多様な環境抵抗性植物製造のためのＡｔＢＧ１遺伝子の用途
本発明は、ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）遺伝子の用途及び前記ＡｔＢＧ１遺伝子が導入された形質転換植物に関するもので、詳細には、植物内に導入されて発現したＡｔＢＧ１タンパク質が植物ホルモンの一種であるアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させることで、植物が多様な環境ストレスに対する抵抗性を有するようにするＡｔＢＧ１遺伝子の用途及び前記ＡｔＢＧ１遺伝子が導入されてストレスに抵抗性を有する形質転換植物に関するのである。植物内ＡＢＡの濃度を増加させる方法によって植物は、低温、塩害、脱水のような多様な環境ストレスに抵抗性を有するようになるので、農産物の生産性増大に大きく寄与することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）遺伝子の用途及び前記ＡｔＢＧ１遺伝子が導入された形質転換植物に関するもので、詳細には、植物内に導入されて発現したＡｔＢＧ１タンパク質が、植物ホルモンの一種であるアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させることにより、植物が多様な環境ストレスに対する抵抗性を有するようにするＡｔＢＧ１遺伝子の用途及び、前記ＡｔＢＧ１遺伝子が導入されてストレスに抵抗性を有する形質転換植物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）は、植物ホルモンの一種で、種子休眠、発芽そして環境ストレスに対する適応反応を含んだ多様な生理学的過程で重要な役割をする（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ Ｒ．Ｒ．等，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００２年，第１４巻，５１５頁；Ｊ．Ｋ．Ｚｈｕ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，２００２年，第５３巻，２４７頁；Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｃｒｅｅｌｍａｎ Ｒ．Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．．１９８８年，第３９巻，４３９頁；Ｌｅｕｎｇ Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｒａｕｄａｔ Ｊ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９９８年，第４９巻，１９９頁）。ＡＢＡは、ほとんど同時にＦ．Ｔ．エジコートとＰ．Ｆ．ウェオイング、二つのグループの研究陣によって発見されたが、十分に熟していない果実の落果を研究したＦ．Ｔ．エジコートの研究グループは、木花の果実から落葉促進物質であるアブシスIIを分離し、木の芽の冬休眠を研究していたＰ．Ｆ．ウェオイングの研究グループは、カバノキの種類であるケカンバ（Ｂｅｔｕｌａ Ｐｕｂｅｓｃｅｎｃｅ）の葉から休眠誘導物質を分離した後、ドルミン（ｄｏｒｍｉｎ）と名付けた。１９６５年にドルミンとアブシスIIが同一物質であることが確認されて、アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、以下ＡＢＡと略称する）という名称に統一された。
【０００３】
ＡＢＡは、休眠中の種子、木の芽、球根などに多量含有されていて、普通発芽の進行につれて含量が減少する。また、ＡＢＡは、葉の気孔を閉めるようにする作用をするが、植物が水分欠乏状態になれば、ＡＢＡ合成が活発になってこれにより葉の気孔が閉まって植物から水分が損失されることを防止する。実際に、フラッカ（ｆｌａｃｃａ）というトマトの突然変異種は、正常植物と比べてＡＢＡ合成が少なく起きるため気孔が閉まらない。
【０００４】
細胞内に存在するＡＢＡのレベルは、生理的で環境的な変化に影響を受けて、生合成と分解との間の正確な均衡によって量が調節される。デノボ生合成（ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、ＡＢＡレベルの増加に寄与するが、酸化や不活性形態に結合することで現れるＡＢＡの分解でそのレベルが減少される（Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｃｒｅｅｌｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．．１９８８年，第３９巻，４３９頁；Ｌｅｕｎｇ Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｒａｕｄａｔ Ｊ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９８年，第４９巻，１９９頁；Ｃｕｔｌｅｒ Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｋｒｏｃｈｋｏ Ｊ．Ｅ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年，第４巻，４７２頁；Ｑｉｎ Ｘ．ａｎｄ Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９９年，第９６巻，１５３５４頁）。
【０００５】
低いＡＢＡレベルは、早い発芽、枯死そして環境ストレスに対して敏感度が増加するような多様な生理学的欠陥を示めす（Ｃｕｔｌｅｒ Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｋｒｏｃｈｋｏ Ｊ．Ｅ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年，第４巻，４７２頁；Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ Ｍ．等，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９８２年，第６１巻，３８５頁；Ｒｏｃｋ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９１年，第８８巻，７４９６頁）。これは、合成と分解との間の均衡を通じてＡＢＡレベルを維持することが、多様な生理学的反応のために重要であることを示す。ＡＢＡ分解の一番目経路は、シトクロムＰ４７０ ＣＹＣ７０７Ａによって不安定な８’ハイドロキシＡＢＡを作るハイドロキシレーションが起きることだが、この不安定な中間物質は、自然発生的な異性体化（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって易しくファゼイン酸（ｐｈａｓｅｉｃ ａｃｉｄ）に転換される（Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｃｒｅｅｌｍａｎ Ｒ．Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９８８年，第３９巻，４３９頁；Ｔ．Ｋｕｓｈｉｒｏ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０００年，第２３巻，１６４７頁）。
【０００６】
ＡＢＡレベルが低くなるもう一つの経路は、ＡＢＡがグルコースと結合することであるが、この反応は、グルコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって媒介されて、ＡＢＡグルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）が生成される反応である（Ｃｕｔｌｅｒ Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｋｒｏｃｈｋｏ Ｊ．Ｅ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年，第４巻，４７２頁；Ｗａｌｔｏｎ Ｄ．Ｃ．ａｎｄ Ｌｉ Ｙ．，ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４０−１５７頁；Ｘｕ Ｚ．Ｊ．等，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００２年，第１２９巻，１２８５頁）。このように結合したＡＢＡ−ＧＥ分子は、液胞やアポプラスチックスペース（ａｐｏｐｌａｓｔｉｃ ｓｐａｃｅ）に運搬されるが（Ｋａｉｓｅｒ Ｗ．等，Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９８５年，第１１９巻，２３７頁；Ｄｉｅｔｚ Ｋ．Ｊ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ，２０００年，第５１巻，９３７頁）これは、保存や保管のための形態であるとは考えられていない。
【０００７】
本発明では、ベータグルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の一種であるＡｔＢＧ１が、ＥＲで伝達されるＡＢＡ−ＧＥをＡＢＡ形態に加水分解させて、脱水ストレス下で低分子量ＡｔＢＧ１の早い重合を通じて、細胞内ＡＢＡ含量を増加させるということを確認した。ＡｔＢＧ１遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された突然変異シロイヌナズナ（以下「突然変異ａｔｂｇ１」と略称する）では、減少さしたＡＢＡレベルと気孔閉鎖の欠陥、葉緑体不足による黄色い葉及び非生物学的ストレスに敏感な表現型をみせた。反対にＡｔＢＧ１遺伝子を過発現させる形質転換されたシロイヌナズナは、対照区の発現量の２．５倍のＡＢＡを蓄積させて環境ストレスに対してさらに強い抵抗性を示した。
【０００８】
したがって、本発明者らは、前記ＡｔＢＧ１遺伝子を使用して塩害、冷害、脱水を含む多様な環境ストレスに抵抗性を有する植物を製造することができることを確認することにより本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、植物が多様な環境ストレスに対する抵抗性を有するようにする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、植物に導入することにより対象植物が環境ストレスに対する抵抗性を有するようにする、ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）または、その変異体をコードする遺伝子の用途を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ＡｔＢＧ１またはその変異体をコードする遺伝子が導入されて環境ストレスに抵抗性を有する形質転換植物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、植物内ＡＢＡの濃度を増加させることで、植物が環境ストレスに抵抗性を有する植物を生産する方法を提供する。
【００１３】
併せて、本発明は、ＡｔＢＧ１遺伝子またはＡｔＢＧ１タンパク質を導入して植物にストレス抵抗性を付与する方法を提供する。
【００１４】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１５】
本発明は、植物に導入することで対象植物が環境ストレスに対する抵抗性を有するようにする、ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）またはその変異体をコードする遺伝子の用途を提供する。
【００１６】
アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）は、植物ホルモンの一種で、種子休眠、発芽そして環境ストレスに対する適応反応を含んだ多様な生理学的過程で重要な役割をする。植物内でＡＢＡのレベルが低ければ、早い発芽、枯死のような多様な突然変異表現型が現れる。ＡＢＡレベルが低くなる経路の一つは、ＡＢＡがグルコシルトランスフェラーゼによって不活性形態であるＡＢＡグルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）に変化することであるが、本発明ではシロイヌナズナのベータグルコシダーゼ同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）であるＡｔＢＧ１がＡＢＡ−ＧＥをＡＢＡ形態に変化させて、ＡＢＡレベルを高めることにより植物が環境ストレスに抵抗性を有するようにするということを確認した。前記ストレスは、高温、塩害、乾燥、公害、病源菌、傷、低温、過多な光条件、オゾン、除草剤、過多なＵＶ露出及び浸透圧衝撃（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）を含む。
【００１７】
まず、多様な環境ストレスによってＡｔＢＧ１遺伝子が発現されるのかどうかを確認するために、シロイヌナズナに高濃度のＮａＣｌ、低温、脱水のような多様な環境ストレスを加えた後、ＡｔＢＧ１遺伝子の発現有無を確認した。その結果、ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換された植物は、ＮａＣｌストレスによってＡｔＢＧ１の発現が誘導された一方、他のベータグルコシダーゼ同族体をコードする遺伝子であるＧｌｕｃとｐｓｒ３．１は、発現が誘導されなかった（図２）。これは、ベータグルコシダーゼ同族体の中でＡｔＢＧ１遺伝子だけが、植物がストレス抵抗性を有するようにするということを示している。
【００１８】
本発明者等は、ＡｔＢＧ１が植物に環境ストレスに対する抵抗性を示すようにするのかどうかを調べる間接的な方法として、ＡｔＢＧ１遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された「突然変異ａｔｂｇ１」がどんな表現型を示すのか観察した。その結果、野生型と異なり葉が黄色くて背が低く（図９及び図１０）、正常な植物では気孔は昼に開かれて夜には閉まる一方、「突然変異ａｔｂｇ１」は夜にも昼のように気孔が閉まらなかった（図１３）。乾燥した環境時に野生型に比べて水分損失量が、１．５倍程度多く（図１５）、脱水もひどく起きて大部分の葉が枯死した（図１６）。
【００１９】
したがって、「突然変異ａｔｂｇ１」は、ＡｔＢＧ１タンパク質の欠乏によって環境ストレスに対する抵抗力が弱化したことを確認した。
【００２０】
本発明者等は、前記の「突然変異ａｔｂｇ１」に再びＡｔＢＧ１遺伝子を導入したシロイヌナズナ（以下、「遺伝子回復ａｔｂｇ１」と略称する）に前記の「突然変異ａｔｂｇ１」に対する実験と同一実験を実施することにより、前記実験結果で示された「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型が、ＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異による結果なのかを検証した。
【００２１】
その結果、「遺伝子回復ａｔｂｇ１」は、発芽後１週（１ｗ）、２週（２ｗ）（図９）及び４週（図１０）後に、野生型と類似な鮮やかな緑を示して背が高く、気孔開閉においても野生型のように昼には気孔が開かれて夜には気孔が閉まることを確認した（図１３）。また、脱水実験では、野生型より水分損失が少なく（図１５）、乾燥した環境で２１日間培養した結果、脱水によって葉が黒っぽく変わる表現型が現れないで正常によく育った（図１６）。
【００２２】
したがって、「突然変異ａｔｂｇ１」にＡｔＢＧ１遺伝子を再導入して野生型のような表現型を回復したことから、「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型の変化がＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異によるものであることを検証した。
【００２３】
ＡｔＢＧ１遺伝子が暗号化するＡｔＢＧ１タンパク質は、植物内アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ）の濃度を増加させることで、環境ストレスに対する抵抗性を示す。
【００２４】
本発明の好ましい実施例では、ＡｔＢＧ１タンパク質がＡＢＡグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって生成されるＡＢＡ−ＧＥを加水分解することができるのかどうかを確認するために、正常なＡｔＢＧ１タンパク質及び正常なＡｔＢＧ１遺伝子に置換や欠失突然変異を起こした突然変異ＡｔＢＧ１タンパク質を、ＡＢＡ−ＧＥ（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｅｓｔｅｒ）とともに反応させてＨＰＬＣを実施した後、ＡＢＡ分画を定量した。その結果、正常なＡｔＢＧ１タンパク質と反応させた方でのみ多量のＡＢＡが観察され、突然変異ＡｔＢＧ１タンパク質と反応させた方ではＡＢＡが観察されなかったので（図１７及び図１８）、ＡｔＢＧ１遺伝子が暗号化するＡｔＢＧ１タンパク質がＡＢＡ−ＧＥを加水分解してＡＢＡの濃度を増加させるということを確認した。
【００２５】
「突然変異ａｔｂｇ１」にＡＢＡを導入すると、黄色かった葉が正常と同じ緑になり（図１２）、夜に気孔が閉まることが誘導されるという実験結果（図１４）もまた、ＡｔＢＧ１遺伝子によってＡＢＡが活性化すると植物がストレス抵抗性を示すということを示している。
【００２６】
前記と共に、ＡｔＢＧ１がアブシジン酸の不活性形態であるＡＢＡ−ＧＥが存在する細胞内小器官であるＥＲに存在するという観察結果（図２３ないし図２６）も、ＡｔＢＧ１がＡＢＡ−ＧＥを加水分解してＡＢＡに活性化させる反応を媒介するという事実を間接的に証明する。
【００２７】
したがって、本発明は、植物内に導入して対象植物が環境ストレスに抵抗性を有するようにするＡｔＢＧ１遺伝子及び他の植物のその相同の遺伝子の用途を提供する。本発明の遺伝子は、単独でまたは、ベクターに挿入して公知された植物形質転換方法によって植物内に導入することができる。すなわち、アグロバクテリウム媒介方法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）、ＰＥＧを使用した方法及び電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）など本発明が属する技術分野の当業者に知られた周知の方法を利用することができる。
【００２８】
一方、変異体と言うのは、本来のＡｔＢＧ１タンパク質のアミノ酸配列の中で一部アミノ酸に変異が存在するが、機能的には等価であるタンパク質を意味する。前記変異体は、同一種または他の種のＡｔＢＧ１タンパク質相同体と構造的、生理学的機能が類似の自然的または人為的突然変異体を全て含む。
【００２９】
また、本発明は、ＡｔＢＧ１またはその変異体をコードする遺伝子が導入されてストレス抵抗性を有する形質転換植物を提供する。
【００３０】
本発明者等は、環境ストレスに抵抗性を有する形質転換植物を製造するために、ＡｔＢＧ１遺伝子を含む植物発現ベクターｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１を製造し、それをアグロバックテリウム（ＬＢＡ４４０４）に形質転換させて、２００４年１１月１８日付けで韓国生命工学研究所遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ１０７２９ＢＰ）。
【００３１】
続いて、前記ｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１ベクターで形質転換させたアグロバクテリウムをフローラルディプ（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ）法を使用してシロイヌナズナを形質転換させて、形質転換植物を修得した。
【００３２】
