培養容器用スペーサ、該スペーサを備えた培養装置、該培養装置を用いた観察方法
【課題】特別な装置を使用することなく、一般の蓋体付きのマルチウエルプレートのような培養容器に適用するだけで、気相に含まれる対象物質が生体試料に与える影響をリアルタイムで観察して、信頼性よく評価でき、しかも対象物質の種類が限定されることのない培養容器用スペーサと、該スペーサを備えた培養装置、該培養装置を用いた観察方法の提供。
【解決手段】培養装置の培養容器本体２１と、該培養容器本体２１に被せられる蓋体２２との間に装着され、培養容器本体２１と蓋体２２とを離間させつつ、気密に接続する培養容器用スペーサ１０Ａ。この培養容器用スペーサ１０Ａを備えた培養装置によれば、生体試料を培養しながら、培養装置内の気相に含まれる物質が生体試料に及ぼす影響をリアルタイムで観察できる。
【解決手段】培養装置の培養容器本体２１と、該培養容器本体２１に被せられる蓋体２２との間に装着され、培養容器本体２１と蓋体２２とを離間させつつ、気密に接続する培養容器用スペーサ１０Ａ。この培養容器用スペーサ１０Ａを備えた培養装置によれば、生体試料を培養しながら、培養装置内の気相に含まれる物質が生体試料に及ぼす影響をリアルタイムで観察できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の培養容器に装着される培養容器用スペーサ、該スペーサを備えた培養装置、該培養装置を用いた観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、気化した有機溶媒、窒素酸化物、浮遊微粒子など、大気に含まれる物質が動物の呼吸器系などに影響を与え、病気を引き起こす可能性があることが指摘されている。一方、アロマテラピーや森林浴のように、精油などの揮発性物質や樹木が発散する物質を積極的に利用することにより、健康を増進しようとすることも広く行なわれている。
このように気相に含まれる物質は、生物に対して大きな影響を与える。そのため、このような物質（以下、対象物質という場合もある。）による影響をインビトロで観察し、評価する方法について検討されている。
【０００３】
例えば、細胞を培養皿で培養する際に、対象物質を溶解させた培養液を添加することにより、通常のインビトロ法と同様に、対象物質の影響を観察したり、評価したりする方法がある。しかしながら、このような方法では、対象物質は液相に含まれた状態で添加され、気相に含まれた状態で添加されるものではないため、その対象物質が気相に含まれる場合の影響については、正確には評価できない。さらに、気相に存在する複数の対象物質を気相中と同じ濃度で培養液に溶解させ得るとは限らないため、この点でも、これらの対象物質が気相に含まれる場合の影響について、正確に観察して評価することは困難であった。
【０００４】
そこで、対象物質が含まれる気相を実際に細胞に接触させることにより、対象物質が気相に含まれる場合の影響について、正確に観察し評価しようとすることも検討されている。
例えば、培養液を入れた培養皿を気相中で上下左右に動かすことで培養液から細胞を露出させ、それにより細胞と気相とを接触させ、その際の細胞の様子を観察して評価する方法が検討されている。ところが、液体は表面張力を有しているために、細胞を露出させた場合でも液が細胞上に残存しており、やはり正確な評価は困難であった。
また、培養液を取り除いた培養細胞を対象物質が含まれる気相中に置き、観察、評価する方法も検討されている。ところが、この方法では、培養液が除去された後、細胞の活性が持続する時間は限られるため、正確な評価は難しいという問題があった。
さらに、気体は透過し、液体は透過しない膜の上で細胞を培養することで、気相に含まれる対象物質の影響を観察、評価しようとする方法も検討されているが、このような特殊な膜の上では、培養自体が難しかった。
【０００５】
そこで、細胞を培養しながら、対象物質が含まれる気相をその細胞に接触させることにより、気相に含まれる物質が細胞に与える影響をリアルタイムに観察して評価する方法が検討され、例えば特許文献１には特別な装置を用いる方法が開示されている。
また、細胞を培養しながら、対象物質が含まれる気相をその細胞に接触させることのできる装置も市販されている（例えば、柴田科学株式会社、細胞ばく露実験装置「ＳＩＳ−ＣＵＬ」）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１０１８９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載された方法では、細胞を支持する支持体、細胞に培養液を供給するための培養液収容槽、対象物質を含む気体収容部、水貯留部などを具備した特別な装置を使用する必要があり、簡便に観察や評価を行えるものではなかった。
また、先に例示した市販の細胞ばく露実験装置は、上部には不透明な蓋体が被せられた構成であり、さらには、下部にウォーターバスが設けられ、顕微鏡のレンズから細胞までの距離がレンズのワーキングディスタンスと比較してはるかに長いことから、リアルタイムでの顕微鏡観察は困難であった。
【０００８】
また、例えば図１７に示すような蓋体５１付きのマルチウエルプレート５０を応用する方法も考えられる。このマルチウエルプレート５０は、６つのウエル（２×３）が形成されている６穴タイプの市販のものであって、透明プラスチック製である。
具体的には、生体試料６０をウエルＷ内の培地６１上に配置した後、マルチウエルプレート５０に蓋体５１を被せる。ここで蓋体５１には、気体を供給するための気体供給口５２と気体を排出するための気体排出口５３とをあらかじめ形成しておく。そして、この蓋体５１をマルチウエルプレート５０に被せた後、対象物質を含む気体を気体供給口５２からマルチウエルプレート５０内に供給し、気体排出口５３から排出する。そして、その際の生体試料６０の様子について、顕微鏡などで観察し評価する。
このような方法によれば、供給された気体によりマルチウエルプレート５０内の空間が置換され、生体試料６０と気体とが接触し、気体に含まれる対象物質が生体試料６０に与える影響をインビトロでリアルタイムに観察し、評価できるものと期待される。
【０００９】
ところが、このような一般の蓋体５１付きのマルチウエルプレート５０では、蓋体５１を被せた場合には、図１７（ｂ）に示すように、マルチウエルプレート５０と蓋体５１との間には、ほとんど隙間は形成されない。
よって、マルチウエルプレート５０内に気体供給口５２から気体を供給したとしても、ウエルＷ間の気体の移動が困難なため、供給された気体は各ウエルＷ内の空間を十分には置換することなく、主にマルチウエルプレート５０の周囲における、マルチウエルプレート５０と蓋体５１との間のわずかな隙間から漏出してしまう。また、このような隙間からの気体の漏出を防ぐために、マルチウエルプレート５０と蓋体５１との間をパッキンなどで密封したとしても、マルチウエルプレート５０と蓋体５１との間に隙間が無い状態には変わりがないため、ウエルＷ間の気体の移動はやはり困難であった。そのため、気体の供給速度を上げると容器内圧が上昇し、容器内の温度、湿度が変化してしまうという問題や、このような気圧変化が生体試料６０に影響してしまうという問題があった。また、気体供給口５２に減圧手段を接続して、吸引法によりマルチウエルプレート５０内の空気を置換する方法でも、気体の吸引速度を上げると容器内圧が低下し、やはり同様の問題が生じた。
【００１０】
すなわち、このような市販の蓋体５１付きのマルチウエルプレート５０を単に応用した方法では、マルチウエルプレート５０内に気体を短時間で効率よく拡散させ、置換することはできない。そのため、各ウエルＷ内の空間を十分に置換し、ウエルＷに配置された生体試料６０に気体を接触させるまでには、気体の供給を開始した時点から長時間を要し、気体に含まれる対象物質の影響をリアルタイムで観察することは難しい。また、ウエルＷ内の空間が十分に置換されるのに要する時間は、各ウエルＷごとに異なってくるため、たとえ評価を行ったとしても、ウエルＷ間で得られるデータのばらつきは大きく、信頼性の高い評価はできない。
また、市販の蓋体５１付きのマルチウエルプレート５０では、上述したように、供給された気体は蓋体５１とマルチウエルプレート５０との隙間から大気中に漏洩してしまう。したがって、供給可能な気体の種類は限定され、例えば毒性のある物質を含む気体などを供給することは困難である。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、特別な装置を使用することなく、一般の蓋体付きのマルチウエルプレートのような培養容器に適用するだけで、気相に含まれる対象物質が生体試料に与える影響をリアルタイムで観察して、信頼性よく評価でき、しかも対象物質の種類が限定されることのない培養容器用スペーサと、該スペーサを備えた培養装置、該培養装置を用いた観察方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の培養容器用スペーサは、培養装置の培養容器本体と、該培養容器本体に被せられる蓋体との間に装着され、前記培養容器本体と前記蓋体とを離間させるとともに、気密に接続することを特徴とする。
培養装置の内側と外側とを連通する開口部が少なくとも１つ形成されていることが好ましい。
本発明の培養容器用スペーサとしては、複数のウエルが形成された培養容器本体に対して装着される形態が挙げられる。
その場合、前記培養容器用スペーサは、各ウエルに対応する複数の孔が形成された中板部を備え、前記装着の際には、各孔の周縁部と各ウエルの開口周縁部とが密着するものである形態が好ましい。
また、ウエル同士を隔てる隔離手段を備えたものである形態も好ましい。
本発明の培養装置は、前記培養容器本体と、前記蓋体と、前記培養容器本体と前記蓋体との間に装着された前記培養容器用スペーサとを備えたことを特徴とする。
本発明の生体試料の観察方法は、前記培養装置で生体試料を培養しながら、前記培養装置内の気相に含まれる物質が前記生体試料に及ぼす影響を観察することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、特別な装置を使用することなく、一般の蓋体付きのマルチウエルプレートのような培養容器に適用するだけで、気相に含まれる対象物質が生体試料に与える影響をリアルタイムで観察して、信頼性よく評価でき、しかも対象物質の種類が限定されることのない培養容器用スペーサと、該スペーサを備えた培養装置、該培養装置を用いた観察方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】第１実施形態例の培養容器用スペーサを示す部分破断斜視図である。
【図２】図１の培養容器用スペーサのＩ−Ｉ’線に沿う断面図である。
【図３】図１の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図４】図１の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す分解斜視図である。
