子宮頸部ＨＰＶの新たな検出方法
本発明は、１４のヒトパピローマウイルス型（すなわち、子宮頸癌の原因に関して（おそらく）高リスクとして分類されるＨＰＶ１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６および６８）、および候補ｈｒＨＰＶ型（ＨＰＶ６７）の、これらのｈｒＨＰＶ型のＥ７オープンリーディングフレームの約（２１５）〜（２４５）塩基対のフラグメントを協働して増幅する、６の重複するフォワードプライマーおよび９の重複するバックワードプライマーのセットを用いた一斉検出のための、コンセンサスＰＣＲベースの方法を記載する。反応産物の検出のために、ＥＩＡフォーマットが、例示される型特異的オリゴプローブのカクテルの援助により、使用可能である。さらに、発明者らは、検出方法と適合し得るこれら（１５）のＨＰＶの効率的な分類方法を開発した。このＲＬＢ分類システムは、固定された型特異的オリゴプローブによるＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションに関連する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸癌におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出、より詳細には、高リスク子宮頸部ＨＰＶのヌクレオチド配列に基づく検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
高リスクヒトパピローマウイルス（ｈｒＨＰＶ）感染と子宮頸癌との因果関係が、疫学的研究および機能的研究から明らかとなってきた（Zur Hausen, ２００２年, Nat. Rev. Cancer ２：３４２−３５０; Bosch et al., ２００２年, J. Clin. Pathol. ５５：１４４−２６５）。ＨＰＶゲノムは、８ｋｂ環状二本鎖ＤＮＡであって、同じ鎖上にすべてコードされる８遺伝子を含むＤＮＡである。ヒトにおいて、２００もの異なるＨＰＶ型が識別されている（Burd, E. M. ２００３年, Clin Microbiol Rev.１６：１−１７）；これらのおおよそ４０の型が、生殖管に感染することができるとわかっている。広い世界規模のケースコントロール研究のプールされた分析に基づいて、ｈｒＨＰＶ型の疫学的分類がなされ、１５のＨＰＶ型（ＨＰＶ１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６８，７３および８２）を高リスクであるとして分類し、別の３型（ＨＰＶ２６，５３および６６）をおそらく高リスクであるとして分類することができることが示されている（Munoz et al., ２００３年, N. Eng. J. Med. ３４８：５１８−５２７）。ｈｒＨＰＶは、子宮頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）の９９．７％において（Walboomers et al., １９９９年, J. Pathol. １８９：１２−１９）、および子宮頸部腺癌および腺扁平上皮癌の少なくとも９４％で（Zielinsky et al., ２００３年, J. Pathol. ２０１：５３５−５４３）、検出されている。
【０００３】
子宮頸癌は、すべての女性の癌のほぼ１０％の割合を占め、発展途上国の女性の癌の主因である（Franco, E. L. et al., ２００１年, Can Med Assoc J １６４：１０１７−２５）。この病気の最も高い発生率を有する地域は、一般に、最も高い死亡率を有する地域であり、中央アメリカ、アフリカ、およびカリブ海諸島を含む（Ferlay, J. et al., １９９８年. IARC CancerBase no. 3. Lyon:IARC Press.）。ヨーロッパおよび北アメリカでの発生は、おそらく、パパニコロ（Ｐａｐ）スミア試験（Franco et al., ibidにレビューされる）によるルーチンスクリーニングの出現によって、過去５０年にわたって急激に下降した。子宮頸癌は、生存率が診断時の病気の段階に直接関連する、最も予防可能な癌の１つである。５年生存率は、遠隔的な病気と診断された女性の１３％とは反対に、局所的な病気と初期診断された女性について、８８％である（Report of the Gynecologic Cancers Progress Review Group, November ２００１年, National Cancer Institute）。米国において子宮頸癌と診断された女性の５０％以上は、過去３年にＰａｐスミアを受けていなかった（Wright, T. C. et al., ２０００年, JAMA ２８３：８１−６）。
【０００４】
Ｐａｐスクリーニングは依然として、癌および前癌子宮頸部病変を検出する有力な方法であり、５千万以上の女性が、米国において、毎年、Ｐａｐスクリーニングを経験している（Wright, T. C. et al., ２００２年, JAMA ２８７：２１２０−２９）。その広範囲に及ぶ使用にも関わらず、Ｐａｐスミア試験は、部分的に効果的であるだけで、実質的な程度の偽陰性および偽陽性の双方の試験結果を示しており、いくつかの推定に基づけば、従来のＰａｐスミア試験の感度は、５０〜６０％（Lorincz, A. T. and Richart, R. M., ２００３年, Arch Pathol Lab Med １２７：９５９−６８; Nanda, K. et al., ２０００年. Ann Intern Med １３２：８１０.; Fahey MT, et al. １９９５年, Am J
Epidemiol.１４１：６８０−９; Myers ER, McCrory DC, Subramanian S, et al. ２０００年, Obstet Gynecol ９６：６４５−５２.）から７０〜８０％（Clavel, C. et al., ２００１年, Br J Cancer ８４：１６１６）にまで変動する。液体ベースの試験などの、細胞学的スクリーニングおよびサンプリングにおける最近の革新は、これらの方法の感度を７５〜９５％に改善した（Lorincz, A. T. et al. ibid ; Nanda, K. et al., ibid. ;
Hutchinson ML, Zahniser DJ, Sherman ME, et al. １９９９年 Cancer.８７：４８−５５）。それにも関わらず、これらの改善された方法でさえ、異常な、そしてしばしば前癌の細胞のかなりの部分を検出しない。ｈｒＨＰＶ ＤＮＡ試験のＰａｐ試験への付加が、特に子宮頸癌および最も近い前癌病変（すなわち、病変ＣＩＮ３）についての高い陰性予測値のために、子宮頸部スクリーニングプログラムの有効性を改善しそうである。さらに、いくつかの機関が、従来の細胞学的方法との併用における、またはある場合ではその代用における、ＨＰＶ ＤＮＡスクリーニングの使用を標榜している（Wright, T. C. and Schiffman, M., ２００３年, N. Engl. J. Med. ３４８：４８９−９０）。
【０００５】
現在最も幅広く利用されているＨＰＶ試験は、２つの原理に基づいている。１つ目は、ＦＤＡ承認のハイブリッドキャプチャ２（ｈｃ２）アッセイにおいて使用されるように、ＨＰＶ標的ＤＮＡの、全長ＨＰＶ型特異的ＲＮＡのカクテルとのハイブリダイゼーションに続き、固体相にＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを捕獲することを含む。続いて、シグナル増幅が、特異的にＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識する複数の結合抗体とのハイブリッドの結合によって、達成される。２つ目の原理は、すべての関連する生殖系のｈｒＨＰＶ遺伝子型のＥ１またはＬ１オープンリーディングフレーム内で高度に保存される領域に結合する、いわゆるコンセンサスプライマーまたはジェネラルプライマーによって向けられる、ＨＰＶ標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む。種々の読出しシステムが後者のアッセイのために記載されてきたが、個々に、もしくはカクテルのいずれかで、型特異的オリゴプローブを用いる（Jacobs et al., １９９７年, J Clin Microbiol ３５：７９１−７９５;
Kleter et al., １９９８年, Am J Pathol: １５３：１７３１−１７３９）酵素免疫アッセイ（たとえばＥＩＡ、ＤＥＩＡ）、またはリバースラインブロットアッセイ（たとえばＬｉＰＡ、ＲＬＢ（van den Brule et al., ２００２年, J Clin Microbiol ４０：７７９−７８７; Kleter et al., １９９９年, J Clin Microbiol; ３７：２５０８−２５１７; Gravitt et al., １９９８年, J Clin Microbiol ３６：３０２０−３０２７））が、今日最も普通に使用されている。ＨＰＶコンセンサスＰＣＲシステムのうち、ＭＹ１１／０９−ＰＣＲプライマーから再設計されたＬ１ベースのＰＧＭＹ−ＰＣＲ（Gravitt et al., ２０００年, J Clin Microbiol ３８：３５７−３６１）、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（van den Brule et al., ２００２年, J Clin Microbiol ４０：７７９−７８７）およびＳＰＦ１０−ＬｉＰＡ（Kleter et al., １９９９年, J Clin Microbiol ３７：２５０８−２５１７）が、現在最も頻繁に利用されている。より最近、新規のＬ１ベースのコンセンサスＰＣＲシステムである、Roche AMPLICOR（登録商標）HPV Testが発売され、これは、１３のｈｒＨＰＶ型を検出することができる。
【０００６】
現在すべての利用可能なｈｒＨＰＶ試験システムは、アッセイまたは読出し条件を適合させても容易に解決され得ないいくつかの固有の欠点を有する。特に、ｈｒＨＰＶ陽性の症例にリフレックス細胞学が適用されるｈｒＨＰＶ試験が一次スクリーニング手段として考察される場合、これらの欠点は、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌の試験の陽性または陰性のいずれかの予測値について、実質的に陰性の結果を有するかもしれない。このことは、自己採取された膣材料がスクリーニング目的のために使用される場合に、特に関連がある。この材料は、信頼できる細胞学的評価に適していないが、子宮頸部のｈｒＨＰＶ状態を高度に表す。
【０００７】
Ａ．ｈｃ２法は、プローブ混合物においては表されない、低リスクＨＰＶ型を含むＨＰＶ型とのある程度の交差反応を示す（Castle et al., Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev. ２００２年: １１：１３９４−１３９９）。これは、子宮頸癌のリスク評価についてのこのアッセイの特異性に負の影響を及ぼす。
【０００８】
Ｂ．一方、種々のＰＣＲベースのシステムは、ｈｒＨＰＶに対して異なる分析感受性を示し、これは実際、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌に対して異なる特異性を引き起こす。後者は、多くのｈｒＨＰＶ感染、特に低いウイルス負荷を有するｈｒＨＰＶ感染が、臨床的に関連のない一過性感染を反映する一方で、高いグレードの子宮頸部の病変に関連する感染は概して、増大したウイルス負荷によって特徴付けられるという事実によっている（Snijders et al., J Pathol. ２００３年: ２０１：１−６; van
