増強されたマラリアＭＳＰ−１サブユニットワクチン
寄生虫熱帯熱マラリア原虫のＭＳＰ−１のＣ末端領域に由来し、増強された免疫原性特性を持つ組換えサブユニットタンパク質について記載する。ｐ３３の選択された領域をｐ１９と組み合わせて、ｐ１９コア領域の免疫原性能力を増強する。このコンストラクトは不連続なセグメントを融合して作られる特有のタンパク質を表すため、発現される組換えタンパク質は、自然界に見出されない。開示された組換えタンパク質の増強された免疫原性能力は、強くて一貫した特異的抗体反応を与えた。開示された組換えサブユニットタンパク質は、マラリアによる感染に対する保護のためのワクチン候補である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって支援された研究に関する言及
本発明は、契約番号１Ｒ４３−ＡＩ５１０２１−０１（ＮＩＨ）およびＲ２１ＡＩ０７６９５５−０１（ＮＩＨ）による政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
技術分野
本発明は、マラリアから保護するためのワクチンとして使用されるように設計された組換えサブユニットタンパク質に関する。特に、この組換えサブユニットタンパク質は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのメロゾイト表面タンパク質１（「ＭＳＰ−１：ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １」）のＣ末端領域に由来し、その免疫原性能力（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を増強するためさらに修飾されている。ＭＳＰ−１のＣ末端領域のコアは、ｐ１９である。ｐ１９コア領域は、寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の標的であるエピトープを含む。しかしながら、ｐ１９コア領域それ自体は、免疫原性が低い。ｐ１９コア領域の直前にある、ＭＳＰ−１のｐ３３領域がＴ細胞エピトープを含むことが明らかになっている。こうしたＴ細胞エピトープは、ｐ１９コア領域に対する抗体反応を増強し得ると考えられている。増強されかつ一貫した免疫応答を惹起できる組換えタンパク質に関して可能なこうしたＴ細胞エピトープの機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ）および有用性については、まだ十分に明らかにされていない。本出願では、ＭＳＰ−１のｐ３３領域に由来するセグメントを選択的に付加することにより、ｐ１９コア領域の免疫原性能力を増強している。こうした選択されるセグメントは、免疫原性能力が増強された新規なタンパク質を産生するようにｐ１９コア領域に連結されている。こうした新規なタンパク質は、自然界に見出されない。免疫原性能力が増強された組換えサブユニットタンパク質は、細胞産生系を用いて産生され、精製後、適切な免疫応答を起こすワクチンとして製剤化される。増強された組換えサブユニットタンパク質は、産生される寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が一貫してないかまたは減少する他のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットと比較して強い寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を誘導することが明らかにされている。増強されたサブユニットタンパク質は、マラリアから保護するためのヒトのワクチンとして使用される可能性がある。
【背景技術】
【０００３】
関連技術
マラリアの年間発生数は２億５０００万症例であり、毎年１００万人を超える人が死亡していると推定される（ＷＨＯ，２００８（非特許文献１））。大部分の症例はアフリカで発生しているとはいえその脅威は、世界の他の多くの熱帯地域および亜熱帯地域に広がっている。世界中で約３０億人に感染のリスクがある。現時点で、媒介する蚊および寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍはどちらも従来の防除対策に対して耐性を示すようになっているため、この疾患の拡散を制御することが強く求められている。過去１０年から１５年においては、寄生虫の様々な発育段階に対するマラリアワクチンの開発に主に焦点が当てられてきた。組換えサブユニットのマラリアワクチンのための科学技術を確立すべく多くの努力が試みられ、いくつかの候補サブユニットが臨床試験に入ってはいるものの、組換えサブユニットタンパク質技術に基づく有効なマラリアワクチンはまだ十分に実現していない。スポロゾイト周囲段階のマラリアを標的とする候補ワクチンの１つが臨床試験（ｔｒａｉｌ）で依然として評価されているが、ワクチンとして認可される可能性に関しては意見が一致していない。メロゾイト段階の寄生虫を標的とする臨床試験（ｔｒａｉｌ）のワクチン候補は、これまで成功していない。このため、マラリアに使用できる認可ワクチンはまだ存在しない。
【０００４】
マラリア寄生虫には多くの種があり、各種は、明確な宿主域を有する。ヒトに感染する種は複数ある。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、ヒトに疾患を引き起こす主要な種である。本明細書では、「寄生虫」という用語は、他に記載がない限り、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を意味する。
【０００５】
マラリア寄生虫の生活環は複雑である。この寄生虫は、その生活環の多くの段階の間に多くの発育変化および形態学的変化を経る。この生活環は、感染した蚊が宿主にスポロゾイトを注入したときから始まる。スポロゾイトは、すぐに肝実質細胞に入り、その後発育して肝臓シゾントになる。成熟すると、メロゾイトが血流に放出される。次いでメロゾイトは、赤血球に侵入し、そこで感染細胞が破裂するまで無性生殖的に増殖し、さらなるメロゾイトが放出され、その後、このさらなるメロゾイトが次の赤血球に侵入する。メロゾイトの増殖および赤血球の溶解は、マラリアの臨床症状と関連している。一部のメロゾイトは、さらに発育して雌性生殖母細胞および雄性生殖母細胞となり、次いでこれらの生殖母細胞は、感染した個体を刺す蚊により取り込まれる。一旦蚊の中に入ると、雌性生殖体が雄性生殖体によって受精してさらに発育して、スポロゾイト段階の寄生虫になる。こうして、この生活環が再び開始されるようになる。この生活環は、３つの段階（前赤血球段階、無性生殖赤血球段階および有性生殖段階）に分類される。ワクチン開発に関して、これらの３つの段階をしばしばスポロゾイトまたは肝臓段階（前赤血球段階）、血液段階（無性生殖赤血球段階）および伝搬阻止（有性生殖段階）という。
【０００６】
マラリアワクチンの開発の可能性はあるものの、過去１０年の努力から、こうしたワクチンの開発が困難な作業であることが証明された。マラリアワクチン候補としてのタンパク質の同定および開発に関しては、進展している。マラリアワクチンに使用するためのタンパク質を選択する主な手段は、ヒト免疫血清に反応するものをスクリーニングすることによって行われてきた。こうして、生活環段階のそれぞれでいくつかのタンパク質をワクチン候補として同定してきた。ワクチン候補に進んだこれらのタンパク質の大部分は、寄生虫の表面に発現されるタンパク質である。抗原の供給源として寄生虫を培養することは難しいため、マラリアワクチンの開発は、組換えＤＮＡなどの別の方法に頼らざるを得なかった。この技術は、重要なペプチド配列を明らかにし、サブユニット抗原を発現させて、ＤＮＡベースのワクチンを開発するのに利用され成功している。
【０００７】
各発育段階の寄生虫を標的とするマラリアワクチンを開発する試みが進行中であるが、血液段階は、疾患の症状が引き起こされる段階であるため、血液段階を標的とするワクチンが、最も大きな影響を与える可能性がある（Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ，１９９８（非特許文献２））。同定されている多くの血液段階抗原の中で詳細に研究されてきたのが、主要なメロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）である。
【０００８】
ネイティブなＭＳＰ−１タンパク質の分子量は、約１９５ｋＤである。このタンパク質は、メロゾイトの表面に突き出て提示される膜アンカー型分子である。このタンパク質は、４つの主要なフラグメントにプロセシングされ、これらは、その相対分子量により、ｐ８３、ｐ２８、ｐ３８およびｐ４２と呼ばれる（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ，１９８４（非特許文献３），Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８６（非特許文献４）およびＨｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ １９８７（非特許文献５））。必ずしもすべてのフラグメントの機能が明らかになっているわけではない。メロゾイトの表面に固定されるＣ末端ｐ４２フラグメントは、ｐ３３およびｐ１９と呼ばれる２つのフラグメントにさらにプロセシングされることが決定されており、このプロセシングが赤血球への侵入に必須であることもまた決定されている（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９０，１９９１（非特許文献６および７）およびＢｌａｃｋｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｄｅｒ，１９９２（非特許文献８））。ＦＵＰ株のＭＳＰ−１ ｐ４２のアミノ酸配列を図１に示す。
【０００９】
いくつかの知見から、ＭＳＰ−１が重要なマラリアワクチン候補であることが裏付けられている。サルを培養寄生虫由来のＭＳＰ−１で免疫すると、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの攻撃誘発から保護できることが実証されている（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ １９８４（非特許文献３），Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ １９８７（非特許文献９），およびＥｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ １９９１（非特許文献１０））。また、ＭＳＰ−１の様々な部分を代表する組換えまたは合成のペプチドも、誘発試験で様々なレベルの保護作用を惹起することが示されている（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ，１９８４（非特許文献３），Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ，１９８６（非特許文献１１），Ｐａｔａｒｒｏｙｏ ｅｔ ａｌ，１９８７（非特許文献１２），Ｈｅｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ，１９９０（非特許文献１３），Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，１９９５（非特許文献１４），およびＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献１５），Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，２０００（非特許文献１６），Ｓｔｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２００１（非特許文献１７），Ｄａｒｋｏ ｅｔ ａｌ，２００５（非特許文献１８））。さらに、流行地域に住んでいるヒトから採取した血清の解析からは、ＭＳＰ−１のＣ末端領域に対するＩｇＧ抗体の産生が、熱帯熱マラリアに対する臨床免疫の発生と相関することも示されている（Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９２（非特許文献１９），Ｓｈａｉ ｅｔ ａｌ，１９９５（非特許文献２０），Ａｌ−Ｙａｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献２１），およびＳｈｉ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献２２））。最後に、ＭＳＰ−１に対するモノクローナル抗体がインビトロで赤血球への寄生虫の侵入を防ぐことができることが証明されている（Ｐｉｒｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｋｉｎｓ，１９８５（非特許文献２３）、およびＢｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９０（非特許文献６））。
【００１０】
ＭＳＰ−１のＣ末端ｐ４２フラグメント、およびそのプロセッシングされたｐ１９フラグメントは、ＭＳＰ−１タンパク質に由来する代表的なサブユニットワクチン候補として同定されている。ｐ１９コア領域の配列（図１に太字の斜体で示す）は、様々なＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株で高度に保存されている。図２は、３種のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株（ＦＵＰ、３Ｄ７およびＦＶＯ）からのＭＳＰ−１ ｐ４２タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを提供する。ｐ３３領域は、ＦＵＰ株と３Ｄ７株との間で保存されている。しかし、ＦＶＯ株のｐ３３は、他の２種のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株とはかなり異なる。ｐ１９コア領域は、３種の株間で高度に保存されており、６つのジスルフィド架橋をさらに含み、これが、２つの上皮増殖因子様ドメインを表す高度に折りたたまれた構造をもたらす（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９１（非特許文献７））。ｐ１９コア領域に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、インビトロで寄生虫の発育を阻害することが示されている（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９０（非特許文献６），Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９２（非特許文献２４），Ｃｈａｐｐｅｌ ａｎｄ Ｈｏｌｄｅｒ，１９９３（非特許文献２５））。
【００１１】
ＭＳＰ−１のｐ４２フラグメントまたはｐ１９フラグメントをベースにした組換えサブユニットワクチンを開発する試みにおいては、いくつかの異なる異種タンパク質発現系を利用してきた。Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母およびバキュロウイルスのベクター系を用いたこれらのサブユニットの発現については以下にまとめてある。Ｅ．ｃｏｌｉにより抗原を発現させる初期の試みでは、免疫時にネイティブなタンパク質に反応する抗体はごく低レベルでしか誘導されなかった（Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８８（非特許文献２６），Ｂｕｒｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献２７））。したがって、現在、大部分の試みは、適切な免疫応答を誘発する可能性がより高い、より適切な産物を作製する試みにおいて、ＭＳＰ−１サブユニットのネイティブと同様の折り畳みを誘導する能力がある発現系に焦点を合わせている。
【００１２】
より高い抗原性能力を持つ、よりネイティブに近いＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質の発現は可能ではあるものの、これまでの試みにより得られたのはどれも、一貫していない、および／または関係のない抗体反応である。たとえば、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ（１９９５）（非特許文献１４）は、酵母で発現させたｐ１９サブユニットでヨザル（Ａｏｔｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）を免疫した場合に、保護作用があることを証明することができた。しかしながら、必ずしも免疫したすべてのサルで保護作用が達成されたわけではないことから、ｐ１９サブユニットによる免疫応答が一貫しないことが実証された。さらに、保護したサルからの血清は、インビトロで寄生虫増殖を阻害することができなかったことから、免疫応答の質（抗体特異性）も期待通りではないことが示唆された。別の一連の例では、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９６）６４：２５３−２６１（非特許文献１５）および米国特許第６，８５５，３１６号（特許文献１））は、バキュロウイルス系で産生されたｐ４２産物を用いてヨザルにおける保護作用を証明することができた。しかしながら、この保護作用は、必ずしもすべての動物が保護されたわけではないため、一貫したものではなかった。これは、保護されたサルの血清がインビトロで寄生虫の増殖を阻害できたという事実にもかかわらずであった。なお別の例では、Ｄａｒｋｏ ｅｔ ａｌ（２００５）（非特許文献１８）は、ヨザルの攻撃誘発モデルを用いて、バキュロウイルスで発現させたｐ４２産物の有効性を評価した。抗体反応は比較的高レベルではあったものの、このバキュロウイルスで発現させたｐ４２産物は、攻撃誘発時にごくわずかの保護作用しか提供しなかった。最後に、Ｅ．ｃｏｌｉで産生し、第ＩＩ相臨床試験に入ったｐ４２産物（Ｏｇｕｔｕ ｅｔ ａｌ，２００９（非特許文献２８））は、免疫応答が低く、一貫していないため、現在中止されている。これらの例から、ＭＳＰ−１のＣ末端領域由来の、有効なワクチン候補である組換えサブユニットタンパク質を製造するための解決策がまだ実現していないのは明らかである。
【００１３】
前述のように、ＭＳＰ−１ ｐ４２フラグメントは、ｐ３３フラグメントおよびｐ１９フラグメントから構成される。メロゾイトの表面に固定されたＭＳＰ−１ ｐ１９コア領域は、メロゾイトの赤血球侵入の過程で必要とされるエレメントであるのに対し、ｐ３３フラグメントは、メロゾイトが赤血球に結合すると血漿に放出される。ｐ１９フラグメントは、赤血球侵入の際に役割を果たすほか、インビトロでの寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の標的でもある。ｐ３３フラグメントの役割は、不明である。
【００１４】
ｐ３３領域内では、いくつかのＴ細胞エピトープが同定されており（Ｕｄｈａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，１９９５（非特許文献２９）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２００１（非特許文献３０）；Ｍａｌｈｏｔｒａ ｅｔ ａｌ，２００８（非特許文献３１））、ｐ３３が、ｐ１９に欠けているヘルパーＴエピトープを与えることにより、防御免疫を誘発する際に間接的な役割を果たしていることが示唆されている（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献３２）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２００１（非特許文献３０））。臨床試験からは、メモリーＴ細胞応答がＭＳＰ１−４２ワクチン接種により誘発され、これらの応答がＭＳＰ１−３３フラグメントに局在していることが示されている（Ｈｕａｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００８（非特許文献３３））。しかしながら、組換えサブユニットタンパク質および能動免疫に関して、ｐ１９に特異的な抗体反応を増強するＴ細胞エピトープの能力は実証されていない。
【００１５】
有効な候補ワクチンとしての組換えＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の可能性を実現するには、さらなる研究を必要とする重要な課題が存在する。第１に、特異的な防御抗体反応の惹起に関する、ＭＳＰ−１のＣ末端領域のうちの適切な免疫原性セグメントを同定する必要がある。特異的な防御抗体とは、インビトロで寄生虫増殖を阻害することができる抗体である。第２の研究領域は、所望の適切な特異的応答の惹起を妨げる応答を引き起こす、無関係な免疫原性セグメントの同定を含む。第３の研究領域は、ワクチン候補としての免疫原性能力を増強した組換えサブユニットタンパク質産物を産生するような様式でＭＳＰ−１のＣ末端領域由来の不連続な配列の連結を評価することを含む。
【００１６】