ＡｔＢＧ１遺伝子が導入された前記形質転換シロイヌナズナが、多様な環境ストレスに対してどんな表現型を示すのか確認してみた。その結果、形質転換されていない野生型は高濃度のＮａＣｌで枯死したが、ＡｔＢＧ１で形質転換されたシロイヌナズナは、正常に成長し（図４）、根成長の場合、ＮａＣｌの濃度を漸次高めて処理した時、形質転換されていない野生型の根成長率は漸次に減少したが、形質転換されたシロイヌナズナは一定濃度まで根成長率が増加した（図５）。
【００３３】
したがって、ＡｔＢＧ１が導入された形質転換植物は、高濃度のＮａＣｌのような環境ストレスに対して抵抗性を示すということが分かる。
【００３４】
本発明には、ＡｔＢＧ１またはその変異体をコードする遺伝子を保有する、形質転換された植物細胞も含まれる。
【００３５】
また、本発明の範囲には、前記遺伝子が導入されて環境ストレスに抵抗性を有する形質転換植物の子孫またはクローンである植物及び前記植物の種子、実、穂、塊茎、塊根、樹木、カルスまたは原形質体も含まれる。
【００３６】
同時に、本発明は、植物内ＡＢＡの濃度を増加させることで、環境ストレスに対する抵抗性を有する植物を生産する方法を提供する。
【００３７】
詳細には、前記方法は、I）ＡｔＢＧ１遺伝子／他の植物のその相同遺伝子または前記遺伝子を有するベクターを植物細胞に導入する工程；及び
II）前記植物細胞を組職培養して再分化させる工程を含むことができる。
【００３８】
本発明者等は、ＡｔＢＧ１遺伝子を含むｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１ベクターでアグロバクテリウムを形質転換させてフローラルディプ（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ）を使用してシロイヌナズナで形質転換させて形質転換植物を修得した。前記形質転換植物は、ＡｔＢＧ１遺伝子の発現産物によって活性化したＡＢＡの濃度が増加されるので、多様なストレスに対する抵抗性を示した。
【００３９】
同時に、本発明は、ＡｔＢＧ１遺伝子またはＡｔＢＧ１タンパク質を導入して、植物にストレスに対する抵抗性を付与する方法を提供する。
【００４０】
前記のように、ＡｔＢＧ１は、アブシジン酸グルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）を加水分解してストレス耐性物質であるアブシス酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させて、植物にストレス抵抗性を付与する。これは、ＡｔＢＧ１の重合によって促進される。
【００４１】
本発明者等は、ＡｔＢＧ１−過多発現植物を通じて、脱水ストレス条件下で脱水−誘導重合によるＡｔＢＧ１の早い活性化は、ＡＢＡレベルを増加させる機序で（図２７ないし図３１参照）、植物は正常成長条件下で日周期性ＡＢＡ増加を調節するために、ＡｔＢＧ１重合を通じてＡＢＡ−ＧＥをＡＢＡで活性化させることを確認した（図３２ないし図３４及び図３６ないし図３８参照）。これは、植物が信号伝達経路を通じないでＡＢＡ活性化プール（ａｃｔｉｖｅ ｐｏｏｌ）調節のためにＡｔＢＧ１を使用することを示す。ＡｔＢＧ１によってＡＢＡ−ＧＥからＡＢＡを生産することは、長くて複雑なデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）生合成経路に比べて、非常に単純でストレスの強度と持続時間によって早くＡＢＡ活性化プール（ａｃｔｉｖｅ ｐｏｏｌ）を調節することができる。したがって、ＡＢＡ−ＧＥからＡＢＡを修得する経路が、植物が脱水ストレスに対する抵抗性を示すために使用される理由であると判断される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００４３】
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００４４】
＜実施例１＞形質転換シロイヌナズナの製造
＜１−１＞ｃＤＮＡライブラリーからＡｔＢＧ１遺伝子分離
本発明者等は、浸透圧ストレス中の一つである高濃度のＮａＣｌによって発現が誘導される遺伝子が含まれた「部分ｃＤＮＡライブラリー」（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ）（Ｐｉｈ Ｋ．Ｔ．等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ，１９９７年，第７巻，５６７頁）を修得した。それから、ベータグルコシダーゼの同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）（図１）中の一つをコードするシロイヌナズナ遺伝子であるＡｔＢＧ１を分離した。配列番号１で表される正方向プライマーと配列番号２で表される逆方向プライマーを使用した。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）を使用して前記に記載したプライマー対と鋳型を９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５０℃で１秒及び７２℃で１分間５０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させて反応を終結した。
【００４５】
＜１−２＞植物形質転換用発現ベクターの製造
本発明者等は、ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換されたシロイヌナズナを製造するために、まずＡｔＢＧ１遺伝子を発現ベクターにクローニングした。
【００４６】
詳細には、ＣａＭＶ３５Ｓプローモーターを有していてカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性を有する発現ベクターｐＢΙ１２１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＧＵＳ部位を、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するＡｔＢＧ１遺伝子で置換して、形質転換用発現ベクターｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１を製造した。前記ｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１ベクターは、アグロバクテリウムに導入して前記アグロバクテリウム形質転換体ＬＢＡ４４０４を、２００４年１１月１８日付けで韓国生命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ１０７２９ＢＰ）。
【００４７】
＜１−３＞形質転換シロイヌナズナの製造
本発明者等は、前記実施例＜１−２＞で製造したＡｔＢＧ１遺伝子を含む発現ベクターをシロイヌナズナに形質転換させた。
【００４８】
詳細には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を媒介にした形質転換方法の一つであるフローラルディップ（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ）方法を使用した（Ｓｔｅｖｅｎ Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｆ．Ｂ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８年，第１６（６）巻，７３５−７４３頁）。形質転換植物を製造するために、シロイヌナズナをＭＳ培地で育てて土に移した後、花軸が延びてくると２回切って状態が良い時、シロイヌナズナの地上に出た部分を切り捨てた。
【００４９】
ｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１ベクターで形質転換させたアグロバクテリウムを、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエクストラクト、０．５％ＮａＣｌ）に安定期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）まで育てて、遠心分離で回収して接種培地（５％スクロース 、０．０５％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７（Ｏｓｉ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ社））に再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。懸濁液のＯＤ値が０．８になると、切って準備しておいたシロイヌナズナを懸濁液に逆に浸けて３〜５秒間やわらかく掻きまぜた後、シロイヌナズナを取り出してプラスチックトレーに移した。シロイヌナズナに透明なプラスチックドーム（ｄｏｍｅ）をかぶせて湿度が維持されるようにしたままで闇の中で、１２〜２４時間培養してそれから形質転換植物を修得した。
【００５０】
＜実施例２＞多様なストレスによる形質転換シロイヌナズナの変化観察
＜２−１＞多様なストレスによるＡｔＢＧ１遺伝子の発現分析
本発明者等は、ＡｔＢＧ１の発現がストレスによって誘導されるのかどうか確認するために、前記形質転換シロイヌナズナに多様な全体ＲＮＡを抽出して環境ストレスを加えた後、これをノーザンブロットで分析してＡｔＢＧ１遺伝子の発現を測定した。
【００５１】
詳細には、高濃度のＮａＣｌ処理のために、１５０ｍＭのＮａＣｌを加え、低温ストレスを加えるために植物をＭＳプレートで２週間４℃で培養し、脱水処理のためにはプレートに蓋をしないまま培養した。抽出した全体ＲＮＡに、ＡｔＢＧ１、Ｇｌｕｃ（ＡＦ０８２１５７）及びｐｓｒ３．１（Ｕ７２１５３）ｃＤＮＡをプローブ（ｐｒｏｂｅ）でノーザンブロットを実施した。プローブに使用したＧｌｕｃ（ＡＦ０８２１５７）とｐｓｒ３．１（Ｕ７２１５３）遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号４で表される正方向プライマーと配列番号５で表される逆方向プライマーを使用して、全体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型でＰＣＲを実施して得たものである。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）を使用して前記に記載したプライマー対と鋳型を９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５０℃で１秒及び７２℃で１分間、５０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させて反応を終結した。
【００５２】
ノーザンブロット結果、ＡｔＢＧ１遺伝子が導入された植物は、ＮａＣｌストレスによってＡｔＢＧ１の発現が誘導された一方、ベータグルコシダーゼ同族体をコードするＡｔＢＧ１以外の遺伝子（Ｌｅａｈ Ｒ．等，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年，第２７０巻，１５−７８９頁；Ｍａｌｂｏｏｂｉ Ｍ．，ａｎｄ Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｄ．Ｄ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７年，第３４巻，５７頁）であるＧｌｕｃとｐｓｒ３．１は、環境ストレスによって発現が誘導されなかった（図２）。したがって、他のベータグルコシダーゼ同族体と異なり、ＡｔＢＧ１遺伝子だけが唯一に植物でストレス抵抗性を示すようにする遺伝子であることが分かる。
【００５３】
＜２−２＞多様なストレスに対する形質転換シロイヌナズナの表現型観察
本発明者等は、ＡｔＢＧ１遺伝子に形質転換されたシロイヌナズナが多様な環境ストレスに対してどんな表現型を示すのか確認してみた。
【００５４】
詳細には、ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換されたシロイヌナズナであるＴ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ １）、Ｔ２（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ２）及びＴ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ３）と対照区に使用する空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＢΙ１２１で形質転換されたシロイヌナズナの全体ＲＮＡを得て、ＡｔＢＧ１ｃＤＮＡをプローブでノーザンブロットを実施した結果、空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）で形質転換されたシロイヌナズナを除いたＴ１、Ｔ２及びＴ３で、ＡｔＢＧ１遺伝子が正常に発現されることを確認した（図３）。
【００５５】
この中からＴ１を選んで１０日間土で培養した後、４日間毎日２時間ずつ２００ｍＭのＮａＣｌ溶液を吸収させる方法で、高濃度のＮａＣｌを処理した。根成長は、新しいＭＳプレートに移してから７日後に測定した（ｎ＝５０）。
【００５６】
その結果、空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＢΙ１２１で形質転換されたシロイヌナズナは、高濃度のＮａＣｌを加えた時枯死したが、ＡｔＢＧ１で形質転換されたＴ１は、高濃度のＮａＣｌにも正常に成長した（図４）。
【００５７】
根成長の場合、ＮａＣｌの濃度を漸次に高めた時、ＡｔＢＧ１で形質転換されていない野生型は根成長率が漸次減少したが、ＡｔＢＧ１で形質転換されたＴ１、Ｔ２及びＴ３は一程濃度（１００ｍＭ）まで根成長率が増加した（図５）。
【００５８】
発現パターンをさらに詳しく調べるために、ＡｔＢＧ１上流をベータグルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、ＧＵＳ）暗号化部位の前に位置させた。詳細には、ｐＢΙ１２１ベクター内３５Ｓ：ＧＵＳから３５Ｓプローモーターを制限酵素で切り取って、配列番号９と１０で表されるプライマーを使用して鋳型であるクロモゾーマル（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡを準備してＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）を使用して、前記に記載したプライマー対と鋳型を９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で１分間、５０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させて反応を終結した。前記方法で修得したＡｔＢＧ１上流プローモーター１．７Ｋｂを修得して、これをベクター内に挿入、すなわちＡｔＢＧ１遺伝子をＧＵＳで標識して前記実施例の方法と同様に前記作製物を植物に導入した。既存論文の方法によって（Ｈｗａｎｇ Ｉ ａｎｄ Ｓｈｅｅｎ Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ．，２００１年，第４１３（６８５４）巻，３８３−９頁）基質であるＸ−グルクロナイド（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）（Ｒｏｓｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ）を使用して、ＧＵＳの活性度を測定した結果、形質転換植物でＧＵＳ発現は低く、放射葉（ｒｏｓｅｔｔｅ）と茎葉（ｃａｕｌｉｎｅ ｌｅａｖｅｓ）の倍数組職（ｈｙｄａｔｈｏｄｅ）に特異的に発現されることを確認した（図６）。また、２週間育てた前記形質転換植物に２週間水を与えない方法で脱水ストレスを加えた後、Ｘ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを基質でＧＵＳの活性度を測定した結果、倍数組職、放射葉と茎葉の脈管構造でＧＵＳが標識されたＡｔＢＧ１の発現が強く誘導された。これは、ＡｔＢＧ１が日照り反応に関与するということを示す（図６）。
【００５９】
＜実施例３＞「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型観察
＜３−１＞「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型観察
本発明者等は、ＡｔＢＧ１の生物学的役割を調べるために、ＡｔＢＧ１遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された「突然変異ａｔｂｇ１」が、多様な環境ストレスにどんな表現型を示すのか観察した。
【００６０】
詳細には、米国サルク研究所（ＳＡＬＫ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で構築したＴ−ＤＮＡ挿入突然変異株の中で、ＡｔＢＧ１の９番目イントロンにＴ−ＤＮＡが挿入された突然変異（図７Ａ）を修得した後、前記突然変異のＡｔＢＧ１遺伝子でＴ−ＤＮＡが挿入されたかどうかをもう一度確認した。配列番号６で表される左側境界プライマーと配列番号７で表される正方向プライマー、配列番号８で表される逆方向プライマーでＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）を使用して前記に記載したプライマー対と鋳型を９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５０℃で１秒及び７２℃から１分間、５０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させて反応を終結した。その結果、４１０ｂｐのＰＣＲ産物が生成されたことを観察することにより、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたことを確認した（図７Ｂ）。
【００６１】
また、配列番号２５で表されるＡｔＢＧ１−特異的な正方向プライマーと配列番号２６で表される逆方向プライマーを使用して、前記「突然変異ａｔｂｇ１」の全体ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲを実施した。その結果、図８に示したようにＡｔＢＧ１転写体（ｍＲＮＡ）がないことを確認し、以後の実験に使用した。
【００６２】
野生型と前記Ｔ−ＤＮＡが挿入された「突然変異ａｔｂｇ１」を、発芽後、１週（１ｗ）、２週（２ｗ）（図９）及び４週（図１０）後に観察した結果、野生型と異なり葉が黄色くて背が低かった。
【００６３】
１週間育った「突然変異ａｔｂｇ１」に外部からＡＢＡを注入して３日間培養した結果、注入するＡＢＡの量が増えるほど、黄色かった葉が正常と同じ緑色に変ってきた（図１２）。
【００６４】
＜３−２＞「突然変異ａｔｂｇ１」の気孔大きさ測定
本発明者等は、ＡｔＢＧ１の生物学的役割を調べるためのまた他の方法として、「突然変異ａｔｂｇ１」の葉にある気孔の大きさ変化を測定した。
【００６５】
詳細には、２０℃、７０％の相対湿度で光１６時間、闇８時間の周期で培養した後、１２時と２４時に葉にある気孔の大きさを測定した（ｎ＝１５０）（図１３）。その結果、正常な植物では気孔が昼に開いて夜には閉まる一方、「突然変異ａｔｂｇ１」は夜にも昼のように気孔が閉まらなかった。
【００６６】
また、外部から注入されたＡＢＡが闇の中で気孔を閉めるのにどんな影響を与えるのか調べるために、２３時にＡＢＡ１０ｍＭと５０ｍＭをそれぞれ処理して、２４時に気孔の大きさを測定した（図１４）。対照区として、気孔が閉まる時にＮＯ合成酵素を抑制することが知られているＮＡＭＥ（Ｌ−ｎｉｔｒｏａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）１００ｕｌを４時から１０時間処理して、２４時に気孔の大きさを測定した。
【００６７】
その結果、野生型にＮＡＭＥを処理すると夜にも気孔が閉まらない一方、「突然変異ａｔｂｇ１」にＡＢＡを処理すると夜に気孔が閉まることが誘導された。これは、夜に気孔が閉まることがＡＢＡによって調節されるということを示す（ｎ＝２００、バー：標準誤差）。
【００６８】
