレポーターサブユニットが、阻害剤による該酵素活性の阻害に対する活性ポリペプチド複合体の感受性を低下させる１以上のアミノ酸配列変化を含む、レポーター系を提供する。
【００１８】
具体的な実施形態において、本発明は、インビトロ均一ＦＥＣアッセイでの使用に必要とされる所望の特徴を得られる断片に与える、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼのネイティブアミノ酸配列における、点突然変異、切断点及び欠失に基づく、レポーター断片ペアドメインとしての使用のためのポリペプチドコンストラクトを提供する。これらの所望の特徴には、以下に限定されないが、１以上の血液血清成分存在下で、均一形式においてβ−ラクタマーゼに基づくＦＥＣアッセイを可能にするものが含まれる。特定の実施形態において、これらの血液血清成分には、β−ラクタマーゼの阻害剤が含まれる。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、β−ラクタマーゼ阻害剤の存在下及び均一インビトロＦＥＣアッセイで使用するために断片ペアを適応させるその他の方法において、溶解性を向上させ、凝集性を低下させ、性能を向上させるために、断片ペアコンストラクトに有利に導入され得る具体的な突然変異を提供する。これらの突然変異の効果により、単独で（本発明のものではない操作可能なペアメンバーと組み合わせて使用される場合）又は本発明の操作可能なペアメンバーと組み合わせての何れかで、レポーター、リンカー又はインタラクタードメインにおいて複数の長所が与えられ得る。これらの長所には、β−ラクタマーゼの阻害剤又はこのような条件においてＦＥＣの有効性を損なう血清又はその他の生体試料に存在するその他の因子を含み得るインビトロ又は均一アッセイ条件での操作可能性が含まれる。
【００２０】
具体的な突然変異（アミノ酸配列変化）を同定することにおいて、本明細書中で従った表記法（文脈で必要とされる場合を除く。）は、ネイティブβ−ラクタマーゼアミノ酸配列からの位置情報と組み合わせてアミノ酸に対する１文字コードを使用する。例えば、Ｖ７４Ｔは、ネイティブの位置７４のバリン（付随の配列で又は代替的な配列付番スキームにおける相同位置で示される。）が、チロシンにより置換されることなどを示す。一貫性及び利便性のために、ネイティブ配列の付番は、実質的にわずかなアミノ酸の配列又はレポーター断片を指す場合でも保持される。このようにして、Ｆ２３０Ｙは、置換がより短い、例えば本発明のα又はω断片内で起こり得る場合でも、全長ネイティブ配列付番での位置２３０でのＹによるＦの置換を指す。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明のネイティブβ−ラクタマーゼ配列の突然変異は、付随する配列リストの付番において又は何らかの代替的な配列付番法での相同位置において、位置１９６のグリシンと位置１９７のグルタミン酸との連結部の間の切断点により形成されるα及びω断片と連結して提供される。本明細書中で提供される突然変異との連結において有用な、代替的なα又はω断片を生じるその他の切断点は、関連技術の通常の技術内である。
【００２２】
本発明は、次のものから選択される１又は複数のアミノ酸配列変化を含むＴＥＭ−１β−ラクタマーゼのα又はω断片を提供する：Ｍ６９Ｌ；Ｍ６９Ｉ；Ｖ７４Ｔ；Ｍ１８２Ｔ；Ｉ２０８Ｔ；Ｍ２１１Ｑ；Ｆ２３０Ｙ；及びＮ２７６Ｄ。これらの突然変異は、個々に又は組み合わせて存在し得る。ネイティブ配列に関連する突然変異の具体的な組み合わせは、完全に１個のレポータードメイン又はレポーター断片ペアメンバー内に存在し得る。具体的な突然変異又は突然変異の組み合わせは、本発明の範囲内のアッセイの必要条件を満たすため、所望のアッセイ及び突然変異の操作可能性に依存して、ＦＥＣアッセイにおいて有用な１個のレポータードメイン又は２個の相補的レポータードメイン又はレポーター断片ペアメンバーにおいて存在し得る。本発明の範囲内の１個のアミノ酸突然変異の特定の組み合わせには、α断片レポータードメインにおけるＭ１８２ＴとのＭ６９Ｌ；α断片レポータードメインにおけるＭ１８２ＴとのＭ６９Ｉ；及びω断片レポータードメインにおけるＮ２７６Ｄが含まれる。これら変化したレポータードメイン配列は、言うまでもなく、ＦＥＣアッセイの操作可能なメンバーを構成するために、適切なレポーター断片メンバーに組み込まれ得る。インタラクタードメインが、操作可能なメンバー又はＦＥＣアッセイのメンバーの操作可能なペアを構成するための本発明の改変レポータードメインの１以上に連結される、当業者が所望し得る何らかのこのようなドメインであり得ることは、本発明の範囲内である。当業者にとって当然のことながら、これらのコンストラクトは操作可能であり得、従って、インビボ又はインビトロで有用であり得る。本発明の阻害剤耐性コンストラクトのインビボでの使用が具体的にもくろまれる。
【００２３】
さらなる代表的実施形態において、本発明のレポーター断片メンバーは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列の単離又は精製ポリペプチドを含む。ある好ましい実施形態において、本発明のレポーター断片は、基本的に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列の単離又は精製ポリペプチドから構成される。具体的な好ましい実施形態において、本発明のレポーター断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列の単離又は精製ポリペプチドから構成される。
【００２４】
本発明はまた、レポーター断片ペアの対形成を含む単離又は精製された特異的断片ペアも提供し、この場合、対形成は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列（標識されたコンストラクトＰＢ１５を示す。）により例示されるように、配列の実質的な再編成を特徴とする。さらなる実施形態には、配列番号２３及び２４により例示されるものなどのこのような再編成された基本配列由来のレポーター断片が含まれる。
【００２５】
本発明と一致して、リンカードメインを本発明のレポーター断片に付加し得る。さらに、介在リンカードメイン有り又は無しでインタラクタードメインを本発明のレポーター断片に連結し得る。リンカードメインの数、例えば、Ｇ４Ｓドメイン（即ちＧＧＧＧＳ配列反復）は０、１、２、３、４、５、６以上であり得、（Ｇ４Ｓ）ｎとして特定し得る（ここでｎは０、１、２、３、４、５、６以上の整数であり得る。）。何らかの特定のインタラクター及びレポータードメインコンストラクト及び断片対形成に対する適切なリンカードメイン配列及び／又はリンカードメイン反復数の選択は、当業者による通常の実験レベル内である。
【００２６】
本発明のレポーター断片には、均一インビトロＦＥＣアッセイへと操作可能に構成され得る単離及び精製レポーター断片が含まれる。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、６６、６８、７０、７２、７４、７６、８０及び８２で示される配列から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はこれらからなる核酸など、本発明のポリペプチド実施形態をコードする核酸を提供する。
【００２８】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のレポーター断片及びインビトロＦＥＣアッセイ成分を作製し、精製し、単離し、使用する方法を提供する。
【００２９】
本発明は、さらに、本発明の単離及び精製ポリペプチド及びレポーター断片ペアを含む均一インビトロＦＥＣアッセイを提供する。
【００３０】
従って、別の態様において、本発明は、
（ａ）関心のある被分析物質の存在について試験しようとする試料を得て；
（ｂ）被分析物質に対して親和性があるインタラクタードメインを含む、精製された第一のレポーター断片ペアメンバーを得て；
（ｃ）関心のある被分析物質に対して親和性があり、関心のある被分析物質と第一及び第二のレポーター断片ペアメンバーのインタラクタードメインとの親和性を通じて第一のレポーター断片ペアメンバーとの会合に際してレポーター酵素活性を再構成することにおいて操作可能であるインタラクタードメインを含む精製された第二のレポーター断片ペアメンバーを得て；
（ｄ）第一及び第二のレポーター断片ペアメンバーが、被分析物質とのインタラクタードメインの親和性を通じて会合することを可能にするのに十分なインビトロでのアッセイ条件を提供する段階を含み、レポーター酵素活性の再構成が試料中の被分析物質の存在を示す、被分析物質の存在をアッセイする方法を提供する。
【００３１】
関連する態様において、本発明は、本発明のレポーター系と試料を接触させることと、第一及び第二のポリペプチドサブユニットの会合の結果として生じる酵素活性の有無を検出することと、を含む、試料中の関心のある被分析物質の存在を調べる方法も提供する。
【００３２】
別の関連する態様において、本発明は、試料中の関心のある被分析物質の存在を調べるための本発明のレポーター系の使用を提供する。
【００３３】
本発明はまた、特定の被分析物質に対して均一インビトロアッセイを行うために適応させられた特異的レポーター断片ペアも提供する。ある実施形態において、被分析物質はＮｉ２＋、Ｚｎ２＋又はＣｏ２＋などの２価金属陽イオンである。さらに別の実施形態において、被分析物質は抗体である。抗体被分析物質は、関心のあるアッセイに依存して、モノクローナル抗体又はその他、適切な抗体であり得る。さらなる実施形態において、被分析物質は抗原である。さらなる実施形態において、被分析物質は１以上のポリヌクレオチド又は特異的配列である。このようなポリヌクレオチドは、メチル化されていてもされていなくてもよく、それらのメチル化状態は、本発明の特定の実施形態の使用から得られる情報であり得る。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のアッセイを行うためのキット又は、材料、試薬及び本発明のアッセイ成分を調製するための又は本発明のアッセイの続く使用のための説明書を含むキットを含む。
【００３５】
本発明のその他の目的、特性及び長所は、続く詳細な説明から明らかになろう。しかし、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び変化がこの詳細な説明から当業者にとって明らかとなるので、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示す一方、単なる説明のために与えられるものであることを理解されたい。
【００３６】
次の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある一定の態様をさらに明らかにするために含まれる。本明細書中で与えられる本発明の詳細な説明及び実施例と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することにより、本発明がより詳細に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＦＥＣアッセイ及びその基本成分の概略図。
【図２】２価金属陽イオンに対する均一インビトロＦＥＣアッセイの概略図。
【図３】野生型又は突然変異β−ラクタマーゼレポーターコンストラクトを使用する２価陽イオンに対する均一インビトロＦＥＣアッセイの実行。
【図４】Ｎｉ２＋に対する均一インビトロＦＥＣアッセイにおける１０分間のＯＤ４９２試験。
【図５】抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体に対する均一インビトロＦＥＣアッセイの概略図。
【図６】抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体に対する均一インビトロＦＥＣアッセイの実行（ＯＤ４９２での吸収）。
【図７】本発明のタンパク質断片の精製。図面の左のパネルはαβ−ラクタマーゼ酵素断片の誘導発現前後及びアフィニティー精製物質のゲル電気泳動である。α断片の表示されたクロマトグラム「アフィニティー精製」及び表示されたクロマトグラム「ゲルろ過」プロファイルの両方が、精製酵素断片の実施形態を説明する。本発明のその他の断片に対して同様の結果が得られる。
【図８】被分析物質としてのＮｉ２＋に対して反応性のあるβ−ラクタマーゼ酵素断片及び本発明のα及びωβ−ラクタマーゼ断片の等モル量を用いたＦＥＣインビトロアッセイの進展の４９２ｎｍでの吸収読み取り。
【図９】マルチウェルプレート形式でのＮｉ２＋に対するインビトロアッセイ中の色の変化の強度の説明。時間点は非線形である。各ウェルの色の強度は、被分析物質の存在及び非存在下（それぞれウェルＡ１−Ａ８及びＢ１−Ｂ８）及び基質のみ（ウェルＣ１−Ｃ８）において示される。
【図１０】突然変異コンストラクトのアッセイの特徴。単位はｍＯＤ分−１である。
【図１１】ＨＳＶに対するコンストラクトのアッセイの特徴。単位はｍＯＤ分−１である。
【図１２】野生型ＴＥＭ−１（ＰＢ１１＋ＰＢ１３）ＦＥＣと比較した、最適阻害剤耐性突然変異ＴＥＭ−３３Ｍ１８２ＴＮ２７６Ｄ（ＰＢ１１．１２＋ＰＢ１３．３）の相対的耐性を示すグラフ。
【図１３】野生型ＴＥＭ−１（ＰＢ１１＋ＰＢ１３）ＦＥＣ及び全長ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼと比較した、最適阻害剤耐性突然変異ＴＥＭ−３３Ｍ１８２Ｔ Ｎ２７６Ｄ（ＰＢ１１．１２＋ＰＢ１３．３）のβ−ラクタマーゼ阻害剤添加血清アッセイの結果を示すグラフ。
【図１４】ＢＬαＰｒｏＧ／ＢＬω−ＨＳＶ１を用いたＨＳＶ−１アッセイの特徴を示すグラフ。カットオフ＝１．２０。感受性＝ＨＳＶ １＋ｖｅに対して９８％。特異性＝ＨＳＶ２＋ｖｅに対して１００％。特異性＝ＨＳＶ−ｖｅに対して１００％。
【図１５】ＢＬαＰｒｏＧ／ＢＬω−ＨＳＶ２を用いたＨＳＶ−２アッセイの特徴を示すグラフ。カットオフ＝１．１６。感受性＝ＨＳＶ２＋ｖｅに対して９４％。特異性＝ＨＳＶ１＋ｖｅに対して１００％。特異性＝ＨＳＶ−ｖｅに対して１００％。
【図１６】ＢＬαＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧを用いたＨＳＶ−１アッセイの特徴を示すグラフ。カットオフ＝１．１５。感受性＝ＨＳＶ１＋ｖｅに対して９８％。特異性＝ＨＳＶ２＋ｖｅに対して１００％。特異性＝ＨＳＶ−ｖｅに対して９６％。
【図１７】ＢＬαＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧを用いたＨＳＶ−２アッセイの特徴を示すグラフ。カットオフ＝１．２０。感受性＝ＨＳＶ２＋ｖｅに対して９８％。特異性＝ＨＳＶ１＋ｖｅに対して１００％。特異性＝ＨＳＶ−ｖｅに対して９６％。
【図１８】正常（対照）又はＨＳＶ−２高陽性患者血清の何れかの存在下でのニトロセフィン加水分解の典型的な速度を示すグラフ（１５分間の予備温置時間後、４９２ｎｍで監視）。加水分解の平均速度は０．８５ｍＯＤ分−１（ＨＳＶ陰性）及び５．１４ｍＯＤ分−１。
【図１９】β−ラクタマーゼに基づくＦＥＣのイラスト表示及びＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２特異的抗原性ペプチドの配列。（ａ）酵素断片、α及びω、は、疾患特異的抗原性ペプチド（Ｐ）及びプロテインＧの１つのドメインなど、被分析物質結合物質に連結される。被分析物質（疾患特異的抗体）の存在下で、断片を強制的に近接近させ（右）、それによりニトロセフィンの加水分解が開始されるが、それは黄色から赤への色の変化として見ることができる。（ｂ）ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２抗原性ペプチドの短縮型糖タンパク質アミノ酸配列。下線付きの太字は免疫優勢領域を表す。
【図２０】この研究で使用されるＦＥＣ断片の概略図。ＢＬはβ−ラクタマーゼα（α、青）及びω（ω、緑）断片を指す。被分析物質結合部分（赤）、ＰｒｏＧ、ＨＳＶ−Ｐ１及びＨＳＶ−Ｐ２は、それぞれプロテインＧドメイン及びＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対するＨＳＶ型特異的抗原性ペプチドを指す。ヒスチジンタグを灰色で示す。被分析物質結合部分に酵素断片を連結するために、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを使用した。
【００３８】
配列リストの簡単な説明
配列番号１。ＰＢ１１、ネイティブβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００３９】
配列番号２。ＰＢ１１、ネイティブβ−ラクタマーゼのα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４０】
配列番号３。ＰＢ１３、ネイティブβ−ラクタマーゼ配列のω断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００４１】
配列番号４。ＰＢ１３、ネイティブβ−ラクタマーゼのω断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４２】
配列番号５。ＰＢ１１．２、Ｖ７４Ｔ及びＭ１８２Ｔの置換を含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００４３】
配列番号６。ＰＢ１１．２、Ｖ７４Ｔ及びＭ１８２Ｔの置換を含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４４】
配列番号７。ＰＢ１１．１１ 置換Ｍ６９Ｌを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクト。
【００４５】
配列番号８。ＰＢ１１．１１ 置換Ｍ６９Ｌを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４６】
配列番号９。ＰＢ１１．１２ 置換Ｍ６９Ｌ及びＭ１８２Ｔを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクト。
【００４７】
配列番号１０。ＰＢ１１．１２ 置換Ｍ６９Ｌ及びＭ１８２Ｔを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００４８】
配列番号１１。ＰＢ１３．１ Ｍ２１１Ｑの置換を含有するβ−ラクタマーゼ配列のω断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００４９】
配列番号１２。ＰＢ１３．１ Ｍ２１１Ｑの置換を含有するβ−ラクタマーゼ配列のω断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００５０】
配列番号１３。ＰＢ１１．１３ 置換Ｍ６９Ｉ及びＭ１８２Ｔを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトをコードするヌクレオチド配列。
【００５１】
配列番号１４。ＰＢ１１．１３ 置換Ｍ６９Ｉ及びＭ１８２Ｔを含有するβ−ラクタマーゼ配列のα断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００５２】
配列番号１５。ＰＢ１１．４、（Ｇ４Ｓ）３リンカードメインを含むネイティブβ−ラクタマーゼのα断片をコードするヌクレオチド配列。
【００５３】
配列番号１６。ＰＢ１１．４、（Ｇ４Ｓ）３リンカードメインを含むネイティブβ−ラクタマーゼのα断片のアミノ酸配列。
【００５４】
配列番号１７。ＰＢ１３．２、（Ｇ４Ｓ）３リンカードメインを含むネイティブβ−ラクタマーゼのω断片をコードするヌクレオチド配列。
【００５５】
配列番号１８。ＰＢ１３．２、（Ｇ４Ｓ）３リンカードメインを含むネイティブβ−ラクタマーゼのω断片のアミノ酸配列。
【００５６】
配列番号１９。ＰＢ１３．３ 置換Ｎ２７６Ｄを含有するβ−ラクタマーゼのω断片コンストラクト。
【００５７】
配列番号２０。ＰＢ１３．３ 置換Ｎ２７６Ｄを含有するネイティブβ−ラクタマーゼのω断片コンストラクトのアミノ酸配列。
【００５８】
配列番号２１。ＰＢ１５、β−ラクタマーゼの再編成コンストラクトのアミノ酸配列。
【００５９】
配列番号２２。ＰＢ１５．３、β−ラクタマーゼの、及びＭ１８２Ｔ、Ｉ２０８Ｔ及びＦ２３０Ｙの置換を含む、再編成コンストラクトのアミノ酸配列。
【００６０】
配列番号２３。ＰＢ７．２、ＰＢ１５．３のα断片のアミノ酸配列。
【００６１】
配列番号２４。ＰＢ９．１、ＰＢ１５．３のω断片のアミノ酸配列。
【００６２】
配列番号２５から配列番号６５は、表１及び５で記載のとおりの合成プライマーである。
【００６３】
配列番号６６ Ｐ１−Ｉ ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−１短縮型抗原ヌクレオチド配列。
【００６４】
配列番号６７ Ｐ１−Ｉ ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−１短縮型抗原アミノ酸配列。
【００６５】
配列番号６８ ＢＬαＨＳＶ−１α断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００６６】
配列番号６９ ＢＬαＨＳＶ−１α断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００６７】
配列番号７０ ＢＬω、ＨＳＶ−１ω断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００６８】
配列番号７１ ＢＬω、ＨＳＶ−１ω断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００６９】
配列番号７２ Ｐ２−１ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−２短縮型抗原ヌクレオチド配列。
【００７０】
配列番号７３ Ｐ２−１ｔｒｕｎｃ、ＨＳＶ−２短縮型抗原アミノ酸配列。
【００７１】
配列番号７４ ＢＬαＨＳＶ−２ α断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００７２】
配列番号７５ ＢＬαＨＳＶ−２ α断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００７３】
配列番号７６ ＢＬωＨＳＶ−２ ω断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００７４】
配列番号７７ ＢＬωＨＳＶ−２ ω断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００７５】
配列番号７８ プロテインＧヌクレオチド配列。
【００７６】
配列番号７９ プロテインＧアミノ酸配列。
【００７７】
配列番号８０ ＢＬαＰｒｏＧ、プロテインＧα断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００７８】
