変異型ＡＢＬキナーゼドメイン
【課題】
本発明は、STI５７１抵抗性患者をスクリーニングするための化合物を提供することを目的とする。また、STI５７１抵抗性患者の処置に有用な化合物、当該化合物のスクリーニング法を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド、該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の選別のための該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドをコード化する核酸分子、該核酸分子を含む組み換えベクターおよび宿主細胞、および該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用する該ポリペプチドの生成での該核酸分子の使用に関する。
本発明は、STI５７１抵抗性患者をスクリーニングするための化合物を提供することを目的とする。また、STI５７１抵抗性患者の処置に有用な化合物、当該化合物のスクリーニング法を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド、該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の選別のための該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドをコード化する核酸分子、該核酸分子を含む組み換えベクターおよび宿主細胞、および該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用する該ポリペプチドの生成での該核酸分子の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
変異型Ａｂｌキナーゼドメイン
発明の分野：
本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該変異型機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩による該チロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド、該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングのための該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドをコード化する核酸分子、該核酸分子を含む組み換えベクターおよび宿主細胞、および該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用する該ポリペプチドの生成での該核酸分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
９番および２２番染色体の長腕間の相互転座［Rowley J.D., Nature 243, 290-293 (1973)］によるフィラデルフィア染色体の形成から生じる常時活性型チロシンキナーゼであるＢｃｒ−Ａｂｌ［Nowell P.C. and Hungerford D.A., Science 132, 1497 (1960)］は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の実質的全類型および成人急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の最大２０％に存在する特徴的分子異常として示された［Faderl S. et al., N Engl J Med 341, 164-172 (1999); Sawyers C.L., N Engl J Med 340, 1330-1340 (1999)］。Ｂｃｒ−ＡｂｌはマウスにおいてＣＭＬを引き起こすのに足り［Daley G.Q. et al., Science 247, 824-830 (1990)］、かつその形質変換能はチロシンキナーゼ活性に完全に依存している。Ｂｃｒ−Ａｂｌならびに血小板由来成長因子受容体のＡＴＰ結合部位、およびｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼ［Lugo T.G. et al., Science 247, 1079 (1990)］での競合的阻害剤である化合物Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミド（以下、「ＳＴＩ５７１」としても言及される；ＳＴＩ５７１はＥＰ０ ５６４ ４０９に記載され、そしてメタンスルホン酸塩の形でＷＯ９９／０３８５４に記載される）は、慢性期および急性転化のＣＭＬ、ならびにフィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）の臨床的異常および血液学的異常を非常に急激に逆にする能力があると示されてきた［Druker B.J. et al., N Engl J Med 344, 1031-1037 (2001); Druker B.J. et al., N Engl J Med 344, 1038-1042 (2001)］。ほとんど全ての慢性期ＣＭＬ患者が永続的に応答する一方で、ＣＭＬ急性転化およびＰｈ＋ＡＬＬの寛解は一時的であり、そしてほとんどの患者がＳＴＩ５７１での継続治療にもかかわらず数ヶ月後に再発する［Druker B. J. et al., N Engl J Med 344, 1038-1042 (2001)］。ＳＴＩ５７１に対する抵抗性のメカニズムは熱心な研究の対象である。
【０００３】
ＣＭＬまたはＰｈ＋ＡＬＬに罹患する患者のＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子のキナーゼドメインに存在する変異が、該変異がＳＴＩ５７１による阻害に対するＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの抵抗性を導くという点で、ＳＴＩ５７１処置に対する該患者の生物学的抵抗性に起因すということは、当時としては驚くべき発見であった。
【０００４】
これらの発見は、例えば、ＳＴＩ５７１での処置に対する抵抗性に打ち勝つ能力のある新規化合物または化合物の組合せを見つける際に非常に価値がある。さらにかかる変異の認識は、それが例えば、患者が臨床的に再発する前に薬物抵抗性クローンの検出を可能とするという点で、Ｐｈ＋白血病の診断においても非常に有益である。
【０００５】
定義：
本明細書の文章中、以下の表現、用語および略語は以下に定義される意味を有する。
表現「機能的キナーゼドメイン」において、用語「機能的」はそれぞれのキナーゼドメインがチロシンキナーゼ活性を有することを示す。好ましくは、かかる機能的キナーゼドメインのキナーゼ活性は天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインの活性の範囲内である。
【０００６】
表現「機能的キナーゼドメインがＳＴＩ５７１またはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である」において、用語「抵抗性」は、ＳＴＩ５７１が天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのものより高い、すなわち、約０．０２５μＭより高い、好ましくは約０．１５μＭより高い、より好ましくは約０．２５μＭより高い、最も好ましくは約５μＭより高いＩＣ５０でそれぞれの機能的キナーゼドメインを阻害することを意味する。
【０００７】
表現「天然のヒトキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列」において、一部分「またはその本質的に類似の配列」は、キナーゼの機能性にとっては本質的でないアミノ酸変換、アミノ酸欠損および／またはアミノ酸付加を含む変異を含有する天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列、および上で定義された様に用語「機能的」および「抵抗性」の意味の範囲内でＳＴＩ５７１またはその塩による阻害に対する該抵抗性に言及する。
【０００８】
表現「別のアミノ酸により置換される」はある天然のアミノ酸の別の天然のアミノ酸による置換に言及する。
アミノ酸名は、１文字または３文字コードのいずれかを用いて記載されている。変異は、一般に認められる命名法、例えば、ともに、位置３８０のアラニンがスレオニンにより置換されることを示す「Ａｌａ３８０Ｔｈｒ」または「３８０Ａｌａ→Ｔｈｒ」により言及される。
【０００９】
配列番号：１は、天然のヒトＡｂｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを表す（ヒトｃ−ａｂｌ ｍＲＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ１６４１６）。
配列番号：２は、天然のヒトＡｂｌタンパク質のアミノ酸配列を表す（ヒトｃ−Ａｂｌ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号：Ｐ００５１９）。
【００１０】
別に示されていなければ、あるアミノ酸に与えられた数は配列番号：２のアミノ酸の番号付けに言及する。上で定義された意味の範囲内の天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列に本質的に類似するアミノ酸配列においては、アミノ酸は配列番号：２のアミノ酸の番号付けに従って番号付けされる。
【００１１】
用語「単離」は、物質が本来の環境（例えば、それが天然に生じるなら天然の環境）から移されることを意味する。
「宿主細胞」は、任意の方法、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、トランスフォーメーション法、ウイルス感染法等により細胞内に導入された異種性ＤＮＡを含有する原核細胞または真核細胞に言及する。
【発明の開示】
【００１２】
発明の説明：
本発明の実施において、分子生物学、微生物学の多くの通常の技術、および組み換えＤＮＡが用いられる。これらの技術はよく知られており、そして例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory);およびMethods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)に説明されている。
【００１３】
特に、本発明のポリペプチドは当該技術分野でよく知られた技術を用いる組み換えＤＮＡテクノロジーにより生成され得る。当業者によく知られている方法を用いて、本発明のポリペプチドをコード化する配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するこができる。様々な宿主発現ベクターシステムを利用して本発明のポリペプチドを発現することができる。
【００１４】
（１）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｐｈｅ３８２およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１５】
（２）本発明は特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１６】
（３）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉs３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１７】
（４）本発明はさらに、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１８】
（５）本発明は特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１９】
（６）本発明はまた特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性となっている）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２０】
（７）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似な配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ａｓｐ３８１およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性であり、かつ任意で、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｐｈｅ３８２およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つの追加アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２１】
（８）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、アミノ酸Ｐｈｅ３１１が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２２】
（９）好ましい実施態様において、本発明は上記段落（８）に記載されている単離ポリペプチド（ここで任意で、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つの追加アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている）に関する。
【００２３】
（１０）好ましい実施態様において、本発明は上記段落（８）に記載されている単離ポリペプチド（ここで任意で、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つの追加アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている）に関する。
【００２４】
（１１）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似な配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２５】
（１２）本発明はさらに、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２６】
（１３）本発明は特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２７】
（１４）本発明はまた特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２８】
（１５）本発明は非常に著しく、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２９】
（１６）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３０】
（１７）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、かつ任意でＭｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３１】
（１８）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３２】
（１９）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３３】
（２０）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３４】
（２１）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３５】
（２２）本発明の好ましい実施態様は、上記段落（１）〜（２１）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列において、１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている）に関する。
【００３６】
（２３）非常に好ましい実施態様において、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７ＴｙｒおよびＧｌｕ４５９Ｌｙｓから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３７】
（２４）好ましい実施態様において、本発明は、上記段落（２３）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ３９６ＰｒｏおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つの追加アミノ酸変異を含有し得る）に関する。
【００３８】
（２５）好ましい実施態様において、本発明は、上記段落（２３）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｈｉｓ３９６ＰｒｏおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つの追加アミノ酸変異を含有し得る）に関する。
【００３９】
（２６）第２の好ましい実施態様において、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００４０】
（２７）非常に好ましい実施態様において、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００４１】
（２８）非常に好ましい実施態様において、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ３９６ＰｒｏおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００４２】
（２９）本発明はさらに、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｈｉｓ３９６ＰｒｏおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４３】
（３０）本発明はさらに、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１７ＬｅｕおよびＨｉｓ３９６Ｐｒｏから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに非常に著しく関する。
【００４４】
（３１）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４５】
（３２）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｍｅｔ２４４Ｖａｌを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含み機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４６】
（３３）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４７】
（３４）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４８】
（３５）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４９】