【図５】図１の培養容器用スペーサを備えた培養装置を示す概略構成図である。
【図６】培養容器用スペーサに形成される気体供給口および気体排出口の配置例を示す概略平面図であって、（ａ）気体供給口および気体排出口を三組形成した例と、（ｂ）気体供給口および気体排出口を四組形成した例である。
【図７】培養容器用スペーサに形成される気体供給口および気体排出口の配置例を示す（ａ）概略平面図と、（ｂ）側面図と、（ｃ）気体供給口側から見た正面図である。
【図８】第２実施形態例の培養容器用スペーサを示す（ａ）斜視図と、（ｂ）（ａ）の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図９】第３実施形態例の培養容器用スペーサを示す（ａ）斜視図と、（ｂ）（ａ）の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図１０】第４実施形態例の培養容器用スペーサを示す（ａ）斜視図と、（ｂ）（ａ）の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図１１】図１０の培養容器用スペーサを用いて、培養装置内の空間の分割例を示す概略図であって、（ａ）分割なしの例と、（ｂ）２分割の例と、（ｃ）３分割の例である。
【図１２】第５実施形態例の円形の培養容器用スペーサに形成される気体供給口および気体排出口の配置例を示す概略平面図であって、（ａ）気体供給口および気体排出口を一組形成した例と、（ｂ）気体供給口および気体排出口を二組形成した例である。
【図１３】第５実施形態例の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図１４】試験例１において、曝露時間と繊毛運動周波数（ＣＢＦ）との関係を示すグラフである。
【図１５】試験例２で使用した培養装置の構成を示す概略構成図である。
【図１６】試験例２において、曝露時間と繊毛運動周波数（ＣＢＦ）との関係を示すグラフである。
【図１７】市販の蓋体付きマルチウエルプレートにおいて、生体試料を培養しながら気相に含まれる物質が生体試料に及ぼす影響を観察する方法を概略的に示す（ａ）分解斜視図と、（ｂ）側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
［第１実施形態例］
図１および図２は、第１実施形態例の培養容器用スペーサ１０Ａを示す部分破断斜視図および断面図である。図３および図４は、培養装置３０を示す断面図および分解斜視図であって、この培養装置３０は、細胞などの生体試料を培養する培養容器２０と、この培養装置２０に装着された図１および図２の培養容器用スペーサ１０Ａとを具備して構成されている。
【００１６】
この例の培養容器用スペーサ（以下、単にスペーサという。）１０Ａは、図示のように市販の培養容器２０に装着されるものであって、図中上下が開口した四角形の枠状のものでる。ここでは、市販の培養容器２０として、６つのウエル（２×３）Ｗ１〜Ｗ６が形成されている６穴タイプの四角形のマルチウエルプレートからなる培養容器本体２１と、これに被せられる蓋体２２とを具備するものを例示している。この例のマルチウエルプレートと蓋体２２は、いずれも透明プラスチック製であり、顕微鏡観察や滅菌が可能なものである。
【００１７】
スペーサ１０Ａは、図示のように、培養容器本体２１と蓋体２２との間に装着されることによって、培養容器本体２１と蓋体２２とを離間して、これらの間に、培養容器本体２１の上端から蓋体２２に到る高さｈのスペースＳを形成するとともに、培養容器本体２１と蓋体２２とを気密に接続するものである。
この例のスペーサ１０Ａは、蓋体２２と嵌合する四角形の枠状の上枠１１と、培養容器本体２１と嵌合する四角形の枠状の下枠１２とを具備して構成され、上枠１１は蓋体２２の内側に嵌められ、下枠１２は培養容器本体１２の外側に嵌められるようになっている。そのため、上枠１１は下枠１２よりも小さく形成されているとともに、上枠１１では外周側に、下枠１２では内周側に、それぞれ全周にわたって天然ゴム、シリコーンゴムなどからなるゴム製のパッキン１３が設けられ、スペーサ１０Ａを培養容器２０に装着した際には、上枠１１は蓋体２２と気密に接続し、下枠１２は培養容器本体２１と気密に接続するようになっている。
【００１８】
また、この例では、スペーサ１０Ａの下枠１２を形成している一対の短辺のほぼ中央に、このスペーサ１０Ａを備えた培養装置３０の内側と外側とを連通する開口部がそれぞれ１つずつ形成されている。このうちの一方の開口部は、培養装置３０内に気体を供給する図示略の気体供給手段が接続される気体供給口１４である。他方の開口部は、培養装置３０内から気体が排出される気体排出口１５であって、必要に応じて、排出された気体が大気中に漏洩しないように回収する袋、容器などの気体回収手段が接続される。気体供給口１４と気体供給手段との間や、気体排出口１５と気体回収手段との間には、気体の逆流を防止するための逆流防止弁を設けてもよい。また、気体回収手段には吸引ポンプなどの減圧手段を接続して、気体を吸引できるようにしてもよい。
【００１９】
また、この例では、下枠１２の気体供給口１４が形成されている側の短辺に、開口部としてセンサ差込口１６が形成され、培養装置３０内の温度、湿度、ガス組成などを測定するための図示略のセンサ類を外側から内側に差し込めるようになっている。
【００２０】
ここでスペーサ１０Ａの高さＨは、気体供給口１４から培養装置３０内に供給された気体が、短時間で効率よく培養装置３０内に均一に拡散し、かつ、培養装置３０ごと顕微鏡観察に供した場合に、培養装置３０と顕微鏡のコンデンサとが干渉しないような範囲に決定される。また、図示例のようにスペーサ１０Ａに気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６が形成される場合には、これらが適切な位置に形成されるように、その点も勘案して、高さＨが決定される。
【００２１】
具体的には、培養容器３０に形成されているウエルＷ１〜Ｗ６の数や大きさ（容積）や、培養容器２０の高さなどによるが、一般的な蓋体付きマルチウエルプレートを培養容器２０として使用し、スペーサに気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６が形成されない場合には、スペースＳの高さｈが３〜３０ｍｍとなる範囲に決定されることが好ましい。より好ましくはスペースＳの高さｈが５〜２０ｍｍとなる範囲である。この範囲内であると、培養装置３０内に気体を短時間で効率よく均一に拡散させることができる。また、培養装置３０全体としての高さが大きくなりすぎて、培養装置３０ごとの顕微鏡観察に支障をきたしたり、培養装置３０内の容積が大きくなりすぎて気体の置換効率が低下したり、気体を無駄に消費したりすることもない。
図示例のようにスペーサ１０Ａに気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６が形成される場合には、スペースＳの高さｈは１０〜３０ｍｍとなる範囲に決定されることが好ましく、より好ましくは１５〜２０ｍｍとなる範囲に決定される。
【００２２】
スペーサ１０Ａの材質は、供給される気体により腐食するなどの不都合を生じず、生体試料に対して毒性が低く、また、滅菌処理可能なものであればよく、気体の種類に応じて、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック、ステンレスなどの金属などを使用でき、公知の成形方法により製造できる。
滅菌処理としては、ガンマ線照射法、乾熱滅菌法、オートクレーブを用いた方法、７０％エタノール噴霧などが挙げられる。
【００２３】
このような培養装置３０内に生体試料を配置して培養しながら、培養装置３０内の気相に対象物質を存在させて、対象物質が生体試料に及ぼす影響を観察し、評価する具体的な方法について、一例を挙げて以下に説明する。
図５に示すように、まず、培養容器本体２１であるマルチウエルプレートのウエルＷ５に培地３１を設けた後、このウエルＷ５内に、底部がメンブレンからなるセル状のカルチャーインサート３２を配置する。そして、メンブレンを介して培地３１と接触するように生体試料３３を載置し、培養する。このようにすれば、生体試料３３の下側は培地３１と接し、上側は後に供給される気体と接する、いわゆる気液界面培養が可能となる。また、この際、培地３１よりも上方におけるカルチャーインサート３２の外周とウエルＷ５の内周との間に、天然ゴム、シリコーンゴムなどからなるゴム製のパッキン３４を図示のように挿入配置して、後に気体供給口１４から培養装置３０内に供給される気体が培地３１に接触し、培地３１が悪影響を受けるのを防ぐようにすることが好ましい。
なお、図５では、６穴タイプのマルチウエルプレートを培養容器本体２１として使用しているが、ウエルＷ５以外のウエル内の詳細については図示は略している。
【００２４】
ついで、スペーサ１０Ａの下枠１２をマルチウエルプレートに嵌合し、上枠１１を蓋体２２に嵌合して、スペーサ１０Ａを培養容器本体２１と蓋体２２との間に装着する。
このように装着することによって、マルチウエルプレートと蓋体２２とを離間させ、これらの間にスペースＳを形成するとともに、スペーサ１０Ａのパッキン１３の作用によりマルチウエルプレートと蓋体２２とを気密に接続する。
ついで、培養装置３０の気体排出口１５に、排出された気体を集めるための袋（気体回収手段）３５を接続し、図５では図示略のセンサ差込口に必要なセンサ類を差し込む。そして、培養装置３０ごと、図示略の顕微鏡のステージに載置する。なお、この際必要に応じて、顕微鏡での観察の妨げにならない範囲で、培養装置３０を断熱シートで覆ってもよい。図中符号Ｍは、顕微鏡のコンデンサである。
【００２５】
ついで、対象物質を含む気体が入った注射筒（気体供給手段）３６を用意し、この注射筒３６をチューブ３７を介して気体供給口１４に接続する。そして、注射筒３６のピストンを押し込んで、気体を培養装置３０内に供給するとともに、顕微鏡に接続された図示略のデジタルカメラにより生体試料３３を連続的に撮影するなどして観察する。
そして、このような観察で得られたデータを解析するなどして、気体に含まれる対象物質が生体試料３３に及ぼす影響について評価する。
使用したスペーサ１０Ａは、適宜洗浄、滅菌して、繰り返し使用できる。また、パッキン１３をスペーサ１０Ａから着脱自在に設けておき、パッキン１３のみを取り外して洗浄、滅菌して繰り返し使用してもよいし、パッキン１３のみをその都度交換してもよい。
【００２６】
このような培養装置３０を用いた場合には、培養容器本体２１であるマルチウエルプレートと蓋体２２との間に、これらを離間させるスペーサ１０Ａが配置され、スペースＳが形成されているため、気体供給口１４から培養装置３０内に供給された気体は、マルチウエルプレート内に短時間で効率よく均一に拡散し、各ウエルＷ１〜Ｗ６内の空間も十分に置換され、その中に配置された生体試料３３に気体を接触させるまでに長時間を要しない。よって、気体に含まれる対象物質の影響をリアルタイムで観察し、評価することができる。また、ウエルＷ１〜Ｗ６内の空間が十分に置換されるのに要する時間がウエルごとに異なってくることもないため、ウエル間でデータがばらつくこともなく、信頼性の高い評価を行うことができる。