Duin et al., Int J Cancer ２００２年: ９８：５９０−５９５; Schlecht et al Int J cancer ２００３年: １０３：５１９−５２４）。ゆえに、分析試験の感度（すなわち、ｈｒＨＰＶを検出する感度）は、臨床実施およびスクリーニング実施における使用にとって充分な要件ではない。ｈｒＨＰＶを検出するのに感度のよ過ぎる試験は、高いグレードの子宮頸部病変についての特異性の低下を被る。というのも、一過性のｈｒＨＰＶ感染の検出の増大が、低いウイルス負荷によって特徴付けられるからである。結果として、ほとんどのコンセンサスｈｒＨＰＶ ＤＮＡアッセイは、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌について類似の感度を示す一方で、特異性値は著しく変動し得る。現在、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲおよびｈｃ２アッセイは、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌について、感受性と特異性との間で最適な均衡を示すただ２つの試験であり、したがって臨床的に確証されていると考えることができる（Lorincz and Richart, Arch
Pathol Lab Med ２００３年: １２７：９５９−９６８; Bulk et al. Int J Cancer ２００７年: １２１：３６１−３６７）。これらのアッセイは、ＣＩＮ２病変の検出のために使用される場合、類似の感受性および特異性を有する（Hesselink et al. J Clin
Microbiol ２００６年: ４４：３６８０−３６８５）。
【０００９】
Ｃ．特に、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌において、ｈｒＨＰＶゲノムはしばしば宿主細胞のゲノム内に組込まれる。この現象はしばしば、Ｅ１からＬ１までのオープンリーディングフレームに広がり得る領域でのウイルスゲノムの中断を伴うので、この現象は、これらの領域におけるウイルスＤＮＡのＰＣＲ媒介増幅の結果をもたらし得る。実際、組込みが、約４％の子宮頸部ＳＣＣ（Walboomers et al., １９９９年, J Pathol １８９：１２−１９）、５％の全ＨＳＩＬ、６％の子宮頸部腺扁平上皮癌のｉｎ ｓｉｔｕの病変、および１０％の子宮頸部腺扁平上皮癌（Zielinski et al., ２００３年, J Pathol ２０１：５３５−５４３）における、Ｅ１および／またはＬ１ベースのＰＣＲアッセイによるウイルスＤＮＡの検出を妨げるという指摘がある。Ｅ１およびＬ１ベースのＰＣＲ法の、子宮頸癌および高いグレードの前駆性病変に対するこれらの偽陰性スコアは、ｈｒＨＰＶ陽性の症例にリフレックス細胞学が適用されるｈｒＨＰＶ試験が一次スクリーニング手段として考察される場合、受け入れられないほど高い。
ゆえに、ｈｒＨＰＶの改良された検出システムの必要性が今なお存在する。
【発明の概要】
【００１０】
これらの困難を克服するために、発明者らは、高いグレードの子宮頸部病変に対してＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲとよく似た特異性を示すが、ウイルスＤＮＡの組込みによって影響されない、１４のｈｒＨＰＶ型（すなわち、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６および６８）、および候補ｈｒＨＰＶ型（ＨＰＶ６７）の、一斉検出の方法を今回発見した。さらに、本発明のさらなる態様において、発明者らは、検出方法と適合し得る前述のｈｒＨＰＶ型に属するＨＰＶ型についての効率的な分類システムの方法を発見した。
【００１１】
本発明に従うｈｒＨＰＶの検出方法は、ｈｒＨＰＶを有する疑いのあるサンプルを提供し、前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡに集合的に、実質的に相補的な複数のフォワードおよびバックワードプライマーを提供し、前記複数のプライマーを用いて前記サンプルに由来するＤＮＡを増幅させる反応を実行し、ＤＮＡ増幅反応の反応産物を、複数の特異的ｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによって、ｈｒＨＰＶ型由来のＤＮＡ増幅産物を検出する工程を含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、ｈｒＨＰＶの分類方法であって、複数のフォワードおよびバックワードプライマーを用いてｈｒＨＰＶのＤＮＡを増幅することによってＤＮＡ増幅産物を提供し、前記増幅産物を、すべてではないが少なくとも１つのｈｒＨＰＶ型のＤＮＡに実質的に相補的な少なくとも１つの特異的ｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによって、１以上のｈｒＨＰＶ型からのＤＮＡ増幅産物を検出する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、ｈｒＨＰＶ−ＤＮＡの増幅用の、フォワードおよびバックワード増幅用プライマーのセットを提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、個々のｈｒＨＰＶ型の、型特異的検出または型選択的検出のための、型特異的オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ｈｒＨＰＶ由来ＨＲＥ７のＰＣＲ増幅に用いられるフォワードおよびバックワードプライマーのセットを示す。
【図２】ＨＲＥ７−ＰＣＲ産物の検出用ＥＩＡプローブの配列を示す。
【図３】ＨＲＥ７−ＰＣＲ産物の分類用ＲＬＢプローブの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
「相補体」または「相補配列」は、ワトソン−クリックの塩基対合法則に従って、別のヌクレオチド配列と水素結合二量体を形成するヌクレオチド配列である。たとえば、５’−ＡＡＧＧＣＴ−３’の相補塩基配列は、３’−ＴＴＣＣＧＡ−５’である。
【００１７】
「発現」は、遺伝子の、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、および適用可能な場合には、続くタンパクへの翻訳、を表す。
【００１８】
ポリヌクレオチドは、同じ生物において一斉に自然発生しない場合、互いに「非相同」である。ポリヌクレオチドは、生物において特定の型および配置で自然発生しない場合、その生物に非相同である。
【００１９】
ポリヌクレオチドは、２つの配列におけるヌクレオチド配列が、ここに記載されるように、最大一致でアライメントされた場合に同じであるのならば、「相同の」配列を有する。２以上のポリヌクレオチド間の配列比較は、概して、配列類似性の局所領域を識別および比較するために、比較ウインドウの全体にわたって２つの配列の部分を比較することによって、実行される。比較ウインドウは、概して、約２０〜２００の連続ヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの、５０，６０，７０，８０，９０，９５，９８，９９または１００パーセントの配列ホモロジなどの「配列ホモロジのパーセンテージ」は、比較ウインドウの全体にわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定することができ、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列（付加または欠損（すなわちギャップ）を含まない）と比較して、付加または欠損を含み得る。パーセンテージは、（ａ）同じ核酸塩基が双方の配列において生じる位置の数を決定して、一致位置の数を算出し、（ｂ）一致位置の数を、比較ウインドウにおける位置の総数で割り、（ｃ）結果に１００を掛けて、配列ホモロジのパーセンテージを算出することによって、計算される。比較のための配列の最適のアライメントは、周知のアルゴリズムのコンピュータ実施によって、または検査によって、行われてよい。容易に利用可能な配列比較およびマルチプル配列アライメントアルゴリズムはそれぞれ、Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschul, S.F. et al. １９９０年. J. Mol. Biol. ２１５：４０３; Altschul, S.F. et al. １９９７年.
Nucleic Acid Res. ２５：３３８９−３４０２）およびClustalWプログラムであり、双方ともインターネット上で入手可能である。他の適当なプログラムは、Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group（GCG）,米国、ウィスコンシン州、マディソン）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＦＡＳＴＡを含む。
【００２０】
本明細書で使用するように、「実質的に相補的な」は、２つの核酸配列が相互に、少なくとも約９０％、好ましくは約９３％、より好ましくは約９５％、最も好ましくは約９８％の配列相補性を有することを意味する。このことは、プライマーおよびプローブがそれらの鋳型および標的核酸に対する十分な相補性をそれぞれ示して、厳密条件下においてハイブリダイズしなければならないことを意味する。したがって、本明細書に開示されたプライマー配列は、鋳型上の結合領域の正確な配列を反映する必要はなく、縮重プライマーが用いられてもよい。実質的に相補的なプライマー配列は、増幅用鋳型に対して十分な配列相補性を有してプライマー結合および第二鎖合成を結果として生じるものである。
【００２１】
用語「ハイブリッド」は、相補的ヌクレオチド間の水素結合によって形成される二本鎖核酸分子、すなわち二量体を意味する。用語「ハイブリダイズ」または「アニール」は、一本鎖の核酸配列が相補的なヌクレオチド間の水素結合によって二重らせん部分を形成するプロセスを意味する。
【００２２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、リン結合（たとえばホスホジエステル、リン酸アルキルおよびアリール、ホスホロチオエート）、または非リン結合（たとえばペプチド、サルファミン酸塩およびその他）によって結合された短配列のヌクレオチドモノマー（通常、６〜１００個のヌクレオチド）を意味する。オリゴヌクレオチドは、修飾された塩基（たとえば５−メチルシトシン）と、修飾された糖類（たとえば２’−Ｏ−メチルリボシル、２’−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−アミノリボシルなど）とを有する修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、環状、分岐または直線状であって、任意に安定した二次構造（たとえばステム−ループ構造およびループ−ステム−ループ構造）を形成することができるドメインを含む、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡの自然発生または合成分子であってもよい。
【００２３】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、ＤＮＡポリメラーゼを付着させることを可能にする増幅用標的にアニーリングすることができ、これによって核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下にあるときに、すなわちヌクレオチドとＤＮＡモリメラーゼなどのポリメリゼーションのための薬剤との存在下および適切な温度およびｐＨでのＤＮＡ合成の開始点として機能する、オリゴヌクレオチドを意味する。この（増幅用）プライマーは、増幅における最大効率のために一本鎖とされることが好ましい。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、ポリメリゼーションのための薬剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマー温度およびプライマー源を含む多くの因子に依存するであろう。本明細書で使用される「一対の二方向プライマー」は、ＰＣＲ増幅におけるＤＮＡ増幅の技術において一般的に使用される１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーを意味する。
【００２４】
用語「プローブ」は、水素結合二量体を標的核酸配列分析物またはそのｃＤＮＡ誘導体において相補的な配列で識別し形成するであろう一本鎖オリゴヌクレオチド配列を意味する。
【００２５】