前記のように「突然変異ａｔｂｇ１」に外部ＡＢＡを添加すると正常の表現型を回復するということは、ＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異によってＡｔＢＧ１遺伝子が発現されず、ＡＢＡが媒介した反応に欠陥が生じたということを示す。
【００６９】
＜３−３＞乾燥した環境で「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型観察
本発明者等は、ＡｔＢＧ１の生物学的役割を調べるための最後の方法として、乾燥した環境時での「突然変異ａｔｂｇ１」の水分損失程度と枯死程度を観察した。
【００７０】
詳細には、水分損失を比べるために、３時間２０℃、１０％の乾燥した相対湿度に置いておいた葉の重さを測定した（花芽が形成される前、短い茎に付いている葉であるロゼット葉２０枚を全て測定した）。その結果、「突然変異ａｔｂｇ１」は、野生型に比べて水分損失量が１．５倍程度多いことが分かった（図１５）。
【００７１】
また、野生型と「突然変異ａｔｂｇ１」を土に植え代えて１４日（１４ｄ）または２１日（２１ｄ）間、水を与えないまま温室で２０℃、７０％の相対湿度の条件で培養した。その結果、野生型は脱水によって葉が黒っぽく変わった一方、「突然変異ａｔｂｇ１」は野生型よりさらに脱水が進んで大部分の葉が枯死した（図１６）。
【００７２】
したがって、「突然変異ａｔｂｇ１」は、野生型に比べて環境ストレスに対する抵抗力が弱化されたことを確認した。
【００７３】
＜３−４＞遺伝子間相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を通じた検証実験
本発明者等は、前記の「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型が確実にＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異による結果なのか検証するために、「突然変異ａｔｂｇ１」にＡｔＢＧ１遺伝子を形質転換させてＡｔＢＧ１遺伝子を過発現させた後、＜実施例２＞と同一実験を実施した。
【００７４】
詳細には、ウイルスＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で標識された野生型ＡｔＢＧ１ｃＤＮＡ（ＡｔＢＧ１：ＨＡ）を植物に形質転換させて、ＡｔＢＧ１が発現されるようにすることで、ＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異による損失を相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）して、前記形質転換体を「遺伝子回復ａｔｂｇ１（ｒｅｓｃｕｅｄ ａｔｂｇ１）」とした。
【００７５】
「遺伝子回復ａｔｂｇ１」のタンパク質抽出物に対して、抗−ＨＡ抗体でウエスタンブロットを遂行した結果、図１１に示したようにＡｔＢＧ１タンパク質が発現されることを確認した。
【００７６】
前記「遺伝子回復ａｔｂｇ１」に＜実施例３＞と同じ実験を実施した結果、発芽後、１週（１ｗ）、２週（２ｗ）（図９）及び４週（図１０）後に野生型と類似に鮮かな緑色を示して背が高く、気孔開閉においても、野生型のように昼には気孔を開いて夜には気孔が閉まることを確認した（図１３）。脱水実験では、野生型より水分損失が少なかく（図１５）、乾燥した環境で２１日間培養した結果、脱水によって葉が黒っぽく変わらないで正常によく育った（図１６）。
【００７７】
したがって、「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型は、ＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異によるものであることが検証された。
【００７８】
＜実施例４＞ＡｔＢＧ１によるＡＢＡ−ＧＥの加水分解
＜４−１＞エライザ（ＥＬＩＳＡ）によるＨＰＬＣのＡＢＡ分画定量
本発明者等は、ＡｔＢＧ１タンパク質がＡＢＡグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって生成されるＡＢＡ−ＧＥを加水分解することができるのかどうか確認した（Ｘｕ Ｚ．Ｊ．等，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００２年，第１２９巻，１２８５頁）。
【００７９】
詳細には、ＡｔＢＧ１：ＨＡ、ＡｔＢＧ１［Ｅ２０７Ｑ］：ＨＡ、ＡｔＢＧ１［△Ｃ１０５］：ＨＡ及び対照区である空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）でシロイヌナズナを形質転換させた後、２４時間経過後タンパク質抽出物を修得した。前記で、ＡｔＢＧ１［Ｅ２０７Ｑ］：ＨＡは、ベータグルコシダーゼの活性化部位である２０７番目塩基に挿入突然変異（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有するもので（Ｇ． Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９５年，第３巻，８５３頁；Ｍａｒａｎａ Ｓ．Ｒ．等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００１年，第１５４５巻，４１頁）、ＡｔＢＧ１［△Ｃ１０５］は、Ｃ末端に１０５個のアミノ酸がない、欠失突然変異を有しているものである。
【００８０】
抗ＨＡ抗体を使用して、これら遺伝子から発現されたタンパク質を免疫分離（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後（図１７）、分離したタンパク質をＡＢＡ−ＧＥ（ＡＰＥＸ ＯＲＧＡＮＩＣＳ ＬＴＤ．）とともに１００ｍＭシトラート緩衝溶液（ｐＨ５．５）で、３７℃で一時間半反応させた。反応産物は、特定溶媒（４０％メタノール、０．１Ｍアセト酸、１０ｍｇ／ｌブチレートハイドロキシトルエン）であらかじめ満たされた（ｐａｃｋｉｎｇ）カラム（ＲＴ２５０−４ｃｏｌｕｍｎ、ＭＥＲＣＫ社）が具備されたＨＰＬＣで分離した。
【００８１】
その結果、ＡｔＢＧ１：ＨＡとＡｔＢＧ１［２０７］：ＨＡ全てＡＢＡ位置に新しいピークを作った（図１８）。このピークに該当する分画を抗−ＡＢＡ抗体（ＡＢＡ−ＧＥは認識することができない）を使用してエライザ（ＥＬＩＳＡ）で定量した。
【００８２】
その結果、ＡｔＢＧ１［Ｅ２０７Ｑ］：ＨＡと反応させて排出されたＡＢＡの量は、野生型と反応させて排出されたＡＢＡの量に比べて８０パーセント減少したが（図１９）、これは、２０７番目塩基配列であるグルタミン酸が他のベータグルコシダーゼと同じく、この酵素の加水分解活性に重要であるということを示す（Ｄａｖｉｅｓ Ｇ．ａｎｄ Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９５年，第３巻，８５３頁；Ｍａｒａｎａ Ｓ．Ｒ．等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００１年，第１５４５巻，４１頁）。一方、ＡｔＢＧ１［△Ｃ１０５］：ＨＡやベクター対照区のタンパク質抽出物は、ＡＢＡ−ＧＥと反応させた時、ＡＢＡを生産しなかったが、これは、前記実験結果で「突然変異ａｔｂｇ１」のＡＢＡ生産が減ったり初めから生成されない結果と一致する。したがって、ＡｔＢＧ１：ＨＡがＡＢＡ−ＧＥを加水分解してＡＢＡを生成させるということが確認された。
【００８３】
＜４−２＞種子内のＡＢＡのレベル確認
ＡＢＡは、他のどの部位よりも種子に多量含有されているので、前記実験結果をより確実なものにするために、本発明者等は、野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」、「遺伝子回復したａｔｂｇ１（ｒｅｓｃｕｅｄ ａｔｂｇ１）」の種子にあるＡＢＡのレベルを測定した。
【００８４】
詳細には、液体窒素を加えてつぶした種子から８０％エチルアルコールに溶解される成分を抽出して、Ｃ１８カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社）が装着されたＨＰＬＣで、ＡＢＡピークに該当する分画を得た。これを抗−ＡＢＡ抗体（Ａｇｄｉａ社）を使用して、エライザ（ＥＬＩＳＡ）でＡＢＡを定量した。
【００８５】
その結果、「突然変異ａｔｂｇ１」種子のＡＢＡ含量は、野生型の約４０パーセントである一方（図２０）、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」種子のＡＢＡ含量は、野生型含量の８６パーセントから２５０パーセント範囲にかけて分布した。すなわち、「突然変異ＡｔＢＧ１種子」は、野生型に比べてＡＢＡ含量が非常に低い一方、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」種子は、野生型と類似かまたは野生型より二倍以上多かった。また、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」種子のＡｔＢＧ１：ＨＡ量を抗−ＨＡ抗体で確認した結果（図２１）、ＨＰＬＣ結果定量されたＡＢＡ量（図２０）と分布が類似していた。すなわち、ＡＢＡの量とＡｔＢＧ１タンパク質の量との間に密接な関連があることが明らかにされた。
【００８６】
＜４−３＞発芽分析
本発明者等は、前記種子内のＡＢＡのレベルが発芽と関連があるのかどうか確認してみた。詳細には、野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」及び「遺伝子回復したａｔｂｇ１（ｒｅｓｃｕｅｄ ａｔｂｇ１）」に対して発芽分析（ａｓｓａｙ）を実施した結果、「突然変異ａｔｂｇ１」の種子は、野生型より早く発芽した一方、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」の種子は、野生型より遅く発芽した（図２２）。よって、「突然変異ａｔｂｇ１」が野生型よりさらに低いレベルのＡＢＡを含むということを確認した。これは、突然変異ａｔｂｇ１が損失したＡｔＢＧ１タンパク質によって、ＡＢＡ−ＧＥがＡＢＡで加水分解されないが、自体的に活性化状態であるＡＢＡ形態を少量含んでいることを示す。
【００８７】
＜実施例５＞蛍光顕微鏡を使用した細胞内ＡｔＢＧ１の位置確認
＜５−１＞ＧＦＰ標識されたＡｔＢＧ１の蛍光顕微鏡象観察
アブシジン酸の不活性化された形態であるアブシジン酸グルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）は、ＥＲに存在する。ＡＢＡ−ＧＥを活性化形態であるＡＢＡで加水分解させるＡｔＢＧ１は、Ｃ末端にＲＥＥＬという配列モチーフを有している。これは、ＥＲ位置（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）配列であるＫＤＥＬと非常に類似している（Ｄａｖｉｅｓ Ｇ．ａｎｄ Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９５年，第３巻，８５３頁）。本発明者等は、これを根拠にＡｔＢＧ１がＡＢＡ−ＧＥが存在するＥＲに位置するのかどうか確認するために、ＡｔＢＧ１の蛍光顕微鏡象を観察した。
【００８８】
詳細には、ＡｔＢＧ１の先行配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）下側（ｄｏｗｎ ｓｔｒｅａｍ）に緑蛍光タンパク質ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を標識した組換え遺伝子であるＧＦＰ：ＡｔＢＧ１及びＥＲシャペロン結合タンパク質であるＢｉＰ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に、赤色蛍光タンパク質であるＲＥＰ（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を標識した組換え遺伝子であるＢｉＰ：ＲＦＰを、シロイヌナズナに形質転換させて蛍光顕微鏡で観察した（図２４）。
【００８９】
ＧＦＰ：ＡｔＢＧ１は、ＧＦＰ単独である時の拡散したパターン（図２３のパネルａ）とは異なり、ＥＲ構造を示すマルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ネットワークパターンを作り（パネルｃ）、前記ＧＦＰ：ＡｔＢＧ１のパターンは、ＥＲシャペロン結合タンパク質であるＢｉＰ：ＲＦＰのパターン（パネルｄ）と重なった（パネルｅ）（Ｊｉｎ Ｊ．Ｂ．等，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００１年，第１３巻，１５１１頁）。すなわち、ＡｔＢＧ１がＥＲに存在するタンパク質であるＢｉＰとともに存在して、これは、ＡｔＢＧ１がＢｉＰと同じくＥＲに位置するということを示す。
【００９０】
ＡｔＢＧ１がＥＲに位置するという、より直接的な証拠を捜すために、形質転換された植物で発現されるＡｔＢＧ１：ＨＡを抗−ＨＡ抗体を使用して免疫化学療法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ）で検査した結果、同様に、ＡｔＢＧ１：ＨＡがＢｉＰ：ＲＦＰ蛍光象と重なるＥＲ特異的なネットワークパターンを示した（図２４）。
【００９１】
＜５−２＞ＡｔＢＧ１の糖質化有無確認
本発明者等は、ＡｔＢＧ１がＥＲに位置するということを、さらに確実にさせるために、ＡｔＢＧ１の糖質化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を検査した。タンパク質は、糖質化によってグリカン（ｇｌｙｃａｎ）が形成されて、ＥＲに位置するタンパク質等は、このグリカンが、エンドＨとＰＮＧａｓｅ Ｆの酵素作用によって切断される特性を有している（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ Ｇ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年，第２６８巻，２００１頁）。チュニカマイシンは、前記糖質化を抑制する物質である。
【００９２】
ＡｔＢＧ１：ＨＡで形質転換された原形質体から得られたタンパク質抽出物を、エンドＨとＰＮＧ酵素（ＰＮＧａｓｅ）Ｆで処理したもの（チュニカマイシン非処理）、ＡｔＢＧ１に形質転換されたシロイヌナズナにチュニカマイシンを処理した原形質体から得られたタンパク質抽出物、ＡｔＢＧ１で形質転換されたシロイヌナズナにチュニカマイシンを処理しない原形質体から得られたタンパク質抽出物を、抗−ＨＡ抗体でブロッティングした。
【００９３】
チュニカマイシン処理した原形質体から得られたＡｔＢＧ１：ＨＡは、チュニカマイシン処理しない原形質体から得られたものよりタンパク質の大きさが小さかったが、これは、チュニカマイシンによって糖質化が起きなくてグリカンが生成されなかったために現れた結果であると考えられる。また、エンドＤとＰＮＧａｓｅ Ｆ処理してグリカンが切断されたＡｔＢＧ１：ＨＡが、チュニカマイシン処理したＡｔＢＧ１：ＨＡと大きさが同じなので、前記結果をさらに確実に知ることができる。すなわち、ＡｔＢＧ１：ＨＡのグリカン部位は、エンドとＰＮＧａｓｅ全てにセンシティブしてグリカンが切断されることで、チュニカマイシン処理したＡｔＢＧ１と大きさが同じになったことが分かる（図２５）。この結果は、ＡｔＢＧ１がＥＲに存在するということを明確に示す。
【００９４】
＜実施例６＞脱水ストレス誘導重合によるＡｔＢＧ１のＡＢＡ−ＧＥ加水分解活性確認
前記実施例中、脱水させた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」植物でＡＢＡ含量が相当量増加した原因を明らかにするため、本発明者等は、３０％相対湿度条件下に１０時間放置して脱水ストレスを加えた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」とＡＢＡ−ＧＥでＡＢＡを生産するように正常条件で育てた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」のマイクロゾームを比べた。植物のマイクロゾームは、ホモゲナイザー緩衝溶液（２５０ｍＭスクロース ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１０ｍＭ Ｍｇｃｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）に植物を粉砕して３，０００ｒｐｍで５分、１４，０００ｒｐｍで５分間それぞれ遠心分離後、上澄み液のみを得て、１００，０００ｇで超高速遠心分離機で分離して修得した。マイクロゾーム内のＡＢＡ量は、前記で修得したマイクロゾームに１００ｍＭシトラート緩衝液 ｐＨ５．５溶液を添加して反応させた後、ＡＢＡ抗体が入っているエライザ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ａｇｄｉａ社）を使用してＡＢＡを定量した。その結果、脱水ストレスを加えた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」のＡＢＡ生産量が、正常条件で育てた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」のＡＢＡ生産量より増加したことを確認した（図２７）。
【００９５】
前記とともに、本発明者等は、ストレスがＡｔＢＧ１を活性化させる機序が何なのかを調べたが、以前の研究でベータグルコシダーゼの重合形態がモノマーやダイマーよりさらに高い酵素活性を示すという研究結果があったので（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ、１９９８年）、本発明者等は、脱水ストレスがＡｔＢＧ１を活性化させる機序も、やはりＡｔＢＧ１重合によるものであるのか実験してみた。そのために、まず、二つ異なって標識されたＡｔＢＧ１のＡｔＢＧ１：ＨＡとＡｔＢＧ１：Ｔ７を植物に共形質導入して修得した原形質体から前記実施例と同じ方法で、タンパク質抽出物を修得して抗−Ｔ７抗体で共免疫沈降を実施して、抗−ＨＡ抗体でウエスタンブロットを実施してＡｔＢＧ１分子がお互いに結合するのかどうか調べた。その結果、Ｔ７抗体で免疫沈降させた沈降物でＨＡ標識されたＡｔＢＧ１が存在するということが確認された（図３５）。さらに、浸透圧ストレスを誘導する化合物質であるＰＥＧ８０００を原形質体に最終１０％ＰＥＧ８０００になるように１２時間処理した時、沈降物内のＨＡ標識されたＡｔＢＧ１の量が約３倍増加した（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒｙ ｓｏｆｔｗａｒｅで測定、図３５）。ゆえに、本発明者等は、ＡｔＢＧ１が浸透圧ストレス下で促進されるホモメリックな（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）相互作用をすると結論付けた。
【００９６】
このような可能性をより確実にするために、脱水ストレスを加えたり加えていない「遺伝子回復したａｔｂｇ１」の葉を、粉砕緩衝溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮａＮ３、０．１％トリトンＸ−１００）で粉砕した後、１４，０００ｇで５分間遠心分離して上澄み液、すなわちタンパク質抽出物を修得した。これをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００ハイレゾルーション（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にローディングした後、タンパク質を溶離緩衝溶液（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮａＮ３）を３．０ｍｌ分画体積当り０．５ｍｌ／分速度で流してやって所望するタンパク質分画を修得した。これを抗−ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットで分析した。
【００９７】