また、このスペーサ１０Ａは、蓋体２２とマルチウエルプレートとを気密に接続するものであるため、供給された気体は蓋体２２とマルチウエルプレートとの間から漏洩することがない。よって、供給可能な気体の種類は限定されず、例えば毒性のある物質を含む気体なども供給可能である。
【００２７】
なお、この例のスペーサ１０Ａには、スペーサ１０Ａの内側と外側を連通する開口部として、気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６が下枠１２に形成されているが、これらが形成される数や位置には特に制限はなく、上枠１１に形成されてもよい。また、例えば、図６および７に１２穴タイプのマルチウエルプレートを例示するように、マルチウエルプレートの各ウエルＷ１〜Ｗ１２に対してばらつきなく気体を供給できるように、ウエルの数、配置などに応じて、気体供給口１４や気体排出口１５などをスペーサの適当な位置に各々複数形成できる。
【００２８】
また、気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６は、必ずしも形成されていなくてもよい。例えば、揮発性物質を対象物質とし、その影響を観察、評価する場合には、生体試料が載置されたウエルとは異なるウエルに揮発性物質を入れた後、直ちにマルチウエルプレートに蓋体とスペーサとを装着する方法でも、揮発性物質を気相中に供給することができる。
また、気体供給口や気体排出口が形成された蓋体を用いて、ここから気体の供給と排出を行うようにすれば、スペーサには気体供給口や気体排出口が形成されていなくてもよい。
【００２９】
なお、液体状の揮発性物質を対象物質とする場合であっても、気体供給口１４が形成されているスペーサ１０Ａを用いて、揮発性物質を気体供給口１４から供給することもできる。その場合には、揮発性物質が入れられた注射筒を気体供給口１４から挿入し、生体試料が載置されたウエルとは異なるウエルに、揮発性物質を滴下する方法が好適である。
また、気体供給口１４、気体排出口１５に接続される気体供給手段、気体回収手段の種類にも特に制限はない。
【００３０】
また、この例のスペーサ１０Ａは、６穴タイプの四角形の蓋体付きマルチウエルプレートに対して使用されるものであるので、蓋体２２と嵌合する四角形の枠状の上枠１１と、培養容器本体２１と嵌合する四角形の枠状の下枠１２とを具備して構成されているが、その形状は、培養容器２０の形状などに応じて適宜決定できる。例えば、市販のマルチウエルプレートには、培養中の各ウエルの順序を取り違えないために、４つの角のうちの２つの角を丸めるなど、その形状の一部を変えたものなどもある。そのようなマルチウエルプレートに対応するように、スペーサの形状も適宜設計することができる。また、この例では、上枠１１は蓋体２２の内側に嵌められ、下枠１２は培養容器本体２１の外側に嵌められるようになっているが、反対に、上枠が蓋体の外側に嵌められ、下枠が培養容器本体の内側に嵌められる形態でもよい。
培養容器としても、例えば１２穴タイプ（３×４）、２４穴タイプ（４×６）などの他のウエル数のものを使用してもよいし、後述するように、マルチウエルではない一般の円形のシャーレなどを使用してもよい。
【００３１】
［第２実施形態例］
図８（ａ）は、第２実施形態例のスペーサ１０Ｂを示す斜視図であり、図８（ｂ）は、このスペーサ１０Ｂを市販の培養容器２０に装着した状態を示す断面図である。ここでは、市販の培養容器２０として、図４に示したものと同じく、６つのウエル（２×３）Ｗ１〜Ｗ６が形成されている６穴タイプの四角形のマルチウエルプレートからなる培養容器本体２１と、これに被せられる蓋体２２とを具備するものを例示している。
この例のスペーサ１０Ｂは、下枠１２の内周側に平板が掛け渡され固定された水平な中板部１７を有している点で、第１実施形態例のスペーサ１０Ｂとは相違している。この例の中板部１７には、培養容器本体２１に形成されている６つの各ウエルに対応するように、６つの孔１７ａ〜１７ｆが形成されており、図８（ｂ）のようにこの例のスペーサ１０Ｂを培養容器２０に装着した際には、各孔１７ａ〜１７ｆの周縁部と各ウエルＷ１〜Ｗ６上端の開口周縁部とがそれぞれ密着するようになっている。
【００３２】
このような第２実施形態例のスペーサ１０Ｂによれば、スペーサ１０Ｂを培養容器２０に図示のように装着することによって、各ウエル間に形成されている空隙部Ｐを中板部１７で上方から覆って塞ぐことができる。このように空隙部Ｐを塞ぐと、気体供給口１４から培養装置３０内に供給された気体により、培養装置３０内の空間（各ウエルＷ１〜Ｗ６内の空間やその上方の空間）を短時間で効率よく、十分に置換することができる。これは、このように空隙部Ｐを塞ぐと、空隙部Ｐを気体で置換する必要はなくなり、しかも、置換時の気流の乱れが軽減されるためである。
さらに、図示は略すが、このような中板部１７の孔１７ａ〜１７ｆのうちのいずれか１つ以上を透明フィルムまたはシートなどの透明板で塞ぐことによって、その孔に対応するウエル内への気体の供給を遮断してもよい。このように気体の供給が遮断されたウエルは、気体の影響を受けない対照実験用の対照ウエルとすることができる。また、このように遮断することは、培養装置３０内の余分な空間を減らすことにもなり、置換時の気流の乱れを防ぐことにもつながる。
【００３３】
［第３実施形態例］
図９（ａ）は、第３実施形態例のスペーサ１０Ｃを示す斜視図であり、図９（ｂ）は、このスペーサ１０Ｃを市販の培養容器２０に装着した状態を示す断面図である。ここでも、市販の培養容器２０として、図４に示したものと同じく、６つのウエル（２×３）Ｗ１〜Ｗ６が形成されている６穴タイプの四角形のマルチウエルプレートからなる培養容器本体２１と、これに被せられる蓋体２２とを具備するものを例示している。
この例のスペーサ１０Ｃは、第２実施形態例と同様の構成の中板部１７を備え、さらに、スペーサ１０Ｃを形成している一対の長辺間を掛け渡すように、中板部１７から鉛直方向に立設した２枚の仕切板１８ａ、１８ｂを備えている。各仕切板１８ａ、１８ｂは、その上端が蓋体２２に到達する高さに形成されており、スペーサ１０Ｃを装着することによって、培養装置３０内の空間を３つのゾーンに分割できるように構成されている。そして、分割された３つの各ゾーンには、それぞれ独立して気体を供給および排出できるように、一対の気体供給口１４および気体排出口１５が下枠１２に設けられている。
【００３４】
このように第３実施形態例のスペーサ１０Ｃは、孔１７ａ〜１７ｆが形成された中板部１７と、この中板部１７から鉛直方向に立設した２枚の仕切板１８ａ、１８ｂとからなる隔離手段を備えており、そのため、ウエル同士を隔て、培養装置３０内の空間を３つのゾーンに分割できるようになっている。
そのため、この例のスペーサ１０Ｃによれば、スペーサ１０Ｃを培養容器２０に図示のように装着することによって、仕切板１８ａ、１８ｂにより分割された各ゾーンごとに独立して異なる種類の気体を供給および排出でき、複数の気体による影響を同時に観察するなど、複数系統の実験をすることが可能となる。
また、この例においても、必要があれば、中板部１７の孔１７ａ〜１７ｆのうちのいずれか１つ以上を透明板で塞ぎ、その孔に対応するウエル内への気体の供給を遮断してもよい。
なお、この例では、６つのウエルＷ１〜Ｗ６を２つずつ３分割して３ゾーンを形成しているが、複数に分割するかぎり、分割の仕方や分割数には制限はない。
【００３５】
［第４実施形態例］
図１０（ａ）は、第４実施形態例のスペーサ１０Ｄを示す斜視図であり、図１０（ｂ）は、このスペーサ１０Ｄを市販の培養容器２０に装着した状態を示す断面図である。ここでも、市販の培養容器２０として、図４に示したものと同じく、６つのウエル（２×３）Ｗ１〜Ｗ６が形成されている６穴タイプの四角形のマルチウエルプレートからなる培養容器本体２１と、これに被せられる蓋体２２とを具備するものを例示している。
この例のスペーサ１０Ｄは、培養容器本体２１に形成されている６つの各ウエルに対応するように、鉛直方向に立設し、両端が開口した６つの筒体１９ａ〜１９ｆを具備しており、図１０（ｂ）のようにこの例のスペーサ１０Ｄを培養容器２０に装着した際には、各筒体１９ａ〜１９ｆの下端周縁部と各ウエル上端の開口周縁部とがそれぞれ密着し、各筒体１９ａ〜１９ｆの上端周縁部と蓋体２２とが密着するようになっている。また、この例のスペーサ１０Ｄは、図１１にも示すように、隣合う筒体１９ａ〜１９ｆ同士を連通する７つの筒体連通管４１ａ〜４１ｇと、各筒体１９ａ〜１９ｆとスペーサ１０Ｄの外部とを連通する１０の外部連通管４２ａ〜４２ｊとを備えている。この例では、各筒体連通管４１ａ〜４１ｇおよび各外部連通管４２ａ〜４２ｊは、各筒体１９ａ〜１９ｆをスペーサ１０Ｄの下枠１２に固定する固定手段としての役割も果たしている。さらに、各筒体連通管４１ａ〜４１ｇおよび各外部連通管４２ａ〜４２ｊは、いずれもゴムなどからなる栓体により容易に閉塞可能とされている。
【００３６】
このように第４実施形態例のスペーサ１０Ｄは、培養容器本体２１に形成されている６つの各ウエルに対応するように、鉛直方向に立設し、両端が開口した６つの筒体１９ａ〜１９ｆからなる隔離手段を備えており、ウエル同士を隔てることができるようになっている。そして、さらに７つの筒体連通管４１ａ〜４１ｇと、１０の外部連通管４２ａ〜４２ｊとを備えていて、これらは栓体により容易に閉塞できるようになっている。
そのため、この例のスペーサ１０Ｄによれば、スペーサ１０Ｄを培養容器２０に図示のように装着し、適宜、任意の筒体連通管４１ａ〜４１ｇおよび外部連通管４２ａ〜４２ｊを閉塞することによって、図１１（ｂ）および（ｃ）に示すように、培養装置３０内の空間を複数のゾーンに分割することができる。図１１（ｂ）および（ｃ）中、「ＣＬＯＳＥ」とされている部分は、栓体により閉塞されている部分である。
よって、分割された各ゾーンごとに独立して異なる種類の気体を供給および排出でき、複数の気体による影響を同時に観察するなど、複数系統の実験をすることが可能となる。
なお、図１１（ｂ）の例では、６つのウエルＷ１〜Ｗ６を３つずつ２分割して２ゾーンを形成し、図１１（ｃ）の例では、６つのウエルＷ１〜Ｗ６を２つずつ３分割して３ゾーンを形成しているが、複数に分割できるかぎり、分割の仕方や分割数には制限はない。
【００３７】
［第５実施形態例］
以上説明した第１〜４実施形態例では、市販の培養容器の培養容器本体として、複数のウエルが形成されているマルチウエルプレートを例示した。以下の本実施形態例では、市販の培養容器として、円形のシャーレ本体とこれを塞ぐ蓋体とからなる市販のシャーレを使用した場合について説明する。
