多量体アディポネクチンの分別測定方法
生体試料中で種々の多量体を形成して存在しているアディポネクチンを分別して免疫学的に測定する方法の提供、さらに、分別測定することによりアディポネクチンの総量測定のみでは得られない情報を得、疾病とアディポネクチンの関係をより正確に評価する方法を提供する。
測定対象の多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法。
測定対象の多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中に含まれる種々の多量体アディポネクチンを分別して免疫学的に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチンは、脂肪細胞から特異的に分泌されるインスリン感受性ホルモンであり、血中に比較的高濃度（５〜１０μｇ／ｍＬ）存在している。アディポネクチンの生理的な作用については、本発明者らにより、アディポネクチンの量的な減少が、肥満による２型糖尿病や脂肪萎縮性糖尿病における糖・脂質代謝異常を引き起こす原因の一つであることが報告され（非特許文献１）、医学的な利用については、糖代謝異常の診断、特にインスリン抵抗性改善薬であるチアゾリジン誘導体の治療効果のモニタリングへの利用（特許文献１）、肝星細胞の活性化及び増殖の抑制、細胞外マトリックス産生の抑制などの作用を利用した肝繊維化抑制剤（特許文献２）が提案されている。
【０００３】
アディポネクチンは、構造上Ｃ１ｑ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ １ｑ）ファミリーに属し、Ｃ１ｑファミリーの特徴であるコラーゲン様ドメインを有していることから、３量体を基本とした多量体を形成して存在していることが報告されている（非特許文献２、３）。
【０００４】
アディポネクチンの構造上の相違と生理的作用、活性等との関係に関しては、Ｔｓａｏらが、ＮＦ−κＢの活性化作用について、３量体を超える多量体アディポネクチンにのみ活性が認められ、３量体やコラーゲン様ドメインが欠落したグロブラー（ｇｌｏｂｕｌａｒ：球状）ドメインには、活性化作用が認められなかったことを報告している。また、Ｕｔｐａｌらは、インスリンやグルコース投与により、高分子画分アディポネクチンのみが有意に低下することや、血糖降下作用は、コラーゲン様ドメインのシステインをセリンに変換したアディポネクチンや還元処理したアディポネクチンで強く、還元未処理及びｇｌｏｂｕｌａｒ アディポネクチンではほとんど示さなかったことを報告している（非特許文献４）。
【０００５】
しかしながら、これらの報告で検討に使用されたアディポネクチンは、大腸菌等における遺伝子組換えにより発現されたものであり、生体内で分泌されたアディポネクチンの挙動や作用を正確に反映していない可能性が考えられる。また、血中アディポネクチン濃度には性差があることが知られており、女性は男性と比較して有意に高値化している（非特許文献５）ことが報告される一方、マウス血清での成績ではあるが、特に高分子画分アディポネクチンの含量が高いことも報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
このように、アディポネクチンの構造上の相違と生理的作用や、疾病とアディポネクチンとの関係について、アディポネクチンの総量のみの測定によっては得ることができない情報があるため、生体試料中に存在する種々のアディポネクチン多量体を分別して測定することができる方法が要望されていた。
【０００７】
アディポネクチンを測定する方法としては、測定用の試料を予めドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下に煮沸処理した後、免疫学的に測定をする方法が開示（特許文献３）されている。この方法は立体構造上隠れている、抗体の認識部位を前記処理により露出させて免疫学的にアディポネクチンの総量を測定しようとする方法であり、種々の多量体を分別して測定することはできない。
【０００８】
また、測定試料中のアディポネクチンを、ＳＤＳ変性処理や熱変性処理を行わずに測定する方法（特許文献２では天然型の測定と称している）が開示されている（特許文献２）が、分別測定に関する記載はなく、利用できるものではない。
【特許文献１】国際公開 ＷＯ ０３／０１６９０６公報
【特許文献２】特開２００２−３６３０９４公報
【特許文献３】特開２０００−３０４７４８公報
【非特許文献１】Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ．， ７， ９４１−９４６， ２００１
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｏ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２０， ８０３−８１２， １９９６
【非特許文献３】Ｔｓａｏ Ｔ−Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ２９３５９−２９３６２， ２００２
【非特許文献４】Ｕｔｐａｌ Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ９０７３−９０８５， ２００３
【非特許文献５】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ．， １０３， １３７−１４２， ２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生体試料中で種々の多量体を形成して存在しているアディポネクチンを分別して測定する方法を提供することを目的とし、さらに、分別測定することによりアディポネクチンの総量測定のみでは得られない情報を得、アディポネクチンの生理的作用や、疾病とアディポネクチンとの関係をより正確に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究したところ、血液中のアディポネクチンは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより見積もられる分子量から、１５０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下（主として１６０ｋＤａ付近）（以下、ＬＭＷ−Ａｄと表記する。）、２００ｋＤａ超４００ｋＤａ未満（主として２６０ｋＤａ付近）（以下、ＭＭＷ−Ａｄと表記する。）及び４００ｋＤａ以上８００ｋＤａ以下（主として４５０ｋＤａ付近）（以下、ＨＭＷ−Ａｄと表記する。）で区別できる３種が存在することを確認し、さらに検討を続けたところ、人血液中から４種の多量体アディポネクチンの分別精製標品を得ることに成功した。これら４種は、非変性系のポリアクリルアミド（２−１５％）による電気泳動（以降、「ＰＡＧＥ（２−１５％）」のように表記することがある）にて分離可能であり、移動度の大きい側から順に、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄと表記して区別した。これら４種のうちＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄは前記血清中の３種のアディポネクチンにそれぞれ対応していた。そしてＬＭＷ−Ａｄが、３量体アディポネクチンにアルブミンがジスルフィド結合したものであること、及び、少なくともアディポネクチンに対する抗体とアルブミンに対する抗体を組合わせて使用することで、ＬＭＷ−Ａｄを分別測定できることを見出し、又、分子内架橋後のＳＤＳ−ポリアクリルアミド（２−１５％）による電気泳動（以降、方法について「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と表記することがある）での分子量算出から、ＵＬＭＷ−Ａｄが、アディポネクチンの３量体であることを解明し、ＭＭＷ−Ａｄは６〜９量体程度、ＨＭＷ−ＡｄはＭＭＷ−Ａｄの２倍以上の会合体を形成していることを推測するに至った。
【００１１】
さらにこれらの知見に基づき、アディポネクチンが含まれる試料に適当なプロテアーゼを作用させることによって、ＨＭＷ−Ａｄ以外のアディポネクチンを消化しうることを見出し、プロテアーゼによる消化処理の後、残ったＨＭＷ−Ａｄを、抗アディポネクチン抗体を用いて分別測定できることを見出した。
【００１２】
さらに、試料中のＭＭＷ−Ａｄ量を、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄをプロテアーゼ処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄ量及びＭＭＷ−Ａｄ量の合計量を算出し、該合計量からさらにＨＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで、算出できること、試料中のＵＬＭＷ−Ａｄ量を、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄをプロテアーゼ処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄ量及びＭＭＷ−Ａｄ量の合計量を算出し、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及びＬＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで、算出できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【００１３】
すなわち、本発明は、多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法を提供するものである。
さらに本発明は、人血中由来多量体アディポネクチンが下記の４種であり、その内の１種又は２種を、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中のアディポネクチンの測定方法を提供するものである。
（１）ＵＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１００ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（２）ＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＵＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１５０ｋＤａ付近にあり、さらにアルブミンがジスルフィド結合しているアディポネクチン。
（３）ＭＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２５０ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（４）ＨＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が小さく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が少なくとも３００ｋＤａ以上であるアディポネクチン。
【００１４】
また本発明は、上記の４種のアディポネクチンのうちの１種又は２種を、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定し、その結果を基に、疾病又は病態に関する情報を得ることを特徴とする、疾病又は病態の評価方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄを分別して測定できることから、アディポネクチンの生理的作用や、疾病又は病態、特に２型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患、肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果をより正確に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１における多量体アディポネクチンのゲルろ過クロマトグラムである。
【図２】実施例１において、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−ＡｄをそれぞれＰＡＧＥ（２−１５％）し、ＣＢＢ蛋白染色した、泳動像の図である。
【図３】実施例２において、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−ＡｄをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）し、ＣＢＢ蛋白染色した、泳動像の図である。
【図４】実施例５において、ヒト血清中のアディポネクチンを、ウェスタンブロッティング法により解析した図である。
【図５】実施例６において、ＬＭＷ−Ａｄ（アルブミン結合型アディポネクチン）を免疫測定法により測定した結果を示す図である。
【図６】実施例３において、ヒト由来ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄの精製品をそれぞれＰＡＧＥ（２−１５％）し、ＣＢＢ蛋白染色した、泳動像の図である。
【図７】実施例４において、ヒト由来ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄの精製品をそれぞれ非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）し、ＣＢＢ蛋白染色した、泳動像の図である。
【図８】実施例４において、ヒト由来ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄの精製品をそれぞれ分子内架橋後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）し、ウェスタンブロッティング法により解析した図である。
【図９】実施例７において、ＬＭＷ−Ａｄ（アルブミン結合型アディポネクチン）を免疫測定法により測定した結果を示す図である。
【図１０】実施例１３におけるプロテイナーゼＫの多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。
【図１１】実施例１３におけるプロテアーゼＡ「アマノ」の多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明において使用できる生体試料としては、多量体アディポネクチンを含有するものであれば、すべて対象となり、ヒト、サル、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット及びその他の哺乳類の動物から得られた血液、尿などの体液、組織抽出液や組織由来の細胞の培養上清液などが挙げられる。これらのうち、アディポネクチンの生理的作用や、疾病又は病態の正確な評価のための試料としては、血液（血清、血漿）が好適である。試料の採取方法は、分別測定するという目的を考慮し、試料中に存在するアディポネクチンに影響を与えない方法であれば使用可能である。例えば、ヒト血液を試料とする場合、評価の目的により、空腹時採血、薬物投与後採血など適宜選択することが好ましい。
【００１８】
ＬＭＷ−Ａｄを分別して免疫測定するための方法について説明する。ＬＭＷ−Ａｄを認識する抗体によりＬＭＷ−Ａｄを捕捉、検出する方法である。
【００１９】
ＬＭＷ−Ａｄを認識する抗体によりＬＭＷ−Ａｄを捕捉、検出する方法に使用される抗体は、ＬＭＷ−Ａｄが３量体アディポネクチンとアルブミンとの複合体であることから、当該複合体を認識して捕捉・検出し得るものであれば、特に制限を受けることなく使用できる。このような抗体の好適な例として、アディポネクチンを認識する抗体とアルブミンを認識する抗体の組み合わせ、あるいは、アディポネクチンとアルブミンとの複合体を特異的に認識する抗体が挙げられる。アディポネクチン、アルブミン、アディポネクチンとアルブミンとの複合体をそれぞれ認識するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、公知の手法によって適当な動物に免疫して得ることができる。これらの抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、抗ヒトアディポネクチン抗体としては、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＧＴ社）、ｒａｂｂｉｔαｈｕ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−ＰｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ（藤沢薬品工業社、ＢＤ社）、Ｍｏｕｓｅαｈｕ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ＭｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、抗ヒトＡＣＲＰ３０モノクローナル抗体（ＡＸ７７３、ＡＸ７４１、Ｎｅ，Ｎａ、和光純薬工業社）などが挙げられる。抗ヒトアルブミン抗体としては、ＧｏａｔαＡｌｂｕｍｉｎ，ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＢＥＴ、ＡＣＤ、ＢＭＤ）、ＭｏｕｓｅαＡｌｂｕｍｉｎ，ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＮＢＴ、ＺＹＭ、ＭＥＤ）、ＲａｂｂｉｔαＡｌｂｕｍｉｎ，ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＣＬ、ＡＣＭ）、ＧｏａｔαＡｌｂｕｍｉｎ，ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（フナコシ社、ＡＮＴ）などが挙げられる。
【００２０】
本発明の具体的な免疫学的測定方法としては、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＬＴＩＡ（ラテックス免疫比濁法）などの公知の方法を使用することができる。ＥＬＩＳＡの場合、例えば、アディポネクチンを認識する抗体を結合させた不溶性担体とアルブミンを認識する抗体を酵素標識抗体として組み合せる方法、アディポネクチンとアルブミンの複合体を認識する抗体を結合させた不溶性担体によりアディポネクチンとアルブミンの複合体を捕捉し、アディポネクチンを認識する抗体あるいはアルブミンを認識する抗体を酵素標識抗体として組み合せる方法が挙げられる。測定工程に従ってさらに説明する。アディポネクチンを認識する抗体を結合させた不溶性担体と、アディポネクチンとアルブミンの複合体を含む試料を接触、混合させ、前記不溶性担体にアディポネクチンとアルブミンの複合体を捕捉する。次いで、酵素標識したアルブミンを認識する抗体を接触、混合することにより、不溶性担体−アディポネクチンとアルブミンの複合体−酵素標識抗体の三元複合体が形成される。この後、標識抗体中の酵素と適当な該酵素の基質を反応させ、その結果生じる反応生成物に由来する吸光度変化を光学的に測定することでアディポネクチンとアルブミンの複合体を定性的または定量的に測定する。ＬＴＩＡの場合、アディポネクチンとアルブミンの複合体に特異的に結合する抗体を担持させた不溶性担体とアディポネクチンとアルブミンの複合体とを混合することによりアディポネクチンとアルブミンの複合体を介した不溶性担体の架橋（凝集）が起こり、その結果生じる濁りを光学的に測定することでアディポネクチンとアルブミンの複合体を定性的または定量的に測定することができる。ＬＴＩＡは、アディポネクチンとアルブミンの複合体を簡便、迅速かつ正確に測定するには好適である。
【００２１】
本発明に使用される不溶性担体としては、通常の免疫学的測定試薬に使用され工業的に大量生産可能な有機系の不溶性担体が使用される。ＥＬＩＳＡにおいては抗体の吸着性に優れかつ生物学的活性を長期間安定的に保持できるポリスチレン等の９６穴のマイクロプレート、ＬＴＩＡにおいてはポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
【００２２】
上記不溶性担体の表面に抗体を担持させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、担持（感作）方法として不溶性担体表面に抗体を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する不溶性担体表面に既知の方法である物理結合法や化学結合法により抗体を効率的に感作する方法が挙げられる。
【００２３】
抗体を担持させた抗体不溶性担体及び／又は酵素標識抗体とアディポネクチンとアルブミンの複合体との反応は、抗原抗体反応が起こりえる条件であれば、その反応条件は特に限定されない。反応液としては、アディポネクチンとアルブミンの複合体との抗原抗体反応が起こり得る溶液であればどのようなものでも良い。例えば、ｐＨを制御するためのリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝成分、非特異反応を回避するための界面活性剤や塩化ナトリウムなど、安定化剤としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ショ糖、高分子多糖類など、反応性を制御する前記物質の他にデキストランなどの水溶性多糖類、酵素の阻害剤等の添加剤を適宜溶解させても良い。
【００２４】
