培養情報処理装置、培養状態評価装置、細胞培養方法およびプログラム
【課題】 コロニーに含まれる培養細胞の数を非侵襲で把握するための技術を提供する。
【解決手段】 培養情報処理装置は、取得部と、輪郭情報生成部と、細胞計数部と、教師情報生成部とを備える。取得部は、蛍光染色された細胞からなる第１細胞塊を各々の焦点位置を変化させて撮影した蛍光画像群を取得する。輪郭情報生成部は、第１細胞塊を観察面に投影したときの輪郭の大きさ情報を求める。細胞計数部は、蛍光画像群を用いて第１細胞塊に含まれる細胞数を求める。教師情報生成部は、第１細胞塊の観察時期を示す情報に、第１細胞塊の細胞数の情報と第１細胞塊の輪郭の大きさの情報とを対応付けて教師情報を生成する。
【解決手段】 培養情報処理装置は、取得部と、輪郭情報生成部と、細胞計数部と、教師情報生成部とを備える。取得部は、蛍光染色された細胞からなる第１細胞塊を各々の焦点位置を変化させて撮影した蛍光画像群を取得する。輪郭情報生成部は、第１細胞塊を観察面に投影したときの輪郭の大きさ情報を求める。細胞計数部は、蛍光画像群を用いて第１細胞塊に含まれる細胞数を求める。教師情報生成部は、第１細胞塊の観察時期を示す情報に、第１細胞塊の細胞数の情報と第１細胞塊の輪郭の大きさの情報とを対応付けて教師情報を生成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養情報処理装置、培養状態評価装置、細胞培養方法およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の培養技術および培養状態の評価技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
細胞の培養過程では細胞が凝集し、コロニー（細胞塊）が形成されることが知られている。平面に単層で細胞が接着培養されていた頃に比べて、コロニーの状態では内部で細胞が複雑な構造を形成し、３次元方向にもコロニーが進展する。培養細胞に組織的な機能を発現させるためには、このような３次元構造をとりながら細胞を培養することが重要であると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４５３６４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
培養した細胞を次の工程で使用するときには、培養細胞の総数を把握する必要がある。しかし、３次元的に成長したコロニー状態の培養細胞では、コロニーのまま細胞数を計測することができない。一般的にコロニー内の細胞数をカウントする場合、トリプシン処理等によってコロニーを一度細胞単体までばらす必要があるが、かかる処理は培養細胞に大きなダメージを与えてしまう。例えば、再生医療の分野では、インビトロで培養した細胞を人体に移植することが前提となるので、細胞へのダメージをできる限り抑制しつつ、細胞数の情報を取得することが強く要請されている。
【０００６】
上記事情に鑑み、コロニーに含まれる培養細胞の数を非侵襲で把握するための技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面である培養情報処理装置は、取得部と、輪郭情報生成部と、細胞計数部と、教師情報生成部とを備える。取得部は、蛍光染色された細胞からなる第１細胞塊を各々の焦点位置を変化させて撮影した蛍光画像群を取得する。輪郭情報生成部は、第１細胞塊を観察面に投影したときの輪郭の大きさ情報を求める。細胞計数部は、蛍光画像群を用いて第１細胞塊に含まれる細胞数を求める。教師情報生成部は、第１細胞塊の観察時期を示す情報に、第１細胞塊の細胞数の情報と第１細胞塊の輪郭の大きさ情報とを対応付けて教師情報を生成する。
【０００８】
本発明の他の側面である培養状態評価装置は、教師情報取得部と、画像取得部と、推定部とを備える。教師情報取得部は、上記の培養情報処理装置で生成された教師情報を取得する。画像取得部は、第１細胞塊と同じ種類で蛍光染色のされていない細胞からなる第２細胞塊を撮影した明視野観察画像を取得する。推定部は、明視野観察画像の観察時期と対応する教師情報を用いて、第２細胞塊の明視野観察画像から取得した輪郭の大きさから第２細胞塊に含まれる細胞数を推定する。
【０００９】
なお、コンピュータを上記の培養情報処理装置または培養状態評価装置として動作させるプログラムや、当該プログラムを記憶した記憶媒体や、上記の培養状態評価装置を用いた細胞培養方法や、上記の培養情報処理装置または培養状態評価装置の動作を方法のカテゴリで表現した態様は、いずれも本発明の具体的態様として有効である。
【発明の効果】
【００１０】
第１細胞塊の蛍光画像群を用いて、細胞塊の輪郭の大きさと細胞数とを含む教師情報を予め生成する。そして、上記の教師情報を用いることで、明視野観察画像で取得した輪郭の大きさから第２細胞塊に含まれる培養細胞の数を非侵襲で把握できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】一の実施形態での培養情報処理装置および培養状態評価装置の構成例を示す図
【図２】ヒトｉＰＳ細胞のコロニーを撮影した位相差画像の例を示す図
【図３】一の実施形態での蛍光画像群の取得方法の例を示す概要図
【図４】培養情報処理装置としてのコンピュータの動作例を示す流れ図
【図５】培養状態評価装置としてのコンピュータの動作例を示す流れ図
【図６】一の実施形態における観察時期と評価対象のコロニーの推定細胞数との例を示すグラフ
【図７】他の実施形態での細胞培養装置の構成例を示す図
【図８】図７の細胞培養装置をコンピュータによって制御する場合のフローチャート
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜一の実施形態での装置構成例＞
図１は、培養情報処理装置および培養状態評価装置の一例である一の実施形態でのコンピュータの構成例を示す図である。ここで、一の実施形態のコンピュータ１１は、細胞塊を撮影した明視野観察画像から細胞数を推定する処理を行う。このとき、前処理工程で培養情報処理装置としてのコンピュータ１１は教師情報を生成し、後処理工程で培養状態評価装置としてのコンピュータ１１は、教師情報を用いて明視野観察画像から細胞塊に含まれる細胞数を推定する。
【００１３】
一の実施形態のコンピュータ１１は、細胞の培養およびタイムラプス観察を行う細胞培養装置３１に接続されている。そして、コンピュータ１１には、培養情報処理装置のプログラムおよび培養状態評価装置のプログラムがインストールされている。
【００１４】
上記の細胞培養装置３１は、恒温室３２および撮像部３３を有している。恒温室３２は、細胞の培養に適した環境条件（例えば、温度３７℃、湿度９０％、ＣＯ2濃度５％）に維持されており、その内部で培養容器に収納された細胞が培養される。また、撮像部３３は、恒温室３２の環境下で培養容器内の細胞を観察する電子カメラモジュールである。また、撮像部３３は、透過型顕微鏡（例えば位相差顕微鏡）の光学系と、レーザ光源および共焦点光学系を有する共焦点蛍光顕微鏡の光学系との２種類の光学系を有している。撮像部３３の光学系は、光軸方向（ｚ軸方向）に焦点位置を調節することができる。なお、上記の各光学系はいずれも公知であるので、図１では撮像部３３の光学系の図示は省略する。
【００１５】
一方、コンピュータ１１は、データ読込部１２、記憶装置１３、ＣＰＵ１４、メモリ１５および入出力Ｉ／Ｆ１６、バス１７を有している。データ読込部１２、記憶装置１３、ＣＰＵ１４、メモリ１５および入出力Ｉ／Ｆ１６は、バス１７を介して相互に接続されている。さらに、コンピュータ１１には、入出力Ｉ／Ｆ１６を介して、入力デバイス１８（キーボード、ポインティングデバイスなど）とモニタ１９とがそれぞれ接続されている。なお、入出力Ｉ／Ｆ１６は、入力デバイス１８からの各種入力を受け付けるとともに、モニタ１９に対して表示用のデータを出力する。
【００１６】
データ読込部１２は、画像のデータや、プログラムを外部から読み込むときに用いられるＩ／Ｆである。例えば、データ読込部１２は、着脱可能な記憶媒体からデータを取得する読込デバイス（光ディスク、磁気ディスク、光磁気ディスクの読込装置など）や、公知の通信規格に準拠して外部の装置と通信を行う通信デバイス（ＵＳＢインターフェース、ＬＡＮモジュール、無線ＬＡＮモジュールなど）である。なお、一の実施形態のコンピュータ１１は、データ読込部１２を介して細胞培養装置３１の撮像部３３と接続されている。
