多色ルシフェラーゼの抽出方法
【課題】本発明は、ルシフェリン−ルシフェラーゼの発光反応を用いた、サンプル中のルシフェラーゼを検出するための安定した抽出方法に関する。さらに詳しくは、複数の発光スペクトル特性を有する甲虫由来のルシフェラーゼをノニデット（登録商標）Ｐ４０またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ならびに、グリセロールを含む抽出試薬を用いて同時抽出する方法ならびにそのための試薬に関する。
【解決手段】イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼ酵素を抽出する工程であって、（ａ）ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびに、グリセロールを混合する工程、（ｂ）該混合液を細胞に接触させてルシフェラーゼ酵素を抽出する工程、からなる方法。
【解決手段】イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼ酵素を抽出する工程であって、（ａ）ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびに、グリセロールを混合する工程、（ｂ）該混合液を細胞に接触させてルシフェラーゼ酵素を抽出する工程、からなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェリン−ルシフェラーゼの発光反応を用いた、サンプル中のルシフェラーゼを検出するための安定した抽出方法に関する。さらに詳しくは、複数の発光スペクトル特性を有する甲虫由来のルシフェラーゼをノニデット（登録商標）Ｐ４０またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルならびにグリセロールを含む抽出試薬を用いて同時抽出する方法ならびにそのための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
レポーター遺伝子を用いた遺伝子発現制御解析は、レポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列）を含むプラスミドを細胞に導入して、ある条件下において発現されるレポーター酵素の活性を指標に遺伝子発現制御を評価する手法である。これまで多くのレポーター酵素がこの評価に用いられてきたが、ホタルルシフェラーゼの発光を利用したシステムは感度が高く、活性測定が簡便なことから、現在広く用いられている。
【０００３】
しかしながら、レポーター活性をサンプル間で評価する際には、トランスフェクション効率、細胞数、生育状態、細胞死等、遺伝子発現制御とは関係しない、レポーター酵素の絶対量の変化をもたらす要因が存在する。このため、被験配列に連結されたレポーター遺伝子とあわせて、一定発現（コントロール）プロモーターに連結された基質特異性、あるいは反応性の異なるレポーター分子を内部標準として加え、サンプル間で標準化処理を行う必要がある。このように２つ以上の遺伝子発現を同時に測定するために、これまで種々の遺伝子、特にホタルルシフェラーゼと異なった基質特異性を示すウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）がクローニングされ用いられてきた。しかし、この方法では発光の機構が異なるため、複数の反応及び測定を行わなければならず煩雑であった。
【０００４】
一方、ホタルルシフェラーゼ遺伝子から発光色の異なる変異体を見つける研究（非特許文献１）や、発光色の異なる４種類のヒカリコメツキムシ由来ルシフェラーゼの単離（非特許文献２）、２色の鉄道虫由来のルシフェラーゼの研究（非特許文献３）、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼの変異体の研究（非特許文献４）などが進められてきた。これらのルシフェラーゼは同じ基質で異なった発光色を示すことで注目された。特に、ホタルルシフェラーゼ変異体はｐＨにより発光スペクトルが変動してしまうことから、多色測定においてはコメツキムシ、鉄道虫、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼなどのようにｐＨに対して発光スペクトルが変動しないルシフェラーゼが好ましく、３色の発光ルシフェラーゼを用いたアッセイシステムが実用化されている（近江谷ら、マルチ遺伝子転写活性測定システム、特許文献１）。しかし、これらのルシフェラーゼの安定性が異なるため、特に複数のルシフェラーゼを同時に検出しようとする際、いずれのルシフェラーゼも細胞から安定して効率よく抽出し、発光反応を行える検出試薬の開発が望まれていた。
【非特許文献１】Ｃｏｎｔａｇ Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｒｅｄ Ｓｈｉｆｔｅｄ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ６，４９５，３５５ （２００２）
【非特許文献２】Ｗｏｏｄ Ｋ．Ｖ．， Ｌａｍ Ｙ．Ａ．， Ｓｅｌｉｇｅｒ Ｈ．Ｈ．， ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ Ｗ．Ｄ． １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４， ７００−７０２：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｃｏｄｉｎｇ Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅｓ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ Ｃａｎ Ｅｌｉｃｉｔ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃｏｌｏｒｓ
【非特許文献３】Ｖｉｖｉａｎｉ Ｖ．Ｒ．， Ｂｅｃｈａｒａ Ｅ．Ｊ．Ｈ．， Ｏｈｍｉｙａ Ｙ． １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３８， ８２７１−８２７９
【非特許文献４】Ｖｉｖｉａｎｉ Ｖ．， Ｕｃｈｉｄａ Ａ．， Ｓｕｅｎａｇａ Ｎ．， Ｒｙｕｆｕｋｕ Ｍ．， ａｎｄ Ｏｈｍｉｙａ Ｙ． ２００１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２８０， １２８６−１２９１
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９９４２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、複数色の発光酵素に対し、細胞試料からルシフェラーゼを安定して効率よく抽出し、発光反応を行える検出試薬に関する。さらに詳しくは、複数色の発光酵素を同時に安定して効率よく抽出し、発光反応を行える検出試薬に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、界面活性剤としてポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０を含有する抽出剤にグリセロール、を混合することによって、安定して抽出・発光反応を行うことができることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼ酵素を含む画分を抽出する方法であって、
（ａ）ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびにグリセロールを混合する工程、および
（ｂ）（ａ）の工程で得られた混合液を細胞に接触させてルシフェラーゼ酵素を抽出する工程、
を含む方法。
［項２］
前記（ａ）の工程で得られた混合液のグリセロールの濃度が２０〜２５％である、項１に記載の方法。
［項３］
前記混合液が、さらに１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む、項１または２に記載の方法。
［項４］
項１〜３のいずれかに記載の方法で抽出されたルシフェラーゼ酵素を含む画分の発光を測定する工程をさらに含む、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼを検出する方法。
［項５］
項１〜３のいずれかに記載の方法で抽出されたルシフェラーゼ酵素を含む画分を静置する工程をさらに含む、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを保持する方法。
［項６］
項１〜５のいずれかに記載の方法に用いるための試薬であって、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびにグリセロールを含む試薬。
［項７］
試薬中のグリセロールの濃度が２０〜２５％である、項６に記載の方法。
［項８］