ＥＬＩＳＡにおける酵素標識抗体は、公知の方法によって調製することができる。例えば、石川らの方法（マレイミド法：「酵素免疫測定法 第３版 医学書院」）等に従い、抗体をそのまま、あるいは必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解してＦ（ａｂ’）２又はＦａｂ’とした後、酵素で標識することができる。標識に使用する酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。さらに、酵素活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）アンモニウム塩等を用いることができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、基質としてｐ−ニトロフェニルフォスフェート等を、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は、基質としてβ−Ｄ−ガラクトピラノシド等を、酵素にグルコースオキシダーゼを用いる場合は、ペルオキシダーゼの共存下で、グルコースオキシダーゼの基質としてβ−Ｄ−グルコース、発色剤として酵素がペルオキシダーゼである場合に使用した発色剤等を用いることができる。
【００２５】
ＥＬＩＳＡにおける酵素標識抗体の酵素活性に由来する基質と酵素の反応生成物を測定する方法は特に限定されない。例えば、酵素がペルオキシダーゼ、基質が過酸化水素、発色剤がｏ−フェニレンジアミンの場合、酵素反応生成物固有の波長、４９２ｎｍにおける吸光度として９６穴マイクロプレートリーダーで読み取ることが可能である。
【００２６】
ＬＴＩＡにおける不溶性担体の凝集程度を測定する方法は特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合は、既知濃度試料の濁度程度と測定試料の濁度程度との比較から、凝集の程度を目視によって判定することも可能である。また、該凝集を定量的に測定する場合は、簡便性及び精度の点からは、光学的に測定することが好ましい。凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加として捕らえる）、粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないしは平均粒径の変化として捕らえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。
【００２７】
ＨＭＷ−Ａｄを分別して免疫測定するための方法について説明する。アディポネクチンが含まれる試料に適当なプロテアーゼを作用させ、ＨＭＷ−Ａｄ以外のアディポネクチンを消化し、プロテアーゼによる消化処理の後、残ったＨＭＷ−Ａｄを、抗アディポネクチン抗体を用いて測定する。ＨＭＷ−Ａｄを分別測定するのに使用されるプロテアーゼとしては、ＨＭＷ−Ａｄを消化せず、それ以外のアディポネクチンを消化するものであればいずれも制限することなく使用することができる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）属由来のプロテイナーゼＫ、アスペルギルス属、バチルス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用される。アスペルギルス属由来のプロテアーゼの市販品の例として、プロテアーゼＰ「アマノ」、プロテアーゼＡ「アマノ」、ウマミザイム（いずれもアマノエンザイム社）、スミチームＭＰ、スミチームＦＰ（新日本化学工業社）などが挙げられ、バチルス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、プロテアーゼＮ「アマノ」（アマノエンザイム社）、プロチンＰＣ（大和化成社）などが挙げられる。これらのプロテアーゼは遺伝子組換え技術により得られたものであっても差し支えない。また化学修飾を施されていてもよい。プロテアーゼ処理の条件は、用いるプロテアーゼによって異なるが、リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、４〜６０℃で５分〜２４時間行うことが好ましい。プロテアーゼの使用濃度は、プロテアーゼの比活性、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね０．０１〜１００ｕ／ｍＬあるいは０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲で使用される。
【００２８】
生体試料をこれらのプロテアーゼで処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄを測定するための抗体としてはアディポネクチンを認識する抗体を使用することができる。抗アディポネクチン−ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、公知の手法によって適当な動物に免疫し得ることができるが、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、抗ヒトアディポネクチン抗体は、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＧＴ社）、ｒａｂｂｉｔαｈｕ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−ＰｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ（藤沢薬品工業社、ＢＤ社）、Ｍｏｕｓｅαｈｕ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ＭｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、抗ヒトＡＣＲＰ３０モノクローナル抗体（ＡＸ７７３、ＡＸ７４１、Ｎｅ，Ｎａ、和光純薬工業社）などが挙げられる。また、市販のアディポネクチン総量を測定するキットも使用することが出来、例えば、「ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）等が挙げられる。さらに、生体試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤及びプロテアーゼの内の少なくともひとつを加えてアディポネクチンに作用させ、多量体アディポネクチンを一定の形態に変換させて免疫学的に測定する本発明者らの開発した方法（特願２００３−３５４７１５を優先権主張してなされた国際出願）も利用できる。
【００２９】
ＭＭＷ−Ａｄを分別して免疫測定するための方法について説明する。ＭＭＷ−Ａｄは、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄを特異的に消化するプロテアーゼを作用させ、消化されずに残存するＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量を求め、その総量からＨＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで算出することが可能である。この方法で使用されるプロテアーゼとしては、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄのみを特異的に消化できるものであればいずれも制限することなく使用することができる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、バチルス属、アスペルギルス属、スタフィロコッカス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用され、例えば、プロテアーゼＳ「アマノ」、プロテアーゼＡ「アマノ」（いずれもアマノエンザイム社）、スミチームＦＰ、スミチームＬＰ５０Ｄ（新日本化学工業社）、プロテアーゼＶ８（生化学工業社）などの市販されているものも利用できる。これらのプロテアーゼは、遺伝子組換え技術により得られたものでもよい。また化学修飾を施したものでもよい。残存するＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量は、市販のアディポネクチン総量を測定するキット等を使用することで求められる。差し引くＨＭＷ−Ａｄ含量は、上記に挙げた方法により測定できる。
【００３０】
生体試料のプロテアーゼ処理方法は、用いるプロテアーゼによって異なるが、リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、４〜６０℃で５分〜２４時間行うことが好ましい。プロテアーゼの使用濃度は、プロテアーゼの比活性、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね０．０１〜１００ｕ／ｍＬあるいは０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲で使用される。免疫測定法は、前述したＬＭＷ−Ａｄを分別測定する方法についての記載を参考に、ＥＬＩＳＡやＬＴＩＡが実施できる。
【００３１】
さらにまた、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄの総量を、ＨＭＷ−Ａｄの分別測定方法の項において述べたプロテアーゼを用いて、変換物の総量として算出し、この量から、先に述べたＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄを特異的に消化できるプロテアーゼを作用させ、変換物の総量として算出される量を差し引くことで、ＭＭＷ−Ａｄの量を算出することも可能である。免疫測定法は、前述したＬＭＷ−ＡｄあるいはＨＭＷ−Ａｄを分別測定する方法についての記載を参考に、ＥＬＩＳＡやＬＴＩＡが実施できる。
【００３２】
ＵＬＭＷ−Ａｄを分別して免疫測定するための方法について説明する。ＵＬＭＷ−Ａｄは、アディポネクチン総量から、前記で測定したＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量を差し引くことにより算出できる。具体例としは、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄを特異的に消化するプロテアーゼを作用させ、消化されずに残存するＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量を求め、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及びＬＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで算出することが可能である。
【００３３】
本発明によれば、ヒト血液中に存在する４種のヒトアディポネクチンが各々分別して測定できる。その結果、２型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患、肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果が評価可能となる。評価の方法としては、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのうちの１種以上の量の変動あるいはＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ及びアディポネクチン総量のうち少なくとも２つの量の比を基準値を設けて観察する方法、同一個体における経時的な変動を観察する方法が挙げられる。さらに特定の疾病や病態において公知の他の指標（例えば、２型糖尿病におけるインスリン、動脈硬化性疾患におけるＨＤＬコレステロールなど）とＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのうちの１種以上の量、あるいはＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ及びアディポネクチン総量のうち少なくとも２つの量の比を関連付けることにより評価を行う方法も挙げることができる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３５】
＜試薬及び材料＞
実施例及び参考例で用いた試薬及び材料は以下の通りである。
ａ．抗体結合樹脂用洗浄液：０．５Ｍ ＮａＣｌ を含む ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ（ｐＨ８．３）。
ｂ．抗体結合樹脂用溶出液：０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）。
ｃ．抗体結合樹脂用中和液：２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）。
ｄ．ＥＬＩＳＡ用プレート：９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ社）。
ｅ．ＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）。
ｆ．ＥＬＩＳＡ用緩衝液：１％ ウシ血清アルブミン、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含む ＰＢＳ（ｐＨ７．４）。
ｇ．Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｍｏｕｓｅ）：フナコシ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＰＫ−６１０２。
ｈ．ＤＡＢ基質キット（ウエスタンブロティング発色基質）：フナコシ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＳＫ−４１００。
ｉ．抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ）：藤沢薬品工業社、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、商品コードＡ１２８２０。
ｊ．ヤギ抗ヒトアディポネクチン−ポリクローナル抗体（Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ）：コスモバイオ社、ＧＴ社、Ｃａｔ Ｎｏ．４２１０６５。
ｋ．ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体：コスモバイオ社、ｃａｐｐｌｅ社。
ｌ．ＥＬＩＳＡ用洗浄液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含むＰＢＳ
ｍ．ＥＬＩＳＡ用緩衝液２：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ。
ｎ．ヤギ抗ヒトアルブミン−ポリクローナルＨＲＰ標識抗体（ＨＲＰ−Ｇｔ抗ＨＳＡ抗体）：ＰＡＲＩＳ社。
ｏ．ＨＲＰ−Ａｖｉｄｉｎ：ＰＩＥＲＣＥ社。
【００３６】
参考例１． 大腸菌リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン（ｒＭｇＡｄ）の調製
マウスアディポネクチンの遺伝子配列（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｕ３７２２２）のグロブラードメイン配列（１０４−２４７残基相当）を６×Ｈｉｓタグを含むｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩに挿入し、大腸菌に組み込んだ。リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン（ｒＭｇＡｄ）を発現した大腸菌からのｒＭｇＡｄの精製は、以下の操作により行った。すなわち、大腸菌の可溶画分をＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ社）に４℃、１６時間添加してｒＭｇＡｄを結合させた後、イミダゾールにより段階的に溶出させ、アディポネクチンを含む画分を回収し、３日間ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析を行なった。得られたｒＭｇＡｄの蛋白質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ を用いて求めた。
【００３７】
参考例２． 抗ｒＭｇＡｄ抗体の作製
参考例１で調製したｒＭｇＡｄの５０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、２匹のウサギに２週間おきに６回免疫して抗血清を作製した。抗血清中の特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いて常法により行なった（抗ｒＭｇＡｄ抗体）。
【００３８】
参考例３． ヒト血中由来多量体アディポネクチン（ｍＡｄ）の精製
参考例２で作製した抗ｒＭｇＡｄ抗体５００ｍｇをＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）５０ｍＬに結合させ抗ｒＭｇＡｄ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂を作製した。ヒト血清２．５Ｌを抗ｒＭｇＡｄ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂に添加し、抗体結合樹脂用洗浄液で十分量洗浄した後、抗体結合樹脂用溶出液でヒト血清アディポネクチン画分（ｍＡｄ）を溶出し、溶出画分に抗体結合樹脂用中和液を１／１０量添加して中和した。さらに、中和した溶出画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂に添加し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂への非吸着画分を精製ｍＡｄとして回収し、「ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）によりアディポネクチン含量を測定した。
【００３９】
参考例４． 抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体の作製
参考例３で得た精製ｍＡｄ ２０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、２匹のマウスに２週間おきに３又は４回免疫を行った後、さらに細胞融合３日前に再投与した。免疫したマウスより脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞と細胞融合を行った。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞の選択は、ＥＬＩＳＡ法によりｍＡｄとの反応性の高いウエルを選択し、ついで限界希釈法にて選択する常法により行なった。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体は、選択した融合細胞をプリスタン処理したマウス腹空内に投与し腹水として回収した。腹水からの特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いて常法により行なった。上記により認識番号；６４４０１〜６４４１１で識別される１１の抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞とモノクローナル抗体が得られた。
【００４０】
実施例１ ヒト血中由来の多量体アディポネクチンの分別精製（１）
参考例３で得た精製ｍＡｄを、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析して脱塩した後、これをＧｅｌａｔｉｎ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業社）カラムに吸着させ、０、１００、２００、３００及び５００ｍＭのＮａＣｌをそれぞれ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて、段階的に溶出させた。得られた各ＮａＣｌ濃度の溶出画分中には、分子量の異なるアディポネクチンが混在していた。得られた各溶出画分を濃縮し、それぞれの溶出画分についてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（分画分子量；１０〜１５００ｋＤａ、平均粒子径４７μｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーをさらに実施した。溶離液には、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムの分子量較正はＧｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて行った。各クロマトグラフィーにおけるアディポネクチンの検出は、「ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）により行った。
【００４１】