その結果、対照群植物である脱水ストレスを加えていない「遺伝子回復したａｔｂｇ１」で ＡｔＢＧ１：ＨＡは、主にモノマーで存在し、若干の高分子形態も存在した（図３０）。反対に脱水ストレスを加えた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」のＡｔＢＧ１：ＨＡは、高分子量の形態で存在し、ダイマーやモノマーでは存在しなかった（図２８）。脱水ストレス処理植物でＡｔＢＧ１の主なピークは、６００ｋＤａ以上で現れるが、これはＡｔＢＧ１１０−ｍｅｒに該当するもので、このような結果は、脱水ストレスがＡｔＢＧ１の重合を誘導することを明確に示すものである。
【００９８】
それとともに、本発明者等は、高分子及び低分子量形態のＡｔＢＧ１の酵素活性を比べるため、前記実施例と同様にカラムを使用したゲルろ過方法で修得した高分子量分画と低分子量分画を抗−ＨＡ抗体で免疫沈降を実施した後、ＡＢＡ量をエライザ（ＥＬＩＳＡ）で分析した結果、高分子量形態はＡＢＡの量、すなわちＡｔＢＧ１活性が約４倍増加したが（図２９）、これは、脱水ストレスを加えた植物のマイクロゾームで、ＡＢＡ−ＧＥ加水分解活性増加によりＡＢＡ量が増加したという結果と一致する（図２７）。
【００９９】
次に、ＡｔＢＧ１が脱水ストレス下で高分子量形態で組み合わされる速度を測定したが、そのために「遺伝子回復したａｔｂｇ１」に脱水ストレスを加えた後、３０分、１時間、３時間、時間別にタンパク質抽出物を修得して、ゲルろ過クロマトグラフィーで分画して抗−ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットで確認した。
【０１００】
その結果、高分子量形態のＡｔＢＧ１は、脱水３０分後に現れて時間経過にしたがって漸次に量が増加して（図３０及び図３１）、脱水ストレス１０時間後に、８０％以上の高分子量ＡｔＢＧ１が観察された（図３０及び図３１）。ゆえに、ＡｔＢＧ１の高分子量形態への組み合わせは、脱水ストレスを加えるやいなや速く集中的に進行されたことを確認した。
【０１０１】
＜実施例７＞ＡｔＢＧ１の高分子量形態への重合パターン確認
植物の水分状態は、一日中で正常成長条件下で持続的に変化する。蒸発速度は、日が一番明るい日中に一番高いが、これは周期的に水分含量を低めたり一時的な水分欠乏を惹起する。したがって、本発明者等は、葉でＡＢＡレベルが日周期性を経験すると仮定した。特にさらに高い細胞内ＡＢＡレベルが、太陽光が一番明るい日中に観察され、低いＡＢＡレベルは夜に観察された。
【０１０２】
前記理論を確認するために本発明者等は、正常成長条件下で６時間ごとに野生型及び 「遺伝子回復したａｔｂｇ１」植物の葉の上端部を切って８０％メタノールを入れてすり鉢で粉砕後、４℃で３時間抽出後上澄液を回収してＣ−１８カラム（ＢＭＳ）通過させて凍結乾燥後、ＴＢＳバッファー（Ａｇｄｉａ社）に溶かしてエライザ（ＥＬＩＳＡ）でＡＢＡレベルを測定した。その結果、葉のＡＢＡレベルは、午前８時〜午後２時の間で一番低く、一番高い濃度で日周期性を示した（図３２）。野生型植物は、類似のＡＢＡパターンを示したが全体的に若干低い水準だった。
【０１０３】
ＡＢＡのこのような日周期性増加の原因を調べるために、本発明者等は、ＡｔＢＧ１転写体のみならず野生型植物で一日中多様な時間のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ＡＢＡ生合成に重要なＡｔＡＢＡ１、ＡｔＡＢＡ２及びＡｔＮＣＥＤ３転写体のレベルを測定した（図３６）。詳細には、１０ｍｇ全体ＲＮＡ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及び１０ｎｇの各々のプライマーを使用してすべて反応体積１００ｍｌ（ＲＴ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ５ｍｌ）で、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で３０秒で遺伝子レベルによって総１５〜３５周期を実施した。遺伝子特異的なプライマーは、各々、配列番号１１及び１２（ＡｔＢＧ１）、配列番号１３及び１４（ＡＢＡ１）、配列番号１５及び１６（ＡＢＡ２）、配列番号１７及び１８（ＮＣＥＤ３）、配列番号１９及び２０（陽性対照群ＣＣＡ１）、配列番号２１及び２２（陽性対照群ＴＯＣ１）、配列番号２３及び２４（陰性対照群アクチン）を使用した。
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＴ結果、成長条件下でＡｔＢＧ１とＡｔＡＢＡ２ ｍＲＮＡレベルは、一日中一定に維持されたが（図３６ないし図３８）、これは植物が成長条件下では、脱水ストレスを経験しなかったことを示し、一日中ＡＢＡ含量が増加することは、ＡｔＢＧ１発現増加によるものではないことを示す。一方、ＡｔＡＢＡ１転写体のレベルは、午後２時に約１．７倍増加する変化があり（図３６及び図３７）、ＡｔＮＣＥＤ３ ｍＲＮＡ発現は、午後８時に１．８倍増加し、午前２時まで増加した状態で残っていたが、午前８時には基本レベルに戻った。前記結果は、ＡｔＡＢＡ１とＡｔＮＣＥＤ３ ｍＲＮＡレベル全てがＡＢＡのように日周期性を有するということを意味するが、このようなｍＲＮＡレベルの変化パターンは、ＡＢＡレベルの変化パターンとは一致しないで、なおかつｍＲＮＡの変化程度は２倍よりさらに低かった。
【０１０５】
前記のように、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成関連遺伝子の発現パターンが、ＡＢＡの発現パターンと違うということは、ＡＢＡのデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成が日中にＡＢＡレベルが増加することにほとんど関与しないことを示す。
【０１０６】
前記実験で、ＣＣＡ１及びＴＯＣ１転写体濃度は、生体リズムに対して陽性対照群に使用し（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｔｏｂｉｎ，１９９８年；Ｓｔｒａｙｅｒ等，２０００年）（図３６及び図３８）。アクチンは、生体リズムに対して陰性対照群に使用した。
【０１０７】
次に、本発明者等は、ＡＢＡレベルの日周期性がＡｔＢＧ１の重合を通じた活性化によるものであるのかを実験した。
【０１０８】
詳細には、正常条件で育った「遺伝子回復したａｔｂｇ１」から時間別に修得した全体タンパク質抽出物を、ゲルろ過カラムを使用して分画して抗−ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットで分析した。その結果、高分子量形態のＡｔＢＧ１が日周期性を示したが（図３３及び図３４）、午後２時にレベルが最高であり、早く減少して午前８時に一番低かった。午後２時に全体ＡｔＢＧ１の半分が高分子量形態で存在し、一方午前８時には１０％未満の高分子量形態のＡｔＢＧ１が観察された。高分子量形態のＡｔＢＧ１の濃度は、昼の間葉組職でＡＢＡの増加と相当な関連性があった。これは、ＡｔＢＧ１の重合を通じた活性化が日周期性の間、ＡＢＡ含量の増加をもたらすということを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
前記で詳しくみたように、本発明のＡｔＢＧ１遺伝子が導入された形質転換植物は、植物内で発現されたＡｔＢＧ１タンパク質がアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）を活性化させて低温、塩害、脱水のような多様な環境ストレスに抵抗性を有するので、農産物の生産性増大に大きく寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）のアミノ酸配列を他のベータグルコシダーゼ同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）と整列して比べた結果を示した図である。
【図２−６】環境ストレスが、ＡｔＢＧ１の発現を誘導し、ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換された植物は、ＮａＣｌストレス抵抗性が増加するということを示した図である。
【図２】一週間の間「野生型」シロイヌナズナに多様な化学的処理（低温、脱水、高濃度のＮａＣｌ処理）をした後、全体ＲＮＡを抽出して、ＡｔＢＧ１、ＡｔＧｌｕｃ（ＡＦ０８２１５７）及びＡｔｐｓｒ３．１（Ｕ７２１５３）のｃＤＮＡをプローブ（ｐｒｏｂｅ）にして、ノーザンブロットを実施した結果を示したゲル電気泳動写真である。
【図３】ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナの全体ＲＮＡを抽出してノーザンブロットを実施した結果を示したゲル電気泳動写真である。
【図４】ＡｔＢＧ１や空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｐＢΙ１２１）で形質転換させたシロイヌナズナを１０日間、土で培養した後、４日間ＮａＣｌ処理した結果を示した写真である。
【図５】ＭＳプレートで４日間培養した植物を、高濃度のＮａＣｌを含んだプレートに移して根成長を測定したグラフ（ｎ＝５０）である。
【図６】組職特異的なＡｔＢＧ１の発現を示し、ＡｔＢＧ１プロモーターの調節下にＧＵＳを含む形質転換植物を培養した後、１週間（１Ｗ）、２週間（２Ｗ）及び３週間（３Ｗ）後にＸ−Ｇｌｕｃで染色した結果を示した写真である。
【図７】（Ａ）は、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたＡｔＢＧ１突然変異遺伝子の概路図である。（Ｂ）は、Ｔ−ＤＮＡがＡｔＢＧ１遺伝子に挿入された突然変異シロイヌナズナ（以下「突然変異ａｔｂｇ１」と略称する）のＡｔＢＧ１遺伝子を分離して、ＡｔＢＧ１遺伝子特異的なプライマーでＰＣＲを実施することにより、ＡｔＢＧ１にＴ−ＤＮＡが挿入される突然変異が起きたかどうかを検証したゲル電気泳動写真である。
【図８−１６】「突然変異ａｔｂｇ１」と「突然変異ａｔｂｇ１」にＡｔＢＧ１：ＨＡ遺伝子を形質転換させることにより遺伝子損失が回復したａｔｂｇ１（ｒｅｓｃｕｅｄ ａｔｂｇ１、以下「遺伝子回復したａｔｂｇ１」と略称する）の表現型を示したものである。
【図８】「突然変異ａｔｂｇ１」にＡｔＢＧ１遺伝子特異的なプライマーを使用して ＲＴ−ＰＣＲを実施することで、ＡｔＢＧ１転写体がないことを確認したゲル電気泳動写真である。
【図９−１０】野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」を発芽後、１週（１ｗ）または２週（２ｗ）及び４週後に撮影した写真である。
【図１１】「遺伝子回復したａｔｂｇ１」に、抗−ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ社）を使用してウエスタンブロットを実施することで、ＡｔＢＧ１：ＨＡが発現されることを確認した写真である。
【図１２】「突然変異ａｔｂｇ１」にＡＢＡを注入することで野生型の表現型が再び現れることを示した写真である。
【図１３】光１６時間、闇８時間の周期で培養したシロイヌナズナの葉で昼と夜に気孔の大きさを測定し、その結果を示したグラフ（ｎ＝１５０、バー（ｂａｒ）＝標準誤差）である。
【図１４】「突然変異ａｔｂｇ１」にＡＢＡを注入したり、気孔が閉まる時にＮＯ合成酵素を抑制すると知られたＮＡＭＥを処理した後、植物の葉で昼と夜に気孔の大きさを測定して、その結果を示したグラフ（ｎ＝２００、バー＝標準誤差）である。
【図１５】水分損失を比べるために、表示された時間、１０％の乾燥した相対湿度で ２０℃に置いておいた葉の重さを測定して、その結果を示したグラフである。
【図１６】野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」を１４日（１４ｄ）または２１日（２１ｄ）間、水を与えないまま培養した結果を示した写真である。
【図１７−２２】ＡｔＢＧ１によるＡＢＡ−ＧＥの加水分解と、それによる植物内ＡＢＡレベルの変化を示した図である。
【図１７】ＡｔＢＧ１：ＨＡ、ＡｔＢＧ１［Ｅ２０７Ｑ］、ＡｔＢＧ１［△Ｃ１０５］、空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）で形質転換させた植物の原形質体を抗−ＨＡ抗体を使用し、免疫分離（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した結果を示した写真である。
【図１８】免疫分離されたＡｔＢＧ１：ＨＡタンパク質をＡＢＡ−ＧＥと適切な緩衝溶液で培養して、反応産物をＨＰＬＣで分離した結果を示したグラフである。
【図１９】ＨＰＬＣを実施して分離したＡＢＡ分画を、抗−ＡＢＡ抗体を使用してエライザ（ＥＬＩＳＡ）で測定した結果を示したグラフである。
【図２０】野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」、「遺伝子回復した（ｒｅｓｃｕｅｄ）ａｔｂｇ１」の種子にあるＡＢＡのレベルを、抗−ＡＢＡ抗体（Ａｇｄｉａ社）を使用してエライザ（ＥＬＩＳＡ）で測定した結果を示したグラフである。
【図２１】「遺伝子回復した（ｒｅｓｃｕｅｄ）ａｔｂｇ１」にあるＡｔＢＧ１：ＨＡのレベルを、抗−ＨＡ抗体で確認した結果を示したグラフである。
【図２２】野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」及び「遺伝子回復した（ｒｅｓｃｕｅｄ）ａｔｂｇ１」に対して発芽分析（ａｓｓａｙ）を実施したグラフである。
【図２３−２６】ＡｔＢＧ１の細胞内位置を示した図である。
【図２３】ＡｔＢＧ１遺伝子をＧＦＰ遺伝子で標識した組換え遺伝子の概路図である。
【図２４】ＥＲ標識子であるＢｉｐ：ＲＦＰが発現されて細胞内ＥＲの位置を示し、ＧＦＰは細胞質溶解タンパク質で細胞質を示した蛍光顕微鏡写真である。
【図２５】ＡｔＢＧ１：ＨＡとＢｉＰ：ＲＦＰの細胞内位置を示した蛍光顕微鏡写真である。
【図２６】ＡｔＢＧ１：ＨＡで形質転換されてチュニカマイシン処理しない原形質体から得られたタンパク質抽出物を、エンドＨとＰＮＧ酵素（ＰＮＧａｓｅ）Ｆで処理したサンプルと、ＡｔＢＧ１：ＨＡで形質転換されてチュニカマイシン処理した原形質体から得られたタンパク質抽出物を、抗−ＨＡ抗体でブロッティングした写真である。
【図２７−３１】脱水によってマイクロゾームでＡｔＢＧ１が早く重合されて ＡＢＡ−ＧＥの加水分解を促進することを示した図である。
【図２７】脱水または脱水処理されない「遺伝子回復したａｔｂｇ１」から修得されたマイクロゾーム分画のＡＢＡ−ＧＥ加水分解活性を測定した結果を示した図である。
【図２８】脱水ストレスによってＡｔＢＧ１が重合されることを示した図である。
【図２９】高分子量ＡｔＧＢ１のＡＢＡ−ＧＥ加水分解活性を示した図である。
【図３０−３１】高分子量ＡｔＧＢ１の形成を測定した結果を示した図である。
【図３２−３４】ＡＢＡレベルに比例して日周期性で高分子量ＡｔＢＧ１が重合されることを示した図である。
【図３２】「遺伝子回復したａｔｂｇ１」でＡＢＡレベルの日周期性変化を示した図である。
【図３３】一日中「遺伝子回復したａｔｂｇ１」で修得したタンパク質抽出物中、ＡｔＢＧ１を分析した結果を示した図である。
【図３４】高分子量ＡｔＢＧ１を測定した結果を示した図である。
【図３５】ＰＥＧ８０００で浸透圧ストレスを加えた形質転換された原形質体から修得されたタンパク質抽出物を、抗−Ｔ７抗体で免疫沈降した結果を示した図である。
【図３６−３８】デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ＡＢＡ生合成経路に関連した遺伝子の発現分析に対する図である。
【図３６】ＡｔＢＧ１及びデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）生合成関連遺伝子プライマーを使用して半−定量的なＲＴ−ＰＣＲを実施した結果を示した図である。
【図３７−３８】時間帯別に発現レベルを測定した結果を示した図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１と２は、部分ｃＤＮＡライブラリーからシロイヌナズナ遺伝子であるＡｔＢＧ１を分離するために使用したプライマー配列である。
【０１１２】
配列番号３は、ＡｔＢＧ１遺伝子の配列である。
【０１１３】
配列番号４と５は、全体ｃＤＮＡライブラリーから使用されたＧｌｕｃ（ＡＦ０８２１５７）とｐｓｒ３．１（Ｕ７２１５３）遺伝子を修得するために使用したプライマー配列である。
【０１１４】
配列番号６、７及び８は、ＡｔＢＧ１遺伝子でＴ−ＤＮＡが挿入されたかどうかを確認するために使用したプライマー配列である。
【０１１５】
配列番号９と１０は、ＡｔＢＧ１上流１．７ｋｂ部位を修得するために使用したプライマー配列である。
【０１１６】
配列番号１１と１２は、ＡｔＢＧ１特異的なプライマー配列である。
【０１１７】
配列番号１３と１４は、ＡＢＡ１特異的なプライマー配列である。
【０１１８】
配列番号１５と１６は、ＡＢＡ２特異的なプライマー配列である。
【０１１９】
配列番号１７と１８は、ＮＣＥＤ３特異的なプライマー配列である。
【０１２０】
配列番号１９と２０は、陽性対照群ＣＣＡ１特異的なプライマー配列である。
【０１２１】
配列番号２１と２２は、陽性対照群ＴＯＣ１特異的なプライマー配列である。
【０１２２】
配列番号２３と２４は、陰性対照群アクチン特異的なプライマー配列である。
【０１２３】
配列番号２５と２６も、ＡｔＢＧ１特異的なプライマー配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）遺伝子の用途及び前記ＡｔＢＧ１遺伝子が導入された形質転換植物に関するもので、詳細には、植物内に導入されて発現したＡｔＢＧ１タンパク質が、植物ホルモンの一種であるアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させることにより、植物が多様な環境ストレスに対する抵抗性を有するようにするＡｔＢＧ１遺伝子の用途及び、前記ＡｔＢＧ１遺伝子が導入されてストレスに抵抗性を有する形質転換植物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）は、植物ホルモンの一種で、種子休眠、発芽そして環境ストレスに対する適応反応を含んだ多様な生理学的過程で重要な役割をする（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ Ｒ．Ｒ．等，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００２年，第１４巻，５１５頁；Ｊ．Ｋ．Ｚｈｕ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，２００２年，第５３巻，２４７頁；Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｃｒｅｅｌｍａｎ Ｒ．Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．．１９８８年，第３９巻，４３９頁；Ｌｅｕｎｇ Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｒａｕｄａｔ Ｊ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９９８年，第４９巻，１９９頁）。ＡＢＡは、ほとんど同時にＦ．Ｔ．エジコートとＰ．Ｆ．ウェオイング、二つのグループの研究陣によって発見されたが、十分に熟していない果実の落果を研究したＦ．Ｔ．エジコートの研究グループは、木花の果実から落葉促進物質であるアブシスIIを分離し、木の芽の冬休眠を研究していたＰ．Ｆ．ウェオイングの研究グループは、カバノキの種類であるケカンバ（Ｂｅｔｕｌａ Ｐｕｂｅｓｃｅｎｃｅ）の葉から休眠誘導物質を分離した後、ドルミン（ｄｏｒｍｉｎ）と名付けた。１９６５年にドルミンとアブシスIIが同一物質であることが確認されて、アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、以下ＡＢＡと略称する）という名称に統一された。
【０００３】
ＡＢＡは、休眠中の種子、木の芽、球根などに多量含有されていて、普通発芽の進行につれて含量が減少する。また、ＡＢＡは、葉の気孔を閉めるようにする作用をするが、植物が水分欠乏状態になれば、ＡＢＡ合成が活発になってこれにより葉の気孔が閉まって植物から水分が損失されることを防止する。実際に、フラッカ（ｆｌａｃｃａ）というトマトの突然変異種は、正常植物と比べてＡＢＡ合成が少なく起きるため気孔が閉まらない。