配列番号８１ ＢＬαＰｒｏＧ、プロテインＧα断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００７９】
配列番号８２ ＢＬωＰｒｏＧ、プロテインＧω断片コンストラクトヌクレオチド配列。
【００８０】
配列番号８３ ＢＬωＰｒｏＧ、プロテインＧω断片コンストラクトアミノ酸配列。
【００８１】
配列番号８４ ＨＳＶ１のｇＧ１のアミノ酸９２から１４８。
【００８２】
配列番号８５ ＨＶＳ２のｇＧ２のアミノ酸又は５５１から６４１。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する（例えば、細胞生物学、化学及び分子生物学において）。分子及び生化学的方法のために使用される標準的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．及び題名「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」の完全版）で見出すことができる。
【００８４】
特定の実施形態及び実施例の次の詳細な説明は、説明を目的として与えられるものであり、限定するために与えられるものではない。禁忌であるか又は別段の断りがない限り、これらの説明において及び本明細書を通して、「ａ」及び「ａｎ」という用語は、１又は複数を意味する。同様に、「又は」は「及び／又は」を意味する。
【００８５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語に続くものを全て含むがこれらに限定されないことを意味する。従って、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語の使用は、列挙される要素が必要とされるか又は必須であるが、その他の要素は任意であり、存在してもよいししなくてもよいことを示す。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句に続くものを全て含み、それらに限定されることを意味する。従って、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句は、列挙される要素が必要であるか又は必須であり、その他の要素が存在し得ないことを示す。「基本的に、からなる（Ｃｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、この句の後に列挙される何れの要素も含まれ、列挙される要素に対する開示において指定される活性又は作用を妨害しないか又は寄与しないその他の要素に限定されることを意味する。従って、「基本的に、からなる（Ｃｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という句は、列挙される要素が必要とされるか必須であるが、その他の要素は任意であり、それらが列挙される要素の活性又は作用に影響するか否かによって、存在し得るか又はし得ないことを示す。
【００８６】
値の範囲が与えられる場合、途中にある各値、文脈からの明らかな別段の指示がない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間及び何らかのその他の規定されるか又は規定される範囲において途中にある値が本発明内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立に、このより小さい範囲に含まれ得、また本発明内に包含され、規定される範囲における何らかの具体的に除外される制限に制約される。
【００８７】
レポーター成分及びレポーターポリペプチド断片
本発明は、均一インビトロＦＥＣアッセイの単離及び精製成分としての使用に適応させられたポリペプチドを含むかそれらからなるレポーター成分を提供する。このレポーター成分はレポーター系の一部をなす。上記で考察したように、ＦＥＣアッセイにおけるレポーター系は、会合した場合に検出可能なシグナルを生じさせることができるレポータータンパク質複合体を形成する２以上のポリペプチド断片を含む。従って、各レポーター成分は、少なくとも１つのこのようなポリペプチド断片又はサブユニット（本明細書中で、「レポーター断片」と呼ばれる。）を含む。例えば、βラクタマーゼに基づく系の場合、この２つのレポーター成分がアッセイ条件下で会合する場合、結果として得られる複合体がβラクタマーゼ活性を有するように、第一のレポーター成分はβラクタマーゼのα断片を含み得、第二のレポーター成分は、βラクタマーゼのω断片を含み得る。それらの個々のレポーターポリペプチド断片（「サブユニット」とも呼ばれる。）が会合する場合に一緒になって検出可能な酵素活性を生じさせることができる第一のレポーター成分及び第二のレポーター成分の組み合わせは、本明細書中で「レポーター成分ペア」と呼ばれ、個々のレポーターポリペプチド断片はまとめて「レポーター断片ペア」と呼ばれる。
【００８８】
レポーター断片及び系に対する基礎として使用され得るレポーターポリペプチドの例には、β−ラクタマーゼ（例えばＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ：ＥＣ：３．５．２．６）β−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質（例えばホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ）及び緑色蛍光タンパク質を含む蛍光タンパク質が含まれる。レポーターポリペプチドは、通常、会合した場合に元の全長ポリペプチドの活性を再構成することができる２つの断片に分割される。例えば、β−ラクタマーゼ及びβ−ガラクトシダーゼは、通常、２つの断片、α及びω断片に分割される。２つの断片を生じさせるためのこれらの様々なタンパク質のアミノ酸配列における適切な切断点は既に述べている。
【００８９】
レポーターポリペプチド／断片は、それらがインビトロでの使用に適切であるように選択される（疑義を避けるために、本文脈において、インビトロという用語は、アッセイが生きている細胞の外で行われることを意味する。）。このレポーターポリペプチドは、通常、例えば、安定性を促進し、溶解性を向上させ及び／又は凝集性を低下させるための、インビトロでの使用に対するそれらの適合性を向上させるアミノ酸変化を有する野生型配列の変異体である。特に好ましい実施形態において、レポーターポリペプチド／断片は、野生型ポリペプチドと比較して、レポーター機能に必要とされるポリペプチドの活性、例えばβラクタマーゼ活性の、酵素阻害剤などの阻害剤に対する感受性が低下している。このような阻害剤には、試料、例えば、関心のある被分析物質の存在について試験することが必要とされる血液及び血清試料などの生体試料中で見出される化合物、が含まれる。このような阻害剤の特定の例は、血液試料を採取する個体への抗生物質の投与の結果血液中で見られるβ−ラクタマーゼ活性の阻害剤である。
【００９０】
アッセイ条件下で、レポーター活性を有する活性複合体を形成するためのレポーター断片の会合には、通常、レポーター成分のその他の領域と標的被分析物質との間の相互作用が介在する。従って、このレポーター成分は、通常、インタラクター部分又はドメインを含む。
【００９１】
インタラクタードメインは、関心のある標的被分析物質に対する結合特異性を有する。インタラクタードメインには、例えば、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、抗原、抗体及び抗体の抗原結合断片、例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）など、が含まれる。抗原には、病原体由来の抗原、例えばウイルス性又は細菌性抗原など、が含まれる。抗体／ＣＤＲには、病原体、例えばウイルス又は細菌など、由来の抗原に結合する配列が含まれる。インタラクタードメインの特定の例には、プロテインＧのＩｇＧ結合ドメイン及び単純ヘルペスウイルス抗原が含まれる（その特に好ましいものは、ＨＳＶ１からの短縮型糖タンパク質Ｇ１エンベロープタンパク質又はＨＳＶ２からの短縮型糖タンパク質Ｇ２エンベロープタンパク質、例えばｇＧ１のアミノ酸９２から１４８又はｇＧ２の５５１から６４１などである。）。
【００９２】
インタラクタードメインをレポーター断片に直接又はリンカーを介して連結し得る。適切なリンカードメインには、ペプチド、例えばグリシンリッチ反復配列（例えばＧ４Ｓ反復配列−即ちＧＧＧＧＳ配列回復）が含まれる。リンカードメイン、例えばＧ４Ｓドメイン、の数は、１、２、３、４、５、６以上であり得る。ある実施形態において、グリシンリッチ反復配列の数は好ましくは２又は３である（特にインタラクタードメインが１５０又は１００アミノ酸より少ないポリペプチドである場合）。より大きいインタラクタードメインを使用する場合、リンカー長を長くする事が望ましいものであり得る。
【００９３】
ある実施形態において、リンカードメインはフレキシブルである。別の実施形態において、リンカードメインは堅い。
【００９４】
適切なリンカードメイン配列及び／又は何らかの特定のインタラクター及びレポーター断片コンストラクト及び断片対形成に対するリンカードメイン反復の数の選択は、当業者による通常レベルの実験の範囲内である。
【００９５】
レポーター成分を形成するために、レポーター断片ポリペプチド、リンカードメイン及びインタラクタードメインを共有又は非共有手段により連結し得る。
【００９６】
ある実施形態において、リンカードメイン及びインタラクタードメインはポリペプチドである。従って、レポーター成分は１つのポリペプチドであり得る。
【００９７】
別の実施形態において、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、例えばチオ−チオ、アミン−カルボキシル又はアミン−アルデヒド官能基を介した、例えば共有カップリングにより、インタラクタードメインにレポーター断片を連結する。特定の例には、炭水化物基を介した糖タンパク質へのポリペプチドの架橋；例えばアミン反応基及びスルフィドリル反応基を有するヘテロ二官能性架橋剤を用いた、一級アミンを介した架橋（Ｎ末端及びリジン残基で見られる。）；カルボキシル基を介した架橋（Ｃ末端で、及び、グルタミン酸及びアスパラギン酸残基での側基として見られる。）；遊離スルフヒドリル基を介した架橋；及びジスルフィド交換が含まれる。
【００９８】
非共有法には、アビジン−ビオチン系及びオリゴヌクレオチド−タンパク質結合のハイブリッド形成が含まれる。
【００９９】
ある態様において本発明は、本明細書中で開示される酵素ペプチドのアミノ酸配列からなるか又は基本的にそれらからなるか又はそれらを含むものなど、単離又は精製ペプチド及びタンパク質レポーター断片及びレポーター成分を提供する。図面又は配列リストにおいて、本発明の代表的な配列が提供される。提供されるペプチド配列は、本明細書中で、本発明に記載のアッセイのレポーター断片又はレポーターペアメンバー／成分と呼ばれる。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、実質的に細胞性物質不含又は化学的前駆体もしくはその他の化学物質不含であるとき、「単離されている」又は「精製されている」と言われる。本発明のペプチドは、均一になるまで又はその他の程度の純度まで精製され得る。精製レベルは使用目的に基づく。本発明における使用目的は特異的被分析物質に対する均一インビトロＦＥＣアッセイの操作可能な成分である。
【０１０１】
ある使用において、「実質的に細胞性物質不含」には、その他のタンパク質（即ち夾雑タンパク質）が約３０％（乾燥重量）未満である、その他のタンパク質が約２０％未満である、その他のタンパク質が約１０％未満である、又はその他のタンパク質が約５％未満である、ペプチドの調製品が含まれる。ペプチドが組み換え産生される場合、これは実質的に培地不含でもあり得、即ち培地はタンパク質調製品の体積の約２０％未満である。
【０１０２】
「実質的に化学的前駆体又はその他の化学物質不含」という語には、その合成に関与する化学的前駆体又はその他の化学物質からそれが分離されているペプチドの調製品が含まれる。ある実施形態において、「実質的に化学的前駆体又はその他の化学物質不含」という語には、化学的前駆体又はその他の化学物質が約３０％未満（乾燥重量）である、化学的前駆体又はその他の化学物質が約２０％未満である、化学的前駆体又はその他の化学物質が約１０％未満である、又は化学的前駆体又はその他の化学物質が約５％未満である、酵素ペプチドの調製品が含まれる。
【０１０３】
単離レポーター断片及びポリペプチドレポーター成分は、それを発現するように改変されている細胞から精製され得る（組み換え）か、又は既知のタンパク質合成方法を用いて合成され得る。例えば、酵素ペプチドをコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングし、その発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞でそのタンパク質を発現させる。適切な宿主細胞を下記でさらに詳細に記載する。次に、適切なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによりこのタンパク質を細胞から単離し得る。本発明の代表的技術は下記で示す実施例で詳細に記載する。
【０１０４】
ある態様において、本発明は、提供されるアミノ酸配列からなるタンパク質を提供する。あるアミノ酸配列がタンパク質の最終アミノ酸配列である場合、タンパク質はそのアミノ酸配列からなる。さらなる態様において、本発明は、さらに、基本的に提供されるアミノ酸配列からなるタンパク質を提供する。タンパク質は、アミノ酸配列が本発明のタンパク質の機能的特徴を変化させない数個のさらなるアミノ酸残基のみを伴い存在する場合、基本的にこのようなアミノ酸配列からなる。さらなる態様において、本発明は、提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。アミノ酸配列がタンパク質の最終アミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はそのアミノ酸配列を含む。このような様式においてこのタンパク質は、そのペプチドのみであり得るか又は、それと連結されるアミノ酸残基（連続するコードされる配列）又は異種アミノ酸残基もしくはペプチド配列などのさらなるアミノ酸分子を有し得る。このようなタンパク質は、数個のさらなるアミノ酸残基を有し得るか又は数百以上のさらなるアミノ酸を含み得る。様々なタイプのこれらのタンパク質がどのようにして作製され、単離され得るかの簡単な説明は以下で与える。
【０１０５】
キメラ又は融合タンパク質を形成するために、本発明のペプチドは、異種配列に連結され得る。このようなキメラ及び融合タンパク質は、実質的に酵素ペプチドと同種ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に操作可能に連結された酵素ペプチドを含み得る。「操作可能に連結される」とは、それぞれの操作可能性が破壊されないように酵素ペプチド及び異種タンパク質が融合されることを指す。異種タンパク質を酵素ペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合させ得る。
【０１０６】
標準的組み換えＤＮＡ技術によりキメラ又は融合タンパク質を作製し得る。例えば、従来の技術に従い、様々なタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片を一緒にインフレームで連結する。別の実施形態において、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により融合遺伝子を合成し得る。あるいは、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的突出部（続いて、キメラ遺伝子配列を生成させるためにこれをアニーリングし再増幅させ得る。）を生じさせるアンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅又は連結（ライゲーション）を行い得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８）。さらに、既に融合部分をコードする、多くの発現ベクターが市販されている。融合部分がインフレームで酵素ペプチドに連結されるように、酵素ペプチドをコードする核酸をこのような発現ベクターにクローニングし得るが、これは、各成分の操作可能性を破壊することなく融合タンパク質を作製する１つの手段である。
【０１０７】
代替的な配列付番スキームにおける相同位置の同定
２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列の比較において相同的位置を決定するために、最適な比較のために配列を整列（アラインメント）させる（例えば、最適アラインメントのための第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列の一方又は両方においてギャップを導入し得、比較のために非相同配列を無視し得る。）。好ましい実施において、参照配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上を比較のために整列させる。次に、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置に第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドがある場合、その位置において分子は同一であり、２つにおいてその位置は相同である。２つの配列間の％同一性は、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れて（これらは、２つの配列の最適整列のために導入される必要がある。）、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である。
【０１０８】
数学的アルゴリズムを用いて、配列の比較及び２つの配列間の％同一性及び類似性を決定し得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ １、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【０１０９】
例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＢｅｓｔＦｉｔプログラムを用いて、ペアワイズアラインメント及び配列同一性及びホモロジーのレベルを計算し得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている。）を用いて２つのアミノ酸配列間の％同一性を計算し得る（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））。このアルゴリズムは通常、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスの何れか及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップウエイト及び１、２、３、４、５又は６の長さウエイトを用いて、使用される。ＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を用いて、ＮＳＷｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス及び４０、５０、６０、７０又は８０のギャップウエイト及び１、２、３、４、５又は６の長さウエイトとともに、２つのヌクレオチド配列間の％同一性を計算し得る。
【０１１０】
このようにして、アミノ酸に対する１文字表記と、それに続く関連する非置換配列又はペプチドの位置の数と、それに続く置換アミノ酸に対する１以上の１文字表記により、アミノ酸配列又はペプチドのある位置の置換が示される。例えば、添付の配列リスト及び図面で示されるようなＴＥＭ−１β−ラクタマーゼのα断片の位置７２のバリンに対するスレオニンの置換は、Ｖ７４Ｔと呼ばれる。同様の表示は、本明細書中で提供される文脈及びさらなる詳細から明らかとなろう。
【０１１１】
インビトロでのレポーター機能を向上させるためのアミノ酸修飾
本発明のアッセイでの使用のためのレポーターポリペプチド断片は、通常、このようなアッセイでの使用に対するレポーターポリペプチドの適合性を向上させるアミノ酸配列変化又は修飾を含む。特に、好ましい実施形態において、少なくとも１つのレポーターポリペプチド断片は、再構成される活性レポーターポリペプチド複合体の、非修飾（例えば野生型）アミノ酸配列の阻害剤である物質による阻害に対する感受性を低下させる、そのアミノ酸配列における変化又はそのアミノ酸配列に対する修飾を含む。
【０１１２】
このような変異体は、通常、１以上の非保存的アミノ酸の、置換、欠失、挿入、逆転もしくは短縮又は重要な残基もしくは重要な領域における、置換、挿入、逆転もしくは欠失を含有する。機能が変化した変異体はまた、結果として機能が変化しないか又は顕著に変化しない類似アミノ酸の置換も含有し得る。ある実施形態において、変異体は、１、２、３、４又は５個のアミノ酸変化を含有する。
【０１１３】
本発明は、１個のアミノ酸置換又はさらに本明細書中で例示されるように、均一インビトロＦＥＣアッセイでの使用に特に適応させられた組み合わせでの複数の置換を含む修飾β−ラクタマーゼペプチド配列を提供する。このような置換の具体例は、α断片のアミノ酸位置６９での置換（好ましくはＭ６９Ｌ又はＭ６９Ｉ）（これによりβ−ラクタマーゼ阻害剤による阻害が低下する。）及びω断片のアミノ酸位置２７６での置換（好ましくはＮ２７６Ｄ）（これによってもまた、β−ラクタマーゼ阻害剤による阻害が低下する。）である。その他の例は、アミノ酸位置７４、１８２、２０８、２１１及び２３０の１以上での置換（好ましくはＶ７４Ｔ、Ｍ１８２Ｔ、Ｉ２０８Ｔ、Ｍ２１１Ｑ及びＦ２３０Ｙの１以上）から選択される。
【０１１４】
さらなる例は、次の疎水性アミノ酸残基の、疎水性がより低いと考えられる何らかの残基への突然変異であり、アッセイを向上させ得る：Ｖ４４、Ｙ４６、Ｌ４９、Ｌ５１、Ｆ６６、Ｖ７４、Ｌ８１、Ｆ１５１、Ｐ１８３、Ｖ１８４、Ａ１８７、Ｌ１９０、Ｌ１９４、Ｌ１９８、Ｌ１９９、Ｌ２０７、１２０８、Ｗ２１０、Ｍ２１１、Ａ２３２、Ｉ２４７、Ａ２４９、Ｐ２５７、１２６０、Ｉ２６１、Ｉ２６２、Ｉ２６３、Ｙ２６４、Ｉ２８２、Ｌ２８６（特に太字及び下線付きの残基）。
【０１１５】
与えられるアミノ酸の付番は、配列番号１及び３で示される野生型ＴＥＭ−１βラクタマーゼ配列を基準にしている。しかし、当然のことながら、等価位置で相同βラクタマーゼ配列にも修飾が適用され得る（配列アラインメントによる等価位置の決定に関する先行するセクションを参照。）。
【０１１６】