用語「ストリンジェンシー」または「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、たとえば温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などのハイブリッドの安定性に影響を与えるハイブリダイゼーション条件を意味する。これらの条件は、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列への特異的な結合を最大にし、非特異的な結合を最小にするために経験的に最適化される。使用されるこれらの用語は、プローブまたはプライマーがその標的配列に、他の配列よりも検出可能に大きな程度（たとえばバックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズするであろう条件への参照を含む。厳密条件は、配列に依存し、異なる状況では異なるであろう。一般的に、厳密条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列に対して、解離温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選ばれる。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に適合したプローブまたはプライマーにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨの下）である。典型的には、厳密条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が、１．０Ｍ Ｎａ＋イオン以下、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブまたはプライマー（たとえば１０〜５０個のヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃、長いプローブまたはプライマー（たとえば５０個よりも多いヌクレオチド）に対して少なくとも約６０℃である、というものである。厳密条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されてもよい。模範的な低い厳密条件、すなわち「ストリンジェンシーを下げた条件」は、３０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳのバッファー溶液による３７℃におけるハイブリダイゼーションと、２ｘＳＳＣ内での４０℃における洗浄とを含む。模範的な高い厳密条件は、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳ内での３７℃におけるハイブリダイゼーションと、０．１ｘＳＳＣ内での６０℃における洗浄とを含む。ハイブリダイゼーション手順は、当該技術において周知であり、たとえば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons Inc., １９９４年に記載されている。
【００２６】
本発明の方法は、高リスクヒトパピローマウイルス（ｈｒＨＰＶ）によって引き起こされる子宮頸癌および他の肛門性器癌におけるｈｒＨＰＶの亜群に属するヒトパピローマウイルスの検出、同定および診断を可能にする。
【００２７】
ｈｒＨＰＶの検出
本発明に従う、１４のｈｒＨＰＶ型（すなわち、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６および６８）および候補ｈｒＨＰＶ型（ＨＰＶ６７）（以降ｈｒＨＰＶと示す）の検出方法は、ヒト臨床サンプルに実行されてよい。好ましくは、本発明の方法における使用のためのサンプルは、子宮頸癌のリスクを評価するための、女性の子宮頸部スメアサンプルを含む。
【００２８】
本発明の方法における使用のためのこのようなサンプルを獲得および調製する方法は、当業者に周知であるか、本開示から明らかとなろう。ＤＮＡの分析および操作に関する一般的な方法については、たとえばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, 第１~３巻, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press （１９８９年）またはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Greene Publishing and
Wiley-Interscience, ニューヨーク（１９８７年）およびその定期的なアップデートを参照されたい。
【００２９】
好ましくは、本発明に従う方法は、１４のｈｒＨＰＶ型（すなわち、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６および６８）および候補ｈｒＨＰＶ型（ＨＰＶ６７）の検出のために、使用される。
【００３０】
本発明の有利な態様は、まだ試験されていないか、発見されていないｈｒＨＰＶのサブグループのメンバが、本発明の方法を用いることによって、適切に検出され得ることである。
【００３１】
本発明のｈｒＨＰＶの検出方法において、６のフォワードプライマーおよび９のバックワードプライマーのセットであって、いくつかが重複し、ＨＰＶ型に応じて、Ｅ７オープンリーディングフレームの約２１５〜２４５塩基対のフラグメントを協働して増幅するセットを用いる、コンセンサスＰＣＲベースの方法が記載される。
【００３２】
ウイルス腫瘍形成遺伝子Ｅ７は、ｈｒＨＰＶによって仲介される形質転換表現型の開始および維持の双方にとって、重要である。事実、これは、Ｅ７オープンリーディングフレームが常に子宮頸癌およびその前駆段階において維持されることを意味する（先のZur
Hausen）。加えて、驚いたことに、Ｅ７領域は、他のＨＰＶ型と交差反応しないプライマーおよびプローブの組合せを選択するためには充分に、異なるＨＰＶ型間で非相同であることが明らかとなった。
【００３３】
前述のフォワードおよびバックワードプライマーは、ＨＰＶ型１６ゲノム（GenBank系統番号ＮＣ ００１５２６）のそれぞれヌクレオチド位置６２２〜６４４間、および８２８〜８４７間の領域、ならびに他のｈｒＨＰＶ遺伝子型のゲノム内の同等の位置の領域に、一致する。カクテルにおける最も一致するプライマーは、各ＨＰＶ型の標的配列と最大で２の不一致を有する。
【００３４】
この発見に基づいて、本発明は、個々のプライマーが各々、１以上のｈｒＨＰＶ型のＥ７領域にアニーリングすることができる、フォワードおよびバックワードプライマーのセットを提供する。６フォワードプライマーおよび９バックワードプライマーの完全セットは、一斉に用いた場合、言及されるあらゆるｈｒＨＰＶのＥ７ ＤＮＡにアニーリングすることができ、ＨＰＶ１６の６２２〜６４４の位置と、８２８〜８４７の位置との間で規定されるＤＮＡ配列、およびこれらの位置に隣接するＤＮＡ配列、ならびに他のｈｒＨＰＶ型のゲノム内の同等の位置のＤＮＡ配列、を増幅することができる複数のプライマーを提供する。
【００３５】
このプライマーのセットの強みは、最適な感度を維持しながら、ｈｒＨＰＶ型に対して広い特異性を有することである。感度は、真のｈｒＨＰＶ感染を検出することができるほど充分に高いと同時に、サンプルにおけるｈｒＨＰＶの一時的で臨床的に関連のない量として特徴付けられる、非常に低いウイルス負荷によっては誘発されないほど充分に低いので、最適である。この注目すべき組合せは、ほとんどの場合、標的ウイルス配列に１００％相補的でなく、１または２の不一致を含むプライマーを選択することによって、達成される。たとえば国際公開第０３／０２０９７６号に開示されるプライマーセットなどの先行技術のプライマーセットは、ｈｒＨＰＶに対して高い分析感度を有し、その結果、ＣＩＮ２またはＣＩＮ３病変に対してより低い特異性を有する（Snijders, P. et al., ２００３年, J. Pathol. ２０１：１−６）。
【００３６】
前記領域を増幅するためのフォワードおよびバックワードプライマーのセットは、図１に表される。幾分短い、または幾分長いプライマーを使用することもできる。この図１のプライマーのセットにおいて、プライマーミックスのＴｍを等しくするために、バックワードプライマーはフォワードプライマーよりも意図的に短い。
【００３７】
本発明の方法は、原則的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ; Mullis １９８７年, 米国特許第４６８３１９５号、米国特許第４６８３２０２号、および米国特許第４８００１５９号）などの何らかの核酸増幅方法を用いることによって、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ; Barany １９９１年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１８９−１９３; 欧州特許第３２０３０８号）、Self-Sustained Sequence Replication（３ＳＲ; Guatelli et al., １９９０年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：１８７４−１８７８）、Strand
Displacement Amplification（ＳＤＡ; 米国特許第５２７０１８４号、および米国特許第５４５５１６６号）、Transcriptional Amplification System（ＴＡＳ; Kwoh et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：１１７３−１１７７）、Q-Beta Replicase（
Lizardi et al., １９８８年, Bio/Technology ６：１１９７）、Rolling Circle
Amplification（ＲＣＡ; 米国特許第５８７１９２１号）、Nucleic Acid Sequence Based Amplification（ＮＡＳＢＡ）、Cleavage Fragment Length Polymorphism（米国特許第５７１９０２８号）、Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of
Nucleic Acid（ＩＣＡＮ）、Ramification-extension Amplification Method（ＲＡＭ; 米国特許第５７１９０２８号および米国特許第５９４２３９１号）もしくは他の適切なＤＮＡの増幅方法などの増幅反応を用いることによって、実行することができる。
【００３８】
本発明に従う好ましい実施形態は、図１の６フォワードプライマーおよび９バックワード（すなわちリバース）プライマーのセットによるｈｒＨＰＶ−ＤＮＡのプライマー開始増幅を含むＰＣＲ法を用いる。
【００３９】
１以上の増幅プライマーとの少数の不一致のあるＨＰＶ型のＤＮＡを増幅するために、増幅反応は、ストリンジェンシーを下げた条件下で実行してもよい（たとえば、アニーリング温度を３８°Ｃにまで下げた、または３．５ｍＭにまでＭｇＣｌ２を高めた、ＰＣＲ増幅）。当業者は、適当なストリンジェンシーの条件を選択することができる。
【００４０】
増幅産物の検出は、原則的に、当該技術において知られているあらゆる適切な方法によって、達成することができる。検出フラグメントは、放射性ラベル、抗体、発光染料、蛍光染料、または酵素試薬で直接的に染色または標識されてもよい。直接的なＤＮＡ染色は、たとえば、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、エチジウムモノアジドまたはHoechst dyeなどのインターカレーション染料を含む。好ましくは、ＥＩＡフォーマットが、図２に例示されるような型特異的オリゴプローブのカクテルの援助により、使用可能である。別の好ましい実施形態において、固定された型特異的オリゴプローブ（図３）によるハイブリダイゼーションによって、検出が行われる。
【００４１】
代わりに、ＤＮＡフラグメントは、合成ＤＮＡフラグメント内への標識ｄＮＴＰ塩基の組込みによって、検出されてもよい。ヌクレオチド塩基に関連し得る検出標識は、たとえば、フルオレセイン、シアニン染料またはBrdUrdを含む。
【００４２】
本発明は、好ましくは、反応産物を１以上の特異的ｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによる、ｈｒＨＰＶ ＤＮＡでの前述したＤＮＡ増幅反応によって得られる反応産物の検出、を含む。
【００４３】