ゲルろ過クロマトグラフィーのクロマトグラムを図１に示した。得られた溶出フラクションを、１５０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下（主として１６０ｋＤａ付近）、２００ｋＤａ超４００ｋＤａ未満（主として２６０ｋＤａ付近）、４００ｋＤａ以上８００ｋＤａ以下（主として４５０ｋＤａ付近）の３画分に区別して収集し、多量体アディポネクチン分別精製品とした。なお、各多量体アディポネクチン分別精製品は、１５０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下（主として１６０ｋＤａ付近）のものをＬＭＷ−Ａｄ、２００ｋＤａ超４００ｋＤａ未満（主として２６０ｋＤａ付近）のものをＭＭＷ−Ａｄ、４００ｋＤａ以上８００ｋＤａ以下（主として４５０ｋＤａ付近）のものをＨＭＷ−Ａｄと呼ぶこととした。
【００４２】
前工程で得られた３種の多量体アディポネクチン分別精製品、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄそれぞれを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ポリアクリルアミド濃度２−１５％）（以下、ＰＡＧＥ（２−１５％）のように表記する）にて分離し、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）による蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図２に示した。
【００４３】
ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのいずれについても主たる染色バンド以外のバンドが認められたが、主たる染色バンドに対して検出の程度は僅かであり、分別、精製が達成されていることが確認された。なお、前述したとおりアディポネクチンは、３量体を基本として多量体を形成しているため、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄのいずれについても、ＰＡＧＥで見積もられる分子量とゲルろ過での分子量は必ずしも一致していない。
【００４４】
実施例２ ヒト血中由来の多量体アディポネクチン（ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ）の構造解析
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
実施例１で得られた多量体アディポネクチン分別精製品を、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢ蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図３に示した。
【００４５】
ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄともに６０ｋＤａ付近に、明確な染色バンドが認められた。当該染色バンドは、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、２量体のアディポネクチンと推定された。ＬＭＷ−Ａｄについては、前記６０ｋＤａ以外に、９０ｋＤａ付近に、未同定の明確な染色バンドが認められた。
【００４６】
２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）で９０ｋＤａ付近に泳動される未同定アディポネクチンの分析
前記１）で検出された９０ｋＤａ付近の未同定染色バンドのゲルを切り出し、エレクトロエリューターＭｏｄｅｌ４２２（バイオラッド社）を用いて蛋白を抽出した。抽出された蛋白を２−メルカプトエタノールを含む処理液により煮沸、還元処理し、再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離後、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ＣＢＢ蛋白染色を行なったところ、６０ｋＤａ付近と３０ｋＤａ付近に２本の染色バンドが確認された。
【００４７】
前記６０ｋＤａ付近及び３０ｋＤａのバンド中の蛋白それぞれについて、Ｎ末端アミノ酸配列を分析したところ、６０ｋＤａ付近のバンド中の蛋白のＮ末端アミノ酸配列は、ヒトアルブミンのＮ末端アミノ酸配列と一致した。一方、３０ｋＤａ付近のバンド中の蛋白のＮ末端アミノ酸配列は、アディポネクチンのアミノ酸配列の１９番目からの配列と一致した。
【００４８】
以上の事実より、ＬＭＷ−ＡｄをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）した際に検出される９０ｋＤａ付近の蛋白は、アルブミン１分子とアディポネクチン１分子がジスルフィド結合したヘテロダイマーであることが判明した。従って、ＬＭＷ−Ａｄ画分のアディポネクチンの構造は、３量体アディポネクチンとアルブミンがジスルフィド結合した構造を有していることが判明した。
【００４９】
実施例３ ヒト血中由来の多量体アディポネクチンの分別精製（２）
参考例３の方法に準じて、再度調製された精製ｍＡｄを、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析して脱塩した後、これをＧｅｌａｔｉｎ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業社）カラムに吸着させ、０、１００、２００及び５００ｍＭのＮａＣｌをそれぞれ含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて、段階的に溶出させた。得られた１００ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分には、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄが混在し、２００ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分には、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄが混在したが、５００ｍＭ ＮａＣｌ画分は、ＨＭＷ−Ａｄのみであったことから、５００ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分を、ＨＭＷ−Ａｄ分別精製品とした。次に、上記参考例３の方法に準じて、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ ＡＬＢ ａｎｔｉｂｏｄｙ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ樹脂を作製後、１００ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分を添加し、非吸着画分及び吸着画分を得た。非吸着画分には、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄが混在していたが、吸着画分にはＬＭＷ−Ａｄのみであったことから、これをＬＭＷ−Ａｄ分別精製品とした。さらに、非吸着画分を濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（分画分子量；１０〜１５００ｋＤａ、平均粒子径４７μｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄを分離した。得られたそれぞれの画分を、ＵＬＭＷ−Ａｄ分別精製標品及びＭＭＷ−Ａｄ分別精製品とした。
実施例１の分別精製で得られた情報を基に、さらに分別精製条件を改良した結果、この方法では、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの３種以外に、もう１種（ＵＬＭＷ−Ａｄとした）新たに分離された。
【００５０】
前工程で得られた４種の多量体アディポネクチン分別精製品、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄそれぞれを、非変性条件下、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢ蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図６に示した。
【００５１】
実施例４ ヒト血中由来の多量体アディポネクチン（ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ）の構造解析
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
実施例３で得られた各多量体アディポネクチン分別精製品を、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢ蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図７に示した。
【００５２】
ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄともに６０ｋＤａ付近に、明確な染色バンドが認められた。当該染色バンドは、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、２量体のアディポネクチンと推定された。ＬＭＷ−Ａｄについては、前記６０ｋＤａ以外に、９０ｋＤａ付近に、未同定の明確な染色バンドが認められた。又、ＵＬＭＷ−Ａｄについては、２量体以外に１量体の染色バンドが認められたことから、３量体と推測された。尚、図７の泳動像から、ＬＭＷ−Ａｄの染色バンドが２本確認されるが、共にアルブミンが結合したアディポネクチンであることを確認している。
【００５３】
２）分子内架橋による分子量の推定
実施例３で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて、５〜１０μｇ／ｍＬ程度に希釈し、別に架橋剤であるＢｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（商品名ＢＳ３：ＰＩＥＲＣＥ社製）を２０ｍｇ／ｍＬとなるように精製水で希釈した液と、等量混合後、室温にて３０分間放置した。さらに、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合液に等量添加し、室温で１５分間放置した。これらの各処理液を非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、セミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜を５％ スキムミルク及び０．１％ ＮａＮ３を含むＰＢＳでブロッキング後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで洗浄し、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ）１μｇ／ｍＬを室温で１時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで十分に洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ ｋｉｔ （Ｍｏｕｓｅ） 及びＤＡＢ基質キットを用いて発色させた。
【００５４】
その結果を図８に示した。分子量マーカーより分子量較正した結果、ＵＬＭＷ−Ａｄは、約１００ｋＤａ付近に染色バンドが認められ、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、３量体であることが確認された。ＬＭＷ−Ａｄは、約１５０ｋＤａ付近に染色バンドが認められ、上記で得られたアルブミンが結合した３量体であることが、分子量からも確認された。ＭＭＷ−Ａｄは、２５０ｋＤａ付近に染色バンドが認められ、６又は９量体を形成しているものと推測された。ＨＭＷ−Ａｄは、非常に高分子位置に染色バンドが確認され、かなり分子量が大きく、少なくとも、３００ｋＤａ以上はあるものと推測され、１２量体又は１８量体程度と推定されるが、正確な形態は不明である。
【００５５】
実施例５ ヒト血清中のアディポネクチンのウェスタンブロッティング解析
健常者８名の血清０．２μＬ分を、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、セミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜を５％スキムミルク及び０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）でブロッキング後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）で洗浄し、抗アディポネクチン−モノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ；藤沢薬品工業社、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）１μｇ／ｍＬを室温で１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）で十分に洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ ｋｉｔ （Ｍｏｕｓｅ） 及びＤＡＢ基質キット（フナコシ社）を用いて発色させた。
【００５６】
実施例１で調製したＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ画分と同じ位置にメインバンドとして発色を認めたことから、この３種のアディポネクチンが血中に存在する主なものであることが判明した（図４）。
又、ＵＬＭＷ−Ａｄについては、存在量が少ない為か不明であるが、ほとんど染色バンドが認められなかった（図４）。
【００５７】
実施例６ アルブミン結合型アディポネクチンの測定（１）
ＥＬＩＳＡ用プレートにヤギ抗ヒトアディポネクチンポリクローナル抗体（Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ）をＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液で１μｇ／ｍＬに希釈した後、感作した。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でブロッキング後、実施例１で調製したＬＭＷ−ＡｄをＥＬＩＳＡ用緩衝液で１、０．１、０．０１μｇ／ｍＬ（Ａｄ含量として）の濃度に希釈し室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／２０００倍希釈した抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体（特開２００１−３３７０９２）液を室温で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／１０００倍希釈したヤギ抗マウス（Ｇｏａｔαｍｏｕｓｅ） ＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体液を室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄後、ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）と過酸化水素の基質を用いたＨＲＰの酵素反応により発色させ、２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸収を測定した。測定結果を図５に示す。
【００５８】
濃度依存的な吸光度の増加が観察され、サンドイッチ免疫測定法が成立したことより、ＬＭＷ−Ａｄは、アディポネクチンにアルブミンが結合したもの（アルブミン結合型アディポネクチン）であることがわかった。また、本実施例の方法によりＬＭＷ−Ａｄを分別測定できることもわかった。
【００５９】
実施例７ アルブミン結合型アディポネクチンの測定（２）
（１）希釈直線性
ＥＬＩＳＡ用プレートに、ＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液で５μｇ／ｍＬに希釈した抗アディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０２）を、感作した。次に、２０％ヤギ血清を含むＥＬＩＳＡ用緩衝液でブロッキング後、実施例３で調製したＬＭＷ−Ａｄ精製品をＥＬＩＳＡ用緩衝液で０〜２０ｎｇ／ｍＬ（Ａｄ含量として）の濃度範囲に希釈し、に希釈し室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトアルブミン（ＨＲＰ−Ｇｔ抗ＨＳＡ）抗体液を室温で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄し、ＯＰＤ発色液（２ｍｇ／ｍＬ オルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％ 過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）により発色させ、停止液（１．５Ｎ 硫酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。測定結果を図９に示す。
【００６０】
濃度依存的な吸光度の増加が観察され、サンドイッチ免疫測定法が成立したことより、ＬＭＷ−Ａｄは、アディポネクチンにアルブミンが結合したもの（アルブミン結合型アディポネクチン）であることが再度確認された。
【００６１】
（２）添加回収試験
人血清を、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で１００〜８００倍希釈したものに、実施例３で調製したＬＭＷ−Ａｄ精製品を０〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で添加し、前記（１）と同様のＥＬＩＳＡ系にて測定後、添加量と実測値からの回収率を求めた。その結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
いずれの場合も、良好な回収率が得られ、本実施例の方法によりＬＭＷ−Ａｄを分別測定できることもわかった。
【００６４】
実施例８ プロテアーゼ処理（１）
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、参考例３で得た精製ｍＡｄ及び各種市販プロテアーゼを添加し、３７℃で６０分間加温した。その処理液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、プロテアーゼ非添加試料を対照として、各画分への作用を、ＣＢＢ蛋白染色像にて比較した（表２）。
【００６５】
処理条件１〜２に使用のプロテアーゼ処理では、ＬＭＷ−Ａｄ画分は消失するが、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認された。さらに、明確な変換物は確認されなかった。一方、処理条件３〜４に使用のプロテアーゼ処理では、ＬＭＷ−Ａｄは消失し、ＭＭＷ−Ａｄ画分及びＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認され、さらに、低分子量領域にＬＭＷ−Ａｄ由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。さらに、処理条件５〜６に使用のプロテアーゼ処理では、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ画分は消失し、ＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認され、さらに、低分子量領域にＬＭＷ−Ａｄ由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。これら変換物のＰＡＧＥ（２−１５％）での染色バンドの検出位置は、用いるプロテアーゼにより、若干異なる場合があるものの、３０−４２ｋＤａの範囲で検出された。この結果より、処理条件１及び２での処理により、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量、処理条件３及び４での処理により、ＬＭＷ−Ａｄのみ又はＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量、処理条件５及び６での処理により、ＨＭＷ−Ａｄのみ又はＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量を測定可能となることがわかった。
【００６６】
【表２】
【００６７】
実施例９ プロテアーゼ処理（２）
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、実施例３で解析された精製ｍＡｄ及び各種市販プロテアーゼを１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で３０分間加温した。その処理液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、プロテアーゼ非添加試料を対照として、各画分へのプロテアーゼの作用を、ＣＢＢ蛋白染色像にて比較した（表３）。
【００６８】