【０００４】
細胞内に存在するＡＢＡのレベルは、生理的で環境的な変化に影響を受けて、生合成と分解との間の正確な均衡によって量が調節される。デノボ生合成（ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、ＡＢＡレベルの増加に寄与するが、酸化や不活性形態に結合することで現れるＡＢＡの分解でそのレベルが減少される（Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｃｒｅｅｌｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．．１９８８年，第３９巻，４３９頁；Ｌｅｕｎｇ Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｒａｕｄａｔ Ｊ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９８年，第４９巻，１９９頁；Ｃｕｔｌｅｒ Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｋｒｏｃｈｋｏ Ｊ．Ｅ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年，第４巻，４７２頁；Ｑｉｎ Ｘ．ａｎｄ Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９９年，第９６巻，１５３５４頁）。
【０００５】
低いＡＢＡレベルは、早い発芽、枯死そして環境ストレスに対して敏感度が増加するような多様な生理学的欠陥を示めす（Ｃｕｔｌｅｒ Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｋｒｏｃｈｋｏ Ｊ．Ｅ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年，第４巻，４７２頁；Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ Ｍ．等，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９８２年，第６１巻，３８５頁；Ｒｏｃｋ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９１年，第８８巻，７４９６頁）。これは、合成と分解との間の均衡を通じてＡＢＡレベルを維持することが、多様な生理学的反応のために重要であることを示す。ＡＢＡ分解の一番目経路は、シトクロムＰ４７０ ＣＹＣ７０７Ａによって不安定な８’ハイドロキシＡＢＡを作るハイドロキシレーションが起きることだが、この不安定な中間物質は、自然発生的な異性体化（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって易しくファゼイン酸（ｐｈａｓｅｉｃ ａｃｉｄ）に転換される（Ｚｅｅｖａａｒｔ Ｊ．Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｃｒｅｅｌｍａｎ Ｒ．Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９８８年，第３９巻，４３９頁；Ｔ．Ｋｕｓｈｉｒｏ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０００年，第２３巻，１６４７頁）。
【０００６】
ＡＢＡレベルが低くなるもう一つの経路は、ＡＢＡがグルコースと結合することであるが、この反応は、グルコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって媒介されて、ＡＢＡグルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）が生成される反応である（Ｃｕｔｌｅｒ Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｋｒｏｃｈｋｏ Ｊ．Ｅ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年，第４巻，４７２頁；Ｗａｌｔｏｎ Ｄ．Ｃ．ａｎｄ Ｌｉ Ｙ．，ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４０−１５７頁；Ｘｕ Ｚ．Ｊ．等，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００２年，第１２９巻，１２８５頁）。このように結合したＡＢＡ−ＧＥ分子は、液胞やアポプラスチックスペース（ａｐｏｐｌａｓｔｉｃ ｓｐａｃｅ）に運搬されるが（Ｋａｉｓｅｒ Ｗ．等，Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９８５年，第１１９巻，２３７頁；Ｄｉｅｔｚ Ｋ．Ｊ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ，２０００年，第５１巻，９３７頁）これは、保存や保管のための形態であるとは考えられていない。
【０００７】
本発明では、ベータグルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の一種であるＡｔＢＧ１が、ＥＲで伝達されるＡＢＡ−ＧＥをＡＢＡ形態に加水分解させて、脱水ストレス下で低分子量ＡｔＢＧ１の早い重合を通じて、細胞内ＡＢＡ含量を増加させるということを確認した。ＡｔＢＧ１遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された突然変異シロイヌナズナ（以下「突然変異ａｔｂｇ１」と略称する）では、減少さしたＡＢＡレベルと気孔閉鎖の欠陥、葉緑体不足による黄色い葉及び非生物学的ストレスに敏感な表現型をみせた。反対にＡｔＢＧ１遺伝子を過発現させる形質転換されたシロイヌナズナは、対照区の発現量の２．５倍のＡＢＡを蓄積させて環境ストレスに対してさらに強い抵抗性を示した。
【０００８】
したがって、本発明者らは、前記ＡｔＢＧ１遺伝子を使用して塩害、冷害、脱水を含む多様な環境ストレスに抵抗性を有する植物を製造することができることを確認することにより本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、植物が多様な環境ストレスに対する抵抗性を有するようにする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、植物に導入することにより対象植物が環境ストレスに対する抵抗性を有するようにする、ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）または、その変異体をコードする遺伝子の用途を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ＡｔＢＧ１またはその変異体をコードする遺伝子が導入されて環境ストレスに抵抗性を有する形質転換植物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、植物内ＡＢＡの濃度を増加させることで、植物が環境ストレスに抵抗性を有する植物を生産する方法を提供する。
【００１３】
併せて、本発明は、ＡｔＢＧ１遺伝子またはＡｔＢＧ１タンパク質を導入して植物にストレス抵抗性を付与する方法を提供する。
【００１４】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１５】
本発明は、植物に導入することで対象植物が環境ストレスに対する抵抗性を有するようにする、ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）またはその変異体をコードする遺伝子の用途を提供する。
【００１６】
アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）は、植物ホルモンの一種で、種子休眠、発芽そして環境ストレスに対する適応反応を含んだ多様な生理学的過程で重要な役割をする。植物内でＡＢＡのレベルが低ければ、早い発芽、枯死のような多様な突然変異表現型が現れる。ＡＢＡレベルが低くなる経路の一つは、ＡＢＡがグルコシルトランスフェラーゼによって不活性形態であるＡＢＡグルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）に変化することであるが、本発明ではシロイヌナズナのベータグルコシダーゼ同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）であるＡｔＢＧ１がＡＢＡ−ＧＥをＡＢＡ形態に変化させて、ＡＢＡレベルを高めることにより植物が環境ストレスに抵抗性を有するようにするということを確認した。前記ストレスは、高温、塩害、乾燥、公害、病源菌、傷、低温、過多な光条件、オゾン、除草剤、過多なＵＶ露出及び浸透圧衝撃（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）を含む。
【００１７】
まず、多様な環境ストレスによってＡｔＢＧ１遺伝子が発現されるのかどうかを確認するために、シロイヌナズナに高濃度のＮａＣｌ、低温、脱水のような多様な環境ストレスを加えた後、ＡｔＢＧ１遺伝子の発現有無を確認した。その結果、ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換された植物は、ＮａＣｌストレスによってＡｔＢＧ１の発現が誘導された一方、他のベータグルコシダーゼ同族体をコードする遺伝子であるＧｌｕｃとｐｓｒ３．１は、発現が誘導されなかった（図２）。これは、ベータグルコシダーゼ同族体の中でＡｔＢＧ１遺伝子だけが、植物がストレス抵抗性を有するようにするということを示している。
【００１８】
本発明者等は、ＡｔＢＧ１が植物に環境ストレスに対する抵抗性を示すようにするのかどうかを調べる間接的な方法として、ＡｔＢＧ１遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された「突然変異ａｔｂｇ１」がどんな表現型を示すのか観察した。その結果、野生型と異なり葉が黄色くて背が低く（図９及び図１０）、正常な植物では気孔は昼に開かれて夜には閉まる一方、「突然変異ａｔｂｇ１」は夜にも昼のように気孔が閉まらなかった（図１３）。乾燥した環境時に野生型に比べて水分損失量が、１．５倍程度多く（図１５）、脱水もひどく起きて大部分の葉が枯死した（図１６）。
【００１９】
したがって、「突然変異ａｔｂｇ１」は、ＡｔＢＧ１タンパク質の欠乏によって環境ストレスに対する抵抗力が弱化したことを確認した。
【００２０】
本発明者等は、前記の「突然変異ａｔｂｇ１」に再びＡｔＢＧ１遺伝子を導入したシロイヌナズナ（以下、「遺伝子回復ａｔｂｇ１」と略称する）に前記の「突然変異ａｔｂｇ１」に対する実験と同一実験を実施することにより、前記実験結果で示された「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型が、ＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異による結果なのかを検証した。
【００２１】
その結果、「遺伝子回復ａｔｂｇ１」は、発芽後１週（１ｗ）、２週（２ｗ）（図９）及び４週（図１０）後に、野生型と類似な鮮やかな緑を示して背が高く、気孔開閉においても野生型のように昼には気孔が開かれて夜には気孔が閉まることを確認した（図１３）。また、脱水実験では、野生型より水分損失が少なく（図１５）、乾燥した環境で２１日間培養した結果、脱水によって葉が黒っぽく変わる表現型が現れないで正常によく育った（図１６）。
【００２２】
したがって、「突然変異ａｔｂｇ１」にＡｔＢＧ１遺伝子を再導入して野生型のような表現型を回復したことから、「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型の変化がＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異によるものであることを検証した。
【００２３】
ＡｔＢＧ１遺伝子が暗号化するＡｔＢＧ１タンパク質は、植物内アブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ）の濃度を増加させることで、環境ストレスに対する抵抗性を示す。
【００２４】
本発明の好ましい実施例では、ＡｔＢＧ１タンパク質がＡＢＡグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって生成されるＡＢＡ−ＧＥを加水分解することができるのかどうかを確認するために、正常なＡｔＢＧ１タンパク質及び正常なＡｔＢＧ１遺伝子に置換や欠失突然変異を起こした突然変異ＡｔＢＧ１タンパク質を、ＡＢＡ−ＧＥ（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｅｓｔｅｒ）とともに反応させてＨＰＬＣを実施した後、ＡＢＡ分画を定量した。その結果、正常なＡｔＢＧ１タンパク質と反応させた方でのみ多量のＡＢＡが観察され、突然変異ＡｔＢＧ１タンパク質と反応させた方ではＡＢＡが観察されなかったので（図１７及び図１８）、ＡｔＢＧ１遺伝子が暗号化するＡｔＢＧ１タンパク質がＡＢＡ−ＧＥを加水分解してＡＢＡの濃度を増加させるということを確認した。
【００２５】
「突然変異ａｔｂｇ１」にＡＢＡを導入すると、黄色かった葉が正常と同じ緑になり（図１２）、夜に気孔が閉まることが誘導されるという実験結果（図１４）もまた、ＡｔＢＧ１遺伝子によってＡＢＡが活性化すると植物がストレス抵抗性を示すということを示している。
【００２６】
前記と共に、ＡｔＢＧ１がアブシジン酸の不活性形態であるＡＢＡ−ＧＥが存在する細胞内小器官であるＥＲに存在するという観察結果（図２３ないし図２６）も、ＡｔＢＧ１がＡＢＡ−ＧＥを加水分解してＡＢＡに活性化させる反応を媒介するという事実を間接的に証明する。
【００２７】
したがって、本発明は、植物内に導入して対象植物が環境ストレスに抵抗性を有するようにするＡｔＢＧ１遺伝子及び他の植物のその相同の遺伝子の用途を提供する。本発明の遺伝子は、単独でまたは、ベクターに挿入して公知された植物形質転換方法によって植物内に導入することができる。すなわち、アグロバクテリウム媒介方法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）、ＰＥＧを使用した方法及び電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）など本発明が属する技術分野の当業者に知られた周知の方法を利用することができる。
【００２８】
一方、変異体と言うのは、本来のＡｔＢＧ１タンパク質のアミノ酸配列の中で一部アミノ酸に変異が存在するが、機能的には等価であるタンパク質を意味する。前記変異体は、同一種または他の種のＡｔＢＧ１タンパク質相同体と構造的、生理学的機能が類似の自然的または人為的突然変異体を全て含む。
【００２９】
また、本発明は、ＡｔＢＧ１またはその変異体をコードする遺伝子が導入されてストレス抵抗性を有する形質転換植物を提供する。
【００３０】
本発明者等は、環境ストレスに抵抗性を有する形質転換植物を製造するために、ＡｔＢＧ１遺伝子を含む植物発現ベクターｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１を製造し、それをアグロバックテリウム（ＬＢＡ４４０４）に形質転換させて、２００４年１１月１８日付けで韓国生命工学研究所遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ１０７２９ＢＰ）。
【００３１】
続いて、前記ｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１ベクターで形質転換させたアグロバクテリウムをフローラルディプ（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ）法を使用してシロイヌナズナを形質転換させて、形質転換植物を修得した。
【００３２】
ＡｔＢＧ１遺伝子が導入された前記形質転換シロイヌナズナが、多様な環境ストレスに対してどんな表現型を示すのか確認してみた。その結果、形質転換されていない野生型は高濃度のＮａＣｌで枯死したが、ＡｔＢＧ１で形質転換されたシロイヌナズナは、正常に成長し（図４）、根成長の場合、ＮａＣｌの濃度を漸次高めて処理した時、形質転換されていない野生型の根成長率は漸次に減少したが、形質転換されたシロイヌナズナは一定濃度まで根成長率が増加した（図５）。
【００３３】
したがって、ＡｔＢＧ１が導入された形質転換植物は、高濃度のＮａＣｌのような環境ストレスに対して抵抗性を示すということが分かる。
【００３４】
本発明には、ＡｔＢＧ１またはその変異体をコードする遺伝子を保有する、形質転換された植物細胞も含まれる。
【００３５】
また、本発明の範囲には、前記遺伝子が導入されて環境ストレスに抵抗性を有する形質転換植物の子孫またはクローンである植物及び前記植物の種子、実、穂、塊茎、塊根、樹木、カルスまたは原形質体も含まれる。
【００３６】
同時に、本発明は、植物内ＡＢＡの濃度を増加させることで、環境ストレスに対する抵抗性を有する植物を生産する方法を提供する。
【００３７】
詳細には、前記方法は、I）ＡｔＢＧ１遺伝子／他の植物のその相同遺伝子または前記遺伝子を有するベクターを植物細胞に導入する工程；及び
II）前記植物細胞を組職培養して再分化させる工程を含むことができる。
【００３８】
本発明者等は、ＡｔＢＧ１遺伝子を含むｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１ベクターでアグロバクテリウムを形質転換させてフローラルディプ（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ）を使用してシロイヌナズナで形質転換させて形質転換植物を修得した。前記形質転換植物は、ＡｔＢＧ１遺伝子の発現産物によって活性化したＡＢＡの濃度が増加されるので、多様なストレスに対する抵抗性を示した。
【００３９】
同時に、本発明は、ＡｔＢＧ１遺伝子またはＡｔＢＧ１タンパク質を導入して、植物にストレスに対する抵抗性を付与する方法を提供する。
【００４０】
前記のように、ＡｔＢＧ１は、アブシジン酸グルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）を加水分解してストレス耐性物質であるアブシス酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させて、植物にストレス抵抗性を付与する。これは、ＡｔＢＧ１の重合によって促進される。
【００４１】
本発明者等は、ＡｔＢＧ１−過多発現植物を通じて、脱水ストレス条件下で脱水−誘導重合によるＡｔＢＧ１の早い活性化は、ＡＢＡレベルを増加させる機序で（図２７ないし図３１参照）、植物は正常成長条件下で日周期性ＡＢＡ増加を調節するために、ＡｔＢＧ１重合を通じてＡＢＡ−ＧＥをＡＢＡで活性化させることを確認した（図３２ないし図３４及び図３６ないし図３８参照）。これは、植物が信号伝達経路を通じないでＡＢＡ活性化プール（ａｃｔｉｖｅ ｐｏｏｌ）調節のためにＡｔＢＧ１を使用することを示す。ＡｔＢＧ１によってＡＢＡ−ＧＥからＡＢＡを生産することは、長くて複雑なデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）生合成経路に比べて、非常に単純でストレスの強度と持続時間によって早くＡＢＡ活性化プール（ａｃｔｉｖｅ ｐｏｏｌ）を調節することができる。したがって、ＡＢＡ−ＧＥからＡＢＡを修得する経路が、植物が脱水ストレスに対する抵抗性を示すために使用される理由であると判断される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００４３】
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００４４】
＜実施例１＞形質転換シロイヌナズナの製造
＜１−１＞ｃＤＮＡライブラリーからＡｔＢＧ１遺伝子分離