（３６）本発明はまた、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５０】
（３７）本発明はまた、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５１】
（３８）本発明はまた、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５２】
（３９）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５３】
（４０）本発明はまた、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｐｈｅ４８６Ｓｅｒを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５４】
（４１）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｌｅｕ２４８Ｖａｌを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５５】
（４２）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ａｌａを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５６】
（４３）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５７】
（４４）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５８】
（４５）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ３５９Ｖａｌを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５９】
（４６）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ａｒｇを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００６０】
（４７）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００６１】
（４８）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ４５９Ｌｙｓを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００６２】
（４９）別の実施態様において、本発明は上記段落（３１）〜（４８）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列は、Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し得る）に関する。
【００６３】
（５０）好ましい実施態様において、本発明は、上記段落（１）〜（４９）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列は配列番号：２のアミノ酸２２９〜５００からなる）に関する。
【００６４】
（５１）別の好ましい実施態様において、本発明は、上記段落（１）〜（５０）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチドに関し、該ポリペプチドはＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼである。
【００６５】
（５２）さらに別の好ましい実施態様において、本発明は、該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物を選別するための、上記段落（１）〜（５１）のいずれか１つの単離ポリペプチドの使用に関する。
【００６６】
（５３）本発明はまた、上記段落（１）〜（５１）のいずれか１つに記載されているポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する。
【００６７】
（５４）本発明は、該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用する上記段落（１）〜（５１）のいずれか１つのポリペプチドの生成における上記段落（５３）の核酸分子の使用にさらに関する。
【００６８】
（５５）本発明はまた、上記段落（５３）に記載されている核酸分子を含む組み換えベクターに関する。
【００６９】
（５６）本発明は特に、組み換え発現ベクターである上記段落（５５）に記載されている組み換えベクターにさらに関する。
【００７０】
（５７）本発明はまた、上記段落（５５）または（５６）に記載されている組み換えベクターを含む宿主細胞に関する。
【００７１】
好ましくは、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド（ここで、少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩による該チロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）に関する。
【００７２】
ＳＴＩ５７１の好ましい塩は、ＷＯ９９／０３８５４で記載されるメタンスルホン酸塩である。
本発明のポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングは、例えば、当該技術分野で公知の任意のインビトロチロシンキナーゼリン酸化アッセイでの本発明の単離ポリペプチドの使用、および該アッセイでの本発明のポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の潜在性の測定によりなされ得る。
【００７３】
当該技術分野において公知の高処理量スクリーニングアッセイを用いて、本発明のポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の大きな化合物ライブラリーをスクリーニングし得る。
【００７４】
大きな化合物ライブラリーのランダムなスクリーニングに加えて、本発明のポリペプチドはまた、以下のスクリーニング方法で用いられ得る：本発明のポリペプチドの３次元構造は例えば、Ｘ線結晶解析により決定される。次に、本発明のポリペプチドの原子座標を用いて、可能性のある阻害剤をデザインする。この可能性のある阻害剤を次に合成し、そしてインビトロのチロシンキナーゼリン酸化アッセイにおいて本発明のポリペプチドのチロシンキナーゼ活性の該阻害能について試験する。
【００７５】
実施例：
以下の実施例は、範囲を制限することなく本発明を説明するものである。
実施例１：
Ａｂｌキナーゼドメインの多数の変異をＡｂｌキナーゼドメインに結合するＳＴＩ５７１の３つのモデルに基づき生成し、そしてこの変異体キナーゼをＳＴＩ５７１に対する感受性について評価した。
【００７６】
様々な点変異を、ＳＴＩ５７１関連２−フェニルアミノピリミジンＡｂｌ−特異的阻害剤と共に同時結晶化したＡｂｌキナーゼドメインのモデルに基づき発生させた［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］。Ａｂｌの結晶構造によりＳＴＩ５７１の潜在的結合部位として同定したアミノ酸は、Ｔ３１５、Ｍ２９０、Ｅ２８６、Ｋ２７１およびＤ３８１およびＭ３１８でのペプチドバックボーンとの水素結合、ならびにＩ３１３、Ｆ３８２、Ｖ２５６、Ｙ２５３およびＬ３７０との疎水性相互作用を含んでいる。変異を発生させて、ＡｂｌキナーゼとＳＴＩ５７１との間の水素結合または疎水性相互作用の可能性を除去した［ｃ−Ａｂｌアミノ酸２２０〜４５８からなるＡｂｌキナーゼドメインを、ｐＧＥＸ ＫＧ（Pharmacia）のＢａｍ ＨＩサイトにサブクローン化した。Hemagglutin（１２ＣＡ５）抗体認識標識を、Ａｂｌリン酸化ドメインとしてかつタンパク質発現の検出のためＡｂｌキナーゼドメインの５’末端で挿入した。キナーゼドメイン内の全変異を、適当な点変異を含有するプライマーでＡｂｌキナーゼｐＧＥＸ ＫＧプラスミドのポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて構築した］。
【００７７】
Ｍ３１８およびＤ３８１はペプチドバックボーンを介してＳＴＩ５７１と水素結合を形成することが予測されるので、該部位での変異は不適切である。変異のＩＣ５０値を表１に要約する［Ａｂｌキナーゼドメイン変異のＧＳＴ融合タンパク質ならびに野生型Ａｂｌキナーゼを、指数関数的に増殖する形質転換ＤＨ５α細菌の１ｍＭのイソプロピルフェニルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）での誘導により生成させた。細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１ｍＭ バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフッ化物および１０μＭ βーメルカプトエタノールを含有するＭＴ ＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４ｍＭ Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）での超音波処理により溶解した。ＧＳＴ−Ａｂｌキナーゼ変異体を、グルタチオンセファロースに一晩４℃で結合させることにより可溶化液から精製した。結合タンパク質を、０．５Ｍ ＬｉＣｌで２度、ＰＢＳ（リン酸バッファー食塩水ｐＨ７．５）で２度、そしてＡｂｌキナーゼ洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１度洗浄した。結合タンパク質濃度を、続いてクーマシーブルー染色するＳＤＳ ＰＡＧＥにより測定した。Ａｂｌキナーゼタンパク質および変異の全てを発現させ、そしてこの方法で精製した。５００ｎｇの結合タンパク質をそれぞれのキナーゼ反応に用いた。キナーゼ反応を３０μｌのＡｂｌのキナーゼバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ バナジン酸ナトリウム、１μＭ ＤＴＴ、１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））中で行った。キナーゼ反応に加える前に、ＳＴＩ５７１を３％ ＤＭＳＯに溶解した。Ａｂｌキナーゼ変異を、０μＭから１μＭの範囲の濃度のＳＴＩ５７１と共に１０分間インキュベートし、その後１０μＣｉのγ３２Ｐ ＡＴＰ（１００μＭ 全ＡＴＰ）を添加し、そしてキナーゼ反応を３０分間続けさせた。反応をＳＤＳローディングダイ中でボイルすることで終結させ、そして試料をＳＤＳ ＰＡＧＥ（等量のタンパク質添加液を抗Ａｂｌキナーゼドメイン抗体Ａｂ−２（Santa Cruz）を用いる免疫ブロットにより示した）により分析した。Ａｂｌ自己リン酸化シグナル強度をホスフォイメージャー（Molecular Dynamics）で定量し、そしてＩＣ５０値を決定した。］同様のキナーゼアッセイを用いて報告されたものと一致して、野生型ＡｂｌキナーゼのＩＣ５０値は０．０２５μＭであった。Ｋ２７１Ｒ、Ｅ２８６Ｌ、Ｍ２９０ＡおよびＩ３１３Ｇがキナーゼ不活性型変異を生じた。Ｌ３７０Ｇの変異はＳＴＩ５７１に対する感受性を変化させなかった。反対に、Ｔ３１５ＶはＳＴＩ５７１に対して減少した感受性を示した。この変異のＩＣ５０値は平均して０．３０μＭであり、野生型Ａｂｌキナーゼのものより約１０倍高かった。野生型Ａｂｌと比べてＳＴＩ５７１に対するこの変異の減少した感受性は、阻害剤の第２級アミノ基とＴ３１５の側鎖との間の重要な水素結合を呈示する結晶構造からの推測と一致する。
【００７８】
結晶構造が利用できるようになる前は、変異を、既知のキナーゼドメイン構造に基づくＡｂｌに結合するＳＴＩ５７１のコンピューターモデリングによって生成させた。該変異を分析して、該変異が既知のＡｂｌキナーゼドメイン構造に適合できるか否かを決定した。例えば、ＳｒｃファミリーメンバーＬｃｋの結晶構造に基づくＡｂｌのコンピューターモデルを最初に分析した［Yamaguchi H. and Hendrickson W.A., Nature 384, 484 (1996)］Ｌｃｋに基づくモデルから予測した結合点の変異を、ＳｒｃまたはＦｍｓのいずれかの対応する残基に対して引き起こした（表２）。該変異の大部分がキナーゼ不活性型であるか、またはＳＴＩ５７１に対する感受性の変化を示さないかのいずれかであった。この結果は、ＡｂｌキナーゼおよびＳｒｃファミリーキナーゼのＡＴＰ結合部位ポケットのアミノ酸配列の差よりむしろ形態的差がＳＴＩ５７１の特異性の原因であることを示す結晶構造からの推測を支持した。興味深いことに、Ａ３８０Ｔの変異は、野生型ＡｂｌキナーゼのＩＣ５０を１０倍超えるＳＴＩ５７１結合についてのＩＣ５０を生じた。この残基はSchindler等のモデル［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］で予測された結合点ではないが、隣接残基Ｄ３８１がＳＴＩ５７１との重要な水素結合を形成する。より小さなグリシンへのＡ３８０の変異がＳＴＩ５７１に対する感受性を変化させないため、若干大きな残基への変異がＡ３８０Ｔ変異の感受性の減少を説明できるＳＴＩ５７１結合表面の立体効果または小さな立体構造変化のいずれかを導入するようである。従って、Ｌｃｋキナーゼから予測した全てを、Ａｂｌ結晶構造により説明できる。
【００７９】
Ａｂｌキナーゼに結合するＳＴＩ５７１の第３のモデルを、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）のコンピューターモデリングから推定する［Mohammadi M. et al., Science 276, 955 (1997)］。このモデルにおいて、ＳＴＩ５７１は、Schindler等のモデルで見られるものと比べて逆の向きで結合する。加えて、Ｅ２５８、Ｍ３１８およびＬ２４８を含むいくつかの新たな潜在的結合点を同定した。該結合モデルは、ＳＴＩ５７１が結晶構造中の予測結合部位であるＶ２５６およびＬ３７０を結合することも予測する。該残基の変異を、ＳＴＩ５７１に対する該感受性について調べた（表３）。上記変異の多くと同様に、これらのうちいくつかがキナーゼ不活性型であった。興味深いことに、Ｅ２５８Ｇ変異が野生型Ａｂｌキナーゼのものより８倍高い、０．１８μＭのＩＣ５０値を示した。変異のＳＴＩ５７１の感受性の減少は、Ｅ２５８の水素結合能がＳＴＩ５７１とＡｂｌキナーゼとの間の相互作用に重要であり得ることを示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１．変異を水素結合形成能または疎水性のいずれかを失っている残基に対して引き起こした。ＳＴＩ５７１がＭ３１８およびＤ３８１のペプチドバックボーンと水素結合するものと予測した。それゆえ、該残基の変異は行われなかった。多くの変異がキナーゼ不活性型Ａｂｌを生じた。Ｌ３７０ＧはＳＴＩ５７１に対する感受性を変化させなかった。Ｔ３１５Ｖの変異は野生型Ａｂｌキナーゼと比べて１０倍、ＳＴＩ５７１に対する感受性が増加した。
【００８２】
【表２】
【００８３】
表２．Ａｂｌキナーゼドメイン変異は、阻害剤結合のＬｃｋコンピューターモデルに基づく。不活性型Ａｂｌキナーゼドメインの構造を、阻害剤結合Ｌｃｋの結晶構造由来（Kinetix Pharmaceuticals由来）の情報を用いて形成した。変異をＳｒｃまたはｆｍｓのいずれかの対応残基に対して、ＳＴＩ５７１とのＡｂｌの予測結合点について起こさせた。変異のほとんどが、ＳＴＩ５７１に対する感受性の無変化またはキナーゼ不活性型Ａｂｌのいずれかを生じた。Ａ３８０Ｔの変異は野生型Ａｂｌキナーゼと比べて１０倍、ＳＴＩ５７１に対する感受性が減少した。このことは、変異型ＡｂｌのＳＴＩ５７１結合表面の立体効果または立体構造変化に起因するようである。
【００８４】
【表３】
【００８５】
表３．Ａｂｌキナーゼドメイン変異は、阻害剤結合の線維芽細胞成長因子受容体モデルに基づく。変異を、水素結合または大きな疎水性側鎖を除くＳＴＩ５７１とのＡｂｌの予測結合点について行った。変異の多くはキナーゼ不活性型Ａｂｌを生じた。Ｅ２５８Ｇの変異は、野生型Ａｂｌキナーゼと比べて８倍、ＳＴＩ５７１に対する感受性が減少した。
【００８６】
さらなる構造研究が、Ａｂｌキナーゼドメインの残基Ｉｌｅ３６０およびＨｉｓ３６１がＳＴＩ５７１の結合に関与することも明らかにした。それゆえ、該位置のアミノ酸変異がＳＴＩ５７１抵抗性をもたらす潜在性を有する。
【００８７】
実施例２：
ＳＴＩ５７１での治療前および薬物で治療中の再発時の６人の患者の臨床試料を、ＡｂｌキナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケットおよび活性化ループ中の変異の存在について解析した。解析した患者のうち、
２人が進行期のＣＭＬに罹患し（リンパ性急性転化、１人の患者；再発時の急性転化に進行する加速期ＣＭＬ、１人の患者）、３人の患者がＰｈ＋ＡＬＬに罹患し、そして１人の患者が混合型Ｐｈ＋急性白血病に罹患していた（表４参照）。
【００８８】
【表４】
【００８９】
表４．臨床データ
Ｐｈ＋：フィラデルフィア染色体陽性；ＡＬＬ：急性リンパ芽球性白血病；ＣＭＬ：慢性骨髄性白血病；ＡＰ：加速期、骨髄の芽球のパーセンテージ＞１５％だが＜３０％に基づく；ＢＣ：急性転化、骨髄の芽球のパーセンテージ＞３０％に基づく；ＣＨＲ：血液学的完全寛解、以下の全ての判定基準に基づく：骨髄中の芽球数＜５％、末梢血を循環している芽球がない、絶対好中球数＞１．５×１０９／Ｌ、血小板数＞１００×１０９／Ｌ、髄外所見なし；ＰＣＲ：細胞遺伝学的部分寛解、５／１００のＰｈ染色体陽性分裂中期細胞の発見に基づく；ＲＣＰ：慢性期への回帰、以下の全ての判定基準に基づく：血液または骨髄中の芽球のパーセンテージ＜１５％、末梢血または骨髄中の芽球＋前骨髄球のパーセンテージ＜３０％、末梢血好塩基球＜２０％；Ｂｉｐｈ：骨髄およびリンパ球両方の表面マーカーの発現に起因する混合型疾患
＊ＳＴＩ５７１での治療前
＊＊Ｐｈ＋ＡＬＬの再発のため一日当たり８００ｍｇのＳＴＩ５７１を継続投与
＊＊＊ＣＭＬ急性転化への急激な再発のため一日当たり６００ｍｇのＳＴＩ５７１を投与
#末梢血中芽球様細胞の持続および骨髄中＞３０％芽球細胞を伴う汎血球減少症
##１０週間末梢血を循環している芽球がなくかつ絶対好中球数＞１．０×１０９／Ｌだが、骨髄中の芽球数＞５％持続
＋一日当たり６００ｍｇのＳＴＩ５７１
＋＋再発（白血球数３６０×１０９／Ｌ、８５％の芽球様細胞）のため一日当たり６００ｍｇのＳＴＩ５７１投与から８００ｍｇのＳＴＩ５７１に切り替え
§骨髄を検査していない
§§ＮＬＥ：末梢血に白血病の所見なし、以下の発見に基づく：末梢血を循環している芽球がなく、完全好中球数＞１．０×１０９／Ｌ、血小板数＞２０×１０９／Ｌ、骨髄を検査していない
【００９０】