円形のシャーレを使用する場合には、図１２に示すように、シャーレに対応する形状に形成された円形のスペーサ１０Ｅを採用し、そのスペーサ１０Ｅに気体供給口１４および気体排出口１５を一組設けたり（図１２（ａ））、二組設けたりできる（図１２（ｂ））。
【００３８】
さらに、図１３に示すように、円形のシャーレ本体６１とこれを塞ぐ蓋体６２とからなる市販の円形のシャーレ６０に使用されるスペーサ１０Ｅには、その内側に、カルチャーインサート３２を係止可能な係止孔２３ａが１つ形成された水平な係止板２３を設け、カルチャーインサート３２の底部がシャーレ本体６１の底部に接触しないように、カルチャーインサート３２を適切な高さに維持しながら、スペーサ１０Ｅに係止できる形態とすることも好適である。具体的には、カルチャーインサート３２の底部とシャーレ本体６１の底部との隙間が０．８〜１ｍｍ程度となるようにすることが好ましい。また、係止孔２３ａの周縁には、パッキン２４を全周にわたって形成して、カルチャーインサート３２と係止孔２３ａとが気密に接続されるようにする。
この場合、スペーサ１０Ｅにより形成されるスペースの高さｈ’としては、第１の実施形態において説明した高さが好適であり、そのような高さが確保されるように、スペーサ１０Ｅの高さも設計することが好ましい。また、上枠１１は蓋体６２と、下枠１２はシャーレ本体６１と嵌合できる高さとされ、上枠の高さは３〜２７ｍｍ、下枠の高さは３〜２５ｍｍ程度が好ましい。
【００３９】
このようにすると、生体試料３３の下側は培地３１と接し、上側は供給される気体と接する、いわゆる気液界面培養が可能となり、気相に存在する対象物質が生体試料３３に及ぼす影響について、シャーレ６０とこれに係止されたカルチャーインサート３２とを用いて観察、評価することができる。
なお、この例では、係止孔２３ａは１つとしたが、複数設けてもよい。そのようにすると、カルチャーインサート３２を複数係止することができ、マルチウエルタイプとして使用することも可能となる。
【００４０】
以上説明した各形態において、生体試料に対する影響が観察、評価される対象物質としては、各種の気体の他、気相に含まれる液体、固体、揮発性物質などであってもよい。例えば、自動車などから排出される粒子状物質、粉塵、花粉などの固体微粒子；トルエン、ベンゼン、フロン類、ジクロロメタン、アルコール類、アルデヒド類などの揮発性の有機物；などでもよく、空気などの気体に同伴させて、培養装置内に供給できるものであれば、制限はない。また、これら対象物質は、１種単独で供給しても、２種以上を供給してもよい。また、培養環境を維持するために適した気体（湿度１００％、３７℃、空気９５ｖｏｌ％、二酸化炭素５ｖｏｌ％）とともに、対象物質を供給してもよい。
【００４１】
生体試料としては、動物、植物由来の細胞、組織片、器官、微生物などが挙げられる。特に細胞としては、気相中に存在する物質の影響を受けやすい呼吸器系に存在する細胞（肺気道や肺胞由来の細胞、気管由来の細胞、鼻腔由来の細胞など。）、皮膚細胞、角膜を構成する細胞、毛髪の細胞、植物のカルス、線虫、菌糸などが挙げられる。
【００４２】
また、観察中において、培養装置３０内の各種条件を適切に維持するために、種々の手法を採用することができる。
例えば、湿度制御のために、生体試料３３が載置されていないウエルやウエル同士の間に、水を入れておくことができる。また、その際、蓋体２２の内側に親水性物質をコーティングするなどの処理により結露を防止し、外部からの観察がしやすくなるようにしてもよい。具体的には、例えばアラビアゴムなどの親水性高分子の溶液を少量塗布し乾燥する方法、界面活性剤水溶液（台所洗剤希釈液）を塗布し乾燥する方法、特開平５−１５３６２号公報に記載されているように、セルロース系樹脂をケン化して得られる防曇フィルムを貼る方法などが挙げられる。
【００４３】
温度制御のためには、上述した断熱シートを用いる方法の他、顕微鏡観察する場合において保温機能付きのステージを具備した顕微鏡や、保温加湿チャンバー付きの顕微鏡を使用する方法なども採用できる。さらに、蓋体やスペーサに発熱機能を持たせる方法も有効である。例えば蓋体やスペーサの少なくとも一部に、温度調節機能が接続された導電膜を設け、この導電膜に電流を流して発熱させるようにする方法などを例示できる。
【実施例】
【００４４】
以下、培養装置内で生体試料を培養しながら、培養装置内の気相に含まれる物質が生体試料に及ぼす影響を観察し、評価する方法について、具体的に説明する。
［評価例１］
ウサギ（日本ＳＣＣ（株）：ニュージーランドホワイト種、１６週齢（オス））由来気管を滅菌生理食塩水でタテ半分に切断し、気管内腔面の粘膜層を外側の軟骨などを含む組織から剥離した。粘膜層をメスで細片化し、粘膜片を得た。
一方、図５に示すように、培養装置３０を構成した。すなわち、まず、培養容器２０として、２×３の６穴タイプの蓋体付きのマルチウエルプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ ＭＳ−８００６０、ポリスチレン製、外寸１２７．６ｍｍ（Ｌ）×８５．８ｍｍ（Ｗ）、本体の高さ２０．２ｍｍ、ウエルの深さ１７．０ｍｍ、ウエルの直径３５．６ｍｍ、培養面積９．２ｃｍ２／ウエル、ウエル容量１６ｍＬ）を用意し、ウエルＷ５に培地３１を入れた後、このウエルＷ５内に、底部がメンブレンからなるセル状のカルチャーインサート３２を配置した。そして、メンブレンを介して培地３１と接触するように、先に細片化した粘膜片を生体試料３３として載置し、培養した。培地３１には、ペニシリン−ストレプトマイシン添加、ダルベッコＭＥＭ、１０％牛胎児血清を０．５ｍＬ用いた。また、培地３１よりも上方におけるカルチャーインサート３２の外周とウエルＷ５の内周との間には、ゴム製のパッキン３４を挿入配置した。そして、マルチウエルプレートと蓋体２２との間に図１および図２に示したスペーサ１０Ａを装着した。これにより形成されるスペースＳの高さｈを１７ｍｍとした。ついで、図５では図示略のセンサ差込口にセンサ類（温度センサ、湿度センサを差し込んで、これらの条件をモニタリングできるようにした。その後、培養装置３０ごと、図示略の保温ステージ付倒立微分干渉顕微鏡（オリンパスＩＸ７０、対物レンズ２０倍）の保温ステージに載置した。
ついで、二酸化硫黄ガス（対象物質として二酸化硫黄を濃度１００ｐｐｍで含む空気）が入った注射筒３６を用意し、この注射筒３６をチューブ３７を介してスペーサ１０の気体供給口１４に接続し、注射筒３６のピストンを押し込んで、この気体を培養装置３０内に供給した。一方、スペーサ１０の気体排出口１５には気体回収手段として袋３５をあらかじめ装着しておき、気体が供給されたことにより過剰となった気体を回収し、培養装置３０内の圧力を一定に保てるようにした。
そして、顕微鏡に接続した図示略のデジタルカメラ（アクアコスモス：浜松ホトニクス製）を用いて、サブアレイ６４×６４ピクセル、バースト取り込みにより、連続的に約７０回／秒の頻度で、粘膜表面の繊毛部分の画像を１０２４枚取り込んで観察し、繊毛部分の各２５箇所のエリアそれぞれについて、輝度の経時変化をフーリエ変換し、繊毛運動周波数（ＣＢＦ）を算出し、二酸化硫黄ガスが粘膜片に与える影響について評価した。
結果を図１４に示す。
グラフ中、横軸は曝露時間（ｍｉｎ）、縦軸はＣＢＦ（Ｈｚ）であり、暴露時間０ｍｉｎとは、注射筒３６から二酸化硫黄ガスを供給開始した時点である。
図１４に示すように、二酸化硫黄ガスの供給を開始した直後に、ＣＢＦが低下し、すなわち、繊毛運動が低下することが明らかとなり、リアルタイムでの観察、評価を行うことができた。
【００４５】
［評価例２］
評価例１で使用したものと同じ粘膜片を用意した。
一方、図１５に示す培養装置３０を構成した。すなわち、培養容器２０として、評価例１で使用したものと同じ蓋体付きのマルチウエルプレートを用意し、ウエルＷ５に評価例１と同様に培地３１を入れ、カルチャーインサート３２を配置し、生体試料３３として粘膜片を載置し、培養した。また、カルチャーインサート３２の外周とウエルＷ５の内周との間に、評価例１と同様にして、ゴム製のパッキン３４を挿入配置した。そして、マルチウエルプレートと蓋体２２との間に、評価例１で使用したものと同じスペーサ１０を装着し、同様の高さｈのスペースＳを形成した。ただし、スペーサ１０の気体供給口１５には、１ｍの長さのチューブ３７を介して三方コック３８を接続した。三方コック３８の残りの二方のうちの一方には、温度３７℃、湿度１００％の空気が供給されるように調整された空気ボックス３９と接続し、他方は温度２５℃、湿度４０％の室内に開放し、空気ボックス３９中の空気か、室内の空気のいずれかを選択して、培養装置３０に供給できるようにした。一方、スペーサ１０の気体排出口１５には、脈動を防ぐためのトラップ４０を介して、吸引ポンプ４１を接続し作動させ、空気ボックス３９中の空気を培養装置３０内に連続的に取り込んだ。そして、図示略のセンサ差込口に評価例１と同様のセンサ類を差し込んで、培養装置３０ごと、評価例１で使用したものと同じ図示略の保温ステージ付倒立微分干渉顕微鏡の保温ステージに載置した。
そして、顕微鏡に接続したデジタルカメラ（アクアコスモス：浜松ホトニクス製）により、評価例１と同様にして連続的に粘膜表面の繊毛部分の画像を取り込んで観察し、同様の手法で繊毛運動周波数（ＣＢＦ）を算出し、湿度（水分）が粘膜片に与える影響について評価した。
結果を図１６に示す。
グラフ中、横軸は曝露時間（ｍｉｎ）、縦軸はＣＢＦ（Ｈｚ）であり、暴露時間０ｍｉｎとは、空気を供給開始した時点である。
図１６に示すように、温度３７℃、湿度１００％の空気を供給した場合には、供給の前後でＣＢＦは変化しなかったが、温度２５℃、湿度４０％の空気を供給した場合には、供給開始の直後からＣＢＦが徐々に低下し、空気の乾燥により、繊毛運動が低下することが明らかとなった。このように本例によれば、リアルタイムでの観察、評価を行うことができた
【符号の説明】
【００４６】
１０Ａ〜１０Ｅ スペーサ
２０、６０ 培養容器
２１、６１ 培養容器本体
２２、６２ 蓋体
３０ 培養装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の培養容器に装着される培養容器用スペーサ、該スペーサを備えた培養装置、該培養装置を用いた観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、気化した有機溶媒、窒素酸化物、浮遊微粒子など、大気に含まれる物質が動物の呼吸器系などに影響を与え、病気を引き起こす可能性があることが指摘されている。一方、アロマテラピーや森林浴のように、精油などの揮発性物質や樹木が発散する物質を積極的に利用することにより、健康を増進しようとすることも広く行なわれている。
このように気相に含まれる物質は、生物に対して大きな影響を与える。そのため、このような物質（以下、対象物質という場合もある。）による影響をインビトロで観察し、評価する方法について検討されている。
【０００３】