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質とは、ＭＳＰ−１ ｐ１９コア領域と、ｐ３３配列が自然状態のように隣接しているか、または、新規なタンパク質を作製する場合のように隣接していないか否かに関わらず、ＭＳＰ−１ ｐ３３領域由来の追加配列とを含む、任意の組換えタンパク質と定義される。
【００１７】
増強されたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質を開発する最初の試みではまず、ｐ３３領域のＮ末端の切断をベースに３つのコンストラクトを作製した。切断点は、ｐ３３中の推定Ｔ細胞エピトープに基づいた。１つのコンストラクトでは、この切断形態にｐ３３領域由来の追加のエピトープを連結した。これらの３つのコンストラクトの最初のデータでは、寄生虫抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に免疫増強が認められなかったため、増強配列の存在を実証することができなかった。これら最初の３つのコンストラクトＡ、ＢおよびＣの配列を図３に示す。意外にも、コンストラクトＣのその後のデータから、このコンストラクトの３１アミノ酸のｐ３３セグメントは、抗体反応は全体として強かったものの、寄生虫増殖の抑制抗体に関する免疫応答を抑制する配列（単数または複数）を含むことが示唆された。
【００１８】
このため、ＭＳＰ−１のＣ末端領域の使用をベースにした有効なマラリア組換えサブユニットワクチンをさらに開発するには、組み合わせた配列が、増強された免疫原性特性を持つような様式でｐ１９コア領域と組み合わせることができるように、ｐ３３領域内で適切な配列を同定する必要がある。さらに詳しくは、増強された免疫原性特性とは、インビトロで寄生虫増殖を抑制でき、マラリアにより引き起こされる疾患に対する保護作用を与えることができる、一貫して特異的な抗体を誘導する能力をいう。さらに、増強配列の能力を十分に実現するには、増強特性を持つ配列の免疫原性能力を阻害する配列を除去することも重要である。
【００１９】
「抑制」ｐ３３配列の選択的な除去に加えて、「増強」ｐ３３配列を選択し、「増強」配列をｐ１９コア領域に連結して、霊長類動物モデルおよびヒトにおいて一貫して増強された防御免疫応答を惹起できる新規な組換えタンパク質を作製することが、最終目標である。しかしながら、「増強」配列および「抑制」配列の同定は、これまで報告されていない。したがって、解決すべき技術的課題は、（１）ｐ１９コア領域と組み合わせた場合に免疫応答を増強する推定Ｔ細胞エピトープを含む配列（「増強配列」）を、ｐ３３領域において同定すること、（２）ｐ１９エピトープの免疫原性能力を抑制するｐ３３領域中の配列（「抑制配列」）を同定および除去すること、および（３）ｐ３３領域由来の不連続な増強配列とｐ１９コア領域との連結に基づき、組換えサブユニットタンパク質産物を、細胞ベースの系で効率よく発現させることが可能であるような様式で、組換えサブユニットタンパク質産物を産生する能力を証明することである。こうして産生された組換えサブユニットタンパク質は、これまでのｐ４２ベースのワクチンに見られた課題を解決し、動物モデルおよびヒトにおけるマラリアに対して防御免疫を与える特異的な抗メロゾイト抗体を一貫して誘導する可能性がある。したがって、解決すべき全体的な技術的課題は、免疫原性を増強し、防御有効性を向上させる、ＭＳＰ−１のＣ末端領域に由来する配列に基づき、新規な組換えサブユニットタンパク質の設計、構築および発現を行うことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第６，８５５，３１６号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】ＷＨＯ．（２００８）”Ｗｏｒｌｄ ｍａｌａｒｉａ ｒｅｐｏｒｔ ２００８”
【非特許文献２】Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｎｏｌ． １６：５７−８７
【非特許文献３】Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １１：６１−８１
【非特許文献４】Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＰＮＡＳ ８３：２９８９−２９９３
【非特許文献５】Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ９４： １９９−２０８
【非特許文献６】Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７２：３７９−３８２
【非特許文献７】Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４９：２９−３４
【非特許文献８】Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５０：３０７−３１６
【非特許文献９】Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＰＮＡＳ ８４：３０１４−３０１８．
【非特許文献１０】Ｅｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５９：３４９８−３５０３．
【非特許文献１１】Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＰＮＡＳ ８３：８３２８−８３３２
【非特許文献１２】Ｐａｔａｒｒｏｙｏ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：６２９−６３２
【非特許文献１３】Ｈｅｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ８７：４０１７−４０２１
【非特許文献１４】Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １ ：３２５−３３２
【非特許文献１５】Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４：２５３−２６１
【非特許文献１６】Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６８：２２１５−２２２３
【非特許文献１７】Ｓｔｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． １７（９）：４１５−９
【非特許文献１８】Ｄａｒｋｏ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ７３（１）：２８７−９７
【非特許文献１９】Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４：３２１−３３７
【非特許文献２０】Ｓｈａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７：２６９−２７５
【非特許文献２１】Ａｌ−Ｙａｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ５４：４４３−４４８
【非特許文献２２】Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４：２７１６−２７２３
【非特許文献２３】Ｐｉｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３４： １９４６−１９５１
【非特許文献２４】Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． １４９：５４８−５５５
【非特許文献２５】Ｃｈａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ． ６０：３０３−３１２
【非特許文献２６】Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０：６０７−６１７
【非特許文献２７】Ｂｕｒｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６４（９）：３６１４−９
【非特許文献２８】Ｏｇｕｔｕ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ４（３）：ｅ４７０８
【非特許文献２９】Ｕｄｈａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４（１１）：６０２２ ３０
【非特許文献３０】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ６４： １９４−２０３
【非特許文献３１】Ｍａｌｈｏｔｒａ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８０：３３８３−３３９０
【非特許文献３２】Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７： １１７６−１１８３
【非特許文献３３】Ｈｕａｍａｎ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０： １４５１−１４６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の概要
本発明は、動物モデルおよびヒトにおいてマラリアに対して保護するためのワクチンとして好適なものにする増強された免疫原性特性を持つ、組換えサブユニットタンパク質を提供する。この組換えサブユニットタンパク質は、このタンパク質のＭＳＰ−１のＣ末端ｐ１９コア領域、およびＭＳＰ−１のＣ末端ｐ３３領域由来の選択されたセグメントから構成される。選択されたｐ３３セグメントを付加すると、免疫原性特性が増強される。具体的には、増強された免疫原性能力とは、一貫した防御抗体反応を惹起する能力のことである。こうした増強された抗体反応は、インビトロでは寄生虫増殖を阻害し、インビボではマラリア寄生虫により引き起こされる疾患に対する保護作用を与える可能性がある。本発明の組換えサブユニットタンパク質は、形質転換された昆虫細胞のゲノム内に組み込まれた適切な発現カセットのコピーを含む形質転換された昆虫細胞から発現される。昆虫細胞の発現系は、ネイティブと同様のコンフォメーションを持つ組換えサブユニットタンパク質を高収率で与える。具体的には、形質転換された昆虫細胞から組換えサブユニットタンパク質を分泌させ、自然界に見出されない、マラリアＭＳＰ−１のＣ末端領域の新規な形態にする。さらに詳しくは、組換えサブユニットタンパク質は、マラリア寄生虫により引き起こされる疾患に対して保護するための向上させた免疫原性能力を与えるために作製した新規な誘導体である。動物モデルでは、組換えサブユニットタンパク質を用いたワクチン接種により獲得された、免疫原性能力が増強された抗体は、インビトロで寄生虫増殖を阻害することができる。
【００２３】
本発明はまた、哺乳動物宿主のマラリアに対して保護作用を付与することができる抗体の産生を誘発するワクチンとして記載される組換えサブユニットタンパク質を利用するための方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＭＡＤ型のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＦＵＰ株（Ｕｇａｎｄａ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）由来のＭＳＰ−１ ｐ４２のアミノ酸配列。ｐ３３領域は標準字体であり、ｐ１９コア領域は太字の斜体で示す。
【図２】３種のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＦＵＰ、３Ｄ７およびＦＶＯ株由来のＭＳＰ−１ ｐ４２アミノ酸配列のアライメント。ＦＵＰ株と同一の、３Ｄ７およびＦＶＯのアミノ酸を＋記号で示し、ＦＵＰ株と異なるアミノ酸を図示し、ｐ１９コア領域のアミノ酸を太字にしてある。アライメントのギャップは−記号で示す。ｐ１９コア領域は、太字の斜体で示す。
【図３】ＦＵＰのｐ４２配列と比較した、Ｎ末端を切断した３つのサブユニット（コンストラクトＡ、コンストラクトＢおよびコンストラクトＣ）のアミノ酸配列のアライメント。ｐ３３配列のＣＴエピトープ、Ｃ７２エピトープおよびｐ３３−７エピトープを、下線を引いた太字で示す。ｐ１９コア領域は、太字の斜体で示す
【図４−１】ＦＵＰのＭＳＰ−１ ｐ３３配列と比較した、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の全コンストラクトのアミノ酸配列のアライメント。
【図４−２】ＦＵＰのＭＳＰ−１ ｐ３３配列と比較した、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の全コンストラクトのアミノ酸配列のアライメント。
【図４−３】ＦＵＰのＭＳＰ−１ ｐ３３配列と比較した、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の全コンストラクトのアミノ酸配列のアライメント。
【図５】すべてのＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットコンストラクトの図−名前順。
【図６】すべてのＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットコンストラクトの図−群順。
【図７】群２のＭＳＰ−１のＣ末端コンストラクトのＥＬＩＳＡ抗体力価。
【図８】群１および群２のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットのＥＬＩＳＰＯＴ解析。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、ｐ１９コア領域とｐ３３領域の選択されたセグメントとを含む、マラリアＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質を提供する。こうした組換えサブユニットタンパク質は、適切な発現プラスミドで形質転換された安定した昆虫細胞株から産生し、分泌させる。本発明の組換えサブユニットタンパク質で動物を免疫すると、一貫した抗体反応を誘導するのに有効である。特に、これらの抗体反応は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの増殖を阻害することができる。寄生虫増殖を阻害でき、最終的にマラリアから保護することができる抗体を与える特異的で一貫した免疫応答を誘導するには、選択されたｐ３３セグメントをｐ１９コアと組み合わせることが重大である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の組換えマラリアＭＳＰ−１ Ｃ末端サブユニットタンパク質は、自然界に見出される形態を表すＭＳＰ−１ ｐ４２組換えタンパク質と比較して、増強され一貫した免疫応答を惹起できることが実証されている。一層好ましくは、増強された組換えＭＳＰ−１ Ｃ末端サブユニットタンパク質は、一貫した寄生虫抑制抗体反応を惹起することができる。好ましくは、免疫された被験体はすべて、５０％より高いインビトロでの増殖抑制抗体力価を有する。一層好ましくは、免疫された被験体はすべて、６０％より高いインビトロでの増殖抑制抗体力価を有する。なお一層好ましくは、免疫された被験体は、７０％より高いインビトロでの増殖抑制抗体力価を有する。なお一層好ましくは、免疫された被験体は、８０％より高いインビトロでの増殖抑制抗体力価を有する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、「増強」配列は、ＭＳＰ−１のｐ３３領域から選択され、ｐ１９コア領域に連結されて、新規なＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質が作製される。「増強」配列を選択するだけでなく、ＭＳＰ−１のｐ３３領域から「抑制」配列を除去して、新規なＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質の免疫原性能力をさらに増強する。
【００２８】
より好ましい実施形態では、ＭＳＰ−１のｐ１９コア領域に連結している、ｐ３３領域からの選択されたセグメントは、ヘルパーＴ細胞エピトープを含む。こうしたヘルパーＴ細胞エピトープは、増強された免疫応答を、それ自体では免疫原性が低いｐ１９コア領域に向けるのを担っている。一層好ましくは、選択されたｐ３３セグメントは、ｐ１９コア領域に対する抑制抗体の形態で、増強された抗体反応を惹起する能力を阻害または抑制する配列およびまたはエピトープを含まない。したがって、その結果得られる組換えタンパク質は、利益を与えるセグメント（単数または複数）のみが保持され、好ましくない影響を与えるセグメントが除去されているという点でネイティブなｐ３３領域とは異なる。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、組換えマラリアＭＳＰ−１ Ｃ末端サブユニットタンパク質は、ＭＳＰ−１のｐ１９コアと、選択されたｐ３３セグメントとを含み、これらは、組換えタンパク質が細胞ベースの発現系で分泌産物として発現できるように連結されている。その後、分泌された組換えサブユニットタンパク質は、精製され、免疫原として使用される。精製されたタンパク質を動物の免疫に使用すると、免疫応答が増強される。
【００３０】
なお別の好ましい実施形態では、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞を宿主細胞として用いて「ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質」を発現させる。「ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質」とは、ＭＳＰ−１のｐ１９コア領域と、ｐ３３配列が自然状態のように隣接しているか、あるいは、新規なタンパク質を作製する場合のように隣接していないか否かに関わらず、ＭＳＰ−１のｐ３３領域由来の追加配列とを含む任意の組換えタンパク質をいう。これらの「ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質」は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのどのような株に由来してもよい。図４は、本出願で言及される「ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質」のすべてに利用したｐ３３配列のセグメントを示す。
【００３１】
本発明では、ＭＳＰ−１のＣ末端ｐ１９コア領域、およびＭＳＰ−１のＣ末端ｐ３３領域に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｏｒｍ）セグメントを含むサブユニットタンパク質については、標準的な組換えＤＮＡ法を利用して、こうしたタンパク質のコード配列を機能的分泌シグナルと作動可能に連結し、これを、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞内で機能することが証明されたプロモーターの制御下に配置することにより、安定に形質転換されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞から発現および分泌させた。
【００３２】
本明細書に記載の組換えＭＳＰ−１ Ｃ末端サブユニットタンパク質は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ種に由来する３種類の株を代表する。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの２種の株、すなわち、ＭＡＤ型のＦＵＰ（Ｕｇａｎｄａ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ型のＮＦ−５４（クローン３Ｄ７）、およびＫ１型のＦＶＯ（Ｖｉｅｔｎａｍ−Ｏａｋ Ｎｏｌｌ）由来のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質をコードする配列。すべての配列をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現プラスミドにクローニングし、次いでＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞の形質転換に使用した。
【００３３】
このため、本発明のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットはすべて、図５に示すようなＭＳＰ−１のＣ末端ｐ１９コア領域を含むため、関連している。さらに、各コンストラクトでｐ３３配列が異なっている一方、コンストラクトはすべて、ｐ１９コア領域に対する免疫応答の効力および特異性を誘導および増強するように設計されている。ｐ１９コア領域に対する抗体反応の増強される質は、マラリア感染に起因する疾患に対する保護作用を与える能力の増大と関連する。
【００３４】