プローブベースの検出システムを用いる場合、本発明における使用に適切な検出手順は、たとえば、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）フォーマットを含んでもよい（Jacobs et al., １９９７年, J. Clin. Microbiol. ３５, ７９１−７９５）。ＥＩＡ手順による方法で検出を実行するために、増幅反応に用いられるフォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかは、後のｈｒＨＰＶ単位複製配列のＥＩＡ検出用の、たとえばストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートウェルへのｈｒＨＰＶ ＤＮＡ ＰＣＲ単位複製配列の固定のための、ビオチン基などの捕獲基を含んでもよい（下記参照）。当業者は、ＥＩＡフォーマットにおけるｈｒＨＰＶ−ＤＮＡ ＰＣＲ単位複製配列の固定のために、他の基が用いられてもよいことを理解するであろう。
【００４４】
ｈｒＨＰＶの分類
さらに、Ｅ７領域は、他のＨＰＶ型と交差反応しないプライマーおよびプローブ組合せを選択するのに足りるほど、異なるＨＰＶ型間で充分に非相同であることが明らかとなった。
【００４５】
したがって、本発明の別の態様において、上で列挙したｈｒＨＰＶ型に属する種々のＨＰＶ型は、１つの特異的な高リスク型のＨＰＶの単位複製配列にのみ、個々に結合する複数の型特異的ｈｒＨＰＶ検出プローブを用いることによって、検出されてもよい。ゆえに、ここで規定される２つのコンセンサス領域間でＤＮＡ配列領域を増幅し、続いて個々のＨＰＶ型の独特な配列にプロービングすることによる、種々の高リスクＨＰＶの分類方法が提供される。
【００４６】
ここに開示されるＥ７領域の型特異的検出に有用なプローブは、ＥＩＡ検出のために図２に、およびリバースラインブロット（ＲＬＢ）による検出のために図３に、例示される。これらの型特異的プローブは好ましくは、ｈｒＨＰＶの群に属する単一のＨＰＶ型の２つのコンセンサス領域間で増幅されたＤＮＡ配列領域の少なくとも一部にのみ、結合する。また、図３に列挙される相補配列は、このような相補鎖が、利用される増幅反応において増幅されることを条件に、本発明の方法における型特異的検出プローブとして好適に使用され得る。
【００４７】
本発明に従う分類方法で使用されるプローブは、ある１つのまたは複数のＨＰＶ型の単位複製配列に選択的に結合するが、ストリンジェンシーが非常に低いハイブリダイゼーション条件下では、他のＨＰＶ型の単位複製配列に結合しないか、弱く結合するだけである。したがって、１つの実施形態において、本発明は、患者に感染しているＨＰＶの型を決定するのに用いることができる。これは、悪性疾病への進行（従って臨床予後）がＨＰＶ型に強く依存しているため、非常に意義深い。したがって、分類の態様において、本発明は、患者におけるＨＰＶ感染の型を決定する方法を提供する。
【００４８】
本発明のｈｒＨＰＶ分類方法の好ましい実施形態において、１５の異なるｈｒＨＰＶに由来し得る単位複製配列中の型特異的配列にハイブリダイズする、１５の異なるプローブ（図３）またはそれらの相補配列のセットが、使用される。
【００４９】
本発明の分類態様における使用のための好適な検出手順は、たとえば、単位複製配列の固定およびそのＤＮＡ配列の、たとえばサザンブロッティングによる、プロービングを含む。他のフォーマットは、前述のＥＩＡフォーマットを含む（その場合、好ましくは図２のプローブが使用される）。結合の検出を容易にするために、型特異的ｈｒＨＰＶは、増幅反応の反応産物へのプローブの結合の監視を容易にする、蛍光団、発色団、酵素または放射性標識などの標識部分を含み得る。そのような標識は、当業者に周知であり、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、β−ガラクトシデース、セイヨウワサビペルオキシデース、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、３５Ｓまたは１２５Ｉが含まれる。他の例は当業者にとって明白であろう。
【００５０】
他の方法を採用してもよいが、本発明に従う分類方法は、好ましくは、ＰＣＲ産物を、ビーズ、または、最近論文に記載された、たとえばＬ１ベースのコンセンサスＨＰＶ ＰＣＲ法（van den Brule et al.，２００２年，J. Clin. Microbiol. ４０，７７９ ７８７）のためなどの、ＲＬＢフィルタに固定した型特異的プローブに、ハイブリダイゼーションさせることによって行う。このために、好ましくは、たとえばカルボキシル被覆ナイロン膜への、後に行う固定のための５’アミノ基を有するＲＬＢプローブが合成される。このようなフォーマットの利点は、システムの容易さとその速度であり、サンプル処理の高いスループットが可能になる。
【００５１】
本発明に従うｈｒＨＰＶの分類方法は、前述のように、採取直後のサンプル材料に対して行うことができる（そのようなサンプルが充分なウイルスＤＮＡを提供する場合に限られる）。これに代えて、本発明に従うｈｒＨＰＶの分類は、前述のＤＮＡ増幅反応を使用することによって得られる、単位複製配列またはＤＮＡ増幅反応産物に対して直接行うこともできる。
【００５２】
プライマーおよびプローブ
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法における使用のための、ｈｒＨＰＶ ＤＮＡの増幅用のフォワードおよびバックワード増幅用プライマーのセットを提供する。これらのプライマーは、約８〜約３５、好ましくは約１５〜約３０、より好ましくは約１８〜約２５ヌクレオチドの配列長を有する、オリゴヌクレオチドプライマーであることが好ましい。最も好ましい実施形態において、フォワードプライマーは約２２〜２３のヌクレオチドを含み、一方、リバースプライマーは約１９〜２１のヌクレオチドを含む。好ましくは、プライマーの１つは、二本鎖ｈｒＨＰＶ単位複製配列の１つの鎖の固定または染色を容易にする基で標識される。
【００５３】
本発明のフォワードおよびバックワードプライマーのヌクレオチド配列は、プライマーと、ここで規定するｈｒＨＰＶ遺伝子のＥ７領域における２つのコンセンサス領域のうちの一方の位置の標的ＤＡＮとの間に、安定なハイブリッドを形成することを可能にするように設計されるべきである。そのために、フォワードプライマーのヌクレオチド配列は、好ましくは、図１に示したフォワードプライマーの群から選択される。同様に、バックワードすなわちリバースプライマーは、好ましくは、図１に示したバックワードプライマーの群から選択される。一斉に使用されるとき、図１のプライマーは、ここで規定するすべてのｈｒＨＰＶの遺伝子における対応領域のＤＮＡを増幅する。
【００５４】
プライマーは、増幅すべき各特異的配列の異なる鎖に存在するコンセンサス領域に対して、「実質的に」相補的であるように選択されている。図１のプライマーの配列と比べて、幾分短いまたは幾分長いプライマーを使用することも可能である。
【００５５】
単位複製配列は、種々のｈｒＨＰＶ間での、独特の配列のみならず、共通のモチーフによって特徴づけられる領域を含んでいる。
【００５６】
他の態様において、本発明は、個々のＨＰＶ型またはｈｒＨＰＶ型に属するサブセット型の型特異的検出または型選択的検出のための、オリゴヌクレオチドプローブを提供する。好ましい実施形態において、各ＨＰＶ型のために１つのプローブが提供され、それらのプローブは、したがって、型特異的である。本発明は、図２および図３に示した特異的ｈｒＨＰＶの型特異的検出のための、２セットの１５の好適な型特異的プローブ配列を開示する。いくつかの不一致は許容されるが、分類プローブはそれらの個々の標的配列に対して完全に相補的であることが好ましい。これまでに概説したように、図２および図３に示した配列の相補配列は、増幅反応が相補ＤＮＡフラグメントの増幅を可能にするという条件で、本発明の方法における型特異的プローブとして使用し得る。したがって、図２および図３のプローブに言及するときには、それらの相補配列をも含むことが意図されている。
【００５７】
型特異的検出プローブまたは型選択的検出プローブは、種々の分類手順において使用することができる。好適な手順はプローブの標的が固定される手順を含むが、プローブが固定される手順も使用してよい。後者の例として、バイオチップ型フォーマットおよびビーズフォーマットの両方に加えて、ＲＬＢまたはラインプローブアッセイなどのリバースラインブロットフォーマットを使用することができる。固定用の基質および選択された表面化学に応じて、当業者は、基質固定のためにオリゴヌクレオチドを標識する好適な基を選択することが可能である。好ましい実施形態において、この基は、プローブの５’末端に導入されるアミノ基である。
【００５８】
型特異的検出プローブは、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブであって、約８〜約３５の配列長、好ましくは約１５〜約３５の配列長を有するものである。ＥＩＡアッセイの場合、一般にはより長いプローブ、すなわち約２５〜約３５のヌクレオチド、好ましくは約２６〜３１のヌクレオチドが好ましい。ＲＬＢアッセイの場合、一般には、より短いプローブ、約１５〜約２２のヌクレオチド、より好ましくは約１８〜約２０のヌクレオチドのプローブで十分であろう。当業者であれば、一回のハイブリッド形成反応において使用されるプローブのセット内の各プローブのアニーリング温度が、Ｇ＋Ｃ成分とプローブ長との間に均衡を付与することによって適切に調整可能であることを知っている。
【００５９】
一つの実施形態において、本発明は、本発明の方法を行うためのプライマーとプローブとを含むキットを提供する。かかるキットの好ましい実施形態は、図１に開示された増幅用プライマーと、図２および図３の一方または双方に開示された型特異的プローブとの両方を有する。
【００６０】
これらに制限される訳ではないが、以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示す。
【実施例】
【００６１】
実施例１：純粋ウイルスＤＮＡのアッセイ
１００ｎｇヒト胎盤ＤＮＡのバックグラウンドにおいて、ｈｒＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８、ならびにＨＰＶ６，１１，２６，３４，４０，４２，４３，４４，５３，５４，５５，５７および６１を含む種々のＨＰＶ型のプラスミドＤＮＡの連続希釈物について、最初にＨＲＥ７−ＰＣＲアッセイを行った。５０μｌのＰＣＲ反応混合物は、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２と、２００μＭの各ｄＮＴＰと、２０ｐｍｏｌの各プライマーと、１ユニットのAmpliTaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer，フォスターシティー，カリフォルニア州）と、１０μｌの標的ＤＮＡとをTaq Goldバッファー中に含有した。４０のＰＣＲサイクルがＰＥ９７００サーモサイクラー（Perkin-Elmer，フォスターシティー，カリフォルニア州）を用いて行われた。各ＰＣＲ反応は、９４℃で６分間の予熱工程によって開始された後、変性工程（９４℃で３０秒）とプライマーアニーリング工程（６０℃で６０秒）と伸長工程（７２℃で６０秒）とから成る４０サイクルが続いた。ランピング時間は、上述の通りであった（van den Brule et al.,２００２年, J. Clin. Microbiol. ４０, ７７９−７８７）。最後の伸長工程は、４分間に延長された。
【００６２】
すべての１５のｈｒＨＰＶクローンがＥＩＡ読出しによって決定されるように明瞭な増幅信号を明らかにしたが、ヒトＤＮＡ、またはＨＰＶ６，１１，２６，３４，４０，４２，４３，４４，５３，５４，５５，５７および６６などの他のＨＰＶ型との交差反応は観察されなかった。ヒト胎盤ＤＮＡと混合されたクローンＨＰＶ１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６７および６８の希釈ラインが、試験当たり２００〜２０００のウイルスコピーに対応する、１０ｆｇ〜１００ｆｇのプラスミドＤＮＡの範囲にある分析感度を明らかにした。これは、試験当たり約１０のウイルスコピーを検出することによってはるかに感度がよかった、Ｅ７領域を標的とする公開されたｈｒＨＰＶ多重ＰＣＲアッセイの実績に矛盾する（Gheit et al., J Clin Microbiol.