【００１７】
記憶装置１３は、例えば、ハードディスクや、不揮発性の半導体メモリなどの記憶媒体で構成される。この記憶装置１３には、培養情報処理装置のプログラムおよび培養状態評価装置のプログラムが記録されている。なお、記憶装置１３には、細胞培養装置３１で撮影された培養細胞の画像のデータや、後述の教師情報を記憶しておくこともできる。
【００１８】
ＣＰＵ１４は、コンピュータ１１の各部を統括的に制御するプロセッサである。このＣＰＵ１４は、培養情報処理装置のプログラムの実行によって、輪郭情報生成部２１、細胞計数部２２、教師情報生成部２３として動作する。また、ＣＰＵ１４は、培養状態評価装置のプログラムの実行によって推定部２４として動作する（上記のＣＰＵ１４の各部動作についてはいずれも後述する）。
【００１９】
メモリ１５は、上記の各プログラムでの各種演算結果を一時的に記憶する。このメモリ１５は、例えば揮発性のＳＤＲＡＭである。
【００２０】
＜培養情報処理装置の動作例＞
次に、培養情報処理装置による教師情報の生成について説明する。
【００２１】
上記の教師情報を生成する場合、蛍光タンパクによって細胞核を蛍光染色した細胞を細胞培養装置３１によって培養容器内で培養する。細胞培養装置３１で培養する細胞種はいかなるものでもよいが、一の実施形態ではヒトｉＰＳ細胞を培養する例を説明する。
【００２２】
そして、細胞培養装置３１の撮像部３３は、共焦点蛍光顕微鏡および位相差顕微鏡によって、蛍光染色した細胞からなるコロニーを同一の撮影条件下で一定期間ごとにタイムラプス観察する。これにより、細胞培養装置３１の撮像部３３は、一定期間ごとに同じコロニーを撮影した蛍光画像および明視野観察画像（位相差画像）を生成する。なお、図２に、ヒトｉＰＳ細胞のコロニーを撮影した位相差画像の例を示す。
【００２３】
ここで、細胞培養装置３１は、各観察時期で同じコロニーを共焦点蛍光顕微鏡で撮影するときに、培養細胞の厚さにあわせて光軸方向に焦点位置を一定量ずつ変化させて複数の蛍光画像を取得する（図３参照）。同じ観察時期において焦点位置を変化させて同じコロニーを撮影した蛍光画像群は、各々の画像がコロニーをｚ軸方向にスライスした状態を示している。
【００２４】
その後、培養情報処理装置としてのコンピュータ１１は、上記の蛍光画像群および位相差画像を用いて教師情報を生成する。以下、図４の流れ図を参照しつつ、培養情報処理装置としてのコンピュータ１１の動作例を説明する。なお、図４の流れ図の処理は、プログラムの実行指示に応じてＣＰＵ１４が実行する。
【００２５】
ステップ＃１０１：ＣＰＵ１４は、データ読込部１２を介して、蛍光染色した細胞からなるコロニーをタイムラプス観察して得た各観察時期の画像（蛍光画像群および位相差画像）を細胞培養装置３１から取得する。ここで、上記の蛍光画像群には、観察時期を示す情報と焦点位置の情報とがそれぞれ付帯情報として対応付けされている。また、位相差画像には、観察時期を示す情報が付帯情報として対応付けされている。その後、ＣＰＵ１４は、上記の画像のデータを記憶装置１３に記録する。
【００２６】
なお、ＣＰＵ１４は、１回の観察時期ごとに蛍光画像群および位相差画像を細胞培養装置３１から取得してもよく、タイムラプス観察が終了した時点で全ての観察時期の蛍光画像群および位相差画像を細胞培養装置３１からまとめて取得してもよい。
【００２７】
ステップ＃１０２：ＣＰＵ１４は、教師情報の生成対象となる蛍光画像群および位相差画像のグループを指定する。このとき、ＣＰＵ１４は、同じ観察時期に取得した蛍光画像群および位相差画像をグループ化し、観察時期の古い順に教師情報の生成対象のグループを指定するものとする。
【００２８】
ステップ＃１０３：輪郭情報生成部２１は、コロニーを観察面に投影したときの輪郭の大きさ情報を求める。具体的には、位相差画像では光軸方向からみてコロニーの外縁となる輪郭が観察面に投影されるので、＃１０３での輪郭情報生成部２１は、位相差画像を用いてコロニーの輪郭の大きさ情報を求める。
【００２９】
例えば、輪郭情報生成部２１は、コロニーの輪郭に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出する。そして、輪郭情報生成部２１は、輪郭追跡処理によってコロニーの輪郭で囲まれた閉空間を求め、この閉空間の面積をコロニーの輪郭の大きさ情報とすればよい。また、コロニーの輪郭の大きさ情報は、面積に限らず、例えば、輪郭線の長さを指標にしても良い。
【００３０】
ステップ＃１０４：細胞計数部２２は、教師情報の生成対象のグループに含まれる蛍光画像群を用いて、コロニーに含まれる細胞数を求める。
【００３１】
一例として、細胞計数部２１は、位相差画像で求めたコロニーの輪郭内にある細胞核の数を各々の蛍光画像でカウントする。そして、細胞計数部２１は、焦点位置が隣接する蛍光画像間で同じ座標にある細胞核を除外した上で、各々の蛍光画像でカウントした細胞核の数を合計し、コロニー内の細胞の総数を算出する。なお、本実施形態の例では、蛍光染色する対象を細胞核としたが、例えば核酸染色試薬を使って細胞内のｄｓＤＮＡを染色しても良い。さらに正細胞と死細胞とを区別して染色するなどしても良い。
【００３２】
ステップ＃１０５：教師情報生成部２３は、コロニーの輪郭の大きさ情報（＃１０３）とコロニーの細胞数（＃１０４）を示す情報とを、コロニーの観察時期を示す情報と対応付けて教師情報を生成する。
【００３３】
ステップ＃１０６：ＣＰＵ１４は、全ての観察時期において教師情報が生成されたか否かを判定する。上記要件を満たす場合（ＹＥＳ側）には、＃１０７に処理が移行する。
一方、上記要件を満たさない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ１４は＃１０２に戻って、教師情報の生成対象のグループを新たに指定して上記動作を繰り返す。
【００３４】
ステップ＃１０７：教師情報生成部２３は、同じコロニーについて観察時期が異なる複数の教師情報を時間軸方向に関連付けてデータベース化する。そして、教師情報生成部２３は、データベース化した教師情報を記憶装置１３に記録する。以上で、図４の説明を終了する。
【００３５】
また、一の実施形態での培養情報処理装置は、＃１０１〜＃１０７の処理によって、同じ細胞種の他のコロニーから得た一連の教師情報をさらにデータベース化する。これにより、或る細胞種のコロニーを培養したときの成長曲線の上限および下限を把握することができる。
【００３６】
同じ細胞種の細胞を培養した場合でもコロニーの成長にある程度のバラツキが生じるが、複数回の培養によってそれぞれ異なるコロニーから複数の教師情報を生成することで、より精度の高い細胞数の推定が可能となる。
【００３７】
＜培養状態評価装置の動作例＞
次に、培養状態評価装置による培養細胞の評価について説明する。
【００３８】
上記の培養状態評価装置は、教師情報のときと同じ細胞種であって、蛍光染色されていない細胞（非蛍光染色のヒトｉＰＳ細胞）を評価対象とする。この場合、評価対象の細胞を細胞培養装置３１によって培養容器内で培養する。
【００３９】
そして、細胞培養装置３１の撮像部３３は、位相差顕微鏡によって、評価対象の細胞からなるコロニーを同一の撮影条件下で一定期間ごとにタイムラプス観察する。これにより、細胞培養装置３１の撮像部３３は、一定期間ごとに同じコロニーを撮影した位相差画像を生成する。
【００４０】
その後、培養状態評価装置としてのコンピュータ１１は、上記の位相差画像を用いて培養細胞の評価を行う。以下、図５の流れ図を参照しつつ、培養状態評価装置としてのコンピュータ１１の動作例を説明する。なお、図５の流れ図の処理は、プログラムの実行指示に応じてＣＰＵ１４が実行する。
【００４１】
ステップ＃２０１：ＣＰＵ１４は、評価対象の細胞種に対応する教師情報のデータベースを記憶装置１３から読み込んで取得する。なお、＃２０１の処理で読み込まれる教師情報のデータベースは、培養情報処理装置が図４の処理で予め生成したものである。
【００４２】