本発明のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質は、記載されたように選択されたＳ２細胞株から発現および分泌させ、最初にイムノアフィニティークロマトグラフィー法により精製する。精製には、抗ＭＳＰ−１モノクローナル抗体５．２（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９２）（「５．２抗体」または「ＭＡｂ５．２」）を利用する。５．２抗体は、製造者（ＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により推奨される標準的な方法により適切なカラムマトリックスに化学的に結合して好適なカラムを調製する。
【００３５】
好ましくは、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットは、ｐ４２と呼ばれる、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのメロゾイト表面タンパク質の部分に由来し、ＦＵＰ株および３Ｄ７株のｐ４２は、ＭＳＰ−１のアミノ酸Ａｌａ１３３３からＳｅｒ１７０５を含む。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質は、本明細書に記載するように、安定に形質転換された昆虫細胞から組換え技術によって産生および分泌させる。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットは、ＭＳＰ−１のｐ４２領域全体を含んでも、またはその一部を含んでもよい。一層好ましくは、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットは、ネイティブなｐ４２に隣接しているかあるいは隣接していないＭＳＰ−１のｐ３３配列に連結したＭＳＰ−１のｐ１０コア領域を含むが、すべてのＭＳＰ−１、しかし、すべてのＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質領域の長さは、ＦＵＰ株および３Ｄ７株のネイティブなｐ４２より少なくとも２８アミノ酸短い。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットは、Ｋ、ＭＡＤ２０およびＷｅｌｌｃｏｍｅなどのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの３つの対立遺伝子型のほか、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅおよびＰ．ｏｖａｌｅの対立遺伝子型などのいずれに由来してもよい。
【００３６】
すべての実施形態では、発現産物を昆虫細胞分泌経路を通して導き、さらに培養培地に導くことができる機能的分泌シグナルにより、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の分泌を導く。ここで、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の分泌は、ｔＰＡプレ／プロ分泌リーダーおよび合成分泌シグナルを利用して実証される。
【００３７】
驚いたことに、そして非常に高い抗体力価が寄生虫増殖活性の重要な指標であると考えられている、ＭＳＰ−１ ｐ１９およびＭＳＰ−１ ｐ４２の組換えサブユニットに関する以前に記載された報告とは対照的に、本出願に記載された組換えＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットの一部が顕著な寄生虫増殖抑制活性を惹起する能力は、高力価の抗体反応を起こす必要性に左右されない。中程度の抗体力価を惹起した一部のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質も、顕著な寄生虫増殖抑制活性を引き起こすことが明らかになった。このため、記載されるＭＳＰ−１のＣ末端タンパク質は、顕著な寄生虫増殖抑制活性を惹起する能力が、以前記載されたＭＳＰ−１ベースの組換えタンパク質と比較して機能的に異なるということから、新規なタンパク質である。
【００３８】
以上のように、本発明は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種による感染を予防または減弱する手段としてのワクチン製剤に使用し得る組換えサブユニットタンパク質に関し、それを提供する。記載される組換えサブユニットタンパク質は、マラリア感染により引き起こされる疾患に対する保護作用を与える手段としてアジュバントと組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
上述の説明および以下の実施例は主に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットの発現に関するものであるが、その方法は、他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種にも応用することができる。たとえば、やはりヒトの健康を脅かすＰ．ｖｉｖａｘ種、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ種およびＰ．ｏｖａｌｅ。本明細書に記載のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのコンストラクトに類似のコンストラクトを、マラリア感染により引き起こされる疾患を予防するワクチン用として、それぞれＰ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅおよびＰ．ｏｖａｌｅ向けに開発してもよい。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例は、ＭＳＰ−１ ｐ３３領域由来の配列を選択および除去し、ワクチン候補として増強された免疫原性能力を持つ新規な組換えサブユニットタンパク質を産生するように、選択された配列をＭＳＰ−１ ｐ１９コア領域に連結することが可能であることを実証する。また、新規なＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の発現および分泌は、安定に形質転換された昆虫細胞を使用しても実証される。さらに、発現させたサブユニットタンパク質の精製についても実証される。新規なＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の増強された免疫原性特性を実証する実施例を提供する。下記の結果から、増強された免疫原性能力の選択および実証により、ある特定の免疫応答の喪失から高度に的を絞った免疫応答に至るまでの幅があり得る、ばらつきが大きい結果が得られることが実証される。このため、免疫応答の的をｐ１９コア領域に絞ることを目的としてｐ３３領域から増強配列を選択しても、完全に予測可能であるとは限らず、経験的に決定しなければならない。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の一部は、この新規な組換えタンパク質が中程度の全体的な抗体反応を生じるものの、意外にも、寄生虫抑制活性が５０％より高い、著しく増強された免疫原性特性を誘発することができた。このため、本明細書に記載の本発明は、記載される組換えサブユニットタンパク質の組成物、およびそこから得られる免疫原性特性の点で従来にないものである。
【００４１】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００４２】
（実施例１）
ＭＳＰ−１ ｐ４２のｐ３３領域のＴ細胞エピトープの評価
マラリアワクチンの開発を試みてＭＳＰ−１のｐ１９サブユニットまたはｐ４２サブユニットのいずれかを利用した研究は多くある。上記で検討し、下記でさらに考察するように、これらの各ＭＳＰ−１サブユニットの成功ばかりでなく、これらの各サブユニットの失敗についても報告されている。矛盾した結果のため、インビトロで寄生虫増殖を阻害することができる抗体反応を惹起する際に、または攻撃誘発から動物を保護する際に、抗原として働くその能力に関し、これらのサブユニットのどの領域が最も関係があるかは、不明である。ｐ１９コア領域への増殖抑制抗体の誘導は、ｐ３３領域のヘルパーＴエピトープの特異性により決定されるという仮説が立てられている。この理論を裏付けるものとして、組換えｐ１９サブユニットおよびｐ４２サブユニットが寄生虫増殖抑制抗体を惹起する能力を直接比較した研究が行われた（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ，１９９４）。同じアジュバント（ＦＣＡ）を使用した場合、ｐ１９組換え体およびｐ４２組換え体はどちらも、ＥＬＩＳＡ測定に基づいて、高力価の抗体を惹起した。しかしながら、ｐ４２抗原により生成された抗体は、寄生虫増殖を阻害したのに対し、ｐ１９により生成された抗体は、寄生虫増殖を阻害することができなかった。ｐ１９により生成された抗体は、寄生虫増殖を阻害できなかったものの、寄生虫由来のＭＳＰ−１に結合できる、ｐ４２により生成された抗体は、ｐ１９抗原を用いて交差吸収させることができることが実証された。さらにこの理論を裏付けるものとして、Ｕｄｈａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ（１９９５）による研究により、熱帯熱マラリアが非常に流行している地域であるケニアに住む個体の免疫応答に関してｐ４２領域のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの特徴付けが行われた。この研究では、Ｂ細胞エピトープは主にｐ１９コア領域にあり、増殖応答を与えることができるＴ細胞エピトープは、ｐ３３領域に存在することが明らかにされた。また、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ（２００１）およびＭａｌｈｏｔｒａ ｅｔ ａｌ（２００８）による研究により、ＭＳＰ−１のＣ末端領域の防御免疫応答を増強するのに関与し得る、ｐ３３領域中の他の可能性のあるＴ細胞エピトープも明らかにされた。
【００４３】
これらの研究で同定されたＴ細胞エピトープは、ヘルパーＴ細胞機能を直接与えることについては決定されていない一方で、これらが抗体反応をｐ１９の重要な寄生虫増殖抑制エピトープに集中させることを担い得ることが示唆される。これらの結果は、ｐ３３領域のヘルパーＴ細胞機能の理論を裏付けるものではあるが、動物モデルにおいて寄生虫増殖抑制抗体または防御応答を惹起する能力を増強するように設計された組換えサブユニットの発現に関するデータは、存在しない。
【００４４】
重要なＴ細胞エピトープを保持するｐ３３の適切なセグメントを選択する際の指針となる解析を支援するため、コンピュータプログラムを使用した。最初に、ｐ３３領域について、Ｔ細胞エピトープの確立されたパターンに当てはまる配列の存在を解析した（Ｍａｒｇａｌｉｔ ｅｔ ａｌ，１９８７）。このアルゴリズムは、可能性のあるＴ細胞エピトープを選択するために、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ（１９９０）により書かれたコンピュータプログラムの一部である。この解析の結果、１４個のＴ細胞エピトープが予測された。両親媒性スコアが最も高いエピトープは、ｐ３３のＮ末端の保存された領域にあるエピトープＬＫＰＬＡＧＶＹＲＳＬＫＫＱである。このエピトープをＣＴ（保存されたＴ）と呼ぶ。次に同定されたエピトープは、ｐ１９配列の開始点から７２アミノ酸前に位置するＡＨＶＫＩＴＫＬＳＤＬＫＡＩＤであり、Ｃ７２と呼ぶ。第３のＴ細胞エピトープは、コンピュータプログラムＴＥＰＩＴＯＰＥを用い、ｐ３３領域のＭＨＣクラスＩＩエピトープのさらなる解析を基に同定された（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：５５５−５６１；Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．ａｎｄ Ｒａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７（１２），１２３６−３７）。このエピトープは、ｐ１９配列の開始点から２２アミノ酸前に位置するＬＶＱＮＦＰＮＴＩＩＳＫＬＩＥＧＫであり、ｐ３３−７と呼ぶ。
【００４５】
下記表１は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＭＳＰ−１ ｐ４２のｐ３３領域中の可能性のあるＭＨＣクラスＩＩ Ｔ細胞エピトープを列挙したものである。これらのエピトープは、コンピュータアルゴリズムにより予測されるか、または上記のような公表された報告に基づく。
【００４６】
【表１】
【００４７】
（実施例２）
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質−ｐ３３Ｎ末端切断の発現および分泌
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の第１群は、動物モデルにおいて寄生虫増殖抑制抗体を惹起する能力を増強し得るｐ３３の領域を規定しようとしており、ＭＳＰ−１ ｐ４２タンパク質のｐ３３領域のＮ末端切断に基づく。切断点は、表１に示した、可能性のある様々なＴ細胞エピトープの位置を参考にした。これらのコンストラクトはＮ末端の欠失に基づくため、保持されたｐ３３の部分は、図３に図示したように、ネイティブなｐ４２と同様にｐ１９領域と隣接した形で共に維持された。Ｎ末端切断に基づき、合計８つのコンストラクト（コンストラクトＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＱ）を作製した。
【００４８】
培養Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞における異種組換えタンパク質の発現および選択用の発現プラスミドの設計を記載する。ＭＳＰ−１ ｐ４２、ならびにコンストラクトＡ、ＢおよびＣの発現は、ｐＭｔｔｂｎｓベースの発現プラスミドを利用して達成した。こうした発現プラスミドに関する詳細については、米国特許第５，５５０，０４３号；同第５，６８１，７１３号；同第５，７０５，３５９号；同第６，０４６，０２５号に記載されている。ｐＭｔｔｂｎｓ発現ベクターは、以下のエレメント：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａメタロチオネインプロモーター（Ｍｔｎ）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナル配列、およびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルを含む（Ｃｕｌｐ ｅｔ ａｌ，１９９１）。また、ハイグロマイシン耐性を付与する選択可能なマーカーとしてｐＣｏＨｙｇｒｏプラスミドも利用する（Ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｒａｔｅｎ，１９８９）。ハイグロマイシン遺伝子は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＣＯＰＩＡ転位因子の長い末端反復配列プロモーターの転写制御下にある。ｐＭｔｔｂｎｓベクターは、外来性のＸｈｏ Ｉ部位を含んでいた１５塩基対のＢａｍＨＩフラグメントを欠失させることにより改変した。ｐＭｔｔΔＸｈｏと呼ばれるこの改変ベクターは、特有のＢｇｌ ＩＩ部位およびＸｈｏ Ｉ部位を利用してインサートを、方向性を持ってクローニングすることができる。
【００４９】
コンストラクトＤ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＱの発現は、プラスミドｐＨＢＩ−１０の誘導体であるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現プラスミドｐＨＢＩ−２０Ｄを用いて達成した。ｐＨＢＩ−１０プラスミドの詳細については、ＰＣＴ出願であるＷＯ／２００８／１３４０６８に記載されている。ｐＨＢＩ−２０Ｄ発現ベクターは、以下のエレメント：合成金属応答近位プロモーター、合成コアプロモーターおよび５’ＵＴＲ、合成分泌シグナル、ならびに最適化した３’ＵＴＲを含む。また、ハイグロマイシンをコードする遺伝子を、発現カセットの下流でｐＨＢＩ−２０Ｄ発現プラスミドに組み込んでいる。ｐＨＢＩ−２０Ｄ発現プラスミドは、目的の遺伝子を特有のＢａｍ ＨＩ部位およびＸｈｏ Ｉ部位に方向性を持ってクローニングできるように設計する。
【００５０】
ＭＳＰ−１ ｐ４２配列の発現のため、ＰＣＲ増幅したフラグメントを調製し、発現ベクターｐＭｔｔΔＸｈｏにクローニングした。ゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）製のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを利用して３種の株（ＦＵＰ、ＮＦ５４（クローン３Ｄ７）およびＦＶＯ）の培養したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生虫から調製した。
【００５１】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅により、コンストラクトＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＱ用の全長ＭＳＰ−１ ｐ４２、およびＭＳＰ−１のＣ末端フラグメントを作製した。増幅したＭＳＰ−１ ｐ４２のＰＣＲフラグメントは、ＦＵＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３７２１３）のＭＳＰ−１のアミノ酸Ａｌａ１３３３からＳｅｒ１７０５をコードする配列を含む。Ｎ末端切断型はすべて、全長ＭＳＰ−１ ｐ４２コンストラクトから増幅した。増幅に使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、適切な制限部位および終止コドンもコードしていた。コンストラクトＢは、実施例１に記載したＣＴエピトープをコンストラクトＡのＮ末端に融合してある点で、どれもｐ４２に由来する隣接配列を持つ他のＮ末端切断サブユニットと異なる。
【００５２】
ＰＣＲ増幅は、高忠実度Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の使用により達成した。得られたＰＣＲ増幅フラグメントを適切な制限酵素で消化し、Ｂｇｌ ＩＩおよびＸｈｏ Ｉで消化したｐＭｔｔΔＸｈｏベクターに挿入するか、またはＢａｍ ＨＩおよびＸｈｏ Ｉで消化したｐＨＢＩ−２０Ｄベクターに挿入した。すべてのコンストラクトの接合部および全インサートを配列決定して、導入されている様々な構成要素が正しく、かつ適切なリーディングフレームが保存されていることを確認した。
【００５３】
ＡＴＣＣから入手したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｓ２細胞（「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞」、または単に「Ｓ２細胞」。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９７２）を利用した。細胞は、Ｅｘｃｅｌｌ ４２０培地での増殖に適応しており、すべての手順および培養をこの培地で行う。細胞は、５日から７日の間で経過させ、典型的には１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、２６℃でインキュベートする。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質のコード配列を含むすべての発現プラスミドを、リン酸カルシウム法によってＳ２細胞に形質転換した。ｐＭｔｔΔＸｈｏプラスミドを使用した場合、ハイグロマイシンＢで選択するため、ｐＣｏＨｙｇｒｏが０．５μｇに対して発現プラスミドが１０μｇの比率でｐＣｏＨｙｇｒｏプラスミドを用いて細胞を同時形質転換した。ｐＨＢＩ−２０Ｄプラスミドを使用した場合、このプラスミドにはハイグロマイシン遺伝子が導入されているため、１０μｇの発現プラスミドでのみ細胞を形質転換した。形質転換後、０．３ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンに耐性がある細胞を選択した。一旦安定な細胞株が選択されたら、適切な産物を発現しているかについてこれらを評価した。５ｍＬの培養液を２×１０６細胞／ｍＬで播種し、０．２ｍＭのＣｕＳＯ４で誘導し、２６℃で７日間培養した。細胞の除去後、培養培地のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に供して、様々なＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の発現を評価した。
【００５４】