２００６年：４４：２０２５−２０３１）。結果として、後者のアッセイは、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（Gheit et al., J Clin Microbiol. ２００６年：４４：２０２５−２０３１）よりも、多重感染を含む高いｈｒＨＰＶ感染数を検出した。また、ＲＬＢ分類は、交差反応なしで特異的信号を明らかにし、その感度はＥＩＡのものと同じ範囲にあった。
【００６３】
実施例２：組織サンプルの予備的研究
パイロット実験において、ＨＲＥ７−ＰＣＲアッセイの適用は、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって早期に試験された扁平上皮および腺癌組織型の両方の一連の子宮頸癌標本について開始された。これらは、Ｌ１ベースのＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって陰性に判定されたが、１以上のｈｒＨＰＶ型に対するＥ６／Ｅ７型特異的ＰＣＲによって陽性に判定されたサンプルを含む（Walboomers et al., J Pathol １９９９年：１８９：１２−１９；Zielinski et al., J Pathol ２００３年：２０１：５３５−５４３）。後者の研究結果は、ＧＰ５＋およびＧＰ６＋プライマー結合配列が存するＬ１領域の中断を伴うウイルスＤＮＡ組込みを示唆している。ＨＲＥ７−ＰＣＲアッセイは、今までのところ、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって得られる陽性を確認しただけではなく、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲでは陰性であるがＥ６／Ｅ７型特異的ＰＣＲでは陽性であった２５のサンプルを陽性に判定した。これらのパイロットデータに基づいて、Ｅ１またはＬ１ベースのＰＣＲアッセイと比較して、ＨＲＥ７−ＰＣＲが少なくとも５％以上子宮頸癌を検出できることを予想することができる。
【００６４】
実施例３：コホート調査における子宮頸部切屑の分析
子宮頸部切屑のＨＲＥ７−ＰＣＲアッセイの実績の分析について、本発明者らは、ＰＯＢＡＳＣＡＭ（Bulkmans et al., Int J Cancer ２００４年：１１０：９４−１０１）試験などの、種々の母集団に基づく子宮頸部スクリーニング試験の経過中に収集した子宮頸部切屑のより大きな系を調査した。この子宮頸部切屑は、合計で、ＣＩＮ３の女性の５６の切屑と、ＰＯＢＡＳＣＡＭ試験に参加した５年ごとの反復正常細胞診での３００の女性とを含んだ。さらなる分析は、種々のコホートにおけるprevalent/incident ＣＩＮ３の約１５００の女性から選ばれたＣＩＮ３の女性の粗細胞抽出物について行われた標準ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって陰性であった一連の３５の子宮頸部切屑に関連した。ＨＲＥ７ ＰＣＲは、単離されたＤＮＡについて行われたが、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲは、粗細胞抽出物（古典的ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ法；ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（粗細胞））と単離されたＤＮＡ（ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（単離））との両方について行われた。
【００６５】
ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（粗細胞）、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（単離）およびＨＲＥ７−ＰＣＲは、ＰＯＢＡＳＣＡＭのＣＩＮ３の女性の５６（１００％）の子宮頸部切屑のすべてに対して陽性の試験結果を明らかにした。正常サンプルに対する陽性率は、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（粗細胞）が１１／３００（３．７％、９５％ＣＩ：１．６〜５．９）であったのに対して、ＨＲＥ７−ＰＣＲが１９／３００（６．３％、９５％ＣＩ：３．５〜９．１）であった。ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（単離）は、ＨＲＥ７−ＰＣＲ（Ｐ＝０．５）と同様の数の正常切屑を陽性と判定した（すなわち１７／３００、５．６％、９５％ＣＩ：３．０〜８．２）。さらに、ＨＲＥ７−ＰＣＲは、２５／３５（７１％、９５％ＣＩ：５６〜８６）のＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（粗細胞）陰性のＣＩＮ３の女性の切屑に対して陽性であった。ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（単離）は３５の切屑のうちの１４（４０％、９５％ＣＩ：２４〜５６）に対して同様に陽性であったが、この陽性率は、ＨＲＥ７ ＰＣＲの陽性率よりも依然として低かった（Ｐ＜０．００１）。ＨＲＥ７−ＰＣＲを陽性と判定するが、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲを陰性と判定するこれらの場合に対して、ウイルス組込みがＡＰＯＴアッセイ（Klaes et al., Cancer Res. １９９９年，１５；５９：６１３２〜６１３６）によって実証されるであろう。
【００６６】
実施例４：リバースラインブロットを用いたＨＲＥ７ ＰＣＲおよびＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって遺伝子型決定する高リスクＨＰＶの比較
ＨＲＥ７−ＰＣＲおよびＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲの両方において陽性であった実施例３に詳述したサンプルの全ＰＣＲ産物は、両ＰＣＲアッセイに関連したＲＬＢ法を用いる遺伝子型決定を受けた。これらの場合に対して、両アッセイによって検出可能な１５のｈｒＨＰＶ型のうちの１以上を遺伝子型決定するための一致は、１００％（Kappa＝１．０）であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸癌におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出、より詳細には、高リスク子宮頸部ＨＰＶのヌクレオチド配列に基づく検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
高リスクヒトパピローマウイルス（ｈｒＨＰＶ）感染と子宮頸癌との因果関係が、疫学的研究および機能的研究から明らかとなってきた（Zur Hausen, ２００２年, Nat. Rev. Cancer ２：３４２−３５０; Bosch et al., ２００２年, J. Clin. Pathol. ５５：１４４−２６５）。ＨＰＶゲノムは、８ｋｂ環状二本鎖ＤＮＡであって、同じ鎖上にすべてコードされる８遺伝子を含むＤＮＡである。ヒトにおいて、２００もの異なるＨＰＶ型が識別されている（Burd, E. M. ２００３年, Clin Microbiol Rev.１６：１−１７）；これらのおおよそ４０の型が、生殖管に感染することができるとわかっている。広い世界規模のケースコントロール研究のプールされた分析に基づいて、ｈｒＨＰＶ型の疫学的分類がなされ、１５のＨＰＶ型（ＨＰＶ１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６８，７３および８２）を高リスクであるとして分類し、別の３型（ＨＰＶ２６，５３および６６）をおそらく高リスクであるとして分類することができることが示されている（Munoz et al., ２００３年, N. Eng. J. Med. ３４８：５１８−５２７）。ｈｒＨＰＶは、子宮頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）の９９．７％において（Walboomers et al., １９９９年, J. Pathol. １８９：１２−１９）、および子宮頸部腺癌および腺扁平上皮癌の少なくとも９４％で（Zielinsky et al., ２００３年, J. Pathol. ２０１：５３５−５４３）、検出されている。
【０００３】
子宮頸癌は、すべての女性の癌のほぼ１０％の割合を占め、発展途上国の女性の癌の主因である（Franco, E. L. et al., ２００１年, Can Med Assoc J １６４：１０１７−２５）。この病気の最も高い発生率を有する地域は、一般に、最も高い死亡率を有する地域であり、中央アメリカ、アフリカ、およびカリブ海諸島を含む（Ferlay, J. et al., １９９８年. IARC CancerBase no. 3. Lyon:IARC Press.）。ヨーロッパおよび北アメリカでの発生は、おそらく、パパニコロ（Ｐａｐ）スミア試験（Franco et al., ibidにレビューされる）によるルーチンスクリーニングの出現によって、過去５０年にわたって急激に下降した。子宮頸癌は、生存率が診断時の病気の段階に直接関連する、最も予防可能な癌の１つである。５年生存率は、遠隔的な病気と診断された女性の１３％とは反対に、局所的な病気と初期診断された女性について、８８％である（Report of the Gynecologic Cancers Progress Review Group, November ２００１年, National Cancer Institute）。米国において子宮頸癌と診断された女性の５０％以上は、過去３年にＰａｐスミアを受けていなかった（Wright, T. C. et al., ２０００年, JAMA ２８３：８１−６）。
【０００４】
Ｐａｐスクリーニングは依然として、癌および前癌子宮頸部病変を検出する有力な方法であり、５千万以上の女性が、米国において、毎年、Ｐａｐスクリーニングを経験している（Wright, T. C. et al., ２００２年, JAMA ２８７：２１２０−２９）。その広範囲に及ぶ使用にも関わらず、Ｐａｐスミア試験は、部分的に効果的であるだけで、実質的な程度の偽陰性および偽陽性の双方の試験結果を示しており、いくつかの推定に基づけば、従来のＰａｐスミア試験の感度は、５０〜６０％（Lorincz, A. T. and Richart, R. M., ２００３年, Arch Pathol Lab Med １２７：９５９−６８; Nanda, K. et al., ２０００年. Ann Intern Med １３２：８１０.; Fahey MT, et al. １９９５年, Am J
Epidemiol.１４１：６８０−９; Myers ER, McCrory DC, Subramanian S, et al. ２０００年, Obstet Gynecol ９６：６４５−５２.）から７０〜８０％（Clavel, C. et al., ２００１年, Br J Cancer ８４：１６１６）にまで変動する。液体ベースの試験などの、細胞学的スクリーニングおよびサンプリングにおける最近の革新は、これらの方法の感度を７５〜９５％に改善した（Lorincz, A. T. et al. ibid ; Nanda, K. et al., ibid. ;
Hutchinson ML, Zahniser DJ, Sherman ME, et al. １９９９年 Cancer.８７：４８−５５）。それにも関わらず、これらの改善された方法でさえ、異常な、そしてしばしば前癌の細胞のかなりの部分を検出しない。ｈｒＨＰＶ ＤＮＡ試験のＰａｐ試験への付加が、特に子宮頸癌および最も近い前癌病変（すなわち、病変ＣＩＮ３）についての高い陰性予測値のために、子宮頸部スクリーニングプログラムの有効性を改善しそうである。さらに、いくつかの機関が、従来の細胞学的方法との併用における、またはある場合ではその代用における、ＨＰＶ ＤＮＡスクリーニングの使用を標榜している（Wright, T. C. and Schiffman, M., ２００３年, N. Engl. J. Med. ３４８：４８９−９０）。
【０００５】
現在最も幅広く利用されているＨＰＶ試験は、２つの原理に基づいている。１つ目は、ＦＤＡ承認のハイブリッドキャプチャ２（ｈｃ２）アッセイにおいて使用されるように、ＨＰＶ標的ＤＮＡの、全長ＨＰＶ型特異的ＲＮＡのカクテルとのハイブリダイゼーションに続き、固体相にＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを捕獲することを含む。続いて、シグナル増幅が、特異的にＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識する複数の結合抗体とのハイブリッドの結合によって、達成される。２つ目の原理は、すべての関連する生殖系のｈｒＨＰＶ遺伝子型のＥ１またはＬ１オープンリーディングフレーム内で高度に保存される領域に結合する、いわゆるコンセンサスプライマーまたはジェネラルプライマーによって向けられる、ＨＰＶ標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む。種々の読出しシステムが後者のアッセイのために記載されてきたが、個々に、もしくはカクテルのいずれかで、型特異的オリゴプローブを用いる（Jacobs et al., １９９７年, J Clin Microbiol ３５：７９１−７９５;