試薬中に、１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む、項６または７に記載の試薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、複数色のルシフェラーゼを含む検体からそれぞれのルシフェラーゼを安定に抽出できるため、この発光量を測定することによって、複数の遺伝子の転写活性を同時にモニターするなど、複数のレポーターを用いた種々の生命現象の定量が可能となった。さらに、本発明の方法によりプレートリーダーを用いて多検体を一度により安定して測定することが可能となり、創薬スクリーニング、化学物質の毒性評価などに広く応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の抽出方法の抽出対象となるルシフェラーゼは、イリオモテボタルＲａｇｏｐｈｔｈａｌｍｉｄａｅ Ｏｈｂａｉ由来の緑色発光ルシフェラーゼ（非特許文献５）、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ（非特許文献４）、鉄道虫Ｐｈｒｉｘｏｔｈｒｉｘ ｈｉｒｔｕｓ由来の赤色発光ルシフェラーゼ（非特許文献３）などが挙げられる。これらルシフェラーゼは野生型の配列、あるいは１ないし２以上のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失があってもよい。これらは通常、発現可能な遺伝子構築物の形で細胞に導入されるが、ルシフェラーゼ遺伝子はｃＤＮＡ由来などの天然の遺伝子を使用してもよいが、試験に使用される細胞種において翻訳効率が向上するように遺伝子工学的に改変された遺伝子を用いることがより好ましく、近江谷らのルシフェラーゼが例示される（マルチ遺伝子転写活性測定システム、特許文献１）。
【非特許文献５】Ｏｈｍｉｙａ Ｙ．，Ｍｉｎａ Ｙ．，Ｖｉｖｉａｎｉ Ｖ．Ｒ．，Ｏｈｂａ Ｎ．２０００，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．Ｙｏｋｏｓｕｋａ Ｃｉｔｙ Ｍｕｓ．４７，３１−３８
【００１０】
本発明の抽出方法の抽出対象となるルシフェラーゼは、さらに、天然の発光酵素と同一のアミノ酸配列を有しても、また１又は２以上のアミノ酸の置換、付加、欠失または挿入が含まれるものであってもよいし、Ｎ末端またはＣ末端に第２のタンパク質が結合した融合タンパク質であってもよい。
【００１１】
本発明の別の態様として、前記の方法により抽出されたルシフェラーゼを、ホタルルシフェラーゼと同様Ｄ−ルシフェリンを発光基質として検出する方法が例示される。すなわち、ルシフェラーゼを含むサンプル溶液を発光反応に十分な濃度のＤ−ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウム塩などを含む発光試薬を混合し、この反応によって生じる発光量を測定し、各サンプル中のルシフェラーゼの相対的な存在量を決定する。
【００１２】
前記ルシフェラーゼの検出方法は、Ｄ−ルシフェリンを細胞に浸透させることによっても発光を生じせしめることができるが、より高感度な検出を行うにはルシフェラーゼを発現する細胞を物理的に破砕あるいは化学的に溶解し、その処理液の全部または一部と発光反応に十分な濃度のＭｇイオン、ＡＴＰ、ルシフェリンなどを含む発光反応液を調製し、前記反応液の発光量をもとに各サンプル中のルシフェラーゼの相対的な存在量を決定することが好ましい。細胞を物理的に破砕する方法としては、超音波破砕法が挙げられる。化学的に溶解する手法としては、細胞を界面活性剤を含む溶液と接触させる方法である。この破砕／溶解された細胞抽出液を前記試薬と混合し、発光を測定することによってルシフェラーゼの存在量を調べることができる。このような細胞で発現するルシフェラーゼの検出においては、発光試薬に界面活性剤を添加することによって、細胞を溶解しながら発光反応を行う方法は操作性がよく、サンプル数が多い場合に最適である。しかしながら、抗原抗体反応等によって、同じ細胞サンプル中に存在する調べたいタンパク質の存在量や、リン酸化などの修飾の状態を解析したい場合には、細胞溶解、発光を別々のステップで進められることが好ましい。
【００１３】
また、本発明の別の態様として、前記の方法により抽出されたルシフェラーゼを、静置し、保持する方法が例示される。
【００１４】
前記、細胞を溶解してルシフェラーゼを抽出するための方法に添加される界面活性剤としては、ルシフェラーゼを失活させたり、その活性をできるだけ阻害しない種類、濃度でなければならない。本発明に用いられるルシフェラーゼの抽出には非イオン性界面活性剤の使用が好ましい。一般に、ホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ Ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼを細胞から抽出する界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）が用いられる（非特許文献６）。また、特許文献２では、緑色発光ルシフェラーゼ、橙色発光ルシフェラーゼ、赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出にもＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を使用することが報告されている。
【非特許文献６】実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ（４）遺伝子導入と発現・解析法（１９９４年４月２０日発行、羊土社）ｐ．８９−９８
【特許文献２】ＷＯ２００６／０６１９８５
【００１５】
これに対し、本発明のルシフェラーゼの抽出方法では、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）（ＣＡＳ ９０３６−１９−５）、または、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ブリジ（登録商標）−５８）（ＣＡＳ ９００４−９５−９）を使用する。
Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０）の使用濃度の下限としては０．００５％が好ましく、さらに好ましくは０．０５％である。上限としては１％が好ましく、さらに好ましくは０．２５％である。
また、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用濃度の下限としては０．００５％が好ましく、さらに好ましくは０．０５％である。上限としては１％が好ましく、さらに好ましくは０．２５％である。
【００１６】
本発明のルシフェラーゼの抽出方法では、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルとノニデットＰ４０の両方が含まれる構成であってもよい。両方入れることにより、ロット間差によるリスクを分散させることができる。
【００１７】
本発明の抽出方法には、ルシフェラーゼの安定化のため、さらにグリセロールを添加する。好ましい濃度の下限としては１０％であり、さらに好ましくは２０％である。好ましい濃度の上限は３０％であり、さらに好ましくは２５％である。
この際、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００においてもグリセロールの安定化効果が認められるが、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルはさらに高い安定化が可能である。
【００１８】
本発明の抽出方法には、ルシフェラーゼの安定化のため、さらに硫酸アンモニウムを添加することができる。好ましい濃度の下限としては１０ｍＭである。好ましい濃度の上限は５０ｍＭであり、さらに好ましくは２０ｍＭである。
【００１９】
本発明の抽出方法では、さらにイオン強度やｐＨを維持するために、緩衝成分を含んでもよい。緩衝成分としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、グリシルグリシンなどが挙げられ、通常は２０〜１００ｍＭの使用が好ましい。好ましいｐＨ範囲は７．０〜８．５である。ｐＨ７．８〜８．０で最大発光を得ることができるが、ｐＨを７．８以下にすることによって発光持続性を高めることができる。本発明ではさらにルシフェラーゼの活性を増強するタンパク質性材料、例えば、ウシなどの哺乳類血清アルブミン、ラクトアルブミンなどを存在させることもできる。
【００２０】
本発明の抽出方法では、さらにサンプル中に存在して、ルシフェラーゼやＡＴＰなどに悪影響を及ぼす可能性のある金属含有プロテアーゼやホスファターゼの活性を抑制するため、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤などを含有させることができる。好ましい濃度としては１〜５ｍＭである。
【００２１】