処理条件７〜９に使用のプロテアーゼ処理では、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄ画分は消失するが、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認された。さらに、低分子量領域にＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄ由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。さらに、処理条件１０〜１２に使用のプロテアーゼ処理では、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ画分は消失し、ＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認され、さらに、低分子量領域にＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。これら変換物のＰＡＧＥ（２−１５％）での染色バンドの検出位置は、用いるプロテアーゼにより、若干異なる場合があるものの、３０−４０ｋＤａ付近で検出された。この結果より、処理条件７〜９で使用のプロテアーゼを用いることにより、残存するＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量若しくは、新たに生成するＡｄ変換生成物を測定することにより、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄの総量の分別測定が可能となることがわかった。又、処理条件１０〜１２で使用のプロテアーゼを用いることにより、残存するＨＭＷ−Ａｄ量、若しくはＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄの総量も分別測定が可能である。
【００６９】
【表３】
【００７０】
実施例１０ ＨＭＷ−Ａｄの測定用のプロテアーゼ処理
参考例３で得られた、抗体結合樹脂非吸着画分（以下、「Ａｄ除去血漿」という）に、実施例３で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、最終濃度で１０μｇ／ｍＬ程度となるように添加したものを検討用試料とした。又、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、プロテイナーゼＫを５〜１０ｕ／ｍＬとなるように溶解したものを前処理用酵素液とした。各検討用試料１０μＬに前処理用酵素液９０μＬを加え、３７℃で１０〜３０分間反応させた後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、２％ ＳＤＳ含有）を４００μＬ加え、酵素反応（前処理）を停止させた。この反応液２０μＬに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２を１．０ｍＬ添加して希釈し、前処理済み試料とした。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ＥＬＩＳＡ系にて、残存するアディポネクチン含量を算出した。
【００７１】
実施例１１ ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ合計量測定用のプロテアーゼ処理
実施例１０と同様に、Ａｄ除去血漿に、実施例３で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、最終濃度で１０μｇ／ｍＬ程度となるように添加したものを検討用試料とした。又、５０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、プロテアーゼＡ「アマノ」を０．６〜１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解したものを前処理用酵素液とした。各検討用試料１０μＬに前処理用酵素液９０μＬを加え、３７℃で１０〜３０分間反応させた後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、２％ ＳＤＳ含有）を４００μＬ加え、酵素反応（前処理）を停止させた。この反応液２０μＬに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２を１．０ｍＬ添加して希釈し、前処理済み試料とした。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ＥＬＩＳＡ系にて、残存するアディポネクチン含量を算出した。
【００７２】
実施例１２ アディポネクチン総量測定用試料の調製
生体試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤及びプロテアーゼの内の少なくともひとつを加え、アディポネクチンに作用させ、多量体アディポネクチンを一定の形態に変換させて免疫学的に測定する本発明者らの開発した方法（特願２００３−３５４７１５を優先権主張してなされた国際出願）から、酸と界面活性剤で前処理する方法を使用した。すなわち、人血漿又は人血清１０μＬに、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、２％ＳＤＳ含有）を４９０μＬ加え十分に攪拌し、当該混液２０μＬに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２を１．０ｍＬ添加して希釈し、前処理済み試料として。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ＥＬＩＳＡ系にて、アディポネクチン総量を算出した。
【００７３】
実施例１３ アディポネクチン測定用ＥＬＩＳＡ系
ＥＬＩＳＡ用プレートにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０５）を感作した。次に、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２でブロッキング後、実施例１０又は１１で調製された各前処理済み試料を添加し、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で２０００倍希釈したＢｉｏｔｉｎ標識抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０４）を室温で１時間反応させた後、さらに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で２０００倍希釈したＨＲＰ−Ａｖｉｄｉｎを添加し、室温で３０分間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄し、ＯＰＤ発色液（２ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）により発色させ、停止液（１．５Ｎ硫酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。前処理用酵素液９０μＬと１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、２％ ＳＤＳ含有）４００μＬの混液に検討用試料１０μＬを加えたものを標準試料として同様にＥＬＩＳＡ測定を行い、得られた発色値を１００％として、実施例１０及び１１の各検討試料の発色値を％換算した。換算された％発色値を各条件毎に平均し、実施例１０の試料について図１０、実施例１１の試料について図１１に示した。
【００７４】
図１０の結果から、プロテイナーゼＫによるプロテアーゼ処理により、血漿中のＨＭＷ−Ａｄ以外の多量体Ａｄが消化され、ＨＭＷ−Ａｄが特異的に測定できることが判明した。又、図１１の結果から、プロテアーゼＡ「アマノ」によるプロテアーゼ処理により、血漿中のＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ以外の多量体Ａｄが消化され、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量が特異的に測定できることが判明した。ＭＭＷ−Ａｄの濃度については、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量から、ＨＭＷ−Ａｄの濃度を差し引くことで、算出することが可能である。
【００７５】
以上の事実より、実施例１２の前処理を行ったのち試料中のアディポネクチン総量を測定し、実施例６又は７の方法で求められるＬＭＷ−Ａｄ濃度及び実施例１１及び１３の方法で求められるＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量を、アディポネクチン総量から差し引くことにより、ＵＬＭＷ−Ａｄ濃度も算出することが可能であることも分かる。これらのことから、人血中に存在する４種の多量体Ａｄの総量及び分別測定は、可能となった。
【００７６】
実施例１４ 動脈硬化性疾患との関係
インスリン治療を行っていない２型糖尿病患者２９８名中、冠動脈造影検査（ＣＡＧ）により器質的病変を認めた９０名を冠動脈疾患（ＣＡＤ）群、残りの２０８名を非冠動脈疾患（ＮＣＡＤ）群に分け、前記実施例で挙げた方法を用いて、患者血漿中の総アディポネクチン（Ｔ．Ａｄ）含量測定及び各多量体アディポネクチンの分別測定を実施した。即ち、Ｔ．Ａｄ含量は実施例１２及び１３の方法、ＨＭＷ−Ａｄ含量は実施例１０及び１３の方法、ＭＭＷ−Ａｄ含量は実施例１１及び１３の方法でＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ合計量を算出し、さらにＨＭＷ−Ａｄ含量を差し引くことで求めた。ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄの合計量は、Ｔ．Ａｄ含量からＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ合計量を差し引くことによって求めた。求められたそれぞれの値で、ＣＡＤ群及びＮＣＡＤ群間の有意差検定を、ｔ検定を用いて行った。
【００７７】
その結果を表４に示す。Ｔ．Ａｄ含量では、ＣＡＤ群とＮＣＡＤ群間で、有意差は認められなかったが、ＨＭＷ−Ａｄ含量では、有意差を認め（ｐ＜０．０５）。さらに、Ｔ．Ａｄ含量に対するＨＭＷ−Ａｄ含量比（％）でも、明確な有意差を認めた（ｐ＜０．０００１）。この結果から、Ｔ．Ａｄ含量よりも、ＨＭＷ−Ａｄ含量や特にそのＴ．Ａｄ含量に占める割合（％）が、ＣＡＤを正確に反映することが示された。
【００７８】
【表４】
【００７９】
実施例１５ メタボリックシンドロームとの関係
実施例１４で挙げた２９８名について、総アディポネクチン量（Ｔ．Ａｄ）及びＴ．Ａｄ量に占めるＨＭＷ−Ａｄ量の割合、すなわちＨＭＷ−Ａｄ／Ｔ．Ａｄ×１００％（ＨＭＷ−Ｒ）を基に、次に示す基準で、４群に分類した。まず、Ｔ．Ａｄの平均値及びＨＭＷ−Ｒの平均値をそれぞれ算出した結果、それぞれ９．８μｇ／ｍＬ及び３２％であった。次にＴ．Ａｄ値及びＨＭＷ−Ｒ値がともに平均値未満の患者をＡ群、Ｔ．Ａｄ値が平均値未満で、ＨＭＷ−Ｒ値が平均値以上である患者をＢ群、Ｔ．Ａｄ値が平均値以上で、ＨＭＷ−Ｒ値が平均値未満である患者をＣ群及びＴ．Ａｄ値及びＨＭＷ−Ａｄ値がともに平均値以上である患者をＤ群に分類した。さらに、各群内において、米国のＡｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ（ＡＴＰＩＩＩ）によって提唱されているメタボリックシンドロームの診断基準（ＪＡＭＡ，２８５：２４８６，２００１）に照らし合わせ、５項目のリスクファクターの内、２項目以上基準値を超える患者と２項目未満の患者の２グループに分けた（本来、ＡＴＰＩＩＩの診断基準では、３項目以上基準値を超える場合をメタボリックシンドロームとしているが、今回はより厳しい条件とした）。その結果を、表５に示す。
【００８０】
「メタボリックシンドローム診断基準項目数とＴ．Ａｄ値及びＨＭＷ−Ｒ値には統計学的に有意な関係がある」ことがクラスカル・ワーリス検定の結果、判明した（ｐ値＝０．００１）。さらに、ＨＭＷ−Ｒ値が平均値以下であるＡ群及びＣ群において、メタボリックシンドローム診断基準項目数が２項目以上である患者割合が多いことが判明した。この結果は、Ｔ．Ａｄ値に比較して、ＨＭＷ−Ｒ値の方が、メタボリックシンドロームとの関係を表す上でより好適な指標となることを示している。即ち、ＨＭＷ−Ｒ値を測定し、メタボリックシンドロームの指標として用いる事がメタボリックシンドロームの予知や予防にとって有効であることを、今回初めて見出した。
【００８１】
【表５】
【００８２】
以上の結果から、総アディポネクチン含量を指標としただけでは、疾病や病態の評価が出来ない場合においても、多量体Ａｄの特定の画分を測定することや総アディポネクチン含量に占める特定の画分の割合を見ることによって、疾病の予知や予防、病態の把握が可能となることが判った。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中に含まれる種々の多量体アディポネクチンを分別して免疫学的に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチンは、脂肪細胞から特異的に分泌されるインスリン感受性ホルモンであり、血中に比較的高濃度（５〜１０μｇ／ｍＬ）存在している。アディポネクチンの生理的な作用については、本発明者らにより、アディポネクチンの量的な減少が、肥満による２型糖尿病や脂肪萎縮性糖尿病における糖・脂質代謝異常を引き起こす原因の一つであることが報告され（非特許文献１）、医学的な利用については、糖代謝異常の診断、特にインスリン抵抗性改善薬であるチアゾリジン誘導体の治療効果のモニタリングへの利用（特許文献１）、肝星細胞の活性化及び増殖の抑制、細胞外マトリックス産生の抑制などの作用を利用した肝繊維化抑制剤（特許文献２）が提案されている。
【０００３】
アディポネクチンは、構造上Ｃ１ｑ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ １ｑ）ファミリーに属し、Ｃ１ｑファミリーの特徴であるコラーゲン様ドメインを有していることから、３量体を基本とした多量体を形成して存在していることが報告されている（非特許文献２、３）。
【０００４】
アディポネクチンの構造上の相違と生理的作用、活性等との関係に関しては、Ｔｓａｏらが、ＮＦ−κＢの活性化作用について、３量体を超える多量体アディポネクチンにのみ活性が認められ、３量体やコラーゲン様ドメインが欠落したグロブラー（ｇｌｏｂｕｌａｒ：球状）ドメインには、活性化作用が認められなかったことを報告している。また、Ｕｔｐａｌらは、インスリンやグルコース投与により、高分子画分アディポネクチンのみが有意に低下することや、血糖降下作用は、コラーゲン様ドメインのシステインをセリンに変換したアディポネクチンや還元処理したアディポネクチンで強く、還元未処理及びｇｌｏｂｕｌａｒ アディポネクチンではほとんど示さなかったことを報告している（非特許文献４）。
【０００５】
しかしながら、これらの報告で検討に使用されたアディポネクチンは、大腸菌等における遺伝子組換えにより発現されたものであり、生体内で分泌されたアディポネクチンの挙動や作用を正確に反映していない可能性が考えられる。また、血中アディポネクチン濃度には性差があることが知られており、女性は男性と比較して有意に高値化している（非特許文献５）ことが報告される一方、マウス血清での成績ではあるが、特に高分子画分アディポネクチンの含量が高いことも報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
このように、アディポネクチンの構造上の相違と生理的作用や、疾病とアディポネクチンとの関係について、アディポネクチンの総量のみの測定によっては得ることができない情報があるため、生体試料中に存在する種々のアディポネクチン多量体を分別して測定することができる方法が要望されていた。
【０００７】
アディポネクチンを測定する方法としては、測定用の試料を予めドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下に煮沸処理した後、免疫学的に測定をする方法が開示（特許文献３）されている。この方法は立体構造上隠れている、抗体の認識部位を前記処理により露出させて免疫学的にアディポネクチンの総量を測定しようとする方法であり、種々の多量体を分別して測定することはできない。
【０００８】
また、測定試料中のアディポネクチンを、ＳＤＳ変性処理や熱変性処理を行わずに測定する方法（特許文献２では天然型の測定と称している）が開示されている（特許文献２）が、分別測定に関する記載はなく、利用できるものではない。
【特許文献１】国際公開 ＷＯ ０３／０１６９０６公報
【特許文献２】特開２００２−３６３０９４公報
【特許文献３】特開２０００−３０４７４８公報
【非特許文献１】Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ．， ７， ９４１−９４６， ２００１
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｏ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２０， ８０３−８１２， １９９６
【非特許文献３】Ｔｓａｏ Ｔ−Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ２９３５９−２９３６２， ２００２
【非特許文献４】Ｕｔｐａｌ Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ９０７３−９０８５， ２００３
【非特許文献５】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ．， １０３， １３７−１４２， ２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生体試料中で種々の多量体を形成して存在しているアディポネクチンを分別して測定する方法を提供することを目的とし、さらに、分別測定することによりアディポネクチンの総量測定のみでは得られない情報を得、アディポネクチンの生理的作用や、疾病とアディポネクチンとの関係をより正確に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究したところ、血液中のアディポネクチンは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより見積もられる分子量から、１５０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下（主として１６０ｋＤａ付近）（以下、ＬＭＷ−Ａｄと表記する。）、２００ｋＤａ超４００ｋＤａ未満（主として２６０ｋＤａ付近）（以下、ＭＭＷ−Ａｄと表記する。）及び４００ｋＤａ以上８００ｋＤａ以下（主として４５０ｋＤａ付近）（以下、ＨＭＷ−Ａｄと表記する。）で区別できる３種が存在することを確認し、さらに検討を続けたところ、人血液中から４種の多量体アディポネクチンの分別精製標品を得ることに成功した。これら４種は、非変性系のポリアクリルアミド（２−１５％）による電気泳動（以降、「ＰＡＧＥ（２−１５％）」のように表記することがある）にて分離可能であり、移動度の大きい側から順に、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄと表記して区別した。これら４種のうちＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄは前記血清中の３種のアディポネクチンにそれぞれ対応していた。そしてＬＭＷ−Ａｄが、３量体アディポネクチンにアルブミンがジスルフィド結合したものであること、及び、少なくともアディポネクチンに対する抗体とアルブミンに対する抗体を組合わせて使用することで、ＬＭＷ−Ａｄを分別測定できることを見出し、又、分子内架橋後のＳＤＳ−ポリアクリルアミド（２−１５％）による電気泳動（以降、方法について「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と表記することがある）での分子量算出から、ＵＬＭＷ−Ａｄが、アディポネクチンの３量体であることを解明し、ＭＭＷ−Ａｄは６〜９量体程度、ＨＭＷ−ＡｄはＭＭＷ−Ａｄの２倍以上の会合体を形成していることを推測するに至った。
【００１１】
さらにこれらの知見に基づき、アディポネクチンが含まれる試料に適当なプロテアーゼを作用させることによって、ＨＭＷ−Ａｄ以外のアディポネクチンを消化しうることを見出し、プロテアーゼによる消化処理の後、残ったＨＭＷ−Ａｄを、抗アディポネクチン抗体を用いて分別測定できることを見出した。
【００１２】
さらに、試料中のＭＭＷ−Ａｄ量を、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄをプロテアーゼ処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄ量及びＭＭＷ−Ａｄ量の合計量を算出し、該合計量からさらにＨＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで、算出できること、試料中のＵＬＭＷ−Ａｄ量を、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄをプロテアーゼ処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄ量及びＭＭＷ−Ａｄ量の合計量を算出し、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及びＬＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで、算出できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【００１３】