Kleter et al., １９９８年, Am J Pathol: １５３：１７３１−１７３９）酵素免疫アッセイ（たとえばＥＩＡ、ＤＥＩＡ）、またはリバースラインブロットアッセイ（たとえばＬｉＰＡ、ＲＬＢ（van den Brule et al., ２００２年, J Clin Microbiol ４０：７７９−７８７; Kleter et al., １９９９年, J Clin Microbiol; ３７：２５０８−２５１７; Gravitt et al., １９９８年, J Clin Microbiol ３６：３０２０−３０２７））が、今日最も普通に使用されている。ＨＰＶコンセンサスＰＣＲシステムのうち、ＭＹ１１／０９−ＰＣＲプライマーから再設計されたＬ１ベースのＰＧＭＹ−ＰＣＲ（Gravitt et al., ２０００年, J Clin Microbiol ３８：３５７−３６１）、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（van den Brule et al., ２００２年, J Clin Microbiol ４０：７７９−７８７）およびＳＰＦ１０−ＬｉＰＡ（Kleter et al., １９９９年, J Clin Microbiol ３７：２５０８−２５１７）が、現在最も頻繁に利用されている。より最近、新規のＬ１ベースのコンセンサスＰＣＲシステムである、Roche AMPLICOR（登録商標）HPV Testが発売され、これは、１３のｈｒＨＰＶ型を検出することができる。
【０００６】
現在すべての利用可能なｈｒＨＰＶ試験システムは、アッセイまたは読出し条件を適合させても容易に解決され得ないいくつかの固有の欠点を有する。特に、ｈｒＨＰＶ陽性の症例にリフレックス細胞学が適用されるｈｒＨＰＶ試験が一次スクリーニング手段として考察される場合、これらの欠点は、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌の試験の陽性または陰性のいずれかの予測値について、実質的に陰性の結果を有するかもしれない。このことは、自己採取された膣材料がスクリーニング目的のために使用される場合に、特に関連がある。この材料は、信頼できる細胞学的評価に適していないが、子宮頸部のｈｒＨＰＶ状態を高度に表す。
【０００７】
Ａ．ｈｃ２法は、プローブ混合物においては表されない、低リスクＨＰＶ型を含むＨＰＶ型とのある程度の交差反応を示す（Castle et al., Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev. ２００２年: １１：１３９４−１３９９）。これは、子宮頸癌のリスク評価についてのこのアッセイの特異性に負の影響を及ぼす。
【０００８】
Ｂ．一方、種々のＰＣＲベースのシステムは、ｈｒＨＰＶに対して異なる分析感受性を示し、これは実際、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌に対して異なる特異性を引き起こす。後者は、多くのｈｒＨＰＶ感染、特に低いウイルス負荷を有するｈｒＨＰＶ感染が、臨床的に関連のない一過性感染を反映する一方で、高いグレードの子宮頸部の病変に関連する感染は概して、増大したウイルス負荷によって特徴付けられるという事実によっている（Snijders et al., J Pathol. ２００３年: ２０１：１−６; van
Duin et al., Int J Cancer ２００２年: ９８：５９０−５９５; Schlecht et al Int J cancer ２００３年: １０３：５１９−５２４）。ゆえに、分析試験の感度（すなわち、ｈｒＨＰＶを検出する感度）は、臨床実施およびスクリーニング実施における使用にとって充分な要件ではない。ｈｒＨＰＶを検出するのに感度のよ過ぎる試験は、高いグレードの子宮頸部病変についての特異性の低下を被る。というのも、一過性のｈｒＨＰＶ感染の検出の増大が、低いウイルス負荷によって特徴付けられるからである。結果として、ほとんどのコンセンサスｈｒＨＰＶ ＤＮＡアッセイは、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌について類似の感度を示す一方で、特異性値は著しく変動し得る。現在、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲおよびｈｃ２アッセイは、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌について、感受性と特異性との間で最適な均衡を示すただ２つの試験であり、したがって臨床的に確証されていると考えることができる（Lorincz and Richart, Arch
Pathol Lab Med ２００３年: １２７：９５９−９６８; Bulk et al. Int J Cancer ２００７年: １２１：３６１−３６７）。これらのアッセイは、ＣＩＮ２病変の検出のために使用される場合、類似の感受性および特異性を有する（Hesselink et al. J Clin
Microbiol ２００６年: ４４：３６８０−３６８５）。
【０００９】
Ｃ．特に、高いグレードの前癌性子宮頸部病変および子宮頸癌において、ｈｒＨＰＶゲノムはしばしば宿主細胞のゲノム内に組込まれる。この現象はしばしば、Ｅ１からＬ１までのオープンリーディングフレームに広がり得る領域でのウイルスゲノムの中断を伴うので、この現象は、これらの領域におけるウイルスＤＮＡのＰＣＲ媒介増幅の結果をもたらし得る。実際、組込みが、約４％の子宮頸部ＳＣＣ（Walboomers et al., １９９９年, J Pathol １８９：１２−１９）、５％の全ＨＳＩＬ、６％の子宮頸部腺扁平上皮癌のｉｎ ｓｉｔｕの病変、および１０％の子宮頸部腺扁平上皮癌（Zielinski et al., ２００３年, J Pathol ２０１：５３５−５４３）における、Ｅ１および／またはＬ１ベースのＰＣＲアッセイによるウイルスＤＮＡの検出を妨げるという指摘がある。Ｅ１およびＬ１ベースのＰＣＲ法の、子宮頸癌および高いグレードの前駆性病変に対するこれらの偽陰性スコアは、ｈｒＨＰＶ陽性の症例にリフレックス細胞学が適用されるｈｒＨＰＶ試験が一次スクリーニング手段として考察される場合、受け入れられないほど高い。
ゆえに、ｈｒＨＰＶの改良された検出システムの必要性が今なお存在する。
【発明の概要】
【００１０】
これらの困難を克服するために、発明者らは、高いグレードの子宮頸部病変に対してＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲとよく似た特異性を示すが、ウイルスＤＮＡの組込みによって影響されない、１４のｈｒＨＰＶ型（すなわち、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６および６８）、および候補ｈｒＨＰＶ型（ＨＰＶ６７）の、一斉検出の方法を今回発見した。さらに、本発明のさらなる態様において、発明者らは、検出方法と適合し得る前述のｈｒＨＰＶ型に属するＨＰＶ型についての効率的な分類システムの方法を発見した。
【００１１】
本発明に従うｈｒＨＰＶの検出方法は、ｈｒＨＰＶを有する疑いのあるサンプルを提供し、前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡに集合的に、実質的に相補的な複数のフォワードおよびバックワードプライマーを提供し、前記複数のプライマーを用いて前記サンプルに由来するＤＮＡを増幅させる反応を実行し、ＤＮＡ増幅反応の反応産物を、複数の特異的ｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによって、ｈｒＨＰＶ型由来のＤＮＡ増幅産物を検出する工程を含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、ｈｒＨＰＶの分類方法であって、複数のフォワードおよびバックワードプライマーを用いてｈｒＨＰＶのＤＮＡを増幅することによってＤＮＡ増幅産物を提供し、前記増幅産物を、すべてではないが少なくとも１つのｈｒＨＰＶ型のＤＮＡに実質的に相補的な少なくとも１つの特異的ｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによって、１以上のｈｒＨＰＶ型からのＤＮＡ増幅産物を検出する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、ｈｒＨＰＶ−ＤＮＡの増幅用の、フォワードおよびバックワード増幅用プライマーのセットを提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、個々のｈｒＨＰＶ型の、型特異的検出または型選択的検出のための、型特異的オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ｈｒＨＰＶ由来ＨＲＥ７のＰＣＲ増幅に用いられるフォワードおよびバックワードプライマーのセットを示す。
【図２】ＨＲＥ７−ＰＣＲ産物の検出用ＥＩＡプローブの配列を示す。
【図３】ＨＲＥ７−ＰＣＲ産物の分類用ＲＬＢプローブの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
「相補体」または「相補配列」は、ワトソン−クリックの塩基対合法則に従って、別のヌクレオチド配列と水素結合二量体を形成するヌクレオチド配列である。たとえば、５’−ＡＡＧＧＣＴ−３’の相補塩基配列は、３’−ＴＴＣＣＧＡ−５’である。
【００１７】
「発現」は、遺伝子の、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、および適用可能な場合には、続くタンパクへの翻訳、を表す。
【００１８】
ポリヌクレオチドは、同じ生物において一斉に自然発生しない場合、互いに「非相同」である。ポリヌクレオチドは、生物において特定の型および配置で自然発生しない場合、その生物に非相同である。
【００１９】
ポリヌクレオチドは、２つの配列におけるヌクレオチド配列が、ここに記載されるように、最大一致でアライメントされた場合に同じであるのならば、「相同の」配列を有する。２以上のポリヌクレオチド間の配列比較は、概して、配列類似性の局所領域を識別および比較するために、比較ウインドウの全体にわたって２つの配列の部分を比較することによって、実行される。比較ウインドウは、概して、約２０〜２００の連続ヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの、５０，６０，７０，８０，９０，９５，９８，９９または１００パーセントの配列ホモロジなどの「配列ホモロジのパーセンテージ」は、比較ウインドウの全体にわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定することができ、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列（付加または欠損（すなわちギャップ）を含まない）と比較して、付加または欠損を含み得る。パーセンテージは、（ａ）同じ核酸塩基が双方の配列において生じる位置の数を決定して、一致位置の数を算出し、（ｂ）一致位置の数を、比較ウインドウにおける位置の総数で割り、（ｃ）結果に１００を掛けて、配列ホモロジのパーセンテージを算出することによって、計算される。比較のための配列の最適のアライメントは、周知のアルゴリズムのコンピュータ実施によって、または検査によって、行われてよい。容易に利用可能な配列比較およびマルチプル配列アライメントアルゴリズムはそれぞれ、Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschul, S.F. et al. １９９０年. J. Mol. Biol. ２１５：４０３; Altschul, S.F. et al. １９９７年.
Nucleic Acid Res. ２５：３３８９−３４０２）およびClustalWプログラムであり、双方ともインターネット上で入手可能である。他の適当なプログラムは、Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group（GCG）,米国、ウィスコンシン州、マディソン）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＦＡＳＴＡを含む。
【００２０】
本明細書で使用するように、「実質的に相補的な」は、２つの核酸配列が相互に、少なくとも約９０％、好ましくは約９３％、より好ましくは約９５％、最も好ましくは約９８％の配列相補性を有することを意味する。このことは、プライマーおよびプローブがそれらの鋳型および標的核酸に対する十分な相補性をそれぞれ示して、厳密条件下においてハイブリダイズしなければならないことを意味する。したがって、本明細書に開示されたプライマー配列は、鋳型上の結合領域の正確な配列を反映する必要はなく、縮重プライマーが用いられてもよい。実質的に相補的なプライマー配列は、増幅用鋳型に対して十分な配列相補性を有してプライマー結合および第二鎖合成を結果として生じるものである。
【００２１】
用語「ハイブリッド」は、相補的ヌクレオチド間の水素結合によって形成される二本鎖核酸分子、すなわち二量体を意味する。用語「ハイブリダイズ」または「アニール」は、一本鎖の核酸配列が相補的なヌクレオチド間の水素結合によって二重らせん部分を形成するプロセスを意味する。
【００２２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、リン結合（たとえばホスホジエステル、リン酸アルキルおよびアリール、ホスホロチオエート）、または非リン結合（たとえばペプチド、サルファミン酸塩およびその他）によって結合された短配列のヌクレオチドモノマー（通常、６〜１００個のヌクレオチド）を意味する。オリゴヌクレオチドは、修飾された塩基（たとえば５−メチルシトシン）と、修飾された糖類（たとえば２’−Ｏ−メチルリボシル、２’−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−アミノリボシルなど）とを有する修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、環状、分岐または直線状であって、任意に安定した二次構造（たとえばステム−ループ構造およびループ−ステム−ループ構造）を形成することができるドメインを含む、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡの自然発生または合成分子であってもよい。