様々な技術を使用して、均一アッセイなどインビトロアッセイでの使用に対する特性が向上している修飾されたレポーター断片を得ることができる。例えば、部位特異的突然変異誘発により配列変化を導入し得る。適切な部位の選択は、例えば、ｘ線結晶学又はＮＭＲなどの技術により決定された構造情報を含む一次アミノ酸配列及び／又は二次／三次構造情報が手がかりとなり得る。例えば、阻害剤に対する感受性が低下している変異体の設計を支援するために、酵素の活性部位の３Ｄ構造を使用することができる（例えば、Ｊｅｌｓｃｈ、Ｃ、Ｆ．Ｌｅｎｆａｎｔら、１９９２、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２９９（２）：１３５−４２に記載のようなＴＥＭ１の結晶構造参照）。
【０１１７】
無作為突然変異誘発又は定方向分子進化などの技術と、それに続く所望の特性を有する変異体の選択によっても、特性が向上している修飾されたレポーター断片を得ることができる（例えば非修飾タンパク質の阻害剤の存在下で酵素活性について変異体を試験することによって）。
【０１１８】
本発明において有用なさらなる修飾は、一般に２０種類の天然に存在するアミノ酸と言われる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含有する配列を含み得る。さらなる修飾には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン付加などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファー−ＲＮＡ介在付加及びユビキチン化が含まれる。
【０１１９】
従って、本発明のペプチド及びコンストラクトはまた、置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされるものではない誘導体又は類似体も包含し、これには置換基が含まれ、ここでは、成熟酵素ペプチドが、酵素ペプチドの半減期を延長させるための化合物などの別の化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合されるか、又はリーダーもしくは分泌配列もしくは成熟酵素ペプチド又はプロタンパク質配列の精製のための配列などのさらなるアミノ酸が成熟酵素ペプチドに融合させられる。
【０１２０】
核酸分子
本発明は、本明細書中に記載のようなレポーターポリペプチド断片及びレポーター成分を含む、酵素ペプチド又は本発明のタンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。特定の実施形態において、本発明は、図面及び添付の配列リストに記載のような本発明の酵素ペプチド又はタンパク質及び様々な修飾又はその断片をコードする単離核酸分子を提供する。このような核酸分子は、本発明のペプチド又はコンストラクトの１つをコードするヌクレオチド配列からなるか又は基本的にそれらからなるか又はそれらを含む。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、「単離（された）」核酸分子は、その核酸の天然の源に存在するその他の核酸から分離されているものである。さらに、転写産物又はｃＤＮＡ分子など、「単離（された）」核酸分子は、実質的にその他の細胞性物質又は、組み換え技術により産生される場合は培地又は、化学合成される場合は化学的前駆体もしくはその他の化学物質不含である。しかし、本核酸分子は、その他のコード配列又は調節配列と融合され得、それでも単離されているとみなされ得る。
【０１２２】
例えば、ベクター中に含有される組み換えＤＮＡ分子は単離されているとみなす。単離ＤＮＡ分子のさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組み換えＤＮＡ分子又は溶液中の精製（部分的又は実質的に）ＤＮＡ分子が含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明の単離ＤＮＡ分子ならびにその新規断片のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写が含まれる。本発明による単離核酸分子にはさらに、合成により作製されるこのような分子が含まれる。
【０１２３】
従って、本発明は、提供されるヌクレオチド配列からなる核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列がその核酸分子の完全ヌクレオチド配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列からなる。本発明は、基本的に提供されるヌクレオチド配列からなる核酸分子をさらに提供する。このようなヌクレオチド配列が最終核酸分子において数個のさらなる核酸残基のみとともに存在する場合、核酸分子は基本的にヌクレオチド配列からなる。
【０１２４】
本発明はさらに、提供されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の最終ヌクレオチド配列の少なくとも一部である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。このような様式において、この核酸分子は、そのヌクレオチド配列のみであるか又はそれと天然に結合される核酸残基又は異種ヌクレオチド配列などのさらなる核酸残基を有し得る。このような核酸分子は、数個のさらなるヌクレオチドを有し得るか又は数百以上のさらなるヌクレオチドを含み得る。様々なタイプのこれらの核酸分子がどのようにして容易に作製又は単離され得るかについての簡単な説明は以下で与える。
【０１２５】
単離核酸分子には、以下に限定されないが、酵素ペプチドのみをコードする配列、成熟ペプチドをコードする配列及びさらなるコード配列、例えばリーダー又は分泌配列など（例えば、プレプロ又はプロタンパク質配列）、さらなるコード配列を伴うか又は伴わない成熟ペプチドをコードする配列、さらに、さらなる非コード配列、例えばイントロン及び非コード５’及び３’配列、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含む。）、リボソーム結合及びｍＲＮＡの安定性に寄与する転写されるが翻訳されない配列などが含まれる。さらに、例えば精製を促進するペプチドをコードするマーカー配列に本核酸分子を融合させ得る。
【０１２６】
単離核酸分子は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態又はクローニングにより得られるかもしくは化学合成技術により作製されるかもしくはそれらの組み合わせにより作製されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であり得る。核酸、特にＤＮＡは、２本鎖又は１本鎖であり得る。１本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１２７】
遺伝子コードの縮重を斟酌すれば、配列は、それらが本発明のヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、通常は少なくとも約６０％、より一般的には約７０％、最も一般的には約８０％、好ましくは少なくとも約９０％及び最も好ましくは約９５％のヌクレオチドにおいて同一である場合、基本的に同じであるとみなされる。示されるものと基本的に同じである配列もまた、標準的条件下でポリヌクレオチドの相補性を含有する核酸セグメントとハイブリッド形成することができる配列として機能上定義され得る。「非常に関連のある配列」という用語は、本明細書中で、比較されているポリヌクレオチド又はポリペプチドと最小又は５０％の類似性がある配列を指すために使用される。
【０１２８】
当然、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの配列と相補的であるか又は基本的に相補的であるオリゴヌクレオチドも包含する。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補性規則に従い塩基対形成することができるものである。本明細書中で使用される場合、「相補的配列」という用語は、上記で述べた同じヌクレオチド比較により評価され得るように、又は本明細書中に記載のものなどの比較的厳しい条件下でのポリヌクレオチドの核酸セグメントとのハイブリッド形成が可能であるとして定義されるように、実質的に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。
【０１２９】
本発明の核酸の変異体は、当技術分野で周知の方法を用いて同定され得る。これらの変異体は、図面で示されるヌクレオチド配列又はこの配列の断片に対して通常は６０−７０％、７０−８０％、８０−９０％及びより一般的には少なくとも約９０−９５％以上の相同性があるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。図面で示されるヌクレオチド配列又はこの配列の断片に対して、中程度から厳しい条件下でハイブリッド形成できるものとしてこのような核酸分子を容易に同定し得る。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、及び当業者にとって周知のように、核酸ハイブリッド形成に対する「高ストリンジェンシー条件」、「中程度のストリンジェンシー条件」及び「低いストリンジェンシー条件」は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」の２．１０．１−２．１０．１６及び６．３．１−６頁で説明されている（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（１９９８））。ハイブリッド形成のストリンジェンシーを決定する的確な条件は、イオン強度（例えば、０．２ｘＳＳＣ、０．１ｘＳＳＣ）、温度（例えば、室温、４２℃、６８℃）及びホルムアミドなどの脱安定化剤又はＳＤＳなどの変性剤の濃度だけでなく、ヌクレオチド配列の長さ、塩基組成、ハイブリッド形成する配列間の％ミスマッチ及びその他の非同一配列内でのその配列のサブセットの出現頻度にも依存する。従って、高、中程度又は低ストリンジェンシー条件を実験的に決定することができる。ハイブリッド形成が起こらないストリンジェンシーレベルから、ハイブリッド形成が最初に観察されるレベルへとハイブリッド形成条件を変化させることにより、ある配列を試料中で最も類似した配列と（例えば選択的に）ハイブリッド形成させることができる条件を決定することができる。
【０１３１】
代表的な条件はまた、Ｋｒａｕｓｅ、Ｍ．Ｈ．及びＳ．Ａ．Ａａｒｏｎｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２００：５４６−５５６ （１９９１）にも記載されている。Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（１９９８）（これは、中程度又は低ストリンジェンシー条件に対する洗浄条件の決定を記載する。）も参照のこと。洗浄は、通常はハイブリッドの相補性の最小レベルを決定するように条件が設定される段階である。一般に、相同のハイブリッド形成のみが起こる最低温度から開始して、最終洗浄温度を１℃低下させることにより（ＳＳＣ濃度を一定に保持）、ハイブリッド形成する配列間でミスマッチする程度を最大で１％上昇させることができる。一般に、ＳＳＣの濃度を倍にすると、Ｔｍが約１７℃上昇する。これらのガイドラインを使用して、求められるミスマッチのレベルに依存して、高、中程度又は低ストリンジェンシーに対して実験的に洗浄温度を決定することができる。
【０１３２】
例えば、低ストリンジェンシー洗浄は、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する溶液中での室温にて１０分間の洗浄を含み得；中程度のストリンジェンシー洗浄は、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する前もって加温した溶液（４２℃）中での４２℃にて１５分間の洗浄を含み得；高ストリンジェンシー洗浄は、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含有する前もって加温した（６８℃）溶液中での６８℃にて１５分間の洗浄を含み得る。さらに、当技術分野で公知のように所望の結果を得るために洗浄を繰り返して又は連続して行い得る。当技術分野で公知のように、標的核酸分子と使用されるプライマー又はプローブとの間の同一性又は類似性の程度を同様に維持しながら、例として与えられるパラメーターの１以上を変化させることにより、同等の条件を決定することができる。
【０１３３】
ベクター／宿主細胞
本発明はまた、本明細書中に記載の核酸分子を含有するベクターも提供する。「ベクター」という用語は、ビヒクル、好ましくは核酸分子を指し、これは核酸分子を輸送し得る。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクター核酸に共有結合される。本発明のこの態様により、ベクターには、プラスミド、１本鎖もしくは２本鎖ファージ、１本鎖もしくは２本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクター又は人工染色体、例えばＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲ ＭＡＣなど、が含まれる。
【０１３４】
ベクターは、染色体外エレメントとして宿主細胞中に維持され、ここでベクター核酸分子のさらなるコピーを複製し産生し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに一体化され得、宿主細胞が複製する場合、核酸分子のさらなるコピーを産生し得る。
【０１３５】
本発明は、核酸分子の、維持のためのベクター（クローニングベクター）又は発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核又は真核細胞又は両方（シャトルベクター）で機能し得る。
【０１３６】
発現ベクターは、核酸分子の転写が宿主細胞中で可能となるように、ベクターにおいて核酸分子に操作可能に連結されるシス作用調節領域を含有する。転写に影響を与えることができる別個の核酸分子とともに宿主細胞に核酸分子を導入し得る。このようにして、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を可能とするために、シス調節制御領域と相互作用するトランス作用因子を提供し得る。あるいは、宿主細胞によりトランス作用因子が供給され得る。最後に、ベクターそのものからトランス作用因子が産生され得る。しかし、ある実施形態において、核酸分子の転写又は翻訳が細胞不含系で起こり得ることを理解されたい。
【０１３７】
本明細書中に記載の核酸分子が操作可能に連結され得る調節配列には、ｍＲＮＡ転写を支配するためのプロモーターが含まれる。これらには、以下に限定されないが、バクテリオファージＸからの左プロモーター、Ｅ．コリからの、ｌａｃ、ＴＲＰ及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター及びレトロウイルスの長い末端反復が含まれる。
【０１３８】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターにはまた、リプレッサー結合部位及びエンハンサーなど、転写を調節する領域も含まれ得る。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー及びレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
【０１３９】
転写開始及び制御のための部位を含有することに加えて、発現ベクターはまた、転写終結に必要な配列及び、転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位も含有し得る。発現のためのその他の調節制御エレメントには、開始及び終結コドンならびにポリアデニル化シグナルが含まれる。当業者は、発現ベクターにおいて有用である多くの調節配列を知っている。このような調節配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【０１４０】
核酸分子を発現させるために、様々な発現ベクターを使用し得る。このようなベクターには、染色体、エピソーム及びウイル由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来（酵母人工染色体を含む。）、ウイルス由来（バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルスなど）などのベクターが含まれる。ベクターはまた、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素由来のものなどのこれらの源の組み合わせ由来でもあり得る（例えばコスミド及びファージミド）。原核及び真核宿主に対する適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記箇所、に記載されている。
【０１４１】
調節配列は、１以上の宿主細胞において構成的な発現を与え得る（即ち組織特異的）か又は、１以上の細胞型において、温度、栄養素添加物又は外生要因（ホルモン又はその他のリガンドなど）などによる誘導性発現を与え得る。原核及び真核宿主において構成的で誘導性である発現を与える様々なベクターは、当業者にとって周知である。
【０１４２】
周知の方法によって核酸分子をベクター核酸に挿入し得る。一般に、１以上の制限酵素を用いてＤＮＡ配列及び発現ベクターを切断し、次いで断片を一緒に連結することにより、最終的に発現されるＤＮＡ配列を発現ベクターに連結する。
【０１４３】
制限酵素消化及びライゲーションのための手順は当業者にとって周知である。
【０１４４】
周知の技術を用いて増殖又は発現のために、適切な核酸分子を含有するベクターを適切な宿主細胞導入し得る。細菌細胞には、以下に限定されないが、Ｅ．コリ、ストレプトミセス及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌）が含まれる。真核細胞には、以下に限定されないが、酵母、昆虫細胞（ショウジョウバエなど）、動物細胞（ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞など）及び植物細胞が含まれる。
【０１４５】
本明細書中に記載のように、特に完全レポーター断片ペアメンバーコンストラクトを発現する場合、融合タンパク質として本発明のペプチドを発現することが望まれ得る。従って、本発明は、このようなペプチドの産生を可能にするベクターを提供する。これらのベクターは、組み換えタンパク質の発現を増加させ、組み換えタンパク質の溶解性を向上させ、例えばアフィニティー精製に対するリガンドとして作用することによりタンパク質の精製を促進し得る。所望のペプチドが最終的に融合部分から分離され得るように融合部分の連結点にタンパク質分解性切断部位を導入し得る。タンパク質分解酵素には、以下に限定されないが、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロ酵素（ｅｎｔｅｒｏｅｎｚｙｍｅ）が含まれる。典型的な融合発現ベクターには、標的組み換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はプロテインＡを融合する、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ．）が含まれる。適切な誘導性の非融合Ｅ．コリ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５（１９８８））及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９（１９９０））が含まれる。
【０１４６】
タンパク質分解により組み換えタンパク質を切断する能力を宿主細胞が損なう遺伝的背景を与えることによって、宿主細菌において組み換えタンパク質発現を最大限にし得る（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｓ．、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８）。あるいは、特異的な宿主細胞、例えばＥ．コリに対して選択的なコドンをもたらすために、関心のある核酸分子の配列を変化させ得る（Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８（１９９２））。
【０１４７】
酵母において操作可能である発現ベクターによって、核酸分子を発現させることもできる。酵母、例えば、Ｓ．セレビシエにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｊａｎら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３（１９８７））及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
【０１４８】
例えばバキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において核酸分子を発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５（１９８３））及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９））が含まれる。
【０１４９】
本発明のある実施形態において、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において本明細書中に記載の核酸分子を発現させる。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５（１９８７））が含まれる。
【０１５０】
核酸分子を発現させるために有用である当業者にとって利用可能な周知のベクターのほんの一例として、本明細書中で列挙される発現ベクターが与えられる。当業者は、本明細書中に記載の核酸分子の維持増殖又は発現に適切なその他のベクターを知っている。これらは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前記箇所、で見出される。
【０１５１】
本発明はまた、本明細書中に記載のヌクレオチド配列がベクターに逆方向でクローニングされるが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にする調節配列へ操作可能に連結されるベクターも包含する。このようにして、コード及び非コード領域の両方を含め、本明細書中に記載の核酸分子配列の全て又は一部に対して、アンチセンス転写産物が産生され得る。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現と関連する上述のパラメータのそれぞれに影響を受ける（調節配列、構成的又は誘導性発現、組織特異性発現）。