精製した末梢血および／または骨髄細胞由来の全ＲＮＡを、ＲＮＡＣｌｅａｎ（Hybaid GmbH, Heidelberg, Germany）を用いて抽出した。臨床試料当たり１０ｎｇのＲＮＡ、ポジティブコントロールとして１０ｐｇのＫ５６２全ＲＮＡおよびネガティブコントロールとして鋳型を含まない反応液を、３’Ａｂｌ特異的プライマー（５’−ＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣ−３’）および５’Ａｂｌ特異的プライマー（５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧ−３’）を用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の対象とした。ＡＭＶ逆転写酵素をファーストストランド合成のため、Expand high fidelity（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびプルーフリーディングポリメラーゼ；Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）を増幅のために用いた。ヒトβ−アクチンは、フォワードプライマー５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’およびリバースプライマー５’−ＡＧＧＧＴＡＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＣ−３’（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）を用いてコントロールとして働かせた。増幅５７９ｂｐフラグメントを、２つのＡｂｌ特異的プライマー（５’−ＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣ−３’および５’−ＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧ−３’）および２つの別の５’Ａｂｌ特異的プライマー（５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧ−３’および５’−ＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣ−３’）をそれぞれ用いて、ＡＢＩ３７００シークエンサー（PE Biosystems, Foster City, CA, USA）で配列決定した。配列解析を、Lasergeneソフトウエア（DNA＊, Madison, USA）を用いて行った。患者および時間ポイント当たり２〜９回ＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、そして単独で解析した。それぞれの患者および時間ポイントで１００％の配列同一性を示した。全体として、ＳＴＩ５７１−抵抗性疾患時に見られる６つの１点変異を除き、互いにおよびヒトｃ−Ａｂｌ（ＧＩ：２８２３６）の配列に対する全プローブの配列同一性は１００％であった。
【００９１】
【表５】
【００９２】
表５．配列解析
＊一日当たり６００ｍｇのＳＴＩ５７１を投与されている１度目の再発
＊＊一日当たり８００ｍｇのＳＴＩ５７１を投与されている２度目の再発
♯ヌクレオチド／アミノ酸残基がヒトｃ−Ａｂｌの最初のヌクレオチド／アミノ酸（受託番号：ＧＩ：２８２３６）から番号付けされている
＋異なる時間ポイントの解析
【００９３】
６人の患者のうち、配列解析により５人の患者の臨床試料において１点変異の存在が明らかになった。５つの変異全部が、ＡｂｌキナーゼドメインのＡＴＰ結合部位（患者１、３、４、および６、表５参照）または活性化ループ（患者５）内にアミノ酸変換を生じ、抵抗性疾病発症時に得た試料においてのみ存在した。１人の患者（６番、表５参照）において、ＡＴＰ結合部位の位置３１５（ヒトｃ−Ａｂｌの最初のアミノ酸ＧＩ：２８２３６から番号付け）でのＴｈｒ→Ｉｌｅ変換を導くヌクレオチド１０９１Ｃ→Ｔ（ヒトｃ−Ａｂｌの最初のヌクレオチドＧＩ：２８２３６から番号付け）でのヒトｃ−Ａｂｌキナーゼドメインの点変異を検出できた。興味深いことに、この患者は、より少量を投与されていた抵抗性疾病発症時にＴ３１５Ｉが存在したにも関わらず、ＳＴＩ５７１の一日の投与量が６００〜８００ｍｇに増加した後、２度目の効果を経験していた（表４および表５参照）。Ｔｈｒ３１５の存在が、ＳＴＩ５７１が結合し、従ってＡｂｌを阻害する鍵となる要件であることを考慮すると［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］、この観察は悪性クローンの成長の原因となる未変異型Ｂｃｒ−Ａｂｌの存在を必要としなければならい。このことは、抵抗性疾病発症時に得た４つの試料全部の一塩基多型（ＳＮＰ）解析がｃ−Ａｂｌの位置１０９１でのＳＮＰの証拠を示し、クロマトグラフィーでＴ−シグナルの後ろでＣ−バックグラウンドとして明らかであり、そして６００ｍｇに不応時に得た試料と８００ｍｇに不応時に得た試料とを比較した際に、変異型転写物に伴って該多相性が優位に減少することは、正しいと思われる。この発見は、Ｔ３１５Ｉが多数のＢｃｒ−Ａｂｌ分子に存在すると、ＳＴＩ５７１の生物学的活性を無くすことを強く示す。
【００９４】
患者番号４（表５参照）でヒスチジンに変換された位置２５３のチロシンは、アスパラギン３２２と水素結合して、所定の２β鎖間の折りたたまれたループを維持し、ＳＴＩ５７１との表面相補性を増加し、そしてさらにＳＴＩ５７１の芳香環とのファンデルワールス結合を維持するとわかっていた［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］。
【００９５】
患者１および３において見られる点変異の両方は、それぞれ、患者１ではバリン（疎水性）への、そして患者３ではリジン（親水性、正に帯電）へのＡＴＰ結合部位の位置２５５のグルタミン酸（親水性、負に帯電）の変換を生じる。ＳＴＩ５７１の芳香環の１つとの隣接バリン２５６の相互作用を考慮すると［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］、該変換も薬物結合を損なう立体構造変化を導き得る。
【００９６】
患者５において見られる変異、位置３９６のヒスチジンのプロリンへの変換は、活性化ループ内に位置する。Ａｂｌの該領域は、Ｈｉｓ３９６のＮＨ２−末端に位置するアンカー領域を除いて、ＳＴＩ５７１と直接相互作用しないが、不活性型（閉環）構造においてはＡｂｌへのＳＴＩ５７１の特異的結合に必要である［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］。該変異が、開環立体構造の活性化ループを安定化し得ると推測し得る。そしてそのことは、Ａｂｌの主要なリン酸化部位であるＴｙｒ３９３のリン酸化による開環立体構造を安定化後、ＳＴＩ５７１による阻害の影響を受けにくいことが示されている［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］。
【００９７】
要するに、６人の患者の解析は、ＳＴＩ５７１に不応性のＰｈ＋白血病の場合、ＡＴＰ−結合部位または活性化ループ内の変異がしばしば生じることを示す。従って、悪性クローンのＢｃｒ−Ａｂｌ依存性増殖は、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性を変化させることなくＢｃｒ−ＡｂｌへのＳＴＩ５７１の結合を損なわせることにより回復され得る。
【００９８】
実施例３：
ＰＣＲストラテジーを用いて、Ｂｃｒ−ＡｂｌｃＤＮＡのＡＴＰ結合領域を増幅し、そして全領域を両方向に配列決定した。急性転化ＣＭＬ（骨髄性ＢＣ２人、リンパ球性ＢＣ２人）、加速期（１人）またはＳＴＩ５７１に対して血液学的抵抗性となった２度目の慢性期ＣＭＬ（１人）のためＳＴＩ５７１投与中の患者の４／６に、Ｂｃｒ−Ａｂｌの変異を発見した。１人の患者は変異Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅを有していた。２人の患者は位置２５０での変異を有し、それはグルタミン酸をグリシンに置換したものであった。１人の患者はアミノ酸２５３での変異を有し、そしてヒスチジンをチロシンに置換したものであった。アミノ酸２５０は、アミノ酸３１５の様にはＳＴＩ５７１と水素結合せず、アミノ酸２５３の様には阻害剤とのファンデルワールス結合に関与しない。試料が利用可能な場合（３つの場合）、変異がＳＴＩ５７１治療前に存在せず、かつ正常Ａｂｌ対立遺伝子に存在しないことを確認した。また、血液学的効果を示しそして維持しているが、ＳＴＩ５７１に対してはマイナーな細胞遺伝学的効果を示すだけか、または細胞遺伝学的効果を示さない移行期ＣＭＬ（５人）または慢性期ＣＭＬ（３人）の８人の患者のＢｃｒ−ＡｂｌのＡＴＰ結合領域を配列決定した。該患者の全てが、ＳＴＩ５７１治療の６〜９ヶ月後に変異の証拠を示さなかった。Ｂｃｒ−Ａｂｌのいくつかの点変異が移行期ＣＭＬ患者で出現し、Ｂｃｒ−ＡｂｌへのＳＴＩ５７１結合を完全にまたは部分的に阻害するようであると推測する。
【００９９】
実施例４：
ＲＴ−ＰＣＲストラテジーを用いて、２８患者のＢｃｒ−ＡｂｌのＡｂｌキナーゼドメインを増幅し、そして配列決定した。５箇所のオーストラリアの施設での拡大アクセス研究に登録された２５３患者からＳＴＩ５７１−不応性およびＳＴＩ５７１−抵抗性患者を選択した。ねらいは、注意深く定義した臨床グループ内の後天的変異の生じる頻度およびタイミングの測定、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼドメイン内の該分布の測定、および特定の変異と臨床的特徴との関連の決定であった。
【０１００】
研究デザイン
ＳＴＩ５７１−抵抗性患者（ｎ＝１８）を、少なくとも３ヶ月間続いた血液学的完全寛解を喪失した者、または急性期ＣＭＬまたはＰｈ＋ＡＬＬ再発へと移行した者として定義した。ＳＴＩ５７１−不応性患者（ｎ＝１０）は、少なくとも６ヶ月の治療後、主要細胞遺伝学的効果を達成できなかった者であった。
【０１０１】
血液からのＲＮＡの抽出、逆転写およびＤＮＡ配列決定の方法は既に記載されている［Branford S. et al., Br. J. Haematol. 107, 587-599 (1999)］。ロングＰＣＲ法［Branford S. et al., Br. J. Haematol. 109, 635-637 (2000)］を用いて、Ｂｃｒ−ＡｂｌのＡｂｌキナーゼドメインを、フォワードプライマーＢｃｒＦ（５’ｔｇａｃｃａａｃｔｃｇｔｇｔｇｔｇａａａｃｔｃ）およびリバースプライマーＡｂｌＫｉｎａｓｅＲ（５’ｔｃｃａｃｔｔｃｇｔｃｔｇａｇａｔａｃｔｇｇａｔｔ）で増幅した。第２段ＰＣＲでは、フォワードプライマーＡｂｌＫｉｎａｓｅＦ（５’ｃｇｃａａｃａａｇｃｃｃａｃｔｇｔｃｔ）およびリバースプライマーＡｂｌＫｉｎａｓｅＲを用いた。全キナーゼドメインを配列決定し、領域は８６３塩基を含んでいた（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４７５２）。
【０１０２】
結果
ＳＴＩ５７１−抵抗性患者：
１８人のＳＴＩ５７１−抵抗性患者のうち１２人がＢｃｒ−ＡｂｌのＡＴＰ結合領域に変異を有していた（表６）。試料が利用可能であった９人の場合で、変異がＳＴＩ５７１治療を開始する前に存在せず、それぞれの場合で抵抗性の発現前であった３〜９ヶ月で試験した４人の場合で存在しないことを確認した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異のない６人の抵抗性患者のうち３人が、再発時にクローン発生の証拠を示し、２人の場合では追加のフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体を含んでいた。１人の患者は、再発時に変異と別のＰｈ染色体の両方を有していた。
【０１０３】
同定した６変異はＴ３１５Ｉ（ｎ＝３患者）、Ｙ２５３Ｈ（ｎ＝１）、Ｆ３１７Ｌ（ｎ＝１）、Ｅ２５５Ｋ（ｎ＝４）、Ｇ２５０Ｅ（ｎ＝２）およびＭ３５１Ｔ（ｎ＝１）である。
【０１０４】
１８人のＳＴＩ５７１−抵抗性患者を、急性転化またはＰｈ＋ＡＬＬ（ｎ＝８）へと再発したもの、加速期へと再発したもの（ｎ＝６）、および血液学的寛解の喪失の証拠を伴う依然慢性期のままの者（ｎ＝４）へとさらに分けることができた。急性転化／ＡＬＬへと直接再発した８人の患者のうち６人が変異を有していた。これらのうち３人では、Ｔ３１５Ｉ変異が存在した。加速期へと再発した６人の患者のうち２人が変異を有していた。慢性期へと再発した残りの４人の患者の全てが変異を有していた。
【０１０５】
ＳＴＩ５７１−不応性患者：
１０人の不応性患者のうちただ１人が変異を有していた（表６）。ＳＴＩ５７１治療前または処置開始後３ヶ月での変異の証拠はない。野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌと混ざって変異クローンが８ヶ月で出現し、そして変異クローンが１１ヶ月で優性となるまで混在パターンで持続した。これまで、患者の抵抗性の臨床的証拠はない。
【０１０６】
表６．ＳＴＩ５７１で処置された患者の臨床的経過および変異解析
【表６】
【０１０７】
表６の続き
【表７】
【０１０８】
表６の続き
【表８】
【０１０９】
表６の続き
【表９】
【０１１０】
Ｆ：女性；Ｍ：男性；ｍ：月
ＮＭは、Ｂｃｒ−Ａｂｌのキナーゼ領域の両方向の配列決定に従って検出された変異がないことを示す。
Ｃはクローン発生を示す。
Ｐは２本鎖フィラデルフィア染色体を示す。
＊疾患状態／効果：１ａ）骨髄性急性転化 ｂ）リンパ球性急性転化 ｃ）Ｐｈ陽性ＡＬＬ再発。２）加速期、３）慢性期、４）部分寛解（血液＋骨髄の芽球＜１５％）、５）血液学的完全寛解（ＷＢＣ＜１０．０、血小板＜４５０、芽球なし、骨髄球＋後骨髄球＜５％、前骨髄球なし、異常関連症状かつ髄外異常なし）、６）メジャー細胞遺伝学的効果、７）細胞遺伝学的完全寛解
†処置開始以後の月数
‡患者を８ヶ月間研究対象としたが、ＳＴＩ５７１を経口ヒ素と月ごとに交代させた。そしてそれゆえ患者は、この期間中、ＳＴＩ５７１を４ヶ月間だけ投与された。
§Ｐｈ陽性ＡＬＬ患者
【０１１１】
さらなる研究により、Ｐｈ染色体陽性白血病に罹患するＳＴＩ５７１−抵抗性／不応性患者の２つの追加変異、すなわち、Ｍｅｔ２４４ＶａｌおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒの存在が明らかになった。
【０１１２】
別の研究では、オーストラリアおよびニュージーランドの１２のセンターのＣＭＬ患者を変異解析について試験した。試料をＢＣＲ−ＡＢＬレベルの分子評価のためまず集め、保存ＲＮＡが測定可能なレベルのＢＣＲ−ＡＢＬを含有し、かつ対照遺伝子レベルが未分解ＲＮＡを示したときのみ変異解析を続けた。患者は、６ヶ月またはそれ以上のイマチニブ治療を受けたか、または抵抗性となり６ヶ月前に治療を終えたかのいずれかであった（ｎ＝２）。１５６患者由来の試料が利用可能であったが、１２の試料のうち４つが低レベルのＢＣＲ−ＡＢＬのため、そして８つがＲＮＡの質が十分でないため試験できなかった。残る１４４人の患者をイマチニブの開始時の異常段階によりグループ化した；ＡＰが４０人、診断から１２ヶ月以上であるとして定義された後期ＣＰの６４人、および診断から１２ヶ月未満であるとして定義された初期ＣＰの４０人。１６人の初期ＣＰ患者がインターフェロン治療に既に失敗し、そして２４人がイマチニブ治療前、ヒドロキシ尿素を投与去れているだけであった。イマチニブの効果を、フィラデルフィア染色体陽性細胞の数が３５％未満ならメジャー細胞遺伝学的効果（ＭＣＲ）、または３５〜１００％ならＭＣＲなしのいずれかについて６ヶ月時での細胞遺伝学的解析により分類した。イマチニブ抵抗性を、少なくとも３ヶ月間続いた血液学的完全寛解（ＣＨＲ）の喪失、加速期または急性期への変化を伴うＣＨＲの喪失、または確立したＣＨＲまたは細胞遺伝学的完全寛解（フィラデルフィア染色体陰性として定義されたＣＣＲ）の喪失として定義した。３４６のＲＮＡ試料を本明細書において既に記載した様に解析した。利用可能なＲＮＡにより、患者を１〜１５の異なる時間ポイント間で変異について試験した。それゆえ、イマチニブ治療の投与期間の中央値を、最後の時間ポイントの解析から決定した。ＡＰ患者のイマチニブ投与の中央値は９ヶ月（範囲４〜２４）であり、後期ＣＰ患者の中央値は１０ヶ月（範囲６〜２４）であり、そして初期ＣＰ患者の中央値は１４ヶ月（範囲５〜２４）であった。
【０１１３】
加速期患者のイマチニブ抵抗性
４０人のＡＰ患者のうち１４人がイマチニブ抵抗性となり、５人が急性期への変化を伴い、８人がＡＰの再発を伴い、そして１人がＣＣＲの喪失を伴っていた。変異を、イマチニブ治療の中央値である８ヶ月（範囲４〜１３）で１４人中１２人（８６％）の抵抗性患者で検出した。
【０１１４】
後期慢性期患者（後期ＣＰ）のイマチニブ抵抗性
６４人の後期ＣＰ患者のうち１３人がイマチニブ抵抗性となり、５人が急性期への変化、６人がＡＰへの変化そして２人がＭＣＲの喪失を伴っていた。変異を、イマチニブ治療の中央値である８ヶ月（範囲３〜１８）で１３人中１１人（８５％）の抵抗性患者で検出した。
【０１１５】
初期慢性期患者（初期ＣＰ）のイマチニブ抵抗性
４０人の初期ＣＰ患者のうち６人が抵抗性となり、１人が急性転化へと変化し、２人がＡＰへと変化し、２人がＣＣＲを喪失し、そして１人がＭＣＲを喪失した。抵抗性患者で変異を検出しなかった。
【０１１６】
ＣＭＬの継続期間および変異の発生
６ヶ月以内にメジャー細胞遺伝学的効果（ＭＣＲ）を達成した研究中の全患者を調べると、診断から４年より長く処置された者が、４年以内の処置であった者より９倍高い変異の発生率を有していた（２２人中６人（２７％）対７２人中２人（３％））。６ヶ月以内にＭＣＲを達成しなかった全患者を調べると、診断から４年より長く処置された者が、４年以内の処置であったものより２倍高い変異の発生率を有していた（２２人中１２人（５４％）対２８人中７人（２５％））。変異の最高発生率は、診断から４年より長く処置されたＡＰ患者で、かつ６ヶ月までにＭＣＲを達成できなかったＡＰ患者においてであった（１２人中８人、６７％）。この研究では、１４４人のうち２７人の患者が変異を発生した。変異を有する２７人の患者のイマチニブ治療の開始前のＣＭＬの継続期間の中央値（５．３年、範囲１．１〜１１）は、変異のない１１７人の患者のもの（１．３年、範囲０．０２〜１７．７）（ｐ＜０．０００１）と統計的に異なった。
【０１１７】
ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインの変異
表７に、２７人の患者で検出されたＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインの１７の異なる変異を列挙する。全点変異が存在し、そしてそれはアミノ酸２４４から４８６に関与する７２８のヌクレオチド配列内に位置していた。７人の患者が２〜４の変異を有し、そして１人の患者が位置２５２でのグルタミンからヒスチジンへとアミノ酸を変化させる同一のヌクレオチドでの２つの異なる変異を有していた。Ｎ−末端でのＬ２４８ＶおよびキナーゼドメインのＣ−末端でのＳ４１７Ｙ、Ｅ４５９ＫおよびＦ４８６Ｓの変異はこれまでに発表されていない。最初の３つの変異は、Ｇ２５０Ｅ変異も有する１人のイマチニブ抵抗性患者において全て検出された。
【０１１８】
表７．ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインの変異
【表１０】
＊７人の患者が複数変異を有した
【０１１９】
実施例５：
