【課題】ポリペプチドの生成を変更するための新規な方法の提供。
【解決手段】（ａ）ポリペプチドをコードするDNA 配列を含んで成る細胞中に、核酸構造体を、その核酸構造体が突然変異細胞を生成するために前記ポリペプチドをコードするDNA 配列内に存在しない遺伝子座で細胞のゲノム中に組込む条件下で導入し、ここで前記核酸の組込みが、突然変異細胞及び親細胞が同じ条件下で培養される場合、親細胞に対する突然変異細胞によるポリペプチドの生成を変更し；そして（ｂ）ポリペプチドの変更された生成を有する突然変異細胞を同定することを含んで成る。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のＤＮＡ配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii）突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項２】
核酸構成体が、第１のDNA配列と40％未満の相同性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸構成体が該遺伝子座と40％未満の相同性を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子座が第１のDNA配列とは異なる染色体上にあるか又は第１のDNA配列の５' 又は３' 末端から3000bps のところではあるが同じ染色体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（Ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内に無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入は、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を分断し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項６】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの転写の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも無い１つの遺伝子産で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを発現する；
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項７】
核酸構成体が、第１のDNA配列と40％未満の相同性を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸構成体が該遺伝子座と40％未満の相同性を有している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子座が第１のDNＡ配列とは異なる染色体上にあるか又は第１のDNA配列の５' 又は３' 末端から3000bps のところではあるが同じ染色体上にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
（Ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内に無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入は、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を分断し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを発現する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項１１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの翻訳の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを合成する；
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項１２】
核酸構成体が、第１のDNA配列と40％未満の相同性を有する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
核酸構成体が該遺伝子座と４０％未満の相同性を有している、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子座が第１のDNA配列とは異なる染色体上にあるか又は第１のDNA配列の５' 又は３' 末端から3000bps のところではあるが同じ染色体上にある、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
（Ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内に無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入は、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を分断し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを合成する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項１６】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを分泌する；
培養段階、
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項１７】
核酸構成体が、第１のDNA配列と40％未満の相同性を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
核酸構成体が該遺伝子座と40％未満の相同性を有している、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子座が第１のDNA配列とは異なる染色体上にあるか又は第１のDNA配列の５' 又は３' 末端から3000bps のところではあるが同じ染色体上にある、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
（Ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内に無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入は、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする遺伝子以外の、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ又はそれらの調節又は制御配列をコードする遺伝子を分断し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを分泌する、
培養段階、
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項２１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、又該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第２のDNA配列内にも無い遺伝子座において、この遺伝子座と相同でない核酸構成体を親細胞のゲノム内に無作為に組込むことによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る、ポリペプチド産生方法。
【請求項２２】
核酸構成体が、制限酵素により媒介される組込みによって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸構成体が選択可能なマーカーを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
選択可能なマーカーが amdＳ，arg Ｂ，bar, hygＢ，nia Ｄ，pyr Ｇ，ｓＣ又は trpＣである請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
親細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
親細胞が細菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
親細胞が真菌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
真菌細胞が糸状真菌細胞である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
糸状真菌細胞が Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humnicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium Scytalidium, Thielavia, Tolypocladium 及び Trichodermaの中から選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