【０１５２】
本発明は、本明細書中に記載のベクターを含有する組み換え宿主細胞にも関する。従って、宿主細胞には、原核細胞、下等な真核細胞（酵母など）、その他の真核細胞（昆虫細胞など）及び高等真核細胞（哺乳動物細胞など）が含まれる。宿主細胞には、以下に限定されないが、カイコ幼虫、ＣＨＯ細胞、Ｅ．コリ及び酵母が含まれ得る。
【０１５３】
当業者にとって容易に利用可能な技術により細胞に本明細書中に記載のベクターコンストラクトを導入することによって、組み換え宿主細胞を調製する。これらには、以下に限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション（遺伝子移入）、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、陽イオン脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション及びその他の技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記箇所、で見出されるものなど）が含まれる。
【０１５４】
宿主細胞は、複数のベクターを含有し得る。このようにして、同じ細胞の様々なベクターにおいて様々なヌクレオチド配列を導入し得る。同様に、単独で又はその核酸分子と関連のないその他の核酸分子（発現ベクターに対するトランス作用因子を与えるものなど）とともに、の何れかで、核酸分子を導入し得る。複数のベクターを細胞に導入する場合、ベクターを独立に導入するか、同時に導入するか又は核酸分子ベクターに連結し得る。
【０１５５】
バクテリオファージ及びウイルスベクターの場合、感染及び形質導入のための標準的手順によって、パッケージされるか又はカプセル封入されたウイルスとして細胞にこれらを導入し得る。ウイルスベクターは、複製可能であるか又は複製欠損性であり得る。ウイルス複製が欠損している場合、欠損を補完する機能を与える宿主細胞で複製が起こる。
【０１５６】
ベクターは、一般に、組み換えベクターコンストラクトを含有する細胞のサブ集団の選択を可能にする選択可能マーカーを含む。このマーカーは、本明細書中に記載の核酸分子を含有する同じベクター中に含有され得るか又は別個のベクター上にあり得る。マーカーには、原核宿主細胞に対するテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子及び真核宿主細胞に対するジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性が含まれる。しかし、表現型形質に対する選択を可能にする何らかのマーカーが有効である。
【０１５７】
適切な調節配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳動物細胞及びその他の細胞で成熟タンパク質が産生され得る一方、本明細書中に記載のＤＮＡコンストラクト由来のＲＮＡを用いてこれらのタンパク質を産生させるために細胞不含転写及び翻訳系も使用し得る。
【０１５８】
ペプチドの分泌が所望され、酵素などの複数膜貫通ドメイン含有タンパク質によって達成することが困難である場合、適切な分泌シグナルをベクターに組み込む。シグナル配列は、これらのペプチドにとって内在性であるかこれらのペプチドにとって異種性であり得る。
【０１５９】
ペプチドが培地に分泌されない場合、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、溶解剤の使用などを含む標準的破壊手順によって宿主細胞からタンパク質を単離し得る。次に、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィーを含む周知の精製法により、ペプチドを回収し、精製し得る。
【０１６０】
ある実施形態において、Ｅ．コリなどの細菌宿主細胞においてポリペプチドを発現させ、タンパク質を可溶化するためにグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）又は尿素などのカオトロピック剤を用いて宿主細胞に存在する封入体からタンパク質を抽出する。次に、ポリペプチドにおいて存在する融合タグ（例えば６ｘＨｉｓタグ）を介してクロマトグラフィーマトリクスなどの固相にポリペプチドを結合させる。夾雑物を除去するために固相を洗浄したら、カオトロピック剤の濃度勾配を適用することにより、固相に結合したままポリペプチドを好ましくは再び折り畳ませる（試薬の濃度が低下するにれてポリペプチドが再び折り畳まれる。）。発明者らは、この方法を用いることで、結果として均一アッセイにおいてレポーター断片が優れたインビトロ活性を有するようになることを見出した。
【０１６１】
本明細書中に記載のペプチドの組み換え産生における宿主細胞に依存して、ペプチドが様々なグリコシル化パターンを有し得、細胞によっては、細菌で産生される場合グリコシル化されない可能性があることも理解されたい。さらに、ペプチドは、宿主が介在するプロセスの結果、ある場合においては、最初の修飾メチオニンを含み得る。
【０１６２】
本明細書中に記載のペプチドを発現する組み換え宿主細胞には様々な用途がある。最初に、この細胞は、酵素タンパク質又は断片の所望の量を産生させるためにさらに精製され得る酵素タンパク質又はペプチドを産生させるのに有用である。このようにして、発現ベクターを含有する宿主細胞はペプチド産生にとって有用である。
【０１６３】
宿主細胞はまた、上述のものならびに当技術分野で公知のその他の形式など、酵素タンパク質又は酵素タンパク質断片を含む細胞を利用したアッセイを遂行するのにも有用である。このようにして、ネイティブ酵素タンパク質を発現する組み換え宿主細胞は、酵素タンパク質機能を刺激又は阻害する化合物をアッセイするために有用である。
【０１６４】
宿主細胞はまた、これらの機能が影響を受けている酵素タンパク質突然変異を同定するためにも有用である。この突然変異が天然のものであり、病原性を生じさせる場合、突然変異を含有する宿主細胞は、ネイティブ酵素タンパク質におけるそれらの影響により示され得ない突然変異酵素タンパク質における所望の効果（例えば、刺激又は阻害機能）を有する化合物をアッセイするために有用である。
【０１６５】
均一アッセイ
関心のある標的被分析物質の存在を調べるために、インビトロアッセイにおいて、本発明の、レポーター断片、ポリペプチド及びレポーター成分を使用することができる。関心のある被分析物質には、環境又は生体試料中に存在するものが含まれる。生体試料には、全血、血清、唾液及び尿が含まれる。「インビトロ」という用語は、この背景中で、細胞不含アッセイなど、生きている細胞の外でアッセイが行われることを意味する。
【０１６６】
本発明のアッセイ法は、通常、レポーター成分と試料を混合することと、関心のある被分析物質へのレポーター成分の結合が介在するレポーター断片／レポーター成分の会合の結果として得られる検出可能なシグナルの有無（又は程度）を調べることと、を含む。
【０１６７】
検出可能なシグナルは、例えば、比色シグナル、蛍光シグナル又は化学発光シグナルであり得る。例として、β−ラクタマーゼはニトロセフィンを切断して、黄色から赤への色の変化を生じさせ得る。ルシフェラーゼは、基質ルシフェリンにおいて作用して、化学発光シグナルを生じさせる。
【０１６８】
インビトロアッセイに必要とされるレポーターポリペプチドの量は、通常、インビボで見出されるものより多い。例えば、反応混合液中のレポートポリペプチドの濃度は、少なくとも１ｐＭ、例えば少なくとも１０又は１００ｐＭなど、又は１ｎＭであり得る。従って、レポーター複合体のメンバー間の自発的会合の可能性を低下させる反応混合液中に試薬を含むことが望ましいものであり得る。このような試薬には、カオトロピック剤／タンパク質変性剤、例えば尿素など（例えば２００から７００ｍＭの濃度、約５００ｍＭなど）、が含まれる。低濃度の尿素で酵素断片が部分的に変性し、それにより互いにそれらの天然の親和性（自然発生的相補性）が低下し、一方で、被分析物質により近接近へと方向付けされた場合（強制的相補性）、相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが、実施例１で特定された。
【０１６９】
バックグラウンドの低下／ノイズに対するシグナル比の増加を促進するために含まれることが望ましいものであり得るその他の試薬は、（ｉ）エタノールなどの溶媒（好ましくは２％から１０％ｖ／ｖ、例えば３％から８％ｖ／ｖなど）；イソプロパノール（好ましくは２％から１０％ｖ／ｖ、例えば３％から８％ｖ／ｖなど）；メタノール（好ましくは５％から１０％ｖ／ｖ）；ＤＭＳＯ（好ましくは１０％から２０％ｖ／ｖ）又はアセトニトリル（好ましくは２％から１０％ｖ／ｖ、例えば３％から８％ｖ／ｖなど）；（ｉｉ）ＢＳＡ；（ｉｉｉ）Ｔｗｅｅｎ−２０などの界面活性剤（例えば０．１％から０．２５％ｖ／ｖ又はＴｒｉｔｏｎＸ１００（好ましくは０．２％超、例えば０．２％から０．４％ｖ／ｖなど）；（ｉｖ）塩、例えばＮａＣｌ、Ｋ２ＳＯ４又は（ＮＨ４）２ＳＯ４；及び／又は（ｖ）イミダゾール（好ましくは５から２０ｍＭ、例えば５から１５ｍＭなど）である。
【０１７０】
本発明のレポーターポリペプチド及びレポーター成分は、インビトロ均一アッセイでの使用に限定されない。これらはまた、少なくとも１つのレポーター断片又はレポーター成分が固相に固定化されるインビトロ不均一アッセイでも使用され得る。これらは、適切な条件下で細胞においてレポーターポリペプチドの発現を支配することができる本発明のヌクレオチドコンストラクトで細胞に対して形質転換／遺伝子移入を行うことにより細胞に一般には導入されている成分とともにインビボアッセイでも使用され得る。
【０１７１】
キット
本発明はまた、キットとしてもレポーター断片及び／又はレポーター成分を提供する。試料中の被分析物質の存在及び／又は量を調べるためのインビトロアッセイなどＦＥＣアッセイに対してこのようなキットを使用し得る。キットは、本発明の１以上のレポーターポリペプチド断片及び／又はレポーター成分を含む。このキットは、通常、関心のある被分析物質の存在下で検出可能なシグナルを生成させることができる活性ポリペプチド複合体を一緒に形成することができるペアなど、本発明の複数のポリペプチド断片及び／又はレポーター成分を含む。
【０１７２】
キットはまた使用説明書も含み得る。その他の任意の成分には、緩衝液、標準物質、検出試薬などが含まれる。
【０１７３】
実施例
次の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。当業者にとって当然のことながら、続く実施例で開示される技術は、本発明の実施においてよく機能することが発明者により発見された技術を表し、従って、その実施に対して好ましい様式を構成すると考えられ得る。しかし、当業者は、本発明の開示に照らして、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において多くの変更がなされ得、依然として同様又は類似の結果が得られ得ることを認めよう。
【実施例１】
【０１７４】
２価陽イオンに対する均一インビトロＦＥＣアッセイ
本明細書中で概説される手順は、アミノ酸１９６／１９７で全長親酵素を分割し、次いで切断点末端でフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）を導入することにより生成されるＴＥＭ１断片の合成及び特性決定を述べる。疎水性相互作用及び凝集性を低下させ、タンパク質安定性を向上させるために、次のα断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）を使用して点突然変異を導入した。断片のアミノ酸配列に対するこれらの変化の結果、αＶ７４ＴＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．２）及びωＭ２１１Ｑ断片（ＰＢ１３：１）が得られた。
【０１７５】
フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）及びインタラクタードメイン（ポリヒスチジンタグ（６ｘＨ））を含むレポーター断片ペアメンバーを構築するために、これらのペプチド及びそれらをコードする核酸を使用した。フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）、ポリヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）及び点突然変異の位置を示すＤＮＡ配列データを提供する。これらの断片ペアメンバーを単離し、精製し、被分析物質の存在に関する操作可能な均一インビトロＦＥＣアッセイを構成するために使用した。
【０１７６】
α及びω断片をコードするＴＥＭ１遺伝子のＰＣＲ
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてｐＵＣ１８からＴＥＭ１βラクタマーゼをコードするｂｌａ遺伝子を増幅した。製造者の推奨に従い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．１１７０８−０２１）を用いて全ての増幅を行った。ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）からカスタムメードのオリゴヌクレオチドプライマーを購入した。フォワードプライマーＦＥＣ１６及びリバースプライマーＦＥＣ２７を用いて、Ｃ末端Ｇ４Ｓリンカー及びヒスチジンタグを有するＴＥＭ１のα断片を増幅した。
【０１７７】
フォワードプライマーＦＥＣ２４及びリバースプライマーＦＥＣ２９（表１参照−ＰＣＲ、配列決定及び突然変異誘発のために使用されるプライマーの説明のためのプライマー配列）を用いて、Ｎ−末端ヒスチジンタグ及びＧ４Ｓリンカーを有するＴＥＭ１のω断片を増幅した。ｐＥＴ−２６ｂ（＋）へのＰＣＲ産物のクローニングのために、フォワードプライマーの５’末端に目的ベクターＮｄｅＩ制限部位を組み込み、ＸｈｏＩ制限部位をリバースプライマーの５’末端に組み込んだ。
【０１７８】
１％ＴＡＥアガロースゲル上で各ＰＣＲ反応液４μＬアリコートを分析した（１００Ｖで３０分間）。
【０１７９】
【表１】
【０１８０】
ＰＣＲ産物の精製及びＥ．コリ宿主細胞へのクローニング
製造者の説明書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｃａｔ．２８１０４）を用いて反応チューブからＰＣＲ産物を直接精製した。
【０１８１】
ｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ．６９８６２−３）、Ｅ．コリでの組み換えタンパク質の誘導性発現を可能にする原核発現ベクターのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にＰＣＲ産物をクローニングした。製造者の説明書に従い、連結したプラスミドをＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ．２３０１３２）へと形質転換した。既に述べたようなＮｄｅＩ／ＸｈｏＩでの制限消化及びゲル電気泳動による消化産物の分析により、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター内のクローニング挿入配列の存在を確認するために各形質転換体からの５から１０個のコロニーをスクリーニングした。突然変異が起こっていることを確認するために、ＤＮＡ配列決定（プライマーＦＥＣ１０及びＦＥＣ１１−表１を用いて）によっても特定のクローンをチェックした。
【０１８２】
部位特異的突然変異誘発
製造者の説明書（Ｒｅｖ＃１２４００１ｅ）に記載のように、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ．２００５２２）を用いて、α断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）の部位特異的突然変異誘発を行った。Ｅ．コリのコドン使用頻度を考慮に入れて（ｗｗｗ．ｋａｚＵＳＡ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎでアクセス可能）、ベクターＮＴＩ９．０．０（２００３年９月２日）を用いて、配列操作及びプライマー設計を行った。プライマー（使用されるフォワード及びリバースプライマーの詳細な説明については表１を参照。）は、ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により、合成され、ＨＰＬＣを使用して精製された。
【０１８３】
簡潔に述べると、次のようなＰＣＲ増幅突然変異誘発反応において、鋳型として、既に述べたように単離し定量したα断片及びω断片プラスミドＤＮＡを使用した；１２５ｎｇフォワードプライマー（ＦＥＣ４７又はＦＥＣ４９）、１２５ｎｇリバースプライマー（ＦＥＣ４８又はＦＥＣ５０）、１ｘ反応緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ混合液、３μＬ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ及び超純水に、２５ｎｇ鋳型ＤＮＡを５０μＬの最終体積まで添加した。次に１μＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）を添加し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ勾配サーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で温度サイクルを行った。Ｖ７４Ｔ及びＭ２１１Ｑ点突然変異の導入のために、次のようにＰＣＲサイクルを行った；９５℃ｘ１分で変性及び、９５℃ｘ５０秒（変性）、６０℃ｘ５０秒（アニーリング）及び６８℃ｘ６分（伸長）を１８サイクル、サイクル完了時に６８℃ｘ６分の最終伸長段階。Ｍ１８２Ｔ突然変異の導入のためのＰＣＲサイクル条件は少し異なり、鋳型としてαＶ７４Ｔ断片を用い、それぞれＦＥＣ５５及びＦＥＣ５６フォワード及びリバースプライマーを用いて、６５℃ｘ５０秒でアニーリングを行った。続いて、非突然変異親ＤＮＡを消化するために、ＰＣＲ増幅された突然変異誘発反応物を１μＬ ＤｐｎＩ制限酵素（１０Ｕ／μＬ）（各反応に直接添加）で消化し、３７℃で１時間温置した。次に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キットの製造者の説明書（Ｒｅｖ＃１２４００１ｅ）で概説されるようにＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｕｌｔｒａコンピーテント細胞を形質転換するために、各試料反応液からのＤｐｎＩ処理ＤＮＡ ２μＬを使用した。既に概説されているように、点突然変異の正しい挿入を確認するために、得られたプラスミドＤＮＡの配列決定を行ってＥ．コリ形質転換体をスクリーニングした。次に、タンパク質発現及び精製に対して述べられているように、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞を形質転換するために、所望の突然変異を組み込んでいるプラスミドＤＮＡを使用した。
【０１８４】
これらの点突然変異の導入の結果、断片の溶解性が向上し、最終産物の凝集性が低下し、これらは、均一インビトロＦＥＣアッセイならびに製造プロセスでの使用に非常に有利である（例えば表２）。
【０１８５】
【表２】
【０１８６】
α及びω断片の精製及び特性決定
下記で述べるように、触媒作用の速度及びＮｉとの強制的酵素相補性におけるノイズに対するシグナル比を直接比較するために、同様にして、全ての４つの酵素断片［α断片（ＰＢ１１）、ω断片（ＰＢ１３）、αＶ７４ＴＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．２）及びωＭ２１１Ｑ断片（ＰＢ１３．１）］を発現させ、精製し、特性決定を行った。
【０１８７】
α断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）の発現
次のようにＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）での断片の発現を行った；カナマイシン５０μｇ／ｍＬを添加したＬＢブロス１０ｍＬに関心のある１個のコロニーを接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら液体培地を一晩（〜１４時間）３７℃で温置した。次に、２Ｌコニカルフラスコ中のカナマイシン５０μｇ／ｍＬを添加した２５０ｍＬ Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ．７１４９１−４）に接種するために、この培養物を使用した。２５０ｒｐｍで一晩振盪しながら、３７℃で２４時間、この培養物を温置した。ここで使用したＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ培地により、高細菌密度でのタンパク質発現の自己誘導が可能となる（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｕｓｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＴＢ３８３ Ｒｅｖ．Ｆ０５０５を参照）。細菌培養物が静止期に到達すると最適タンパク質発現が起こるが、これは、６００ｎｍで行った光学密度読み取りに基づき、２４時間以内に起こることが分かった。続いて、３，２２０ｘｇで３０分間（４℃）、細胞を沈殿させ、上清を廃棄した。タンパク質精製まで−２０℃で細胞ペレットを保存した。
【０１８８】
変性条件下での組み換えタンパク質の抽出
［６Ｍ ＧｕＨＣｌ １００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８］２５ｍＬ中で、一晩誘導した２５０ｍＬからのペレットを溶解し、続いて１００ｒｐｍで振盪しながら、４℃で１時間温置した。溶解を促進するために、Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクルで懸濁液を超音波処理した。超音波処理後、１２，０００ｘｇで３０分間（４℃）溶解液を遠心し、次いで細胞残屑を除去するために０．２μｍフィルターに通した。