【００２３】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、ＤＮＡポリメラーゼを付着させることを可能にする増幅用標的にアニーリングすることができ、これによって核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下にあるときに、すなわちヌクレオチドとＤＮＡモリメラーゼなどのポリメリゼーションのための薬剤との存在下および適切な温度およびｐＨでのＤＮＡ合成の開始点として機能する、オリゴヌクレオチドを意味する。この（増幅用）プライマーは、増幅における最大効率のために一本鎖とされることが好ましい。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、ポリメリゼーションのための薬剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマー温度およびプライマー源を含む多くの因子に依存するであろう。本明細書で使用される「一対の二方向プライマー」は、ＰＣＲ増幅におけるＤＮＡ増幅の技術において一般的に使用される１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーを意味する。
【００２４】
用語「プローブ」は、水素結合二量体を標的核酸配列分析物またはそのｃＤＮＡ誘導体において相補的な配列で識別し形成するであろう一本鎖オリゴヌクレオチド配列を意味する。
【００２５】
用語「ストリンジェンシー」または「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、たとえば温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などのハイブリッドの安定性に影響を与えるハイブリダイゼーション条件を意味する。これらの条件は、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列への特異的な結合を最大にし、非特異的な結合を最小にするために経験的に最適化される。使用されるこれらの用語は、プローブまたはプライマーがその標的配列に、他の配列よりも検出可能に大きな程度（たとえばバックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズするであろう条件への参照を含む。厳密条件は、配列に依存し、異なる状況では異なるであろう。一般的に、厳密条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列に対して、解離温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選ばれる。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に適合したプローブまたはプライマーにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨの下）である。典型的には、厳密条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が、１．０Ｍ Ｎａ＋イオン以下、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブまたはプライマー（たとえば１０〜５０個のヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃、長いプローブまたはプライマー（たとえば５０個よりも多いヌクレオチド）に対して少なくとも約６０℃である、というものである。厳密条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されてもよい。模範的な低い厳密条件、すなわち「ストリンジェンシーを下げた条件」は、３０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳのバッファー溶液による３７℃におけるハイブリダイゼーションと、２ｘＳＳＣ内での４０℃における洗浄とを含む。模範的な高い厳密条件は、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳ内での３７℃におけるハイブリダイゼーションと、０．１ｘＳＳＣ内での６０℃における洗浄とを含む。ハイブリダイゼーション手順は、当該技術において周知であり、たとえば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons Inc., １９９４年に記載されている。
【００２６】
本発明の方法は、高リスクヒトパピローマウイルス（ｈｒＨＰＶ）によって引き起こされる子宮頸癌および他の肛門性器癌におけるｈｒＨＰＶの亜群に属するヒトパピローマウイルスの検出、同定および診断を可能にする。
【００２７】
ｈｒＨＰＶの検出
本発明に従う、１４のｈｒＨＰＶ型（すなわち、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６および６８）および候補ｈｒＨＰＶ型（ＨＰＶ６７）（以降ｈｒＨＰＶと示す）の検出方法は、ヒト臨床サンプルに実行されてよい。好ましくは、本発明の方法における使用のためのサンプルは、子宮頸癌のリスクを評価するための、女性の子宮頸部スメアサンプルを含む。
【００２８】
本発明の方法における使用のためのこのようなサンプルを獲得および調製する方法は、当業者に周知であるか、本開示から明らかとなろう。ＤＮＡの分析および操作に関する一般的な方法については、たとえばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, 第１~３巻, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press （１９８９年）またはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Greene Publishing and
Wiley-Interscience, ニューヨーク（１９８７年）およびその定期的なアップデートを参照されたい。
【００２９】
好ましくは、本発明に従う方法は、１４のｈｒＨＰＶ型（すなわち、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６および６８）および候補ｈｒＨＰＶ型（ＨＰＶ６７）の検出のために、使用される。
【００３０】
本発明の有利な態様は、まだ試験されていないか、発見されていないｈｒＨＰＶのサブグループのメンバが、本発明の方法を用いることによって、適切に検出され得ることである。
【００３１】
本発明のｈｒＨＰＶの検出方法において、６のフォワードプライマーおよび９のバックワードプライマーのセットであって、いくつかが重複し、ＨＰＶ型に応じて、Ｅ７オープンリーディングフレームの約２１５〜２４５塩基対のフラグメントを協働して増幅するセットを用いる、コンセンサスＰＣＲベースの方法が記載される。
【００３２】
ウイルス腫瘍形成遺伝子Ｅ７は、ｈｒＨＰＶによって仲介される形質転換表現型の開始および維持の双方にとって、重要である。事実、これは、Ｅ７オープンリーディングフレームが常に子宮頸癌およびその前駆段階において維持されることを意味する（先のZur
Hausen）。加えて、驚いたことに、Ｅ７領域は、他のＨＰＶ型と交差反応しないプライマーおよびプローブの組合せを選択するためには充分に、異なるＨＰＶ型間で非相同であることが明らかとなった。
【００３３】
前述のフォワードおよびバックワードプライマーは、ＨＰＶ型１６ゲノム（GenBank系統番号ＮＣ ００１５２６）のそれぞれヌクレオチド位置６２２〜６４４間、および８２８〜８４７間の領域、ならびに他のｈｒＨＰＶ遺伝子型のゲノム内の同等の位置の領域に、一致する。カクテルにおける最も一致するプライマーは、各ＨＰＶ型の標的配列と最大で２の不一致を有する。
【００３４】
この発見に基づいて、本発明は、個々のプライマーが各々、１以上のｈｒＨＰＶ型のＥ７領域にアニーリングすることができる、フォワードおよびバックワードプライマーのセットを提供する。６フォワードプライマーおよび９バックワードプライマーの完全セットは、一斉に用いた場合、言及されるあらゆるｈｒＨＰＶのＥ７ ＤＮＡにアニーリングすることができ、ＨＰＶ１６の６２２〜６４４の位置と、８２８〜８４７の位置との間で規定されるＤＮＡ配列、およびこれらの位置に隣接するＤＮＡ配列、ならびに他のｈｒＨＰＶ型のゲノム内の同等の位置のＤＮＡ配列、を増幅することができる複数のプライマーを提供する。
【００３５】
このプライマーのセットの強みは、最適な感度を維持しながら、ｈｒＨＰＶ型に対して広い特異性を有することである。感度は、真のｈｒＨＰＶ感染を検出することができるほど充分に高いと同時に、サンプルにおけるｈｒＨＰＶの一時的で臨床的に関連のない量として特徴付けられる、非常に低いウイルス負荷によっては誘発されないほど充分に低いので、最適である。この注目すべき組合せは、ほとんどの場合、標的ウイルス配列に１００％相補的でなく、１または２の不一致を含むプライマーを選択することによって、達成される。たとえば国際公開第０３／０２０９７６号に開示されるプライマーセットなどの先行技術のプライマーセットは、ｈｒＨＰＶに対して高い分析感度を有し、その結果、ＣＩＮ２またはＣＩＮ３病変に対してより低い特異性を有する（Snijders, P. et al., ２００３年, J. Pathol. ２０１：１−６）。
【００３６】
前記領域を増幅するためのフォワードおよびバックワードプライマーのセットは、図１に表される。幾分短い、または幾分長いプライマーを使用することもできる。この図１のプライマーのセットにおいて、プライマーミックスのＴｍを等しくするために、バックワードプライマーはフォワードプライマーよりも意図的に短い。
【００３７】
本発明の方法は、原則的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ; Mullis １９８７年, 米国特許第４６８３１９５号、米国特許第４６８３２０２号、および米国特許第４８００１５９号）などの何らかの核酸増幅方法を用いることによって、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ; Barany １９９１年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１８９−１９３; 欧州特許第３２０３０８号）、Self-Sustained Sequence Replication（３ＳＲ; Guatelli et al., １９９０年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：１８７４−１８７８）、Strand
Displacement Amplification（ＳＤＡ; 米国特許第５２７０１８４号、および米国特許第５４５５１６６号）、Transcriptional Amplification System（ＴＡＳ; Kwoh et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：１１７３−１１７７）、Q-Beta Replicase（
Lizardi et al., １９８８年, Bio/Technology ６：１１９７）、Rolling Circle
Amplification（ＲＣＡ; 米国特許第５８７１９２１号）、Nucleic Acid Sequence Based Amplification（ＮＡＳＢＡ）、Cleavage Fragment Length Polymorphism（米国特許第５７１９０２８号）、Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of
Nucleic Acid（ＩＣＡＮ）、Ramification-extension Amplification Method（ＲＡＭ; 米国特許第５７１９０２８号および米国特許第５９４２３９１号）もしくは他の適切なＤＮＡの増幅方法などの増幅反応を用いることによって、実行することができる。
【００３８】
本発明に従う好ましい実施形態は、図１の６フォワードプライマーおよび９バックワード（すなわちリバース）プライマーのセットによるｈｒＨＰＶ−ＤＮＡのプライマー開始増幅を含むＰＣＲ法を用いる。
【００３９】
１以上の増幅プライマーとの少数の不一致のあるＨＰＶ型のＤＮＡを増幅するために、増幅反応は、ストリンジェンシーを下げた条件下で実行してもよい（たとえば、アニーリング温度を３８°Ｃにまで下げた、または３．５ｍＭにまでＭｇＣｌ２を高めた、ＰＣＲ増幅）。当業者は、適当なストリンジェンシーの条件を選択することができる。
【００４０】
増幅産物の検出は、原則的に、当該技術において知られているあらゆる適切な方法によって、達成することができる。検出フラグメントは、放射性ラベル、抗体、発光染料、蛍光染料、または酵素試薬で直接的に染色または標識されてもよい。直接的なＤＮＡ染色は、たとえば、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、エチジウムモノアジドまたはHoechst dyeなどのインターカレーション染料を含む。好ましくは、ＥＩＡフォーマットが、図２に例示されるような型特異的オリゴプローブのカクテルの援助により、使用可能である。別の好ましい実施形態において、固定された型特異的オリゴプローブ（図３）によるハイブリダイゼーションによって、検出が行われる。
【００４１】
代わりに、ＤＮＡフラグメントは、合成ＤＮＡフラグメント内への標識ｄＮＴＰ塩基の組込みによって、検出されてもよい。ヌクレオチド塩基に関連し得る検出標識は、たとえば、フルオレセイン、シアニン染料またはBrdUrdを含む。
【００４２】
本発明は、好ましくは、反応産物を１以上の特異的ｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによる、ｈｒＨＰＶ ＤＮＡでの前述したＤＮＡ増幅反応によって得られる反応産物の検出、を含む。
【００４３】