ステップ＃２０２：ＣＰＵ１４は、データ読込部１２を介して、評価対象の細胞からなるコロニーを或る観察時期に撮影した位相差画像を細胞培養装置３１から取得する。ここで、位相差画像には、観察時期を示す情報が付帯情報として対応付けされている。その後、ＣＰＵ１４は、上記の位相差画像のデータを記憶装置１３に記録する。
【００４３】
ステップ＃２０３：推定部２４は、教師情報のデータベースを用いて、＃２０２で取得した評価対象の位相差画像からコロニー全体に含まれる細胞数を推定する。そして、推定部２４は、コロニー全体の推定細胞数の情報を記憶装置１３に記録する。
【００４４】
一例として、推定部２４は、評価対象の位相差画像に含まれるコロニーの輪郭の大きさ情報を上記の＃１０３と同じ手法で求める。次に、推定部２４は、教師情報のデータベースのうち、評価対象の位相差画像と同じ観察時期の教師情報を参照し、評価対象の位相差画像から求めたコロニーの輪郭の大きさ情報に対応する細胞数を推定する。
【００４５】
このとき、推定部２４は、同じ観察時期の教師情報のうち、評価対象の位相差画像とコロニーの輪郭の大きさが最も近い教師情報を選択する。そして、推定部２４は、選択された教師情報の示す細胞数を用いて、評価対象となるコロニーの細胞数を推定すればよい。あるいは、推定部２４は、複数の教師情報からコロニーの輪郭の大きさ情報と細胞数との相関を示す関数を求め、この関数を用いてコロニーの輪郭の大きさ情報から細胞数を推定してもよい。以上で、図５の説明を終了する。
【００４６】
一の実施形態の培養状態評価装置は、同じ細胞種のコロニーの蛍光観察結果から予め生成された教師情報を用いて、位相差画像に含まれるコロニーの輪郭の大きさからコロニー全体の培養細胞の数を推定する。これにより、培養工程で有用な情報となるコロニーの培養細胞の数をコロニーのまま非侵襲で求めることができる。
【００４７】
ここで、同じコロニーをタイムラプス観察しつつ、各観察時期において培養状態評価装置で図６の処理を逐次行う場合、推定部２４は、以下の手法により位相差画像からコロニーの培養状態の良否を推定できる。
【００４８】
具体的には、評価対象の位相差画像に含まれるコロニーの輪郭の大きさが、同じ観察時期の教師情報における輪郭の大きさの上限から下限の範囲に収まる場合、推定部２４は、評価対象のコロニーが正常な状態にあると推定する。一方、評価対象の位相差画像に含まれるコロニーの輪郭の大きさが、同じ観察時期の教師情報における輪郭の大きさの上限から下限の範囲から外れる場合、推定部２４は、評価対象のコロニーが異常な状態にあると推定する。
【００４９】
これにより、一の実施形態の培養状態評価装置では、教師情報を用いて位相差画像からコロニーの培養状態を非侵襲で判断することができるので、実用的な培養工程の良否の指標を提供できる。
【００５０】
図６は、一の実施形態における観察時期と評価対象のコロニーの推定細胞数との例を示すグラフである。図６の横軸は観察時期であり、図６の縦軸はコロニーの推定細胞数である。図６では、各観察時期で位相差画像から求めた推定細胞数と、教師情報のうちで輪郭の大きさの上限に対応する細胞数と、輪郭の大きさの下限に対応する細胞数とをそれぞれ示している。図６の例では、評価対象のコロニーが正常な状態であり、各観察時期で位相差画像から求めた推定細胞数は、教師情報の細胞数の上限から下限の範囲に収まっている。
【００５１】
＜他の実施形態での細胞培養装置の説明＞
以下、図７、図８を参照しつつ、培養状態評価装置を細胞培養装置に適用した実施形態を説明する。
【００５２】
図７は、細胞培養装置３１の改良型であって、培養細胞の培養操作を自動化した細胞培養装置の構成例である。なお、後述する図８の流れ図において、ステップ＃３０１での細胞の播種、ステップ＃３０２での細胞の培養・増殖操作は、図７の細胞培養装置によって行われる。
【００５３】
細胞培養装置３１による播種・培養操作は、コンピュータ１１のＣＰＵ１４によって行われる。具体的には、ＣＰＵ１４の制御部２５によって、播種部５３とピペッティング装置５４とが制御される。
【００５４】
播種部５３は、細胞を収納する収納容器と、収納容器からピペッティング装置５４に細胞を送り出すポンプと、ポンプの駆動源とを含んでいる。
【００５５】
ピペッティング装置５４は、 ピペットと、上記のピペットをＸＹ方向およびＺ方向に駆動制御する駆動源（モータやギヤ機構など）と、上記のピペットをピックアップ部５１、分注部５２および播種部５３にそれぞれ繋ぐ管と、ピックアップ部５１、分注部５２および播種部５３の間でピペットの接続先を切換える切換部（弁など）と、ピペットおよび管を洗浄する洗浄装置と、を含んでいる。
【００５６】
細胞培養装置３１による細胞の播種操作では、播種部５３およびピペッティング装置５４が制御部２５により制御される。細胞の播種操作において、ピペッティング装置５４は、播種部５３から送られて来た細胞をピベッティングによって培養容器５６に分散するように播く。
【００５７】
培養過程が進むと、培養容器の培地交換や継代操作が必要となる。
【００５８】
分注部５２には、培地交換作業に必要な新しい培地のボトルや、廃棄培地の収容ボトルや、継代作業に必要なトリプシン溶液のボトルや、その他の試薬のボトルなどが配置されている。
【００５９】
細胞培養装置３１による培地交換作業では、ピペッティング装置５４および分注器５２が制御部２５によって制御される。培地交換作業では、古い培地を培養容器５６から抜いて、新しい培地が供給される。ピペッティング装置５４および分注器５２の各種ボトルは弁を介して接続されている。そして、制御部２５がそれらの弁とボトルの溶液を押し出すポンプとを制御することで、上記の培地交換作業が成される。
【００６０】
細胞培養装置３１による継代作業では、ピペッティング装置５４およびピックアップ部５１が制御部２５によって制御される。培地交換作業では、培養容器内に増えた細胞コロニーをピックアップし、ピックアップされた細胞コロニーを細胞単体に分離した後、新たな培養容器に細胞が播種される。これにより、培養細胞が再増殖される。なお、新たな培養容器はストッカ５５に収納される。そして、細胞培養装置３１では、不図示のロボットアームによって培養容器の移動、交換が行われる。
【００６１】
上記の細胞培養装置３１では、ピックアップ部５１、分注部５２、播種部５３、ピペッティング装置５４が恒温室に設置されている構成を示した。しかし、細胞培養装置はこれに限られず、ピックアップ部５１、分注部５２、播種部５３、ピペッティング装置５４がそれぞれ細胞培養装置３１の外に配置され、これらがシステムとして連携動作する構成であってもよい。
【００６２】
また、ｉＰＳ細胞のコロニーが次の工程で使える品質・量を満たさない場合（図８のステップ＃３０９）には、ｉＰＳ細胞のコロニーを再増殖させる必要がある。かかる場合には、細胞培養装置３１によって、培養容器のｉＰＳ細胞のコロニーを継代し、新たな培養容器に播種することでｉＰＳ細胞のコロニーが増殖される。
【００６３】
図８は、図７の細胞培養装置をコンピュータによって制御する場合のフローチャートである。
【００６４】
ステップ＃３０１では、細胞培養装置３１によって、細胞が培養容器に撒かれる。
【００６５】
ステップ＃３０２では、細胞培養装置３１によって、細胞の培養が開始される。同時に培養容器内の培養細胞は、細胞培養装置３１によって定期的に観察（位相差観察、蛍光観察）される。上記のいわゆるタイムラプス撮影によって、位相差画像および蛍光画像のデータが細胞培養装置３１に記憶される。
【００６６】
ステップ＃３０３では、細胞培養装置３１によって、上記の位相差画像データに基づき、細胞・細胞コロニーの輪郭形状の解析が実行される。
【００６７】
ステップ＃３０４では、細胞培養装置３１によって、一定時期（１〜２週間）の培養中に、タイムラプス撮影された画像データを用いて＃３０３の輪郭形状の解析が行われるとともに、その輪郭形状に基づき細胞コロニーの探索（細胞コロニーの抽出・特定）が行われる。
【００６８】
ステップ＃３０５では、細胞培養装置３１によって、＃３０４で探索された細胞コロニーから、良いｉＰＳ細胞のコロニーになりそうなものが選択される。具体的には、細胞培養装置３１は、所定の条件（例えば輪郭線が連続したもの、コロニーの輝度分散が均一のもの等）に基づき、コロニーの輪郭形状から良いｉＰＳ細胞のコロニーを選択する。
【００６９】
ステップ＃３０６では、細胞培養装置３１によって、既に上述した教師値データが読み出される。