【０１８９】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＲａｄ ｃａｔ．７６０−００３７）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換えＨｉｓタグ付加タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で、８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ １０カラム体積（ＣＶ）によりＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。次に、０．５ｍＬ／分でモデルＥＰ−１ Ｅｃｏｎｏｐｕｍｐ（ＢｉｏＲａｄ ｃａｔ．７３１−８１４２）を使用して、透明化したＥ．コリ溶解液をカラムに載せた。８Ｍ 尿素 １００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．３ １０ＣＶでカラムを洗浄した。１ｍＬ／分の、８Ｍ 尿素 １００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ２００ｍＭ Ｌ−アルギニン １００μＭ ＧＳＳＧ ｐＨ７．５から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ２００ｍＭ Ｌ−アルギニン １００μＭ ＧＳＳＧ ｐＨ７．５ ６０ＣＶ勾配で、結合タンパク質を再び折り畳ませた。２５０ｍＭイミダゾール ５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ゲルろ過及び質量分析により分析した。
【０１９０】
変性断片のカラム上再折り畳みがβ−ラクタマーゼのα及びω断片（野生型及び突然変異があるもの）の両方の産生において非常に効果的であることが分かった。この方法は、ネイティブ物質の精製法を凌ぐ利点があり、大規模の製造プロセスに適切である。
【０１９１】
ゲルろ過
場合によって、酵素断片のアフィニティー精製後、ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＲａｄ Ｃａｔ．７６０−００３７）の制御下で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５１７５−０１）を用いて、プール溶出物をサイズ排除クロマトグラフィーに供した。精製酵素断片のさらなる精製（夾雑タンパク質の除去）又はカラム上での再折り畳み後の凝集酵素断片に対する単量体の割合の決定の何れかのために、ゲルろ過を使用した。プロトコールは次のとおりである：０．６ｍＬ／分での５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７ ２ＣＶによる平衡化；０．６ｍＬ／分での試料２５０−５００μＬの注入；及び０．６ｍＬ／分での５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７ １ＣＶの定組成フロー。典型的な結果については図７参照。
【０１９２】
質量分析
Ｉｎｓｕｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、ＡｕｓｔｒａｌｉａのＨＰＬＣ／ＴＯＦ質量分析サービスを利用してゲルろ過精製されたα及びω断片の分子量を調べた。個々の実験データを回収し、理論的分子量値との比較のために分析した。
【０１９３】
酵素断片相補性
動態研究のために６−ヒスチジン−タグを含有する精製α及びω断片を使用して、ノイズ（Ｎｉ２＋なしでの自発的酵素相補性）に対するシグナル（Ｎｉ２＋強制的酵素相補性）比を計算した。強制的酵素相補性のノイズに対するシグナル比を調べ、評価するために、様々な基質、緩衝添加物及び阻害剤を使用した。本発明のα及びω断片の等モル量を用いたある実施形態における代表的な結果は、図８及び図９で与える。
【０１９４】
ニトロセフィン活性アッセイ
ニトロセフィン（Ｍｅｒｃｋ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）は、β−ラクタム環の加水分解後黄色から赤（ＯＤ４９２）に色を変化させるＴＥＭ−１β−ラクタマーゼの比色基質である。ゆえに、酵素断片相補性の酵素活性を評価するためにニトロセフィンアッセイを行った。９６ウェル平底細胞培養プレート（ＴＰＰ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてアッセイを行った。５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）ｐＨ７中で２００又は６００μＭのニトロセフィン保存溶液を調製した。各２００μＬの反応液に対して、ニトロセフィン保存液１００μＬを５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７中の酵素断片１００μＬ（Ｎｉ２＋あり又はなし）に添加した。必要とされる最終的シグナルに依存して、使用されたウェルあたりの酵素断片の濃度は４０ｎＭから２００ｎＭの範囲であり、Ｎｉ２＋被分析物質の最終濃度は１００μＭ又は２００μＭであった。ピペッティングによりアッセイ成分をよく混合し、室温で５分間温置した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０を用いてニトロセフィン加水分解の動態を４９２ｎｍで読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）。
【０１９５】
様々な緩衝添加物の影響
強制α及びω断片相補性のノイズに対するシグナル比を向上させるために、溶媒、ＢＳＡ、界面活性剤、タンパク質変性剤及び塩などの様々な緩衝添加物の影響を調べた。停止溶液タゾバクタムも調べた。本明細書中に記載のようにアッセイを行った。
【０１９６】
溶媒
低濃度の溶媒は酵素断片を部分的に変性させ得るので、少量のエタノール、イソプロパノール、メタノール、ＤＭＳＯ及びアセトニトリルが、天然の断片相補性を低下させ、ノイズに対するシグナル比を上昇させるか否かを調べた。試験した各溶媒の最終濃度は、１５％、７．５％、３．７５％、１．８７５％、０．９８７５％及び０％であった。４９２ｎｍで３０分間、相補性アッセイの動態を読み取った。次に、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏからの最大速度（ｍＯＤ分−１）に照らしてシグナル／ノイズ比を計算した。最適な、ノイズに対するシグナル比が、それぞれ３．７５％、３．７５％、７．５％、１５％及び３．７５％の濃度の、エタノール、イソプロパノール、メタノール、ＤＭＳＯ及びアセトニトリルで達成されることが分かった。例えば、最終濃度でのエタノールの効果は、１５％、７．５％、３．７５％、１．８７５％及び０％の範囲であり、シグナル／ノイズ比はそれぞれ７．１、８．４、８．５、５．４及び３．７であった。
【０１９７】
溶媒のある範囲の濃度で酵素断片が部分的に変性し、それにより互いに対するその天然の親和性（自発的相補性）が低下する一方で、Ｎｉ２＋被分析物質（強制的相補性）により近接近に向かわせられた場合に相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが分かった。
【０１９８】
ＢＳＡ
ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）はタンパク質安定化剤として広く使用されており；ＢＳＡを使用することで、２つの断片の密接な接触を妨害することにより天然の断片の相補性の阻止が促進され、シグナル／ノイズ比が上昇し得る。最終濃度範囲（ｍｇ／ｍＬ）は、０．６、０．３、０．１５、０．０７５、０．０３７５、０．０１８７５及び０であった。読み取りデータ回収時間は３０分であった。次に、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏからの最大速度（ｍＯＤ／分）により、シグナル／ノイズ比を計算した。ＢＳＡを添加することにより、シグナル及びバックグラウンドの両方が上昇したので、最終的シグナル／ノイズ比は顕著には変化しなかったが、シグナル出力はほぼ２倍増幅された。ＢＳＡが、シグナル及びバックグラウンドの両方を増幅するために、アッセイ溶液中で込み合い効果を与えることが分かった。
【０１９９】
界面活性剤
界面活性剤は、タンパク質−タンパク質相互作用又はＥＬＩＳＡバックグラウンドを減少させるために広く使用され；少量を使用することにより、２つの断片を離しておくことによって天然の断片相補性の阻止が促進され得、シグナル／ノイズ比が上昇する。Ｔｗｅｅｎ−２０及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を使用し、最終濃度範囲は、０．３％、０．１５％、０．０７５％、０．０３７５％、０．０１８７５％及び０％であった。読み取りデータ回収時間は３０分であった。次に、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏからの最大速度（ｍＯＤ分−１）に照らして、シグナル／ノイズ比を計算した。
【０２００】
それぞれ０．１５％及び０．３％の濃度のＴｗｅｅｎ−２０及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で最適な、ノイズに対するシグナル比が達成されることが分かった。例えば、０．３％、０．１５％、０．０７５％、０．０３７５％、０．０１８７５％及び０％からの最終濃度範囲で試験したＴＸ−１００の効果において、シグナル／ノイズ比は、それぞれ１４．１、６．９、３．８、２．７、１．８及び３．９であった。界面活性剤濃度が上昇すると活性が低下することに注意すること。
【０２０１】
界面活性剤のある範囲の濃度で酵素断片が部分的に変性し、それにより互いに対するその天然の親和性（自発的相補性）が低下する一方で、Ｎｉ２＋被分析物質（強制的相補性）により近接近に向かわせられた場合に相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが分かった。
【０２０２】
変性剤
酵素断片相補性におけるタンパク質変性剤の効果を試験するために、尿素又はグアニジン塩酸塩の存在下で、断片、基質及びＮｉＳＯ４濃度のマトリクスを使用してニトロセフィン活性アッセイを行った。予備アッセイにおいて、２Ｍから６２．５ｍＭの範囲の尿素濃度及び１Ｍから３１．２５ｍＭの範囲のＧｕＨＣｌ濃度で４０ｎＭ断片の相補性を試験した。アッセイを次のように準備した：尿素［２Ｍ尿素、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７から６２．５ｍＭ 尿素、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７］又はグアニジン塩酸塩［１Ｍ ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７から３１．２５ｍＭ ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７］の連続２倍希釈液に各断片４０ｎＭを添加した（２回ずつ試験）。第一セットのウェルに１００μＭの最終濃度までＮｉＳＯ４を添加し、一方で第二セットのウェルにはＮｉＳＯ４は添加しなかった。プレートを５分間温置し、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘリーダーを用いて４９２ｎｍで動態の読み取りを行った。最適な、ノイズに対するシグナル比が０．５Ｍの濃度の尿素で達成されることが分かり、低バックグラウンドで可能な最大のシグナルを達成するために、続く実験において断片の量を２００ｎＭまで増加させ、ＮｉＳＯ４及び基質濃度をそれぞれ２００μＭ及び３００μＭまで増加させた。
【０２０３】
低濃度の尿素で酵素断片が部分的に変性し、それにより互いに対するその天然の親和性（自発的相補性）が低下する一方で、Ｎｉ２＋被分析物質（強制的相補性）により近接近に向かわせられた場合に相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが分かった。
【０２０４】
塩
静電効果は、酵素触媒作用及びタンパク質−タンパク質相互作用の両方において重要な機能を有し、様々な塩を使用してこれらの効果が調節されるか又は変化し得る。強制的酵素相補性におけるその影響について３種類の異なる塩：ＮａＣｌ、Ｋ２ＳＯ４及び（ＮＨ４）２ＳＯ４を試験した。アッセイを次のように準備した：ＮａＣｌ［２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７から６２．５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７］、Ｋ２ＳＯ４［０．４Ｍ Ｋ２ＳＯ４、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７から２５ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７］又は（ＮＨ４）２ＳＯ４［０．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７から５０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７］の連続２倍希釈液に各断片４０ｎＭを添加した（２回ずつ試験）。第一セットのウェルにＮｉＳＯ４ １００μＭを添加し、一方で第二セットにはＮｉＳＯ４は添加しなかった。プレートを５分間温置し、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ１９０リーダーを用いて４９２ｎｍで動態の読み取りを行った。
【０２０５】
ＦＥＣアッセイに塩を添加することにより、シグナル及びバックグラウンドの両方が上昇したので、最終的シグナル／ノイズ比は顕著には変化しなかったが、シグナル出力が増幅された。
【０２０６】
イミダゾール
ヒスチジンタグ付加タンパク質精製（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）において、洗浄緩衝液として少量（２０ｍＭ）のイミダゾール（ＩＣＮ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用したが、イミダゾールは、断片表面のヒスチジン相互作用を妨害することによって天然の断片相補性を妨げ、シグナル／ノイズ比の上昇を促進し得る。イミダゾール最終濃度の範囲は、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ及び０ｍＭであった。読み取りデータ回収時間は３０分であった。次に、ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏからの最大速度（ｍＯＤ分−１）に照らして、シグナル／ノイズ比を計算した。
【０２０７】
それぞれ１２．５ｍＭの濃度のイミダゾールで最適な、ノイズに対するシグナル比が達成されることが分かった。例えば、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、６．２５ｍＭ及び０ｍＭからの最終濃度範囲でのイミダゾールの効果、シグナル／ノイズ比はそれぞれ０．８、２．１、３．７、５．３、５．２及び４．０であった。イミダゾール濃度が上昇すると活性が低下することに注意すること。
【０２０８】
イミダゾールのある範囲の濃度において、互いに対するその天然の親和性（自発的相補性）が低下する一方で、Ｎｉ２＋被分析物質により近接近に向かわせられた場合（強制的相補性）に相互作用及び立体配座の変化が可能なままであることが分かった。
【０２０９】
停止溶液（タゾバクタム）
（Ｓｉｇｍａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）は、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼに対する最も効果的な阻害剤の１つであり、ＩＣ５０が２０−５０ｎｍであることが報告されている。タゾバクタムのＩＣ５０は、５０ｎＭの濃度で、全長及び相補断片において社内で計算された。従って、２５から５０μＭ（ＩＣ５０より５００−１０００倍大きい。）の間のタゾバクタム最終濃度は、ＯＤ４９２の値を変化させることなく速やかに反応を停止させるのに十分であるはずである。阻害の有効性を試験するために、タゾバクタム２５又は５０μＭを使用し、０．５から３時間、タゾバクタム添加後のＯＤ４９２値の連続モニタリングを行った。得られたＯＤ４９２の変化を比較し、評価した。
【実施例２】
【０２１０】
抗ヒスチジンモノクローナル抗体に対する均一インビトロＦＥＣアッセイ
ここで概説する手順は、切断点末端において長いフレキシブルリンカー［（Ｇ４Ｓ）３］及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）を組み込むα断片（ＰＢ１１．４）及びω断片（ＰＢ１３．２）の合成及び特性決定を説明する。ＤＮＡ配列データにより、長いリンカー［（Ｇ４Ｓ）３］及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）の存在が確認された。均一インビトロ方式アッセイにおいて抗体（ヒスチジンタグに結合するペンタ−ヒスチジンモノクローナル抗体）との強制的酵素相補性を示すために、この断片ペアを使用した。
【０２１１】
部位特異的突然変異誘発
既存のコンストラクト（既にその切断点末端に５アミノ酸のフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）を含有する。）にさらなる１０アミノ酸リンカー［（Ｇ４Ｓ）２］を導入するために、α（ＰＢ１１）及びω（ＰＢ１３）断片のＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発を行い、１５アミノ酸長のリンカーを作製した（ＰＣＲプライマー配列は表１で与える。）。
【０２１２】
簡潔に述べると、長いリンカーを有するα断片（ＰＢ１１．４）を作製するために、５０μＬの最終体積になるように、１２５ｎｇフォワードプライマー（ＦＥＣ６７）、１２５ｎｇリバースプライマー（ＦＥＣ６８）、１ｘ反応緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ混合液、３μＬ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ及び超純水に鋳型ＤＮＡ２５ｎｇを添加した。次に、１μＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）を添加し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ勾配サーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で温度サイクルを行った。次のようにＰＣＲサイクルを行った；９５℃ｘ１分で変性及び、９５℃ｘ５０秒（変性）、６０℃ｘ３０秒（アニーリング）、６５℃ｘ３０秒（アニーリング）及び６８℃ｘ１０分（伸長）を２５サイクルと、サイクル完了時に６８℃ｘ６分で最終伸長段階。
【０２１３】
長いリンカーを有するω断片（ＰＢ１３．２）を作製するために、５０μＬの最終体積になるように、１２５ｎｇフォワードプライマー（ＦＥＣ７５）、１２５ｎｇリバースプライマー（ＦＥＣ７６）、１ｘ反応緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ混合液、３μＬ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ及び超純水に鋳型ＤＮＡ５０ｎｇを添加した。次に、１μＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）を添加し、次のようにＰＣＲサイクルを行った；９５℃ｘ１分で変性及び、９５℃ｘ５０秒（変性）、６０℃ｘ３０秒（アニーリング）、６５℃ｘ１５秒（アニーリング）及び６８℃ｘ１０分（伸長）を２５サイクルと、サイクル完了時に６８℃ｘ７分で最終伸長段階。
【０２１４】
上述のように１μＬ ＤｐｎＩでＰＣＲ増幅突然変異誘発反応物を消化した。製造者の説明書に従い、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ．２３０１３２）を形質転換するために、ＤｐｎＩ処理したＰＢ１１．４ ＤＮＡ及びＤｐｎＩ処理したＰＢ１３．２ ＤＮＡを使用した。既に概説したように、長いリンカーの正しい挿入を確認するために、得られたプラスミドＤＮＡの配列決定を行ってＥ．コリ形質転換体をスクリーニングした（プライマー ＦＥＣ１０及びＦＥＣ１１−表１を用いて）。
【０２１５】
酵素断片相補性
上記で概説したように、酵素断片を発現させ、精製し、特性を調べた。ノイズ（Ａｂなしでの自発的酵素相補性）に対するシグナル（Ａｂ強制的酵素相補性）比を計算するための動態実験のために、１５アミノ酸の長いフレキシブルリンカー及びペンタ−ヒスチジンモノクローナル抗体（Ａｂ）に結合し得る６−ヒスチジンタグを含有する精製α及びω断片を使用した。
【０２１６】
Ａｂ強制ＦＥＣアッセイの酵素活性を測定するために、ニトロセフィン加水分解を使用した。９６ウェル平底細胞培養プレート（ＴＰＰ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてアッセイを行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）プレートリーダーを用いてニトロセフィン加水分解を４９２ｎｍで読み取った。簡潔に述べると、２００μＬの反応体積中０．５Ｍ尿素、０．６２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１２．５ｍＭ Ｌ−アルギニン、６．２５μＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７中でα（ＰＢ１１．４）及びω（ＰＢ１３．２）断片２０ｎＭ及び３３ｎＭ Ｈｉｓ−Ｔａｇモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ．７０７９６−３）を希釈し、室温で２０分間温置した。次に、反応溶液にニトロセフィン（ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍＬ、２μＬ）を添加し、１時間にわたりプレートリーダーを用いて４９２ｎｍで監視した。
【０２１７】
本発明のα及びω断片の等モル量を使用する代表的な実施形態の結果を図６で与える。
【０２１８】
図６で、均一インビボＦＥＣが、３３ｎＭの濃度でモノクローナル抗体（１５０ｋＤａ）などの大きな被分析物質をうまく検出することができることが示される。Ａｂ濃度のＫＤが１８．４３ｎＭであることがさらに分かった。
【実施例３】
【０２１９】
β−ラクタマーゼＴＥＭ１阻害剤耐性強制的酵素相補性（ＦＥＣ）均一アッセイ
この実施例中で概説する手順は、アミノ酸１９６／１９７で全長親酵素を分割し、続いて切断点末端にフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）を導入することにより作製されるＴＥＭ１断片の合成及び特性決定を説明する。β−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性を向上させるために、次のα断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）を使用して点突然変異を導入し、結果としてαＭ６９ＬＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１２）及びωＮ２７６Ｄ断片（ＰＢ１３．３）が得られた。ＤＮＡ配列データにより、フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）ヒスチジンタグ（６ｘＨ）及び点突然変異の存在を確認した。β−ラクタマーゼ阻害剤の存在下で、被分析物質（Ｎｉ２＋）を用いて強制的酵素相補性を示すために、これらの断片ペアを使用した。