すなわち、本発明は、多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法を提供するものである。
さらに本発明は、人血中由来多量体アディポネクチンが下記の４種であり、その内の１種又は２種を、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中のアディポネクチンの測定方法を提供するものである。
（１）ＵＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１００ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（２）ＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＵＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１５０ｋＤａ付近にあり、さらにアルブミンがジスルフィド結合しているアディポネクチン。
（３）ＭＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２５０ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（４）ＨＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が小さく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が少なくとも３００ｋＤａ以上であるアディポネクチン。
【００１４】
また本発明は、上記の４種のアディポネクチンのうちの１種又は２種を、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定し、その結果を基に、疾病又は病態に関する情報を得ることを特徴とする、疾病又は病態の評価方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄを分別して測定できることから、アディポネクチンの生理的作用や、疾病又は病態、特に２型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患、肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果をより正確に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１における多量体アディポネクチンのゲルろ過クロマトグラムである。
【図２】実施例１において、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−ＡｄをそれぞれＰＡＧＥ（２−１５％）し、ＣＢＢ蛋白染色した、泳動像の図である。
【図３】実施例２において、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−ＡｄをそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）し、ＣＢＢ蛋白染色した、泳動像の図である。
【図４】実施例５において、ヒト血清中のアディポネクチンを、ウェスタンブロッティング法により解析した図である。
【図５】実施例６において、ＬＭＷ−Ａｄ（アルブミン結合型アディポネクチン）を免疫測定法により測定した結果を示す図である。
【図６】実施例３において、ヒト由来ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄの精製品をそれぞれＰＡＧＥ（２−１５％）し、ＣＢＢ蛋白染色した、泳動像の図である。
【図７】実施例４において、ヒト由来ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄの精製品をそれぞれ非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）し、ＣＢＢ蛋白染色した、泳動像の図である。
【図８】実施例４において、ヒト由来ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄの精製品をそれぞれ分子内架橋後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）し、ウェスタンブロッティング法により解析した図である。
【図９】実施例７において、ＬＭＷ−Ａｄ（アルブミン結合型アディポネクチン）を免疫測定法により測定した結果を示す図である。
【図１０】実施例１３におけるプロテイナーゼＫの多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。
【図１１】実施例１３におけるプロテアーゼＡ「アマノ」の多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明において使用できる生体試料としては、多量体アディポネクチンを含有するものであれば、すべて対象となり、ヒト、サル、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット及びその他の哺乳類の動物から得られた血液、尿などの体液、組織抽出液や組織由来の細胞の培養上清液などが挙げられる。これらのうち、アディポネクチンの生理的作用や、疾病又は病態の正確な評価のための試料としては、血液（血清、血漿）が好適である。試料の採取方法は、分別測定するという目的を考慮し、試料中に存在するアディポネクチンに影響を与えない方法であれば使用可能である。例えば、ヒト血液を試料とする場合、評価の目的により、空腹時採血、薬物投与後採血など適宜選択することが好ましい。
【００１８】
ＬＭＷ−Ａｄを分別して免疫測定するための方法について説明する。ＬＭＷ−Ａｄを認識する抗体によりＬＭＷ−Ａｄを捕捉、検出する方法である。
【００１９】
ＬＭＷ−Ａｄを認識する抗体によりＬＭＷ−Ａｄを捕捉、検出する方法に使用される抗体は、ＬＭＷ−Ａｄが３量体アディポネクチンとアルブミンとの複合体であることから、当該複合体を認識して捕捉・検出し得るものであれば、特に制限を受けることなく使用できる。このような抗体の好適な例として、アディポネクチンを認識する抗体とアルブミンを認識する抗体の組み合わせ、あるいは、アディポネクチンとアルブミンとの複合体を特異的に認識する抗体が挙げられる。アディポネクチン、アルブミン、アディポネクチンとアルブミンとの複合体をそれぞれ認識するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、公知の手法によって適当な動物に免疫して得ることができる。これらの抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、抗ヒトアディポネクチン抗体としては、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＧＴ社）、ｒａｂｂｉｔαｈｕ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−ＰｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ（藤沢薬品工業社、ＢＤ社）、Ｍｏｕｓｅαｈｕ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ＭｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、抗ヒトＡＣＲＰ３０モノクローナル抗体（ＡＸ７７３、ＡＸ７４１、Ｎｅ，Ｎａ、和光純薬工業社）などが挙げられる。抗ヒトアルブミン抗体としては、ＧｏａｔαＡｌｂｕｍｉｎ，ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＢＥＴ、ＡＣＤ、ＢＭＤ）、ＭｏｕｓｅαＡｌｂｕｍｉｎ，ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＮＢＴ、ＺＹＭ、ＭＥＤ）、ＲａｂｂｉｔαＡｌｂｕｍｉｎ，ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＣＬ、ＡＣＭ）、ＧｏａｔαＡｌｂｕｍｉｎ，ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（フナコシ社、ＡＮＴ）などが挙げられる。
【００２０】
本発明の具体的な免疫学的測定方法としては、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＬＴＩＡ（ラテックス免疫比濁法）などの公知の方法を使用することができる。ＥＬＩＳＡの場合、例えば、アディポネクチンを認識する抗体を結合させた不溶性担体とアルブミンを認識する抗体を酵素標識抗体として組み合せる方法、アディポネクチンとアルブミンの複合体を認識する抗体を結合させた不溶性担体によりアディポネクチンとアルブミンの複合体を捕捉し、アディポネクチンを認識する抗体あるいはアルブミンを認識する抗体を酵素標識抗体として組み合せる方法が挙げられる。測定工程に従ってさらに説明する。アディポネクチンを認識する抗体を結合させた不溶性担体と、アディポネクチンとアルブミンの複合体を含む試料を接触、混合させ、前記不溶性担体にアディポネクチンとアルブミンの複合体を捕捉する。次いで、酵素標識したアルブミンを認識する抗体を接触、混合することにより、不溶性担体−アディポネクチンとアルブミンの複合体−酵素標識抗体の三元複合体が形成される。この後、標識抗体中の酵素と適当な該酵素の基質を反応させ、その結果生じる反応生成物に由来する吸光度変化を光学的に測定することでアディポネクチンとアルブミンの複合体を定性的または定量的に測定する。ＬＴＩＡの場合、アディポネクチンとアルブミンの複合体に特異的に結合する抗体を担持させた不溶性担体とアディポネクチンとアルブミンの複合体とを混合することによりアディポネクチンとアルブミンの複合体を介した不溶性担体の架橋（凝集）が起こり、その結果生じる濁りを光学的に測定することでアディポネクチンとアルブミンの複合体を定性的または定量的に測定することができる。ＬＴＩＡは、アディポネクチンとアルブミンの複合体を簡便、迅速かつ正確に測定するには好適である。
【００２１】
本発明に使用される不溶性担体としては、通常の免疫学的測定試薬に使用され工業的に大量生産可能な有機系の不溶性担体が使用される。ＥＬＩＳＡにおいては抗体の吸着性に優れかつ生物学的活性を長期間安定的に保持できるポリスチレン等の９６穴のマイクロプレート、ＬＴＩＡにおいてはポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
【００２２】
上記不溶性担体の表面に抗体を担持させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、担持（感作）方法として不溶性担体表面に抗体を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する不溶性担体表面に既知の方法である物理結合法や化学結合法により抗体を効率的に感作する方法が挙げられる。
【００２３】
抗体を担持させた抗体不溶性担体及び／又は酵素標識抗体とアディポネクチンとアルブミンの複合体との反応は、抗原抗体反応が起こりえる条件であれば、その反応条件は特に限定されない。反応液としては、アディポネクチンとアルブミンの複合体との抗原抗体反応が起こり得る溶液であればどのようなものでも良い。例えば、ｐＨを制御するためのリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝成分、非特異反応を回避するための界面活性剤や塩化ナトリウムなど、安定化剤としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ショ糖、高分子多糖類など、反応性を制御する前記物質の他にデキストランなどの水溶性多糖類、酵素の阻害剤等の添加剤を適宜溶解させても良い。
【００２４】
ＥＬＩＳＡにおける酵素標識抗体は、公知の方法によって調製することができる。例えば、石川らの方法（マレイミド法：「酵素免疫測定法 第３版 医学書院」）等に従い、抗体をそのまま、あるいは必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解してＦ（ａｂ’）２又はＦａｂ’とした後、酵素で標識することができる。標識に使用する酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。さらに、酵素活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）アンモニウム塩等を用いることができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、基質としてｐ−ニトロフェニルフォスフェート等を、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は、基質としてβ−Ｄ−ガラクトピラノシド等を、酵素にグルコースオキシダーゼを用いる場合は、ペルオキシダーゼの共存下で、グルコースオキシダーゼの基質としてβ−Ｄ−グルコース、発色剤として酵素がペルオキシダーゼである場合に使用した発色剤等を用いることができる。
【００２５】
ＥＬＩＳＡにおける酵素標識抗体の酵素活性に由来する基質と酵素の反応生成物を測定する方法は特に限定されない。例えば、酵素がペルオキシダーゼ、基質が過酸化水素、発色剤がｏ−フェニレンジアミンの場合、酵素反応生成物固有の波長、４９２ｎｍにおける吸光度として９６穴マイクロプレートリーダーで読み取ることが可能である。
【００２６】
ＬＴＩＡにおける不溶性担体の凝集程度を測定する方法は特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合は、既知濃度試料の濁度程度と測定試料の濁度程度との比較から、凝集の程度を目視によって判定することも可能である。また、該凝集を定量的に測定する場合は、簡便性及び精度の点からは、光学的に測定することが好ましい。凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加として捕らえる）、粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないしは平均粒径の変化として捕らえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。
【００２７】
ＨＭＷ−Ａｄを分別して免疫測定するための方法について説明する。アディポネクチンが含まれる試料に適当なプロテアーゼを作用させ、ＨＭＷ−Ａｄ以外のアディポネクチンを消化し、プロテアーゼによる消化処理の後、残ったＨＭＷ−Ａｄを、抗アディポネクチン抗体を用いて測定する。ＨＭＷ−Ａｄを分別測定するのに使用されるプロテアーゼとしては、ＨＭＷ−Ａｄを消化せず、それ以外のアディポネクチンを消化するものであればいずれも制限することなく使用することができる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）属由来のプロテイナーゼＫ、アスペルギルス属、バチルス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用される。アスペルギルス属由来のプロテアーゼの市販品の例として、プロテアーゼＰ「アマノ」、プロテアーゼＡ「アマノ」、ウマミザイム（いずれもアマノエンザイム社）、スミチームＭＰ、スミチームＦＰ（新日本化学工業社）などが挙げられ、バチルス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、プロテアーゼＮ「アマノ」（アマノエンザイム社）、プロチンＰＣ（大和化成社）などが挙げられる。これらのプロテアーゼは遺伝子組換え技術により得られたものであっても差し支えない。また化学修飾を施されていてもよい。プロテアーゼ処理の条件は、用いるプロテアーゼによって異なるが、リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、４〜６０℃で５分〜２４時間行うことが好ましい。プロテアーゼの使用濃度は、プロテアーゼの比活性、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね０．０１〜１００ｕ／ｍＬあるいは０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲で使用される。
【００２８】
生体試料をこれらのプロテアーゼで処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄを測定するための抗体としてはアディポネクチンを認識する抗体を使用することができる。抗アディポネクチン−ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、公知の手法によって適当な動物に免疫し得ることができるが、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、抗ヒトアディポネクチン抗体は、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＧＴ社）、ｒａｂｂｉｔαｈｕ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−ＰｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ（藤沢薬品工業社、ＢＤ社）、Ｍｏｕｓｅαｈｕ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ＭｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、抗ヒトＡＣＲＰ３０モノクローナル抗体（ＡＸ７７３、ＡＸ７４１、Ｎｅ，Ｎａ、和光純薬工業社）などが挙げられる。また、市販のアディポネクチン総量を測定するキットも使用することが出来、例えば、「ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）等が挙げられる。さらに、生体試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤及びプロテアーゼの内の少なくともひとつを加えてアディポネクチンに作用させ、多量体アディポネクチンを一定の形態に変換させて免疫学的に測定する本発明者らの開発した方法（特願２００３−３５４７１５を優先権主張してなされた国際出願）も利用できる。
【００２９】
ＭＭＷ−Ａｄを分別して免疫測定するための方法について説明する。ＭＭＷ−Ａｄは、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄを特異的に消化するプロテアーゼを作用させ、消化されずに残存するＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量を求め、その総量からＨＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで算出することが可能である。この方法で使用されるプロテアーゼとしては、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄのみを特異的に消化できるものであればいずれも制限することなく使用することができる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、バチルス属、アスペルギルス属、スタフィロコッカス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用され、例えば、プロテアーゼＳ「アマノ」、プロテアーゼＡ「アマノ」（いずれもアマノエンザイム社）、スミチームＦＰ、スミチームＬＰ５０Ｄ（新日本化学工業社）、プロテアーゼＶ８（生化学工業社）などの市販されているものも利用できる。これらのプロテアーゼは、遺伝子組換え技術により得られたものでもよい。また化学修飾を施したものでもよい。残存するＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量は、市販のアディポネクチン総量を測定するキット等を使用することで求められる。差し引くＨＭＷ−Ａｄ含量は、上記に挙げた方法により測定できる。
【００３０】
生体試料のプロテアーゼ処理方法は、用いるプロテアーゼによって異なるが、リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、４〜６０℃で５分〜２４時間行うことが好ましい。プロテアーゼの使用濃度は、プロテアーゼの比活性、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね０．０１〜１００ｕ／ｍＬあるいは０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲で使用される。免疫測定法は、前述したＬＭＷ−Ａｄを分別測定する方法についての記載を参考に、ＥＬＩＳＡやＬＴＩＡが実施できる。
【００３１】
さらにまた、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄの総量を、ＨＭＷ−Ａｄの分別測定方法の項において述べたプロテアーゼを用いて、変換物の総量として算出し、この量から、先に述べたＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄを特異的に消化できるプロテアーゼを作用させ、変換物の総量として算出される量を差し引くことで、ＭＭＷ−Ａｄの量を算出することも可能である。免疫測定法は、前述したＬＭＷ−ＡｄあるいはＨＭＷ−Ａｄを分別測定する方法についての記載を参考に、ＥＬＩＳＡやＬＴＩＡが実施できる。