本発明者等は、浸透圧ストレス中の一つである高濃度のＮａＣｌによって発現が誘導される遺伝子が含まれた「部分ｃＤＮＡライブラリー」（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ）（Ｐｉｈ Ｋ．Ｔ．等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ，１９９７年，第７巻，５６７頁）を修得した。それから、ベータグルコシダーゼの同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）（図１）中の一つをコードするシロイヌナズナ遺伝子であるＡｔＢＧ１を分離した。配列番号１で表される正方向プライマーと配列番号２で表される逆方向プライマーを使用した。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）を使用して前記に記載したプライマー対と鋳型を９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５０℃で１秒及び７２℃で１分間５０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させて反応を終結した。
【００４５】
＜１−２＞植物形質転換用発現ベクターの製造
本発明者等は、ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換されたシロイヌナズナを製造するために、まずＡｔＢＧ１遺伝子を発現ベクターにクローニングした。
【００４６】
詳細には、ＣａＭＶ３５Ｓプローモーターを有していてカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性を有する発現ベクターｐＢΙ１２１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＧＵＳ部位を、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するＡｔＢＧ１遺伝子で置換して、形質転換用発現ベクターｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１を製造した。前記ｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１ベクターは、アグロバクテリウムに導入して前記アグロバクテリウム形質転換体ＬＢＡ４４０４を、２００４年１１月１８日付けで韓国生命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ１０７２９ＢＰ）。
【００４７】
＜１−３＞形質転換シロイヌナズナの製造
本発明者等は、前記実施例＜１−２＞で製造したＡｔＢＧ１遺伝子を含む発現ベクターをシロイヌナズナに形質転換させた。
【００４８】
詳細には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を媒介にした形質転換方法の一つであるフローラルディップ（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ）方法を使用した（Ｓｔｅｖｅｎ Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｆ．Ｂ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８年，第１６（６）巻，７３５−７４３頁）。形質転換植物を製造するために、シロイヌナズナをＭＳ培地で育てて土に移した後、花軸が延びてくると２回切って状態が良い時、シロイヌナズナの地上に出た部分を切り捨てた。
【００４９】
ｐＢΙ１２１：：ＡｔＢＧ１ベクターで形質転換させたアグロバクテリウムを、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエクストラクト、０．５％ＮａＣｌ）に安定期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）まで育てて、遠心分離で回収して接種培地（５％スクロース 、０．０５％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７（Ｏｓｉ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ社））に再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。懸濁液のＯＤ値が０．８になると、切って準備しておいたシロイヌナズナを懸濁液に逆に浸けて３〜５秒間やわらかく掻きまぜた後、シロイヌナズナを取り出してプラスチックトレーに移した。シロイヌナズナに透明なプラスチックドーム（ｄｏｍｅ）をかぶせて湿度が維持されるようにしたままで闇の中で、１２〜２４時間培養してそれから形質転換植物を修得した。
【００５０】
＜実施例２＞多様なストレスによる形質転換シロイヌナズナの変化観察
＜２−１＞多様なストレスによるＡｔＢＧ１遺伝子の発現分析
本発明者等は、ＡｔＢＧ１の発現がストレスによって誘導されるのかどうか確認するために、前記形質転換シロイヌナズナに多様な全体ＲＮＡを抽出して環境ストレスを加えた後、これをノーザンブロットで分析してＡｔＢＧ１遺伝子の発現を測定した。
【００５１】
詳細には、高濃度のＮａＣｌ処理のために、１５０ｍＭのＮａＣｌを加え、低温ストレスを加えるために植物をＭＳプレートで２週間４℃で培養し、脱水処理のためにはプレートに蓋をしないまま培養した。抽出した全体ＲＮＡに、ＡｔＢＧ１、Ｇｌｕｃ（ＡＦ０８２１５７）及びｐｓｒ３．１（Ｕ７２１５３）ｃＤＮＡをプローブ（ｐｒｏｂｅ）でノーザンブロットを実施した。プローブに使用したＧｌｕｃ（ＡＦ０８２１５７）とｐｓｒ３．１（Ｕ７２１５３）遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号４で表される正方向プライマーと配列番号５で表される逆方向プライマーを使用して、全体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型でＰＣＲを実施して得たものである。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）を使用して前記に記載したプライマー対と鋳型を９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５０℃で１秒及び７２℃で１分間、５０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させて反応を終結した。
【００５２】
ノーザンブロット結果、ＡｔＢＧ１遺伝子が導入された植物は、ＮａＣｌストレスによってＡｔＢＧ１の発現が誘導された一方、ベータグルコシダーゼ同族体をコードするＡｔＢＧ１以外の遺伝子（Ｌｅａｈ Ｒ．等，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年，第２７０巻，１５−７８９頁；Ｍａｌｂｏｏｂｉ Ｍ．，ａｎｄ Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｄ．Ｄ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７年，第３４巻，５７頁）であるＧｌｕｃとｐｓｒ３．１は、環境ストレスによって発現が誘導されなかった（図２）。したがって、他のベータグルコシダーゼ同族体と異なり、ＡｔＢＧ１遺伝子だけが唯一に植物でストレス抵抗性を示すようにする遺伝子であることが分かる。
【００５３】
＜２−２＞多様なストレスに対する形質転換シロイヌナズナの表現型観察
本発明者等は、ＡｔＢＧ１遺伝子に形質転換されたシロイヌナズナが多様な環境ストレスに対してどんな表現型を示すのか確認してみた。
【００５４】
詳細には、ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換されたシロイヌナズナであるＴ１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ １）、Ｔ２（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ２）及びＴ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ３）と対照区に使用する空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＢΙ１２１で形質転換されたシロイヌナズナの全体ＲＮＡを得て、ＡｔＢＧ１ｃＤＮＡをプローブでノーザンブロットを実施した結果、空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）で形質転換されたシロイヌナズナを除いたＴ１、Ｔ２及びＴ３で、ＡｔＢＧ１遺伝子が正常に発現されることを確認した（図３）。
【００５５】
この中からＴ１を選んで１０日間土で培養した後、４日間毎日２時間ずつ２００ｍＭのＮａＣｌ溶液を吸収させる方法で、高濃度のＮａＣｌを処理した。根成長は、新しいＭＳプレートに移してから７日後に測定した（ｎ＝５０）。
【００５６】
その結果、空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＢΙ１２１で形質転換されたシロイヌナズナは、高濃度のＮａＣｌを加えた時枯死したが、ＡｔＢＧ１で形質転換されたＴ１は、高濃度のＮａＣｌにも正常に成長した（図４）。
【００５７】
根成長の場合、ＮａＣｌの濃度を漸次に高めた時、ＡｔＢＧ１で形質転換されていない野生型は根成長率が漸次減少したが、ＡｔＢＧ１で形質転換されたＴ１、Ｔ２及びＴ３は一程濃度（１００ｍＭ）まで根成長率が増加した（図５）。
【００５８】
発現パターンをさらに詳しく調べるために、ＡｔＢＧ１上流をベータグルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ、ＧＵＳ）暗号化部位の前に位置させた。詳細には、ｐＢΙ１２１ベクター内３５Ｓ：ＧＵＳから３５Ｓプローモーターを制限酵素で切り取って、配列番号９と１０で表されるプライマーを使用して鋳型であるクロモゾーマル（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡを準備してＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）を使用して、前記に記載したプライマー対と鋳型を９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で１分間、５０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させて反応を終結した。前記方法で修得したＡｔＢＧ１上流プローモーター１．７Ｋｂを修得して、これをベクター内に挿入、すなわちＡｔＢＧ１遺伝子をＧＵＳで標識して前記実施例の方法と同様に前記作製物を植物に導入した。既存論文の方法によって（Ｈｗａｎｇ Ｉ ａｎｄ Ｓｈｅｅｎ Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ．，２００１年，第４１３（６８５４）巻，３８３−９頁）基質であるＸ−グルクロナイド（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）（Ｒｏｓｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ）を使用して、ＧＵＳの活性度を測定した結果、形質転換植物でＧＵＳ発現は低く、放射葉（ｒｏｓｅｔｔｅ）と茎葉（ｃａｕｌｉｎｅ ｌｅａｖｅｓ）の倍数組職（ｈｙｄａｔｈｏｄｅ）に特異的に発現されることを確認した（図６）。また、２週間育てた前記形質転換植物に２週間水を与えない方法で脱水ストレスを加えた後、Ｘ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを基質でＧＵＳの活性度を測定した結果、倍数組職、放射葉と茎葉の脈管構造でＧＵＳが標識されたＡｔＢＧ１の発現が強く誘導された。これは、ＡｔＢＧ１が日照り反応に関与するということを示す（図６）。
【００５９】
＜実施例３＞「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型観察
＜３−１＞「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型観察
本発明者等は、ＡｔＢＧ１の生物学的役割を調べるために、ＡｔＢＧ１遺伝子にＴ−ＤＮＡが挿入された「突然変異ａｔｂｇ１」が、多様な環境ストレスにどんな表現型を示すのか観察した。
【００６０】
詳細には、米国サルク研究所（ＳＡＬＫ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で構築したＴ−ＤＮＡ挿入突然変異株の中で、ＡｔＢＧ１の９番目イントロンにＴ−ＤＮＡが挿入された突然変異（図７Ａ）を修得した後、前記突然変異のＡｔＢＧ１遺伝子でＴ−ＤＮＡが挿入されたかどうかをもう一度確認した。配列番号６で表される左側境界プライマーと配列番号７で表される正方向プライマー、配列番号８で表される逆方向プライマーでＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｋａｒａ社）を使用して前記に記載したプライマー対と鋳型を９４℃で５分間変性させて、９４℃で３０秒、５０℃で１秒及び７２℃から１分間、５０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させて反応を終結した。その結果、４１０ｂｐのＰＣＲ産物が生成されたことを観察することにより、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたことを確認した（図７Ｂ）。
【００６１】
また、配列番号２５で表されるＡｔＢＧ１−特異的な正方向プライマーと配列番号２６で表される逆方向プライマーを使用して、前記「突然変異ａｔｂｇ１」の全体ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲを実施した。その結果、図８に示したようにＡｔＢＧ１転写体（ｍＲＮＡ）がないことを確認し、以後の実験に使用した。
【００６２】
野生型と前記Ｔ−ＤＮＡが挿入された「突然変異ａｔｂｇ１」を、発芽後、１週（１ｗ）、２週（２ｗ）（図９）及び４週（図１０）後に観察した結果、野生型と異なり葉が黄色くて背が低かった。
【００６３】
１週間育った「突然変異ａｔｂｇ１」に外部からＡＢＡを注入して３日間培養した結果、注入するＡＢＡの量が増えるほど、黄色かった葉が正常と同じ緑色に変ってきた（図１２）。
【００６４】
＜３−２＞「突然変異ａｔｂｇ１」の気孔大きさ測定
本発明者等は、ＡｔＢＧ１の生物学的役割を調べるためのまた他の方法として、「突然変異ａｔｂｇ１」の葉にある気孔の大きさ変化を測定した。
【００６５】
詳細には、２０℃、７０％の相対湿度で光１６時間、闇８時間の周期で培養した後、１２時と２４時に葉にある気孔の大きさを測定した（ｎ＝１５０）（図１３）。その結果、正常な植物では気孔が昼に開いて夜には閉まる一方、「突然変異ａｔｂｇ１」は夜にも昼のように気孔が閉まらなかった。
【００６６】
また、外部から注入されたＡＢＡが闇の中で気孔を閉めるのにどんな影響を与えるのか調べるために、２３時にＡＢＡ１０ｍＭと５０ｍＭをそれぞれ処理して、２４時に気孔の大きさを測定した（図１４）。対照区として、気孔が閉まる時にＮＯ合成酵素を抑制することが知られているＮＡＭＥ（Ｌ−ｎｉｔｒｏａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）１００ｕｌを４時から１０時間処理して、２４時に気孔の大きさを測定した。
【００６７】
その結果、野生型にＮＡＭＥを処理すると夜にも気孔が閉まらない一方、「突然変異ａｔｂｇ１」にＡＢＡを処理すると夜に気孔が閉まることが誘導された。これは、夜に気孔が閉まることがＡＢＡによって調節されるということを示す（ｎ＝２００、バー：標準誤差）。
【００６８】
前記のように「突然変異ａｔｂｇ１」に外部ＡＢＡを添加すると正常の表現型を回復するということは、ＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異によってＡｔＢＧ１遺伝子が発現されず、ＡＢＡが媒介した反応に欠陥が生じたということを示す。
【００６９】
＜３−３＞乾燥した環境で「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型観察
本発明者等は、ＡｔＢＧ１の生物学的役割を調べるための最後の方法として、乾燥した環境時での「突然変異ａｔｂｇ１」の水分損失程度と枯死程度を観察した。
【００７０】
詳細には、水分損失を比べるために、３時間２０℃、１０％の乾燥した相対湿度に置いておいた葉の重さを測定した（花芽が形成される前、短い茎に付いている葉であるロゼット葉２０枚を全て測定した）。その結果、「突然変異ａｔｂｇ１」は、野生型に比べて水分損失量が１．５倍程度多いことが分かった（図１５）。
【００７１】
また、野生型と「突然変異ａｔｂｇ１」を土に植え代えて１４日（１４ｄ）または２１日（２１ｄ）間、水を与えないまま温室で２０℃、７０％の相対湿度の条件で培養した。その結果、野生型は脱水によって葉が黒っぽく変わった一方、「突然変異ａｔｂｇ１」は野生型よりさらに脱水が進んで大部分の葉が枯死した（図１６）。
【００７２】
したがって、「突然変異ａｔｂｇ１」は、野生型に比べて環境ストレスに対する抵抗力が弱化されたことを確認した。
【００７３】
＜３−４＞遺伝子間相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を通じた検証実験
本発明者等は、前記の「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型が確実にＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異による結果なのか検証するために、「突然変異ａｔｂｇ１」にＡｔＢＧ１遺伝子を形質転換させてＡｔＢＧ１遺伝子を過発現させた後、＜実施例２＞と同一実験を実施した。
【００７４】
詳細には、ウイルスＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で標識された野生型ＡｔＢＧ１ｃＤＮＡ（ＡｔＢＧ１：ＨＡ）を植物に形質転換させて、ＡｔＢＧ１が発現されるようにすることで、ＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異による損失を相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）して、前記形質転換体を「遺伝子回復ａｔｂｇ１（ｒｅｓｃｕｅｄ ａｔｂｇ１）」とした。
【００７５】
「遺伝子回復ａｔｂｇ１」のタンパク質抽出物に対して、抗−ＨＡ抗体でウエスタンブロットを遂行した結果、図１１に示したようにＡｔＢＧ１タンパク質が発現されることを確認した。
【００７６】
前記「遺伝子回復ａｔｂｇ１」に＜実施例３＞と同じ実験を実施した結果、発芽後、１週（１ｗ）、２週（２ｗ）（図９）及び４週（図１０）後に野生型と類似に鮮かな緑色を示して背が高く、気孔開閉においても、野生型のように昼には気孔を開いて夜には気孔が閉まることを確認した（図１３）。脱水実験では、野生型より水分損失が少なかく（図１５）、乾燥した環境で２１日間培養した結果、脱水によって葉が黒っぽく変わらないで正常によく育った（図１６）。
【００７７】
したがって、「突然変異ａｔｂｇ１」の表現型は、ＡｔＢＧ１遺伝子の突然変異によるものであることが検証された。
【００７８】
＜実施例４＞ＡｔＢＧ１によるＡＢＡ−ＧＥの加水分解
＜４−１＞エライザ（ＥＬＩＳＡ）によるＨＰＬＣのＡＢＡ分画定量
本発明者等は、ＡｔＢＧ１タンパク質がＡＢＡグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって生成されるＡＢＡ−ＧＥを加水分解することができるのかどうか確認した（Ｘｕ Ｚ．Ｊ．等，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００２年，第１２９巻，１２８５頁）。
【００７９】