抵抗性の４つの分子メカニズムおよび染色体メカニズムを、慢性期（ＣＰ、ｎ＝１３６）、加速期（ＡＰ、ｎ＝８０）、骨髄性急性転化（ＢＣ、ｎ＝７３）、およびリンパ球性ＢＣ（ｎ＝１）の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のためＳＴＩ５７１で処置された計２９０人の患者の中からＳＴＩ５７１単独療法（一日あたり４００〜８００ｍｇ経口）に対して不応性または抵抗性の４２人の患者（ｐｔｓ）（男性２１人、女性２１人；平均年齢６０歳、範囲２６〜７０歳）において調べた。患者を６つの多施設試験での第ＩＩ相研究へと追加した。ＳＴＩ５７１治療前、抵抗性患者は骨髄性ＢＣ（ｎ＝２８）またはリンパ球性ＢＣ（ｎ＝１）、ＡＰ（ｎ＝９）、またはＣＰ（ｎ＝４）であった。治療の継続期間の中央値は１２３日（範囲１３〜７４１）であった。ＳＴＩ５７１前および抵抗性時に、Ｂｃｒ−Ａｂｌ転写物の発現を、末梢血リンパ球において、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ゲノムＢｃｒ−Ａｂｌのコピー数を相間蛍光インサイツハイブリダイぜーション（ＩＰ−ＦＩＳＨ）により、そしてクローン核型進化（clonal karyotypic evolution）を分裂中期細胞遺伝学により、測定した。Ｂｃｒ−ＡｂｌのチロシンキナーゼドメインのＳＴＩ５７１結合部位を、抵抗性芽球由来のｃＤＮＡから配列決定した。結果：（ｉ）比Ｂｃｒ−Ａｂｌ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼで発現したＢｃｒ−Ａｂｌ転写物の平均レベルは、ＳＴＩ５７１治療前は４．６％（０．１〜４３％）であり、そして抵抗性（ｎｓ）時では５．３％（０．０７〜１００）であった。３／２１の患者は、＞１０倍のＢｃｒ−Ａｂｌの過剰発現を示した；（ii）Ｂｃｒ−Ａｂｌのゲノム増幅をＩＰ−ＦＩＳＨにより調べた２／２１患者で発見した；（iii）クローン進化を生じる追加染色体異常を７／２３患者において観察し、そのうち５人が異数性に発生した；（ｉｖ）ＡｂｌチロシンキナーゼドメインのＡＴＰ結合部位の点変異を６／４０患者において検出した。変異は、結合部位の立体構造を変化させるアミノ酸置換（Ｙ２５３Ｆ、ｎ＝１；Ｅ２５５Ｋ、ｎ＝２；Ｅ２５５Ｖ、ｎ＝１；Ｔ３１５Ｉ、ｎ＝２）を導く。変異をＤＮＡ制限酵素切断分析により確認し、そして治療前の試料から除去した。Ｂｃｒ−Ａｂｌの再活性化を、リン酸化Ｃｒｋｌの平均的群である６３％（範囲３８〜７７％）で、ＳＴＩ５７１に対する非感受性を示す点変異を有する５人の患者でのＣｒｋｌ免疫ブロットにより確認した。Ａｂｌの自己リン酸化アッセイは、野生型Ａｂｌの０．０２５μＭからＹ２５３Ｆの０．５μＭ、Ｅ２５５Ｋの０．４μＭ、Ｅ２５５Ｖの＞０．５μＭ、およびＴ３１５Ｉの０．３０μＭのＳＴＩ５７１に対するＩＣ５０の増加を示した。
【０１２０】
さらなる研究により、Ｐｈ染色体陽性白血病に罹患するＳＴＩ５７１−抵抗性／不応性患者の追加変異、すなわち、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５ＧｌｙおよびＨｉｓ３９６Ａｒｇの存在が明らかになった。
【０１２１】
実施例６：
材料および方法
患者
インターフェロンα（ＩＮＦ−α）に抵抗性かまたは不寛容である７１人のＣＭＬ患者を、３つの多センターでの第２相治験においてＳＴＩ５７１で処置した。３ヶ月の治療後、彼らのうち３４人がＳＴＩ５７１に対して血液学的および細胞遺伝学的効果（すなわち、正常血球数およびＰｈ陽性分裂中期細胞が６５％より多い）を示したが、一方で２９人が細胞遺伝学的効果を示さなかった。彼らのうち慢性期の１６人および加速期の８人を含む２４人をＡｂｌ遺伝子変異について解析した。５人の残りの患者について利用可能な材料はなかった。
【０１２２】
ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＥＬＰアッセイ
ＲＮＡ抽出。全ＲＮＡを、製造元の指示によりＴＲｉｚｏｌ試薬（Life Technologies、ＵＫ）で凍結した一定分量の１０７人の末梢血リンパ球から抽出した。ＲＮＡペレットを１０μｌのＲＮＡｓｅフリーの水に再溶解し、そして量を紫外線蛍光分析法により評価した。
【０１２３】
逆転写。ｃＤＮＡを既に記載された様に２０μｌの反応混合液中１μｇの全ＲＮＡから合成した［Morschhauser F. et al., J. Clin. Oncology 18, 788-794 (2000)］。
【０１２４】
４１２ｂｐフラグメントのＰＣＲ増幅を、２μｌのｃＤＮＡ（１００ｎｇの全ＲＮＡに対応）、１×ＴａｑＧｏｌｄ反応バッファー（Applied Biosystem、ＵＳＡ）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（Pharmacia、Sweden）、０．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Applied Biosystem、ＵＳＡ）、および５０ｐｍｏｌのプライマーＦ２：５’−ＧＡＧ ＧＧＣ ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡ−３’およびＲ２：５’−ＧＣＴ ＧＴＧ ＴＡＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴ−３’で行った。用いたサーモサイクリングの条件は、９４℃で１２分、続いて９４℃、１分間の変性、５７℃、１分間のアニーリング、７２℃、１分間の伸長の３５サイクル、および７２℃、５分の最終伸長ステップであった。
【０１２５】
ＲＥＬＰ解析。ＰＣＲ産物の１／５を５Ｕの制限酵素Ｄｄｅ Ｉ（Roche、Switzerland）により切断し、２．５％のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルで電気泳動した。
【０１２６】
ＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡを、製造元の指示によりＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Qiagen、Germany）を用いて５×１０６の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出した。量を紫外線蛍光分析法により測定した。
【０１２７】
配列解析
キナーゼおよびＡＴＰ−ループＡｂｌドメインの全体（アミノ酸２４２から３９５）を、アニーリング６０℃でフォワードプライマーＦ３：５’−ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＣ−３’およびリバースプライマーＲ２を用いて、上記の反応混合液およびＰＣＲ条件でｃＤＮＡ上で増幅した。
【０１２８】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（Qiagen、Germany）での精製後、４６２ｂｐのＰＣＲフラグメントを、自動ＡＢＩ３７７シークエンサーでＴａｑ−Ｄｙｅターミネーター配列決定のＡＢＩプロトコールに従い配列決定した。配列を配列解析ソフトウエアＶ３．３および配列ナビゲーターソフトウエアＶ１．０．１（Applied Biosystem、ＵＳＡ）で解析した。配列決定を両鎖で行った。
【０１２９】
検出変異を通常は、ＤＮＡ由来の２０７ｂｐのＰＣＲ産物両鎖の配列決定により確認した。ＰＣＲ条件は上記のものであり、アニーリング６０℃でフォワードプライマーＦ４：５’−ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＴＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＧＣ−３’およびリバースプライマーＲ４：５’−ＣＣＣ ＣＴＡ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＴ−３’を用いた。
【０１３０】
ＡＳＯ−ＰＣＲアッセイ
変異型または野生型配列を、以下の対立遺伝子特異的およびリバースプライマーを用いて、上記５０μｌの反応混合液およびＰＣＲ条件でＤＮＡ上で行った非競合的ＰＣＲ反応で特異的に増幅した。Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異に対して、Ｆ３１５Ｃ：５’−ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＴＴ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＡＣ−３’またはＦ３１５Ｔ：５’−ＣＣＣ ＧＴＴ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ−３’およびＲ１：５’−ＧＧＡ ＴＧＡ ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＣＡ Ｇ−３’（６４℃でアニーリング；１５８ｂｐのＰＣＲ産物）；Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ変異に対して、Ｆ３１１Ｔ：５’−ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＴ−３’またはＦ３１１Ｃ：５’−ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＣ−３’およびＲ４（６４℃でアニーリング；１７４ｂｐのＰＣＲフラグメント）。
【０１３１】
このアッセイの感度を、１００ｎｇの健常対照ＤＮＡにおける抵抗性時の１００ｎｇの患者のＤＮＡの１０倍限界希釈の増幅によりそれぞれの変異について測定した。
【０１３２】
Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異の解析
Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異を、２４人のＳＴＩ５７１抵抗性患者のＣからＴ塩基への変化により誘導されたＤｄｅ Ｉ制限酵素部位の欠損の研究により調べた。解析を、診断時および抵抗性時の４１２ｂｐのＰＣＲフラグメントのｃＤＮＡ増幅後に行った。
【０１３３】
ＳＴＩ５７１に対して抵抗性を有する加速期の３人のＣＭＬ患者では、Ｄｄｅ Ｉ切断パターンは２つの集団のＡｂｌ転写物を示した。野生型配列は、それぞれ１７１ｂｐおよび３６ｂｐの２つのフラグメントにより特徴付けられ、そして変異型配列は２０７ｂｐの未切断フラグメントにより特徴付けられた。バンド輝度の差は、１人の患者について小集団の変異型転写物、そして２人以上の患者について大集団の変異型転写物を示した。このＲＴ−ＰＣＲ−ＲＥＬＰアッセイにより、２０７ｂｐの未切断フラグメントのみを該患者で検出したので、診断時にＴｈｒ３１５Ｉｌｅ変異型転写物を検出できなかった。解析を、ＳＴＩ５７１で３ヶ月治療後の細胞遺伝学的完全寛解の１６人の患者でも行った。該患者のうち全てで、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異が存在しなかった。
【０１３４】
ＤＮＡおよびＲＮＡの直接的配列解析
２４人のＳＴＩ５７１抵抗性患者において、ＡｂｌキナーゼドメインおよびＡＴＰ−ループ領域を、抵抗性時およびＳＴＩ５７１治療前のＰＣＲ ＤＮＡおよびｃＤＮＡ産物（それぞれ、２０７ｂｐのＦ４Ｒ４−ＰＣＲフラグメントおよび４６２ｂｐのＦ３Ｒ２−ＰＣＲフラグメント）から直接的に配列決定した。配列決定データにより、既にＲＴ−ＰＣＲ−ＲＥＬＰが検出した３人中２人の患者のＴｈｒ３１５Ｉｌｅ変異を確認したが、より低レベルの変異型転写物を有する残りの患者では失敗した。それぞれの患者のヘテロ接合体の割合を、ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＥＬＦパターンにより、クロマトグラフィー１次配列データの特異的Ｃシグナル幅とＴシグナル幅との比較により表す。
【０１３５】
２１人の残りの患者のうち２人が、２つのまだ未報告の変異を示した：１２ヶ月のＳＴＩ５７１治療後の加速期の１人の患者は、ＴからＣ塩基への変換により誘導されたＰｈｅ３１１Ｌｅｕ置換を有しており、そして１８ヶ月のＳＴＩ５７１治療後の慢性期の１人の患者は、ＴからＣ塩基への変換により誘導されたＭｅｔ３５１Ｔｈｒ変異を有していた。
この直接的配列決定法により、Ｇｌｕ２５５アミノ酸に影響する変異を検出しなかった。
【０１３６】
ＡＳＯ−ＰＣＲモニタリング
変異検出の感度を増加するために、ＡＳＯ−ＰＣＲアッセイを開発した。ＡＳＯ−ＰＣＲモニタリングは、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ、Ｐｈｅ３１１ＬｅｕまたはＭｅｔ３５１Ｔｈｒ変異を有する患者では、該変異がＳＴＩ５７１処置前に存在したことを示し、該点変異がＳＴＩ５７１処置前に存在したという証拠を提供した。変異型細胞のこの期間で増加した集団を、エチジウムブロマイド染色アガロースゲルのＰＣＲシグナル輝度により、解析した変異の３つで示した。この最後の結果は、治療の間の変異型細胞の機能的ＳＴＩ５７１抵抗性によるクローン選択を強く示す。変異型Ａｂｌ遺伝子の特異的ＰＣＲ条件フラグメント産物を、１００００倍希釈後でさえ検出し、非常に高感度のＡＳＯ−ＰＣＲ試験へと発展させた：１０ｎｇのＤＮＡが約１５０００細胞を表すと仮定し、１５０００の野生型細胞で１．５のＡｂｌ変異型細胞を検出できた。予測されたとおり、それぞれの希釈ポイントについて、未変異型細胞のシグナル輝度が常に残っていた。アッセイの高特異性を、健常ＤＮＡ対照由来の変異型検出Ａｂｌ配列の欠損によりそれぞれの変異について示した。
【０１３７】
実施例７：
この実施例では、イマチニブメシレート処置に対して細胞遺伝学的抵抗性または血液学的抵抗性のいずれかとなった４３人のＣＭＬ患者（該疾病の慢性期１８人および移行期２５人）を研究した。移行期の患者を期間の中央値である３ヶ月の間イマチニブメシレートで処置し、そして慢性期の患者を期間の中央値である１３ヶ月の間処置した。ＢＣＲ−ＡＢＬ融合物（１３００ｂｐ）を含む第１の増幅の後、ネスティッドＰＣＲを行って、ＡＴＰ結合ドメインを含む５８４ｂｐのフラグメント、およびＳＨ２およびＳＨ３ドメインを含有する３８６ｂｐのフラグメントを増幅した。ＰＣＲ産物を、アミノ酸７２〜１８０およびアミノ酸２３４〜３９６を含む異なるＡＢＬドメイン覆うことを可能として配列決定し、ＳＨ２／ＳＨ３およびＡＴＰ結合ドメインをそれぞれ研究した。
【０１３８】
４３人の患者間のＡＴＰ結合ドメインに関して、５ケースの変異を検出した。３患者（加速期１人そして急性転化２人）がＴ３１５Ｉ変異を表した。他の加速期の１人の患者において、Ｅ２５５Ｋ変異を検出した。１年より長い間イマチニブメシレートにより処置された細胞遺伝学的抵抗性患者（慢性期）において、研究により新たに記載するＧｌｙ２５０Ａｌａ置換を発見した。ＳＨ２およびＳＨ３ドメインに関して、研究した全４３人のＣＭＬ患者由来の異なる試料において変異を検出しなかった。
【０１３９】
データにより、ＳＴＩ５７１で処置されたＣＭＬ患者ではＡＢＬ変異は疾病の加速期に限られないことを確認した。まだ発表されていない新たな点変異を報告する。
【０１４０】
インビトロの変異誘発後、イマチニブメシレートに対する感受性の差を研究するねらいで、Ｂａ／Ｆ３細胞株を操作して、野生型およびＴ３１５Ｉ、Ｅ２５５Ｋ、Ａ２５０Ｇ変異を発現させた。予備的結果より、ＢａＦ／ＢＣＲ−ＡＢＬ＊Ｔ３１５Ｉから高レベルの抵抗性を確認した。他の機能的研究は研究室において進行中であり、そしてこれと比較されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
変異型Ａｂｌキナーゼドメイン
発明の分野：
本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該変異型機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩による該チロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド、該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングのための該ポリペプチドの使用、該ポリペプチドをコード化する核酸分子、該核酸分子を含む組み換えベクターおよび宿主細胞、および該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用する該ポリペプチドの生成での該核酸分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
９番および２２番染色体の長腕間の相互転座［Rowley J.D., Nature 243, 290-293 (1973)］によるフィラデルフィア染色体の形成から生じる常時活性型チロシンキナーゼであるＢｃｒ−Ａｂｌ［Nowell P.C. and Hungerford D.A., Science 132, 1497 (1960)］は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の実質的全類型および成人急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の最大２０％に存在する特徴的分子異常として示された［Faderl S. et al., N Engl J Med 341, 164-172 (1999); Sawyers C.L., N Engl J Med 340, 1330-1340 (1999)］。Ｂｃｒ−ＡｂｌはマウスにおいてＣＭＬを引き起こすのに足り［Daley G.Q. et al., Science 247, 824-830 (1990)］、かつその形質変換能はチロシンキナーゼ活性に完全に依存している。Ｂｃｒ−Ａｂｌならびに血小板由来成長因子受容体のＡＴＰ結合部位、およびｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼ［Lugo T.G. et al., Science 247, 1079 (1990)］での競合的阻害剤である化合物Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミド（以下、「ＳＴＩ５７１」としても言及される；ＳＴＩ５７１はＥＰ０ ５６４ ４０９に記載され、そしてメタンスルホン酸塩の形でＷＯ９９／０３８５４に記載される）は、慢性期および急性転化のＣＭＬ、ならびにフィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）の臨床的異常および血液学的異常を非常に急激に逆にする能力があると示されてきた［Druker B.J. et al., N Engl J Med 344, 1031-1037 (2001); Druker B.J. et al., N Engl J Med 344, 1038-1042 (2001)］。ほとんど全ての慢性期ＣＭＬ患者が永続的に応答する一方で、ＣＭＬ急性転化およびＰｈ＋ＡＬＬの寛解は一時的であり、そしてほとんどの患者がＳＴＩ５７１での継続治療にもかかわらず数ヶ月後に再発する［Druker B. J. et al., N Engl J Med 344, 1038-1042 (2001)］。ＳＴＩ５７１に対する抵抗性のメカニズムは熱心な研究の対象である。
【０００３】
ＣＭＬまたはＰｈ＋ＡＬＬに罹患する患者のＢｃｒ−Ａｂｌ遺伝子のキナーゼドメインに存在する変異が、該変異がＳＴＩ５７１による阻害に対するＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの抵抗性を導くという点で、ＳＴＩ５７１処置に対する該患者の生物学的抵抗性に起因すということは、当時としては驚くべき発見であった。
【０００４】
これらの発見は、例えば、ＳＴＩ５７１での処置に対する抵抗性に打ち勝つ能力のある新規化合物または化合物の組合せを見つける際に非常に価値がある。さらにかかる変異の認識は、それが例えば、患者が臨床的に再発する前に薬物抵抗性クローンの検出を可能とするという点で、Ｐｈ＋白血病の診断においても非常に有益である。
【０００５】
定義：
本明細書の文章中、以下の表現、用語および略語は以下に定義される意味を有する。
表現「機能的キナーゼドメイン」において、用語「機能的」はそれぞれのキナーゼドメインがチロシンキナーゼ活性を有することを示す。好ましくは、かかる機能的キナーゼドメインのキナーゼ活性は天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインの活性の範囲内である。
【０００６】