【００３２】
ＵＬＭＷ−Ａｄを分別して免疫測定するための方法について説明する。ＵＬＭＷ−Ａｄは、アディポネクチン総量から、前記で測定したＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量を差し引くことにより算出できる。具体例としは、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄを特異的に消化するプロテアーゼを作用させ、消化されずに残存するＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量を求め、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及びＬＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで算出することが可能である。
【００３３】
本発明によれば、ヒト血液中に存在する４種のヒトアディポネクチンが各々分別して測定できる。その結果、２型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患、肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果が評価可能となる。評価の方法としては、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのうちの１種以上の量の変動あるいはＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ及びアディポネクチン総量のうち少なくとも２つの量の比を基準値を設けて観察する方法、同一個体における経時的な変動を観察する方法が挙げられる。さらに特定の疾病や病態において公知の他の指標（例えば、２型糖尿病におけるインスリン、動脈硬化性疾患におけるＨＤＬコレステロールなど）とＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのうちの１種以上の量、あるいはＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ及びアディポネクチン総量のうち少なくとも２つの量の比を関連付けることにより評価を行う方法も挙げることができる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３５】
＜試薬及び材料＞
実施例及び参考例で用いた試薬及び材料は以下の通りである。
ａ．抗体結合樹脂用洗浄液：０．５Ｍ ＮａＣｌ を含む ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ（ｐＨ８．３）。
ｂ．抗体結合樹脂用溶出液：０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）。
ｃ．抗体結合樹脂用中和液：２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）。
ｄ．ＥＬＩＳＡ用プレート：９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ社）。
ｅ．ＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）。
ｆ．ＥＬＩＳＡ用緩衝液：１％ ウシ血清アルブミン、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含む ＰＢＳ（ｐＨ７．４）。
ｇ．Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｍｏｕｓｅ）：フナコシ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＰＫ−６１０２。
ｈ．ＤＡＢ基質キット（ウエスタンブロティング発色基質）：フナコシ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＳＫ−４１００。
ｉ．抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ）：藤沢薬品工業社、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、商品コードＡ１２８２０。
ｊ．ヤギ抗ヒトアディポネクチン−ポリクローナル抗体（Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ）：コスモバイオ社、ＧＴ社、Ｃａｔ Ｎｏ．４２１０６５。
ｋ．ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体：コスモバイオ社、ｃａｐｐｌｅ社。
ｌ．ＥＬＩＳＡ用洗浄液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含むＰＢＳ
ｍ．ＥＬＩＳＡ用緩衝液２：１％ ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ。
ｎ．ヤギ抗ヒトアルブミン−ポリクローナルＨＲＰ標識抗体（ＨＲＰ−Ｇｔ抗ＨＳＡ抗体）：ＰＡＲＩＳ社。
ｏ．ＨＲＰ−Ａｖｉｄｉｎ：ＰＩＥＲＣＥ社。
【００３６】
参考例１． 大腸菌リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン（ｒＭｇＡｄ）の調製
マウスアディポネクチンの遺伝子配列（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｕ３７２２２）のグロブラードメイン配列（１０４−２４７残基相当）を６×Ｈｉｓタグを含むｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩに挿入し、大腸菌に組み込んだ。リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン（ｒＭｇＡｄ）を発現した大腸菌からのｒＭｇＡｄの精製は、以下の操作により行った。すなわち、大腸菌の可溶画分をＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ社）に４℃、１６時間添加してｒＭｇＡｄを結合させた後、イミダゾールにより段階的に溶出させ、アディポネクチンを含む画分を回収し、３日間ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析を行なった。得られたｒＭｇＡｄの蛋白質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ を用いて求めた。
【００３７】
参考例２． 抗ｒＭｇＡｄ抗体の作製
参考例１で調製したｒＭｇＡｄの５０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、２匹のウサギに２週間おきに６回免疫して抗血清を作製した。抗血清中の特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いて常法により行なった（抗ｒＭｇＡｄ抗体）。
【００３８】
参考例３． ヒト血中由来多量体アディポネクチン（ｍＡｄ）の精製
参考例２で作製した抗ｒＭｇＡｄ抗体５００ｍｇをＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）５０ｍＬに結合させ抗ｒＭｇＡｄ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂を作製した。ヒト血清２．５Ｌを抗ｒＭｇＡｄ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂に添加し、抗体結合樹脂用洗浄液で十分量洗浄した後、抗体結合樹脂用溶出液でヒト血清アディポネクチン画分（ｍＡｄ）を溶出し、溶出画分に抗体結合樹脂用中和液を１／１０量添加して中和した。さらに、中和した溶出画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂に添加し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂への非吸着画分を精製ｍＡｄとして回収し、「ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）によりアディポネクチン含量を測定した。
【００３９】
参考例４． 抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体の作製
参考例３で得た精製ｍＡｄ ２０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、２匹のマウスに２週間おきに３又は４回免疫を行った後、さらに細胞融合３日前に再投与した。免疫したマウスより脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞と細胞融合を行った。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞の選択は、ＥＬＩＳＡ法によりｍＡｄとの反応性の高いウエルを選択し、ついで限界希釈法にて選択する常法により行なった。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体は、選択した融合細胞をプリスタン処理したマウス腹空内に投与し腹水として回収した。腹水からの特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いて常法により行なった。上記により認識番号；６４４０１〜６４４１１で識別される１１の抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞とモノクローナル抗体が得られた。
【００４０】
実施例１ ヒト血中由来の多量体アディポネクチンの分別精製（１）
参考例３で得た精製ｍＡｄを、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析して脱塩した後、これをＧｅｌａｔｉｎ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業社）カラムに吸着させ、０、１００、２００、３００及び５００ｍＭのＮａＣｌをそれぞれ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて、段階的に溶出させた。得られた各ＮａＣｌ濃度の溶出画分中には、分子量の異なるアディポネクチンが混在していた。得られた各溶出画分を濃縮し、それぞれの溶出画分についてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（分画分子量；１０〜１５００ｋＤａ、平均粒子径４７μｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーをさらに実施した。溶離液には、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムの分子量較正はＧｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて行った。各クロマトグラフィーにおけるアディポネクチンの検出は、「ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）により行った。
【００４１】
ゲルろ過クロマトグラフィーのクロマトグラムを図１に示した。得られた溶出フラクションを、１５０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下（主として１６０ｋＤａ付近）、２００ｋＤａ超４００ｋＤａ未満（主として２６０ｋＤａ付近）、４００ｋＤａ以上８００ｋＤａ以下（主として４５０ｋＤａ付近）の３画分に区別して収集し、多量体アディポネクチン分別精製品とした。なお、各多量体アディポネクチン分別精製品は、１５０ｋＤａ以上２００ｋＤａ以下（主として１６０ｋＤａ付近）のものをＬＭＷ−Ａｄ、２００ｋＤａ超４００ｋＤａ未満（主として２６０ｋＤａ付近）のものをＭＭＷ−Ａｄ、４００ｋＤａ以上８００ｋＤａ以下（主として４５０ｋＤａ付近）のものをＨＭＷ−Ａｄと呼ぶこととした。
【００４２】
前工程で得られた３種の多量体アディポネクチン分別精製品、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄそれぞれを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ポリアクリルアミド濃度２−１５％）（以下、ＰＡＧＥ（２−１５％）のように表記する）にて分離し、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）による蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図２に示した。
【００４３】
ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのいずれについても主たる染色バンド以外のバンドが認められたが、主たる染色バンドに対して検出の程度は僅かであり、分別、精製が達成されていることが確認された。なお、前述したとおりアディポネクチンは、３量体を基本として多量体を形成しているため、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄのいずれについても、ＰＡＧＥで見積もられる分子量とゲルろ過での分子量は必ずしも一致していない。
【００４４】
実施例２ ヒト血中由来の多量体アディポネクチン（ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ）の構造解析
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
実施例１で得られた多量体アディポネクチン分別精製品を、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢ蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図３に示した。
【００４５】
ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄともに６０ｋＤａ付近に、明確な染色バンドが認められた。当該染色バンドは、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、２量体のアディポネクチンと推定された。ＬＭＷ−Ａｄについては、前記６０ｋＤａ以外に、９０ｋＤａ付近に、未同定の明確な染色バンドが認められた。
【００４６】
２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）で９０ｋＤａ付近に泳動される未同定アディポネクチンの分析
前記１）で検出された９０ｋＤａ付近の未同定染色バンドのゲルを切り出し、エレクトロエリューターＭｏｄｅｌ４２２（バイオラッド社）を用いて蛋白を抽出した。抽出された蛋白を２−メルカプトエタノールを含む処理液により煮沸、還元処理し、再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離後、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ＣＢＢ蛋白染色を行なったところ、６０ｋＤａ付近と３０ｋＤａ付近に２本の染色バンドが確認された。
【００４７】
前記６０ｋＤａ付近及び３０ｋＤａのバンド中の蛋白それぞれについて、Ｎ末端アミノ酸配列を分析したところ、６０ｋＤａ付近のバンド中の蛋白のＮ末端アミノ酸配列は、ヒトアルブミンのＮ末端アミノ酸配列と一致した。一方、３０ｋＤａ付近のバンド中の蛋白のＮ末端アミノ酸配列は、アディポネクチンのアミノ酸配列の１９番目からの配列と一致した。
【００４８】
以上の事実より、ＬＭＷ−ＡｄをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）した際に検出される９０ｋＤａ付近の蛋白は、アルブミン１分子とアディポネクチン１分子がジスルフィド結合したヘテロダイマーであることが判明した。従って、ＬＭＷ−Ａｄ画分のアディポネクチンの構造は、３量体アディポネクチンとアルブミンがジスルフィド結合した構造を有していることが判明した。
【００４９】
実施例３ ヒト血中由来の多量体アディポネクチンの分別精製（２）
参考例３の方法に準じて、再度調製された精製ｍＡｄを、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析して脱塩した後、これをＧｅｌａｔｉｎ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業社）カラムに吸着させ、０、１００、２００及び５００ｍＭのＮａＣｌをそれぞれ含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて、段階的に溶出させた。得られた１００ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分には、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄが混在し、２００ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分には、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄが混在したが、５００ｍＭ ＮａＣｌ画分は、ＨＭＷ−Ａｄのみであったことから、５００ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分を、ＨＭＷ−Ａｄ分別精製品とした。次に、上記参考例３の方法に準じて、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ ＡＬＢ ａｎｔｉｂｏｄｙ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ樹脂を作製後、１００ｍＭ ＮａＣｌ溶出画分を添加し、非吸着画分及び吸着画分を得た。非吸着画分には、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄが混在していたが、吸着画分にはＬＭＷ−Ａｄのみであったことから、これをＬＭＷ−Ａｄ分別精製品とした。さらに、非吸着画分を濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（分画分子量；１０〜１５００ｋＤａ、平均粒子径４７μｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄを分離した。得られたそれぞれの画分を、ＵＬＭＷ−Ａｄ分別精製標品及びＭＭＷ−Ａｄ分別精製品とした。
実施例１の分別精製で得られた情報を基に、さらに分別精製条件を改良した結果、この方法では、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの３種以外に、もう１種（ＵＬＭＷ−Ａｄとした）新たに分離された。
【００５０】
前工程で得られた４種の多量体アディポネクチン分別精製品、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄそれぞれを、非変性条件下、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢ蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図６に示した。
【００５１】
実施例４ ヒト血中由来の多量体アディポネクチン（ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ）の構造解析
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析
実施例３で得られた各多量体アディポネクチン分別精製品を、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢ蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図７に示した。
【００５２】
ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄともに６０ｋＤａ付近に、明確な染色バンドが認められた。当該染色バンドは、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、２量体のアディポネクチンと推定された。ＬＭＷ−Ａｄについては、前記６０ｋＤａ以外に、９０ｋＤａ付近に、未同定の明確な染色バンドが認められた。又、ＵＬＭＷ−Ａｄについては、２量体以外に１量体の染色バンドが認められたことから、３量体と推測された。尚、図７の泳動像から、ＬＭＷ−Ａｄの染色バンドが２本確認されるが、共にアルブミンが結合したアディポネクチンであることを確認している。
【００５３】
２）分子内架橋による分子量の推定