予備的な抗原性試験および免疫原性試験には、発現させたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の迅速な精製手段として、免疫親和性クロマトグラフィー（ＩＡＣ：ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法を利用した。ｐ４２特異的ＩＡＣカラムの調製には、ＭＳＰ−１コンフォメーション感受性ｍＡｂ５．２を使用した（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ １９８７、およびＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ １９９２）。製造者（Ｕｎｉｓｙｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）の推奨に従い、Ｃｅｌｌ Ｐｈａｒｍ１０００中空糸型バイオリアクターを用いて十分な量のｍＡｂ５．２を作製した。ｍＡｂ５．２ハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣから入手し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｈｏｐｋｉｎｓ，ＭＡ）で増殖させた。培地には、フラスコでの増殖の場合１０％のＦＢＳ、および中空糸型バイオリアクターでの増殖の場合５％ＦＢＳを補充した。バイオリアクターを２５日間運転し、総収量５７ｍｇを得た。カラムマトリックス（活性化Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−ＨｉＴｒａｐ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）１ｍＬ当たり１０ｍｇの親和性精製したＭＡｂ５．２をカップリングすることにより、ベッド容量２ｍＬのカラムを作製した。ＩＡＣカラムを２００ｍＬの清澄にした培養培地で１分当たり１ｍＬの速度で灌流した。１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２で洗浄後、抗原を１００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。溶出産物を１Ｍのトリス、ｐＨ７．５（最終濃度０．２Ｍ）で中和させ、ＮａＣｌを、最終濃度１５０ｍＭになるように加えた。次いでサンプルの緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ」）に交換し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて膜限外濾過により濃縮した。
【００５５】
図４、図５および図６に、Ｎ末端コンストラクトを示す。図６に示すように、Ｎ末端切断コンストラクトを群１と呼ぶ。群１のコンストラクトは、ネイティブなｐ４２配列と同様にｐ１９の直前に、ｐ３３のＣ末端の単一の連続部分を保持する任意のコンストラクトと定義される。Ｎ末端が切断された群１コンストラクトは、これらのサブユニットが細胞プロセシングに起因して自然界に見出されないという点で新規なＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットの代表である。
【００５６】
（実施例３）
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質コンストラクトＡ、ＢおよびＣの免疫原性の評価
ｐ３３ Ｎ末端切断（群１）に基づくＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現させたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の免疫原性を、マウスおよびウサギにおいて評価し、それらのタンパク質が増強されたか免疫原性能力を有するかどうかを決定した。最初の実験ではすべて、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ：Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）またはＩＳＡ５１のいずれかを利用してサブユニットタンパク質を送達した。
【００５７】
マウスに、精製されたサブユニットタンパク質を用量１０μｇで、４週間間隔にて３回腹腔内免疫した。各投与から３週間後にマウスから採血した。次いで血清を、抗ｐ１９および抗ｐ４２抗体力価についてＥＬＩＳＡにより評価した。ニュージーランド白ウサギについては、用量５０ｇにて筋肉内経路により４週間間隔で４回免疫した。最初の３回の投与から２週間後、４回目の投与から３週間後および４週間後にウサギから採血した。次いで血清を、ＥＬＩＳＡにより抗ｐ４２抗体力価について評価した。ウサギからの血清はまた、寄生虫増殖活性についてインビトロアッセイでも試験した（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，（１９８７）６４：５１９−５２２）。簡単に説明すると、寄生虫増殖抑制活性をアッセイするため、３０％の最終濃度になるように血清サンプルを培養培地に加え、当初０．５％の寄生虫血となるように調整された感染ヒト赤血球とともにインキュベートする。本アッセイでは、ヒト血清で増殖できるように適合されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ３Ｄ７寄生虫を利用する。次いで培養液を７２時間インキュベートし、培養赤血球のギムザ染色した薄層塗抹標本の寄生虫血を顕微鏡により決定する。阻害パーセントを、対照血清サンプル（同じ動物からあらかじめ採血しておいたもの）の寄生虫血から試験サンプルの寄生虫血を差し引いたものを、対照血清サンプルの寄生虫血で割り、その商に１００を掛けて算出する。
【００５８】
フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とともに配合したＭＳＰ−１ ｐ４２を用いてウサギを免疫する場合に得られる結果の例を表２に示す。ＭＳＰ−１ ｐ４２で免疫されたウサギの結果から、ｐ４２ワクチン製剤が適切な免疫応答、高いＥＬＩＳＡ力価、および５０％より高い寄生虫増殖抑制力価を惹起する可能性があることが実証される。これらの結果は、ＦＣＡなどの強力なアジュバントでしか達成できない。しかしながら、ＦＣＡは、ヒトに使用するのに好適ではないため、これらの結果は、ヒトにとって可能性のあるワクチンの製剤を説明するものではない。ヒトに使用できる可能性がある他のアジュバントを使用すると、免疫時の全体の抗体力価は十分であるものの、寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が一貫しない。したがって、一貫して強力かつ特異的な免疫応答、寄生虫増殖抑制抗体を誘導できる、組換えサブユニットタンパク質の免疫原性能力を増強する別の手段を開発する必要がある。
【００５９】
【表２】
【００６０】
表３に、コンストラクトＡ、ＢおよびＣについてのＥＬＩＳＡのデータを示す。特異的抗体反応ではなく全体的な抗体反応のみを測定するＥＬＩＳＡ力価を基準にすると、コンストラクトＣが最も強力かつ一貫した免疫応答を引き起こす。
【００６１】
【表３】
【００６２】
表４には、コンストラクトＡ、ＢおよびＣについての寄生虫増殖抑制データを示す。特異的抗体反応を測定する抑制データを基準にすると、コンストラクトＡおよびＢが、ｐ１９サブユニットおよびｐ４２サブユニットによく見られるように一貫してはいないものの、免疫された動物に特異的な応答を引き起こすことができた。一方、コンストラクトＣは、感知できる抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を何ら生成できなかった（アッセイの変わりやすさを勘案して、５０％より高い結果のみを有意とみなす）。コンストラクトＣからの結果は、まったく予想外であった。この結果の以前には、重要な作業上の前提は、特異的な抑制抗体の生成には、全体的な抗体力価が一貫して高いことが必須であるということであった。さらに、コンストラクトＣからの結果は、寄生虫増殖抑制の能力がある抗ｐ１９抗体の生成を抑制し得るｐ３３配列が存在することを強く示唆した。これは、コンストラクトＣ中のｐ３３セグメントが、ＰＲＯＰＥＤ（ＴＥＰＩＴＯＰＥ）アルゴリズム（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２００１）１７：１２３６−７；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１７：５５５−６１）により予測された予測Ｔ細胞エピトープ（表１中の、および図３および４に示す通りの、ｐ３３−７）を持つという事実にもかかわらずである。
【００６３】
【表４】
【００６４】
コンストラクトＡ、ＢおよびＣからの寄生虫抑制の結果から、可能性のあるＴ細胞エピトープの予測のみに基づいて作製されたＭＳＰ−１のＣ末端コンストラクトでは、ｐ１９領域に特異的な増強された免疫応答を確実に引き起こすには不十分であることが実証される。実際、コンストラクトＣに伴う予想外の結果からは、予想エピトープの少なくとも１つであるｐ３３−７が、所望の特異的抗体反応を著しく抑制し得ることが実証された。したがって、免疫能力の増強を有するコンストラクトの適切な性質を予測するには、どの配列が増強する可能性があり、どの配列が抑制する可能性があるかを選別するためにかなりの実験を行うことが不可欠である。
【００６５】
（実施例４）
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質−ｐ３３連結配列の発現および分泌
動物モデルにおいて寄生虫増殖抑制抗体を惹起する能力に関わる抑制配列または外来性配列を除外しつつ増強配列を連結する試みにおいて、ＭＳＰ−１ ｐ４２タンパク質のｐ３３領域からの不連続なセグメントの組み合わせに基づき、さらなるＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質を作製した。群１のコンストラクトと同様に、ｐ３３セグメントの選択については、表１に示した、可能性のある様々なＴ細胞エピトープの位置をある程度参考にした。非連続なセグメントを含む３種類の異なるコンストラクト群（群２、群３および群４）を作製した。群２のコンストラクトには、既知のＴ細胞エピトープを含むフラグメントを選択したのに加えて、さらに２つの設計基準が存在した。その第１は、コンストラクトＣのｐ３３セグメントが抑制配列を含むという実施例２のデータに基づき、このセグメントを除外することであった。第２は、２〜３のフラグメントのみを連結することであった。群２のコンストラクトはｐ３３の不連続なセグメントに基づくため、ｐ３３配列をｐ１９に連結して得られたコンストラクトは、組み合わせた配列が自然界に見出されないという点で新規なコンストラクトである。群２のコンストラクトは、合計７つ作製した。６つのコンストラクト（コンストラクトＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、ＭおよびＰ）は、ｐ３３セグメントの様々な組み合わせとｐ１９領域との連結、およびコンストラクトＣ領域の除外に基づくものであった。１つのコンストラクト（コンストラクトＨ）は、コンストラクトＣ領域の除外にのみ基づくものであった。群３のコンストラクトは、ｐ３３領域の保存されたすべてのフラグメントの連結に基づくコンストラクトＮ、あるいは、すべての非保存フラグメントの連結に基づくコンストラクトＯのどちらかであった。これらのコンストラクトはどちらも、合成法により作製した。群４は、１つのコンストラクト（コンストラクトＲ）のみを含む。予備データに基づき、コンストラクトＩ、ＫおよびＬから選択されたフラグメントを選択して組み合わせた。
【００６６】
群２、群３および群４のコンストラクトではすべて、実施例１に記載したｐＨＢＩ−２０Ｄ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現プラスミドを使用した。群２および群４のコンストラクトの作製には、ｐＨＢＩ−２０Ｄ−ｐ１９ベースのプラスミドを最初に構築した。ｐＨＢＩ−２０Ｄ−ｐ１９ベースのプラスミドは、全長ｐ１９配列を含み、その直後にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーをコードする配列がある。この配列は、特有のＫｐｎ Ｉ制限部位を含んでおり、ｐ３３配列をｐ１９配列とインフレームで連結するのに利用した。また、ｐＨＢＩ−２０Ｄの分泌シグナル配列の末端の典型的なクローニング部位であるＢａｍ ＨＩ部位をＮｈｅ Ｉ部位に改変して、組み合わせた様々なｐ３３配列のマルチクローニング事象を可能にした。発現コンストラクトは、発現ベクターｐＨＢＩ−２０Ｄ−ｐ１９に、ＰＣＲ増幅フラグメントを直接クローニングするか、または化学的に合成されたフラグメントを含むシャトルベクター由来のフラグメントをサブクローニングすることにより作製した。ｐ３３の非連続なセグメントが複雑であるため、合成的に作製した群３のコンストラクトでは、合成の際にｐ１９領域も含ませた。したがって、群４のコンストラクトではｐ３３フラグメント間、またはｐ３３領域とｐ１９領域との間にリンカー配列が存在しない。この合成フラグメントは、適切な制限酵素を用いてｐＨＢＩ−２０Ｄに直接クローニングした。
【００６７】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび合成配列は、ＦＵＰ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３７２１３）を基に設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＭＳＰ−１に特異的な配列に加えて適切な制限部位をコードしていた。連結されるセグメントでは、フラグメントの５’末端をＳｐｅ Ｉ部位（Ｎｈｅ Ｉと適合性）を用いて設計し、フラグメントの３’末端を、ｐＨＢＩ−２０−ｐ１９のクローニング部位に相当するＫｐｎ Ｉ部位を用いて設計した。２つのｐ３３フラグメントを組み合わせた場合、連結を可能にするために適切な末端でＢａｍ ＨＩ部位を設計することによりそれらを連結した。ＰＣＲ増幅、クローニング、およびＳ２細胞の形質転換は、実施例２に記載されているように達成した。発現させたサブユニットタンパク質は、実施例２に記載されているようにＩＡＣ法により精製した。
【００６８】
群２、３および４を代表するｐ３３連結コンストラクトを図４、図５および図６に示す。群２のコンストラクトは、ｐ３３の１つまたはそれより多くの不連続なセグメントをｐ１９領域に連結した任意のコンストラクトと定義される。ｐ３３配列をｐ１９に連結して得られたコンストラクトは、組み合わせた配列が自然界に見出されないという点で新規なコンストラクトである。
【００６９】
（実施例５）
マウスにおけるＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の免疫原性の評価
ｐ３３連結配列に基づく、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現させたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質（群２）の免疫原性を、マウスおよびウサギにおいて評価し、それらのタンパク質が増強された免疫原性能力を有するかどうかを決定した。最初の実験ではすべて、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）またはＩＳＡ５１のどちらかを利用してサブユニットタンパク質を送達した。
【００７０】
マウスおよびウサギの免疫ならびに免疫応答の評価を、実施例３に記載されているように行った。群２のコンストラクトの抗体力価を図７に示す。これらの結果から、これらのコンストラクトにより誘導される抗体力価には、様々なレベルが存在し、コンストラクトＨおよびＩの抗体力価が最も高く、コンストラクＪの抗体力価が最も低いことが示される。
【００７１】
【表５】
【００７２】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現させたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の免疫原性は、群１および群２どちらも、ＥＬＩＳＰＯＴ法を用いた、初回免疫したマウス脾細胞からのサイトカイン産生を基にした。マウスの免疫は、実施例３に記載されているように行った。免疫過程の後、各群から一部のマウスを最終投与から７日後に屠殺し、その脾臓を取り出した。脾細胞を培養し、ＥＬＩＳＰＯＴ法によるサイトカイン解析に使用した。免疫された各群の培養脾細胞を、免疫に使用したのと同じ精製された抗原調製物で刺激した。抗原刺激後、細胞のインターフェロン−γおよびインターロイキン−４の産生について解析した。この解析の結果を図８に示す。
【００７３】
群１および群２のＥＬＩＳＰＯＴ解析に基づき、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質には、インターフェロン−γおよびＩＬ−４の産生で見て、２つの群間に明らかな相違があることが分かる。群１のコンストラクトで初回免疫した脾細胞は、刺激時のＩＬ−４の反応が強く、一般にインターフェロン−γの反応が弱い。一方、群２のコンストラクトで初回免疫した脾細胞は、刺激時の反応が正反対であり、インターフェロン−γの反応が強く、ＩＬ−４の反応が弱い。これらの結果から、コンストラクトの２つの群間に顕著な相違があることが確認されるが、その相違の本質は、現時点では不明である。メカニズムは明らかでないものの、群２のコンストラクトのｐ３３−７エピトープの除去が、群１におけるＩＬ−４の強い反応から群２におけるＩＬ−４の弱い反応への変化に役割を果たしている可能性が強い。さらに、このデータから、適切な反応を惹起するのに必要な免疫応答を理解するには、複数レベルの実験が必要とされることも裏付けられる。
【００７４】
（実施例６）
ウサギにおけるＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の免疫原性の評価
最終目的は、どのＭＳＰ−１のＣ末端コンストラクトが、強力で一貫した寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作るかを決定することであることから、この解析を行うため、選択されたコンストラクトを用いてウサギを免疫した。コンストラクトは、実施例３、５および６に示した結果に基づき選択した。
【００７５】
実施例３に記載されているように、ニュージーランド白ウサギの群を免疫した。実施例３に記載されているように、寄生虫増殖抑制アッセイを行った。
【００７６】
結果を下記表Ｘに示す。
【００７７】
【表６】
【００７８】
【表７】
【００７９】
【表８】
【００８０】
【表９−１】
【００８１】
【表９−２】
【００８２】
【表９−３】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって支援された研究に関する言及
本発明は、契約番号１Ｒ４３−ＡＩ５１０２１−０１（ＮＩＨ）およびＲ２１ＡＩ０７６９５５−０１（ＮＩＨ）による政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
技術分野
本発明は、マラリアから保護するためのワクチンとして使用されるように設計された組換えサブユニットタンパク質に関する。特に、この組換えサブユニットタンパク質は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのメロゾイト表面タンパク質１（「ＭＳＰ−１：ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １」）のＣ末端領域に由来し、その免疫原性能力（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を増強するためさらに修飾されている。ＭＳＰ−１のＣ末端領域のコアは、ｐ１９である。ｐ１９コア領域は、寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の標的であるエピトープを含む。しかしながら、ｐ１９コア領域それ自体は、免疫原性が低い。ｐ１９コア領域の直前にある、ＭＳＰ−１のｐ３３領域がＴ細胞エピトープを含むことが明らかになっている。こうしたＴ細胞エピトープは、ｐ１９コア領域に対する抗体反応を増強し得ると考えられている。増強されかつ一貫した免疫応答を惹起できる組換えタンパク質に関して可能なこうしたＴ細胞エピトープの機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ）および有用性については、まだ十分に明らかにされていない。本出願では、ＭＳＰ−１のｐ３３領域に由来するセグメントを選択的に付加することにより、ｐ１９コア領域の免疫原性能力を増強している。こうした選択されるセグメントは、免疫原性能力が増強された新規なタンパク質を産生するようにｐ１９コア領域に連結されている。こうした新規なタンパク質は、自然界に見出されない。免疫原性能力が増強された組換えサブユニットタンパク質は、細胞産生系を用いて産生され、精製後、適切な免疫応答を起こすワクチンとして製剤化される。増強された組換えサブユニットタンパク質は、産生される寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が一貫してないかまたは減少する他のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットと比較して強い寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を誘導することが明らかにされている。増強されたサブユニットタンパク質は、マラリアから保護するためのヒトのワクチンとして使用される可能性がある。
【背景技術】
【０００３】
関連技術