さらに、本発明の抽出方法では、ルシフェラーゼのタンパク質の安定性を保護する作用が考えられる還元剤を含んでもよい。還元剤としてはジチオトレイトールや２−メルカプトエタノールなどのスルフィドリル化合物が挙げられる。
【００２２】
本発明の抽出方法では、前記方法の細胞抽出液の全部、または一部を、D-ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムイオンを含む発光試薬と接触させて発光量を測定することによって、当該サンプル中に含まれるルシフェラーゼの相対的存在量を決定する。発光試薬には、さらに補酵素Ａ、ＤＴＴなどを含んでもよい。
【００２３】
本発明の一つの態様としては、前記ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流に転写調節配列を連結し、この遺伝子構築物を細胞に導入することによって発現するルシフェラーゼを検出する方法が例示される。これによって、ルシフェラーゼの発現量を指標に前記細胞における前記転写制御配列の転写制御を解析することが可能である。
【００２４】
本発明に用いられる細胞とは真核生物、原核生物など由来を問わないが、好ましくは動物由来の細胞であり、特に好ましくは哺乳類由来の細胞であって、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの細胞が挙げられる。大腸菌などの原核生物を用いる場合は、本発明の抽出・維持方法とさらに物理的な細胞破砕手段を組み合わせることが好ましい。
【００２５】
本発明の別の態様としては、前記ルシフェラーゼを試験対象となる第２のタンパク質との融合タンパク質の形で発現させ、その存在量を発光を検出（測定）することによって、試験対象となったタンパク質量の調節をモニターする方法である。例えば、ＩκＢとの融合タンパク質として細胞内で発現させることによって、ＴＮＦα、ＩＬ−１など刺激によってＩκＢが分解され、転写因子ＮＦκＢの活性化される経路の活性化されるが、一定発現プロモーターに連結されたＩκＢとの融合タンパク質の分解の程度を測定することによって、この活性化を定量的にモニターすることができる。
【００２６】
さらに、本発明の別の態様としては、前記の抽出方法、検出方法および保持方法のいずれか１以上の方法に用いるための試薬である。
試薬とは、これら検出に必要な成分をすべて含有する試薬であってもよいし、別個のパーツからなるキットであってもよい。実験室等で本願発明の方法を使用するためにその都度調製した試薬組成物、あるいは、本願発明の方法に使用しやすいように予め必要な試薬等をキット化したものを含む。さらに、本発明の試薬をすべて混合した水溶液の他、２倍以上の高濃度品（使用時に希釈して用いる）などが挙げられる。
前記試薬には、界面活性剤としてノニデット（登録商標）Ｐ４０またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む。さらにグリセロールを含むことが好ましい。あるいは、さらに硫酸アンモニウムを含むことが好ましい。
１つのこのような組成物は、０．０５〜０．２５％のノニデット（登録商標）Ｐ４０またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ならびに、１０〜２５％グリセロールを含む水溶液である。好ましくはさらに１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む組成物である。
本発明の試薬における各構成成分あるいはそれらの組み合わせについて、より好ましい条件は、本願発明の方法に関して説明した上記各項に記載の内容に準ずる。
該試薬は、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞と混合して、該細胞からルシフェラーゼを抽出したり、該ルシフェラーゼ試料を該試薬と混合し、該ルシフェラーゼの保存液として用いてもよい。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００２８】
実施例１ ルシフェラーゼの抽出剤へのグリセロール／硫酸アンモニウムの添加効果の確認
２４ウェルプレートにＣＨＯ細胞を播種し（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ウェル）、１０％ＦＣＳを含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地（日水製薬）１ｍｌ／ウェル中で培養した。翌日、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの発現プラスミド（それぞれ、東洋紡績製、ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− ＳＶ４０コントロールベクターの、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０、１０、または２０％グリセロール、０または１０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００２９】
図1は、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含む細胞抽出剤にグリセロール、硫酸アンモニウムを添加して抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。横軸の（−）は硫酸アンモニウム無添加、（＋）は１０ｍＭ硫酸アンモニウム含有を示す。これら条件下では、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ（ＳＬＧ）はほとんど差異は認められず、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ（ＳＬＯ）においても界面活性剤としてポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを選択した方が発光強度が高いが、安定性については差異は認められなかった。一方、鉄道虫赤色ルシフェラーゼ（ＳＬＲ）は安定性が低く、抽出処理中に酵素が不活性化してしまうが、５〜１０％程度のグリセロール添加によって有意な発光強度の上昇が認められた。また、１０ｍＭの硫酸アンモニウムを添加することによっても安定化の傾向が認められた。
【００３０】
実施例２ ルシフェラーゼの抽出剤へのグリセロール／硫酸アンモニウムの添加量の最適化
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、１０、１５、２０または２５％グリセロール、０、１０、または２０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００３１】
図２は、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む細胞抽出剤に、グリセロールを０〜２５％、硫酸アンモニウムを０〜２０ｍＭ添加して抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。横軸の０、１０、２０は硫酸アンモニウム濃度（ｍＭ）、Ｇｌｙはグリセロールを示す。この結果、グリセロールの添加によってＳＬＲの顕著な安定化が認められ、硫酸アンモニウムの添加によって、さらに上昇が認められた。一方、ＳＬＧ、ＳＬＯにおいては硫酸アンモニウムの添加によって若干の発光強度の低下が認められるが、測定に支障をきたすものではない。
【００３２】
実施例３ ルシフェラーゼの抽出剤への硫酸アンモニウムの添加量の確認
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、２０％グリセロール、０〜５０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００３３】
図３は、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む細胞抽出剤に、グリセロールを２０％、硫酸アンモニウムを０〜５０ｍＭ添加して抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。この結果、ＳＬＲについては１０ｍＭないし２０ｍＭの硫酸アンモニウムの添加で有意な安定化の上昇が認められ、それ以上添加量を増やしてもほとんど変化は認められない。一方、ＳＬＧ、ＳＬＯについては発光量が低下する傾向があることから、添加量としては１０〜２０ｍＭ程度が好ましいといえる。
【００３４】
実施例４ ルシフェラーゼの抽出剤へのポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの添加量の確認（１）
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１〜３％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、２０％グリセロール、１０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００３５】