【０２２０】
部位特異的突然変異誘発
ＰＢ１１．１（αＭ６９Ｌ）、ＰＢ１１．１２（αＭ６９ＬＭ１８２Ｔ）、ＰＢ１１．１３（αＭ６９ＩＭ１８２Ｔ）及びＰＢ１３．３（ωＮ２７６Ｄ）コンストラクトを作製するために、α（ＰＢ１１）及びω（ＰＢ１３）断片の部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発を行った。
【０２２１】
簡潔に述べると、α及びω断片プラスミドＤＮＡを単離し、実施例１に記載のように定量し、次のようにＰＣＲ増幅突然変異誘発反応において鋳型として使用した：５０μＬの最終濃度になるように、１２５ｎｇフォワードプライマー（ＦＥＣ５５、ＦＥＣ１４３、ＦＥＣ１４５又はＦＥＣ１４７）、１２５ｎｇリバースプライマー（ＦＥＣ５６、ＦＥＣ１４４、ＦＥＣ１４６又はＦＥＣ１４８）、１ｘ反応緩衝液、１μＬ ｄＮＴＰ混合液、３μＬ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ及び超純水に鋳型ＤＮＡ２５ｎｇを添加した。次に、ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬ）を添加し、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ勾配サーマルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で温度サイクルを行った。Ｍ６９Ｌ、Ｍ６９Ｉ及びＮ２７６Ｄ点突然変異の導入のために、ＰＣＲサイクルを次のように行った：９５℃ｘ１分で変性、及び９５℃ｘ５０秒（変性）、６０℃ｘ５０秒（アニーリング）及び６８℃ｘ６分（伸長）を１８サイクルと、サイクル完了時に６８℃ｘ６分で最終伸長段階。Ｍ１８２Ｔ突然変異の導入に対するＰＣＲサイクル条件は僅かに変化し、鋳型としてαＭ６９Ｌ及びαＭ６９Ｉ断片を、及びＦＥＣ５５及びＦＥＣ５６フォワード及びリバースプライマーをそれぞれ用いて６５℃ｘ５０秒でアニーリングを行った。続いて、非突然変異親ＤＮＡを消化するために、各反応物に１μＬ ＤｐｎＩ制限酵素（１０Ｕ／μＬ）を直接添加して３７℃で１時間温置し、ＰＣＲ増幅突然変異誘発反応物を消化した。次に、ＱｕｉｘｋＣｈａｎｇｅＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キットの製造者の説明書（Ｒｅｖ＃１２４００１ｅ）で概説されるように、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ ＵＬＴＲＡコンピーテント細胞を形質転換するために、各試料反応物からのＤｐｎＩ処理ＤＮＡ２μＬを使用した。点突然変異の正しい挿入を確認するために、得られたプラスミドＤＮＡの配列決定を行い、既に概説したようにＥ．コリ形質転換体をスクリーニングした。
【０２２２】
次に、タンパク質発現及び精製について記載されるように、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピーテント細胞を形質転換するために、所望の突然変異を組み込むプラスミドＤＮＡを使用した。
【０２２３】
α及びω断片の精製及び特性決定
β−ラクタマーゼ阻害剤の非存在下及び存在下でのその動態特性を直接比較し、下記のようにＮｉ２＋（被分析物質）を用いて強制的酵素相補性におけるノイズに対するそのシグナル比を決定するために、同様にして、全ての６種類の酵素断片［α（ＰＢ１１）、αＭ６９Ｌ（ＰＢ１１．１１）、αＭ６９ＬＭ１８２Ｔ（ＰＢ１１．１２）、αＭ６９ＩＭ１８２Ｔ（ＰＢ１１．１３）、ω（ＰＢ１３）及びωＮ２７６Ｄ（ＰＢ１３．３）］を発現させ、精製し、特性決定した。
【０２２４】
α及びω断片の発現
実施例１に記載のようにＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）における断片の発現を行った。
【０２２５】
変性条件下での組み換えタンパク質の抽出
溶解緩衝液（α断片に対して６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８又はω断片に対して６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）１０ｍＬ／ｇ（ペレット湿重量）中で、一晩誘導した２５０ｍＬからのペレットを溶解し、続いて１００ｒｐｍで振盪しながら４℃にて１時間温置した。溶解を促進するために、Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクルで懸濁液を超音波処理した。超音波処理後、１２，０００ｘｇで３０分間（４℃）溶解液を遠心し、次いで細胞残屑を除去するために０．２μｍフィルターに通した。
【０２２６】
α断片の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換えＨｉｓタグ付加タンパク質を精製した。勾配緩衝液（８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ８）１０カラム体積（ＣＶ）で１ｍＬ／分の流速でＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分での、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ８から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８の５０カラム体積（ＣＶ）勾配にわたり結合タンパク質を再び折り畳ませた。２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶでカラムから夾雑タンパク質を洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８の１０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ゲルろ過及び質量分析により分析した。
【０２２７】
ω断片の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換えＨｉｓタグ付加タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で勾配緩衝液１０ＣＶ（８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５）でＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ 尿素 １００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５の５０ＣＶ勾配にわたり結合タンパク質を再び折り畳んだ。２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶで夾雑タンパク質をカラムから洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８の１０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ゲルろ過及び質量分析により分析した。
【０２２８】
酵素断片相補性
動態研究のためにＮｉ２＋に結合することができる６−ヒスチジン−タグを含有する精製α及びω断片を使用して、ノイズ（Ｎｉ２＋なしでの自発的酵素相補性）に対するシグナル（Ｎｉ２＋強制的酵素相補性）比を計算した。強制的酵素相補性のノイズに対するシグナル比を調べ、評価するために、様々な基質、緩衝添加物及び阻害剤を使用した。
【０２２９】
ニトロセフィン活性アッセイ及びパネル血清スクリーニング
１９０μＬ反応混合液にニトロセフィン（１００％ＤＭＳＯ中で調製した４ｍＭ保存溶液の１０μＭ）を添加し、０．７５Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ＰＨ７、各酵素断片（α及びω）１０−２０ｎＭ及び適切な場合には２００μＭ Ｎｉ２＋の最終濃度にした。ピペッティングによりアッセイ成分をよく混合し、基質添加前に室温で５分間温置した。３０分間の時間枠にわたり、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いてニトロセフィン加水分解の速度を４９２ｎｍで測定した。血清アッセイの場合、Ｎｉ２＋ではなく、１／２００の最終希釈での血清を添加し、上記のように５０検体の個々の血清のパネルをスクリーニングした。血清アッセイの最終濃度は次のとおりであった：各α及びω断片１０ｎＭを添加して、０．６Ｍ尿素、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７。適切な場合には、血清アッセイに１．１μＭ タゾバクタム及び２．８μＭ タゾバクタムを添加した［静脈内タゾバクタム投与後の２ｘ及び５ｘ予想Ｃｍａｘ血清濃度（Ｗｉｓｅ、Ｒ．、Ｍ．Ｌｏｇａｎら、１９９１、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３５（６）：１０８１−４）。
【０２３０】
阻害剤耐性突然変異の酵素反応速度
次を例外として、上述のようにＮｉ２＋を用いた活性アッセイを行った：ニトロセフィン（０ｍＭから１．６ｍＭの範囲の最終基質濃度とするための様々な連続希釈液１００μＬ）を反応混合液１００μＬ（尿素なし）に添加した。室温で１０分間にわたりＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０を用いて４９２ｎｍで反応を監視することにより、ニトロセフィン加水分解を測定した。基質濃度に対して反応初速度（最初の１０回の読み取り、ｍＯＤ／分）をプロットし、各α及びω断片ペアに対してＫｍ及びＫｃａｔを決定した。Ｎｉ２＋アッセイにおいて阻害剤ＩＣ５０値を決定するために、各阻害剤の連続希釈液を含有する反応混合液にニトロセフィン（１００％ＤＭＳＯ中の２ｍＭ ニトロセフィン１０μＬ）を添加し、２００μＬの最終体積中５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７、１０μＭ タゾバクタム（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ｔ２８２０）、０−１００μＭスルバクタム（Ｍｏｌｅｋｕｌａ Ｐｒｏｄ＃１９５９０２９９）又は０−１００μＭクラブラン酸（Ｍｏｌｅｋｕｌａ Ｐｒｏｄ＃８７６４４０４８）、各α及びω断片２５ｎＭ、１００μＭニトロセフィン及び２００μＭ Ｎｉ２＋の最終濃度を得た。室温で１０分間、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０を用いて４９２ｎｍでニトロセフィン加水分解の速度を測定した。次に、各阻害剤濃度に対して反応初速度（最初の１０回の読み取り、ｍＯＤ／分）をプロットし、各α及びω断片ペアに対して阻害剤ＩＣ５０を決定した。
【０２３１】
結果
【０２３２】
【表３】
【０２３３】
【表４】
【０２３４】
これらの結果から、上記の突然変異を組み込むβ−ラクタマーゼ断片が阻害剤に対する耐性を向上させたことが分かった。これらの知見は、血清試料中のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ ＩｇＧの検出のための均一インビトロＦＥＣアッセイにおいて使用しようとする次のβ−ラクタマーゼ断片にも当てはまる（実施例４）。
【実施例４】
【０２３５】
患者血清における疾患特異的ＩｇＧの検出のためのβ−ラクタマーゼＴＥＭ１阻害剤耐性強制的酵素相補性（ＦＥＣ）アッセイ
実施例１、２及び３は、アミノ酸１９６／１９７で全長親酵素（ＰＢ３）を分割し、続いて切断末端にフレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）及びヒスチジンタグ（６ｘＨ）を導入することにより作製されるＴＥＭ１断片の合成及び特性決定を説明する。β−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性を向上させるために、次のα断片（ＰＢ１１）及びω断片（ＰＢ１３）を使用して点突然変異を導入し、結果として、αＭ６９Ｌ断片（ＰＢ１１．１１）、αＭ６９ＬＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１２）、αＭ６９Ｍ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１３）及びωＮ２７６Ｄ断片（ＰＢ１３．３）が得られた。ＤＮＡ配列データから、フレキシブルリンカー（Ｇ４Ｓ）ヒスチジンタグ（６ｘＨ）及び点突然変異の存在が確認された。β−ラクタマーゼ阻害剤（抗生物質を投与されている患者の血清中に存在する可能性がある。）存在下で被分析物質（ヒスチジンタグに結合するＮｉ２＋、Ｚｎ２＋又は６ｘＨモノクローナル抗体）との強制的酵素相補性（ＦＥＣ）を明らかにするために、これらの断片ペアを使用した。
【０２３６】
この実施例において、患者血清中の疾患特異的ＩｇＧ抗体の検出のために、被分析物質結合部分（ＨＳＶ−１短縮型抗原、ＨＳＶ−２短縮型抗原及びタンパク質−Ｇサブユニット）に酵素断片を融合させた。
【０２３７】
方法
ＤＮＡコンストラクト
この実験で使用されるβ−ラクタマーゼコンストラクトの概略図を図２０で示す。全てのプラスミドの構築のために使用される対応するオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）を表５で列挙する。ＰＡＮ１及びＰＡＮ２プライマーを用いたｐＵＣ１８ Ｂｌａ遺伝子のＰＣＲ増幅によって、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ付加（ＣＨｉｓ）全長β−ラクタマーゼ（Ｎ末端分泌配列を含まない。）を発現する第一のコンストラクトを作製した。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩでＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ）に連結して、ｐＥＴ−ＢＬを得た。鋳型としてこのコンストラクトを使用して、Ｇ４Ｓリンカーを介して融合されたＣＨｉｓタグを有するＢＬα（残基２５−１９６）；及びＮ末端ヘキサヒスチジンタグを有するＢＬω（残基１９７−２９０）（これもＧ４Ｓリンカーを介して連結）の発現のためのｂｌａ遺伝子の２つの隣接領域を増幅するためにＰＡＮ１／ＰＡＮ３及びＰＡＮ４／ＰＡＮ５を使用した。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで各ＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）に連結して、ｐＥＴ−ＢＬα及びｐＥＴ−ＢＬωを得た。将来のコンストラクトのために前駆体として使用するために、ｐＥＴ−ＢＬα及びｐＥＴ−ＢＬωの両方に、より長い（Ｇ４Ｓ）３リンカーを発現する配列を組み込み、ｐＥＴ−ＢＬα（Ｇ４Ｓ）３及びｐＥＴ−ＢＬω（Ｇ４Ｓ）３を得た。それぞれプライマーＰＡＮ６／ＰＡＮ７及びＰＡＮ８／ＰＡＮ９を使用して、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キット）によりこれらを導入した。
【０２３８】
３つの異なるタイプの被分析物質結合部分：糖タンパク質Ｇ１（ｇＧ１；ＨＳＶ−１抗原；図１９ｂ）又は糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２；ＨＳＶ−２抗原；図１９ｂ）の何れかのエピトープを含むペプチド及びプロテインＧ（ＰｒｏＧ）のＣ２ドメインを有するようにβラクタマーゼの続く断片を改変した。作製された第一の２つのＤＮＡコンストラクトは、ＨＳＶ−１（ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ１）又はＨＳＶ−２特異的抗原性ペプチド（ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ２）の何れかに融合されたＢＬαを発現する。これらの断片の構築を次のように説明する。最初に、ＨＳＶ−１抗原をコードするメガプライマーを作製するために、オリゴヌクレオチドＰＡＮ１０、ＰＡＮ１１、ＰＡＮ１２及びＰＡＮ１３（表５）を用いた重複伸長ＰＣＲを行った。第二のＰＣＲでは、ＢＬα−ＨＳＶ１遺伝子を与えるために、鋳型としてｐＥＴ−ＢＬα（Ｇ４Ｓ）３、第一のＰＣＲからのメガプライマー及びＰＡＮ１４を用いた。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩでこの第二のＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）に連結した。重複伸長ＰＣＲのためにオリゴヌクレオチドＰＡＮ１０、ＰＡＮ１５、ＰＡＮ１６、ＰＡＮ１７、ＰＡＮ１８及びＰＡＮ１９を用いて、同様にして、ＢＬα−ＨＳＶ２をコードするコンストラクト ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ２を作製した。
【０２３９】
続く融合コンストラクトの改変を簡素化するために、様々なドメイン配列の置換を可能にするため、酵素断片、リンカー及び結合部分の間に制限エンドヌクレアーゼ部位が組み込まれたＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によってユニバーサルＢＬα及びＢＬω融合遺伝子を合成した。ｐＥＴ−２６ｂ（＋）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位への連結（ライゲーション）のために、何れかの末端において、ＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩ部位が、ＰｒｏＧ、（Ｇ４Ｓ）３リンカー及びＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位があるＢＬωコードドメインの間に挿入されるように、ユニバーサルＢＬωコンストラクト、ｐＥＴ−ＢＬω−ＰｒｏＧを設計した。Ｅ．コリのコドン使用表により、ベクターＮＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、公開されているアミノ酸配列（Ｇｕｌｉｃｈら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１５（１０）：８３５−４２）の戻し翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）により、連鎖球菌株Ｇ１４８プロテインＧのＣ２ ＩｇＧ−結合ドメインをコードする配列を得た。同様のアプローチを用いてユニバーサルＢＬαコンストラクト、ｐＥＴ−ＢＬα−ＰｒｏＧを作製した。ｐＥＴ−２６ｂ（＋）のＮｄｅＩ ＸｈｏＩ部位への連結（ライゲーション）のために、何れかの末端において、ＢＬα配列、（Ｇ４Ｓ）３リンカー及びＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位を有する部分をコードする抗原の間にＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ部位を有するように遺伝子配列を設計した。このコンストラクトに対して、ｐＥＴ−ＢＬω−ＰｒｏＧからＰｒｏＧをコードする配列を切り出し、ユニバーサルＢＬαコンストラクトのＢａｍＨＩ ＳｐｅＩ部位に連結した。
【０２４０】
ＢＬα−ＨＳＶ１及びＢＬα−ＨＳＶ２に対する代替物として、発明者らは、ユニバーサルＢＬωコンストラクトを使用し、個々のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２抗原性ペプチド配列でＰｒｏＧ配列を置換することにより、相補的ＢＬω−ＨＳＶ１及びＢＬω−ＨＳＶ２コンストラクトを作製した。隣接するＢｇｌＩＩ及びＳｐｅＩ部位を組み込むためにオリゴヌクレオチドＰＡＮ２０及びＰＡＮ２１を用いて、ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ１からＨＳＶ−１ペプチドをコードする配列をＰＣＲ増幅した。同様に、隣接するＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ部位を組み込むためにオリゴヌクレオチドＰＡＮ２２及びＰＡＮ２３を用いて、ｐＥＴ−ＢＬα−ＨＳＶ２からＨＳＶ−２ペプチド配列をＰＣＲ増幅した。次に、ｐＥＴ−ＢＬω−ＨＳＶ１及びｐＥＴ−ＢＬω−ＨＳＶ２を得るために、ｐＥＴ−ＢＬω−ＰｒｏＧのＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ部位にＰＣＲ産物を連結した。
【０２４１】
オリゴヌクレオチド、ＰＡＮ２４及びＰＡＮ２５を使用して、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩ ＸＬ−部位特異的突然変異誘発キット）により、ｐＥＴ−ＢＬω−ＰｒｏＧ、ｐＥＴ−ＢＬω−ＨＳＶ１及びｐＥＴ−ＢＬω−ＨＳＶ２のω断片配列に、点突然変異Ｎ２７６Ｄを導入した。Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＡＧＲＦ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により、クローニングされ突然変異を導入された全ての挿入物の配列決定が行われた。
【０２４２】
【表５】
【０２４３】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２抗原性ペプチド設計
血清中のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する抗体を検出しそれを差別化するために、被分析物質結合部分として２種類の特異的ＨＳＶ抗原性ペプチドを設計した。ＨＳＶ−１特異的ペプチド（図１９ｂ）は、糖タンパク質Ｇ１（ｇＧ１）の残基９２−１４８からなる。ｇＧ１のこの領域は、免疫優勢エピトープ（残基１１２−１２７）及び、ヒトにおいてＨＳＶタイプ−１特異的反応を与えることが知られている第二のエピトープ内に２つのキーとなるアミノ酸を含有する。ＨＳＶ−２特異的ペプチド（図１９ｂ）は、糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）の残基５５１−６４１から構成され、ヒトにおいてＨＳＶタイプ−２特異的反応を与えることが知られている２つの免疫優勢エピトープ（残基５６１−５７８及び６２６−６４０）からなる。
【０２４４】
α及びωレポーター断片の発現及び精製