真菌細胞が酵母細胞である、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドが組換え型ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが非相同ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドがホルモン、ホルモン変異体、酵素、レセプタ又はその一部分、抗体又はその一部分又はリポータである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
ポリペプチドが、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
ポリペプチドが、アミノペプチターゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボスクレアーゼ、エステラーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファーグルコシターゼ、ベーターグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フイターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、又はキシラナーゼである、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
突然変異体細胞が、親細胞に比べて増大した無機補因子の摂取量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
突然変異体細胞が、親細胞に比べて更に望ましい形態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
突然変異体細胞が、親細胞に比べて高い、単数又は複数の分泌タンパク質の収量を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
突然変異体細胞が、単数又は複数の必須代謝産物を合成する能力を喪失している、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
突然変異体細胞の表現型が、或る一定の条件下でのみ観察される、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
突然変異体細胞が、親細胞に比べて変化した成長率を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
突然変異体細胞の成長は、ポリペプチド又は代謝産物の高レベルの産生を誘発する条件下で成長させられた時点で、望ましいポリペプチド又は代謝産物の過剰産生によって阻害されない、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
突然変異体細胞は、親細胞よりも低い酸素条件を寛容することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
突然変異体細胞は、親細胞に比べ変化したプロモータの転写活性化物質の産生を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
突然変異体細胞は、親細胞のシグナルトランスダクション経路の遺伝子のうち単数又は複数のものの中に突然変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
突然変異体細胞が隠性イントロンを認識したり誤ってスプライシングしたりしない、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
核酸構成体が、pDSY109，pDSY112，pMT1936，pDSY138，pDSY162，pDSY163，pDSY141，pSMO1204，pSMOH603，p4-8.1，p7-14.1，pHB220，pSMO717，pSMO321，pHowB571又はpSMO810である、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
遺伝子座が、配列番号９，16，25，29，34，39，50，56，63，66，71，76又はそれらのフラグメントである請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
遺伝子座がグルコース輸送体、マンニトール−１−リン酸デヒドロゲナーゼ、キチンシンターゼ、熱ショックタンパク質、マンガンスーパオキシドジスムターゼ又は pacＣの活性化に必要とされる遺伝子をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
遺伝子座が palＢ遺伝子である、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、ポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の正の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも少ないポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。
【請求項５２】
（ａ）代謝産物の産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、（ｂ）第１のポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、（ｃ）該条件下で第１のポリペプチドのいずれかを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも、又（ｄ）第２の代謝産物の第２の生合成経路内で第２のポリペプチドをコードする単数又は複数の第４のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、代謝産物の生合成経路内で第１のポリペプチドをコードする単数又は複数の第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで該生合成経路と第２の生合成経路には、同じ中間体の産生が関与し、第２のポリペプチドが中間体の産生後に１つの段階の触媒として作用し、
（ii) 突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くの代謝産物を産生する、
培養段階、及び
（ｂ）代謝産物を回収する段階、
を含んで成る、代謝産物の産生方法。
【請求項５３】
第１のポリペプチドの産生方法において
（ａ）該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、第２のポリペプチドの転写、翻訳又は分泌の負の調節を行なうタンパク質をコードする第２のDNA配列内にも、第１のポリペプチドの産生を導く条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第３のDNA配列内にも無い１つの遺伝子座で、第１のDNA配列を含む親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって突然変異体細胞を形成する段階；
（ｂ）突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する突然変異体細胞を分離する段階；
（ｃ）核酸構成体が組込まれた遺伝子座を同定する段階；
（ｄ）対応する遺伝子座が分断された細胞を産生する段階；
（ｅ）該条件下で細胞を培養する段階、及び
（ｆ）第１のポリペプチドを回収する段階、
を含んで成る方法。
【請求項５４】
（ａ）ポリペプチドの産生を導く条件下で突然変異体細胞を培養する段階であって
（ｉ）突然変異体細胞が、該ポリペプチドをコードする第１のDNA配列内にも、該条件下でポリペプチドを加水分解する能力をもつプロテアーゼをコードする第２のDNA配列内にもない１つの遺伝子座で親細胞のゲノム内に核酸構成体を導入することによって、第１のDNA配列を含む親細胞に関係づけされ、ここで核酸構成体の導入がポリペプチドの転写、翻訳又は分泌を特異的に増強し、
（ii）突然変異体細胞及び親細胞が両方共該条件下で培養された時点で、突然変異体細胞が親細胞よりも多くのポリペプチドを産生する、
培養段階、及び
（ｂ）ポリペプチドを回収する段階、
を含んで成るポリペプチド産生方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【公開番号】特開２０１０−１１８６５（Ｐ２０１０−１１８６５Ａ）
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−２１６９３３（Ｐ２００９−２１６９３３）
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【分割の表示】特願平１０−５１４００５の分割
【原出願日】平成９年９月１２日（１９９７．９．１２）
【出願人】（５００１７５６０２）ノボザイムス，インコーポレイティド (26)
【Ｆターム（参考）】