表現「機能的キナーゼドメインがＳＴＩ５７１またはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である」において、用語「抵抗性」は、ＳＴＩ５７１が天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのものより高い、すなわち、約０．０２５μＭより高い、好ましくは約０．１５μＭより高い、より好ましくは約０．２５μＭより高い、最も好ましくは約５μＭより高いＩＣ５０でそれぞれの機能的キナーゼドメインを阻害することを意味する。
【０００７】
表現「天然のヒトキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列」において、一部分「またはその本質的に類似の配列」は、キナーゼの機能性にとっては本質的でないアミノ酸変換、アミノ酸欠損および／またはアミノ酸付加を含む変異を含有する天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列、および上で定義された様に用語「機能的」および「抵抗性」の意味の範囲内でＳＴＩ５７１またはその塩による阻害に対する該抵抗性に言及する。
【０００８】
表現「別のアミノ酸により置換される」はある天然のアミノ酸の別の天然のアミノ酸による置換に言及する。
アミノ酸名は、１文字または３文字コードのいずれかを用いて記載されている。変異は、一般に認められる命名法、例えば、ともに、位置３８０のアラニンがスレオニンにより置換されることを示す「Ａｌａ３８０Ｔｈｒ」または「３８０Ａｌａ→Ｔｈｒ」により言及される。
【０００９】
配列番号：１は、天然のヒトＡｂｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを表す（ヒトｃ−ａｂｌ ｍＲＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ１６４１６）。
配列番号：２は、天然のヒトＡｂｌタンパク質のアミノ酸配列を表す（ヒトｃ−Ａｂｌ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号：Ｐ００５１９）。
【００１０】
別に示されていなければ、あるアミノ酸に与えられた数は配列番号：２のアミノ酸の番号付けに言及する。上で定義された意味の範囲内の天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列に本質的に類似するアミノ酸配列においては、アミノ酸は配列番号：２のアミノ酸の番号付けに従って番号付けされる。
【００１１】
用語「単離」は、物質が本来の環境（例えば、それが天然に生じるなら天然の環境）から移されることを意味する。
「宿主細胞」は、任意の方法、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、トランスフォーメーション法、ウイルス感染法等により細胞内に導入された異種性ＤＮＡを含有する原核細胞または真核細胞に言及する。
【発明の開示】
【００１２】
発明の説明：
本発明の実施において、分子生物学、微生物学の多くの通常の技術、および組み換えＤＮＡが用いられる。これらの技術はよく知られており、そして例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory);およびMethods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)に説明されている。
【００１３】
特に、本発明のポリペプチドは当該技術分野でよく知られた技術を用いる組み換えＤＮＡテクノロジーにより生成され得る。当業者によく知られている方法を用いて、本発明のポリペプチドをコード化する配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するこができる。様々な宿主発現ベクターシステムを利用して本発明のポリペプチドを発現することができる。
【００１４】
（１）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｐｈｅ３８２およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１５】
（２）本発明は特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１６】
（３）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉs３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１７】
（４）本発明はさらに、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１８】
（５）本発明は特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００１９】
（６）本発明はまた特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性となっている）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２０】
（７）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似な配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ａｓｐ３８１およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性であり、かつ任意で、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｐｈｅ３８２およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つの追加アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２１】
（８）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、アミノ酸Ｐｈｅ３１１が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２２】
（９）好ましい実施態様において、本発明は上記段落（８）に記載されている単離ポリペプチド（ここで任意で、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つの追加アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている）に関する。
【００２３】
（１０）好ましい実施態様において、本発明は上記段落（８）に記載されている単離ポリペプチド（ここで任意で、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つの追加アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている）に関する。
【００２４】
（１１）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似な配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２５】
（１２）本発明はさらに、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２６】
（１３）本発明は特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２７】
（１４）本発明はまた特に、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２８】
（１５）本発明は非常に著しく、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００２９】
（１６）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３０】
（１７）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、かつ任意でＭｅｔ２４４、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３１】
（１８）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３２】
（１９）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３３】
（２０）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３４】
（２１）本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｕ３５５、Ｇｌｕ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３５】
（２２）本発明の好ましい実施態様は、上記段落（１）〜（２１）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列において、１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている）に関する。
【００３６】
（２３）非常に好ましい実施態様において、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７ＴｙｒおよびＧｌｕ４５９Ｌｙｓから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００３７】
（２４）好ましい実施態様において、本発明は、上記段落（２３）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ３９６ＰｒｏおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つの追加アミノ酸変異を含有し得る）に関する。
【００３８】
（２５）好ましい実施態様において、本発明は、上記段落（２３）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｈｉｓ３９６ＰｒｏおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つの追加アミノ酸変異を含有し得る）に関する。
【００３９】
（２６）第２の好ましい実施態様において、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００４０】
（２７）非常に好ましい実施態様において、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００４１】
（２８）非常に好ましい実施態様において、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ３９６ＰｒｏおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに関する。
【００４２】
（２９）本発明はさらに、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｈｉｓ３９６ＰｒｏおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４３】
（３０）本発明はさらに、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１７ＬｅｕおよびＨｉｓ３９６Ｐｒｏから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに非常に著しく関する。
【００４４】
（３１）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４５】
（３２）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｍｅｔ２４４Ｖａｌを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含み機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４６】
（３３）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４７】
（３４）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４８】
（３５）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００４９】
（３６）本発明はまた、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５０】
（３７）本発明はまた、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５１】
（３８）本発明はまた、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５２】
（３９）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５３】
（４０）本発明はまた、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｐｈｅ４８６Ｓｅｒを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５４】
（４１）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｌｅｕ２４８Ｖａｌを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５５】
（４２）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ａｌａを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５６】
（４３）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５７】
（４４）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５８】
（４５）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ３５９Ｖａｌを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００５９】
（４６）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ａｒｇを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００６０】
（４７）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００６１】
（４８）同様に、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列（アミノ酸変異Ｇｌｕ４５９Ｌｙｓを含有し、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチドに特に関する。
【００６２】
（４９）別の実施態様において、本発明は上記段落（３１）〜（４８）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列は、Ｍｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有し得る）に関する。
【００６３】
（５０）好ましい実施態様において、本発明は、上記段落（１）〜（４９）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチド（ここで、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列は配列番号：２のアミノ酸２２９〜５００からなる）に関する。
【００６４】
（５１）別の好ましい実施態様において、本発明は、上記段落（１）〜（５０）のいずれか１つに記載されている単離ポリペプチドに関し、該ポリペプチドはＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼである。
【００６５】
（５２）さらに別の好ましい実施態様において、本発明は、該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物を選別するための、上記段落（１）〜（５１）のいずれか１つの単離ポリペプチドの使用に関する。
【００６６】
（５３）本発明はまた、上記段落（１）〜（５１）のいずれか１つに記載されているポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する。
【００６７】
（５４）本発明は、該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用する上記段落（１）〜（５１）のいずれか１つのポリペプチドの生成における上記段落（５３）の核酸分子の使用にさらに関する。
【００６８】
（５５）本発明はまた、上記段落（５３）に記載されている核酸分子を含む組み換えベクターに関する。
【００６９】
（５６）本発明は特に、組み換え発現ベクターである上記段落（５５）に記載されている組み換えベクターにさらに関する。
【００７０】
（５７）本発明はまた、上記段落（５５）または（５６）に記載されている組み換えベクターを含む宿主細胞に関する。
【００７１】
好ましくは、本発明は、天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド（ここで、少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩による該チロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）に関する。
【００７２】
ＳＴＩ５７１の好ましい塩は、ＷＯ９９／０３８５４で記載されるメタンスルホン酸塩である。
本発明のポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングは、例えば、当該技術分野で公知の任意のインビトロチロシンキナーゼリン酸化アッセイでの本発明の単離ポリペプチドの使用、および該アッセイでの本発明のポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の潜在性の測定によりなされ得る。
【００７３】
当該技術分野において公知の高処理量スクリーニングアッセイを用いて、本発明のポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物の大きな化合物ライブラリーをスクリーニングし得る。
【００７４】
大きな化合物ライブラリーのランダムなスクリーニングに加えて、本発明のポリペプチドはまた、以下のスクリーニング方法で用いられ得る：本発明のポリペプチドの３次元構造は例えば、Ｘ線結晶解析により決定される。次に、本発明のポリペプチドの原子座標を用いて、可能性のある阻害剤をデザインする。この可能性のある阻害剤を次に合成し、そしてインビトロのチロシンキナーゼリン酸化アッセイにおいて本発明のポリペプチドのチロシンキナーゼ活性の該阻害能について試験する。
【００７５】
実施例：
以下の実施例は、範囲を制限することなく本発明を説明するものである。
実施例１：
Ａｂｌキナーゼドメインの多数の変異をＡｂｌキナーゼドメインに結合するＳＴＩ５７１の３つのモデルに基づき生成し、そしてこの変異体キナーゼをＳＴＩ５７１に対する感受性について評価した。