全ての酵素断片［α断片（ＰＢ１１）、αＭ６９Ｌ断片（ＰＢ１１．１１）、αＭ６９ＬＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１２）、αＭ６９ＩＭ１８２Ｔ断片（ＰＢ１１．１３）、α−ＨＳＶ−１断片、α−ＨＳＶ−２断片、α−タンパク質−Ｇ断片及びω断片（ＰＢ１３）、ωＮ２７６Ｄ断片（ＰＢ１３．３）、ＨＳＶ−１−ω断片及びＨＳＶ−２−ω断片］を発現させ（実施例１に記載のように）、変性条件下で精製した。ネイティブ条件下でタンパク質−Ｇ−ω断片を精製した。精製した全てのタンパク質の特性を同様にして調べ、アッセイした。
【０２４５】
変性条件下での組み換えタンパク質の抽出
α断片（ＰＢ１１、ＰＢ１１．１１、ＰＢ１１．１２及びＰＢ１１．１３）に対する溶解緩衝液（６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８）及びω断片（ＰＢ１３及びＰＢ１３．３）に対する（６ＭＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）の１０ｍＬ／ｇ（ペレット湿重量）で、一晩誘導した２５０ｍＬからのペレットを溶解した。６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８中でα断片−被分析物質結合部分融合物（ＢＬαＨＳＶ−１、ＢＬαＨＳＶ−２及びＢＬαＰｒｏＧ）を溶解した。６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８中で被分析物質結合部分−ω−断片融合物（ＢＬωＨＳＶ１及びＢＬωＨＳＶ２）を溶解した。１００ｒｐｍで振盪しながら４℃にて１時間温置した後、溶解を促進するために、Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクルで各懸濁液を超音波処理した。超音波処理後、１２，０００ｘｇで３０分間（４℃）溶解液を遠心し、次いで０．２μｍフィルターに通した。
【０２４６】
ネイティブ条件下でのＢＬωＰｒｏＧの抽出及び精製
５ｍＬ／ｇ（湿重量）で、ネイティブ溶解緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中で、一晩誘導した２５０ｍＬからのペレットを再懸濁した。リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇ／ｍＬになるように添加し、氷上で３０分間、懸濁液を温置した。Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて、氷浴中で３０秒オン／３０秒オフ５サイクルで溶解液を超音波処理した（出力６及び７０％負荷）。１０，０００ｘｇで３０分間、４℃にて溶解液を遠心した。容器を傾けて上清を取り、０．２μｍフィルターに通した。製造者により指示されるように、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）をろ過液に添加した。Ｎｉ−ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ＃３０２１０）を用いてネイティブ条件下でＢＬωＰｒｏＧを精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ １ｍＬを溶解液に添加し、４℃で１時間振盪（１００ｒｐｍ）することにより穏やかに混合した。溶解液−Ｎｉ−ＮＴＡ混合液を１ｘ１０ｃｍカラムに注ぎ、ネイティブ洗浄緩衝液（２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）１６ｍＬで洗浄した。ネイティブ溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８）１０ｍＬにより１ｍＬ分画になるように結合タンパク質を溶出した。
【０２４７】
ＰＢ１１、ＰＢ１１．１１、ＰＢ１１．１２及びＰＢ１１．１３の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換え６ｘＨタグ付加タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で、勾配緩衝液（８Ｍ尿素１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ８）１０カラム体積（ＣＶ）でＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ８から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８ ５０ＣＶ勾配にわたり結合したタンパク質を再び折り畳ませた。２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶで夾雑タンパク質をカラムから洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、ＦＲＡＣ９５０分画回収装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１ｍＬ分画になるように回収した。ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ゲルろ過及び質量分析により、タンパク質をさらに分析した。
【０２４８】
ＰＢ１３及びＰＢ１３．３の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ．１７−５２４７−０１）を用いて、組み換え６ｘＨタグ付加タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で、勾配緩衝液（８Ｍ尿素１００ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５）１０ＣＶでＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．５ ５０ＣＶ勾配にわたり結合タンパク質を再び折り畳ませた。２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶで夾雑タンパク質をカラムから洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、１ｍＬ分画になるように回収した。
【０２４９】
ＢＬα−ＨＳＶ１、ＢＬα−ＨＳＶ２、ＢＬω−ＨＳＶ１、ＢＬω−ＨＳＶ２及びＢＬαＰｒｏＧの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びカラム上での再折り畳み
４℃で、Ｕｎｉｃｏｒｎ５．１コントローラーソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＡＫＴＡ−Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の制御下で、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＴＭＨＰカラムを用いて、融合タンパク質を精製した。１ｍＬ／分の流速で、勾配緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８）１０ＣＶでＨｉｓＴｒａｐカラムを平衡化した。１ｍＬ／分で、注入バルブ（ＩＮＶ−９０７）を介して直接試料を注入するために５０ｍＬスーパーループを用いて、透明化したＥ．コリ溶解液を直接カラムに載せた。１ｍＬ／分で、８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８から１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８の２０ＣＶ勾配にわたり、結合タンパク質を再び折り畳ませた。５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５ １０ＣＶとそれに続く１００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の第二の１０ＣＶで夾雑タンパク質をカラムから洗い流した。５００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５ １０ＣＶでヒスチジンタグ付加タンパク質を溶出し、１ｍＬ分画になるように回収した。タンパク質ピーク（２．５ｍＬ）を含有する分画をプールし、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５０％グリセロールに緩衝液を交換し、−２０℃で保存した。
【０２５０】
ＢＬω−ＰｒｏＧ融合コンストラクトに対するリンカー長の最適化
より短い（Ｇ４Ｓ）２又はより長い（Ｇ４Ｓ）４ドメイン間リンカーを有するＢＬω−ＰｒｏＧコンストラクトを作製するために、ＤＮＡ２．０により個々の遺伝子配列を合成し、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に連結した。元のＢＬω−ＰｒｏＧのようにネイティブ条件下で両断片を精製した。被分析物質の源として、ＨＳＶ１陽性の個体からのプール血清又はＨＳＶ１抗原性ペプチドで免疫付与したウサギからの過免疫血清の何れかを用いて、ＢＬα−ＨＳＶ１と組み合わせて３種類のＢＬω−ＰｒｏＧ断片を用いてアッセイを行った。両アッセイに対して、バックグラウンド相補性のレベルを示すために、ＨＳＶ−１／２陰性血清を加えた。ＢＬα−ＨＳＶ１（５ｎＭ）、ＢＬω−ＰｒｏＧ（５ｎＭ）、０．５Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７及び１００μＭニトロセフィンからなる２００μＬ反応液中で１：１００の最終濃度になるように血清を添加した。ＲＴで４０分間にわたりニトロセフィン加水分解の動態を４９２ｎｍで測定する前に、ＲＴで１０分間、反応液を温置した。
【０２５１】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２特異的ＩｇＧに対するβ−ラクタマーゼに基づくＦＥＣアッセイ
正常個体又はＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２感染が証明された個体の何れかからの５０検体の血清試料を試験した。１５０検体の患者血清（５０検体のＨＳＶ−２陽性／ＨＳＶ−１陰性；５０検体のＨＳＶ−１陽性／ＨＳＶ−２陰性；５０検体のＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２陰性）のそれぞれとともに、（１）ＢＬα−ＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧ、（２）ＢＬα−ＨＳＶ２／ＢＬ−ＰｒｏＧ、（３）ＢＬω−ＨＳＶ１／ＢＬα−ＰｒｏＧ及び（４）ＢＬω−ＨＳＶ２／ＢＬα−ＰｒｏＧを含む断片の４種類の異なる組み合わせを試験した。血清（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中の１：２０希釈液の２０μＬ）、続いてニトロセフィン（Ｍｅｒｃｋ）（５％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中の１ｍＭニトロセフィン２０μＬ）を、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の均一反応混合液１６０μＬに添加し、１：２００患者血清、１００μＭニトロセフィン、０．５％ＤＭＳＯ、５ｎＭ ＢＬα、５ｎＭ ＢＬω、０．５Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７の最終濃度を得た。プラットフォームロッカー上でＲＴで１５分間、反応混合液を温置し、その後、４９２ｎｍでＲＴにて６０分間にわたりニトロセフィン加水分解の速度を測定した。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて速度測定の結果を得て、分析した。アッセイの最初の２０分間において速度（ｍＯＤ分−１）を計算した。
【０２５２】
結果
ＢＬω−ＰｒｏＧに対するリンカー長の最適化
発明者らは、ＢＬω−ＰｒｏＧ内での（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３又は（Ｇ４Ｓ）４ドメイン間リンカーの何れかの使用の効率を比較した。それぞれモデル被分析物質及びその対照としてウサギ過免疫血清（抗ＨＳＶ−１ペプチド）又はＨＳＶ−１／２陰性血清の何れかと３種類のＢＬω−ＰｒｏＧ変異体及びＢＬα−ＨＳＶ１を組み合わせた、相補性アッセイを行った。過免疫血清を用いたアッセイにより、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを有するＢＬω−ＰｒｏＧで活性レベルが最大となり、従ってバックグラウンドに対するシグナルの比が最大となることが示された。これらのアッセイから、より大きい（Ｇ４Ｓ）４リンカーを有するものと比較して（Ｇ４Ｓ）２及び（Ｇ４Ｓ）３リンカーを有するＢＬω−ＰｒｏＧで活性レベルが高くなることが示される。この実験においてＦＥＣアッセイに対して使用される全てのその他のＢＬω−ＰｒｏＧ断片には（Ｇ４Ｓ）３リンカーが組み込まれた。
【０２５３】
ＢＬω−ＰｒｏＧの特異性
ＢＬω−ＰｒｏＧのプロテインＧ部分が機能的であり、発明者らのＨＡ形式で試験するのに適切であることを確認するために、発明者らは、表面プラズモン共鳴を用いてヒトＩｇＧに対するその結合速度を評価した。センソグラムデータの分析から、ＢＬω−ＰｒｏＧが８１ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有することが示されたが、これは公開されているプロテインＧのＣ２ドメインの親和性（９３ｎＭ）（これもまたＳＰＲを用いて決定された。）と同等である。ＢＬω−ＰｒｏＧはＣ２ドメインよりも会合速度が遅いが、これは解離速度がより遅いことにより補正される。ヒト血清アルブミンへの結合を除外するために、短縮型市販の組み換えプロテインＧを陽性対照として含めた。この組み換えプロテインＧは、同じ条件下で試験された場合、ＢＬω−ＰｒｏＧよりもヒトＩｇＧへの結合親和性が低かった（ＫＤ＝４８３ｎＭ）。
【０２５４】
β−ラクタマーゼに基づくＦＥＣを用いた被分析物質定量
本明明細書中に記載のインビトロＦＥＣ方式の濃度−反応を調べるために、モデル被分析物質の存在下で一緒にＢＬα−ＨＳＶ１及びＢＬω−ＰｒｏＧをアッセイした。この場合、β−ラクタマーゼ分割点末端の近接端部に両酵素断片がヘキサヒスチジンタグを有するので、モデル被分析物質としてマウスモノクローナル抗ヒスチジンＡｂ（抗Ｈｉｓ ＭＡｂ）を使用した。得られた曲線（データは示さず。）は、単一部位飽和結合に相応する古典的なシグモイド型を示し、このアッセイ形式が、比例して高い被分析物質濃度と低い被分析物質濃度とを区別できることが確認される。これは、被分析物質濃度が検出範囲に入る限り被分析物質濃度を定量するために本アッセイを使用することができることを示唆する。予想されるように、対照被分析物質（モノクローナル抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＡｂ；抗−ＧＳＴ ＭＡｂ）は反応曲線をなさず、このことから、抗体の存在下での本アッセイの忠実性が示される。
【０２５５】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の検出のためのβ−ラクタマーゼに基づくＦＥＣを用いた均一アッセイ
発明者らの均一アッセイの性能を試験するために、発明者らは、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａからの１５０検体の患者血清試料（５０検体のＨＳＶ−１陽性／ＨＳＶ−２陰性；５０検体のＨＳＶ−２陽性／ＨＳＶ−１陰性；５０検体のＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２陰性）をアッセイし、内部標準として使用した既存の市販アッセイ、ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔ１及び２ ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ（Ｆｏｃｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）と発明者らの結果を比較した。図１４から１７は、β−ラクタマーゼに基づくＦＥＣが高い感受性及び特異性で首尾よくタイプ特異的ＨＳＶ抗体を検出することができることを示す。ＨＳＶ−１／２に対する試験で陰性であるプール血清の試料（ｎ＝４）に対して、５０アッセイの各セットに対する結果（断片の４種類の異なる組み合わせのそれぞれに対して３セットのアッセイ−３日間にわたり３回ずつ行う。）を正規化した。図１８は、ＨＳＶ陰性患者から（０．８５ｍＯＤ分−１）又は高ＨＳＶ−２陽性血清の個体から（５．１４ｍＯＤ分−１）の血清中でのＢＬα−ＨＳＶ２／ＢＬω−ＰｒｏＧによるニトロセフィン加水分解の典型的な速度を示す。ＨＳＶ−１高陽性血清中でＢＬα−ＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧにより同様の加水分解速度が得られた。ＢＬα−ＰｒｏＧ／ＢＬω−ＨＳＶ１の活性（図１４）は全体的にＢＬα−ＨＳＶ１／ＢＬω−ＰｒｏＧ（図１７）よりも僅かに高いが、ある種の融合パートナー（ＰｒｏＧ、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２特異的ペプチド）に対する断片（ＢＬα又はＢＬω）の選択はアッセイの全体的結果にはあまり影響がなかった。対照試料（ＨＳＶ陰性血清）において低バックグラウンド活性を維持するために、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５Ｍ尿素を含有するアッセイ中で低断片濃度（５ｎＭ）と組み合わせた高血清希釈液（１：２００）を使用した。７５分間（基質添加後１５分間の遅延時間を含む。）にわたり血清試料をアッセイしたが、試料によっては、基質添加後、最初の２５分間内に色の変化が観察され得る。
【０２５６】
考察
発明者らは、多岐にわたる生体指標の検出のために使用することができる可能性がある新しいＦＥＣに基づく均一アッセイを開発した。この系は、専用の機器を必要とせず、単純であるため、ポイントオブケアの用途のためにさらに開発することができる。実際に可能であることを示すために、発明者らは、Ｅ．コリβ−ラクタマーゼを用いたタイプ特異的ＨＳＶ ＩｇＧの検出のためのアッセイを開発した。この遺伝子を２つに分割し、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２−特異的ペプチド抗原の何れかに融合させた一方の断片；プロテインＧの１つのドメインに融合させた他方の断片を発現するように改変した。β−ラクタマーゼ断片の全てを大量に容易に精製し、単に被分析物質及び基質存在下で２つの相補的断片を一緒に混合することにより緩衝液中でアッセイした。発明者らは、β−ラクタマーゼに基づくＦＥＣアッセイは、高感受性及び特異性で、ヒト血清中でのＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する抗体を同定することにより、限られた交差反応性、妨害及び阻害で、血清中の大きな被分析物質を検出することができることを明らかにした。
【０２５７】
同じ又は異なるレポーター酵素の何れかを用いたＰＣＡの先行報告に相反して、発明者らは、一貫して、被分析物質の存在下で、相補性断片の自発的アセンブリーの結果として、バックグラウンド活性を観察した。この見解の相違は、これら２つのアッセイの基礎となる性質が異なることによって説明することができる。ＰＣＡは、インビボで（酵素断片の濃度は細胞あたり２５分子程度であり得る。）（〜ｆＭの範囲）タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、最も一般的に使用される。一方、発明者らのインビトロでのＦＥＣに基づくアッセイは、５ｎＭという高い断片濃度を有し、それにより、自発的再会合の可能性が向上する。それにもかかわらず、本明細書中で報告される予備アッセイは、平均でバックグラウンドよりも少なくとも２倍高いシグナルを生じさせ、溶液中の被分析物質の濃度によっては、発明者らは、ヒト血清において１５という高いノイズに対するシグナル比を達成することができる。将来、発明者らは、互いに対して親和性が非常に低い、つまり、アッセイのダイナミックレンジを向上させながら、被分析物質検出及びバックグラウンドノイズの限界の両方を低くする断片を作製することに焦点を当てることを目標としている。
【０２５８】
ＨＳＶ感染の診断のための信頼できる市販のタイプ特異的血清学試験はあまりなく、これらのうち最も一般的であるものはＥＬＩＳＡに基づく。発明者らのアッセイ開発ストラテジーの一部として、発明者らは、レポーター酵素断片に融合させた際にＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２に対する抗体の検出に対して感度が高く特異性が高い新規ＨＳＶタイプ特異的抗原を設計することに成功した。ＨＳＶ−１特異的ペプチドは、ヒトにおいてＨＳＶタイプ−１特異的反応を誘発することが知られている２つのキーとなるアミノ酸に加えて、ｇＧ１の免疫優勢領域を含有する。同様に、ＨＳＶ−２特異的ペプチドは、ヒトにおいてＨＳＶタイプ−２特異的反応を誘発することが知られているｇＧ２の２つの免疫優勢エピトープを含有する。
【０２５９】
本明細書中で報告されるＦＥＣに基づく均一ＥＩＡは単純であり、リアルタイムでの疾患特異的生体指標の検出のために容易に自動化し得る。リアルタイム被分析物質検出（センサー）により、エンドポイント検出よりも大きいダイナミックレンジが得られ、ライフサイエンスでの応用に対して本質的に定量的である。
【０２６０】
上記の個々のセクションで言及された本発明の様々な特性及び実施形態は、必要に応じて、変更すべき部分は変更して、他のセクションに適用される。従って、必要に応じて、あるセクションで述べられる特性を他のセクションで述べられる特性と組み合わせ得る。
【０２６１】
本明細書中で開示され主張される全ての組成物及び方法は、本開示に照らして、不必要な実験を行わずに為し、実行することができる。好ましい実施形態の観点から本発明の組成物及び方法を説明してきたが、当業者にとって当然のことながら、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び方法に対して、及び本明細書中に記載の方法段階において又は段階の順番において、変更を適用し得る。さらに具体的には、同じ又は同様の結果が達成されると同時に、化学的かつ物理学的に関連のあるある一定の作用物質で本明細書中に記載の作用物質を置き換えることができることが明らかである。当業者にとって明らかである全てのこのような類似の置換及び変更は、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の精神、範囲及び概念内にあるものとみなされる。