【００７０】
ステップ＃３０７では、細胞培養装置３１によって、輪郭解析されたコロニーのデータと教師データとが比較される。これにより、細胞培養装置３１は、コロニーの内部の細胞数とコロニーの成長時期を把握できる。なお、＃３０７では、細胞培養装置３１によって、コロニーが所望の培養状態であるか（求められる細胞数と成長時期に来ているか）が判断される。そして、コロニーが所望の培養状態ではない場合（ＮＯ側）には、＃３０２の培養工程に戻される。
【００７１】
ステップ＃３０８では、＃３０７でコロニーが所望の培養状態ではない場合（ＮＯ側）に、細胞培養装置３１によって、コロニーがピックアップされる。
【００７２】
ステップ＃３０９では、細胞培養装置３１によって、ピックアップされたコロニーが次の工程で使える量に達したかが判定される。例えば、次の工程としてはｉＰＳ細胞のコロニーを分化誘導する工程（ステップ＃３１０）が想定される。この＃３１０では、創薬や再生医療用に細胞が供される。上記の用途に応じて十分なコロニーの量が決まるので、細胞培養装置３１は、決められた所定の条件に従い上記の判定を行うことができ、次の＃３１０の工程に行くか否かが決定される。コロニーの量が不十分な場合（ＮＯ側）には＃３０１に戻って、細胞培養装置３１によって、新たな培養容器に細胞の播種がなされ、更に細胞が増殖される。また、上記の所定の条件において、ユーザーは培養細胞の量（質量、重さや体積など）を任意に設定できる。更に、＃３０９の判定では、次の工程に行くために培養細胞の量だけではなく、培養細胞の質が十分な品質にあるかを判断基準に加えることもできる。例えば、＃３０９での品質の判断基準としては、各細胞コロニーの面積やコロニーの輝度情報の分散値などが所定の条件を満たしたか否かを細胞培養装置３１に判定させても良い。
【００７３】
＜実施形態の補足事項＞
（ａ）上記実施形態の輪郭情報生成部２１は、位相差画像を用いてコロニーの輪郭の大きさを求めているが、蛍光画像を用いてコロニーの輪郭の大きさを求めてもよい。一例として、輪郭情報生成部２１は、蛍光画像内の領域毎に細胞核の分布を示す分散値を求め、分散値が一定以上となる領域をコロニーの部分と判定すればよい。そして、輪郭情報生成部２１は、コロニーの部分と判定された領域が連続する範囲をグループ化して、コロニーの輪郭の大きさを求めればよい。
【００７４】
（ｂ）上記実施形態では、培養情報処理装置および培養状態評価装置を同じコンピュータで実現する例を説明したが、本発明において、培養情報処理装置と培養状態評価装置とはそれぞれ別個の装置であってもよい。
【００７５】
（ｃ）上記実施形態では、培養情報処理装置および培養状態評価装置の各機能をプログラムによってソフトウエア的に実現する例を説明した。しかし、本発明において、培養情報処理装置および培養状態評価装置の各機能をＡＳＩＣでハードウエア的に実現しても勿論かまわない。
【００７６】
（ｄ）上記実施形態では、培養情報処理装置および培養状態評価装置が、細胞培養装置３１に接続されるコンピュータ１１である例を説明した。しかし、本発明の培養情報処理装置および培養状態評価装置は、細胞培養装置３１に実装されるものであってもよい。
【００７７】
（ｅ）上記実施形態の培養情報処理装置は、各観察時期で位相差画像および蛍光画像群を取得するたびに、リアルタイム処理で逐次教師情報を生成してもよい。
【００７８】
（ｆ）上記実施形態では、明視野観察画像として位相差顕微鏡の画像（位相差画像）を用いる例を説明した。しかし、本発明の培養情報処理装置および培養状態評価装置は、明視野観察画像として微分干渉顕微鏡の画像を用いるものであってもよい。
【００７９】
以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図する。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。
【符号の説明】
【００８０】
１１…コンピュータ，１２…データ読込部，１３…記憶装置，１４…ＣＰＵ，２１…輪郭情報生成部，２２…細胞計数部，２３…教師情報生成部，２４…推定部，３１…細胞培養装置，３２…恒温室，３３…撮像部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養情報処理装置、培養状態評価装置、細胞培養方法およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の培養技術および培養状態の評価技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
細胞の培養過程では細胞が凝集し、コロニー（細胞塊）が形成されることが知られている。平面に単層で細胞が接着培養されていた頃に比べて、コロニーの状態では内部で細胞が複雑な構造を形成し、３次元方向にもコロニーが進展する。培養細胞に組織的な機能を発現させるためには、このような３次元構造をとりながら細胞を培養することが重要であると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４５３６４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
培養した細胞を次の工程で使用するときには、培養細胞の総数を把握する必要がある。しかし、３次元的に成長したコロニー状態の培養細胞では、コロニーのまま細胞数を計測することができない。一般的にコロニー内の細胞数をカウントする場合、トリプシン処理等によってコロニーを一度細胞単体までばらす必要があるが、かかる処理は培養細胞に大きなダメージを与えてしまう。例えば、再生医療の分野では、インビトロで培養した細胞を人体に移植することが前提となるので、細胞へのダメージをできる限り抑制しつつ、細胞数の情報を取得することが強く要請されている。
【０００６】
上記事情に鑑み、コロニーに含まれる培養細胞の数を非侵襲で把握するための技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面である培養情報処理装置は、取得部と、輪郭情報生成部と、細胞計数部と、教師情報生成部とを備える。取得部は、蛍光染色された細胞からなる第１細胞塊を各々の焦点位置を変化させて撮影した蛍光画像群を取得する。輪郭情報生成部は、第１細胞塊を観察面に投影したときの輪郭の大きさ情報を求める。細胞計数部は、蛍光画像群を用いて第１細胞塊に含まれる細胞数を求める。教師情報生成部は、第１細胞塊の観察時期を示す情報に、第１細胞塊の細胞数の情報と第１細胞塊の輪郭の大きさ情報とを対応付けて教師情報を生成する。
【０００８】
本発明の他の側面である培養状態評価装置は、教師情報取得部と、画像取得部と、推定部とを備える。教師情報取得部は、上記の培養情報処理装置で生成された教師情報を取得する。画像取得部は、第１細胞塊と同じ種類で蛍光染色のされていない細胞からなる第２細胞塊を撮影した明視野観察画像を取得する。推定部は、明視野観察画像の観察時期と対応する教師情報を用いて、第２細胞塊の明視野観察画像から取得した輪郭の大きさから第２細胞塊に含まれる細胞数を推定する。
【０００９】
なお、コンピュータを上記の培養情報処理装置または培養状態評価装置として動作させるプログラムや、当該プログラムを記憶した記憶媒体や、上記の培養状態評価装置を用いた細胞培養方法や、上記の培養情報処理装置または培養状態評価装置の動作を方法のカテゴリで表現した態様は、いずれも本発明の具体的態様として有効である。
【発明の効果】
【００１０】
第１細胞塊の蛍光画像群を用いて、細胞塊の輪郭の大きさと細胞数とを含む教師情報を予め生成する。そして、上記の教師情報を用いることで、明視野観察画像で取得した輪郭の大きさから第２細胞塊に含まれる培養細胞の数を非侵襲で把握できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】一の実施形態での培養情報処理装置および培養状態評価装置の構成例を示す図
【図２】ヒトｉＰＳ細胞のコロニーを撮影した位相差画像の例を示す図
【図３】一の実施形態での蛍光画像群の取得方法の例を示す概要図
【図４】培養情報処理装置としてのコンピュータの動作例を示す流れ図
【図５】培養状態評価装置としてのコンピュータの動作例を示す流れ図
【図６】一の実施形態における観察時期と評価対象のコロニーの推定細胞数との例を示すグラフ