【００７６】
様々な点変異を、ＳＴＩ５７１関連２−フェニルアミノピリミジンＡｂｌ−特異的阻害剤と共に同時結晶化したＡｂｌキナーゼドメインのモデルに基づき発生させた［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］。Ａｂｌの結晶構造によりＳＴＩ５７１の潜在的結合部位として同定したアミノ酸は、Ｔ３１５、Ｍ２９０、Ｅ２８６、Ｋ２７１およびＤ３８１およびＭ３１８でのペプチドバックボーンとの水素結合、ならびにＩ３１３、Ｆ３８２、Ｖ２５６、Ｙ２５３およびＬ３７０との疎水性相互作用を含んでいる。変異を発生させて、ＡｂｌキナーゼとＳＴＩ５７１との間の水素結合または疎水性相互作用の可能性を除去した［ｃ−Ａｂｌアミノ酸２２０〜４５８からなるＡｂｌキナーゼドメインを、ｐＧＥＸ ＫＧ（Pharmacia）のＢａｍ ＨＩサイトにサブクローン化した。Hemagglutin（１２ＣＡ５）抗体認識標識を、Ａｂｌリン酸化ドメインとしてかつタンパク質発現の検出のためＡｂｌキナーゼドメインの５’末端で挿入した。キナーゼドメイン内の全変異を、適当な点変異を含有するプライマーでＡｂｌキナーゼｐＧＥＸ ＫＧプラスミドのポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて構築した］。
【００７７】
Ｍ３１８およびＤ３８１はペプチドバックボーンを介してＳＴＩ５７１と水素結合を形成することが予測されるので、該部位での変異は不適切である。変異のＩＣ５０値を表１に要約する［Ａｂｌキナーゼドメイン変異のＧＳＴ融合タンパク質ならびに野生型Ａｂｌキナーゼを、指数関数的に増殖する形質転換ＤＨ５α細菌の１ｍＭのイソプロピルフェニルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）での誘導により生成させた。細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１ｍＭ バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフッ化物および１０μＭ βーメルカプトエタノールを含有するＭＴ ＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４ｍＭ Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）での超音波処理により溶解した。ＧＳＴ−Ａｂｌキナーゼ変異体を、グルタチオンセファロースに一晩４℃で結合させることにより可溶化液から精製した。結合タンパク質を、０．５Ｍ ＬｉＣｌで２度、ＰＢＳ（リン酸バッファー食塩水ｐＨ７．５）で２度、そしてＡｂｌキナーゼ洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１度洗浄した。結合タンパク質濃度を、続いてクーマシーブルー染色するＳＤＳ ＰＡＧＥにより測定した。Ａｂｌキナーゼタンパク質および変異の全てを発現させ、そしてこの方法で精製した。５００ｎｇの結合タンパク質をそれぞれのキナーゼ反応に用いた。キナーゼ反応を３０μｌのＡｂｌのキナーゼバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ バナジン酸ナトリウム、１μＭ ＤＴＴ、１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））中で行った。キナーゼ反応に加える前に、ＳＴＩ５７１を３％ ＤＭＳＯに溶解した。Ａｂｌキナーゼ変異を、０μＭから１μＭの範囲の濃度のＳＴＩ５７１と共に１０分間インキュベートし、その後１０μＣｉのγ３２Ｐ ＡＴＰ（１００μＭ 全ＡＴＰ）を添加し、そしてキナーゼ反応を３０分間続けさせた。反応をＳＤＳローディングダイ中でボイルすることで終結させ、そして試料をＳＤＳ ＰＡＧＥ（等量のタンパク質添加液を抗Ａｂｌキナーゼドメイン抗体Ａｂ−２（Santa Cruz）を用いる免疫ブロットにより示した）により分析した。Ａｂｌ自己リン酸化シグナル強度をホスフォイメージャー（Molecular Dynamics）で定量し、そしてＩＣ５０値を決定した。］同様のキナーゼアッセイを用いて報告されたものと一致して、野生型ＡｂｌキナーゼのＩＣ５０値は０．０２５μＭであった。Ｋ２７１Ｒ、Ｅ２８６Ｌ、Ｍ２９０ＡおよびＩ３１３Ｇがキナーゼ不活性型変異を生じた。Ｌ３７０Ｇの変異はＳＴＩ５７１に対する感受性を変化させなかった。反対に、Ｔ３１５ＶはＳＴＩ５７１に対して減少した感受性を示した。この変異のＩＣ５０値は平均して０．３０μＭであり、野生型Ａｂｌキナーゼのものより約１０倍高かった。野生型Ａｂｌと比べてＳＴＩ５７１に対するこの変異の減少した感受性は、阻害剤の第２級アミノ基とＴ３１５の側鎖との間の重要な水素結合を呈示する結晶構造からの推測と一致する。
【００７８】
結晶構造が利用できるようになる前は、変異を、既知のキナーゼドメイン構造に基づくＡｂｌに結合するＳＴＩ５７１のコンピューターモデリングによって生成させた。該変異を分析して、該変異が既知のＡｂｌキナーゼドメイン構造に適合できるか否かを決定した。例えば、ＳｒｃファミリーメンバーＬｃｋの結晶構造に基づくＡｂｌのコンピューターモデルを最初に分析した［Yamaguchi H. and Hendrickson W.A., Nature 384, 484 (1996)］Ｌｃｋに基づくモデルから予測した結合点の変異を、ＳｒｃまたはＦｍｓのいずれかの対応する残基に対して引き起こした（表２）。該変異の大部分がキナーゼ不活性型であるか、またはＳＴＩ５７１に対する感受性の変化を示さないかのいずれかであった。この結果は、ＡｂｌキナーゼおよびＳｒｃファミリーキナーゼのＡＴＰ結合部位ポケットのアミノ酸配列の差よりむしろ形態的差がＳＴＩ５７１の特異性の原因であることを示す結晶構造からの推測を支持した。興味深いことに、Ａ３８０Ｔの変異は、野生型ＡｂｌキナーゼのＩＣ５０を１０倍超えるＳＴＩ５７１結合についてのＩＣ５０を生じた。この残基はSchindler等のモデル［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］で予測された結合点ではないが、隣接残基Ｄ３８１がＳＴＩ５７１との重要な水素結合を形成する。より小さなグリシンへのＡ３８０の変異がＳＴＩ５７１に対する感受性を変化させないため、若干大きな残基への変異がＡ３８０Ｔ変異の感受性の減少を説明できるＳＴＩ５７１結合表面の立体効果または小さな立体構造変化のいずれかを導入するようである。従って、Ｌｃｋキナーゼから予測した全てを、Ａｂｌ結晶構造により説明できる。
【００７９】
Ａｂｌキナーゼに結合するＳＴＩ５７１の第３のモデルを、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）のコンピューターモデリングから推定する［Mohammadi M. et al., Science 276, 955 (1997)］。このモデルにおいて、ＳＴＩ５７１は、Schindler等のモデルで見られるものと比べて逆の向きで結合する。加えて、Ｅ２５８、Ｍ３１８およびＬ２４８を含むいくつかの新たな潜在的結合点を同定した。該結合モデルは、ＳＴＩ５７１が結晶構造中の予測結合部位であるＶ２５６およびＬ３７０を結合することも予測する。該残基の変異を、ＳＴＩ５７１に対する該感受性について調べた（表３）。上記変異の多くと同様に、これらのうちいくつかがキナーゼ不活性型であった。興味深いことに、Ｅ２５８Ｇ変異が野生型Ａｂｌキナーゼのものより８倍高い、０．１８μＭのＩＣ５０値を示した。変異のＳＴＩ５７１の感受性の減少は、Ｅ２５８の水素結合能がＳＴＩ５７１とＡｂｌキナーゼとの間の相互作用に重要であり得ることを示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１．変異を水素結合形成能または疎水性のいずれかを失っている残基に対して引き起こした。ＳＴＩ５７１がＭ３１８およびＤ３８１のペプチドバックボーンと水素結合するものと予測した。それゆえ、該残基の変異は行われなかった。多くの変異がキナーゼ不活性型Ａｂｌを生じた。Ｌ３７０ＧはＳＴＩ５７１に対する感受性を変化させなかった。Ｔ３１５Ｖの変異は野生型Ａｂｌキナーゼと比べて１０倍、ＳＴＩ５７１に対する感受性が増加した。
【００８２】
【表２】
【００８３】
表２．Ａｂｌキナーゼドメイン変異は、阻害剤結合のＬｃｋコンピューターモデルに基づく。不活性型Ａｂｌキナーゼドメインの構造を、阻害剤結合Ｌｃｋの結晶構造由来（Kinetix Pharmaceuticals由来）の情報を用いて形成した。変異をＳｒｃまたはｆｍｓのいずれかの対応残基に対して、ＳＴＩ５７１とのＡｂｌの予測結合点について起こさせた。変異のほとんどが、ＳＴＩ５７１に対する感受性の無変化またはキナーゼ不活性型Ａｂｌのいずれかを生じた。Ａ３８０Ｔの変異は野生型Ａｂｌキナーゼと比べて１０倍、ＳＴＩ５７１に対する感受性が減少した。このことは、変異型ＡｂｌのＳＴＩ５７１結合表面の立体効果または立体構造変化に起因するようである。
【００８４】
【表３】
【００８５】
表３．Ａｂｌキナーゼドメイン変異は、阻害剤結合の線維芽細胞成長因子受容体モデルに基づく。変異を、水素結合または大きな疎水性側鎖を除くＳＴＩ５７１とのＡｂｌの予測結合点について行った。変異の多くはキナーゼ不活性型Ａｂｌを生じた。Ｅ２５８Ｇの変異は、野生型Ａｂｌキナーゼと比べて８倍、ＳＴＩ５７１に対する感受性が減少した。
【００８６】
さらなる構造研究が、Ａｂｌキナーゼドメインの残基Ｉｌｅ３６０およびＨｉｓ３６１がＳＴＩ５７１の結合に関与することも明らかにした。それゆえ、該位置のアミノ酸変異がＳＴＩ５７１抵抗性をもたらす潜在性を有する。
【００８７】
実施例２：
ＳＴＩ５７１での治療前および薬物で治療中の再発時の６人の患者の臨床試料を、ＡｂｌキナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケットおよび活性化ループ中の変異の存在について解析した。解析した患者のうち、
２人が進行期のＣＭＬに罹患し（リンパ性急性転化、１人の患者；再発時の急性転化に進行する加速期ＣＭＬ、１人の患者）、３人の患者がＰｈ＋ＡＬＬに罹患し、そして１人の患者が混合型Ｐｈ＋急性白血病に罹患していた（表４参照）。
【００８８】
【表４】
【００８９】
表４．臨床データ
Ｐｈ＋：フィラデルフィア染色体陽性；ＡＬＬ：急性リンパ芽球性白血病；ＣＭＬ：慢性骨髄性白血病；ＡＰ：加速期、骨髄の芽球のパーセンテージ＞１５％だが＜３０％に基づく；ＢＣ：急性転化、骨髄の芽球のパーセンテージ＞３０％に基づく；ＣＨＲ：血液学的完全寛解、以下の全ての判定基準に基づく：骨髄中の芽球数＜５％、末梢血を循環している芽球がない、絶対好中球数＞１．５×１０９／Ｌ、血小板数＞１００×１０９／Ｌ、髄外所見なし；ＰＣＲ：細胞遺伝学的部分寛解、５／１００のＰｈ染色体陽性分裂中期細胞の発見に基づく；ＲＣＰ：慢性期への回帰、以下の全ての判定基準に基づく：血液または骨髄中の芽球のパーセンテージ＜１５％、末梢血または骨髄中の芽球＋前骨髄球のパーセンテージ＜３０％、末梢血好塩基球＜２０％；Ｂｉｐｈ：骨髄およびリンパ球両方の表面マーカーの発現に起因する混合型疾患
＊ＳＴＩ５７１での治療前
＊＊Ｐｈ＋ＡＬＬの再発のため一日当たり８００ｍｇのＳＴＩ５７１を継続投与
＊＊＊ＣＭＬ急性転化への急激な再発のため一日当たり６００ｍｇのＳＴＩ５７１を投与
#末梢血中芽球様細胞の持続および骨髄中＞３０％芽球細胞を伴う汎血球減少症
##１０週間末梢血を循環している芽球がなくかつ絶対好中球数＞１．０×１０９／Ｌだが、骨髄中の芽球数＞５％持続
＋一日当たり６００ｍｇのＳＴＩ５７１
＋＋再発（白血球数３６０×１０９／Ｌ、８５％の芽球様細胞）のため一日当たり６００ｍｇのＳＴＩ５７１投与から８００ｍｇのＳＴＩ５７１に切り替え
§骨髄を検査していない
§§ＮＬＥ：末梢血に白血病の所見なし、以下の発見に基づく：末梢血を循環している芽球がなく、完全好中球数＞１．０×１０９／Ｌ、血小板数＞２０×１０９／Ｌ、骨髄を検査していない
【００９０】
精製した末梢血および／または骨髄細胞由来の全ＲＮＡを、ＲＮＡＣｌｅａｎ（Hybaid GmbH, Heidelberg, Germany）を用いて抽出した。臨床試料当たり１０ｎｇのＲＮＡ、ポジティブコントロールとして１０ｐｇのＫ５６２全ＲＮＡおよびネガティブコントロールとして鋳型を含まない反応液を、３’Ａｂｌ特異的プライマー（５’−ＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣ−３’）および５’Ａｂｌ特異的プライマー（５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧ−３’）を用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の対象とした。ＡＭＶ逆転写酵素をファーストストランド合成のため、Expand high fidelity（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびプルーフリーディングポリメラーゼ；Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）を増幅のために用いた。ヒトβ−アクチンは、フォワードプライマー５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’およびリバースプライマー５’−ＡＧＧＧＴＡＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＣ−３’（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）を用いてコントロールとして働かせた。増幅５７９ｂｐフラグメントを、２つのＡｂｌ特異的プライマー（５’−ＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣ−３’および５’−ＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧ−３’）および２つの別の５’Ａｂｌ特異的プライマー（５’−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧ−３’および５’−ＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣ−３’）をそれぞれ用いて、ＡＢＩ３７００シークエンサー（PE Biosystems, Foster City, CA, USA）で配列決定した。配列解析を、Lasergeneソフトウエア（DNA＊, Madison, USA）を用いて行った。患者および時間ポイント当たり２〜９回ＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、そして単独で解析した。それぞれの患者および時間ポイントで１００％の配列同一性を示した。全体として、ＳＴＩ５７１−抵抗性疾患時に見られる６つの１点変異を除き、互いにおよびヒトｃ−Ａｂｌ（ＧＩ：２８２３６）の配列に対する全プローブの配列同一性は１００％であった。
【００９１】
【表５】
【００９２】
表５．配列解析
＊一日当たり６００ｍｇのＳＴＩ５７１を投与されている１度目の再発
＊＊一日当たり８００ｍｇのＳＴＩ５７１を投与されている２度目の再発
♯ヌクレオチド／アミノ酸残基がヒトｃ−Ａｂｌの最初のヌクレオチド／アミノ酸（受託番号：ＧＩ：２８２３６）から番号付けされている
＋異なる時間ポイントの解析
【００９３】
６人の患者のうち、配列解析により５人の患者の臨床試料において１点変異の存在が明らかになった。５つの変異全部が、ＡｂｌキナーゼドメインのＡＴＰ結合部位（患者１、３、４、および６、表５参照）または活性化ループ（患者５）内にアミノ酸変換を生じ、抵抗性疾病発症時に得た試料においてのみ存在した。１人の患者（６番、表５参照）において、ＡＴＰ結合部位の位置３１５（ヒトｃ−Ａｂｌの最初のアミノ酸ＧＩ：２８２３６から番号付け）でのＴｈｒ→Ｉｌｅ変換を導くヌクレオチド１０９１Ｃ→Ｔ（ヒトｃ−Ａｂｌの最初のヌクレオチドＧＩ：２８２３６から番号付け）でのヒトｃ−Ａｂｌキナーゼドメインの点変異を検出できた。興味深いことに、この患者は、より少量を投与されていた抵抗性疾病発症時にＴ３１５Ｉが存在したにも関わらず、ＳＴＩ５７１の一日の投与量が６００〜８００ｍｇに増加した後、２度目の効果を経験していた（表４および表５参照）。Ｔｈｒ３１５の存在が、ＳＴＩ５７１が結合し、従ってＡｂｌを阻害する鍵となる要件であることを考慮すると［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］、この観察は悪性クローンの成長の原因となる未変異型Ｂｃｒ−Ａｂｌの存在を必要としなければならい。このことは、抵抗性疾病発症時に得た４つの試料全部の一塩基多型（ＳＮＰ）解析がｃ−Ａｂｌの位置１０９１でのＳＮＰの証拠を示し、クロマトグラフィーでＴ−シグナルの後ろでＣ−バックグラウンドとして明らかであり、そして６００ｍｇに不応時に得た試料と８００ｍｇに不応時に得た試料とを比較した際に、変異型転写物に伴って該多相性が優位に減少することは、正しいと思われる。この発見は、Ｔ３１５Ｉが多数のＢｃｒ−Ａｂｌ分子に存在すると、ＳＴＩ５７１の生物学的活性を無くすことを強く示す。
【００９４】
患者番号４（表５参照）でヒスチジンに変換された位置２５３のチロシンは、アスパラギン３２２と水素結合して、所定の２β鎖間の折りたたまれたループを維持し、ＳＴＩ５７１との表面相補性を増加し、そしてさらにＳＴＩ５７１の芳香環とのファンデルワールス結合を維持するとわかっていた［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］。
【００９５】
患者１および３において見られる点変異の両方は、それぞれ、患者１ではバリン（疎水性）への、そして患者３ではリジン（親水性、正に帯電）へのＡＴＰ結合部位の位置２５５のグルタミン酸（親水性、負に帯電）の変換を生じる。ＳＴＩ５７１の芳香環の１つとの隣接バリン２５６の相互作用を考慮すると［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］、該変換も薬物結合を損なう立体構造変化を導き得る。
【００９６】
患者５において見られる変異、位置３９６のヒスチジンのプロリンへの変換は、活性化ループ内に位置する。Ａｂｌの該領域は、Ｈｉｓ３９６のＮＨ２−末端に位置するアンカー領域を除いて、ＳＴＩ５７１と直接相互作用しないが、不活性型（閉環）構造においてはＡｂｌへのＳＴＩ５７１の特異的結合に必要である［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］。該変異が、開環立体構造の活性化ループを安定化し得ると推測し得る。そしてそのことは、Ａｂｌの主要なリン酸化部位であるＴｙｒ３９３のリン酸化による開環立体構造を安定化後、ＳＴＩ５７１による阻害の影響を受けにくいことが示されている［Schindler T. et al., Science 289, 1938-42 (2000)］。
【００９７】
要するに、６人の患者の解析は、ＳＴＩ５７１に不応性のＰｈ＋白血病の場合、ＡＴＰ−結合部位または活性化ループ内の変異がしばしば生じることを示す。従って、悪性クローンのＢｃｒ−Ａｂｌ依存性増殖は、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性を変化させることなくＢｃｒ−ＡｂｌへのＳＴＩ５７１の結合を損なわせることにより回復され得る。
【００９８】
実施例３：