マラリアの年間発生数は２億５０００万症例であり、毎年１００万人を超える人が死亡していると推定される（ＷＨＯ，２００８（非特許文献１））。大部分の症例はアフリカで発生しているとはいえその脅威は、世界の他の多くの熱帯地域および亜熱帯地域に広がっている。世界中で約３０億人に感染のリスクがある。現時点で、媒介する蚊および寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍはどちらも従来の防除対策に対して耐性を示すようになっているため、この疾患の拡散を制御することが強く求められている。過去１０年から１５年においては、寄生虫の様々な発育段階に対するマラリアワクチンの開発に主に焦点が当てられてきた。組換えサブユニットのマラリアワクチンのための科学技術を確立すべく多くの努力が試みられ、いくつかの候補サブユニットが臨床試験に入ってはいるものの、組換えサブユニットタンパク質技術に基づく有効なマラリアワクチンはまだ十分に実現していない。スポロゾイト周囲段階のマラリアを標的とする候補ワクチンの１つが臨床試験（ｔｒａｉｌ）で依然として評価されているが、ワクチンとして認可される可能性に関しては意見が一致していない。メロゾイト段階の寄生虫を標的とする臨床試験（ｔｒａｉｌ）のワクチン候補は、これまで成功していない。このため、マラリアに使用できる認可ワクチンはまだ存在しない。
【０００４】
マラリア寄生虫には多くの種があり、各種は、明確な宿主域を有する。ヒトに感染する種は複数ある。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、ヒトに疾患を引き起こす主要な種である。本明細書では、「寄生虫」という用語は、他に記載がない限り、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を意味する。
【０００５】
マラリア寄生虫の生活環は複雑である。この寄生虫は、その生活環の多くの段階の間に多くの発育変化および形態学的変化を経る。この生活環は、感染した蚊が宿主にスポロゾイトを注入したときから始まる。スポロゾイトは、すぐに肝実質細胞に入り、その後発育して肝臓シゾントになる。成熟すると、メロゾイトが血流に放出される。次いでメロゾイトは、赤血球に侵入し、そこで感染細胞が破裂するまで無性生殖的に増殖し、さらなるメロゾイトが放出され、その後、このさらなるメロゾイトが次の赤血球に侵入する。メロゾイトの増殖および赤血球の溶解は、マラリアの臨床症状と関連している。一部のメロゾイトは、さらに発育して雌性生殖母細胞および雄性生殖母細胞となり、次いでこれらの生殖母細胞は、感染した個体を刺す蚊により取り込まれる。一旦蚊の中に入ると、雌性生殖体が雄性生殖体によって受精してさらに発育して、スポロゾイト段階の寄生虫になる。こうして、この生活環が再び開始されるようになる。この生活環は、３つの段階（前赤血球段階、無性生殖赤血球段階および有性生殖段階）に分類される。ワクチン開発に関して、これらの３つの段階をしばしばスポロゾイトまたは肝臓段階（前赤血球段階）、血液段階（無性生殖赤血球段階）および伝搬阻止（有性生殖段階）という。
【０００６】
マラリアワクチンの開発の可能性はあるものの、過去１０年の努力から、こうしたワクチンの開発が困難な作業であることが証明された。マラリアワクチン候補としてのタンパク質の同定および開発に関しては、進展している。マラリアワクチンに使用するためのタンパク質を選択する主な手段は、ヒト免疫血清に反応するものをスクリーニングすることによって行われてきた。こうして、生活環段階のそれぞれでいくつかのタンパク質をワクチン候補として同定してきた。ワクチン候補に進んだこれらのタンパク質の大部分は、寄生虫の表面に発現されるタンパク質である。抗原の供給源として寄生虫を培養することは難しいため、マラリアワクチンの開発は、組換えＤＮＡなどの別の方法に頼らざるを得なかった。この技術は、重要なペプチド配列を明らかにし、サブユニット抗原を発現させて、ＤＮＡベースのワクチンを開発するのに利用され成功している。
【０００７】
各発育段階の寄生虫を標的とするマラリアワクチンを開発する試みが進行中であるが、血液段階は、疾患の症状が引き起こされる段階であるため、血液段階を標的とするワクチンが、最も大きな影響を与える可能性がある（Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ，１９９８（非特許文献２））。同定されている多くの血液段階抗原の中で詳細に研究されてきたのが、主要なメロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）である。
【０００８】
ネイティブなＭＳＰ−１タンパク質の分子量は、約１９５ｋＤである。このタンパク質は、メロゾイトの表面に突き出て提示される膜アンカー型分子である。このタンパク質は、４つの主要なフラグメントにプロセシングされ、これらは、その相対分子量により、ｐ８３、ｐ２８、ｐ３８およびｐ４２と呼ばれる（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ，１９８４（非特許文献３），Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８６（非特許文献４）およびＨｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ １９８７（非特許文献５））。必ずしもすべてのフラグメントの機能が明らかになっているわけではない。メロゾイトの表面に固定されるＣ末端ｐ４２フラグメントは、ｐ３３およびｐ１９と呼ばれる２つのフラグメントにさらにプロセシングされることが決定されており、このプロセシングが赤血球への侵入に必須であることもまた決定されている（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９０，１９９１（非特許文献６および７）およびＢｌａｃｋｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｄｅｒ，１９９２（非特許文献８））。ＦＵＰ株のＭＳＰ−１ ｐ４２のアミノ酸配列を図１に示す。
【０００９】
いくつかの知見から、ＭＳＰ−１が重要なマラリアワクチン候補であることが裏付けられている。サルを培養寄生虫由来のＭＳＰ−１で免疫すると、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの攻撃誘発から保護できることが実証されている（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ １９８４（非特許文献３），Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ １９８７（非特許文献９），およびＥｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ １９９１（非特許文献１０））。また、ＭＳＰ−１の様々な部分を代表する組換えまたは合成のペプチドも、誘発試験で様々なレベルの保護作用を惹起することが示されている（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ，１９８４（非特許文献３），Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ，１９８６（非特許文献１１），Ｐａｔａｒｒｏｙｏ ｅｔ ａｌ，１９８７（非特許文献１２），Ｈｅｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ，１９９０（非特許文献１３），Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，１９９５（非特許文献１４），およびＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献１５），Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，２０００（非特許文献１６），Ｓｔｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２００１（非特許文献１７），Ｄａｒｋｏ ｅｔ ａｌ，２００５（非特許文献１８））。さらに、流行地域に住んでいるヒトから採取した血清の解析からは、ＭＳＰ−１のＣ末端領域に対するＩｇＧ抗体の産生が、熱帯熱マラリアに対する臨床免疫の発生と相関することも示されている（Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ，１９９２（非特許文献１９），Ｓｈａｉ ｅｔ ａｌ，１９９５（非特許文献２０），Ａｌ−Ｙａｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献２１），およびＳｈｉ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献２２））。最後に、ＭＳＰ−１に対するモノクローナル抗体がインビトロで赤血球への寄生虫の侵入を防ぐことができることが証明されている（Ｐｉｒｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｋｉｎｓ，１９８５（非特許文献２３）、およびＢｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９０（非特許文献６））。
【００１０】
ＭＳＰ−１のＣ末端ｐ４２フラグメント、およびそのプロセッシングされたｐ１９フラグメントは、ＭＳＰ−１タンパク質に由来する代表的なサブユニットワクチン候補として同定されている。ｐ１９コア領域の配列（図１に太字の斜体で示す）は、様々なＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株で高度に保存されている。図２は、３種のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株（ＦＵＰ、３Ｄ７およびＦＶＯ）からのＭＳＰ−１ ｐ４２タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを提供する。ｐ３３領域は、ＦＵＰ株と３Ｄ７株との間で保存されている。しかし、ＦＶＯ株のｐ３３は、他の２種のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株とはかなり異なる。ｐ１９コア領域は、３種の株間で高度に保存されており、６つのジスルフィド架橋をさらに含み、これが、２つの上皮増殖因子様ドメインを表す高度に折りたたまれた構造をもたらす（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９１（非特許文献７））。ｐ１９コア領域に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、インビトロで寄生虫の発育を阻害することが示されている（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９０（非特許文献６），Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９２（非特許文献２４），Ｃｈａｐｐｅｌ ａｎｄ Ｈｏｌｄｅｒ，１９９３（非特許文献２５））。
【００１１】
ＭＳＰ−１のｐ４２フラグメントまたはｐ１９フラグメントをベースにした組換えサブユニットワクチンを開発する試みにおいては、いくつかの異なる異種タンパク質発現系を利用してきた。Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母およびバキュロウイルスのベクター系を用いたこれらのサブユニットの発現については以下にまとめてある。Ｅ．ｃｏｌｉにより抗原を発現させる初期の試みでは、免疫時にネイティブなタンパク質に反応する抗体はごく低レベルでしか誘導されなかった（Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８８（非特許文献２６），Ｂｕｒｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献２７））。したがって、現在、大部分の試みは、適切な免疫応答を誘発する可能性がより高い、より適切な産物を作製する試みにおいて、ＭＳＰ−１サブユニットのネイティブと同様の折り畳みを誘導する能力がある発現系に焦点を合わせている。
【００１２】
より高い抗原性能力を持つ、よりネイティブに近いＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質の発現は可能ではあるものの、これまでの試みにより得られたのはどれも、一貫していない、および／または関係のない抗体反応である。たとえば、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ（１９９５）（非特許文献１４）は、酵母で発現させたｐ１９サブユニットでヨザル（Ａｏｔｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）を免疫した場合に、保護作用があることを証明することができた。しかしながら、必ずしも免疫したすべてのサルで保護作用が達成されたわけではないことから、ｐ１９サブユニットによる免疫応答が一貫しないことが実証された。さらに、保護したサルからの血清は、インビトロで寄生虫増殖を阻害することができなかったことから、免疫応答の質（抗体特異性）も期待通りではないことが示唆された。別の一連の例では、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９６）６４：２５３−２６１（非特許文献１５）および米国特許第６，８５５，３１６号（特許文献１））は、バキュロウイルス系で産生されたｐ４２産物を用いてヨザルにおける保護作用を証明することができた。しかしながら、この保護作用は、必ずしもすべての動物が保護されたわけではないため、一貫したものではなかった。これは、保護されたサルの血清がインビトロで寄生虫の増殖を阻害できたという事実にもかかわらずであった。なお別の例では、Ｄａｒｋｏ ｅｔ ａｌ（２００５）（非特許文献１８）は、ヨザルの攻撃誘発モデルを用いて、バキュロウイルスで発現させたｐ４２産物の有効性を評価した。抗体反応は比較的高レベルではあったものの、このバキュロウイルスで発現させたｐ４２産物は、攻撃誘発時にごくわずかの保護作用しか提供しなかった。最後に、Ｅ．ｃｏｌｉで産生し、第ＩＩ相臨床試験に入ったｐ４２産物（Ｏｇｕｔｕ ｅｔ ａｌ，２００９（非特許文献２８））は、免疫応答が低く、一貫していないため、現在中止されている。これらの例から、ＭＳＰ−１のＣ末端領域由来の、有効なワクチン候補である組換えサブユニットタンパク質を製造するための解決策がまだ実現していないのは明らかである。
【００１３】
前述のように、ＭＳＰ−１ ｐ４２フラグメントは、ｐ３３フラグメントおよびｐ１９フラグメントから構成される。メロゾイトの表面に固定されたＭＳＰ−１ ｐ１９コア領域は、メロゾイトの赤血球侵入の過程で必要とされるエレメントであるのに対し、ｐ３３フラグメントは、メロゾイトが赤血球に結合すると血漿に放出される。ｐ１９フラグメントは、赤血球侵入の際に役割を果たすほか、インビトロでの寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の標的でもある。ｐ３３フラグメントの役割は、不明である。
【００１４】
ｐ３３領域内では、いくつかのＴ細胞エピトープが同定されており（Ｕｄｈａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，１９９５（非特許文献２９）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２００１（非特許文献３０）；Ｍａｌｈｏｔｒａ ｅｔ ａｌ，２００８（非特許文献３１））、ｐ３３が、ｐ１９に欠けているヘルパーＴエピトープを与えることにより、防御免疫を誘発する際に間接的な役割を果たしていることが示唆されている（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６（非特許文献３２）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２００１（非特許文献３０））。臨床試験からは、メモリーＴ細胞応答がＭＳＰ１−４２ワクチン接種により誘発され、これらの応答がＭＳＰ１−３３フラグメントに局在していることが示されている（Ｈｕａｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００８（非特許文献３３））。しかしながら、組換えサブユニットタンパク質および能動免疫に関して、ｐ１９に特異的な抗体反応を増強するＴ細胞エピトープの能力は実証されていない。
【００１５】
有効な候補ワクチンとしての組換えＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の可能性を実現するには、さらなる研究を必要とする重要な課題が存在する。第１に、特異的な防御抗体反応の惹起に関する、ＭＳＰ−１のＣ末端領域のうちの適切な免疫原性セグメントを同定する必要がある。特異的な防御抗体とは、インビトロで寄生虫増殖を阻害することができる抗体である。第２の研究領域は、所望の適切な特異的応答の惹起を妨げる応答を引き起こす、無関係な免疫原性セグメントの同定を含む。第３の研究領域は、ワクチン候補としての免疫原性能力を増強した組換えサブユニットタンパク質産物を産生するような様式でＭＳＰ−１のＣ末端領域由来の不連続な配列の連結を評価することを含む。
【００１６】
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質とは、ＭＳＰ−１ ｐ１９コア領域と、ｐ３３配列が自然状態のように隣接しているか、または、新規なタンパク質を作製する場合のように隣接していないか否かに関わらず、ＭＳＰ−１ ｐ３３領域由来の追加配列とを含む、任意の組換えタンパク質と定義される。
【００１７】
増強されたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質を開発する最初の試みではまず、ｐ３３領域のＮ末端の切断をベースに３つのコンストラクトを作製した。切断点は、ｐ３３中の推定Ｔ細胞エピトープに基づいた。１つのコンストラクトでは、この切断形態にｐ３３領域由来の追加のエピトープを連結した。これらの３つのコンストラクトの最初のデータでは、寄生虫抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に免疫増強が認められなかったため、増強配列の存在を実証することができなかった。これら最初の３つのコンストラクトＡ、ＢおよびＣの配列を図３に示す。意外にも、コンストラクトＣのその後のデータから、このコンストラクトの３１アミノ酸のｐ３３セグメントは、抗体反応は全体として強かったものの、寄生虫増殖の抑制抗体に関する免疫応答を抑制する配列（単数または複数）を含むことが示唆された。
【００１８】
このため、ＭＳＰ−１のＣ末端領域の使用をベースにした有効なマラリア組換えサブユニットワクチンをさらに開発するには、組み合わせた配列が、増強された免疫原性特性を持つような様式でｐ１９コア領域と組み合わせることができるように、ｐ３３領域内で適切な配列を同定する必要がある。さらに詳しくは、増強された免疫原性特性とは、インビトロで寄生虫増殖を抑制でき、マラリアにより引き起こされる疾患に対する保護作用を与えることができる、一貫して特異的な抗体を誘導する能力をいう。さらに、増強配列の能力を十分に実現するには、増強特性を持つ配列の免疫原性能力を阻害する配列を除去することも重要である。
【００１９】
「抑制」ｐ３３配列の選択的な除去に加えて、「増強」ｐ３３配列を選択し、「増強」配列をｐ１９コア領域に連結して、霊長類動物モデルおよびヒトにおいて一貫して増強された防御免疫応答を惹起できる新規な組換えタンパク質を作製することが、最終目標である。しかしながら、「増強」配列および「抑制」配列の同定は、これまで報告されていない。したがって、解決すべき技術的課題は、（１）ｐ１９コア領域と組み合わせた場合に免疫応答を増強する推定Ｔ細胞エピトープを含む配列（「増強配列」）を、ｐ３３領域において同定すること、（２）ｐ１９エピトープの免疫原性能力を抑制するｐ３３領域中の配列（「抑制配列」）を同定および除去すること、および（３）ｐ３３領域由来の不連続な増強配列とｐ１９コア領域との連結に基づき、組換えサブユニットタンパク質産物を、細胞ベースの系で効率よく発現させることが可能であるような様式で、組換えサブユニットタンパク質産物を産生する能力を証明することである。こうして産生された組換えサブユニットタンパク質は、これまでのｐ４２ベースのワクチンに見られた課題を解決し、動物モデルおよびヒトにおけるマラリアに対して防御免疫を与える特異的な抗メロゾイト抗体を一貫して誘導する可能性がある。したがって、解決すべき全体的な技術的課題は、免疫原性を増強し、防御有効性を向上させる、ＭＳＰ−１のＣ末端領域に由来する配列に基づき、新規な組換えサブユニットタンパク質の設計、構築および発現を行うことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第６，８５５，３１６号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】ＷＨＯ．（２００８）”Ｗｏｒｌｄ ｍａｌａｒｉａ ｒｅｐｏｒｔ ２００８”