図４は、０．１〜３％ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む細胞抽出剤（２０％グリセロール、１０ｍＭ硫酸アンモニウムを含む）で抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。この結果、いずれのルシフェラーゼにおいても１％以上のポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの添加で不活性化してしまうことが確認された。
【００３６】
実施例５ ルシフェラーゼの抽出剤へのポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの添加量の確認（２）
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００１〜０．５％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、２５％グリセロール、１０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００３７】
図５は、０．１〜３％ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む細胞抽出剤（２５％グリセロール、１０ｍＭ硫酸アンモニウムを含む）で抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。
【００３８】
この結果、いずれのルシフェラーゼにおいても０．００１％以下のポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの添加では十分な細胞抽出が行えないことがわかる。しかし、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルが０．００５％、０．０１％の場合は、溶解までに時間を要するが抽出処理時間の延長によって２ｈｒ後であれば抽出でき測定可能であることがわかる。また、０．０５％以上であれば、処理直後すみやかに測定できることがわかる。したがって、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用濃度の下限としては０．００５％が好ましく、さらに実用上好ましくは０．０５％である。
【００３９】
一方、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用濃度が０．５％を超えると2時間の残存活性が下がり気味になることがわかる。したがって、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用濃度の上限としては、実施例４（図４）において使用濃度が１％を超えると極端にルシフェラーゼ活性が低下することと合わせて考えると、好ましくは１％、さらに好ましくは０．２５％である。
【００４０】
実施例６ ルシフェラーゼの抽出剤の界面活性剤の比較
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２０または２５％グリセロール、１０ｍＭまたは２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ノニデットＰ４０、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００からなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した
【００４１】
図６は、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（図中記号：ＰＥＣ）、ノニデットＰ４０（図中記号：ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（図中記号：ＴＸ１００）を含む細胞抽出剤で抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性の比較結果を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。この結果、いずれのルシフェラーゼにおいてもＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００では他の２つの界面活性剤に比べ発光強度が低い。一方、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルではいずれのルシフェラーゼにおいても高い発光強度、残存活性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明における多色発光ルシフェラーゼの測定方法は、近年注目される多色発光酵素を用いたアッセイ系の測定に用いられ、このアッセイ系は複雑な細胞内転写制御解析、遺伝子転写を指標としたシグナル伝達系などの解析、さらには化合物スクリーニングの系として利用することができ、創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるグリセロール、硫酸アンモニウムの効果を示す図である。
【図２】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるグリセロール、硫酸アンモニウムの最適濃度を示す図である。
【図３】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出における硫酸アンモニウムの有効濃度を示す図である
【図４】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの有効濃度を示す図である。
【図５】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの有効濃度を示す図である。
【図６】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ノニデットＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の比較結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェリン−ルシフェラーゼの発光反応を用いた、サンプル中のルシフェラーゼを検出するための安定した抽出方法に関する。さらに詳しくは、複数の発光スペクトル特性を有する甲虫由来のルシフェラーゼをノニデット（登録商標）Ｐ４０またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルならびにグリセロールを含む抽出試薬を用いて同時抽出する方法ならびにそのための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
レポーター遺伝子を用いた遺伝子発現制御解析は、レポーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列）を含むプラスミドを細胞に導入して、ある条件下において発現されるレポーター酵素の活性を指標に遺伝子発現制御を評価する手法である。これまで多くのレポーター酵素がこの評価に用いられてきたが、ホタルルシフェラーゼの発光を利用したシステムは感度が高く、活性測定が簡便なことから、現在広く用いられている。
【０００３】
しかしながら、レポーター活性をサンプル間で評価する際には、トランスフェクション効率、細胞数、生育状態、細胞死等、遺伝子発現制御とは関係しない、レポーター酵素の絶対量の変化をもたらす要因が存在する。このため、被験配列に連結されたレポーター遺伝子とあわせて、一定発現（コントロール）プロモーターに連結された基質特異性、あるいは反応性の異なるレポーター分子を内部標準として加え、サンプル間で標準化処理を行う必要がある。このように２つ以上の遺伝子発現を同時に測定するために、これまで種々の遺伝子、特にホタルルシフェラーゼと異なった基質特異性を示すウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）がクローニングされ用いられてきた。しかし、この方法では発光の機構が異なるため、複数の反応及び測定を行わなければならず煩雑であった。
【０００４】
一方、ホタルルシフェラーゼ遺伝子から発光色の異なる変異体を見つける研究（非特許文献１）や、発光色の異なる４種類のヒカリコメツキムシ由来ルシフェラーゼの単離（非特許文献２）、２色の鉄道虫由来のルシフェラーゼの研究（非特許文献３）、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼの変異体の研究（非特許文献４）などが進められてきた。これらのルシフェラーゼは同じ基質で異なった発光色を示すことで注目された。特に、ホタルルシフェラーゼ変異体はｐＨにより発光スペクトルが変動してしまうことから、多色測定においてはコメツキムシ、鉄道虫、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼなどのようにｐＨに対して発光スペクトルが変動しないルシフェラーゼが好ましく、３色の発光ルシフェラーゼを用いたアッセイシステムが実用化されている（近江谷ら、マルチ遺伝子転写活性測定システム、特許文献１）。しかし、これらのルシフェラーゼの安定性が異なるため、特に複数のルシフェラーゼを同時に検出しようとする際、いずれのルシフェラーゼも細胞から安定して効率よく抽出し、発光反応を行える検出試薬の開発が望まれていた。