実施例３で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて、５〜１０μｇ／ｍＬ程度に希釈し、別に架橋剤であるＢｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（商品名ＢＳ３：ＰＩＥＲＣＥ社製）を２０ｍｇ／ｍＬとなるように精製水で希釈した液と、等量混合後、室温にて３０分間放置した。さらに、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合液に等量添加し、室温で１５分間放置した。これらの各処理液を非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、セミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜を５％ スキムミルク及び０．１％ ＮａＮ３を含むＰＢＳでブロッキング後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで洗浄し、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ）１μｇ／ｍＬを室温で１時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで十分に洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ ｋｉｔ （Ｍｏｕｓｅ） 及びＤＡＢ基質キットを用いて発色させた。
【００５４】
その結果を図８に示した。分子量マーカーより分子量較正した結果、ＵＬＭＷ−Ａｄは、約１００ｋＤａ付近に染色バンドが認められ、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、３量体であることが確認された。ＬＭＷ−Ａｄは、約１５０ｋＤａ付近に染色バンドが認められ、上記で得られたアルブミンが結合した３量体であることが、分子量からも確認された。ＭＭＷ−Ａｄは、２５０ｋＤａ付近に染色バンドが認められ、６又は９量体を形成しているものと推測された。ＨＭＷ−Ａｄは、非常に高分子位置に染色バンドが確認され、かなり分子量が大きく、少なくとも、３００ｋＤａ以上はあるものと推測され、１２量体又は１８量体程度と推定されるが、正確な形態は不明である。
【００５５】
実施例５ ヒト血清中のアディポネクチンのウェスタンブロッティング解析
健常者８名の血清０．２μＬ分を、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、セミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜を５％スキムミルク及び０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）でブロッキング後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）で洗浄し、抗アディポネクチン−モノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ；藤沢薬品工業社、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）１μｇ／ｍＬを室温で１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）で十分に洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ ｋｉｔ （Ｍｏｕｓｅ） 及びＤＡＢ基質キット（フナコシ社）を用いて発色させた。
【００５６】
実施例１で調製したＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ画分と同じ位置にメインバンドとして発色を認めたことから、この３種のアディポネクチンが血中に存在する主なものであることが判明した（図４）。
又、ＵＬＭＷ−Ａｄについては、存在量が少ない為か不明であるが、ほとんど染色バンドが認められなかった（図４）。
【００５７】
実施例６ アルブミン結合型アディポネクチンの測定（１）
ＥＬＩＳＡ用プレートにヤギ抗ヒトアディポネクチンポリクローナル抗体（Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ）をＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液で１μｇ／ｍＬに希釈した後、感作した。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でブロッキング後、実施例１で調製したＬＭＷ−ＡｄをＥＬＩＳＡ用緩衝液で１、０．１、０．０１μｇ／ｍＬ（Ａｄ含量として）の濃度に希釈し室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／２０００倍希釈した抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体（特開２００１−３３７０９２）液を室温で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／１０００倍希釈したヤギ抗マウス（Ｇｏａｔαｍｏｕｓｅ） ＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体液を室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄後、ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）と過酸化水素の基質を用いたＨＲＰの酵素反応により発色させ、２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸収を測定した。測定結果を図５に示す。
【００５８】
濃度依存的な吸光度の増加が観察され、サンドイッチ免疫測定法が成立したことより、ＬＭＷ−Ａｄは、アディポネクチンにアルブミンが結合したもの（アルブミン結合型アディポネクチン）であることがわかった。また、本実施例の方法によりＬＭＷ−Ａｄを分別測定できることもわかった。
【００５９】
実施例７ アルブミン結合型アディポネクチンの測定（２）
（１）希釈直線性
ＥＬＩＳＡ用プレートに、ＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液で５μｇ／ｍＬに希釈した抗アディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０２）を、感作した。次に、２０％ヤギ血清を含むＥＬＩＳＡ用緩衝液でブロッキング後、実施例３で調製したＬＭＷ−Ａｄ精製品をＥＬＩＳＡ用緩衝液で０〜２０ｎｇ／ｍＬ（Ａｄ含量として）の濃度範囲に希釈し、に希釈し室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトアルブミン（ＨＲＰ−Ｇｔ抗ＨＳＡ）抗体液を室温で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄し、ＯＰＤ発色液（２ｍｇ／ｍＬ オルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％ 過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）により発色させ、停止液（１．５Ｎ 硫酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。測定結果を図９に示す。
【００６０】
濃度依存的な吸光度の増加が観察され、サンドイッチ免疫測定法が成立したことより、ＬＭＷ−Ａｄは、アディポネクチンにアルブミンが結合したもの（アルブミン結合型アディポネクチン）であることが再度確認された。
【００６１】
（２）添加回収試験
人血清を、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で１００〜８００倍希釈したものに、実施例３で調製したＬＭＷ−Ａｄ精製品を０〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で添加し、前記（１）と同様のＥＬＩＳＡ系にて測定後、添加量と実測値からの回収率を求めた。その結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
いずれの場合も、良好な回収率が得られ、本実施例の方法によりＬＭＷ−Ａｄを分別測定できることもわかった。
【００６４】
実施例８ プロテアーゼ処理（１）
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、参考例３で得た精製ｍＡｄ及び各種市販プロテアーゼを添加し、３７℃で６０分間加温した。その処理液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、プロテアーゼ非添加試料を対照として、各画分への作用を、ＣＢＢ蛋白染色像にて比較した（表２）。
【００６５】
処理条件１〜２に使用のプロテアーゼ処理では、ＬＭＷ−Ａｄ画分は消失するが、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認された。さらに、明確な変換物は確認されなかった。一方、処理条件３〜４に使用のプロテアーゼ処理では、ＬＭＷ−Ａｄは消失し、ＭＭＷ−Ａｄ画分及びＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認され、さらに、低分子量領域にＬＭＷ−Ａｄ由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。さらに、処理条件５〜６に使用のプロテアーゼ処理では、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ画分は消失し、ＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認され、さらに、低分子量領域にＬＭＷ−Ａｄ由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。これら変換物のＰＡＧＥ（２−１５％）での染色バンドの検出位置は、用いるプロテアーゼにより、若干異なる場合があるものの、３０−４２ｋＤａの範囲で検出された。この結果より、処理条件１及び２での処理により、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量、処理条件３及び４での処理により、ＬＭＷ−Ａｄのみ又はＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量、処理条件５及び６での処理により、ＨＭＷ−Ａｄのみ又はＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量を測定可能となることがわかった。
【００６６】
【表２】
【００６７】
実施例９ プロテアーゼ処理（２）
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、実施例３で解析された精製ｍＡｄ及び各種市販プロテアーゼを１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で３０分間加温した。その処理液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、プロテアーゼ非添加試料を対照として、各画分へのプロテアーゼの作用を、ＣＢＢ蛋白染色像にて比較した（表３）。
【００６８】
処理条件７〜９に使用のプロテアーゼ処理では、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄ画分は消失するが、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認された。さらに、低分子量領域にＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄ由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。さらに、処理条件１０〜１２に使用のプロテアーゼ処理では、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ画分は消失し、ＨＭＷ−Ａｄは残存することが確認され、さらに、低分子量領域にＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。これら変換物のＰＡＧＥ（２−１５％）での染色バンドの検出位置は、用いるプロテアーゼにより、若干異なる場合があるものの、３０−４０ｋＤａ付近で検出された。この結果より、処理条件７〜９で使用のプロテアーゼを用いることにより、残存するＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの総量若しくは、新たに生成するＡｄ変換生成物を測定することにより、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄの総量の分別測定が可能となることがわかった。又、処理条件１０〜１２で使用のプロテアーゼを用いることにより、残存するＨＭＷ−Ａｄ量、若しくはＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄの総量も分別測定が可能である。
【００６９】
【表３】
【００７０】
実施例１０ ＨＭＷ−Ａｄの測定用のプロテアーゼ処理
参考例３で得られた、抗体結合樹脂非吸着画分（以下、「Ａｄ除去血漿」という）に、実施例３で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、最終濃度で１０μｇ／ｍＬ程度となるように添加したものを検討用試料とした。又、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、プロテイナーゼＫを５〜１０ｕ／ｍＬとなるように溶解したものを前処理用酵素液とした。各検討用試料１０μＬに前処理用酵素液９０μＬを加え、３７℃で１０〜３０分間反応させた後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、２％ ＳＤＳ含有）を４００μＬ加え、酵素反応（前処理）を停止させた。この反応液２０μＬに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２を１．０ｍＬ添加して希釈し、前処理済み試料とした。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ＥＬＩＳＡ系にて、残存するアディポネクチン含量を算出した。
【００７１】
実施例１１ ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ合計量測定用のプロテアーゼ処理
実施例１０と同様に、Ａｄ除去血漿に、実施例３で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、最終濃度で１０μｇ／ｍＬ程度となるように添加したものを検討用試料とした。又、５０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、プロテアーゼＡ「アマノ」を０．６〜１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解したものを前処理用酵素液とした。各検討用試料１０μＬに前処理用酵素液９０μＬを加え、３７℃で１０〜３０分間反応させた後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、２％ ＳＤＳ含有）を４００μＬ加え、酵素反応（前処理）を停止させた。この反応液２０μＬに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２を１．０ｍＬ添加して希釈し、前処理済み試料とした。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ＥＬＩＳＡ系にて、残存するアディポネクチン含量を算出した。
【００７２】
実施例１２ アディポネクチン総量測定用試料の調製
生体試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤及びプロテアーゼの内の少なくともひとつを加え、アディポネクチンに作用させ、多量体アディポネクチンを一定の形態に変換させて免疫学的に測定する本発明者らの開発した方法（特願２００３−３５４７１５を優先権主張してなされた国際出願）から、酸と界面活性剤で前処理する方法を使用した。すなわち、人血漿又は人血清１０μＬに、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、２％ＳＤＳ含有）を４９０μＬ加え十分に攪拌し、当該混液２０μＬに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２を１．０ｍＬ添加して希釈し、前処理済み試料として。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ＥＬＩＳＡ系にて、アディポネクチン総量を算出した。
【００７３】
実施例１３ アディポネクチン測定用ＥＬＩＳＡ系
ＥＬＩＳＡ用プレートにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０５）を感作した。次に、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２でブロッキング後、実施例１０又は１１で調製された各前処理済み試料を添加し、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で２０００倍希釈したＢｉｏｔｉｎ標識抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０４）を室温で１時間反応させた後、さらに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で２０００倍希釈したＨＲＰ−Ａｖｉｄｉｎを添加し、室温で３０分間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄し、ＯＰＤ発色液（２ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）により発色させ、停止液（１．５Ｎ硫酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。前処理用酵素液９０μＬと１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０、２％ ＳＤＳ含有）４００μＬの混液に検討用試料１０μＬを加えたものを標準試料として同様にＥＬＩＳＡ測定を行い、得られた発色値を１００％として、実施例１０及び１１の各検討試料の発色値を％換算した。換算された％発色値を各条件毎に平均し、実施例１０の試料について図１０、実施例１１の試料について図１１に示した。
【００７４】
図１０の結果から、プロテイナーゼＫによるプロテアーゼ処理により、血漿中のＨＭＷ−Ａｄ以外の多量体Ａｄが消化され、ＨＭＷ−Ａｄが特異的に測定できることが判明した。又、図１１の結果から、プロテアーゼＡ「アマノ」によるプロテアーゼ処理により、血漿中のＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ以外の多量体Ａｄが消化され、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量が特異的に測定できることが判明した。ＭＭＷ−Ａｄの濃度については、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量から、ＨＭＷ−Ａｄの濃度を差し引くことで、算出することが可能である。
【００７５】
以上の事実より、実施例１２の前処理を行ったのち試料中のアディポネクチン総量を測定し、実施例６又は７の方法で求められるＬＭＷ−Ａｄ濃度及び実施例１１及び１３の方法で求められるＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄの合計量を、アディポネクチン総量から差し引くことにより、ＵＬＭＷ−Ａｄ濃度も算出することが可能であることも分かる。これらのことから、人血中に存在する４種の多量体Ａｄの総量及び分別測定は、可能となった。
【００７６】
実施例１４ 動脈硬化性疾患との関係
インスリン治療を行っていない２型糖尿病患者２９８名中、冠動脈造影検査（ＣＡＧ）により器質的病変を認めた９０名を冠動脈疾患（ＣＡＤ）群、残りの２０８名を非冠動脈疾患（ＮＣＡＤ）群に分け、前記実施例で挙げた方法を用いて、患者血漿中の総アディポネクチン（Ｔ．Ａｄ）含量測定及び各多量体アディポネクチンの分別測定を実施した。即ち、Ｔ．Ａｄ含量は実施例１２及び１３の方法、ＨＭＷ−Ａｄ含量は実施例１０及び１３の方法、ＭＭＷ−Ａｄ含量は実施例１１及び１３の方法でＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ合計量を算出し、さらにＨＭＷ−Ａｄ含量を差し引くことで求めた。ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄの合計量は、Ｔ．Ａｄ含量からＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄ合計量を差し引くことによって求めた。求められたそれぞれの値で、ＣＡＤ群及びＮＣＡＤ群間の有意差検定を、ｔ検定を用いて行った。
【００７７】