【非特許文献２】Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｎｏｌ． １６：５７−８７
【非特許文献３】Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １１：６１−８１
【非特許文献４】Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＰＮＡＳ ８３：２９８９−２９９３
【非特許文献５】Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ９４： １９９−２０８
【非特許文献６】Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７２：３７９−３８２
【非特許文献７】Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４９：２９−３４
【非特許文献８】Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５０：３０７−３１６
【非特許文献９】Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＰＮＡＳ ８４：３０１４−３０１８．
【非特許文献１０】Ｅｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５９：３４９８−３５０３．
【非特許文献１１】Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＰＮＡＳ ８３：８３２８−８３３２
【非特許文献１２】Ｐａｔａｒｒｏｙｏ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：６２９−６３２
【非特許文献１３】Ｈｅｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ８７：４０１７−４０２１
【非特許文献１４】Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １ ：３２５−３３２
【非特許文献１５】Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４：２５３−２６１
【非特許文献１６】Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６８：２２１５−２２２３
【非特許文献１７】Ｓｔｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． １７（９）：４１５−９
【非特許文献１８】Ｄａｒｋｏ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ７３（１）：２８７−９７
【非特許文献１９】Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４：３２１−３３７
【非特許文献２０】Ｓｈａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７：２６９−２７５
【非特許文献２１】Ａｌ−Ｙａｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ５４：４４３−４４８
【非特許文献２２】Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４：２７１６−２７２３
【非特許文献２３】Ｐｉｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３４： １９４６−１９５１
【非特許文献２４】Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． １４９：５４８−５５５
【非特許文献２５】Ｃｈａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ． ６０：３０３−３１２
【非特許文献２６】Ｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０：６０７−６１７
【非特許文献２７】Ｂｕｒｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６４（９）：３６１４−９
【非特許文献２８】Ｏｇｕｔｕ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ４（３）：ｅ４７０８
【非特許文献２９】Ｕｄｈａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４（１１）：６０２２ ３０
【非特許文献３０】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ６４： １９４−２０３
【非特許文献３１】Ｍａｌｈｏｔｒａ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８０：３３８３−３３９０
【非特許文献３２】Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７： １１７６−１１８３
【非特許文献３３】Ｈｕａｍａｎ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０： １４５１−１４６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の概要
本発明は、動物モデルおよびヒトにおいてマラリアに対して保護するためのワクチンとして好適なものにする増強された免疫原性特性を持つ、組換えサブユニットタンパク質を提供する。この組換えサブユニットタンパク質は、このタンパク質のＭＳＰ−１のＣ末端ｐ１９コア領域、およびＭＳＰ−１のＣ末端ｐ３３領域由来の選択されたセグメントから構成される。選択されたｐ３３セグメントを付加すると、免疫原性特性が増強される。具体的には、増強された免疫原性能力とは、一貫した防御抗体反応を惹起する能力のことである。こうした増強された抗体反応は、インビトロでは寄生虫増殖を阻害し、インビボではマラリア寄生虫により引き起こされる疾患に対する保護作用を与える可能性がある。本発明の組換えサブユニットタンパク質は、形質転換された昆虫細胞のゲノム内に組み込まれた適切な発現カセットのコピーを含む形質転換された昆虫細胞から発現される。昆虫細胞の発現系は、ネイティブと同様のコンフォメーションを持つ組換えサブユニットタンパク質を高収率で与える。具体的には、形質転換された昆虫細胞から組換えサブユニットタンパク質を分泌させ、自然界に見出されない、マラリアＭＳＰ−１のＣ末端領域の新規な形態にする。さらに詳しくは、組換えサブユニットタンパク質は、マラリア寄生虫により引き起こされる疾患に対して保護するための向上させた免疫原性能力を与えるために作製した新規な誘導体である。動物モデルでは、組換えサブユニットタンパク質を用いたワクチン接種により獲得された、免疫原性能力が増強された抗体は、インビトロで寄生虫増殖を阻害することができる。
【００２３】
本発明はまた、哺乳動物宿主のマラリアに対して保護作用を付与することができる抗体の産生を誘発するワクチンとして記載される組換えサブユニットタンパク質を利用するための方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＭＡＤ型のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＦＵＰ株（Ｕｇａｎｄａ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）由来のＭＳＰ−１ ｐ４２のアミノ酸配列。ｐ３３領域は標準字体であり、ｐ１９コア領域は太字の斜体で示す。
【図２】３種のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＦＵＰ、３Ｄ７およびＦＶＯ株由来のＭＳＰ−１ ｐ４２アミノ酸配列のアライメント。ＦＵＰ株と同一の、３Ｄ７およびＦＶＯのアミノ酸を＋記号で示し、ＦＵＰ株と異なるアミノ酸を図示し、ｐ１９コア領域のアミノ酸を太字にしてある。アライメントのギャップは−記号で示す。ｐ１９コア領域は、太字の斜体で示す。
【図３】ＦＵＰのｐ４２配列と比較した、Ｎ末端を切断した３つのサブユニット（コンストラクトＡ、コンストラクトＢおよびコンストラクトＣ）のアミノ酸配列のアライメント。ｐ３３配列のＣＴエピトープ、Ｃ７２エピトープおよびｐ３３−７エピトープを、下線を引いた太字で示す。ｐ１９コア領域は、太字の斜体で示す
【図４−１】ＦＵＰのＭＳＰ−１ ｐ３３配列と比較した、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の全コンストラクトのアミノ酸配列のアライメント。
【図４−２】ＦＵＰのＭＳＰ−１ ｐ３３配列と比較した、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の全コンストラクトのアミノ酸配列のアライメント。
【図４−３】ＦＵＰのＭＳＰ−１ ｐ３３配列と比較した、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の全コンストラクトのアミノ酸配列のアライメント。
【図５】すべてのＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットコンストラクトの図−名前順。
【図６】すべてのＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットコンストラクトの図−群順。
【図７】群２のＭＳＰ−１のＣ末端コンストラクトのＥＬＩＳＡ抗体力価。
【図８】群１および群２のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットのＥＬＩＳＰＯＴ解析。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、ｐ１９コア領域とｐ３３領域の選択されたセグメントとを含む、マラリアＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質を提供する。こうした組換えサブユニットタンパク質は、適切な発現プラスミドで形質転換された安定した昆虫細胞株から産生し、分泌させる。本発明の組換えサブユニットタンパク質で動物を免疫すると、一貫した抗体反応を誘導するのに有効である。特に、これらの抗体反応は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの増殖を阻害することができる。寄生虫増殖を阻害でき、最終的にマラリアから保護することができる抗体を与える特異的で一貫した免疫応答を誘導するには、選択されたｐ３３セグメントをｐ１９コアと組み合わせることが重大である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の組換えマラリアＭＳＰ−１ Ｃ末端サブユニットタンパク質は、自然界に見出される形態を表すＭＳＰ−１ ｐ４２組換えタンパク質と比較して、増強され一貫した免疫応答を惹起できることが実証されている。一層好ましくは、増強された組換えＭＳＰ−１ Ｃ末端サブユニットタンパク質は、一貫した寄生虫抑制抗体反応を惹起することができる。好ましくは、免疫された被験体はすべて、５０％より高いインビトロでの増殖抑制抗体力価を有する。一層好ましくは、免疫された被験体はすべて、６０％より高いインビトロでの増殖抑制抗体力価を有する。なお一層好ましくは、免疫された被験体は、７０％より高いインビトロでの増殖抑制抗体力価を有する。なお一層好ましくは、免疫された被験体は、８０％より高いインビトロでの増殖抑制抗体力価を有する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、「増強」配列は、ＭＳＰ−１のｐ３３領域から選択され、ｐ１９コア領域に連結されて、新規なＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質が作製される。「増強」配列を選択するだけでなく、ＭＳＰ−１のｐ３３領域から「抑制」配列を除去して、新規なＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質の免疫原性能力をさらに増強する。
【００２８】
より好ましい実施形態では、ＭＳＰ−１のｐ１９コア領域に連結している、ｐ３３領域からの選択されたセグメントは、ヘルパーＴ細胞エピトープを含む。こうしたヘルパーＴ細胞エピトープは、増強された免疫応答を、それ自体では免疫原性が低いｐ１９コア領域に向けるのを担っている。一層好ましくは、選択されたｐ３３セグメントは、ｐ１９コア領域に対する抑制抗体の形態で、増強された抗体反応を惹起する能力を阻害または抑制する配列およびまたはエピトープを含まない。したがって、その結果得られる組換えタンパク質は、利益を与えるセグメント（単数または複数）のみが保持され、好ましくない影響を与えるセグメントが除去されているという点でネイティブなｐ３３領域とは異なる。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、組換えマラリアＭＳＰ−１ Ｃ末端サブユニットタンパク質は、ＭＳＰ−１のｐ１９コアと、選択されたｐ３３セグメントとを含み、これらは、組換えタンパク質が細胞ベースの発現系で分泌産物として発現できるように連結されている。その後、分泌された組換えサブユニットタンパク質は、精製され、免疫原として使用される。精製されたタンパク質を動物の免疫に使用すると、免疫応答が増強される。
【００３０】
なお別の好ましい実施形態では、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞を宿主細胞として用いて「ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質」を発現させる。「ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質」とは、ＭＳＰ−１のｐ１９コア領域と、ｐ３３配列が自然状態のように隣接しているか、あるいは、新規なタンパク質を作製する場合のように隣接していないか否かに関わらず、ＭＳＰ−１のｐ３３領域由来の追加配列とを含む任意の組換えタンパク質をいう。これらの「ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質」は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのどのような株に由来してもよい。図４は、本出願で言及される「ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質」のすべてに利用したｐ３３配列のセグメントを示す。
【００３１】
本発明では、ＭＳＰ−１のＣ末端ｐ１９コア領域、およびＭＳＰ−１のＣ末端ｐ３３領域に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｏｒｍ）セグメントを含むサブユニットタンパク質については、標準的な組換えＤＮＡ法を利用して、こうしたタンパク質のコード配列を機能的分泌シグナルと作動可能に連結し、これを、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞内で機能することが証明されたプロモーターの制御下に配置することにより、安定に形質転換されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞から発現および分泌させた。
【００３２】
本明細書に記載の組換えＭＳＰ−１ Ｃ末端サブユニットタンパク質は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ種に由来する３種類の株を代表する。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの２種の株、すなわち、ＭＡＤ型のＦＵＰ（Ｕｇａｎｄａ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ型のＮＦ−５４（クローン３Ｄ７）、およびＫ１型のＦＶＯ（Ｖｉｅｔｎａｍ−Ｏａｋ Ｎｏｌｌ）由来のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質をコードする配列。すべての配列をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現プラスミドにクローニングし、次いでＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞の形質転換に使用した。
【００３３】
このため、本発明のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットはすべて、図５に示すようなＭＳＰ−１のＣ末端ｐ１９コア領域を含むため、関連している。さらに、各コンストラクトでｐ３３配列が異なっている一方、コンストラクトはすべて、ｐ１９コア領域に対する免疫応答の効力および特異性を誘導および増強するように設計されている。ｐ１９コア領域に対する抗体反応の増強される質は、マラリア感染に起因する疾患に対する保護作用を与える能力の増大と関連する。
【００３４】
本発明のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質は、記載されたように選択されたＳ２細胞株から発現および分泌させ、最初にイムノアフィニティークロマトグラフィー法により精製する。精製には、抗ＭＳＰ−１モノクローナル抗体５．２（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９２）（「５．２抗体」または「ＭＡｂ５．２」）を利用する。５．２抗体は、製造者（ＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により推奨される標準的な方法により適切なカラムマトリックスに化学的に結合して好適なカラムを調製する。
【００３５】
好ましくは、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットは、ｐ４２と呼ばれる、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのメロゾイト表面タンパク質の部分に由来し、ＦＵＰ株および３Ｄ７株のｐ４２は、ＭＳＰ−１のアミノ酸Ａｌａ１３３３からＳｅｒ１７０５を含む。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質は、本明細書に記載するように、安定に形質転換された昆虫細胞から組換え技術によって産生および分泌させる。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットは、ＭＳＰ−１のｐ４２領域全体を含んでも、またはその一部を含んでもよい。一層好ましくは、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットは、ネイティブなｐ４２に隣接しているかあるいは隣接していないＭＳＰ−１のｐ３３配列に連結したＭＳＰ−１のｐ１０コア領域を含むが、すべてのＭＳＰ−１、しかし、すべてのＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質領域の長さは、ＦＵＰ株および３Ｄ７株のネイティブなｐ４２より少なくとも２８アミノ酸短い。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットは、Ｋ、ＭＡＤ２０およびＷｅｌｌｃｏｍｅなどのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの３つの対立遺伝子型のほか、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅおよびＰ．ｏｖａｌｅの対立遺伝子型などのいずれに由来してもよい。
【００３６】
すべての実施形態では、発現産物を昆虫細胞分泌経路を通して導き、さらに培養培地に導くことができる機能的分泌シグナルにより、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の分泌を導く。ここで、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の分泌は、ｔＰＡプレ／プロ分泌リーダーおよび合成分泌シグナルを利用して実証される。
【００３７】
驚いたことに、そして非常に高い抗体力価が寄生虫増殖活性の重要な指標であると考えられている、ＭＳＰ−１ ｐ１９およびＭＳＰ−１ ｐ４２の組換えサブユニットに関する以前に記載された報告とは対照的に、本出願に記載された組換えＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットの一部が顕著な寄生虫増殖抑制活性を惹起する能力は、高力価の抗体反応を起こす必要性に左右されない。中程度の抗体力価を惹起した一部のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質も、顕著な寄生虫増殖抑制活性を引き起こすことが明らかになった。このため、記載されるＭＳＰ−１のＣ末端タンパク質は、顕著な寄生虫増殖抑制活性を惹起する能力が、以前記載されたＭＳＰ−１ベースの組換えタンパク質と比較して機能的に異なるということから、新規なタンパク質である。