例えば、細胞を培養皿で培養する際に、対象物質を溶解させた培養液を添加することにより、通常のインビトロ法と同様に、対象物質の影響を観察したり、評価したりする方法がある。しかしながら、このような方法では、対象物質は液相に含まれた状態で添加され、気相に含まれた状態で添加されるものではないため、その対象物質が気相に含まれる場合の影響については、正確には評価できない。さらに、気相に存在する複数の対象物質を気相中と同じ濃度で培養液に溶解させ得るとは限らないため、この点でも、これらの対象物質が気相に含まれる場合の影響について、正確に観察して評価することは困難であった。
【０００４】
そこで、対象物質が含まれる気相を実際に細胞に接触させることにより、対象物質が気相に含まれる場合の影響について、正確に観察し評価しようとすることも検討されている。
例えば、培養液を入れた培養皿を気相中で上下左右に動かすことで培養液から細胞を露出させ、それにより細胞と気相とを接触させ、その際の細胞の様子を観察して評価する方法が検討されている。ところが、液体は表面張力を有しているために、細胞を露出させた場合でも液が細胞上に残存しており、やはり正確な評価は困難であった。
また、培養液を取り除いた培養細胞を対象物質が含まれる気相中に置き、観察、評価する方法も検討されている。ところが、この方法では、培養液が除去された後、細胞の活性が持続する時間は限られるため、正確な評価は難しいという問題があった。
さらに、気体は透過し、液体は透過しない膜の上で細胞を培養することで、気相に含まれる対象物質の影響を観察、評価しようとする方法も検討されているが、このような特殊な膜の上では、培養自体が難しかった。
【０００５】
そこで、細胞を培養しながら、対象物質が含まれる気相をその細胞に接触させることにより、気相に含まれる物質が細胞に与える影響をリアルタイムに観察して評価する方法が検討され、例えば特許文献１には特別な装置を用いる方法が開示されている。
また、細胞を培養しながら、対象物質が含まれる気相をその細胞に接触させることのできる装置も市販されている（例えば、柴田科学株式会社、細胞ばく露実験装置「ＳＩＳ−ＣＵＬ」）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１０１８９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載された方法では、細胞を支持する支持体、細胞に培養液を供給するための培養液収容槽、対象物質を含む気体収容部、水貯留部などを具備した特別な装置を使用する必要があり、簡便に観察や評価を行えるものではなかった。
また、先に例示した市販の細胞ばく露実験装置は、上部には不透明な蓋体が被せられた構成であり、さらには、下部にウォーターバスが設けられ、顕微鏡のレンズから細胞までの距離がレンズのワーキングディスタンスと比較してはるかに長いことから、リアルタイムでの顕微鏡観察は困難であった。
【０００８】
また、例えば図１７に示すような蓋体５１付きのマルチウエルプレート５０を応用する方法も考えられる。このマルチウエルプレート５０は、６つのウエル（２×３）が形成されている６穴タイプの市販のものであって、透明プラスチック製である。
具体的には、生体試料６０をウエルＷ内の培地６１上に配置した後、マルチウエルプレート５０に蓋体５１を被せる。ここで蓋体５１には、気体を供給するための気体供給口５２と気体を排出するための気体排出口５３とをあらかじめ形成しておく。そして、この蓋体５１をマルチウエルプレート５０に被せた後、対象物質を含む気体を気体供給口５２からマルチウエルプレート５０内に供給し、気体排出口５３から排出する。そして、その際の生体試料６０の様子について、顕微鏡などで観察し評価する。
このような方法によれば、供給された気体によりマルチウエルプレート５０内の空間が置換され、生体試料６０と気体とが接触し、気体に含まれる対象物質が生体試料６０に与える影響をインビトロでリアルタイムに観察し、評価できるものと期待される。
【０００９】
ところが、このような一般の蓋体５１付きのマルチウエルプレート５０では、蓋体５１を被せた場合には、図１７（ｂ）に示すように、マルチウエルプレート５０と蓋体５１との間には、ほとんど隙間は形成されない。
よって、マルチウエルプレート５０内に気体供給口５２から気体を供給したとしても、ウエルＷ間の気体の移動が困難なため、供給された気体は各ウエルＷ内の空間を十分には置換することなく、主にマルチウエルプレート５０の周囲における、マルチウエルプレート５０と蓋体５１との間のわずかな隙間から漏出してしまう。また、このような隙間からの気体の漏出を防ぐために、マルチウエルプレート５０と蓋体５１との間をパッキンなどで密封したとしても、マルチウエルプレート５０と蓋体５１との間に隙間が無い状態には変わりがないため、ウエルＷ間の気体の移動はやはり困難であった。そのため、気体の供給速度を上げると容器内圧が上昇し、容器内の温度、湿度が変化してしまうという問題や、このような気圧変化が生体試料６０に影響してしまうという問題があった。また、気体供給口５２に減圧手段を接続して、吸引法によりマルチウエルプレート５０内の空気を置換する方法でも、気体の吸引速度を上げると容器内圧が低下し、やはり同様の問題が生じた。
【００１０】
すなわち、このような市販の蓋体５１付きのマルチウエルプレート５０を単に応用した方法では、マルチウエルプレート５０内に気体を短時間で効率よく拡散させ、置換することはできない。そのため、各ウエルＷ内の空間を十分に置換し、ウエルＷに配置された生体試料６０に気体を接触させるまでには、気体の供給を開始した時点から長時間を要し、気体に含まれる対象物質の影響をリアルタイムで観察することは難しい。また、ウエルＷ内の空間が十分に置換されるのに要する時間は、各ウエルＷごとに異なってくるため、たとえ評価を行ったとしても、ウエルＷ間で得られるデータのばらつきは大きく、信頼性の高い評価はできない。
また、市販の蓋体５１付きのマルチウエルプレート５０では、上述したように、供給された気体は蓋体５１とマルチウエルプレート５０との隙間から大気中に漏洩してしまう。したがって、供給可能な気体の種類は限定され、例えば毒性のある物質を含む気体などを供給することは困難である。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、特別な装置を使用することなく、一般の蓋体付きのマルチウエルプレートのような培養容器に適用するだけで、気相に含まれる対象物質が生体試料に与える影響をリアルタイムで観察して、信頼性よく評価でき、しかも対象物質の種類が限定されることのない培養容器用スペーサと、該スペーサを備えた培養装置、該培養装置を用いた観察方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の培養容器用スペーサは、培養装置の培養容器本体と、該培養容器本体に被せられる蓋体との間に装着され、前記培養容器本体と前記蓋体とを離間させるとともに、気密に接続することを特徴とする。
培養装置の内側と外側とを連通する開口部が少なくとも１つ形成されていることが好ましい。
本発明の培養容器用スペーサとしては、複数のウエルが形成された培養容器本体に対して装着される形態が挙げられる。
その場合、前記培養容器用スペーサは、各ウエルに対応する複数の孔が形成された中板部を備え、前記装着の際には、各孔の周縁部と各ウエルの開口周縁部とが密着するものである形態が好ましい。
また、ウエル同士を隔てる隔離手段を備えたものである形態も好ましい。
本発明の培養装置は、前記培養容器本体と、前記蓋体と、前記培養容器本体と前記蓋体との間に装着された前記培養容器用スペーサとを備えたことを特徴とする。
本発明の生体試料の観察方法は、前記培養装置で生体試料を培養しながら、前記培養装置内の気相に含まれる物質が前記生体試料に及ぼす影響を観察することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、特別な装置を使用することなく、一般の蓋体付きのマルチウエルプレートのような培養容器に適用するだけで、気相に含まれる対象物質が生体試料に与える影響をリアルタイムで観察して、信頼性よく評価でき、しかも対象物質の種類が限定されることのない培養容器用スペーサと、該スペーサを備えた培養装置、該培養装置を用いた観察方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】第１実施形態例の培養容器用スペーサを示す部分破断斜視図である。
【図２】図１の培養容器用スペーサのＩ−Ｉ’線に沿う断面図である。
【図３】図１の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図４】図１の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す分解斜視図である。
【図５】図１の培養容器用スペーサを備えた培養装置を示す概略構成図である。
【図６】培養容器用スペーサに形成される気体供給口および気体排出口の配置例を示す概略平面図であって、（ａ）気体供給口および気体排出口を三組形成した例と、（ｂ）気体供給口および気体排出口を四組形成した例である。
【図７】培養容器用スペーサに形成される気体供給口および気体排出口の配置例を示す（ａ）概略平面図と、（ｂ）側面図と、（ｃ）気体供給口側から見た正面図である。
【図８】第２実施形態例の培養容器用スペーサを示す（ａ）斜視図と、（ｂ）（ａ）の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図９】第３実施形態例の培養容器用スペーサを示す（ａ）斜視図と、（ｂ）（ａ）の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図１０】第４実施形態例の培養容器用スペーサを示す（ａ）斜視図と、（ｂ）（ａ）の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図１１】図１０の培養容器用スペーサを用いて、培養装置内の空間の分割例を示す概略図であって、（ａ）分割なしの例と、（ｂ）２分割の例と、（ｃ）３分割の例である。
【図１２】第５実施形態例の円形の培養容器用スペーサに形成される気体供給口および気体排出口の配置例を示す概略平面図であって、（ａ）気体供給口および気体排出口を一組形成した例と、（ｂ）気体供給口および気体排出口を二組形成した例である。
【図１３】第５実施形態例の培養容器用スペーサを培養容器に装着した様子を示す断面図である。
【図１４】試験例１において、曝露時間と繊毛運動周波数（ＣＢＦ）との関係を示すグラフである。
【図１５】試験例２で使用した培養装置の構成を示す概略構成図である。
【図１６】試験例２において、曝露時間と繊毛運動周波数（ＣＢＦ）との関係を示すグラフである。
【図１７】市販の蓋体付きマルチウエルプレートにおいて、生体試料を培養しながら気相に含まれる物質が生体試料に及ぼす影響を観察する方法を概略的に示す（ａ）分解斜視図と、（ｂ）側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