【非特許文献１】Ｃｏｎｔａｇ Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｒｅｄ Ｓｈｉｆｔｅｄ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ６，４９５，３５５ （２００２）
【非特許文献２】Ｗｏｏｄ Ｋ．Ｖ．， Ｌａｍ Ｙ．Ａ．， Ｓｅｌｉｇｅｒ Ｈ．Ｈ．， ａｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ Ｗ．Ｄ． １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４， ７００−７０２：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｃｏｄｉｎｇ Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅｓ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ Ｃａｎ Ｅｌｉｃｉｔ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃｏｌｏｒｓ
【非特許文献３】Ｖｉｖｉａｎｉ Ｖ．Ｒ．， Ｂｅｃｈａｒａ Ｅ．Ｊ．Ｈ．， Ｏｈｍｉｙａ Ｙ． １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３８， ８２７１−８２７９
【非特許文献４】Ｖｉｖｉａｎｉ Ｖ．， Ｕｃｈｉｄａ Ａ．， Ｓｕｅｎａｇａ Ｎ．， Ｒｙｕｆｕｋｕ Ｍ．， ａｎｄ Ｏｈｍｉｙａ Ｙ． ２００１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２８０， １２８６−１２９１
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９９４２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、複数色の発光酵素に対し、細胞試料からルシフェラーゼを安定して効率よく抽出し、発光反応を行える検出試薬に関する。さらに詳しくは、複数色の発光酵素を同時に安定して効率よく抽出し、発光反応を行える検出試薬に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、界面活性剤としてポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０を含有する抽出剤にグリセロール、を混合することによって、安定して抽出・発光反応を行うことができることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼ酵素を含む画分を抽出する方法であって、
（ａ）ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびにグリセロールを混合する工程、および
（ｂ）（ａ）の工程で得られた混合液を細胞に接触させてルシフェラーゼ酵素を抽出する工程、
を含む方法。
［項２］
前記（ａ）の工程で得られた混合液のグリセロールの濃度が２０〜２５％である、項１に記載の方法。
［項３］
前記混合液が、さらに１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む、項１または２に記載の方法。
［項４］
項１〜３のいずれかに記載の方法で抽出されたルシフェラーゼ酵素を含む画分の発光を測定する工程をさらに含む、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼを検出する方法。
［項５］
項１〜３のいずれかに記載の方法で抽出されたルシフェラーゼ酵素を含む画分を静置する工程をさらに含む、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを保持する方法。
［項６］
項１〜５のいずれかに記載の方法に用いるための試薬であって、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびにグリセロールを含む試薬。
［項７］
試薬中のグリセロールの濃度が２０〜２５％である、項６に記載の方法。
［項８］
試薬中に、１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む、項６または７に記載の試薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、複数色のルシフェラーゼを含む検体からそれぞれのルシフェラーゼを安定に抽出できるため、この発光量を測定することによって、複数の遺伝子の転写活性を同時にモニターするなど、複数のレポーターを用いた種々の生命現象の定量が可能となった。さらに、本発明の方法によりプレートリーダーを用いて多検体を一度により安定して測定することが可能となり、創薬スクリーニング、化学物質の毒性評価などに広く応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の抽出方法の抽出対象となるルシフェラーゼは、イリオモテボタルＲａｇｏｐｈｔｈａｌｍｉｄａｅ Ｏｈｂａｉ由来の緑色発光ルシフェラーゼ（非特許文献５）、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ（非特許文献４）、鉄道虫Ｐｈｒｉｘｏｔｈｒｉｘ ｈｉｒｔｕｓ由来の赤色発光ルシフェラーゼ（非特許文献３）などが挙げられる。これらルシフェラーゼは野生型の配列、あるいは１ないし２以上のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失があってもよい。これらは通常、発現可能な遺伝子構築物の形で細胞に導入されるが、ルシフェラーゼ遺伝子はｃＤＮＡ由来などの天然の遺伝子を使用してもよいが、試験に使用される細胞種において翻訳効率が向上するように遺伝子工学的に改変された遺伝子を用いることがより好ましく、近江谷らのルシフェラーゼが例示される（マルチ遺伝子転写活性測定システム、特許文献１）。
【非特許文献５】Ｏｈｍｉｙａ Ｙ．，Ｍｉｎａ Ｙ．，Ｖｉｖｉａｎｉ Ｖ．Ｒ．，Ｏｈｂａ Ｎ．２０００，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．Ｙｏｋｏｓｕｋａ Ｃｉｔｙ Ｍｕｓ．４７，３１−３８
【００１０】
本発明の抽出方法の抽出対象となるルシフェラーゼは、さらに、天然の発光酵素と同一のアミノ酸配列を有しても、また１又は２以上のアミノ酸の置換、付加、欠失または挿入が含まれるものであってもよいし、Ｎ末端またはＣ末端に第２のタンパク質が結合した融合タンパク質であってもよい。
【００１１】
本発明の別の態様として、前記の方法により抽出されたルシフェラーゼを、ホタルルシフェラーゼと同様Ｄ−ルシフェリンを発光基質として検出する方法が例示される。すなわち、ルシフェラーゼを含むサンプル溶液を発光反応に十分な濃度のＤ−ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウム塩などを含む発光試薬を混合し、この反応によって生じる発光量を測定し、各サンプル中のルシフェラーゼの相対的な存在量を決定する。
【００１２】
前記ルシフェラーゼの検出方法は、Ｄ−ルシフェリンを細胞に浸透させることによっても発光を生じせしめることができるが、より高感度な検出を行うにはルシフェラーゼを発現する細胞を物理的に破砕あるいは化学的に溶解し、その処理液の全部または一部と発光反応に十分な濃度のＭｇイオン、ＡＴＰ、ルシフェリンなどを含む発光反応液を調製し、前記反応液の発光量をもとに各サンプル中のルシフェラーゼの相対的な存在量を決定することが好ましい。細胞を物理的に破砕する方法としては、超音波破砕法が挙げられる。化学的に溶解する手法としては、細胞を界面活性剤を含む溶液と接触させる方法である。この破砕／溶解された細胞抽出液を前記試薬と混合し、発光を測定することによってルシフェラーゼの存在量を調べることができる。このような細胞で発現するルシフェラーゼの検出においては、発光試薬に界面活性剤を添加することによって、細胞を溶解しながら発光反応を行う方法は操作性がよく、サンプル数が多い場合に最適である。しかしながら、抗原抗体反応等によって、同じ細胞サンプル中に存在する調べたいタンパク質の存在量や、リン酸化などの修飾の状態を解析したい場合には、細胞溶解、発光を別々のステップで進められることが好ましい。