【図７】他の実施形態での細胞培養装置の構成例を示す図
【図８】図７の細胞培養装置をコンピュータによって制御する場合のフローチャート
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜一の実施形態での装置構成例＞
図１は、培養情報処理装置および培養状態評価装置の一例である一の実施形態でのコンピュータの構成例を示す図である。ここで、一の実施形態のコンピュータ１１は、細胞塊を撮影した明視野観察画像から細胞数を推定する処理を行う。このとき、前処理工程で培養情報処理装置としてのコンピュータ１１は教師情報を生成し、後処理工程で培養状態評価装置としてのコンピュータ１１は、教師情報を用いて明視野観察画像から細胞塊に含まれる細胞数を推定する。
【００１３】
一の実施形態のコンピュータ１１は、細胞の培養およびタイムラプス観察を行う細胞培養装置３１に接続されている。そして、コンピュータ１１には、培養情報処理装置のプログラムおよび培養状態評価装置のプログラムがインストールされている。
【００１４】
上記の細胞培養装置３１は、恒温室３２および撮像部３３を有している。恒温室３２は、細胞の培養に適した環境条件（例えば、温度３７℃、湿度９０％、ＣＯ2濃度５％）に維持されており、その内部で培養容器に収納された細胞が培養される。また、撮像部３３は、恒温室３２の環境下で培養容器内の細胞を観察する電子カメラモジュールである。また、撮像部３３は、透過型顕微鏡（例えば位相差顕微鏡）の光学系と、レーザ光源および共焦点光学系を有する共焦点蛍光顕微鏡の光学系との２種類の光学系を有している。撮像部３３の光学系は、光軸方向（ｚ軸方向）に焦点位置を調節することができる。なお、上記の各光学系はいずれも公知であるので、図１では撮像部３３の光学系の図示は省略する。
【００１５】
一方、コンピュータ１１は、データ読込部１２、記憶装置１３、ＣＰＵ１４、メモリ１５および入出力Ｉ／Ｆ１６、バス１７を有している。データ読込部１２、記憶装置１３、ＣＰＵ１４、メモリ１５および入出力Ｉ／Ｆ１６は、バス１７を介して相互に接続されている。さらに、コンピュータ１１には、入出力Ｉ／Ｆ１６を介して、入力デバイス１８（キーボード、ポインティングデバイスなど）とモニタ１９とがそれぞれ接続されている。なお、入出力Ｉ／Ｆ１６は、入力デバイス１８からの各種入力を受け付けるとともに、モニタ１９に対して表示用のデータを出力する。
【００１６】
データ読込部１２は、画像のデータや、プログラムを外部から読み込むときに用いられるＩ／Ｆである。例えば、データ読込部１２は、着脱可能な記憶媒体からデータを取得する読込デバイス（光ディスク、磁気ディスク、光磁気ディスクの読込装置など）や、公知の通信規格に準拠して外部の装置と通信を行う通信デバイス（ＵＳＢインターフェース、ＬＡＮモジュール、無線ＬＡＮモジュールなど）である。なお、一の実施形態のコンピュータ１１は、データ読込部１２を介して細胞培養装置３１の撮像部３３と接続されている。
【００１７】
記憶装置１３は、例えば、ハードディスクや、不揮発性の半導体メモリなどの記憶媒体で構成される。この記憶装置１３には、培養情報処理装置のプログラムおよび培養状態評価装置のプログラムが記録されている。なお、記憶装置１３には、細胞培養装置３１で撮影された培養細胞の画像のデータや、後述の教師情報を記憶しておくこともできる。
【００１８】
ＣＰＵ１４は、コンピュータ１１の各部を統括的に制御するプロセッサである。このＣＰＵ１４は、培養情報処理装置のプログラムの実行によって、輪郭情報生成部２１、細胞計数部２２、教師情報生成部２３として動作する。また、ＣＰＵ１４は、培養状態評価装置のプログラムの実行によって推定部２４として動作する（上記のＣＰＵ１４の各部動作についてはいずれも後述する）。
【００１９】
メモリ１５は、上記の各プログラムでの各種演算結果を一時的に記憶する。このメモリ１５は、例えば揮発性のＳＤＲＡＭである。
【００２０】
＜培養情報処理装置の動作例＞
次に、培養情報処理装置による教師情報の生成について説明する。
【００２１】
上記の教師情報を生成する場合、蛍光タンパクによって細胞核を蛍光染色した細胞を細胞培養装置３１によって培養容器内で培養する。細胞培養装置３１で培養する細胞種はいかなるものでもよいが、一の実施形態ではヒトｉＰＳ細胞を培養する例を説明する。
【００２２】
そして、細胞培養装置３１の撮像部３３は、共焦点蛍光顕微鏡および位相差顕微鏡によって、蛍光染色した細胞からなるコロニーを同一の撮影条件下で一定期間ごとにタイムラプス観察する。これにより、細胞培養装置３１の撮像部３３は、一定期間ごとに同じコロニーを撮影した蛍光画像および明視野観察画像（位相差画像）を生成する。なお、図２に、ヒトｉＰＳ細胞のコロニーを撮影した位相差画像の例を示す。
【００２３】
ここで、細胞培養装置３１は、各観察時期で同じコロニーを共焦点蛍光顕微鏡で撮影するときに、培養細胞の厚さにあわせて光軸方向に焦点位置を一定量ずつ変化させて複数の蛍光画像を取得する（図３参照）。同じ観察時期において焦点位置を変化させて同じコロニーを撮影した蛍光画像群は、各々の画像がコロニーをｚ軸方向にスライスした状態を示している。
【００２４】
その後、培養情報処理装置としてのコンピュータ１１は、上記の蛍光画像群および位相差画像を用いて教師情報を生成する。以下、図４の流れ図を参照しつつ、培養情報処理装置としてのコンピュータ１１の動作例を説明する。なお、図４の流れ図の処理は、プログラムの実行指示に応じてＣＰＵ１４が実行する。
【００２５】
ステップ＃１０１：ＣＰＵ１４は、データ読込部１２を介して、蛍光染色した細胞からなるコロニーをタイムラプス観察して得た各観察時期の画像（蛍光画像群および位相差画像）を細胞培養装置３１から取得する。ここで、上記の蛍光画像群には、観察時期を示す情報と焦点位置の情報とがそれぞれ付帯情報として対応付けされている。また、位相差画像には、観察時期を示す情報が付帯情報として対応付けされている。その後、ＣＰＵ１４は、上記の画像のデータを記憶装置１３に記録する。
【００２６】
なお、ＣＰＵ１４は、１回の観察時期ごとに蛍光画像群および位相差画像を細胞培養装置３１から取得してもよく、タイムラプス観察が終了した時点で全ての観察時期の蛍光画像群および位相差画像を細胞培養装置３１からまとめて取得してもよい。
【００２７】
ステップ＃１０２：ＣＰＵ１４は、教師情報の生成対象となる蛍光画像群および位相差画像のグループを指定する。このとき、ＣＰＵ１４は、同じ観察時期に取得した蛍光画像群および位相差画像をグループ化し、観察時期の古い順に教師情報の生成対象のグループを指定するものとする。
【００２８】
ステップ＃１０３：輪郭情報生成部２１は、コロニーを観察面に投影したときの輪郭の大きさ情報を求める。具体的には、位相差画像では光軸方向からみてコロニーの外縁となる輪郭が観察面に投影されるので、＃１０３での輪郭情報生成部２１は、位相差画像を用いてコロニーの輪郭の大きさ情報を求める。
【００２９】
例えば、輪郭情報生成部２１は、コロニーの輪郭に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出する。そして、輪郭情報生成部２１は、輪郭追跡処理によってコロニーの輪郭で囲まれた閉空間を求め、この閉空間の面積をコロニーの輪郭の大きさ情報とすればよい。また、コロニーの輪郭の大きさ情報は、面積に限らず、例えば、輪郭線の長さを指標にしても良い。
【００３０】
ステップ＃１０４：細胞計数部２２は、教師情報の生成対象のグループに含まれる蛍光画像群を用いて、コロニーに含まれる細胞数を求める。
【００３１】
一例として、細胞計数部２１は、位相差画像で求めたコロニーの輪郭内にある細胞核の数を各々の蛍光画像でカウントする。そして、細胞計数部２１は、焦点位置が隣接する蛍光画像間で同じ座標にある細胞核を除外した上で、各々の蛍光画像でカウントした細胞核の数を合計し、コロニー内の細胞の総数を算出する。なお、本実施形態の例では、蛍光染色する対象を細胞核としたが、例えば核酸染色試薬を使って細胞内のｄｓＤＮＡを染色しても良い。さらに正細胞と死細胞とを区別して染色するなどしても良い。
【００３２】