［第１実施形態例］
図１および図２は、第１実施形態例の培養容器用スペーサ１０Ａを示す部分破断斜視図および断面図である。図３および図４は、培養装置３０を示す断面図および分解斜視図であって、この培養装置３０は、細胞などの生体試料を培養する培養容器２０と、この培養装置２０に装着された図１および図２の培養容器用スペーサ１０Ａとを具備して構成されている。
【００１６】
この例の培養容器用スペーサ（以下、単にスペーサという。）１０Ａは、図示のように市販の培養容器２０に装着されるものであって、図中上下が開口した四角形の枠状のものでる。ここでは、市販の培養容器２０として、６つのウエル（２×３）Ｗ１〜Ｗ６が形成されている６穴タイプの四角形のマルチウエルプレートからなる培養容器本体２１と、これに被せられる蓋体２２とを具備するものを例示している。この例のマルチウエルプレートと蓋体２２は、いずれも透明プラスチック製であり、顕微鏡観察や滅菌が可能なものである。
【００１７】
スペーサ１０Ａは、図示のように、培養容器本体２１と蓋体２２との間に装着されることによって、培養容器本体２１と蓋体２２とを離間して、これらの間に、培養容器本体２１の上端から蓋体２２に到る高さｈのスペースＳを形成するとともに、培養容器本体２１と蓋体２２とを気密に接続するものである。
この例のスペーサ１０Ａは、蓋体２２と嵌合する四角形の枠状の上枠１１と、培養容器本体２１と嵌合する四角形の枠状の下枠１２とを具備して構成され、上枠１１は蓋体２２の内側に嵌められ、下枠１２は培養容器本体１２の外側に嵌められるようになっている。そのため、上枠１１は下枠１２よりも小さく形成されているとともに、上枠１１では外周側に、下枠１２では内周側に、それぞれ全周にわたって天然ゴム、シリコーンゴムなどからなるゴム製のパッキン１３が設けられ、スペーサ１０Ａを培養容器２０に装着した際には、上枠１１は蓋体２２と気密に接続し、下枠１２は培養容器本体２１と気密に接続するようになっている。
【００１８】
また、この例では、スペーサ１０Ａの下枠１２を形成している一対の短辺のほぼ中央に、このスペーサ１０Ａを備えた培養装置３０の内側と外側とを連通する開口部がそれぞれ１つずつ形成されている。このうちの一方の開口部は、培養装置３０内に気体を供給する図示略の気体供給手段が接続される気体供給口１４である。他方の開口部は、培養装置３０内から気体が排出される気体排出口１５であって、必要に応じて、排出された気体が大気中に漏洩しないように回収する袋、容器などの気体回収手段が接続される。気体供給口１４と気体供給手段との間や、気体排出口１５と気体回収手段との間には、気体の逆流を防止するための逆流防止弁を設けてもよい。また、気体回収手段には吸引ポンプなどの減圧手段を接続して、気体を吸引できるようにしてもよい。
【００１９】
また、この例では、下枠１２の気体供給口１４が形成されている側の短辺に、開口部としてセンサ差込口１６が形成され、培養装置３０内の温度、湿度、ガス組成などを測定するための図示略のセンサ類を外側から内側に差し込めるようになっている。
【００２０】
ここでスペーサ１０Ａの高さＨは、気体供給口１４から培養装置３０内に供給された気体が、短時間で効率よく培養装置３０内に均一に拡散し、かつ、培養装置３０ごと顕微鏡観察に供した場合に、培養装置３０と顕微鏡のコンデンサとが干渉しないような範囲に決定される。また、図示例のようにスペーサ１０Ａに気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６が形成される場合には、これらが適切な位置に形成されるように、その点も勘案して、高さＨが決定される。
【００２１】
具体的には、培養容器３０に形成されているウエルＷ１〜Ｗ６の数や大きさ（容積）や、培養容器２０の高さなどによるが、一般的な蓋体付きマルチウエルプレートを培養容器２０として使用し、スペーサに気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６が形成されない場合には、スペースＳの高さｈが３〜３０ｍｍとなる範囲に決定されることが好ましい。より好ましくはスペースＳの高さｈが５〜２０ｍｍとなる範囲である。この範囲内であると、培養装置３０内に気体を短時間で効率よく均一に拡散させることができる。また、培養装置３０全体としての高さが大きくなりすぎて、培養装置３０ごとの顕微鏡観察に支障をきたしたり、培養装置３０内の容積が大きくなりすぎて気体の置換効率が低下したり、気体を無駄に消費したりすることもない。
図示例のようにスペーサ１０Ａに気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６が形成される場合には、スペースＳの高さｈは１０〜３０ｍｍとなる範囲に決定されることが好ましく、より好ましくは１５〜２０ｍｍとなる範囲に決定される。
【００２２】
スペーサ１０Ａの材質は、供給される気体により腐食するなどの不都合を生じず、生体試料に対して毒性が低く、また、滅菌処理可能なものであればよく、気体の種類に応じて、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック、ステンレスなどの金属などを使用でき、公知の成形方法により製造できる。
滅菌処理としては、ガンマ線照射法、乾熱滅菌法、オートクレーブを用いた方法、７０％エタノール噴霧などが挙げられる。
【００２３】
このような培養装置３０内に生体試料を配置して培養しながら、培養装置３０内の気相に対象物質を存在させて、対象物質が生体試料に及ぼす影響を観察し、評価する具体的な方法について、一例を挙げて以下に説明する。
図５に示すように、まず、培養容器本体２１であるマルチウエルプレートのウエルＷ５に培地３１を設けた後、このウエルＷ５内に、底部がメンブレンからなるセル状のカルチャーインサート３２を配置する。そして、メンブレンを介して培地３１と接触するように生体試料３３を載置し、培養する。このようにすれば、生体試料３３の下側は培地３１と接し、上側は後に供給される気体と接する、いわゆる気液界面培養が可能となる。また、この際、培地３１よりも上方におけるカルチャーインサート３２の外周とウエルＷ５の内周との間に、天然ゴム、シリコーンゴムなどからなるゴム製のパッキン３４を図示のように挿入配置して、後に気体供給口１４から培養装置３０内に供給される気体が培地３１に接触し、培地３１が悪影響を受けるのを防ぐようにすることが好ましい。
なお、図５では、６穴タイプのマルチウエルプレートを培養容器本体２１として使用しているが、ウエルＷ５以外のウエル内の詳細については図示は略している。
【００２４】
ついで、スペーサ１０Ａの下枠１２をマルチウエルプレートに嵌合し、上枠１１を蓋体２２に嵌合して、スペーサ１０Ａを培養容器本体２１と蓋体２２との間に装着する。
このように装着することによって、マルチウエルプレートと蓋体２２とを離間させ、これらの間にスペースＳを形成するとともに、スペーサ１０Ａのパッキン１３の作用によりマルチウエルプレートと蓋体２２とを気密に接続する。
ついで、培養装置３０の気体排出口１５に、排出された気体を集めるための袋（気体回収手段）３５を接続し、図５では図示略のセンサ差込口に必要なセンサ類を差し込む。そして、培養装置３０ごと、図示略の顕微鏡のステージに載置する。なお、この際必要に応じて、顕微鏡での観察の妨げにならない範囲で、培養装置３０を断熱シートで覆ってもよい。図中符号Ｍは、顕微鏡のコンデンサである。
【００２５】
ついで、対象物質を含む気体が入った注射筒（気体供給手段）３６を用意し、この注射筒３６をチューブ３７を介して気体供給口１４に接続する。そして、注射筒３６のピストンを押し込んで、気体を培養装置３０内に供給するとともに、顕微鏡に接続された図示略のデジタルカメラにより生体試料３３を連続的に撮影するなどして観察する。
そして、このような観察で得られたデータを解析するなどして、気体に含まれる対象物質が生体試料３３に及ぼす影響について評価する。
使用したスペーサ１０Ａは、適宜洗浄、滅菌して、繰り返し使用できる。また、パッキン１３をスペーサ１０Ａから着脱自在に設けておき、パッキン１３のみを取り外して洗浄、滅菌して繰り返し使用してもよいし、パッキン１３のみをその都度交換してもよい。
【００２６】
このような培養装置３０を用いた場合には、培養容器本体２１であるマルチウエルプレートと蓋体２２との間に、これらを離間させるスペーサ１０Ａが配置され、スペースＳが形成されているため、気体供給口１４から培養装置３０内に供給された気体は、マルチウエルプレート内に短時間で効率よく均一に拡散し、各ウエルＷ１〜Ｗ６内の空間も十分に置換され、その中に配置された生体試料３３に気体を接触させるまでに長時間を要しない。よって、気体に含まれる対象物質の影響をリアルタイムで観察し、評価することができる。また、ウエルＷ１〜Ｗ６内の空間が十分に置換されるのに要する時間がウエルごとに異なってくることもないため、ウエル間でデータがばらつくこともなく、信頼性の高い評価を行うことができる。
また、このスペーサ１０Ａは、蓋体２２とマルチウエルプレートとを気密に接続するものであるため、供給された気体は蓋体２２とマルチウエルプレートとの間から漏洩することがない。よって、供給可能な気体の種類は限定されず、例えば毒性のある物質を含む気体なども供給可能である。
【００２７】
なお、この例のスペーサ１０Ａには、スペーサ１０Ａの内側と外側を連通する開口部として、気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６が下枠１２に形成されているが、これらが形成される数や位置には特に制限はなく、上枠１１に形成されてもよい。また、例えば、図６および７に１２穴タイプのマルチウエルプレートを例示するように、マルチウエルプレートの各ウエルＷ１〜Ｗ１２に対してばらつきなく気体を供給できるように、ウエルの数、配置などに応じて、気体供給口１４や気体排出口１５などをスペーサの適当な位置に各々複数形成できる。
【００２８】
また、気体供給口１４、気体排出口１５、センサ差込口１６は、必ずしも形成されていなくてもよい。例えば、揮発性物質を対象物質とし、その影響を観察、評価する場合には、生体試料が載置されたウエルとは異なるウエルに揮発性物質を入れた後、直ちにマルチウエルプレートに蓋体とスペーサとを装着する方法でも、揮発性物質を気相中に供給することができる。
また、気体供給口や気体排出口が形成された蓋体を用いて、ここから気体の供給と排出を行うようにすれば、スペーサには気体供給口や気体排出口が形成されていなくてもよい。
【００２９】
なお、液体状の揮発性物質を対象物質とする場合であっても、気体供給口１４が形成されているスペーサ１０Ａを用いて、揮発性物質を気体供給口１４から供給することもできる。その場合には、揮発性物質が入れられた注射筒を気体供給口１４から挿入し、生体試料が載置されたウエルとは異なるウエルに、揮発性物質を滴下する方法が好適である。