【００３８】
以上のように、本発明は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種による感染を予防または減弱する手段としてのワクチン製剤に使用し得る組換えサブユニットタンパク質に関し、それを提供する。記載される組換えサブユニットタンパク質は、マラリア感染により引き起こされる疾患に対する保護作用を与える手段としてアジュバントと組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
上述の説明および以下の実施例は主に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来のＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットの発現に関するものであるが、その方法は、他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種にも応用することができる。たとえば、やはりヒトの健康を脅かすＰ．ｖｉｖａｘ種、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ種およびＰ．ｏｖａｌｅ。本明細書に記載のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのコンストラクトに類似のコンストラクトを、マラリア感染により引き起こされる疾患を予防するワクチン用として、それぞれＰ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅおよびＰ．ｏｖａｌｅ向けに開発してもよい。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例は、ＭＳＰ−１ ｐ３３領域由来の配列を選択および除去し、ワクチン候補として増強された免疫原性能力を持つ新規な組換えサブユニットタンパク質を産生するように、選択された配列をＭＳＰ−１ ｐ１９コア領域に連結することが可能であることを実証する。また、新規なＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の発現および分泌は、安定に形質転換された昆虫細胞を使用しても実証される。さらに、発現させたサブユニットタンパク質の精製についても実証される。新規なＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の増強された免疫原性特性を実証する実施例を提供する。下記の結果から、増強された免疫原性能力の選択および実証により、ある特定の免疫応答の喪失から高度に的を絞った免疫応答に至るまでの幅があり得る、ばらつきが大きい結果が得られることが実証される。このため、免疫応答の的をｐ１９コア領域に絞ることを目的としてｐ３３領域から増強配列を選択しても、完全に予測可能であるとは限らず、経験的に決定しなければならない。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の一部は、この新規な組換えタンパク質が中程度の全体的な抗体反応を生じるものの、意外にも、寄生虫抑制活性が５０％より高い、著しく増強された免疫原性特性を誘発することができた。このため、本明細書に記載の本発明は、記載される組換えサブユニットタンパク質の組成物、およびそこから得られる免疫原性特性の点で従来にないものである。
【００４１】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００４２】
（実施例１）
ＭＳＰ−１ ｐ４２のｐ３３領域のＴ細胞エピトープの評価
マラリアワクチンの開発を試みてＭＳＰ−１のｐ１９サブユニットまたはｐ４２サブユニットのいずれかを利用した研究は多くある。上記で検討し、下記でさらに考察するように、これらの各ＭＳＰ−１サブユニットの成功ばかりでなく、これらの各サブユニットの失敗についても報告されている。矛盾した結果のため、インビトロで寄生虫増殖を阻害することができる抗体反応を惹起する際に、または攻撃誘発から動物を保護する際に、抗原として働くその能力に関し、これらのサブユニットのどの領域が最も関係があるかは、不明である。ｐ１９コア領域への増殖抑制抗体の誘導は、ｐ３３領域のヘルパーＴエピトープの特異性により決定されるという仮説が立てられている。この理論を裏付けるものとして、組換えｐ１９サブユニットおよびｐ４２サブユニットが寄生虫増殖抑制抗体を惹起する能力を直接比較した研究が行われた（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ，１９９４）。同じアジュバント（ＦＣＡ）を使用した場合、ｐ１９組換え体およびｐ４２組換え体はどちらも、ＥＬＩＳＡ測定に基づいて、高力価の抗体を惹起した。しかしながら、ｐ４２抗原により生成された抗体は、寄生虫増殖を阻害したのに対し、ｐ１９により生成された抗体は、寄生虫増殖を阻害することができなかった。ｐ１９により生成された抗体は、寄生虫増殖を阻害できなかったものの、寄生虫由来のＭＳＰ−１に結合できる、ｐ４２により生成された抗体は、ｐ１９抗原を用いて交差吸収させることができることが実証された。さらにこの理論を裏付けるものとして、Ｕｄｈａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ（１９９５）による研究により、熱帯熱マラリアが非常に流行している地域であるケニアに住む個体の免疫応答に関してｐ４２領域のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの特徴付けが行われた。この研究では、Ｂ細胞エピトープは主にｐ１９コア領域にあり、増殖応答を与えることができるＴ細胞エピトープは、ｐ３３領域に存在することが明らかにされた。また、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ（２００１）およびＭａｌｈｏｔｒａ ｅｔ ａｌ（２００８）による研究により、ＭＳＰ−１のＣ末端領域の防御免疫応答を増強するのに関与し得る、ｐ３３領域中の他の可能性のあるＴ細胞エピトープも明らかにされた。
【００４３】
これらの研究で同定されたＴ細胞エピトープは、ヘルパーＴ細胞機能を直接与えることについては決定されていない一方で、これらが抗体反応をｐ１９の重要な寄生虫増殖抑制エピトープに集中させることを担い得ることが示唆される。これらの結果は、ｐ３３領域のヘルパーＴ細胞機能の理論を裏付けるものではあるが、動物モデルにおいて寄生虫増殖抑制抗体または防御応答を惹起する能力を増強するように設計された組換えサブユニットの発現に関するデータは、存在しない。
【００４４】
重要なＴ細胞エピトープを保持するｐ３３の適切なセグメントを選択する際の指針となる解析を支援するため、コンピュータプログラムを使用した。最初に、ｐ３３領域について、Ｔ細胞エピトープの確立されたパターンに当てはまる配列の存在を解析した（Ｍａｒｇａｌｉｔ ｅｔ ａｌ，１９８７）。このアルゴリズムは、可能性のあるＴ細胞エピトープを選択するために、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ（１９９０）により書かれたコンピュータプログラムの一部である。この解析の結果、１４個のＴ細胞エピトープが予測された。両親媒性スコアが最も高いエピトープは、ｐ３３のＮ末端の保存された領域にあるエピトープＬＫＰＬＡＧＶＹＲＳＬＫＫＱである。このエピトープをＣＴ（保存されたＴ）と呼ぶ。次に同定されたエピトープは、ｐ１９配列の開始点から７２アミノ酸前に位置するＡＨＶＫＩＴＫＬＳＤＬＫＡＩＤであり、Ｃ７２と呼ぶ。第３のＴ細胞エピトープは、コンピュータプログラムＴＥＰＩＴＯＰＥを用い、ｐ３３領域のＭＨＣクラスＩＩエピトープのさらなる解析を基に同定された（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７：５５５−５６１；Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．ａｎｄ Ｒａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７（１２），１２３６−３７）。このエピトープは、ｐ１９配列の開始点から２２アミノ酸前に位置するＬＶＱＮＦＰＮＴＩＩＳＫＬＩＥＧＫであり、ｐ３３−７と呼ぶ。
【００４５】
下記表１は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＭＳＰ−１ ｐ４２のｐ３３領域中の可能性のあるＭＨＣクラスＩＩ Ｔ細胞エピトープを列挙したものである。これらのエピトープは、コンピュータアルゴリズムにより予測されるか、または上記のような公表された報告に基づく。
【００４６】
【表１】
【００４７】
（実施例２）
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質−ｐ３３Ｎ末端切断の発現および分泌
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の第１群は、動物モデルにおいて寄生虫増殖抑制抗体を惹起する能力を増強し得るｐ３３の領域を規定しようとしており、ＭＳＰ−１ ｐ４２タンパク質のｐ３３領域のＮ末端切断に基づく。切断点は、表１に示した、可能性のある様々なＴ細胞エピトープの位置を参考にした。これらのコンストラクトはＮ末端の欠失に基づくため、保持されたｐ３３の部分は、図３に図示したように、ネイティブなｐ４２と同様にｐ１９領域と隣接した形で共に維持された。Ｎ末端切断に基づき、合計８つのコンストラクト（コンストラクトＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＱ）を作製した。
【００４８】
培養Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞における異種組換えタンパク質の発現および選択用の発現プラスミドの設計を記載する。ＭＳＰ−１ ｐ４２、ならびにコンストラクトＡ、ＢおよびＣの発現は、ｐＭｔｔｂｎｓベースの発現プラスミドを利用して達成した。こうした発現プラスミドに関する詳細については、米国特許第５，５５０，０４３号；同第５，６８１，７１３号；同第５，７０５，３５９号；同第６，０４６，０２５号に記載されている。ｐＭｔｔｂｎｓ発現ベクターは、以下のエレメント：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａメタロチオネインプロモーター（Ｍｔｎ）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナル配列、およびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルを含む（Ｃｕｌｐ ｅｔ ａｌ，１９９１）。また、ハイグロマイシン耐性を付与する選択可能なマーカーとしてｐＣｏＨｙｇｒｏプラスミドも利用する（Ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｒａｔｅｎ，１９８９）。ハイグロマイシン遺伝子は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＣＯＰＩＡ転位因子の長い末端反復配列プロモーターの転写制御下にある。ｐＭｔｔｂｎｓベクターは、外来性のＸｈｏ Ｉ部位を含んでいた１５塩基対のＢａｍＨＩフラグメントを欠失させることにより改変した。ｐＭｔｔΔＸｈｏと呼ばれるこの改変ベクターは、特有のＢｇｌ ＩＩ部位およびＸｈｏ Ｉ部位を利用してインサートを、方向性を持ってクローニングすることができる。
【００４９】
コンストラクトＤ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＱの発現は、プラスミドｐＨＢＩ−１０の誘導体であるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現プラスミドｐＨＢＩ−２０Ｄを用いて達成した。ｐＨＢＩ−１０プラスミドの詳細については、ＰＣＴ出願であるＷＯ／２００８／１３４０６８に記載されている。ｐＨＢＩ−２０Ｄ発現ベクターは、以下のエレメント：合成金属応答近位プロモーター、合成コアプロモーターおよび５’ＵＴＲ、合成分泌シグナル、ならびに最適化した３’ＵＴＲを含む。また、ハイグロマイシンをコードする遺伝子を、発現カセットの下流でｐＨＢＩ−２０Ｄ発現プラスミドに組み込んでいる。ｐＨＢＩ−２０Ｄ発現プラスミドは、目的の遺伝子を特有のＢａｍ ＨＩ部位およびＸｈｏ Ｉ部位に方向性を持ってクローニングできるように設計する。
【００５０】
ＭＳＰ−１ ｐ４２配列の発現のため、ＰＣＲ増幅したフラグメントを調製し、発現ベクターｐＭｔｔΔＸｈｏにクローニングした。ゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）製のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを利用して３種の株（ＦＵＰ、ＮＦ５４（クローン３Ｄ７）およびＦＶＯ）の培養したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生虫から調製した。
【００５１】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅により、コンストラクトＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＱ用の全長ＭＳＰ−１ ｐ４２、およびＭＳＰ−１のＣ末端フラグメントを作製した。増幅したＭＳＰ−１ ｐ４２のＰＣＲフラグメントは、ＦＵＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３７２１３）のＭＳＰ−１のアミノ酸Ａｌａ１３３３からＳｅｒ１７０５をコードする配列を含む。Ｎ末端切断型はすべて、全長ＭＳＰ−１ ｐ４２コンストラクトから増幅した。増幅に使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、適切な制限部位および終止コドンもコードしていた。コンストラクトＢは、実施例１に記載したＣＴエピトープをコンストラクトＡのＮ末端に融合してある点で、どれもｐ４２に由来する隣接配列を持つ他のＮ末端切断サブユニットと異なる。
【００５２】
ＰＣＲ増幅は、高忠実度Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の使用により達成した。得られたＰＣＲ増幅フラグメントを適切な制限酵素で消化し、Ｂｇｌ ＩＩおよびＸｈｏ Ｉで消化したｐＭｔｔΔＸｈｏベクターに挿入するか、またはＢａｍ ＨＩおよびＸｈｏ Ｉで消化したｐＨＢＩ−２０Ｄベクターに挿入した。すべてのコンストラクトの接合部および全インサートを配列決定して、導入されている様々な構成要素が正しく、かつ適切なリーディングフレームが保存されていることを確認した。
【００５３】
ＡＴＣＣから入手したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｓ２細胞（「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞」、または単に「Ｓ２細胞」。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９７２）を利用した。細胞は、Ｅｘｃｅｌｌ ４２０培地での増殖に適応しており、すべての手順および培養をこの培地で行う。細胞は、５日から７日の間で経過させ、典型的には１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、２６℃でインキュベートする。ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質のコード配列を含むすべての発現プラスミドを、リン酸カルシウム法によってＳ２細胞に形質転換した。ｐＭｔｔΔＸｈｏプラスミドを使用した場合、ハイグロマイシンＢで選択するため、ｐＣｏＨｙｇｒｏが０．５μｇに対して発現プラスミドが１０μｇの比率でｐＣｏＨｙｇｒｏプラスミドを用いて細胞を同時形質転換した。ｐＨＢＩ−２０Ｄプラスミドを使用した場合、このプラスミドにはハイグロマイシン遺伝子が導入されているため、１０μｇの発現プラスミドでのみ細胞を形質転換した。形質転換後、０．３ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンに耐性がある細胞を選択した。一旦安定な細胞株が選択されたら、適切な産物を発現しているかについてこれらを評価した。５ｍＬの培養液を２×１０６細胞／ｍＬで播種し、０．２ｍＭのＣｕＳＯ４で誘導し、２６℃で７日間培養した。細胞の除去後、培養培地のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に供して、様々なＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の発現を評価した。
【００５４】
予備的な抗原性試験および免疫原性試験には、発現させたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の迅速な精製手段として、免疫親和性クロマトグラフィー（ＩＡＣ：ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法を利用した。ｐ４２特異的ＩＡＣカラムの調製には、ＭＳＰ−１コンフォメーション感受性ｍＡｂ５．２を使用した（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅｔ ａｌ １９８７、およびＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ １９９２）。製造者（Ｕｎｉｓｙｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）の推奨に従い、Ｃｅｌｌ Ｐｈａｒｍ１０００中空糸型バイオリアクターを用いて十分な量のｍＡｂ５．２を作製した。ｍＡｂ５．２ハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣから入手し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｈｏｐｋｉｎｓ，ＭＡ）で増殖させた。培地には、フラスコでの増殖の場合１０％のＦＢＳ、および中空糸型バイオリアクターでの増殖の場合５％ＦＢＳを補充した。バイオリアクターを２５日間運転し、総収量５７ｍｇを得た。カラムマトリックス（活性化Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−ＨｉＴｒａｐ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）１ｍＬ当たり１０ｍｇの親和性精製したＭＡｂ５．２をカップリングすることにより、ベッド容量２ｍＬのカラムを作製した。ＩＡＣカラムを２００ｍＬの清澄にした培養培地で１分当たり１ｍＬの速度で灌流した。１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２で洗浄後、抗原を１００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。溶出産物を１Ｍのトリス、ｐＨ７．５（最終濃度０．２Ｍ）で中和させ、ＮａＣｌを、最終濃度１５０ｍＭになるように加えた。次いでサンプルの緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ」）に交換し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて膜限外濾過により濃縮した。
【００５５】
図４、図５および図６に、Ｎ末端コンストラクトを示す。図６に示すように、Ｎ末端切断コンストラクトを群１と呼ぶ。群１のコンストラクトは、ネイティブなｐ４２配列と同様にｐ１９の直前に、ｐ３３のＣ末端の単一の連続部分を保持する任意のコンストラクトと定義される。Ｎ末端が切断された群１コンストラクトは、これらのサブユニットが細胞プロセシングに起因して自然界に見出されないという点で新規なＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットの代表である。
【００５６】
（実施例３）
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質コンストラクトＡ、ＢおよびＣの免疫原性の評価
ｐ３３ Ｎ末端切断（群１）に基づくＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現させたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の免疫原性を、マウスおよびウサギにおいて評価し、それらのタンパク質が増強されたか免疫原性能力を有するかどうかを決定した。最初の実験ではすべて、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ：Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）またはＩＳＡ５１のいずれかを利用してサブユニットタンパク質を送達した。