【００１３】
また、本発明の別の態様として、前記の方法により抽出されたルシフェラーゼを、静置し、保持する方法が例示される。
【００１４】
前記、細胞を溶解してルシフェラーゼを抽出するための方法に添加される界面活性剤としては、ルシフェラーゼを失活させたり、その活性をできるだけ阻害しない種類、濃度でなければならない。本発明に用いられるルシフェラーゼの抽出には非イオン性界面活性剤の使用が好ましい。一般に、ホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ Ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼを細胞から抽出する界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）が用いられる（非特許文献６）。また、特許文献２では、緑色発光ルシフェラーゼ、橙色発光ルシフェラーゼ、赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出にもＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を使用することが報告されている。
【非特許文献６】実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ（４）遺伝子導入と発現・解析法（１９９４年４月２０日発行、羊土社）ｐ．８９−９８
【特許文献２】ＷＯ２００６／０６１９８５
【００１５】
これに対し、本発明のルシフェラーゼの抽出方法では、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）（ＣＡＳ ９０３６−１９−５）、または、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ブリジ（登録商標）−５８）（ＣＡＳ ９００４−９５−９）を使用する。
Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０）の使用濃度の下限としては０．００５％が好ましく、さらに好ましくは０．０５％である。上限としては１％が好ましく、さらに好ましくは０．２５％である。
また、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用濃度の下限としては０．００５％が好ましく、さらに好ましくは０．０５％である。上限としては１％が好ましく、さらに好ましくは０．２５％である。
【００１６】
本発明のルシフェラーゼの抽出方法では、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルとノニデットＰ４０の両方が含まれる構成であってもよい。両方入れることにより、ロット間差によるリスクを分散させることができる。
【００１７】
本発明の抽出方法には、ルシフェラーゼの安定化のため、さらにグリセロールを添加する。好ましい濃度の下限としては１０％であり、さらに好ましくは２０％である。好ましい濃度の上限は３０％であり、さらに好ましくは２５％である。
この際、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００においてもグリセロールの安定化効果が認められるが、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルはさらに高い安定化が可能である。
【００１８】
本発明の抽出方法には、ルシフェラーゼの安定化のため、さらに硫酸アンモニウムを添加することができる。好ましい濃度の下限としては１０ｍＭである。好ましい濃度の上限は５０ｍＭであり、さらに好ましくは２０ｍＭである。
【００１９】
本発明の抽出方法では、さらにイオン強度やｐＨを維持するために、緩衝成分を含んでもよい。緩衝成分としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、グリシルグリシンなどが挙げられ、通常は２０〜１００ｍＭの使用が好ましい。好ましいｐＨ範囲は７．０〜８．５である。ｐＨ７．８〜８．０で最大発光を得ることができるが、ｐＨを７．８以下にすることによって発光持続性を高めることができる。本発明ではさらにルシフェラーゼの活性を増強するタンパク質性材料、例えば、ウシなどの哺乳類血清アルブミン、ラクトアルブミンなどを存在させることもできる。
【００２０】
本発明の抽出方法では、さらにサンプル中に存在して、ルシフェラーゼやＡＴＰなどに悪影響を及ぼす可能性のある金属含有プロテアーゼやホスファターゼの活性を抑制するため、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤などを含有させることができる。好ましい濃度としては１〜５ｍＭである。
【００２１】
さらに、本発明の抽出方法では、ルシフェラーゼのタンパク質の安定性を保護する作用が考えられる還元剤を含んでもよい。還元剤としてはジチオトレイトールや２−メルカプトエタノールなどのスルフィドリル化合物が挙げられる。
【００２２】
本発明の抽出方法では、前記方法の細胞抽出液の全部、または一部を、D-ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムイオンを含む発光試薬と接触させて発光量を測定することによって、当該サンプル中に含まれるルシフェラーゼの相対的存在量を決定する。発光試薬には、さらに補酵素Ａ、ＤＴＴなどを含んでもよい。
【００２３】
本発明の一つの態様としては、前記ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流に転写調節配列を連結し、この遺伝子構築物を細胞に導入することによって発現するルシフェラーゼを検出する方法が例示される。これによって、ルシフェラーゼの発現量を指標に前記細胞における前記転写制御配列の転写制御を解析することが可能である。
【００２４】
本発明に用いられる細胞とは真核生物、原核生物など由来を問わないが、好ましくは動物由来の細胞であり、特に好ましくは哺乳類由来の細胞であって、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの細胞が挙げられる。大腸菌などの原核生物を用いる場合は、本発明の抽出・維持方法とさらに物理的な細胞破砕手段を組み合わせることが好ましい。
【００２５】
本発明の別の態様としては、前記ルシフェラーゼを試験対象となる第２のタンパク質との融合タンパク質の形で発現させ、その存在量を発光を検出（測定）することによって、試験対象となったタンパク質量の調節をモニターする方法である。例えば、ＩκＢとの融合タンパク質として細胞内で発現させることによって、ＴＮＦα、ＩＬ−１など刺激によってＩκＢが分解され、転写因子ＮＦκＢの活性化される経路の活性化されるが、一定発現プロモーターに連結されたＩκＢとの融合タンパク質の分解の程度を測定することによって、この活性化を定量的にモニターすることができる。
【００２６】
さらに、本発明の別の態様としては、前記の抽出方法、検出方法および保持方法のいずれか１以上の方法に用いるための試薬である。
試薬とは、これら検出に必要な成分をすべて含有する試薬であってもよいし、別個のパーツからなるキットであってもよい。実験室等で本願発明の方法を使用するためにその都度調製した試薬組成物、あるいは、本願発明の方法に使用しやすいように予め必要な試薬等をキット化したものを含む。さらに、本発明の試薬をすべて混合した水溶液の他、２倍以上の高濃度品（使用時に希釈して用いる）などが挙げられる。
前記試薬には、界面活性剤としてノニデット（登録商標）Ｐ４０またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む。さらにグリセロールを含むことが好ましい。あるいは、さらに硫酸アンモニウムを含むことが好ましい。
１つのこのような組成物は、０．０５〜０．２５％のノニデット（登録商標）Ｐ４０またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ならびに、１０〜２５％グリセロールを含む水溶液である。好ましくはさらに１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む組成物である。
本発明の試薬における各構成成分あるいはそれらの組み合わせについて、より好ましい条件は、本願発明の方法に関して説明した上記各項に記載の内容に準ずる。
該試薬は、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞と混合して、該細胞からルシフェラーゼを抽出したり、該ルシフェラーゼ試料を該試薬と混合し、該ルシフェラーゼの保存液として用いてもよい。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００２８】
実施例１ ルシフェラーゼの抽出剤へのグリセロール／硫酸アンモニウムの添加効果の確認