ＰＣＲストラテジーを用いて、Ｂｃｒ−ＡｂｌｃＤＮＡのＡＴＰ結合領域を増幅し、そして全領域を両方向に配列決定した。急性転化ＣＭＬ（骨髄性ＢＣ２人、リンパ球性ＢＣ２人）、加速期（１人）またはＳＴＩ５７１に対して血液学的抵抗性となった２度目の慢性期ＣＭＬ（１人）のためＳＴＩ５７１投与中の患者の４／６に、Ｂｃｒ−Ａｂｌの変異を発見した。１人の患者は変異Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅを有していた。２人の患者は位置２５０での変異を有し、それはグルタミン酸をグリシンに置換したものであった。１人の患者はアミノ酸２５３での変異を有し、そしてヒスチジンをチロシンに置換したものであった。アミノ酸２５０は、アミノ酸３１５の様にはＳＴＩ５７１と水素結合せず、アミノ酸２５３の様には阻害剤とのファンデルワールス結合に関与しない。試料が利用可能な場合（３つの場合）、変異がＳＴＩ５７１治療前に存在せず、かつ正常Ａｂｌ対立遺伝子に存在しないことを確認した。また、血液学的効果を示しそして維持しているが、ＳＴＩ５７１に対してはマイナーな細胞遺伝学的効果を示すだけか、または細胞遺伝学的効果を示さない移行期ＣＭＬ（５人）または慢性期ＣＭＬ（３人）の８人の患者のＢｃｒ−ＡｂｌのＡＴＰ結合領域を配列決定した。該患者の全てが、ＳＴＩ５７１治療の６〜９ヶ月後に変異の証拠を示さなかった。Ｂｃｒ−Ａｂｌのいくつかの点変異が移行期ＣＭＬ患者で出現し、Ｂｃｒ−ＡｂｌへのＳＴＩ５７１結合を完全にまたは部分的に阻害するようであると推測する。
【００９９】
実施例４：
ＲＴ−ＰＣＲストラテジーを用いて、２８患者のＢｃｒ−ＡｂｌのＡｂｌキナーゼドメインを増幅し、そして配列決定した。５箇所のオーストラリアの施設での拡大アクセス研究に登録された２５３患者からＳＴＩ５７１−不応性およびＳＴＩ５７１−抵抗性患者を選択した。ねらいは、注意深く定義した臨床グループ内の後天的変異の生じる頻度およびタイミングの測定、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼドメイン内の該分布の測定、および特定の変異と臨床的特徴との関連の決定であった。
【０１００】
研究デザイン
ＳＴＩ５７１−抵抗性患者（ｎ＝１８）を、少なくとも３ヶ月間続いた血液学的完全寛解を喪失した者、または急性期ＣＭＬまたはＰｈ＋ＡＬＬ再発へと移行した者として定義した。ＳＴＩ５７１−不応性患者（ｎ＝１０）は、少なくとも６ヶ月の治療後、主要細胞遺伝学的効果を達成できなかった者であった。
【０１０１】
血液からのＲＮＡの抽出、逆転写およびＤＮＡ配列決定の方法は既に記載されている［Branford S. et al., Br. J. Haematol. 107, 587-599 (1999)］。ロングＰＣＲ法［Branford S. et al., Br. J. Haematol. 109, 635-637 (2000)］を用いて、Ｂｃｒ−ＡｂｌのＡｂｌキナーゼドメインを、フォワードプライマーＢｃｒＦ（５’ｔｇａｃｃａａｃｔｃｇｔｇｔｇｔｇａａａｃｔｃ）およびリバースプライマーＡｂｌＫｉｎａｓｅＲ（５’ｔｃｃａｃｔｔｃｇｔｃｔｇａｇａｔａｃｔｇｇａｔｔ）で増幅した。第２段ＰＣＲでは、フォワードプライマーＡｂｌＫｉｎａｓｅＦ（５’ｃｇｃａａｃａａｇｃｃｃａｃｔｇｔｃｔ）およびリバースプライマーＡｂｌＫｉｎａｓｅＲを用いた。全キナーゼドメインを配列決定し、領域は８６３塩基を含んでいた（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４７５２）。
【０１０２】
結果
ＳＴＩ５７１−抵抗性患者：
１８人のＳＴＩ５７１−抵抗性患者のうち１２人がＢｃｒ−ＡｂｌのＡＴＰ結合領域に変異を有していた（表６）。試料が利用可能であった９人の場合で、変異がＳＴＩ５７１治療を開始する前に存在せず、それぞれの場合で抵抗性の発現前であった３〜９ヶ月で試験した４人の場合で存在しないことを確認した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異のない６人の抵抗性患者のうち３人が、再発時にクローン発生の証拠を示し、２人の場合では追加のフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体を含んでいた。１人の患者は、再発時に変異と別のＰｈ染色体の両方を有していた。
【０１０３】
同定した６変異はＴ３１５Ｉ（ｎ＝３患者）、Ｙ２５３Ｈ（ｎ＝１）、Ｆ３１７Ｌ（ｎ＝１）、Ｅ２５５Ｋ（ｎ＝４）、Ｇ２５０Ｅ（ｎ＝２）およびＭ３５１Ｔ（ｎ＝１）である。
【０１０４】
１８人のＳＴＩ５７１−抵抗性患者を、急性転化またはＰｈ＋ＡＬＬ（ｎ＝８）へと再発したもの、加速期へと再発したもの（ｎ＝６）、および血液学的寛解の喪失の証拠を伴う依然慢性期のままの者（ｎ＝４）へとさらに分けることができた。急性転化／ＡＬＬへと直接再発した８人の患者のうち６人が変異を有していた。これらのうち３人では、Ｔ３１５Ｉ変異が存在した。加速期へと再発した６人の患者のうち２人が変異を有していた。慢性期へと再発した残りの４人の患者の全てが変異を有していた。
【０１０５】
ＳＴＩ５７１−不応性患者：
１０人の不応性患者のうちただ１人が変異を有していた（表６）。ＳＴＩ５７１治療前または処置開始後３ヶ月での変異の証拠はない。野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌと混ざって変異クローンが８ヶ月で出現し、そして変異クローンが１１ヶ月で優性となるまで混在パターンで持続した。これまで、患者の抵抗性の臨床的証拠はない。
【０１０６】
表６．ＳＴＩ５７１で処置された患者の臨床的経過および変異解析
【表６】
【０１０７】
表６の続き
【表７】
【０１０８】
表６の続き
【表８】
【０１０９】
表６の続き
【表９】
【０１１０】
Ｆ：女性；Ｍ：男性；ｍ：月
ＮＭは、Ｂｃｒ−Ａｂｌのキナーゼ領域の両方向の配列決定に従って検出された変異がないことを示す。
Ｃはクローン発生を示す。
Ｐは２本鎖フィラデルフィア染色体を示す。
＊疾患状態／効果：１ａ）骨髄性急性転化 ｂ）リンパ球性急性転化 ｃ）Ｐｈ陽性ＡＬＬ再発。２）加速期、３）慢性期、４）部分寛解（血液＋骨髄の芽球＜１５％）、５）血液学的完全寛解（ＷＢＣ＜１０．０、血小板＜４５０、芽球なし、骨髄球＋後骨髄球＜５％、前骨髄球なし、異常関連症状かつ髄外異常なし）、６）メジャー細胞遺伝学的効果、７）細胞遺伝学的完全寛解
†処置開始以後の月数
‡患者を８ヶ月間研究対象としたが、ＳＴＩ５７１を経口ヒ素と月ごとに交代させた。そしてそれゆえ患者は、この期間中、ＳＴＩ５７１を４ヶ月間だけ投与された。
§Ｐｈ陽性ＡＬＬ患者
【０１１１】
さらなる研究により、Ｐｈ染色体陽性白血病に罹患するＳＴＩ５７１−抵抗性／不応性患者の２つの追加変異、すなわち、Ｍｅｔ２４４ＶａｌおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒの存在が明らかになった。
【０１１２】
別の研究では、オーストラリアおよびニュージーランドの１２のセンターのＣＭＬ患者を変異解析について試験した。試料をＢＣＲ−ＡＢＬレベルの分子評価のためまず集め、保存ＲＮＡが測定可能なレベルのＢＣＲ−ＡＢＬを含有し、かつ対照遺伝子レベルが未分解ＲＮＡを示したときのみ変異解析を続けた。患者は、６ヶ月またはそれ以上のイマチニブ治療を受けたか、または抵抗性となり６ヶ月前に治療を終えたかのいずれかであった（ｎ＝２）。１５６患者由来の試料が利用可能であったが、１２の試料のうち４つが低レベルのＢＣＲ−ＡＢＬのため、そして８つがＲＮＡの質が十分でないため試験できなかった。残る１４４人の患者をイマチニブの開始時の異常段階によりグループ化した；ＡＰが４０人、診断から１２ヶ月以上であるとして定義された後期ＣＰの６４人、および診断から１２ヶ月未満であるとして定義された初期ＣＰの４０人。１６人の初期ＣＰ患者がインターフェロン治療に既に失敗し、そして２４人がイマチニブ治療前、ヒドロキシ尿素を投与去れているだけであった。イマチニブの効果を、フィラデルフィア染色体陽性細胞の数が３５％未満ならメジャー細胞遺伝学的効果（ＭＣＲ）、または３５〜１００％ならＭＣＲなしのいずれかについて６ヶ月時での細胞遺伝学的解析により分類した。イマチニブ抵抗性を、少なくとも３ヶ月間続いた血液学的完全寛解（ＣＨＲ）の喪失、加速期または急性期への変化を伴うＣＨＲの喪失、または確立したＣＨＲまたは細胞遺伝学的完全寛解（フィラデルフィア染色体陰性として定義されたＣＣＲ）の喪失として定義した。３４６のＲＮＡ試料を本明細書において既に記載した様に解析した。利用可能なＲＮＡにより、患者を１〜１５の異なる時間ポイント間で変異について試験した。それゆえ、イマチニブ治療の投与期間の中央値を、最後の時間ポイントの解析から決定した。ＡＰ患者のイマチニブ投与の中央値は９ヶ月（範囲４〜２４）であり、後期ＣＰ患者の中央値は１０ヶ月（範囲６〜２４）であり、そして初期ＣＰ患者の中央値は１４ヶ月（範囲５〜２４）であった。
【０１１３】
加速期患者のイマチニブ抵抗性
４０人のＡＰ患者のうち１４人がイマチニブ抵抗性となり、５人が急性期への変化を伴い、８人がＡＰの再発を伴い、そして１人がＣＣＲの喪失を伴っていた。変異を、イマチニブ治療の中央値である８ヶ月（範囲４〜１３）で１４人中１２人（８６％）の抵抗性患者で検出した。
【０１１４】
後期慢性期患者（後期ＣＰ）のイマチニブ抵抗性
６４人の後期ＣＰ患者のうち１３人がイマチニブ抵抗性となり、５人が急性期への変化、６人がＡＰへの変化そして２人がＭＣＲの喪失を伴っていた。変異を、イマチニブ治療の中央値である８ヶ月（範囲３〜１８）で１３人中１１人（８５％）の抵抗性患者で検出した。
【０１１５】
初期慢性期患者（初期ＣＰ）のイマチニブ抵抗性
４０人の初期ＣＰ患者のうち６人が抵抗性となり、１人が急性転化へと変化し、２人がＡＰへと変化し、２人がＣＣＲを喪失し、そして１人がＭＣＲを喪失した。抵抗性患者で変異を検出しなかった。
【０１１６】
ＣＭＬの継続期間および変異の発生
６ヶ月以内にメジャー細胞遺伝学的効果（ＭＣＲ）を達成した研究中の全患者を調べると、診断から４年より長く処置された者が、４年以内の処置であった者より９倍高い変異の発生率を有していた（２２人中６人（２７％）対７２人中２人（３％））。６ヶ月以内にＭＣＲを達成しなかった全患者を調べると、診断から４年より長く処置された者が、４年以内の処置であったものより２倍高い変異の発生率を有していた（２２人中１２人（５４％）対２８人中７人（２５％））。変異の最高発生率は、診断から４年より長く処置されたＡＰ患者で、かつ６ヶ月までにＭＣＲを達成できなかったＡＰ患者においてであった（１２人中８人、６７％）。この研究では、１４４人のうち２７人の患者が変異を発生した。変異を有する２７人の患者のイマチニブ治療の開始前のＣＭＬの継続期間の中央値（５．３年、範囲１．１〜１１）は、変異のない１１７人の患者のもの（１．３年、範囲０．０２〜１７．７）（ｐ＜０．０００１）と統計的に異なった。
【０１１７】
ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインの変異
表７に、２７人の患者で検出されたＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインの１７の異なる変異を列挙する。全点変異が存在し、そしてそれはアミノ酸２４４から４８６に関与する７２８のヌクレオチド配列内に位置していた。７人の患者が２〜４の変異を有し、そして１人の患者が位置２５２でのグルタミンからヒスチジンへとアミノ酸を変化させる同一のヌクレオチドでの２つの異なる変異を有していた。Ｎ−末端でのＬ２４８ＶおよびキナーゼドメインのＣ−末端でのＳ４１７Ｙ、Ｅ４５９ＫおよびＦ４８６Ｓの変異はこれまでに発表されていない。最初の３つの変異は、Ｇ２５０Ｅ変異も有する１人のイマチニブ抵抗性患者において全て検出された。
【０１１８】
表７．ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインの変異
【表１０】
＊７人の患者が複数変異を有した
【０１１９】
実施例５：
抵抗性の４つの分子メカニズムおよび染色体メカニズムを、慢性期（ＣＰ、ｎ＝１３６）、加速期（ＡＰ、ｎ＝８０）、骨髄性急性転化（ＢＣ、ｎ＝７３）、およびリンパ球性ＢＣ（ｎ＝１）の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のためＳＴＩ５７１で処置された計２９０人の患者の中からＳＴＩ５７１単独療法（一日あたり４００〜８００ｍｇ経口）に対して不応性または抵抗性の４２人の患者（ｐｔｓ）（男性２１人、女性２１人；平均年齢６０歳、範囲２６〜７０歳）において調べた。患者を６つの多施設試験での第ＩＩ相研究へと追加した。ＳＴＩ５７１治療前、抵抗性患者は骨髄性ＢＣ（ｎ＝２８）またはリンパ球性ＢＣ（ｎ＝１）、ＡＰ（ｎ＝９）、またはＣＰ（ｎ＝４）であった。治療の継続期間の中央値は１２３日（範囲１３〜７４１）であった。ＳＴＩ５７１前および抵抗性時に、Ｂｃｒ−Ａｂｌ転写物の発現を、末梢血リンパ球において、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ゲノムＢｃｒ−Ａｂｌのコピー数を相間蛍光インサイツハイブリダイぜーション（ＩＰ−ＦＩＳＨ）により、そしてクローン核型進化（clonal karyotypic evolution）を分裂中期細胞遺伝学により、測定した。Ｂｃｒ−ＡｂｌのチロシンキナーゼドメインのＳＴＩ５７１結合部位を、抵抗性芽球由来のｃＤＮＡから配列決定した。結果：（ｉ）比Ｂｃｒ−Ａｂｌ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼで発現したＢｃｒ−Ａｂｌ転写物の平均レベルは、ＳＴＩ５７１治療前は４．６％（０．１〜４３％）であり、そして抵抗性（ｎｓ）時では５．３％（０．０７〜１００）であった。３／２１の患者は、＞１０倍のＢｃｒ−Ａｂｌの過剰発現を示した；（ii）Ｂｃｒ−Ａｂｌのゲノム増幅をＩＰ−ＦＩＳＨにより調べた２／２１患者で発見した；（iii）クローン進化を生じる追加染色体異常を７／２３患者において観察し、そのうち５人が異数性に発生した；（ｉｖ）ＡｂｌチロシンキナーゼドメインのＡＴＰ結合部位の点変異を６／４０患者において検出した。変異は、結合部位の立体構造を変化させるアミノ酸置換（Ｙ２５３Ｆ、ｎ＝１；Ｅ２５５Ｋ、ｎ＝２；Ｅ２５５Ｖ、ｎ＝１；Ｔ３１５Ｉ、ｎ＝２）を導く。変異をＤＮＡ制限酵素切断分析により確認し、そして治療前の試料から除去した。Ｂｃｒ−Ａｂｌの再活性化を、リン酸化Ｃｒｋｌの平均的群である６３％（範囲３８〜７７％）で、ＳＴＩ５７１に対する非感受性を示す点変異を有する５人の患者でのＣｒｋｌ免疫ブロットにより確認した。Ａｂｌの自己リン酸化アッセイは、野生型Ａｂｌの０．０２５μＭからＹ２５３Ｆの０．５μＭ、Ｅ２５５Ｋの０．４μＭ、Ｅ２５５Ｖの＞０．５μＭ、およびＴ３１５Ｉの０．３０μＭのＳＴＩ５７１に対するＩＣ５０の増加を示した。
【０１２０】
さらなる研究により、Ｐｈ染色体陽性白血病に罹患するＳＴＩ５７１−抵抗性／不応性患者の追加変異、すなわち、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５ＧｌｙおよびＨｉｓ３９６Ａｒｇの存在が明らかになった。
【０１２１】
実施例６：
材料および方法
患者
インターフェロンα（ＩＮＦ−α）に抵抗性かまたは不寛容である７１人のＣＭＬ患者を、３つの多センターでの第２相治験においてＳＴＩ５７１で処置した。３ヶ月の治療後、彼らのうち３４人がＳＴＩ５７１に対して血液学的および細胞遺伝学的効果（すなわち、正常血球数およびＰｈ陽性分裂中期細胞が６５％より多い）を示したが、一方で２９人が細胞遺伝学的効果を示さなかった。彼らのうち慢性期の１６人および加速期の８人を含む２４人をＡｂｌ遺伝子変異について解析した。５人の残りの患者について利用可能な材料はなかった。
【０１２２】
ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＥＬＰアッセイ
ＲＮＡ抽出。全ＲＮＡを、製造元の指示によりＴＲｉｚｏｌ試薬（Life Technologies、ＵＫ）で凍結した一定分量の１０７人の末梢血リンパ球から抽出した。ＲＮＡペレットを１０μｌのＲＮＡｓｅフリーの水に再溶解し、そして量を紫外線蛍光分析法により評価した。
【０１２３】
逆転写。ｃＤＮＡを既に記載された様に２０μｌの反応混合液中１μｇの全ＲＮＡから合成した［Morschhauser F. et al., J. Clin. Oncology 18, 788-794 (2000)］。
【０１２４】
４１２ｂｐフラグメントのＰＣＲ増幅を、２μｌのｃＤＮＡ（１００ｎｇの全ＲＮＡに対応）、１×ＴａｑＧｏｌｄ反応バッファー（Applied Biosystem、ＵＳＡ）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（Pharmacia、Sweden）、０．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Applied Biosystem、ＵＳＡ）、および５０ｐｍｏｌのプライマーＦ２：５’−ＧＡＧ ＧＧＣ ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡ−３’およびＲ２：５’−ＧＣＴ ＧＴＧ ＴＡＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴ−３’で行った。用いたサーモサイクリングの条件は、９４℃で１２分、続いて９４℃、１分間の変性、５７℃、１分間のアニーリング、７２℃、１分間の伸長の３５サイクル、および７２℃、５分の最終伸長ステップであった。
【０１２５】
ＲＥＬＰ解析。ＰＣＲ産物の１／５を５Ｕの制限酵素Ｄｄｅ Ｉ（Roche、Switzerland）により切断し、２．５％のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルで電気泳動した。
【０１２６】
ＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡを、製造元の指示によりＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Qiagen、Germany）を用いて５×１０６の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出した。量を紫外線蛍光分析法により測定した。
【０１２７】
配列解析
キナーゼおよびＡＴＰ−ループＡｂｌドメインの全体（アミノ酸２４２から３９５）を、アニーリング６０℃でフォワードプライマーＦ３：５’−ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＡＡ ＧＣ−３’およびリバースプライマーＲ２を用いて、上記の反応混合液およびＰＣＲ条件でｃＤＮＡ上で増幅した。
【０１２８】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（Qiagen、Germany）での精製後、４６２ｂｐのＰＣＲフラグメントを、自動ＡＢＩ３７７シークエンサーでＴａｑ−Ｄｙｅターミネーター配列決定のＡＢＩプロトコールに従い配列決定した。配列を配列解析ソフトウエアＶ３．３および配列ナビゲーターソフトウエアＶ１．０．１（Applied Biosystem、ＵＳＡ）で解析した。配列決定を両鎖で行った。
【０１２９】
検出変異を通常は、ＤＮＡ由来の２０７ｂｐのＰＣＲ産物両鎖の配列決定により確認した。ＰＣＲ条件は上記のものであり、アニーリング６０℃でフォワードプライマーＦ４：５’−ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＴＴ ＧＴＣ ＴＴＧ ＴＴＧ ＧＣ−３’およびリバースプライマーＲ４：５’−ＣＣＣ ＣＴＡ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＴ−３’を用いた。
【０１３０】
ＡＳＯ−ＰＣＲアッセイ