ステップ＃１０５：教師情報生成部２３は、コロニーの輪郭の大きさ情報（＃１０３）とコロニーの細胞数（＃１０４）を示す情報とを、コロニーの観察時期を示す情報と対応付けて教師情報を生成する。
【００３３】
ステップ＃１０６：ＣＰＵ１４は、全ての観察時期において教師情報が生成されたか否かを判定する。上記要件を満たす場合（ＹＥＳ側）には、＃１０７に処理が移行する。
一方、上記要件を満たさない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ１４は＃１０２に戻って、教師情報の生成対象のグループを新たに指定して上記動作を繰り返す。
【００３４】
ステップ＃１０７：教師情報生成部２３は、同じコロニーについて観察時期が異なる複数の教師情報を時間軸方向に関連付けてデータベース化する。そして、教師情報生成部２３は、データベース化した教師情報を記憶装置１３に記録する。以上で、図４の説明を終了する。
【００３５】
また、一の実施形態での培養情報処理装置は、＃１０１〜＃１０７の処理によって、同じ細胞種の他のコロニーから得た一連の教師情報をさらにデータベース化する。これにより、或る細胞種のコロニーを培養したときの成長曲線の上限および下限を把握することができる。
【００３６】
同じ細胞種の細胞を培養した場合でもコロニーの成長にある程度のバラツキが生じるが、複数回の培養によってそれぞれ異なるコロニーから複数の教師情報を生成することで、より精度の高い細胞数の推定が可能となる。
【００３７】
＜培養状態評価装置の動作例＞
次に、培養状態評価装置による培養細胞の評価について説明する。
【００３８】
上記の培養状態評価装置は、教師情報のときと同じ細胞種であって、蛍光染色されていない細胞（非蛍光染色のヒトｉＰＳ細胞）を評価対象とする。この場合、評価対象の細胞を細胞培養装置３１によって培養容器内で培養する。
【００３９】
そして、細胞培養装置３１の撮像部３３は、位相差顕微鏡によって、評価対象の細胞からなるコロニーを同一の撮影条件下で一定期間ごとにタイムラプス観察する。これにより、細胞培養装置３１の撮像部３３は、一定期間ごとに同じコロニーを撮影した位相差画像を生成する。
【００４０】
その後、培養状態評価装置としてのコンピュータ１１は、上記の位相差画像を用いて培養細胞の評価を行う。以下、図５の流れ図を参照しつつ、培養状態評価装置としてのコンピュータ１１の動作例を説明する。なお、図５の流れ図の処理は、プログラムの実行指示に応じてＣＰＵ１４が実行する。
【００４１】
ステップ＃２０１：ＣＰＵ１４は、評価対象の細胞種に対応する教師情報のデータベースを記憶装置１３から読み込んで取得する。なお、＃２０１の処理で読み込まれる教師情報のデータベースは、培養情報処理装置が図４の処理で予め生成したものである。
【００４２】
ステップ＃２０２：ＣＰＵ１４は、データ読込部１２を介して、評価対象の細胞からなるコロニーを或る観察時期に撮影した位相差画像を細胞培養装置３１から取得する。ここで、位相差画像には、観察時期を示す情報が付帯情報として対応付けされている。その後、ＣＰＵ１４は、上記の位相差画像のデータを記憶装置１３に記録する。
【００４３】
ステップ＃２０３：推定部２４は、教師情報のデータベースを用いて、＃２０２で取得した評価対象の位相差画像からコロニー全体に含まれる細胞数を推定する。そして、推定部２４は、コロニー全体の推定細胞数の情報を記憶装置１３に記録する。
【００４４】
一例として、推定部２４は、評価対象の位相差画像に含まれるコロニーの輪郭の大きさ情報を上記の＃１０３と同じ手法で求める。次に、推定部２４は、教師情報のデータベースのうち、評価対象の位相差画像と同じ観察時期の教師情報を参照し、評価対象の位相差画像から求めたコロニーの輪郭の大きさ情報に対応する細胞数を推定する。
【００４５】
このとき、推定部２４は、同じ観察時期の教師情報のうち、評価対象の位相差画像とコロニーの輪郭の大きさが最も近い教師情報を選択する。そして、推定部２４は、選択された教師情報の示す細胞数を用いて、評価対象となるコロニーの細胞数を推定すればよい。あるいは、推定部２４は、複数の教師情報からコロニーの輪郭の大きさ情報と細胞数との相関を示す関数を求め、この関数を用いてコロニーの輪郭の大きさ情報から細胞数を推定してもよい。以上で、図５の説明を終了する。
【００４６】
一の実施形態の培養状態評価装置は、同じ細胞種のコロニーの蛍光観察結果から予め生成された教師情報を用いて、位相差画像に含まれるコロニーの輪郭の大きさからコロニー全体の培養細胞の数を推定する。これにより、培養工程で有用な情報となるコロニーの培養細胞の数をコロニーのまま非侵襲で求めることができる。
【００４７】
ここで、同じコロニーをタイムラプス観察しつつ、各観察時期において培養状態評価装置で図６の処理を逐次行う場合、推定部２４は、以下の手法により位相差画像からコロニーの培養状態の良否を推定できる。
【００４８】
具体的には、評価対象の位相差画像に含まれるコロニーの輪郭の大きさが、同じ観察時期の教師情報における輪郭の大きさの上限から下限の範囲に収まる場合、推定部２４は、評価対象のコロニーが正常な状態にあると推定する。一方、評価対象の位相差画像に含まれるコロニーの輪郭の大きさが、同じ観察時期の教師情報における輪郭の大きさの上限から下限の範囲から外れる場合、推定部２４は、評価対象のコロニーが異常な状態にあると推定する。
【００４９】
これにより、一の実施形態の培養状態評価装置では、教師情報を用いて位相差画像からコロニーの培養状態を非侵襲で判断することができるので、実用的な培養工程の良否の指標を提供できる。
【００５０】
図６は、一の実施形態における観察時期と評価対象のコロニーの推定細胞数との例を示すグラフである。図６の横軸は観察時期であり、図６の縦軸はコロニーの推定細胞数である。図６では、各観察時期で位相差画像から求めた推定細胞数と、教師情報のうちで輪郭の大きさの上限に対応する細胞数と、輪郭の大きさの下限に対応する細胞数とをそれぞれ示している。図６の例では、評価対象のコロニーが正常な状態であり、各観察時期で位相差画像から求めた推定細胞数は、教師情報の細胞数の上限から下限の範囲に収まっている。
【００５１】
＜他の実施形態での細胞培養装置の説明＞
以下、図７、図８を参照しつつ、培養状態評価装置を細胞培養装置に適用した実施形態を説明する。
【００５２】
図７は、細胞培養装置３１の改良型であって、培養細胞の培養操作を自動化した細胞培養装置の構成例である。なお、後述する図８の流れ図において、ステップ＃３０１での細胞の播種、ステップ＃３０２での細胞の培養・増殖操作は、図７の細胞培養装置によって行われる。
【００５３】
細胞培養装置３１による播種・培養操作は、コンピュータ１１のＣＰＵ１４によって行われる。具体的には、ＣＰＵ１４の制御部２５によって、播種部５３とピペッティング装置５４とが制御される。
【００５４】
播種部５３は、細胞を収納する収納容器と、収納容器からピペッティング装置５４に細胞を送り出すポンプと、ポンプの駆動源とを含んでいる。
【００５５】
ピペッティング装置５４は、 ピペットと、上記のピペットをＸＹ方向およびＺ方向に駆動制御する駆動源（モータやギヤ機構など）と、上記のピペットをピックアップ部５１、分注部５２および播種部５３にそれぞれ繋ぐ管と、ピックアップ部５１、分注部５２および播種部５３の間でピペットの接続先を切換える切換部（弁など）と、ピペットおよび管を洗浄する洗浄装置と、を含んでいる。
【００５６】
細胞培養装置３１による細胞の播種操作では、播種部５３およびピペッティング装置５４が制御部２５により制御される。細胞の播種操作において、ピペッティング装置５４は、播種部５３から送られて来た細胞をピベッティングによって培養容器５６に分散するように播く。
【００５７】
培養過程が進むと、培養容器の培地交換や継代操作が必要となる。
【００５８】
分注部５２には、培地交換作業に必要な新しい培地のボトルや、廃棄培地の収容ボトルや、継代作業に必要なトリプシン溶液のボトルや、その他の試薬のボトルなどが配置されている。
【００５９】
細胞培養装置３１による培地交換作業では、ピペッティング装置５４および分注器５２が制御部２５によって制御される。培地交換作業では、古い培地を培養容器５６から抜いて、新しい培地が供給される。ピペッティング装置５４および分注器５２の各種ボトルは弁を介して接続されている。そして、制御部２５がそれらの弁とボトルの溶液を押し出すポンプとを制御することで、上記の培地交換作業が成される。