【００５７】
マウスに、精製されたサブユニットタンパク質を用量１０μｇで、４週間間隔にて３回腹腔内免疫した。各投与から３週間後にマウスから採血した。次いで血清を、抗ｐ１９および抗ｐ４２抗体力価についてＥＬＩＳＡにより評価した。ニュージーランド白ウサギについては、用量５０ｇにて筋肉内経路により４週間間隔で４回免疫した。最初の３回の投与から２週間後、４回目の投与から３週間後および４週間後にウサギから採血した。次いで血清を、ＥＬＩＳＡにより抗ｐ４２抗体力価について評価した。ウサギからの血清はまた、寄生虫増殖活性についてインビトロアッセイでも試験した（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，（１９８７）６４：５１９−５２２）。簡単に説明すると、寄生虫増殖抑制活性をアッセイするため、３０％の最終濃度になるように血清サンプルを培養培地に加え、当初０．５％の寄生虫血となるように調整された感染ヒト赤血球とともにインキュベートする。本アッセイでは、ヒト血清で増殖できるように適合されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ３Ｄ７寄生虫を利用する。次いで培養液を７２時間インキュベートし、培養赤血球のギムザ染色した薄層塗抹標本の寄生虫血を顕微鏡により決定する。阻害パーセントを、対照血清サンプル（同じ動物からあらかじめ採血しておいたもの）の寄生虫血から試験サンプルの寄生虫血を差し引いたものを、対照血清サンプルの寄生虫血で割り、その商に１００を掛けて算出する。
【００５８】
フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とともに配合したＭＳＰ−１ ｐ４２を用いてウサギを免疫する場合に得られる結果の例を表２に示す。ＭＳＰ−１ ｐ４２で免疫されたウサギの結果から、ｐ４２ワクチン製剤が適切な免疫応答、高いＥＬＩＳＡ力価、および５０％より高い寄生虫増殖抑制力価を惹起する可能性があることが実証される。これらの結果は、ＦＣＡなどの強力なアジュバントでしか達成できない。しかしながら、ＦＣＡは、ヒトに使用するのに好適ではないため、これらの結果は、ヒトにとって可能性のあるワクチンの製剤を説明するものではない。ヒトに使用できる可能性がある他のアジュバントを使用すると、免疫時の全体の抗体力価は十分であるものの、寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が一貫しない。したがって、一貫して強力かつ特異的な免疫応答、寄生虫増殖抑制抗体を誘導できる、組換えサブユニットタンパク質の免疫原性能力を増強する別の手段を開発する必要がある。
【００５９】
【表２】
【００６０】
表３に、コンストラクトＡ、ＢおよびＣについてのＥＬＩＳＡのデータを示す。特異的抗体反応ではなく全体的な抗体反応のみを測定するＥＬＩＳＡ力価を基準にすると、コンストラクトＣが最も強力かつ一貫した免疫応答を引き起こす。
【００６１】
【表３】
【００６２】
表４には、コンストラクトＡ、ＢおよびＣについての寄生虫増殖抑制データを示す。特異的抗体反応を測定する抑制データを基準にすると、コンストラクトＡおよびＢが、ｐ１９サブユニットおよびｐ４２サブユニットによく見られるように一貫してはいないものの、免疫された動物に特異的な応答を引き起こすことができた。一方、コンストラクトＣは、感知できる抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を何ら生成できなかった（アッセイの変わりやすさを勘案して、５０％より高い結果のみを有意とみなす）。コンストラクトＣからの結果は、まったく予想外であった。この結果の以前には、重要な作業上の前提は、特異的な抑制抗体の生成には、全体的な抗体力価が一貫して高いことが必須であるということであった。さらに、コンストラクトＣからの結果は、寄生虫増殖抑制の能力がある抗ｐ１９抗体の生成を抑制し得るｐ３３配列が存在することを強く示唆した。これは、コンストラクトＣ中のｐ３３セグメントが、ＰＲＯＰＥＤ（ＴＥＰＩＴＯＰＥ）アルゴリズム（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２００１）１７：１２３６−７；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１７：５５５−６１）により予測された予測Ｔ細胞エピトープ（表１中の、および図３および４に示す通りの、ｐ３３−７）を持つという事実にもかかわらずである。
【００６３】
【表４】
【００６４】
コンストラクトＡ、ＢおよびＣからの寄生虫抑制の結果から、可能性のあるＴ細胞エピトープの予測のみに基づいて作製されたＭＳＰ−１のＣ末端コンストラクトでは、ｐ１９領域に特異的な増強された免疫応答を確実に引き起こすには不十分であることが実証される。実際、コンストラクトＣに伴う予想外の結果からは、予想エピトープの少なくとも１つであるｐ３３−７が、所望の特異的抗体反応を著しく抑制し得ることが実証された。したがって、免疫能力の増強を有するコンストラクトの適切な性質を予測するには、どの配列が増強する可能性があり、どの配列が抑制する可能性があるかを選別するためにかなりの実験を行うことが不可欠である。
【００６５】
（実施例４）
ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質−ｐ３３連結配列の発現および分泌
動物モデルにおいて寄生虫増殖抑制抗体を惹起する能力に関わる抑制配列または外来性配列を除外しつつ増強配列を連結する試みにおいて、ＭＳＰ−１ ｐ４２タンパク質のｐ３３領域からの不連続なセグメントの組み合わせに基づき、さらなるＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質を作製した。群１のコンストラクトと同様に、ｐ３３セグメントの選択については、表１に示した、可能性のある様々なＴ細胞エピトープの位置をある程度参考にした。非連続なセグメントを含む３種類の異なるコンストラクト群（群２、群３および群４）を作製した。群２のコンストラクトには、既知のＴ細胞エピトープを含むフラグメントを選択したのに加えて、さらに２つの設計基準が存在した。その第１は、コンストラクトＣのｐ３３セグメントが抑制配列を含むという実施例２のデータに基づき、このセグメントを除外することであった。第２は、２〜３のフラグメントのみを連結することであった。群２のコンストラクトはｐ３３の不連続なセグメントに基づくため、ｐ３３配列をｐ１９に連結して得られたコンストラクトは、組み合わせた配列が自然界に見出されないという点で新規なコンストラクトである。群２のコンストラクトは、合計７つ作製した。６つのコンストラクト（コンストラクトＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、ＭおよびＰ）は、ｐ３３セグメントの様々な組み合わせとｐ１９領域との連結、およびコンストラクトＣ領域の除外に基づくものであった。１つのコンストラクト（コンストラクトＨ）は、コンストラクトＣ領域の除外にのみ基づくものであった。群３のコンストラクトは、ｐ３３領域の保存されたすべてのフラグメントの連結に基づくコンストラクトＮ、あるいは、すべての非保存フラグメントの連結に基づくコンストラクトＯのどちらかであった。これらのコンストラクトはどちらも、合成法により作製した。群４は、１つのコンストラクト（コンストラクトＲ）のみを含む。予備データに基づき、コンストラクトＩ、ＫおよびＬから選択されたフラグメントを選択して組み合わせた。
【００６６】
群２、群３および群４のコンストラクトではすべて、実施例１に記載したｐＨＢＩ−２０Ｄ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現プラスミドを使用した。群２および群４のコンストラクトの作製には、ｐＨＢＩ−２０Ｄ−ｐ１９ベースのプラスミドを最初に構築した。ｐＨＢＩ−２０Ｄ−ｐ１９ベースのプラスミドは、全長ｐ１９配列を含み、その直後にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーをコードする配列がある。この配列は、特有のＫｐｎ Ｉ制限部位を含んでおり、ｐ３３配列をｐ１９配列とインフレームで連結するのに利用した。また、ｐＨＢＩ−２０Ｄの分泌シグナル配列の末端の典型的なクローニング部位であるＢａｍ ＨＩ部位をＮｈｅ Ｉ部位に改変して、組み合わせた様々なｐ３３配列のマルチクローニング事象を可能にした。発現コンストラクトは、発現ベクターｐＨＢＩ−２０Ｄ−ｐ１９に、ＰＣＲ増幅フラグメントを直接クローニングするか、または化学的に合成されたフラグメントを含むシャトルベクター由来のフラグメントをサブクローニングすることにより作製した。ｐ３３の非連続なセグメントが複雑であるため、合成的に作製した群３のコンストラクトでは、合成の際にｐ１９領域も含ませた。したがって、群４のコンストラクトではｐ３３フラグメント間、またはｐ３３領域とｐ１９領域との間にリンカー配列が存在しない。この合成フラグメントは、適切な制限酵素を用いてｐＨＢＩ−２０Ｄに直接クローニングした。
【００６７】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび合成配列は、ＦＵＰ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３７２１３）を基に設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＭＳＰ−１に特異的な配列に加えて適切な制限部位をコードしていた。連結されるセグメントでは、フラグメントの５’末端をＳｐｅ Ｉ部位（Ｎｈｅ Ｉと適合性）を用いて設計し、フラグメントの３’末端を、ｐＨＢＩ−２０−ｐ１９のクローニング部位に相当するＫｐｎ Ｉ部位を用いて設計した。２つのｐ３３フラグメントを組み合わせた場合、連結を可能にするために適切な末端でＢａｍ ＨＩ部位を設計することによりそれらを連結した。ＰＣＲ増幅、クローニング、およびＳ２細胞の形質転換は、実施例２に記載されているように達成した。発現させたサブユニットタンパク質は、実施例２に記載されているようにＩＡＣ法により精製した。
【００６８】
群２、３および４を代表するｐ３３連結コンストラクトを図４、図５および図６に示す。群２のコンストラクトは、ｐ３３の１つまたはそれより多くの不連続なセグメントをｐ１９領域に連結した任意のコンストラクトと定義される。ｐ３３配列をｐ１９に連結して得られたコンストラクトは、組み合わせた配列が自然界に見出されないという点で新規なコンストラクトである。
【００６９】
（実施例５）
マウスにおけるＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の免疫原性の評価
ｐ３３連結配列に基づく、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現させたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質（群２）の免疫原性を、マウスおよびウサギにおいて評価し、それらのタンパク質が増強された免疫原性能力を有するかどうかを決定した。最初の実験ではすべて、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）またはＩＳＡ５１のどちらかを利用してサブユニットタンパク質を送達した。
【００７０】
マウスおよびウサギの免疫ならびに免疫応答の評価を、実施例３に記載されているように行った。群２のコンストラクトの抗体力価を図７に示す。これらの結果から、これらのコンストラクトにより誘導される抗体力価には、様々なレベルが存在し、コンストラクトＨおよびＩの抗体力価が最も高く、コンストラクＪの抗体力価が最も低いことが示される。
【００７１】
【表５】
【００７２】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで発現させたＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の免疫原性は、群１および群２どちらも、ＥＬＩＳＰＯＴ法を用いた、初回免疫したマウス脾細胞からのサイトカイン産生を基にした。マウスの免疫は、実施例３に記載されているように行った。免疫過程の後、各群から一部のマウスを最終投与から７日後に屠殺し、その脾臓を取り出した。脾細胞を培養し、ＥＬＩＳＰＯＴ法によるサイトカイン解析に使用した。免疫された各群の培養脾細胞を、免疫に使用したのと同じ精製された抗原調製物で刺激した。抗原刺激後、細胞のインターフェロン−γおよびインターロイキン−４の産生について解析した。この解析の結果を図８に示す。
【００７３】
群１および群２のＥＬＩＳＰＯＴ解析に基づき、ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質には、インターフェロン−γおよびＩＬ−４の産生で見て、２つの群間に明らかな相違があることが分かる。群１のコンストラクトで初回免疫した脾細胞は、刺激時のＩＬ−４の反応が強く、一般にインターフェロン−γの反応が弱い。一方、群２のコンストラクトで初回免疫した脾細胞は、刺激時の反応が正反対であり、インターフェロン−γの反応が強く、ＩＬ−４の反応が弱い。これらの結果から、コンストラクトの２つの群間に顕著な相違があることが確認されるが、その相違の本質は、現時点では不明である。メカニズムは明らかでないものの、群２のコンストラクトのｐ３３−７エピトープの除去が、群１におけるＩＬ−４の強い反応から群２におけるＩＬ−４の弱い反応への変化に役割を果たしている可能性が強い。さらに、このデータから、適切な反応を惹起するのに必要な免疫応答を理解するには、複数レベルの実験が必要とされることも裏付けられる。
【００７４】
（実施例６）
ウサギにおけるＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質の免疫原性の評価
最終目的は、どのＭＳＰ−１のＣ末端コンストラクトが、強力で一貫した寄生虫増殖抑制抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作るかを決定することであることから、この解析を行うため、選択されたコンストラクトを用いてウサギを免疫した。コンストラクトは、実施例３、５および６に示した結果に基づき選択した。
【００７５】
実施例３に記載されているように、ニュージーランド白ウサギの群を免疫した。実施例３に記載されているように、寄生虫増殖抑制アッセイを行った。
【００７６】
結果を下記表Ｘに示す。
【００７７】
【表６】
【００７８】
【表７】
【００７９】
【表８】
【００８０】
【表９−１】
【００８１】
【表９−２】
【００８２】
【表９−３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増強された免疫原性特性を持つＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質であって、
ｐ３３領域の選択されたセグメントを加えた、Ｃ末端領域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＭＳＰ−１タンパク質のｐ１９コア領域；ならびに
細胞ベースの発現系からの該組換えサブユニットタンパク質の発現および分泌
を含む、組換えサブユニットタンパク質。
【請求項２】
前記増強された免疫原性特性は増加され一貫した寄生虫増殖抑制活性として測定される、請求項１に記載の組換えサブユニットタンパク質。
【請求項３】
免疫された動物はすべて寄生虫増殖抑制活性が５０％より高くなる、請求項２に記載の組換えサブユニットタンパク質。
【請求項４】
前記サブユニットは配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号７および配列番号１７に示すｐ３３領域のＮ末端の欠失により誘導される、請求項１に記載の組換えサブユニットタンパク質。
【請求項５】
前記サブユニットは配列番号８、配列番号１１、配列番号１４および配列番号１８に示す選択されたｐ３３領域フラグメントの連結により誘導される、請求項１に記載の組換えサブユニットタンパク質。
【請求項６】
前記発現系は真核細胞培養系である、請求項１に記載の組換えサブユニットタンパク質の発現。
【請求項７】
前記細胞培養発現系は昆虫細胞を利用する、請求項６に記載の組換えサブユニットタンパク質の発現。
【請求項８】
前記昆虫細胞はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である、請求項７に記載の組換えサブユニットタンパク質の発現。
【請求項９】
マラリア感染からの保護を惹起することができるＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質を含む、ワクチン製剤。
【請求項１０】
前記ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質は配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号７ 配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８に示される、請求項９に記載のワクチン製剤。
【請求項１】
増強された免疫原性特性を持つＭＳＰ−１のＣ末端組換えサブユニットタンパク質であって、
ｐ３３領域の選択されたセグメントを加えた、Ｃ末端領域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＭＳＰ−１タンパク質のｐ１９コア領域；ならびに
細胞ベースの発現系からの該組換えサブユニットタンパク質の発現および分泌
を含む、組換えサブユニットタンパク質。
【請求項２】
前記増強された免疫原性特性は増加され一貫した寄生虫増殖抑制活性として測定される、請求項１に記載の組換えサブユニットタンパク質。
【請求項３】
免疫された動物はすべて寄生虫増殖抑制活性が５０％より高くなる、請求項２に記載の組換えサブユニットタンパク質。
【請求項４】
前記サブユニットは配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号７および配列番号１７に示すｐ３３領域のＮ末端の欠失により誘導される、請求項１に記載の組換えサブユニットタンパク質。
【請求項５】
前記サブユニットは配列番号８、配列番号１１、配列番号１４および配列番号１８に示す選択されたｐ３３領域フラグメントの連結により誘導される、請求項１に記載の組換えサブユニットタンパク質。
【請求項６】
前記発現系は真核細胞培養系である、請求項１に記載の組換えサブユニットタンパク質の発現。
【請求項７】
前記細胞培養発現系は昆虫細胞を利用する、請求項６に記載の組換えサブユニットタンパク質の発現。
【請求項８】
前記昆虫細胞はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である、請求項７に記載の組換えサブユニットタンパク質の発現。
【請求項９】
マラリア感染からの保護を惹起することができるＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質を含む、ワクチン製剤。
【請求項１０】
前記ＭＳＰ−１のＣ末端サブユニットタンパク質は配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号７ 配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７および配列番号１８に示される、請求項９に記載のワクチン製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５１１５２１（Ｐ２０１３−５１１５２１Ａ）
【公表日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３９８７７（Ｐ２０１２−５３９８７７）
【出願日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００３０１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６２６３７
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０００３８２９３）ハワイ バイオテック， インコーポレイテッド (3)
【出願人】（５９２２２５４３４）ユニバーシティ・オブ・ハワイ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＡＷＡＩＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００３０１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６２６３７
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０００３８２９３）ハワイ バイオテック， インコーポレイテッド (3)
【出願人】（５９２２２５４３４）ユニバーシティ・オブ・ハワイ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＡＷＡＩＩ
【Ｆターム（参考）】
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