変異型または野生型配列を、以下の対立遺伝子特異的およびリバースプライマーを用いて、上記５０μｌの反応混合液およびＰＣＲ条件でＤＮＡ上で行った非競合的ＰＣＲ反応で特異的に増幅した。Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異に対して、Ｆ３１５Ｃ：５’−ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＴＴ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＡＣ−３’またはＦ３１５Ｔ：５’−ＣＣＣ ＧＴＴ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ−３’およびＲ１：５’−ＧＧＡ ＴＧＡ ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＣＡ Ｇ−３’（６４℃でアニーリング；１５８ｂｐのＰＣＲ産物）；Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ変異に対して、Ｆ３１１Ｔ：５’−ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＴ−３’またはＦ３１１Ｃ：５’−ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＣ−３’およびＲ４（６４℃でアニーリング；１７４ｂｐのＰＣＲフラグメント）。
【０１３１】
このアッセイの感度を、１００ｎｇの健常対照ＤＮＡにおける抵抗性時の１００ｎｇの患者のＤＮＡの１０倍限界希釈の増幅によりそれぞれの変異について測定した。
【０１３２】
Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異の解析
Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異を、２４人のＳＴＩ５７１抵抗性患者のＣからＴ塩基への変化により誘導されたＤｄｅ Ｉ制限酵素部位の欠損の研究により調べた。解析を、診断時および抵抗性時の４１２ｂｐのＰＣＲフラグメントのｃＤＮＡ増幅後に行った。
【０１３３】
ＳＴＩ５７１に対して抵抗性を有する加速期の３人のＣＭＬ患者では、Ｄｄｅ Ｉ切断パターンは２つの集団のＡｂｌ転写物を示した。野生型配列は、それぞれ１７１ｂｐおよび３６ｂｐの２つのフラグメントにより特徴付けられ、そして変異型配列は２０７ｂｐの未切断フラグメントにより特徴付けられた。バンド輝度の差は、１人の患者について小集団の変異型転写物、そして２人以上の患者について大集団の変異型転写物を示した。このＲＴ−ＰＣＲ−ＲＥＬＰアッセイにより、２０７ｂｐの未切断フラグメントのみを該患者で検出したので、診断時にＴｈｒ３１５Ｉｌｅ変異型転写物を検出できなかった。解析を、ＳＴＩ５７１で３ヶ月治療後の細胞遺伝学的完全寛解の１６人の患者でも行った。該患者のうち全てで、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異が存在しなかった。
【０１３４】
ＤＮＡおよびＲＮＡの直接的配列解析
２４人のＳＴＩ５７１抵抗性患者において、ＡｂｌキナーゼドメインおよびＡＴＰ−ループ領域を、抵抗性時およびＳＴＩ５７１治療前のＰＣＲ ＤＮＡおよびｃＤＮＡ産物（それぞれ、２０７ｂｐのＦ４Ｒ４−ＰＣＲフラグメントおよび４６２ｂｐのＦ３Ｒ２−ＰＣＲフラグメント）から直接的に配列決定した。配列決定データにより、既にＲＴ−ＰＣＲ−ＲＥＬＰが検出した３人中２人の患者のＴｈｒ３１５Ｉｌｅ変異を確認したが、より低レベルの変異型転写物を有する残りの患者では失敗した。それぞれの患者のヘテロ接合体の割合を、ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＥＬＦパターンにより、クロマトグラフィー１次配列データの特異的Ｃシグナル幅とＴシグナル幅との比較により表す。
【０１３５】
２１人の残りの患者のうち２人が、２つのまだ未報告の変異を示した：１２ヶ月のＳＴＩ５７１治療後の加速期の１人の患者は、ＴからＣ塩基への変換により誘導されたＰｈｅ３１１Ｌｅｕ置換を有しており、そして１８ヶ月のＳＴＩ５７１治療後の慢性期の１人の患者は、ＴからＣ塩基への変換により誘導されたＭｅｔ３５１Ｔｈｒ変異を有していた。
この直接的配列決定法により、Ｇｌｕ２５５アミノ酸に影響する変異を検出しなかった。
【０１３６】
ＡＳＯ−ＰＣＲモニタリング
変異検出の感度を増加するために、ＡＳＯ−ＰＣＲアッセイを開発した。ＡＳＯ−ＰＣＲモニタリングは、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ、Ｐｈｅ３１１ＬｅｕまたはＭｅｔ３５１Ｔｈｒ変異を有する患者では、該変異がＳＴＩ５７１処置前に存在したことを示し、該点変異がＳＴＩ５７１処置前に存在したという証拠を提供した。変異型細胞のこの期間で増加した集団を、エチジウムブロマイド染色アガロースゲルのＰＣＲシグナル輝度により、解析した変異の３つで示した。この最後の結果は、治療の間の変異型細胞の機能的ＳＴＩ５７１抵抗性によるクローン選択を強く示す。変異型Ａｂｌ遺伝子の特異的ＰＣＲ条件フラグメント産物を、１００００倍希釈後でさえ検出し、非常に高感度のＡＳＯ−ＰＣＲ試験へと発展させた：１０ｎｇのＤＮＡが約１５０００細胞を表すと仮定し、１５０００の野生型細胞で１．５のＡｂｌ変異型細胞を検出できた。予測されたとおり、それぞれの希釈ポイントについて、未変異型細胞のシグナル輝度が常に残っていた。アッセイの高特異性を、健常ＤＮＡ対照由来の変異型検出Ａｂｌ配列の欠損によりそれぞれの変異について示した。
【０１３７】
実施例７：
この実施例では、イマチニブメシレート処置に対して細胞遺伝学的抵抗性または血液学的抵抗性のいずれかとなった４３人のＣＭＬ患者（該疾病の慢性期１８人および移行期２５人）を研究した。移行期の患者を期間の中央値である３ヶ月の間イマチニブメシレートで処置し、そして慢性期の患者を期間の中央値である１３ヶ月の間処置した。ＢＣＲ−ＡＢＬ融合物（１３００ｂｐ）を含む第１の増幅の後、ネスティッドＰＣＲを行って、ＡＴＰ結合ドメインを含む５８４ｂｐのフラグメント、およびＳＨ２およびＳＨ３ドメインを含有する３８６ｂｐのフラグメントを増幅した。ＰＣＲ産物を、アミノ酸７２〜１８０およびアミノ酸２３４〜３９６を含む異なるＡＢＬドメイン覆うことを可能として配列決定し、ＳＨ２／ＳＨ３およびＡＴＰ結合ドメインをそれぞれ研究した。
【０１３８】
４３人の患者間のＡＴＰ結合ドメインに関して、５ケースの変異を検出した。３患者（加速期１人そして急性転化２人）がＴ３１５Ｉ変異を表した。他の加速期の１人の患者において、Ｅ２５５Ｋ変異を検出した。１年より長い間イマチニブメシレートにより処置された細胞遺伝学的抵抗性患者（慢性期）において、研究により新たに記載するＧｌｙ２５０Ａｌａ置換を発見した。ＳＨ２およびＳＨ３ドメインに関して、研究した全４３人のＣＭＬ患者由来の異なる試料において変異を検出しなかった。
【０１３９】
データにより、ＳＴＩ５７１で処置されたＣＭＬ患者ではＡＢＬ変異は疾病の加速期に限られないことを確認した。まだ発表されていない新たな点変異を報告する。
【０１４０】
インビトロの変異誘発後、イマチニブメシレートに対する感受性の差を研究するねらいで、Ｂａ／Ｆ３細胞株を操作して、野生型およびＴ３１５Ｉ、Ｅ２５５Ｋ、Ａ２５０Ｇ変異を発現させた。予備的結果より、ＢａＦ／ＢＣＲ−ＡＢＬ＊Ｔ３１５Ｉから高レベルの抵抗性を確認した。他の機能的研究は研究室において進行中であり、そしてこれと比較されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項４に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、単一アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１〜５のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＧｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１７ＬｅｕおよびＨｉｓ３９６Ｐｒｏから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒを含有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｍｅｔ２４４Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１６】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１７】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ４８６Ｓｅｒを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２０】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｌｅｕ２４８Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２１】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ａｌａを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２４】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３５９Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２５】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ａｒｇを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２６】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２７】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ４５９Ｌｙｓを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２８】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸変異を含有し得る、請求項１０〜２７のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項２９】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸２２９〜５００からなる、請求項１〜２８のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項３０】
Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼである、請求項１〜２９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項３１】
該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物をスクリーンするための、請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項３３】
該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用するための、請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドの産生における請求項３２に記載の核酸分子の使用。
【請求項３４】
請求項３２に記載の核酸分子を含む組み換えベクター。
【請求項３５】
組み換え発現ベクターである請求項３４に記載の組み換えベクター。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項４に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、単一アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１〜５のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＧｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１７ＬｅｕおよびＨｉｓ３９６Ｐｒｏから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒを含有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｍｅｔ２４４Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１６】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１７】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ４８６Ｓｅｒを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２０】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｌｅｕ２４８Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２１】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ａｌａを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２４】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３５９Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２５】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ａｒｇを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２６】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２７】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ４５９Ｌｙｓを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２８】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸変異を含有し得る、請求項１０〜２７のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項２９】
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸２２９〜５００からなる、請求項１〜２８のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項３０】
Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼである、請求項１〜２９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項３１】
該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物をスクリーンするための、請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項３３】
該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用するための、請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドの産生における請求項３２に記載の核酸分子の使用。
【請求項３４】
請求項３２に記載の核酸分子を含む組み換えベクター。
【請求項３５】
組み換え発現ベクターである請求項３４に記載の組み換えベクター。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
【公開番号】特開２００９−１６５４６４（Ｐ２００９−１６５４６４Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９３５８６（Ｐ２００８−２９３５８６）
【出願日】平成２０年１１月１７日（２００８．１１．１７）
【分割の表示】特願２００３−５３４５７８（Ｐ２００３−５３４５７８）の分割
【原出願日】平成１４年１０月４日（２００２．１０．４）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【出願人】（５０３１２７８７３）ユニヴェルシテ ヴィクトール セガラン ボルドー ２ (7)
【出願人】（５０４１３５９４１）テッヒニシェ・ウニヴェルジテート・ミュンヘン (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ
【出願人】（５０３３６４４４５）オレゴン・ヘルス・アンド・サイエンス・ユニバーシティ・（オーエイチエスユー） (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＯＨＳＵ）
【出願人】（５０４１３５９３０）ユニヴァーシティ・オブ・ハイデルベルク (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【出願人】（５０４１３５９７４）
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＲＵ ｄｅ Ｌｉｌｌｅ
【出願人】（５００１０９７５５）メドベット・サイエンス・プロプライエタリー・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１７日（２００８．１１．１７）
【分割の表示】特願２００３−５３４５７８（Ｐ２００３−５３４５７８）の分割
【原出願日】平成１４年１０月４日（２００２．１０．４）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【出願人】（５０３１２７８７３）ユニヴェルシテ ヴィクトール セガラン ボルドー ２ (7)
【出願人】（５０４１３５９４１）テッヒニシェ・ウニヴェルジテート・ミュンヘン (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ
【出願人】（５０３３６４４４５）オレゴン・ヘルス・アンド・サイエンス・ユニバーシティ・（オーエイチエスユー） (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＯＨＳＵ）
【出願人】（５０４１３５９３０）ユニヴァーシティ・オブ・ハイデルベルク (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【出願人】（５０４１３５９７４）
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＲＵ ｄｅ Ｌｉｌｌｅ
【出願人】（５００１０９７５５）メドベット・サイエンス・プロプライエタリー・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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