詳細には、ＡｔＢＧ１：ＨＡ、ＡｔＢＧ１［Ｅ２０７Ｑ］：ＨＡ、ＡｔＢＧ１［△Ｃ１０５］：ＨＡ及び対照区である空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）でシロイヌナズナを形質転換させた後、２４時間経過後タンパク質抽出物を修得した。前記で、ＡｔＢＧ１［Ｅ２０７Ｑ］：ＨＡは、ベータグルコシダーゼの活性化部位である２０７番目塩基に挿入突然変異（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有するもので（Ｇ． Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９５年，第３巻，８５３頁；Ｍａｒａｎａ Ｓ．Ｒ．等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００１年，第１５４５巻，４１頁）、ＡｔＢＧ１［△Ｃ１０５］は、Ｃ末端に１０５個のアミノ酸がない、欠失突然変異を有しているものである。
【００８０】
抗ＨＡ抗体を使用して、これら遺伝子から発現されたタンパク質を免疫分離（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後（図１７）、分離したタンパク質をＡＢＡ−ＧＥ（ＡＰＥＸ ＯＲＧＡＮＩＣＳ ＬＴＤ．）とともに１００ｍＭシトラート緩衝溶液（ｐＨ５．５）で、３７℃で一時間半反応させた。反応産物は、特定溶媒（４０％メタノール、０．１Ｍアセト酸、１０ｍｇ／ｌブチレートハイドロキシトルエン）であらかじめ満たされた（ｐａｃｋｉｎｇ）カラム（ＲＴ２５０−４ｃｏｌｕｍｎ、ＭＥＲＣＫ社）が具備されたＨＰＬＣで分離した。
【００８１】
その結果、ＡｔＢＧ１：ＨＡとＡｔＢＧ１［２０７］：ＨＡ全てＡＢＡ位置に新しいピークを作った（図１８）。このピークに該当する分画を抗−ＡＢＡ抗体（ＡＢＡ−ＧＥは認識することができない）を使用してエライザ（ＥＬＩＳＡ）で定量した。
【００８２】
その結果、ＡｔＢＧ１［Ｅ２０７Ｑ］：ＨＡと反応させて排出されたＡＢＡの量は、野生型と反応させて排出されたＡＢＡの量に比べて８０パーセント減少したが（図１９）、これは、２０７番目塩基配列であるグルタミン酸が他のベータグルコシダーゼと同じく、この酵素の加水分解活性に重要であるということを示す（Ｄａｖｉｅｓ Ｇ．ａｎｄ Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９５年，第３巻，８５３頁；Ｍａｒａｎａ Ｓ．Ｒ．等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００１年，第１５４５巻，４１頁）。一方、ＡｔＢＧ１［△Ｃ１０５］：ＨＡやベクター対照区のタンパク質抽出物は、ＡＢＡ−ＧＥと反応させた時、ＡＢＡを生産しなかったが、これは、前記実験結果で「突然変異ａｔｂｇ１」のＡＢＡ生産が減ったり初めから生成されない結果と一致する。したがって、ＡｔＢＧ１：ＨＡがＡＢＡ−ＧＥを加水分解してＡＢＡを生成させるということが確認された。
【００８３】
＜４−２＞種子内のＡＢＡのレベル確認
ＡＢＡは、他のどの部位よりも種子に多量含有されているので、前記実験結果をより確実なものにするために、本発明者等は、野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」、「遺伝子回復したａｔｂｇ１（ｒｅｓｃｕｅｄ ａｔｂｇ１）」の種子にあるＡＢＡのレベルを測定した。
【００８４】
詳細には、液体窒素を加えてつぶした種子から８０％エチルアルコールに溶解される成分を抽出して、Ｃ１８カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社）が装着されたＨＰＬＣで、ＡＢＡピークに該当する分画を得た。これを抗−ＡＢＡ抗体（Ａｇｄｉａ社）を使用して、エライザ（ＥＬＩＳＡ）でＡＢＡを定量した。
【００８５】
その結果、「突然変異ａｔｂｇ１」種子のＡＢＡ含量は、野生型の約４０パーセントである一方（図２０）、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」種子のＡＢＡ含量は、野生型含量の８６パーセントから２５０パーセント範囲にかけて分布した。すなわち、「突然変異ＡｔＢＧ１種子」は、野生型に比べてＡＢＡ含量が非常に低い一方、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」種子は、野生型と類似かまたは野生型より二倍以上多かった。また、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」種子のＡｔＢＧ１：ＨＡ量を抗−ＨＡ抗体で確認した結果（図２１）、ＨＰＬＣ結果定量されたＡＢＡ量（図２０）と分布が類似していた。すなわち、ＡＢＡの量とＡｔＢＧ１タンパク質の量との間に密接な関連があることが明らかにされた。
【００８６】
＜４−３＞発芽分析
本発明者等は、前記種子内のＡＢＡのレベルが発芽と関連があるのかどうか確認してみた。詳細には、野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」及び「遺伝子回復したａｔｂｇ１（ｒｅｓｃｕｅｄ ａｔｂｇ１）」に対して発芽分析（ａｓｓａｙ）を実施した結果、「突然変異ａｔｂｇ１」の種子は、野生型より早く発芽した一方、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」の種子は、野生型より遅く発芽した（図２２）。よって、「突然変異ａｔｂｇ１」が野生型よりさらに低いレベルのＡＢＡを含むということを確認した。これは、突然変異ａｔｂｇ１が損失したＡｔＢＧ１タンパク質によって、ＡＢＡ−ＧＥがＡＢＡで加水分解されないが、自体的に活性化状態であるＡＢＡ形態を少量含んでいることを示す。
【００８７】
＜実施例５＞蛍光顕微鏡を使用した細胞内ＡｔＢＧ１の位置確認
＜５−１＞ＧＦＰ標識されたＡｔＢＧ１の蛍光顕微鏡象観察
アブシジン酸の不活性化された形態であるアブシジン酸グルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）は、ＥＲに存在する。ＡＢＡ−ＧＥを活性化形態であるＡＢＡで加水分解させるＡｔＢＧ１は、Ｃ末端にＲＥＥＬという配列モチーフを有している。これは、ＥＲ位置（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）配列であるＫＤＥＬと非常に類似している（Ｄａｖｉｅｓ Ｇ．ａｎｄ Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９５年，第３巻，８５３頁）。本発明者等は、これを根拠にＡｔＢＧ１がＡＢＡ−ＧＥが存在するＥＲに位置するのかどうか確認するために、ＡｔＢＧ１の蛍光顕微鏡象を観察した。
【００８８】
詳細には、ＡｔＢＧ１の先行配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）下側（ｄｏｗｎ ｓｔｒｅａｍ）に緑蛍光タンパク質ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を標識した組換え遺伝子であるＧＦＰ：ＡｔＢＧ１及びＥＲシャペロン結合タンパク質であるＢｉＰ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に、赤色蛍光タンパク質であるＲＥＰ（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を標識した組換え遺伝子であるＢｉＰ：ＲＦＰを、シロイヌナズナに形質転換させて蛍光顕微鏡で観察した（図２４）。
【００８９】
ＧＦＰ：ＡｔＢＧ１は、ＧＦＰ単独である時の拡散したパターン（図２３のパネルａ）とは異なり、ＥＲ構造を示すマルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ネットワークパターンを作り（パネルｃ）、前記ＧＦＰ：ＡｔＢＧ１のパターンは、ＥＲシャペロン結合タンパク質であるＢｉＰ：ＲＦＰのパターン（パネルｄ）と重なった（パネルｅ）（Ｊｉｎ Ｊ．Ｂ．等，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００１年，第１３巻，１５１１頁）。すなわち、ＡｔＢＧ１がＥＲに存在するタンパク質であるＢｉＰとともに存在して、これは、ＡｔＢＧ１がＢｉＰと同じくＥＲに位置するということを示す。
【００９０】
ＡｔＢＧ１がＥＲに位置するという、より直接的な証拠を捜すために、形質転換された植物で発現されるＡｔＢＧ１：ＨＡを抗−ＨＡ抗体を使用して免疫化学療法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ）で検査した結果、同様に、ＡｔＢＧ１：ＨＡがＢｉＰ：ＲＦＰ蛍光象と重なるＥＲ特異的なネットワークパターンを示した（図２４）。
【００９１】
＜５−２＞ＡｔＢＧ１の糖質化有無確認
本発明者等は、ＡｔＢＧ１がＥＲに位置するということを、さらに確実にさせるために、ＡｔＢＧ１の糖質化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を検査した。タンパク質は、糖質化によってグリカン（ｇｌｙｃａｎ）が形成されて、ＥＲに位置するタンパク質等は、このグリカンが、エンドＨとＰＮＧａｓｅ Ｆの酵素作用によって切断される特性を有している（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ Ｇ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年，第２６８巻，２００１頁）。チュニカマイシンは、前記糖質化を抑制する物質である。
【００９２】
ＡｔＢＧ１：ＨＡで形質転換された原形質体から得られたタンパク質抽出物を、エンドＨとＰＮＧ酵素（ＰＮＧａｓｅ）Ｆで処理したもの（チュニカマイシン非処理）、ＡｔＢＧ１に形質転換されたシロイヌナズナにチュニカマイシンを処理した原形質体から得られたタンパク質抽出物、ＡｔＢＧ１で形質転換されたシロイヌナズナにチュニカマイシンを処理しない原形質体から得られたタンパク質抽出物を、抗−ＨＡ抗体でブロッティングした。
【００９３】
チュニカマイシン処理した原形質体から得られたＡｔＢＧ１：ＨＡは、チュニカマイシン処理しない原形質体から得られたものよりタンパク質の大きさが小さかったが、これは、チュニカマイシンによって糖質化が起きなくてグリカンが生成されなかったために現れた結果であると考えられる。また、エンドＤとＰＮＧａｓｅ Ｆ処理してグリカンが切断されたＡｔＢＧ１：ＨＡが、チュニカマイシン処理したＡｔＢＧ１：ＨＡと大きさが同じなので、前記結果をさらに確実に知ることができる。すなわち、ＡｔＢＧ１：ＨＡのグリカン部位は、エンドとＰＮＧａｓｅ全てにセンシティブしてグリカンが切断されることで、チュニカマイシン処理したＡｔＢＧ１と大きさが同じになったことが分かる（図２５）。この結果は、ＡｔＢＧ１がＥＲに存在するということを明確に示す。
【００９４】
＜実施例６＞脱水ストレス誘導重合によるＡｔＢＧ１のＡＢＡ−ＧＥ加水分解活性確認
前記実施例中、脱水させた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」植物でＡＢＡ含量が相当量増加した原因を明らかにするため、本発明者等は、３０％相対湿度条件下に１０時間放置して脱水ストレスを加えた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」とＡＢＡ−ＧＥでＡＢＡを生産するように正常条件で育てた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」のマイクロゾームを比べた。植物のマイクロゾームは、ホモゲナイザー緩衝溶液（２５０ｍＭスクロース ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１０ｍＭ Ｍｇｃｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）に植物を粉砕して３，０００ｒｐｍで５分、１４，０００ｒｐｍで５分間それぞれ遠心分離後、上澄み液のみを得て、１００，０００ｇで超高速遠心分離機で分離して修得した。マイクロゾーム内のＡＢＡ量は、前記で修得したマイクロゾームに１００ｍＭシトラート緩衝液 ｐＨ５．５溶液を添加して反応させた後、ＡＢＡ抗体が入っているエライザ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ａｇｄｉａ社）を使用してＡＢＡを定量した。その結果、脱水ストレスを加えた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」のＡＢＡ生産量が、正常条件で育てた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」のＡＢＡ生産量より増加したことを確認した（図２７）。
【００９５】
前記とともに、本発明者等は、ストレスがＡｔＢＧ１を活性化させる機序が何なのかを調べたが、以前の研究でベータグルコシダーゼの重合形態がモノマーやダイマーよりさらに高い酵素活性を示すという研究結果があったので（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ、１９９８年）、本発明者等は、脱水ストレスがＡｔＢＧ１を活性化させる機序も、やはりＡｔＢＧ１重合によるものであるのか実験してみた。そのために、まず、二つ異なって標識されたＡｔＢＧ１のＡｔＢＧ１：ＨＡとＡｔＢＧ１：Ｔ７を植物に共形質導入して修得した原形質体から前記実施例と同じ方法で、タンパク質抽出物を修得して抗−Ｔ７抗体で共免疫沈降を実施して、抗−ＨＡ抗体でウエスタンブロットを実施してＡｔＢＧ１分子がお互いに結合するのかどうか調べた。その結果、Ｔ７抗体で免疫沈降させた沈降物でＨＡ標識されたＡｔＢＧ１が存在するということが確認された（図３５）。さらに、浸透圧ストレスを誘導する化合物質であるＰＥＧ８０００を原形質体に最終１０％ＰＥＧ８０００になるように１２時間処理した時、沈降物内のＨＡ標識されたＡｔＢＧ１の量が約３倍増加した（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒｙ ｓｏｆｔｗａｒｅで測定、図３５）。ゆえに、本発明者等は、ＡｔＢＧ１が浸透圧ストレス下で促進されるホモメリックな（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）相互作用をすると結論付けた。
【００９６】
このような可能性をより確実にするために、脱水ストレスを加えたり加えていない「遺伝子回復したａｔｂｇ１」の葉を、粉砕緩衝溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮａＮ３、０．１％トリトンＸ−１００）で粉砕した後、１４，０００ｇで５分間遠心分離して上澄み液、すなわちタンパク質抽出物を修得した。これをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００ハイレゾルーション（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にローディングした後、タンパク質を溶離緩衝溶液（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮａＮ３）を３．０ｍｌ分画体積当り０．５ｍｌ／分速度で流してやって所望するタンパク質分画を修得した。これを抗−ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットで分析した。
【００９７】
その結果、対照群植物である脱水ストレスを加えていない「遺伝子回復したａｔｂｇ１」で ＡｔＢＧ１：ＨＡは、主にモノマーで存在し、若干の高分子形態も存在した（図３０）。反対に脱水ストレスを加えた「遺伝子回復したａｔｂｇ１」のＡｔＢＧ１：ＨＡは、高分子量の形態で存在し、ダイマーやモノマーでは存在しなかった（図２８）。脱水ストレス処理植物でＡｔＢＧ１の主なピークは、６００ｋＤａ以上で現れるが、これはＡｔＢＧ１１０−ｍｅｒに該当するもので、このような結果は、脱水ストレスがＡｔＢＧ１の重合を誘導することを明確に示すものである。
【００９８】
それとともに、本発明者等は、高分子及び低分子量形態のＡｔＢＧ１の酵素活性を比べるため、前記実施例と同様にカラムを使用したゲルろ過方法で修得した高分子量分画と低分子量分画を抗−ＨＡ抗体で免疫沈降を実施した後、ＡＢＡ量をエライザ（ＥＬＩＳＡ）で分析した結果、高分子量形態はＡＢＡの量、すなわちＡｔＢＧ１活性が約４倍増加したが（図２９）、これは、脱水ストレスを加えた植物のマイクロゾームで、ＡＢＡ−ＧＥ加水分解活性増加によりＡＢＡ量が増加したという結果と一致する（図２７）。
【００９９】
次に、ＡｔＢＧ１が脱水ストレス下で高分子量形態で組み合わされる速度を測定したが、そのために「遺伝子回復したａｔｂｇ１」に脱水ストレスを加えた後、３０分、１時間、３時間、時間別にタンパク質抽出物を修得して、ゲルろ過クロマトグラフィーで分画して抗−ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットで確認した。
【０１００】
その結果、高分子量形態のＡｔＢＧ１は、脱水３０分後に現れて時間経過にしたがって漸次に量が増加して（図３０及び図３１）、脱水ストレス１０時間後に、８０％以上の高分子量ＡｔＢＧ１が観察された（図３０及び図３１）。ゆえに、ＡｔＢＧ１の高分子量形態への組み合わせは、脱水ストレスを加えるやいなや速く集中的に進行されたことを確認した。
【０１０１】
＜実施例７＞ＡｔＢＧ１の高分子量形態への重合パターン確認
植物の水分状態は、一日中で正常成長条件下で持続的に変化する。蒸発速度は、日が一番明るい日中に一番高いが、これは周期的に水分含量を低めたり一時的な水分欠乏を惹起する。したがって、本発明者等は、葉でＡＢＡレベルが日周期性を経験すると仮定した。特にさらに高い細胞内ＡＢＡレベルが、太陽光が一番明るい日中に観察され、低いＡＢＡレベルは夜に観察された。
【０１０２】
前記理論を確認するために本発明者等は、正常成長条件下で６時間ごとに野生型及び 「遺伝子回復したａｔｂｇ１」植物の葉の上端部を切って８０％メタノールを入れてすり鉢で粉砕後、４℃で３時間抽出後上澄液を回収してＣ−１８カラム（ＢＭＳ）通過させて凍結乾燥後、ＴＢＳバッファー（Ａｇｄｉａ社）に溶かしてエライザ（ＥＬＩＳＡ）でＡＢＡレベルを測定した。その結果、葉のＡＢＡレベルは、午前８時〜午後２時の間で一番低く、一番高い濃度で日周期性を示した（図３２）。野生型植物は、類似のＡＢＡパターンを示したが全体的に若干低い水準だった。
【０１０３】
ＡＢＡのこのような日周期性増加の原因を調べるために、本発明者等は、ＡｔＢＧ１転写体のみならず野生型植物で一日中多様な時間のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ＡＢＡ生合成に重要なＡｔＡＢＡ１、ＡｔＡＢＡ２及びＡｔＮＣＥＤ３転写体のレベルを測定した（図３６）。詳細には、１０ｍｇ全体ＲＮＡ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及び１０ｎｇの各々のプライマーを使用してすべて反応体積１００ｍｌ（ＲＴ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ５ｍｌ）で、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で３０秒で遺伝子レベルによって総１５〜３５周期を実施した。遺伝子特異的なプライマーは、各々、配列番号１１及び１２（ＡｔＢＧ１）、配列番号１３及び１４（ＡＢＡ１）、配列番号１５及び１６（ＡＢＡ２）、配列番号１７及び１８（ＮＣＥＤ３）、配列番号１９及び２０（陽性対照群ＣＣＡ１）、配列番号２１及び２２（陽性対照群ＴＯＣ１）、配列番号２３及び２４（陰性対照群アクチン）を使用した。