２４ウェルプレートにＣＨＯ細胞を播種し（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ウェル）、１０％ＦＣＳを含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地（日水製薬）１ｍｌ／ウェル中で培養した。翌日、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの発現プラスミド（それぞれ、東洋紡績製、ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− ＳＶ４０コントロールベクターの、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０、１０、または２０％グリセロール、０または１０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００２９】
図1は、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含む細胞抽出剤にグリセロール、硫酸アンモニウムを添加して抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。横軸の（−）は硫酸アンモニウム無添加、（＋）は１０ｍＭ硫酸アンモニウム含有を示す。これら条件下では、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ（ＳＬＧ）はほとんど差異は認められず、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ（ＳＬＯ）においても界面活性剤としてポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを選択した方が発光強度が高いが、安定性については差異は認められなかった。一方、鉄道虫赤色ルシフェラーゼ（ＳＬＲ）は安定性が低く、抽出処理中に酵素が不活性化してしまうが、５〜１０％程度のグリセロール添加によって有意な発光強度の上昇が認められた。また、１０ｍＭの硫酸アンモニウムを添加することによっても安定化の傾向が認められた。
【００３０】
実施例２ ルシフェラーゼの抽出剤へのグリセロール／硫酸アンモニウムの添加量の最適化
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、１０、１５、２０または２５％グリセロール、０、１０、または２０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００３１】
図２は、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む細胞抽出剤に、グリセロールを０〜２５％、硫酸アンモニウムを０〜２０ｍＭ添加して抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。横軸の０、１０、２０は硫酸アンモニウム濃度（ｍＭ）、Ｇｌｙはグリセロールを示す。この結果、グリセロールの添加によってＳＬＲの顕著な安定化が認められ、硫酸アンモニウムの添加によって、さらに上昇が認められた。一方、ＳＬＧ、ＳＬＯにおいては硫酸アンモニウムの添加によって若干の発光強度の低下が認められるが、測定に支障をきたすものではない。
【００３２】
実施例３ ルシフェラーゼの抽出剤への硫酸アンモニウムの添加量の確認
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、２０％グリセロール、０〜５０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００３３】
図３は、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む細胞抽出剤に、グリセロールを２０％、硫酸アンモニウムを０〜５０ｍＭ添加して抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。この結果、ＳＬＲについては１０ｍＭないし２０ｍＭの硫酸アンモニウムの添加で有意な安定化の上昇が認められ、それ以上添加量を増やしてもほとんど変化は認められない。一方、ＳＬＧ、ＳＬＯについては発光量が低下する傾向があることから、添加量としては１０〜２０ｍＭ程度が好ましいといえる。
【００３４】
実施例４ ルシフェラーゼの抽出剤へのポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの添加量の確認（１）
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１〜３％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、２０％グリセロール、１０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００３５】
図４は、０．１〜３％ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む細胞抽出剤（２０％グリセロール、１０ｍＭ硫酸アンモニウムを含む）で抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。この結果、いずれのルシフェラーゼにおいても１％以上のポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの添加で不活性化してしまうことが確認された。
【００３６】
実施例５ ルシフェラーゼの抽出剤へのポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの添加量の確認（２）
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００１〜０．５％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、２５％グリセロール、１０ｍＭ硫酸アンモニウムからなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した。
【００３７】
図５は、０．１〜３％ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルを含む細胞抽出剤（２５％グリセロール、１０ｍＭ硫酸アンモニウムを含む）で抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。
【００３８】
この結果、いずれのルシフェラーゼにおいても０．００１％以下のポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの添加では十分な細胞抽出が行えないことがわかる。しかし、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルが０．００５％、０．０１％の場合は、溶解までに時間を要するが抽出処理時間の延長によって２ｈｒ後であれば抽出でき測定可能であることがわかる。また、０．０５％以上であれば、処理直後すみやかに測定できることがわかる。したがって、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用濃度の下限としては０．００５％が好ましく、さらに実用上好ましくは０．０５％である。
【００３９】
一方、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用濃度が０．５％を超えると2時間の残存活性が下がり気味になることがわかる。したがって、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用濃度の上限としては、実施例４（図４）において使用濃度が１％を超えると極端にルシフェラーゼ活性が低下することと合わせて考えると、好ましくは１％、さらに好ましくは０．２５％である。
【００４０】
実施例６ ルシフェラーゼの抽出剤の界面活性剤の比較