また、気体供給口１４、気体排出口１５に接続される気体供給手段、気体回収手段の種類にも特に制限はない。
【００３０】
また、この例のスペーサ１０Ａは、６穴タイプの四角形の蓋体付きマルチウエルプレートに対して使用されるものであるので、蓋体２２と嵌合する四角形の枠状の上枠１１と、培養容器本体２１と嵌合する四角形の枠状の下枠１２とを具備して構成されているが、その形状は、培養容器２０の形状などに応じて適宜決定できる。例えば、市販のマルチウエルプレートには、培養中の各ウエルの順序を取り違えないために、４つの角のうちの２つの角を丸めるなど、その形状の一部を変えたものなどもある。そのようなマルチウエルプレートに対応するように、スペーサの形状も適宜設計することができる。また、この例では、上枠１１は蓋体２２の内側に嵌められ、下枠１２は培養容器本体２１の外側に嵌められるようになっているが、反対に、上枠が蓋体の外側に嵌められ、下枠が培養容器本体の内側に嵌められる形態でもよい。
培養容器としても、例えば１２穴タイプ（３×４）、２４穴タイプ（４×６）などの他のウエル数のものを使用してもよいし、後述するように、マルチウエルではない一般の円形のシャーレなどを使用してもよい。
【００３１】
［第２実施形態例］
図８（ａ）は、第２実施形態例のスペーサ１０Ｂを示す斜視図であり、図８（ｂ）は、このスペーサ１０Ｂを市販の培養容器２０に装着した状態を示す断面図である。ここでは、市販の培養容器２０として、図４に示したものと同じく、６つのウエル（２×３）Ｗ１〜Ｗ６が形成されている６穴タイプの四角形のマルチウエルプレートからなる培養容器本体２１と、これに被せられる蓋体２２とを具備するものを例示している。
この例のスペーサ１０Ｂは、下枠１２の内周側に平板が掛け渡され固定された水平な中板部１７を有している点で、第１実施形態例のスペーサ１０Ｂとは相違している。この例の中板部１７には、培養容器本体２１に形成されている６つの各ウエルに対応するように、６つの孔１７ａ〜１７ｆが形成されており、図８（ｂ）のようにこの例のスペーサ１０Ｂを培養容器２０に装着した際には、各孔１７ａ〜１７ｆの周縁部と各ウエルＷ１〜Ｗ６上端の開口周縁部とがそれぞれ密着するようになっている。
【００３２】
このような第２実施形態例のスペーサ１０Ｂによれば、スペーサ１０Ｂを培養容器２０に図示のように装着することによって、各ウエル間に形成されている空隙部Ｐを中板部１７で上方から覆って塞ぐことができる。このように空隙部Ｐを塞ぐと、気体供給口１４から培養装置３０内に供給された気体により、培養装置３０内の空間（各ウエルＷ１〜Ｗ６内の空間やその上方の空間）を短時間で効率よく、十分に置換することができる。これは、このように空隙部Ｐを塞ぐと、空隙部Ｐを気体で置換する必要はなくなり、しかも、置換時の気流の乱れが軽減されるためである。
さらに、図示は略すが、このような中板部１７の孔１７ａ〜１７ｆのうちのいずれか１つ以上を透明フィルムまたはシートなどの透明板で塞ぐことによって、その孔に対応するウエル内への気体の供給を遮断してもよい。このように気体の供給が遮断されたウエルは、気体の影響を受けない対照実験用の対照ウエルとすることができる。また、このように遮断することは、培養装置３０内の余分な空間を減らすことにもなり、置換時の気流の乱れを防ぐことにもつながる。
【００３３】
［第３実施形態例］
図９（ａ）は、第３実施形態例のスペーサ１０Ｃを示す斜視図であり、図９（ｂ）は、このスペーサ１０Ｃを市販の培養容器２０に装着した状態を示す断面図である。ここでも、市販の培養容器２０として、図４に示したものと同じく、６つのウエル（２×３）Ｗ１〜Ｗ６が形成されている６穴タイプの四角形のマルチウエルプレートからなる培養容器本体２１と、これに被せられる蓋体２２とを具備するものを例示している。
この例のスペーサ１０Ｃは、第２実施形態例と同様の構成の中板部１７を備え、さらに、スペーサ１０Ｃを形成している一対の長辺間を掛け渡すように、中板部１７から鉛直方向に立設した２枚の仕切板１８ａ、１８ｂを備えている。各仕切板１８ａ、１８ｂは、その上端が蓋体２２に到達する高さに形成されており、スペーサ１０Ｃを装着することによって、培養装置３０内の空間を３つのゾーンに分割できるように構成されている。そして、分割された３つの各ゾーンには、それぞれ独立して気体を供給および排出できるように、一対の気体供給口１４および気体排出口１５が下枠１２に設けられている。
【００３４】
このように第３実施形態例のスペーサ１０Ｃは、孔１７ａ〜１７ｆが形成された中板部１７と、この中板部１７から鉛直方向に立設した２枚の仕切板１８ａ、１８ｂとからなる隔離手段を備えており、そのため、ウエル同士を隔て、培養装置３０内の空間を３つのゾーンに分割できるようになっている。
そのため、この例のスペーサ１０Ｃによれば、スペーサ１０Ｃを培養容器２０に図示のように装着することによって、仕切板１８ａ、１８ｂにより分割された各ゾーンごとに独立して異なる種類の気体を供給および排出でき、複数の気体による影響を同時に観察するなど、複数系統の実験をすることが可能となる。
また、この例においても、必要があれば、中板部１７の孔１７ａ〜１７ｆのうちのいずれか１つ以上を透明板で塞ぎ、その孔に対応するウエル内への気体の供給を遮断してもよい。
なお、この例では、６つのウエルＷ１〜Ｗ６を２つずつ３分割して３ゾーンを形成しているが、複数に分割するかぎり、分割の仕方や分割数には制限はない。
【００３５】
［第４実施形態例］
図１０（ａ）は、第４実施形態例のスペーサ１０Ｄを示す斜視図であり、図１０（ｂ）は、このスペーサ１０Ｄを市販の培養容器２０に装着した状態を示す断面図である。ここでも、市販の培養容器２０として、図４に示したものと同じく、６つのウエル（２×３）Ｗ１〜Ｗ６が形成されている６穴タイプの四角形のマルチウエルプレートからなる培養容器本体２１と、これに被せられる蓋体２２とを具備するものを例示している。
この例のスペーサ１０Ｄは、培養容器本体２１に形成されている６つの各ウエルに対応するように、鉛直方向に立設し、両端が開口した６つの筒体１９ａ〜１９ｆを具備しており、図１０（ｂ）のようにこの例のスペーサ１０Ｄを培養容器２０に装着した際には、各筒体１９ａ〜１９ｆの下端周縁部と各ウエル上端の開口周縁部とがそれぞれ密着し、各筒体１９ａ〜１９ｆの上端周縁部と蓋体２２とが密着するようになっている。また、この例のスペーサ１０Ｄは、図１１にも示すように、隣合う筒体１９ａ〜１９ｆ同士を連通する７つの筒体連通管４１ａ〜４１ｇと、各筒体１９ａ〜１９ｆとスペーサ１０Ｄの外部とを連通する１０の外部連通管４２ａ〜４２ｊとを備えている。この例では、各筒体連通管４１ａ〜４１ｇおよび各外部連通管４２ａ〜４２ｊは、各筒体１９ａ〜１９ｆをスペーサ１０Ｄの下枠１２に固定する固定手段としての役割も果たしている。さらに、各筒体連通管４１ａ〜４１ｇおよび各外部連通管４２ａ〜４２ｊは、いずれもゴムなどからなる栓体により容易に閉塞可能とされている。
【００３６】
このように第４実施形態例のスペーサ１０Ｄは、培養容器本体２１に形成されている６つの各ウエルに対応するように、鉛直方向に立設し、両端が開口した６つの筒体１９ａ〜１９ｆからなる隔離手段を備えており、ウエル同士を隔てることができるようになっている。そして、さらに７つの筒体連通管４１ａ〜４１ｇと、１０の外部連通管４２ａ〜４２ｊとを備えていて、これらは栓体により容易に閉塞できるようになっている。
そのため、この例のスペーサ１０Ｄによれば、スペーサ１０Ｄを培養容器２０に図示のように装着し、適宜、任意の筒体連通管４１ａ〜４１ｇおよび外部連通管４２ａ〜４２ｊを閉塞することによって、図１１（ｂ）および（ｃ）に示すように、培養装置３０内の空間を複数のゾーンに分割することができる。図１１（ｂ）および（ｃ）中、「ＣＬＯＳＥ」とされている部分は、栓体により閉塞されている部分である。
よって、分割された各ゾーンごとに独立して異なる種類の気体を供給および排出でき、複数の気体による影響を同時に観察するなど、複数系統の実験をすることが可能となる。
なお、図１１（ｂ）の例では、６つのウエルＷ１〜Ｗ６を３つずつ２分割して２ゾーンを形成し、図１１（ｃ）の例では、６つのウエルＷ１〜Ｗ６を２つずつ３分割して３ゾーンを形成しているが、複数に分割できるかぎり、分割の仕方や分割数には制限はない。
【００３７】
［第５実施形態例］
以上説明した第１〜４実施形態例では、市販の培養容器の培養容器本体として、複数のウエルが形成されているマルチウエルプレートを例示した。以下の本実施形態例では、市販の培養容器として、円形のシャーレ本体とこれを塞ぐ蓋体とからなる市販のシャーレを使用した場合について説明する。
円形のシャーレを使用する場合には、図１２に示すように、シャーレに対応する形状に形成された円形のスペーサ１０Ｅを採用し、そのスペーサ１０Ｅに気体供給口１４および気体排出口１５を一組設けたり（図１２（ａ））、二組設けたりできる（図１２（ｂ））。
【００３８】
さらに、図１３に示すように、円形のシャーレ本体６１とこれを塞ぐ蓋体６２とからなる市販の円形のシャーレ６０に使用されるスペーサ１０Ｅには、その内側に、カルチャーインサート３２を係止可能な係止孔２３ａが１つ形成された水平な係止板２３を設け、カルチャーインサート３２の底部がシャーレ本体６１の底部に接触しないように、カルチャーインサート３２を適切な高さに維持しながら、スペーサ１０Ｅに係止できる形態とすることも好適である。具体的には、カルチャーインサート３２の底部とシャーレ本体６１の底部との隙間が０．８〜１ｍｍ程度となるようにすることが好ましい。また、係止孔２３ａの周縁には、パッキン２４を全周にわたって形成して、カルチャーインサート３２と係止孔２３ａとが気密に接続されるようにする。
この場合、スペーサ１０Ｅにより形成されるスペースの高さｈ’としては、第１の実施形態において説明した高さが好適であり、そのような高さが確保されるように、スペーサ１０Ｅの高さも設計することが好ましい。また、上枠１１は蓋体６２と、下枠１２はシャーレ本体６１と嵌合できる高さとされ、上枠の高さは３〜２７ｍｍ、下枠の高さは３〜２５ｍｍ程度が好ましい。
【００３９】
このようにすると、生体試料３３の下側は培地３１と接し、上側は供給される気体と接する、いわゆる気液界面培養が可能となり、気相に存在する対象物質が生体試料３３に及ぼす影響について、シャーレ６０とこれに係止されたカルチャーインサート３２とを用いて観察、評価することができる。
なお、この例では、係止孔２３ａは１つとしたが、複数設けてもよい。そのようにすると、カルチャーインサート３２を複数係止することができ、マルチウエルタイプとして使用することも可能となる。
【００４０】
以上説明した各形態において、生体試料に対する影響が観察、評価される対象物質としては、各種の気体の他、気相に含まれる液体、固体、揮発性物質などであってもよい。例えば、自動車などから排出される粒子状物質、粉塵、花粉などの固体微粒子；トルエン、ベンゼン、フロン類、ジクロロメタン、アルコール類、アルデヒド類などの揮発性の有機物；などでもよく、空気などの気体に同伴させて、培養装置内に供給できるものであれば、制限はない。また、これら対象物質は、１種単独で供給しても、２種以上を供給してもよい。また、培養環境を維持するために適した気体（湿度１００％、３７℃、空気９５ｖｏｌ％、二酸化炭素５ｖｏｌ％）とともに、対象物質を供給してもよい。