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＴ結果、成長条件下でＡｔＢＧ１とＡｔＡＢＡ２ ｍＲＮＡレベルは、一日中一定に維持されたが（図３６ないし図３８）、これは植物が成長条件下では、脱水ストレスを経験しなかったことを示し、一日中ＡＢＡ含量が増加することは、ＡｔＢＧ１発現増加によるものではないことを示す。一方、ＡｔＡＢＡ１転写体のレベルは、午後２時に約１．７倍増加する変化があり（図３６及び図３７）、ＡｔＮＣＥＤ３ ｍＲＮＡ発現は、午後８時に１．８倍増加し、午前２時まで増加した状態で残っていたが、午前８時には基本レベルに戻った。前記結果は、ＡｔＡＢＡ１とＡｔＮＣＥＤ３ ｍＲＮＡレベル全てがＡＢＡのように日周期性を有するということを意味するが、このようなｍＲＮＡレベルの変化パターンは、ＡＢＡレベルの変化パターンとは一致しないで、なおかつｍＲＮＡの変化程度は２倍よりさらに低かった。
【０１０５】
前記のように、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成関連遺伝子の発現パターンが、ＡＢＡの発現パターンと違うということは、ＡＢＡのデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成が日中にＡＢＡレベルが増加することにほとんど関与しないことを示す。
【０１０６】
前記実験で、ＣＣＡ１及びＴＯＣ１転写体濃度は、生体リズムに対して陽性対照群に使用し（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｔｏｂｉｎ，１９９８年；Ｓｔｒａｙｅｒ等，２０００年）（図３６及び図３８）。アクチンは、生体リズムに対して陰性対照群に使用した。
【０１０７】
次に、本発明者等は、ＡＢＡレベルの日周期性がＡｔＢＧ１の重合を通じた活性化によるものであるのかを実験した。
【０１０８】
詳細には、正常条件で育った「遺伝子回復したａｔｂｇ１」から時間別に修得した全体タンパク質抽出物を、ゲルろ過カラムを使用して分画して抗−ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットで分析した。その結果、高分子量形態のＡｔＢＧ１が日周期性を示したが（図３３及び図３４）、午後２時にレベルが最高であり、早く減少して午前８時に一番低かった。午後２時に全体ＡｔＢＧ１の半分が高分子量形態で存在し、一方午前８時には１０％未満の高分子量形態のＡｔＢＧ１が観察された。高分子量形態のＡｔＢＧ１の濃度は、昼の間葉組職でＡＢＡの増加と相当な関連性があった。これは、ＡｔＢＧ１の重合を通じた活性化が日周期性の間、ＡＢＡ含量の増加をもたらすということを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
前記で詳しくみたように、本発明のＡｔＢＧ１遺伝子が導入された形質転換植物は、植物内で発現されたＡｔＢＧ１タンパク質がアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）を活性化させて低温、塩害、脱水のような多様な環境ストレスに抵抗性を有するので、農産物の生産性増大に大きく寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＡｔＢＧ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １）のアミノ酸配列を他のベータグルコシダーゼ同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）と整列して比べた結果を示した図である。
【図２−６】環境ストレスが、ＡｔＢＧ１の発現を誘導し、ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換された植物は、ＮａＣｌストレス抵抗性が増加するということを示した図である。
【図２】一週間の間「野生型」シロイヌナズナに多様な化学的処理（低温、脱水、高濃度のＮａＣｌ処理）をした後、全体ＲＮＡを抽出して、ＡｔＢＧ１、ＡｔＧｌｕｃ（ＡＦ０８２１５７）及びＡｔｐｓｒ３．１（Ｕ７２１５３）のｃＤＮＡをプローブ（ｐｒｏｂｅ）にして、ノーザンブロットを実施した結果を示したゲル電気泳動写真である。
【図３】ＡｔＢＧ１遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナの全体ＲＮＡを抽出してノーザンブロットを実施した結果を示したゲル電気泳動写真である。
【図４】ＡｔＢＧ１や空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｐＢΙ１２１）で形質転換させたシロイヌナズナを１０日間、土で培養した後、４日間ＮａＣｌ処理した結果を示した写真である。
【図５】ＭＳプレートで４日間培養した植物を、高濃度のＮａＣｌを含んだプレートに移して根成長を測定したグラフ（ｎ＝５０）である。
【図６】組職特異的なＡｔＢＧ１の発現を示し、ＡｔＢＧ１プロモーターの調節下にＧＵＳを含む形質転換植物を培養した後、１週間（１Ｗ）、２週間（２Ｗ）及び３週間（３Ｗ）後にＸ−Ｇｌｕｃで染色した結果を示した写真である。
【図７】（Ａ）は、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたＡｔＢＧ１突然変異遺伝子の概路図である。（Ｂ）は、Ｔ−ＤＮＡがＡｔＢＧ１遺伝子に挿入された突然変異シロイヌナズナ（以下「突然変異ａｔｂｇ１」と略称する）のＡｔＢＧ１遺伝子を分離して、ＡｔＢＧ１遺伝子特異的なプライマーでＰＣＲを実施することにより、ＡｔＢＧ１にＴ−ＤＮＡが挿入される突然変異が起きたかどうかを検証したゲル電気泳動写真である。
【図８−１６】「突然変異ａｔｂｇ１」と「突然変異ａｔｂｇ１」にＡｔＢＧ１：ＨＡ遺伝子を形質転換させることにより遺伝子損失が回復したａｔｂｇ１（ｒｅｓｃｕｅｄ ａｔｂｇ１、以下「遺伝子回復したａｔｂｇ１」と略称する）の表現型を示したものである。
【図８】「突然変異ａｔｂｇ１」にＡｔＢＧ１遺伝子特異的なプライマーを使用して ＲＴ−ＰＣＲを実施することで、ＡｔＢＧ１転写体がないことを確認したゲル電気泳動写真である。
【図９−１０】野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」を発芽後、１週（１ｗ）または２週（２ｗ）及び４週後に撮影した写真である。
【図１１】「遺伝子回復したａｔｂｇ１」に、抗−ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ社）を使用してウエスタンブロットを実施することで、ＡｔＢＧ１：ＨＡが発現されることを確認した写真である。
【図１２】「突然変異ａｔｂｇ１」にＡＢＡを注入することで野生型の表現型が再び現れることを示した写真である。
【図１３】光１６時間、闇８時間の周期で培養したシロイヌナズナの葉で昼と夜に気孔の大きさを測定し、その結果を示したグラフ（ｎ＝１５０、バー（ｂａｒ）＝標準誤差）である。
【図１４】「突然変異ａｔｂｇ１」にＡＢＡを注入したり、気孔が閉まる時にＮＯ合成酵素を抑制すると知られたＮＡＭＥを処理した後、植物の葉で昼と夜に気孔の大きさを測定して、その結果を示したグラフ（ｎ＝２００、バー＝標準誤差）である。
【図１５】水分損失を比べるために、表示された時間、１０％の乾燥した相対湿度で ２０℃に置いておいた葉の重さを測定して、その結果を示したグラフである。
【図１６】野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」、「遺伝子回復したａｔｂｇ１」を１４日（１４ｄ）または２１日（２１ｄ）間、水を与えないまま培養した結果を示した写真である。
【図１７−２２】ＡｔＢＧ１によるＡＢＡ−ＧＥの加水分解と、それによる植物内ＡＢＡレベルの変化を示した図である。
【図１７】ＡｔＢＧ１：ＨＡ、ＡｔＢＧ１［Ｅ２０７Ｑ］、ＡｔＢＧ１［△Ｃ１０５］、空のベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）で形質転換させた植物の原形質体を抗−ＨＡ抗体を使用し、免疫分離（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した結果を示した写真である。
【図１８】免疫分離されたＡｔＢＧ１：ＨＡタンパク質をＡＢＡ−ＧＥと適切な緩衝溶液で培養して、反応産物をＨＰＬＣで分離した結果を示したグラフである。
【図１９】ＨＰＬＣを実施して分離したＡＢＡ分画を、抗−ＡＢＡ抗体を使用してエライザ（ＥＬＩＳＡ）で測定した結果を示したグラフである。
【図２０】野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」、「遺伝子回復した（ｒｅｓｃｕｅｄ）ａｔｂｇ１」の種子にあるＡＢＡのレベルを、抗−ＡＢＡ抗体（Ａｇｄｉａ社）を使用してエライザ（ＥＬＩＳＡ）で測定した結果を示したグラフである。
【図２１】「遺伝子回復した（ｒｅｓｃｕｅｄ）ａｔｂｇ１」にあるＡｔＢＧ１：ＨＡのレベルを、抗−ＨＡ抗体で確認した結果を示したグラフである。
【図２２】野生型、「突然変異ａｔｂｇ１」及び「遺伝子回復した（ｒｅｓｃｕｅｄ）ａｔｂｇ１」に対して発芽分析（ａｓｓａｙ）を実施したグラフである。
【図２３−２６】ＡｔＢＧ１の細胞内位置を示した図である。
【図２３】ＡｔＢＧ１遺伝子をＧＦＰ遺伝子で標識した組換え遺伝子の概路図である。
【図２４】ＥＲ標識子であるＢｉｐ：ＲＦＰが発現されて細胞内ＥＲの位置を示し、ＧＦＰは細胞質溶解タンパク質で細胞質を示した蛍光顕微鏡写真である。
【図２５】ＡｔＢＧ１：ＨＡとＢｉＰ：ＲＦＰの細胞内位置を示した蛍光顕微鏡写真である。
【図２６】ＡｔＢＧ１：ＨＡで形質転換されてチュニカマイシン処理しない原形質体から得られたタンパク質抽出物を、エンドＨとＰＮＧ酵素（ＰＮＧａｓｅ）Ｆで処理したサンプルと、ＡｔＢＧ１：ＨＡで形質転換されてチュニカマイシン処理した原形質体から得られたタンパク質抽出物を、抗−ＨＡ抗体でブロッティングした写真である。
【図２７−３１】脱水によってマイクロゾームでＡｔＢＧ１が早く重合されて ＡＢＡ−ＧＥの加水分解を促進することを示した図である。
【図２７】脱水または脱水処理されない「遺伝子回復したａｔｂｇ１」から修得されたマイクロゾーム分画のＡＢＡ−ＧＥ加水分解活性を測定した結果を示した図である。
【図２８】脱水ストレスによってＡｔＢＧ１が重合されることを示した図である。
【図２９】高分子量ＡｔＧＢ１のＡＢＡ−ＧＥ加水分解活性を示した図である。
【図３０−３１】高分子量ＡｔＧＢ１の形成を測定した結果を示した図である。
【図３２−３４】ＡＢＡレベルに比例して日周期性で高分子量ＡｔＢＧ１が重合されることを示した図である。
【図３２】「遺伝子回復したａｔｂｇ１」でＡＢＡレベルの日周期性変化を示した図である。
【図３３】一日中「遺伝子回復したａｔｂｇ１」で修得したタンパク質抽出物中、ＡｔＢＧ１を分析した結果を示した図である。
【図３４】高分子量ＡｔＢＧ１を測定した結果を示した図である。
【図３５】ＰＥＧ８０００で浸透圧ストレスを加えた形質転換された原形質体から修得されたタンパク質抽出物を、抗−Ｔ７抗体で免疫沈降した結果を示した図である。
【図３６−３８】デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ＡＢＡ生合成経路に関連した遺伝子の発現分析に対する図である。
【図３６】ＡｔＢＧ１及びデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）生合成関連遺伝子プライマーを使用して半−定量的なＲＴ−ＰＣＲを実施した結果を示した図である。
【図３７−３８】時間帯別に発現レベルを測定した結果を示した図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１と２は、部分ｃＤＮＡライブラリーからシロイヌナズナ遺伝子であるＡｔＢＧ１を分離するために使用したプライマー配列である。
【０１１２】
配列番号３は、ＡｔＢＧ１遺伝子の配列である。
【０１１３】
配列番号４と５は、全体ｃＤＮＡライブラリーから使用されたＧｌｕｃ（ＡＦ０８２１５７）とｐｓｒ３．１（Ｕ７２１５３）遺伝子を修得するために使用したプライマー配列である。
【０１１４】
配列番号６、７及び８は、ＡｔＢＧ１遺伝子でＴ−ＤＮＡが挿入されたかどうかを確認するために使用したプライマー配列である。
【０１１５】
配列番号９と１０は、ＡｔＢＧ１上流１．７ｋｂ部位を修得するために使用したプライマー配列である。
【０１１６】
配列番号１１と１２は、ＡｔＢＧ１特異的なプライマー配列である。
【０１１７】
配列番号１３と１４は、ＡＢＡ１特異的なプライマー配列である。
【０１１８】
配列番号１５と１６は、ＡＢＡ２特異的なプライマー配列である。
【０１１９】
配列番号１７と１８は、ＮＣＥＤ３特異的なプライマー配列である。
【０１２０】
配列番号１９と２０は、陽性対照群ＣＣＡ１特異的なプライマー配列である。
【０１２１】
配列番号２１と２２は、陽性対照群ＴＯＣ１特異的なプライマー配列である。
【０１２２】
配列番号２３と２４は、陰性対照群アクチン特異的なプライマー配列である。
【０１２３】
配列番号２５と２６も、ＡｔＢＧ１特異的なプライマー配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）１（ＡｔＢＧ１）または、その変異体をコードする遺伝子を含む植物の環境ストレス抵抗性増進用組成物。
【請求項２】
前記遺伝子が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の植物の環境ストレス抵抗性増進用組成物。
【請求項３】
前記環境ストレスが、高温、塩害、乾燥、公害、病源菌、傷、低温、過多な光条件、オゾン、除草剤、過多なＵＶ露出及び浸透圧衝撃（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アブシジン酸グルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）を加水分解してアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させることで、植物にストレス抵抗性を付与することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記遺伝子が、ベクターに導入されたことを特徴とする、請求項１に記載の植物の環境ストレス抵抗性増進用組成物。
【請求項６】
前記ベクターが、ｐＢＩＧ：ＡｔＢＧ１：ＨＡ（寄託番号ＫＣＴＣ１０７２９ＢＰ）であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターで形質転換された植物細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の植物細胞を含む形質転換植物。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換植物の子孫またはクローン。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換植物の種子、実、穂、塊茎、塊根、樹木、カルスまたは原形質体。
【請求項１１】
Ｉ）請求項１に記載の遺伝子、また該遺伝子を有するベクターを植物細胞に導入する工程；及び
II）前記植物細胞を組織培養して再分化させる工程を含む、環境ストレスに対する抵抗性を有する植物を生産する方法。
【請求項１２】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １（ＡｔＢＧ１）遺伝子の発現を増加させて植物にストレス抵抗性を付与する方法。
【請求項１３】
アブシジン酸グルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）を加水分解してアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させることによって植物ストレス抵抗性を付与することを特徴とする、請求項１２に記載の植物にストレス抵抗性を付与する方法。
【請求項１４】
アブシジン酸グルコースエステル加水分解が、ＡｔＢＧ１重合によって促進されることを特徴とする、請求項１３に記載の植物にストレス抵抗性を付与する方法。
【請求項１】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）１（ＡｔＢＧ１）または、その変異体をコードする遺伝子を含む植物の環境ストレス抵抗性増進用組成物。
【請求項２】
前記遺伝子が、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の植物の環境ストレス抵抗性増進用組成物。
【請求項３】
前記環境ストレスが、高温、塩害、乾燥、公害、病源菌、傷、低温、過多な光条件、オゾン、除草剤、過多なＵＶ露出及び浸透圧衝撃（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アブシジン酸グルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）を加水分解してアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させることで、植物にストレス抵抗性を付与することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記遺伝子が、ベクターに導入されたことを特徴とする、請求項１に記載の植物の環境ストレス抵抗性増進用組成物。
【請求項６】
前記ベクターが、ｐＢＩＧ：ＡｔＢＧ１：ＨＡ（寄託番号ＫＣＴＣ１０７２９ＢＰ）であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターで形質転換された植物細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の植物細胞を含む形質転換植物。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換植物の子孫またはクローン。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換植物の種子、実、穂、塊茎、塊根、樹木、カルスまたは原形質体。
【請求項１１】
Ｉ）請求項１に記載の遺伝子、また該遺伝子を有するベクターを植物細胞に導入する工程；及び
II）前記植物細胞を組織培養して再分化させる工程を含む、環境ストレスに対する抵抗性を有する植物を生産する方法。
【請求項１２】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ １（ＡｔＢＧ１）遺伝子の発現を増加させて植物にストレス抵抗性を付与する方法。
【請求項１３】
アブシジン酸グルコースエステル（ＡＢＡ−ＧＥ）を加水分解してアブシジン酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、ＡＢＡ）の濃度を増加させることによって植物ストレス抵抗性を付与することを特徴とする、請求項１２に記載の植物にストレス抵抗性を付与する方法。
【請求項１４】
アブシジン酸グルコースエステル加水分解が、ＡｔＢＧ１重合によって促進されることを特徴とする、請求項１３に記載の植物にストレス抵抗性を付与する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【公表番号】特表２００８−５２５０１５（Ｐ２００８−５２５０１５Ａ）
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８０９０（Ｐ２００７−５４８０９０）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６８４４２
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５００３４５４７８）ポステック・ファウンデーション (25)
【出願人】（５０７２０９３５５）エフエヌピー カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６８４４２
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５００３４５４７８）ポステック・ファウンデーション (25)
【出願人】（５０７２０９３５５）エフエヌピー カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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