前記同様、２４ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞に、ｐＳＬＧ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＯ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＳＬＲ−ＳＶ４０ ｃｏｎｔｒｏｌ）をＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、トランスフェクションした。２４時間培養後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２０または２５％グリセロール、１０ｍＭまたは２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％ ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ノニデットＰ４０、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００からなる混合液を調製し、細胞から培地を除去した後、２００μｌ／ウェルになるように細胞に加えた。１０分後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、発光試薬ＭｕｌｔｉＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ −Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標）− Ｔｒｉｐｌｕｃ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡績製）７５μｌと混合し、発光量を測定した。さらに、室温に放置して２時間後に細胞抽出液７５μｌを抜き取り、同様に発光量を測定した
【００４１】
図６は、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（図中記号：ＰＥＣ）、ノニデットＰ４０（図中記号：ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（図中記号：ＴＸ１００）を含む細胞抽出剤で抽出処理をした際の抽出液の発光強度と室温に２時間放置した後の酵素の残存活性の比較結果を示す図である。それぞれ棒グラフは、細胞抽出処理直後（０ｈｒ）と２時間放置後（２ｈｒ）の発光強度、折れ線グラフは細胞抽出処理直後（０ｈｒ）を１００として、２時間放置後の相対発光強度の変化を示した。この結果、いずれのルシフェラーゼにおいてもＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００では他の２つの界面活性剤に比べ発光強度が低い。一方、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルではいずれのルシフェラーゼにおいても高い発光強度、残存活性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明における多色発光ルシフェラーゼの測定方法は、近年注目される多色発光酵素を用いたアッセイ系の測定に用いられ、このアッセイ系は複雑な細胞内転写制御解析、遺伝子転写を指標としたシグナル伝達系などの解析、さらには化合物スクリーニングの系として利用することができ、創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるグリセロール、硫酸アンモニウムの効果を示す図である。
【図２】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるグリセロール、硫酸アンモニウムの最適濃度を示す図である。
【図３】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出における硫酸アンモニウムの有効濃度を示す図である
【図４】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの有効濃度を示す図である。
【図５】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの有効濃度を示す図である。
【図６】哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼ、鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの細胞抽出におけるポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ノニデットＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の比較結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼ酵素を含む画分を抽出する方法であって、
（ａ）ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびにグリセロールを混合する工程、および
（ｂ）（ａ）の工程で得られた混合液を細胞に接触させてルシフェラーゼ酵素を抽出する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記（ａ）の工程で得られた混合液のグリセロールの濃度が２０〜２５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合液が、さらに１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法で抽出されたルシフェラーゼ酵素を含む画分の発光を測定する工程をさらに含む、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼを検出する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法で抽出されたルシフェラーゼ酵素を含む画分を静置する工程をさらに含む、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを保持する方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法に用いるための試薬であって、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびにグリセロールを含む試薬。
【請求項７】
試薬中のグリセロールの濃度が２０〜２５％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試薬中に、１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む、請求項６または７に記載の試薬。
【請求項１】
イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼ酵素を含む画分を抽出する方法であって、
（ａ）ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびにグリセロールを混合する工程、および
（ｂ）（ａ）の工程で得られた混合液を細胞に接触させてルシフェラーゼ酵素を抽出する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記（ａ）の工程で得られた混合液のグリセロールの濃度が２０〜２５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合液が、さらに１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法で抽出されたルシフェラーゼ酵素を含む画分の発光を測定する工程をさらに含む、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを発現する細胞からルシフェラーゼを検出する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法で抽出されたルシフェラーゼ酵素を含む画分を静置する工程をさらに含む、イリオモテボタル由来の緑色発光ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の変異体型橙色発光ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の赤色発光ルシフェラーゼの群から選択される１ないし２以上のルシフェラーゼを保持する方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法に用いるための試薬であって、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルまたはノニデット（登録商標）Ｐ４０、ならびにグリセロールを含む試薬。
【請求項７】
試薬中のグリセロールの濃度が２０〜２５％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試薬中に、１０〜５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む、請求項６または７に記載の試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１４２１８８（Ｐ２００９−１４２１８８Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２１７４５（Ｐ２００７−３２１７４５）
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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