その結果を表４に示す。Ｔ．Ａｄ含量では、ＣＡＤ群とＮＣＡＤ群間で、有意差は認められなかったが、ＨＭＷ−Ａｄ含量では、有意差を認め（ｐ＜０．０５）。さらに、Ｔ．Ａｄ含量に対するＨＭＷ−Ａｄ含量比（％）でも、明確な有意差を認めた（ｐ＜０．０００１）。この結果から、Ｔ．Ａｄ含量よりも、ＨＭＷ−Ａｄ含量や特にそのＴ．Ａｄ含量に占める割合（％）が、ＣＡＤを正確に反映することが示された。
【００７８】
【表４】
【００７９】
実施例１５ メタボリックシンドロームとの関係
実施例１４で挙げた２９８名について、総アディポネクチン量（Ｔ．Ａｄ）及びＴ．Ａｄ量に占めるＨＭＷ−Ａｄ量の割合、すなわちＨＭＷ−Ａｄ／Ｔ．Ａｄ×１００％（ＨＭＷ−Ｒ）を基に、次に示す基準で、４群に分類した。まず、Ｔ．Ａｄの平均値及びＨＭＷ−Ｒの平均値をそれぞれ算出した結果、それぞれ９．８μｇ／ｍＬ及び３２％であった。次にＴ．Ａｄ値及びＨＭＷ−Ｒ値がともに平均値未満の患者をＡ群、Ｔ．Ａｄ値が平均値未満で、ＨＭＷ−Ｒ値が平均値以上である患者をＢ群、Ｔ．Ａｄ値が平均値以上で、ＨＭＷ−Ｒ値が平均値未満である患者をＣ群及びＴ．Ａｄ値及びＨＭＷ−Ａｄ値がともに平均値以上である患者をＤ群に分類した。さらに、各群内において、米国のＡｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ（ＡＴＰＩＩＩ）によって提唱されているメタボリックシンドロームの診断基準（ＪＡＭＡ，２８５：２４８６，２００１）に照らし合わせ、５項目のリスクファクターの内、２項目以上基準値を超える患者と２項目未満の患者の２グループに分けた（本来、ＡＴＰＩＩＩの診断基準では、３項目以上基準値を超える場合をメタボリックシンドロームとしているが、今回はより厳しい条件とした）。その結果を、表５に示す。
【００８０】
「メタボリックシンドローム診断基準項目数とＴ．Ａｄ値及びＨＭＷ−Ｒ値には統計学的に有意な関係がある」ことがクラスカル・ワーリス検定の結果、判明した（ｐ値＝０．００１）。さらに、ＨＭＷ−Ｒ値が平均値以下であるＡ群及びＣ群において、メタボリックシンドローム診断基準項目数が２項目以上である患者割合が多いことが判明した。この結果は、Ｔ．Ａｄ値に比較して、ＨＭＷ−Ｒ値の方が、メタボリックシンドロームとの関係を表す上でより好適な指標となることを示している。即ち、ＨＭＷ−Ｒ値を測定し、メタボリックシンドロームの指標として用いる事がメタボリックシンドロームの予知や予防にとって有効であることを、今回初めて見出した。
【００８１】
【表５】
【００８２】
以上の結果から、総アディポネクチン含量を指標としただけでは、疾病や病態の評価が出来ない場合においても、多量体Ａｄの特定の画分を測定することや総アディポネクチン含量に占める特定の画分の割合を見ることによって、疾病の予知や予防、病態の把握が可能となることが判った。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象の多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法。
【請求項２】
プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別する方法が、分別して測定する対象以外のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させ、残存する測定対象のアディポネクチンを免疫学的に測定することを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別する方法が、分別して測定する対象のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させ、その消化産物を免疫学的に測定することを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
多量体アディポネクチンが、人血中由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
人血中由来多量体アディポネクチンが下記の４種であり、その内の１種又は２種を、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分別測定方法。
（１）ＵＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１００ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（２）ＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＵＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１５０ｋＤａ付近にあり、さらにアルブミンがジスルフィド結合しているアディポネクチン。
（３）ＭＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２５０ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（４）ＨＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が小さく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が少なくとも３００ｋＤａ以上であるアディポネクチン。
【請求項６】
抗体が、抗アルブミン抗体及び／又は抗アディポネクチン抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
分別して測定する対象が、ＵＬＭＷ−Ａｄ及び／又はＬＭＷ−Ａｄである、請求項５又は６に記載の測定方法。
【請求項８】
分別して測定する対象が、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ、又は該２種の組合わせである、請求項５又は６に記載の測定方法。
【請求項９】
分別して測定する対象がＨＭＷ−Ａｄであって、分別して測定するための手段が、ＨＭＷ−Ａｄ以外の３種のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させることである、請求項５、６又は８に記載の測定方法。
【請求項１０】
ＨＭＷ−Ａｄの測定に先立って、ＨＭＷ−Ａｄ以外の３種のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させる、請求項５、６、８又は９に記載の測定方法。
【請求項１１】
分別して測定する対象がＭＭＷ−Ａｄであって、分別して測定する手段が、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄをプロテアーゼ処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄ量及びＭＭＷ−Ａｄ量の合計量を算出し、該合計量からさらにＨＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで算出する、請求項５、６又は８に記載の測定方法。
【請求項１２】
分別して測定する対象がＬＭＷ−Ａｄであって、分別して測定する手段が、抗アルブミン抗体及び抗アディポネクチン抗体を組合わせる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１３】
分別して測定する対象がＵＬＭＷ−Ａｄであって、分別して測定する手段が、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄをプロテアーゼ処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄ量及びＭＭＷ−Ａｄ量の合計量を算出し、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及びＬＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで算出する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１４】
人血中由来多量体アディポネクチンが下記の４種であり、その内の１種又は２種を、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定し、その結果を基に、疾病又は病態に関する情報を得ることを特徴とする、疾病又は病態の評価方法。
（１）ＵＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１００ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（２）ＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＵＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１５０ｋＤａ付近にあり、さらにアルブミンがジスルフィド結合しているアディポネクチン。
（３）ＭＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２５０ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（４）ＨＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が小さく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が少なくとも３００ｋＤａ以上であるアディポネクチン。
【請求項１５】
ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのうちの１種以上の量の変動により評価を行うものである、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１６】
ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ及びアディポネクチン総量のうちの少なくとも２つの量の比を求めて評価を行うものである、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１７】
他の指標とＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのうちの１種以上の量、あるいはＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ及びアディポネクチン総量のうちの少なくとも２つの量の比を関連付けることにより評価を行うものである、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１８】
疾病又は病態が、２型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患又は肥満症、メタボリックシンドロームである、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１９】
２型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患又は肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果を評価する、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１】
測定対象の多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法。
【請求項２】
プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別する方法が、分別して測定する対象以外のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させ、残存する測定対象のアディポネクチンを免疫学的に測定することを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別する方法が、分別して測定する対象のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させ、その消化産物を免疫学的に測定することを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
多量体アディポネクチンが、人血中由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
人血中由来多量体アディポネクチンが下記の４種であり、その内の１種又は２種を、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分別測定方法。
（１）ＵＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１００ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（２）ＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＵＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１５０ｋＤａ付近にあり、さらにアルブミンがジスルフィド結合しているアディポネクチン。
（３）ＭＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２５０ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（４）ＨＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が小さく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が少なくとも３００ｋＤａ以上であるアディポネクチン。
【請求項６】
抗体が、抗アルブミン抗体及び／又は抗アディポネクチン抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
分別して測定する対象が、ＵＬＭＷ−Ａｄ及び／又はＬＭＷ−Ａｄである、請求項５又は６に記載の測定方法。
【請求項８】
分別して測定する対象が、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ、又は該２種の組合わせである、請求項５又は６に記載の測定方法。
【請求項９】
分別して測定する対象がＨＭＷ−Ａｄであって、分別して測定するための手段が、ＨＭＷ−Ａｄ以外の３種のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させることである、請求項５、６又は８に記載の測定方法。
【請求項１０】
ＨＭＷ−Ａｄの測定に先立って、ＨＭＷ−Ａｄ以外の３種のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させる、請求項５、６、８又は９に記載の測定方法。
【請求項１１】
分別して測定する対象がＭＭＷ−Ａｄであって、分別して測定する手段が、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄをプロテアーゼ処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄ量及びＭＭＷ−Ａｄ量の合計量を算出し、該合計量からさらにＨＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで算出する、請求項５、６又は８に記載の測定方法。
【請求項１２】
分別して測定する対象がＬＭＷ−Ａｄであって、分別して測定する手段が、抗アルブミン抗体及び抗アディポネクチン抗体を組合わせる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１３】
分別して測定する対象がＵＬＭＷ−Ａｄであって、分別して測定する手段が、ＵＬＭＷ−Ａｄ及びＬＭＷ−Ａｄをプロテアーゼ処理し、残存するＨＭＷ−Ａｄ量及びＭＭＷ−Ａｄ量の合計量を算出し、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及びＬＭＷ−Ａｄ量を差し引くことで算出する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１４】
人血中由来多量体アディポネクチンが下記の４種であり、その内の１種又は２種を、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定し、その結果を基に、疾病又は病態に関する情報を得ることを特徴とする、疾病又は病態の評価方法。
（１）ＵＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１００ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（２）ＬＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＵＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が１５０ｋＤａ付近にあり、さらにアルブミンがジスルフィド結合しているアディポネクチン。
（３）ＭＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、ＬＭＷ−Ａｄの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が２５０ｋＤａ付近にあるアディポネクチン。
（４）ＨＭＷ−Ａｄ：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（２−１５％）で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される４種のバンドのうち、最も移動度が小さく、さらに、分子内架橋後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が少なくとも３００ｋＤａ以上であるアディポネクチン。
【請求項１５】
ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのうちの１種以上の量の変動により評価を行うものである、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１６】
ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ及びアディポネクチン総量のうちの少なくとも２つの量の比を求めて評価を行うものである、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１７】
他の指標とＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ及びＨＭＷ−Ａｄのうちの１種以上の量、あるいはＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＨＭＷ−Ａｄ及びアディポネクチン総量のうちの少なくとも２つの量の比を関連付けることにより評価を行うものである、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１８】
疾病又は病態が、２型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患又は肥満症、メタボリックシンドロームである、請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１９】
２型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患又は肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果を評価する、請求項１４に記載の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図６】
【図７】
【図８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３８４５７
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【発行日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４７９６（Ｐ２００５−５１４７９６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５２６０
【国際出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【出願人】（８９９００００２４）株式会社東京大学ＴＬＯ (50)
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【発行日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５２６０
【国際出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【出願人】（８９９００００２４）株式会社東京大学ＴＬＯ (50)
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