【００６０】
細胞培養装置３１による継代作業では、ピペッティング装置５４およびピックアップ部５１が制御部２５によって制御される。培地交換作業では、培養容器内に増えた細胞コロニーをピックアップし、ピックアップされた細胞コロニーを細胞単体に分離した後、新たな培養容器に細胞が播種される。これにより、培養細胞が再増殖される。なお、新たな培養容器はストッカ５５に収納される。そして、細胞培養装置３１では、不図示のロボットアームによって培養容器の移動、交換が行われる。
【００６１】
上記の細胞培養装置３１では、ピックアップ部５１、分注部５２、播種部５３、ピペッティング装置５４が恒温室に設置されている構成を示した。しかし、細胞培養装置はこれに限られず、ピックアップ部５１、分注部５２、播種部５３、ピペッティング装置５４がそれぞれ細胞培養装置３１の外に配置され、これらがシステムとして連携動作する構成であってもよい。
【００６２】
また、ｉＰＳ細胞のコロニーが次の工程で使える品質・量を満たさない場合（図８のステップ＃３０９）には、ｉＰＳ細胞のコロニーを再増殖させる必要がある。かかる場合には、細胞培養装置３１によって、培養容器のｉＰＳ細胞のコロニーを継代し、新たな培養容器に播種することでｉＰＳ細胞のコロニーが増殖される。
【００６３】
図８は、図７の細胞培養装置をコンピュータによって制御する場合のフローチャートである。
【００６４】
ステップ＃３０１では、細胞培養装置３１によって、細胞が培養容器に撒かれる。
【００６５】
ステップ＃３０２では、細胞培養装置３１によって、細胞の培養が開始される。同時に培養容器内の培養細胞は、細胞培養装置３１によって定期的に観察（位相差観察、蛍光観察）される。上記のいわゆるタイムラプス撮影によって、位相差画像および蛍光画像のデータが細胞培養装置３１に記憶される。
【００６６】
ステップ＃３０３では、細胞培養装置３１によって、上記の位相差画像データに基づき、細胞・細胞コロニーの輪郭形状の解析が実行される。
【００６７】
ステップ＃３０４では、細胞培養装置３１によって、一定時期（１〜２週間）の培養中に、タイムラプス撮影された画像データを用いて＃３０３の輪郭形状の解析が行われるとともに、その輪郭形状に基づき細胞コロニーの探索（細胞コロニーの抽出・特定）が行われる。
【００６８】
ステップ＃３０５では、細胞培養装置３１によって、＃３０４で探索された細胞コロニーから、良いｉＰＳ細胞のコロニーになりそうなものが選択される。具体的には、細胞培養装置３１は、所定の条件（例えば輪郭線が連続したもの、コロニーの輝度分散が均一のもの等）に基づき、コロニーの輪郭形状から良いｉＰＳ細胞のコロニーを選択する。
【００６９】
ステップ＃３０６では、細胞培養装置３１によって、既に上述した教師値データが読み出される。
【００７０】
ステップ＃３０７では、細胞培養装置３１によって、輪郭解析されたコロニーのデータと教師データとが比較される。これにより、細胞培養装置３１は、コロニーの内部の細胞数とコロニーの成長時期を把握できる。なお、＃３０７では、細胞培養装置３１によって、コロニーが所望の培養状態であるか（求められる細胞数と成長時期に来ているか）が判断される。そして、コロニーが所望の培養状態ではない場合（ＮＯ側）には、＃３０２の培養工程に戻される。
【００７１】
ステップ＃３０８では、＃３０７でコロニーが所望の培養状態ではない場合（ＮＯ側）に、細胞培養装置３１によって、コロニーがピックアップされる。
【００７２】
ステップ＃３０９では、細胞培養装置３１によって、ピックアップされたコロニーが次の工程で使える量に達したかが判定される。例えば、次の工程としてはｉＰＳ細胞のコロニーを分化誘導する工程（ステップ＃３１０）が想定される。この＃３１０では、創薬や再生医療用に細胞が供される。上記の用途に応じて十分なコロニーの量が決まるので、細胞培養装置３１は、決められた所定の条件に従い上記の判定を行うことができ、次の＃３１０の工程に行くか否かが決定される。コロニーの量が不十分な場合（ＮＯ側）には＃３０１に戻って、細胞培養装置３１によって、新たな培養容器に細胞の播種がなされ、更に細胞が増殖される。また、上記の所定の条件において、ユーザーは培養細胞の量（質量、重さや体積など）を任意に設定できる。更に、＃３０９の判定では、次の工程に行くために培養細胞の量だけではなく、培養細胞の質が十分な品質にあるかを判断基準に加えることもできる。例えば、＃３０９での品質の判断基準としては、各細胞コロニーの面積やコロニーの輝度情報の分散値などが所定の条件を満たしたか否かを細胞培養装置３１に判定させても良い。
【００７３】
＜実施形態の補足事項＞
（ａ）上記実施形態の輪郭情報生成部２１は、位相差画像を用いてコロニーの輪郭の大きさを求めているが、蛍光画像を用いてコロニーの輪郭の大きさを求めてもよい。一例として、輪郭情報生成部２１は、蛍光画像内の領域毎に細胞核の分布を示す分散値を求め、分散値が一定以上となる領域をコロニーの部分と判定すればよい。そして、輪郭情報生成部２１は、コロニーの部分と判定された領域が連続する範囲をグループ化して、コロニーの輪郭の大きさを求めればよい。
【００７４】
（ｂ）上記実施形態では、培養情報処理装置および培養状態評価装置を同じコンピュータで実現する例を説明したが、本発明において、培養情報処理装置と培養状態評価装置とはそれぞれ別個の装置であってもよい。
【００７５】
（ｃ）上記実施形態では、培養情報処理装置および培養状態評価装置の各機能をプログラムによってソフトウエア的に実現する例を説明した。しかし、本発明において、培養情報処理装置および培養状態評価装置の各機能をＡＳＩＣでハードウエア的に実現しても勿論かまわない。
【００７６】
（ｄ）上記実施形態では、培養情報処理装置および培養状態評価装置が、細胞培養装置３１に接続されるコンピュータ１１である例を説明した。しかし、本発明の培養情報処理装置および培養状態評価装置は、細胞培養装置３１に実装されるものであってもよい。
【００７７】
（ｅ）上記実施形態の培養情報処理装置は、各観察時期で位相差画像および蛍光画像群を取得するたびに、リアルタイム処理で逐次教師情報を生成してもよい。
【００７８】
（ｆ）上記実施形態では、明視野観察画像として位相差顕微鏡の画像（位相差画像）を用いる例を説明した。しかし、本発明の培養情報処理装置および培養状態評価装置は、明視野観察画像として微分干渉顕微鏡の画像を用いるものであってもよい。
【００７９】
以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図する。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。
【符号の説明】
【００８０】
１１…コンピュータ，１２…データ読込部，１３…記憶装置，１４…ＣＰＵ，２１…輪郭情報生成部，２２…細胞計数部，２３…教師情報生成部，２４…推定部，３１…細胞培養装置，３２…恒温室，３３…撮像部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光染色された細胞からなる第１細胞塊を各々の焦点位置を変化させて撮影した蛍光画像群を取得する取得部と、
前記第１細胞塊を観察面に投影したときの輪郭の大きさ情報を求める輪郭情報生成部と、
前記蛍光画像群を用いて前記第１細胞塊に含まれる細胞数を求める細胞計数部と、
前記第１細胞塊の観察時期を示す情報に、前記第１細胞塊の細胞数の情報と前記第１細胞塊の輪郭の大きさ情報とを対応付けて教師情報を生成する教師情報生成部と、
を備える培養情報処理装置。
【請求項２】
請求項１に記載の培養情報処理装置において、
前記細胞計数部は、前記蛍光画像群のそれぞれの蛍光画像に基づいて細胞数をカウントして、前記蛍光画像群の細胞数を計数する培養情報処理装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の培養情報処理装置において、
前記教師情報生成部は、前記第１細胞塊を対象として各々の観察時期が異なる複数の前記教師情報を、時間軸方向に関連付けて記憶媒体に記録する培養情報処理装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の培養情報処理装置において、