【００４１】
生体試料としては、動物、植物由来の細胞、組織片、器官、微生物などが挙げられる。特に細胞としては、気相中に存在する物質の影響を受けやすい呼吸器系に存在する細胞（肺気道や肺胞由来の細胞、気管由来の細胞、鼻腔由来の細胞など。）、皮膚細胞、角膜を構成する細胞、毛髪の細胞、植物のカルス、線虫、菌糸などが挙げられる。
【００４２】
また、観察中において、培養装置３０内の各種条件を適切に維持するために、種々の手法を採用することができる。
例えば、湿度制御のために、生体試料３３が載置されていないウエルやウエル同士の間に、水を入れておくことができる。また、その際、蓋体２２の内側に親水性物質をコーティングするなどの処理により結露を防止し、外部からの観察がしやすくなるようにしてもよい。具体的には、例えばアラビアゴムなどの親水性高分子の溶液を少量塗布し乾燥する方法、界面活性剤水溶液（台所洗剤希釈液）を塗布し乾燥する方法、特開平５−１５３６２号公報に記載されているように、セルロース系樹脂をケン化して得られる防曇フィルムを貼る方法などが挙げられる。
【００４３】
温度制御のためには、上述した断熱シートを用いる方法の他、顕微鏡観察する場合において保温機能付きのステージを具備した顕微鏡や、保温加湿チャンバー付きの顕微鏡を使用する方法なども採用できる。さらに、蓋体やスペーサに発熱機能を持たせる方法も有効である。例えば蓋体やスペーサの少なくとも一部に、温度調節機能が接続された導電膜を設け、この導電膜に電流を流して発熱させるようにする方法などを例示できる。
【実施例】
【００４４】
以下、培養装置内で生体試料を培養しながら、培養装置内の気相に含まれる物質が生体試料に及ぼす影響を観察し、評価する方法について、具体的に説明する。
［評価例１］
ウサギ（日本ＳＣＣ（株）：ニュージーランドホワイト種、１６週齢（オス））由来気管を滅菌生理食塩水でタテ半分に切断し、気管内腔面の粘膜層を外側の軟骨などを含む組織から剥離した。粘膜層をメスで細片化し、粘膜片を得た。
一方、図５に示すように、培養装置３０を構成した。すなわち、まず、培養容器２０として、２×３の６穴タイプの蓋体付きのマルチウエルプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ ＭＳ−８００６０、ポリスチレン製、外寸１２７．６ｍｍ（Ｌ）×８５．８ｍｍ（Ｗ）、本体の高さ２０．２ｍｍ、ウエルの深さ１７．０ｍｍ、ウエルの直径３５．６ｍｍ、培養面積９．２ｃｍ２／ウエル、ウエル容量１６ｍＬ）を用意し、ウエルＷ５に培地３１を入れた後、このウエルＷ５内に、底部がメンブレンからなるセル状のカルチャーインサート３２を配置した。そして、メンブレンを介して培地３１と接触するように、先に細片化した粘膜片を生体試料３３として載置し、培養した。培地３１には、ペニシリン−ストレプトマイシン添加、ダルベッコＭＥＭ、１０％牛胎児血清を０．５ｍＬ用いた。また、培地３１よりも上方におけるカルチャーインサート３２の外周とウエルＷ５の内周との間には、ゴム製のパッキン３４を挿入配置した。そして、マルチウエルプレートと蓋体２２との間に図１および図２に示したスペーサ１０Ａを装着した。これにより形成されるスペースＳの高さｈを１７ｍｍとした。ついで、図５では図示略のセンサ差込口にセンサ類（温度センサ、湿度センサを差し込んで、これらの条件をモニタリングできるようにした。その後、培養装置３０ごと、図示略の保温ステージ付倒立微分干渉顕微鏡（オリンパスＩＸ７０、対物レンズ２０倍）の保温ステージに載置した。
ついで、二酸化硫黄ガス（対象物質として二酸化硫黄を濃度１００ｐｐｍで含む空気）が入った注射筒３６を用意し、この注射筒３６をチューブ３７を介してスペーサ１０の気体供給口１４に接続し、注射筒３６のピストンを押し込んで、この気体を培養装置３０内に供給した。一方、スペーサ１０の気体排出口１５には気体回収手段として袋３５をあらかじめ装着しておき、気体が供給されたことにより過剰となった気体を回収し、培養装置３０内の圧力を一定に保てるようにした。
そして、顕微鏡に接続した図示略のデジタルカメラ（アクアコスモス：浜松ホトニクス製）を用いて、サブアレイ６４×６４ピクセル、バースト取り込みにより、連続的に約７０回／秒の頻度で、粘膜表面の繊毛部分の画像を１０２４枚取り込んで観察し、繊毛部分の各２５箇所のエリアそれぞれについて、輝度の経時変化をフーリエ変換し、繊毛運動周波数（ＣＢＦ）を算出し、二酸化硫黄ガスが粘膜片に与える影響について評価した。
結果を図１４に示す。
グラフ中、横軸は曝露時間（ｍｉｎ）、縦軸はＣＢＦ（Ｈｚ）であり、暴露時間０ｍｉｎとは、注射筒３６から二酸化硫黄ガスを供給開始した時点である。
図１４に示すように、二酸化硫黄ガスの供給を開始した直後に、ＣＢＦが低下し、すなわち、繊毛運動が低下することが明らかとなり、リアルタイムでの観察、評価を行うことができた。
【００４５】
［評価例２］
評価例１で使用したものと同じ粘膜片を用意した。
一方、図１５に示す培養装置３０を構成した。すなわち、培養容器２０として、評価例１で使用したものと同じ蓋体付きのマルチウエルプレートを用意し、ウエルＷ５に評価例１と同様に培地３１を入れ、カルチャーインサート３２を配置し、生体試料３３として粘膜片を載置し、培養した。また、カルチャーインサート３２の外周とウエルＷ５の内周との間に、評価例１と同様にして、ゴム製のパッキン３４を挿入配置した。そして、マルチウエルプレートと蓋体２２との間に、評価例１で使用したものと同じスペーサ１０を装着し、同様の高さｈのスペースＳを形成した。ただし、スペーサ１０の気体供給口１５には、１ｍの長さのチューブ３７を介して三方コック３８を接続した。三方コック３８の残りの二方のうちの一方には、温度３７℃、湿度１００％の空気が供給されるように調整された空気ボックス３９と接続し、他方は温度２５℃、湿度４０％の室内に開放し、空気ボックス３９中の空気か、室内の空気のいずれかを選択して、培養装置３０に供給できるようにした。一方、スペーサ１０の気体排出口１５には、脈動を防ぐためのトラップ４０を介して、吸引ポンプ４１を接続し作動させ、空気ボックス３９中の空気を培養装置３０内に連続的に取り込んだ。そして、図示略のセンサ差込口に評価例１と同様のセンサ類を差し込んで、培養装置３０ごと、評価例１で使用したものと同じ図示略の保温ステージ付倒立微分干渉顕微鏡の保温ステージに載置した。
そして、顕微鏡に接続したデジタルカメラ（アクアコスモス：浜松ホトニクス製）により、評価例１と同様にして連続的に粘膜表面の繊毛部分の画像を取り込んで観察し、同様の手法で繊毛運動周波数（ＣＢＦ）を算出し、湿度（水分）が粘膜片に与える影響について評価した。
結果を図１６に示す。
グラフ中、横軸は曝露時間（ｍｉｎ）、縦軸はＣＢＦ（Ｈｚ）であり、暴露時間０ｍｉｎとは、空気を供給開始した時点である。
図１６に示すように、温度３７℃、湿度１００％の空気を供給した場合には、供給の前後でＣＢＦは変化しなかったが、温度２５℃、湿度４０％の空気を供給した場合には、供給開始の直後からＣＢＦが徐々に低下し、空気の乾燥により、繊毛運動が低下することが明らかとなった。このように本例によれば、リアルタイムでの観察、評価を行うことができた
【符号の説明】
【００４６】
１０Ａ〜１０Ｅ スペーサ
２０、６０ 培養容器
２１、６１ 培養容器本体
２２、６２ 蓋体
３０ 培養装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養装置の培養容器本体と、該培養容器本体に被せられる蓋体との間に装着され、前記培養容器本体と前記蓋体とを離間させつつ、気密に接続することを特徴とする培養容器用スペーサ。
【請求項２】
培養装置の内側と外側とを連通する開口部が少なくとも１つ形成されていることを特徴とする請求項１に記載の培養容器用スペーサ。
【請求項３】
複数のウエルが形成された培養容器本体に対して装着されることを特徴とする請求項１または２に記載の培養容器用スペーサ。
【請求項４】
各ウエルに対応する複数の孔が形成された中板部を備え、
前記装着の際には、各孔の周縁部と各ウエルの開口周縁部とが密着することを特徴とする請求項３に記載の培養容器用スペーサ。
【請求項５】
ウエル同士を隔てる隔離手段を備えることを特徴とする請求項３に記載の培養容器用スペーサ。
【請求項６】
前記培養容器本体と、前記蓋体と、前記培養容器本体と前記蓋体との間に装着された請求項１ないし５のいずれかに記載の培養容器用スペーサとを備えたことを特徴とする培養装置。
【請求項７】
請求項６に記載された培養装置で生体試料を培養しながら、前記培養装置内の気相に含まれる物質が前記生体試料に及ぼす影響を観察することを特徴とする生体試料の観察方法。
【請求項１】
培養装置の培養容器本体と、該培養容器本体に被せられる蓋体との間に装着され、前記培養容器本体と前記蓋体とを離間させつつ、気密に接続することを特徴とする培養容器用スペーサ。
【請求項２】
培養装置の内側と外側とを連通する開口部が少なくとも１つ形成されていることを特徴とする請求項１に記載の培養容器用スペーサ。
【請求項３】
複数のウエルが形成された培養容器本体に対して装着されることを特徴とする請求項１または２に記載の培養容器用スペーサ。
【請求項４】
各ウエルに対応する複数の孔が形成された中板部を備え、
前記装着の際には、各孔の周縁部と各ウエルの開口周縁部とが密着することを特徴とする請求項３に記載の培養容器用スペーサ。
【請求項５】
ウエル同士を隔てる隔離手段を備えることを特徴とする請求項３に記載の培養容器用スペーサ。
【請求項６】
前記培養容器本体と、前記蓋体と、前記培養容器本体と前記蓋体との間に装着された請求項１ないし５のいずれかに記載の培養容器用スペーサとを備えたことを特徴とする培養装置。
【請求項７】
請求項６に記載された培養装置で生体試料を培養しながら、前記培養装置内の気相に含まれる物質が前記生体試料に及ぼす影響を観察することを特徴とする生体試料の観察方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１０−２３９９１６（Ｐ２０１０−２３９９１６Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９３８７７（Ｐ２００９−９３８７７）
【出願日】平成２１年４月８日（２００９．４．８）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月８日（２００９．４．８）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
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