【０２６２】
参考文献
上記文章で特定される参考文献は、それらが、本明細書中で使用される、方法、技術及び／又は組成物の背景を、補足し、説明し、提供するか又はそれらを教示する程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素活性の阻害剤の存在下で酵素活性を保持するポリペプチド複合体を生成させるための少なくとも第二のポリペプチドとの会合において操作可能なポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが一部であるポリペプチド複合体の酵素活性が、β−ラクタム抗生物質のβ−ラクタム環の加水分解を含み、ならびに酵素活性の阻害剤がβ−ラクタマーゼの阻害剤である、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
単離され及び精製された請求項１又は請求項２のポリペプチド。
【請求項４】
インタラクタードメインに連結されてレポーター断片ペアメンバーを形成する、請求項１から３の何れか一項にポリペプチド。
【請求項５】
インタラクタードメインがリンカーによりポリペプチドに連結される、請求項４のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項６】
強制的酵素相補性アッセイにおいて操作可能な、請求項４又は請求項５のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項７】
インビボ強制的酵素相補性アッセイにおいて操作可能な、請求項６のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項８】
インビトロ強制的酵素相補性アッセイにおいて操作可能な、請求項６のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項９】
メンバーが、そのアミノ酸配列変化を欠く相同配列の安定性と比較してインビトロアッセイ条件下で安定性を促進するアミノ酸配列変化を含む、請求項８のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項１０】
メンバーが、そのアミノ酸配列変化を欠く相同配列の溶解性と比較して溶解性を促進するアミノ酸配列変化を含む、請求項８のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項１１】
単離され及び精製された請求項４から請求項１０の何れか一項のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項１２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列において述べられる連続アミノ酸配列を含む単離ペプチド。
【請求項１３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列のポリペプチドをコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１、３、１２又は１３の何れか一項のポリペプチドを含む、強制的酵素断片相補性アッセイ。
【請求項１５】
請求項４から１１の何れか一項のレポーター断片ペアメンバーを含む、強制的酵素断片相補性アッセイ。
【請求項１６】
アツセイがインビボで行われる、請求項１４又は請求項１５のアッセイ。
【請求項１７】
アッセイがインビトロで行われる、請求項１４又は請求項１５のアッセイ。
【請求項１８】
血液又は血清を含む、請求項１７のアッセイ。
【請求項１９】
ポリペプチド又はレポーター断片ペアメンバーが一部である複合体の酵素活性の阻害剤の存在下で行われる、請求項１４から１８の何れか一項のアッセイ。
【請求項２０】
ポリペプチドが一部である複合体の酵素活性がβ−ラクタム抗生物質のβ−ラクタム環の加水分解を含み、ならびに酵素活性の阻害剤がβ−ラクタマーゼの阻害剤である、請求項１４から１９の何れか一項のアッセイ。
【請求項２１】
インタラクタードメインが、２価金属陽イオン、抗体、代謝産物、疾患マーカー又は抗原からなる群から選択される関心のある被分析物質に対して親和性を有する、請求項１４から２０の何れか一項のアッセイ。
【請求項２２】
被分析物質の存在についてアッセイする方法であって、
（ａ）関心のある被分析物質の存在について試験しようとする試料を得る段階；
（ｂ）被分析物質に対して親和性があるインタラクタードメインを含む、精製された第一のレポーター断片ペアメンバーを得る段階；
（ｃ）関心のある被分析物質に対して親和性があり、ならびに関心のある被分析物質との第一及び第二のレポーター断片ペアメンバーのインタラクタードメインの親和性を通じ、第一のレポーター断片ペアメンバーとの会合に際してレポーター酵素活性を再構成することにおいて操作可能であるインタラクタードメインを含む精製された第二のレポーター断片ペアメンバーを得る段階；及び
（ｄ）第一及び第二のレポーター断片ペアメンバーが、被分析物質とのインタラクタードメインの親和性を通じて会合することができるのに十分なインビトロでのアッセイ条件を提供する段階を含み、レポーター酵素活性の再構成が試料中での被分析物質の存在を示す、方法。
【請求項２３】
被分析物質が２価陽イオンである、請求項２２の方法。
【請求項２４】
被分析物質が抗体である、請求項２２の方法。
【請求項２５】
均一インビトロ強制的酵素断片相補性アッセイを行うためのキットであって、関心のある被分析物質に対して親和性があるインタラクタードメインを含む単離レポーター断片ペアメンバーを含み、単離レポーター断片ペアメンバーが、インビトロアッセイ条件下で安定であり及び操作可能である、キット。
【請求項２６】
均一インビトロ強制的酵素断片相補性アッセイを行うためのキットであって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列の単離ポリペプチドを含む、キット。
【請求項２７】
第一のポリペプチドレポーターサブユニットを含む第一の成分及び第二のポリペプチドレポーターサブユニットを含む第二の成分を含むレポーター系であって、第一のサブユニット及び第二のサブユニットが、検出可能なシグナルを生成し得る酵素活性を有する活性のあるポリペプチド複合体を生成させるために会合することができ、前記会合が関心のある被分析物質に対する第一及び第二の成分の結合により媒介され；第一のポリペプチドサブユニット及び／又は第二のポリペプチドレポーターサブユニットが、阻害剤による前記酵素活性の阻害に対する活性ポリペプチド複合体の感受性を低下させる１以上のアミノ酸配列変化を含む、レポーター系。
【請求項２８】
阻害剤が、生体試料中に存在する物質である、請求項２７に記載のレポーター系。
【請求項２９】
生体試料中に存在する物質が抗生物質である、請求項２８に記載のレポーター系。
【請求項３０】
活性ポリペプチド複合体がβ−ラクタマーゼ活性を有する、請求項２７から２９の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項３１】
第一のポリペプチドレポーターサブユニットがβラクタマーゼのα断片を含み、ならびに第二のポリペプチドレポーターサブユニットがβラクタマーゼのω断片を含む、請求項３０に記載のレポーター系。
【請求項３２】
βラクタマーゼがＴＥＭ−１βラクタマーゼであり、ならびに第一のポリペプチドサブユニット中の前記アミノ酸配列変化がＭ６９Ｌ又はＭ６９Ｉ置換を含む、請求項３１に記載のレポーター系。
【請求項３３】
βラクタマーゼがＴＥＭ−１βラクタマーゼであり、ならびに第二のポリペプチドサブユニット中の前記アミノ酸配列変化がＮ２７６Ｄ置換を含む、請求項３１又は請求項３２に記載のレポーター系。
【請求項３４】
第一及び／又は第二のレポーターポリペプチドサブユニットが、インビトロでのサブユニットの安定性及び／又は溶解性を促進する１以上のアミノ酸変化を含む、請求項２７から３３の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項３５】
第一のポリペプチドサブユニットがＴＥＭ−１βラクタマーゼのα断片を含み、ならびに第二のポリペプチドサブユニットがＴＥＭ−１βラクタマーゼのω断片を含み、ならびに第一のポリペプチドサブユニット中の前記アミノ酸配列変化がＶ７４Ｔ置換及び／又はＭ１８２Ｔ置換を含む、請求項３４に記載のレポーター系。
【請求項３６】
第一のポリペプチドサブユニットがＴＥＭ−１βラクタマーゼのα断片を含み、ならびに第二のポリペプチドサブユニットがＴＥＭ−１βラクタマーゼのω断片を含み、ならびに第二のポリペプチドサブユニット中の前記アミノ酸配列変化がＭ２１１Ｑ置換を含む、請求項３４又は請求項３５に記載のレポーター系。
【請求項３７】
第一及び第二のポリペプチドサブユニットが、それぞれ、第一及び第二のインタラクタードメインにサブユニットを連結するフレキシブルペプチドリンカーをそれぞれ含む、請求項２７から請求項３６の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項３８】
第一及び第二の成分が実質的に単離され精製された形態である、請求項２７から請求項３７の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項３９】
第一及び／又は第二のポリペプチドサブユニットが、細菌細胞中で組み換え産生され、変性条件下で細胞から抽出され、固体マトリクスに結合され、ならびに次いで固体マトリクスに結合されると同時に活性のある立体構造に再び折り畳まれる、請求項２７から請求項３８の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項４０】
試料中の関心のある被分析物質の存在を調べるための、請求項２７から請求項３９の何れか一項に記載のレポーター系の使用。
【請求項４１】
試料中の関心のある被分析物質の存在を調べるための方法であって、請求項２７から請求項３９の何れか一項に記載のレポーター系と試料を接触させること、ならびに第一及び第二のポリペプチドサブユニットの会合の結果による酵素活性の有無を検出することを含む、方法。
【請求項４２】
試料が生体試料である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
生体試料が血液試料又は血清試料である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
被分析物質が、ウイルス性又は細菌性抗原と結合する抗体である、請求項４１から請求項４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
被分析物質がウイルス性又は細菌性抗原である、請求項４１から請求項４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
第一及び第二のポリペプチド断片の最終濃度が１０ｐＭより高い、請求項４１から請求項４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１】
酵素活性の阻害剤の存在下で酵素活性を保持するポリペプチド複合体を生成させるための少なくとも第二のポリペプチドとの会合において操作可能なポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが一部であるポリペプチド複合体の酵素活性が、β−ラクタム抗生物質のβ−ラクタム環の加水分解を含み、ならびに酵素活性の阻害剤がβ−ラクタマーゼの阻害剤である、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
単離され及び精製された請求項１又は請求項２のポリペプチド。
【請求項４】
インタラクタードメインに連結されてレポーター断片ペアメンバーを形成する、請求項１から３の何れか一項にポリペプチド。
【請求項５】
インタラクタードメインがリンカーによりポリペプチドに連結される、請求項４のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項６】
強制的酵素相補性アッセイにおいて操作可能な、請求項４又は請求項５のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項７】
インビボ強制的酵素相補性アッセイにおいて操作可能な、請求項６のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項８】
インビトロ強制的酵素相補性アッセイにおいて操作可能な、請求項６のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項９】
メンバーが、そのアミノ酸配列変化を欠く相同配列の安定性と比較してインビトロアッセイ条件下で安定性を促進するアミノ酸配列変化を含む、請求項８のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項１０】
メンバーが、そのアミノ酸配列変化を欠く相同配列の溶解性と比較して溶解性を促進するアミノ酸配列変化を含む、請求項８のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項１１】
単離され及び精製された請求項４から請求項１０の何れか一項のレポーター断片ペアメンバー。
【請求項１２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列において述べられる連続アミノ酸配列を含む単離ペプチド。
【請求項１３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列のポリペプチドをコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１、３、１２又は１３の何れか一項のポリペプチドを含む、強制的酵素断片相補性アッセイ。
【請求項１５】
請求項４から１１の何れか一項のレポーター断片ペアメンバーを含む、強制的酵素断片相補性アッセイ。
【請求項１６】
アツセイがインビボで行われる、請求項１４又は請求項１５のアッセイ。
【請求項１７】
アッセイがインビトロで行われる、請求項１４又は請求項１５のアッセイ。
【請求項１８】
血液又は血清を含む、請求項１７のアッセイ。
【請求項１９】
ポリペプチド又はレポーター断片ペアメンバーが一部である複合体の酵素活性の阻害剤の存在下で行われる、請求項１４から１８の何れか一項のアッセイ。
【請求項２０】
ポリペプチドが一部である複合体の酵素活性がβ−ラクタム抗生物質のβ−ラクタム環の加水分解を含み、ならびに酵素活性の阻害剤がβ−ラクタマーゼの阻害剤である、請求項１４から１９の何れか一項のアッセイ。
【請求項２１】
インタラクタードメインが、２価金属陽イオン、抗体、代謝産物、疾患マーカー又は抗原からなる群から選択される関心のある被分析物質に対して親和性を有する、請求項１４から２０の何れか一項のアッセイ。
【請求項２２】
被分析物質の存在についてアッセイする方法であって、
（ａ）関心のある被分析物質の存在について試験しようとする試料を得る段階；
（ｂ）被分析物質に対して親和性があるインタラクタードメインを含む、精製された第一のレポーター断片ペアメンバーを得る段階；
（ｃ）関心のある被分析物質に対して親和性があり、ならびに関心のある被分析物質との第一及び第二のレポーター断片ペアメンバーのインタラクタードメインの親和性を通じ、第一のレポーター断片ペアメンバーとの会合に際してレポーター酵素活性を再構成することにおいて操作可能であるインタラクタードメインを含む精製された第二のレポーター断片ペアメンバーを得る段階；及び
（ｄ）第一及び第二のレポーター断片ペアメンバーが、被分析物質とのインタラクタードメインの親和性を通じて会合することができるのに十分なインビトロでのアッセイ条件を提供する段階を含み、レポーター酵素活性の再構成が試料中での被分析物質の存在を示す、方法。
【請求項２３】
被分析物質が２価陽イオンである、請求項２２の方法。
【請求項２４】
被分析物質が抗体である、請求項２２の方法。
【請求項２５】
均一インビトロ強制的酵素断片相補性アッセイを行うためのキットであって、関心のある被分析物質に対して親和性があるインタラクタードメインを含む単離レポーター断片ペアメンバーを含み、単離レポーター断片ペアメンバーが、インビトロアッセイ条件下で安定であり及び操作可能である、キット。
【請求項２６】
均一インビトロ強制的酵素断片相補性アッセイを行うためのキットであって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１及び８３からなる群から選択される配列の単離ポリペプチドを含む、キット。
【請求項２７】
第一のポリペプチドレポーターサブユニットを含む第一の成分及び第二のポリペプチドレポーターサブユニットを含む第二の成分を含むレポーター系であって、第一のサブユニット及び第二のサブユニットが、検出可能なシグナルを生成し得る酵素活性を有する活性のあるポリペプチド複合体を生成させるために会合することができ、前記会合が関心のある被分析物質に対する第一及び第二の成分の結合により媒介され；第一のポリペプチドサブユニット及び／又は第二のポリペプチドレポーターサブユニットが、阻害剤による前記酵素活性の阻害に対する活性ポリペプチド複合体の感受性を低下させる１以上のアミノ酸配列変化を含む、レポーター系。
【請求項２８】
阻害剤が、生体試料中に存在する物質である、請求項２７に記載のレポーター系。
【請求項２９】
生体試料中に存在する物質が抗生物質である、請求項２８に記載のレポーター系。
【請求項３０】
活性ポリペプチド複合体がβ−ラクタマーゼ活性を有する、請求項２７から２９の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項３１】
第一のポリペプチドレポーターサブユニットがβラクタマーゼのα断片を含み、ならびに第二のポリペプチドレポーターサブユニットがβラクタマーゼのω断片を含む、請求項３０に記載のレポーター系。
【請求項３２】
βラクタマーゼがＴＥＭ−１βラクタマーゼであり、ならびに第一のポリペプチドサブユニット中の前記アミノ酸配列変化がＭ６９Ｌ又はＭ６９Ｉ置換を含む、請求項３１に記載のレポーター系。
【請求項３３】
βラクタマーゼがＴＥＭ−１βラクタマーゼであり、ならびに第二のポリペプチドサブユニット中の前記アミノ酸配列変化がＮ２７６Ｄ置換を含む、請求項３１又は請求項３２に記載のレポーター系。
【請求項３４】
第一及び／又は第二のレポーターポリペプチドサブユニットが、インビトロでのサブユニットの安定性及び／又は溶解性を促進する１以上のアミノ酸変化を含む、請求項２７から３３の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項３５】
第一のポリペプチドサブユニットがＴＥＭ−１βラクタマーゼのα断片を含み、ならびに第二のポリペプチドサブユニットがＴＥＭ−１βラクタマーゼのω断片を含み、ならびに第一のポリペプチドサブユニット中の前記アミノ酸配列変化がＶ７４Ｔ置換及び／又はＭ１８２Ｔ置換を含む、請求項３４に記載のレポーター系。
【請求項３６】
第一のポリペプチドサブユニットがＴＥＭ−１βラクタマーゼのα断片を含み、ならびに第二のポリペプチドサブユニットがＴＥＭ−１βラクタマーゼのω断片を含み、ならびに第二のポリペプチドサブユニット中の前記アミノ酸配列変化がＭ２１１Ｑ置換を含む、請求項３４又は請求項３５に記載のレポーター系。
【請求項３７】
第一及び第二のポリペプチドサブユニットが、それぞれ、第一及び第二のインタラクタードメインにサブユニットを連結するフレキシブルペプチドリンカーをそれぞれ含む、請求項２７から請求項３６の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項３８】
第一及び第二の成分が実質的に単離され精製された形態である、請求項２７から請求項３７の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項３９】
第一及び／又は第二のポリペプチドサブユニットが、細菌細胞中で組み換え産生され、変性条件下で細胞から抽出され、固体マトリクスに結合され、ならびに次いで固体マトリクスに結合されると同時に活性のある立体構造に再び折り畳まれる、請求項２７から請求項３８の何れか一項に記載のレポーター系。
【請求項４０】
試料中の関心のある被分析物質の存在を調べるための、請求項２７から請求項３９の何れか一項に記載のレポーター系の使用。
【請求項４１】
試料中の関心のある被分析物質の存在を調べるための方法であって、請求項２７から請求項３９の何れか一項に記載のレポーター系と試料を接触させること、ならびに第一及び第二のポリペプチドサブユニットの会合の結果による酵素活性の有無を検出することを含む、方法。
【請求項４２】
試料が生体試料である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
生体試料が血液試料又は血清試料である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
被分析物質が、ウイルス性又は細菌性抗原と結合する抗体である、請求項４１から請求項４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
被分析物質がウイルス性又は細菌性抗原である、請求項４１から請求項４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
第一及び第二のポリペプチド断片の最終濃度が１０ｐＭより高い、請求項４１から請求項４５の何れか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１０−５１７９４５（Ｐ２０１０−５１７９４５Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４７４８８（Ｐ２００９−５４７４８８）
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００５０８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９５２２２
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０９２２０２３１）パンバイオ・リミテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００５０８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９５２２２
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０９２２０２３１）パンバイオ・リミテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
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