前記取得部は、前記蛍光画像群と同じ観察時期に撮影された前記第１細胞塊の明視野観察画像をさらに取得し、
前記輪郭情報生成部は、前記明視野観察画像を用いて前記輪郭の大きさ情報を求める培養情報処理装置。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の培養情報処理装置において、
前記輪郭情報生成部は、蛍光画像から求めた前記第１細胞塊の細胞の分布を用いて前記輪郭の大きさ情報を求める培養情報処理装置。
【請求項６】
請求項１に記載の培養情報処理装置で生成された教師情報を取得する教師情報取得部と、
第１細胞塊と同じ種類で蛍光染色のされていない細胞からなる第２細胞塊を撮影した明視野観察画像を取得する画像取得部と、
前記明視野観察画像の観察時期と対応する前記教師情報を用いて、前記第２細胞塊の明視野観察画像から取得した輪郭の大きさから前記第２細胞塊に含まれる細胞数を推定する推定部と、
を備える培養状態評価装置。
【請求項７】
請求項６に記載の培養状態評価装置において、
前記教師情報取得部は、前記第１細胞塊を対象として各々の観察時期が異なる複数の前記教師情報を時間軸方向に関連付けて取得し、
前記画像取得部は、異なる観察時期に前記第２細胞塊を撮影した複数の明視野観察画像を取得し、
前記推定部は、前記教師情報から得た前記第１細胞塊の経時変化と、前記明視野観察画像から得た前記第２細胞塊の経時変化とを比較して、前記第２細胞塊の培養状態を推定する培養状態評価装置。
【請求項８】
蛍光染色された細胞からなる第１細胞塊を各々の焦点位置を変化させて撮影した蛍光画像群を取得する処理と、
前記第１細胞塊を観察面に投影したときの輪郭の大きさを求める処理と、
前記蛍光画群を用いて前記第１細胞塊に含まれる細胞数を求める処理と、
前記第１細胞塊の観察時期を示す情報に、前記第１細胞塊の細胞数の情報と前記第１細胞塊の輪郭の大きさの情報とを対応付けて教師情報を生成する処理と、
をコンピュータに実行させるプログラム。
【請求項９】
請求項１に記載の培養情報処理装置または請求項８のプログラムで生成された教師情報を取得する処理と、
第１細胞塊と同じ種類で蛍光染色のされていない細胞からなる第２細胞塊を撮影した明視野観察画像を取得する処理と、
前記明視野観察画像の観察時期と対応する前記教師情報を用いて、前記第２細胞塊の明視野観察画像から取得した輪郭の大きさから前記第２細胞塊に含まれる細胞数を推定する処理と、
をコンピュータに実行させるプログラム。
【請求項１０】
請求項６に記載の培養状態評価装置を用いた細胞培養方法であって、
前記推定部により前記第２細胞塊の培養状態を推定し、該推定結果に基づいて前記第２細胞塊をピックアップするか否かを判定する工程と、
前記判定で前記第２細胞塊が所望の培養状態にないと判定した場合には培養を継続し、前記判定で前記第２細胞塊が所望の培養状態になったと判定した場合には前記第２細胞塊をピックアップする工程と、
前記第２細胞塊をピックアップした場合には、前記第２細胞塊を細胞単体に分離して新たな培地を持つ培養容器へ播種する工程と、
前記細胞単体が播種された前記培養容器内の培地を交換し、細胞培養を増殖させる工程と、
を含む細胞培養方法。
【請求項１】
蛍光染色された細胞からなる第１細胞塊を各々の焦点位置を変化させて撮影した蛍光画像群を取得する取得部と、
前記第１細胞塊を観察面に投影したときの輪郭の大きさ情報を求める輪郭情報生成部と、
前記蛍光画像群を用いて前記第１細胞塊に含まれる細胞数を求める細胞計数部と、
前記第１細胞塊の観察時期を示す情報に、前記第１細胞塊の細胞数の情報と前記第１細胞塊の輪郭の大きさ情報とを対応付けて教師情報を生成する教師情報生成部と、
を備える培養情報処理装置。
【請求項２】
請求項１に記載の培養情報処理装置において、
前記細胞計数部は、前記蛍光画像群のそれぞれの蛍光画像に基づいて細胞数をカウントして、前記蛍光画像群の細胞数を計数する培養情報処理装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の培養情報処理装置において、
前記教師情報生成部は、前記第１細胞塊を対象として各々の観察時期が異なる複数の前記教師情報を、時間軸方向に関連付けて記憶媒体に記録する培養情報処理装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の培養情報処理装置において、
前記取得部は、前記蛍光画像群と同じ観察時期に撮影された前記第１細胞塊の明視野観察画像をさらに取得し、
前記輪郭情報生成部は、前記明視野観察画像を用いて前記輪郭の大きさ情報を求める培養情報処理装置。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の培養情報処理装置において、
前記輪郭情報生成部は、蛍光画像から求めた前記第１細胞塊の細胞の分布を用いて前記輪郭の大きさ情報を求める培養情報処理装置。
【請求項６】
請求項１に記載の培養情報処理装置で生成された教師情報を取得する教師情報取得部と、
第１細胞塊と同じ種類で蛍光染色のされていない細胞からなる第２細胞塊を撮影した明視野観察画像を取得する画像取得部と、
前記明視野観察画像の観察時期と対応する前記教師情報を用いて、前記第２細胞塊の明視野観察画像から取得した輪郭の大きさから前記第２細胞塊に含まれる細胞数を推定する推定部と、
を備える培養状態評価装置。
【請求項７】
請求項６に記載の培養状態評価装置において、
前記教師情報取得部は、前記第１細胞塊を対象として各々の観察時期が異なる複数の前記教師情報を時間軸方向に関連付けて取得し、
前記画像取得部は、異なる観察時期に前記第２細胞塊を撮影した複数の明視野観察画像を取得し、
前記推定部は、前記教師情報から得た前記第１細胞塊の経時変化と、前記明視野観察画像から得た前記第２細胞塊の経時変化とを比較して、前記第２細胞塊の培養状態を推定する培養状態評価装置。
【請求項８】
蛍光染色された細胞からなる第１細胞塊を各々の焦点位置を変化させて撮影した蛍光画像群を取得する処理と、
前記第１細胞塊を観察面に投影したときの輪郭の大きさを求める処理と、
前記蛍光画群を用いて前記第１細胞塊に含まれる細胞数を求める処理と、
前記第１細胞塊の観察時期を示す情報に、前記第１細胞塊の細胞数の情報と前記第１細胞塊の輪郭の大きさの情報とを対応付けて教師情報を生成する処理と、
をコンピュータに実行させるプログラム。
【請求項９】
請求項１に記載の培養情報処理装置または請求項８のプログラムで生成された教師情報を取得する処理と、
第１細胞塊と同じ種類で蛍光染色のされていない細胞からなる第２細胞塊を撮影した明視野観察画像を取得する処理と、
前記明視野観察画像の観察時期と対応する前記教師情報を用いて、前記第２細胞塊の明視野観察画像から取得した輪郭の大きさから前記第２細胞塊に含まれる細胞数を推定する処理と、
をコンピュータに実行させるプログラム。
【請求項１０】
請求項６に記載の培養状態評価装置を用いた細胞培養方法であって、
前記推定部により前記第２細胞塊の培養状態を推定し、該推定結果に基づいて前記第２細胞塊をピックアップするか否かを判定する工程と、
前記判定で前記第２細胞塊が所望の培養状態にないと判定した場合には培養を継続し、前記判定で前記第２細胞塊が所望の培養状態になったと判定した場合には前記第２細胞塊をピックアップする工程と、
前記第２細胞塊をピックアップした場合には、前記第２細胞塊を細胞単体に分離して新たな培地を持つ培養容器へ播種する工程と、
前記細胞単体が播種された前記培養容器内の培地を交換し、細胞培養を増殖させる工程と、
を含む細胞培養方法。
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−２７３６８（Ｐ２０１３−２７３６８Ａ）
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６６８０３（Ｐ２０１１−１６６８０３）
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２９日（２０１１．７．２９）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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