プローブベースの検出システムを用いる場合、本発明における使用に適切な検出手順は、たとえば、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）フォーマットを含んでもよい（Jacobs et al., １９９７年, J. Clin. Microbiol. ３５, ７９１−７９５）。ＥＩＡ手順による方法で検出を実行するために、増幅反応に用いられるフォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかは、後のｈｒＨＰＶ単位複製配列のＥＩＡ検出用の、たとえばストレプトアビジン被覆マイクロタイタプレートウェルへのｈｒＨＰＶ ＤＮＡ ＰＣＲ単位複製配列の固定のための、ビオチン基などの捕獲基を含んでもよい（下記参照）。当業者は、ＥＩＡフォーマットにおけるｈｒＨＰＶ−ＤＮＡ ＰＣＲ単位複製配列の固定のために、他の基が用いられてもよいことを理解するであろう。
【００４４】
ｈｒＨＰＶの分類
さらに、Ｅ７領域は、他のＨＰＶ型と交差反応しないプライマーおよびプローブ組合せを選択するのに足りるほど、異なるＨＰＶ型間で充分に非相同であることが明らかとなった。
【００４５】
したがって、本発明の別の態様において、上で列挙したｈｒＨＰＶ型に属する種々のＨＰＶ型は、１つの特異的な高リスク型のＨＰＶの単位複製配列にのみ、個々に結合する複数の型特異的ｈｒＨＰＶ検出プローブを用いることによって、検出されてもよい。ゆえに、ここで規定される２つのコンセンサス領域間でＤＮＡ配列領域を増幅し、続いて個々のＨＰＶ型の独特な配列にプロービングすることによる、種々の高リスクＨＰＶの分類方法が提供される。
【００４６】
ここに開示されるＥ７領域の型特異的検出に有用なプローブは、ＥＩＡ検出のために図２に、およびリバースラインブロット（ＲＬＢ）による検出のために図３に、例示される。これらの型特異的プローブは好ましくは、ｈｒＨＰＶの群に属する単一のＨＰＶ型の２つのコンセンサス領域間で増幅されたＤＮＡ配列領域の少なくとも一部にのみ、結合する。また、図３に列挙される相補配列は、このような相補鎖が、利用される増幅反応において増幅されることを条件に、本発明の方法における型特異的検出プローブとして好適に使用され得る。
【００４７】
本発明に従う分類方法で使用されるプローブは、ある１つのまたは複数のＨＰＶ型の単位複製配列に選択的に結合するが、ストリンジェンシーが非常に低いハイブリダイゼーション条件下では、他のＨＰＶ型の単位複製配列に結合しないか、弱く結合するだけである。したがって、１つの実施形態において、本発明は、患者に感染しているＨＰＶの型を決定するのに用いることができる。これは、悪性疾病への進行（従って臨床予後）がＨＰＶ型に強く依存しているため、非常に意義深い。したがって、分類の態様において、本発明は、患者におけるＨＰＶ感染の型を決定する方法を提供する。
【００４８】
本発明のｈｒＨＰＶ分類方法の好ましい実施形態において、１５の異なるｈｒＨＰＶに由来し得る単位複製配列中の型特異的配列にハイブリダイズする、１５の異なるプローブ（図３）またはそれらの相補配列のセットが、使用される。
【００４９】
本発明の分類態様における使用のための好適な検出手順は、たとえば、単位複製配列の固定およびそのＤＮＡ配列の、たとえばサザンブロッティングによる、プロービングを含む。他のフォーマットは、前述のＥＩＡフォーマットを含む（その場合、好ましくは図２のプローブが使用される）。結合の検出を容易にするために、型特異的ｈｒＨＰＶは、増幅反応の反応産物へのプローブの結合の監視を容易にする、蛍光団、発色団、酵素または放射性標識などの標識部分を含み得る。そのような標識は、当業者に周知であり、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、β−ガラクトシデース、セイヨウワサビペルオキシデース、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、３５Ｓまたは１２５Ｉが含まれる。他の例は当業者にとって明白であろう。
【００５０】
他の方法を採用してもよいが、本発明に従う分類方法は、好ましくは、ＰＣＲ産物を、ビーズ、または、最近論文に記載された、たとえばＬ１ベースのコンセンサスＨＰＶ ＰＣＲ法（van den Brule et al.，２００２年，J. Clin. Microbiol. ４０，７７９ ７８７）のためなどの、ＲＬＢフィルタに固定した型特異的プローブに、ハイブリダイゼーションさせることによって行う。このために、好ましくは、たとえばカルボキシル被覆ナイロン膜への、後に行う固定のための５’アミノ基を有するＲＬＢプローブが合成される。このようなフォーマットの利点は、システムの容易さとその速度であり、サンプル処理の高いスループットが可能になる。
【００５１】
本発明に従うｈｒＨＰＶの分類方法は、前述のように、採取直後のサンプル材料に対して行うことができる（そのようなサンプルが充分なウイルスＤＮＡを提供する場合に限られる）。これに代えて、本発明に従うｈｒＨＰＶの分類は、前述のＤＮＡ増幅反応を使用することによって得られる、単位複製配列またはＤＮＡ増幅反応産物に対して直接行うこともできる。
【００５２】
プライマーおよびプローブ
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法における使用のための、ｈｒＨＰＶ ＤＮＡの増幅用のフォワードおよびバックワード増幅用プライマーのセットを提供する。これらのプライマーは、約８〜約３５、好ましくは約１５〜約３０、より好ましくは約１８〜約２５ヌクレオチドの配列長を有する、オリゴヌクレオチドプライマーであることが好ましい。最も好ましい実施形態において、フォワードプライマーは約２２〜２３のヌクレオチドを含み、一方、リバースプライマーは約１９〜２１のヌクレオチドを含む。好ましくは、プライマーの１つは、二本鎖ｈｒＨＰＶ単位複製配列の１つの鎖の固定または染色を容易にする基で標識される。
【００５３】
本発明のフォワードおよびバックワードプライマーのヌクレオチド配列は、プライマーと、ここで規定するｈｒＨＰＶ遺伝子のＥ７領域における２つのコンセンサス領域のうちの一方の位置の標的ＤＡＮとの間に、安定なハイブリッドを形成することを可能にするように設計されるべきである。そのために、フォワードプライマーのヌクレオチド配列は、好ましくは、図１に示したフォワードプライマーの群から選択される。同様に、バックワードすなわちリバースプライマーは、好ましくは、図１に示したバックワードプライマーの群から選択される。一斉に使用されるとき、図１のプライマーは、ここで規定するすべてのｈｒＨＰＶの遺伝子における対応領域のＤＮＡを増幅する。
【００５４】
プライマーは、増幅すべき各特異的配列の異なる鎖に存在するコンセンサス領域に対して、「実質的に」相補的であるように選択されている。図１のプライマーの配列と比べて、幾分短いまたは幾分長いプライマーを使用することも可能である。
【００５５】
単位複製配列は、種々のｈｒＨＰＶ間での、独特の配列のみならず、共通のモチーフによって特徴づけられる領域を含んでいる。
【００５６】
他の態様において、本発明は、個々のＨＰＶ型またはｈｒＨＰＶ型に属するサブセット型の型特異的検出または型選択的検出のための、オリゴヌクレオチドプローブを提供する。好ましい実施形態において、各ＨＰＶ型のために１つのプローブが提供され、それらのプローブは、したがって、型特異的である。本発明は、図２および図３に示した特異的ｈｒＨＰＶの型特異的検出のための、２セットの１５の好適な型特異的プローブ配列を開示する。いくつかの不一致は許容されるが、分類プローブはそれらの個々の標的配列に対して完全に相補的であることが好ましい。これまでに概説したように、図２および図３に示した配列の相補配列は、増幅反応が相補ＤＮＡフラグメントの増幅を可能にするという条件で、本発明の方法における型特異的プローブとして使用し得る。したがって、図２および図３のプローブに言及するときには、それらの相補配列をも含むことが意図されている。
【００５７】
型特異的検出プローブまたは型選択的検出プローブは、種々の分類手順において使用することができる。好適な手順はプローブの標的が固定される手順を含むが、プローブが固定される手順も使用してよい。後者の例として、バイオチップ型フォーマットおよびビーズフォーマットの両方に加えて、ＲＬＢまたはラインプローブアッセイなどのリバースラインブロットフォーマットを使用することができる。固定用の基質および選択された表面化学に応じて、当業者は、基質固定のためにオリゴヌクレオチドを標識する好適な基を選択することが可能である。好ましい実施形態において、この基は、プローブの５’末端に導入されるアミノ基である。
【００５８】
型特異的検出プローブは、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブであって、約８〜約３５の配列長、好ましくは約１５〜約３５の配列長を有するものである。ＥＩＡアッセイの場合、一般にはより長いプローブ、すなわち約２５〜約３５のヌクレオチド、好ましくは約２６〜３１のヌクレオチドが好ましい。ＲＬＢアッセイの場合、一般には、より短いプローブ、約１５〜約２２のヌクレオチド、より好ましくは約１８〜約２０のヌクレオチドのプローブで十分であろう。当業者であれば、一回のハイブリッド形成反応において使用されるプローブのセット内の各プローブのアニーリング温度が、Ｇ＋Ｃ成分とプローブ長との間に均衡を付与することによって適切に調整可能であることを知っている。
【００５９】
一つの実施形態において、本発明は、本発明の方法を行うためのプライマーとプローブとを含むキットを提供する。かかるキットの好ましい実施形態は、図１に開示された増幅用プライマーと、図２および図３の一方または双方に開示された型特異的プローブとの両方を有する。
【００６０】
これらに制限される訳ではないが、以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示す。
【実施例】
【００６１】
実施例１：純粋ウイルスＤＮＡのアッセイ
１００ｎｇヒト胎盤ＤＮＡのバックグラウンドにおいて、ｈｒＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８、ならびにＨＰＶ６，１１，２６，３４，４０，４２，４３，４４，５３，５４，５５，５７および６１を含む種々のＨＰＶ型のプラスミドＤＮＡの連続希釈物について、最初にＨＲＥ７−ＰＣＲアッセイを行った。５０μｌのＰＣＲ反応混合物は、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２と、２００μＭの各ｄＮＴＰと、２０ｐｍｏｌの各プライマーと、１ユニットのAmpliTaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer，フォスターシティー，カリフォルニア州）と、１０μｌの標的ＤＮＡとをTaq Goldバッファー中に含有した。４０のＰＣＲサイクルがＰＥ９７００サーモサイクラー（Perkin-Elmer，フォスターシティー，カリフォルニア州）を用いて行われた。各ＰＣＲ反応は、９４℃で６分間の予熱工程によって開始された後、変性工程（９４℃で３０秒）とプライマーアニーリング工程（６０℃で６０秒）と伸長工程（７２℃で６０秒）とから成る４０サイクルが続いた。ランピング時間は、上述の通りであった（van den Brule et al.,２００２年, J. Clin. Microbiol. ４０, ７７９−７８７）。最後の伸長工程は、４分間に延長された。
【００６２】
すべての１５のｈｒＨＰＶクローンがＥＩＡ読出しによって決定されるように明瞭な増幅信号を明らかにしたが、ヒトＤＮＡ、またはＨＰＶ６，１１，２６，３４，４０，４２，４３，４４，５３，５４，５５，５７および６６などの他のＨＰＶ型との交差反応は観察されなかった。ヒト胎盤ＤＮＡと混合されたクローンＨＰＶ１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６７および６８の希釈ラインが、試験当たり２００〜２０００のウイルスコピーに対応する、１０ｆｇ〜１００ｆｇのプラスミドＤＮＡの範囲にある分析感度を明らかにした。これは、試験当たり約１０のウイルスコピーを検出することによってはるかに感度がよかった、Ｅ７領域を標的とする公開されたｈｒＨＰＶ多重ＰＣＲアッセイの実績に矛盾する（Gheit et al., J Clin Microbiol.
２００６年：４４：２０２５−２０３１）。結果として、後者のアッセイは、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（Gheit et al., J Clin Microbiol. ２００６年：４４：２０２５−２０３１）よりも、多重感染を含む高いｈｒＨＰＶ感染数を検出した。また、ＲＬＢ分類は、交差反応なしで特異的信号を明らかにし、その感度はＥＩＡのものと同じ範囲にあった。
【００６３】
実施例２：組織サンプルの予備的研究
パイロット実験において、ＨＲＥ７−ＰＣＲアッセイの適用は、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって早期に試験された扁平上皮および腺癌組織型の両方の一連の子宮頸癌標本について開始された。これらは、Ｌ１ベースのＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって陰性に判定されたが、１以上のｈｒＨＰＶ型に対するＥ６／Ｅ７型特異的ＰＣＲによって陽性に判定されたサンプルを含む（Walboomers et al., J Pathol １９９９年：１８９：１２−１９；Zielinski et al., J Pathol ２００３年：２０１：５３５−５４３）。後者の研究結果は、ＧＰ５＋およびＧＰ６＋プライマー結合配列が存するＬ１領域の中断を伴うウイルスＤＮＡ組込みを示唆している。ＨＲＥ７−ＰＣＲアッセイは、今までのところ、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって得られる陽性を確認しただけではなく、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲでは陰性であるがＥ６／Ｅ７型特異的ＰＣＲでは陽性であった２５のサンプルを陽性に判定した。これらのパイロットデータに基づいて、Ｅ１またはＬ１ベースのＰＣＲアッセイと比較して、ＨＲＥ７−ＰＣＲが少なくとも５％以上子宮頸癌を検出できることを予想することができる。
【００６４】
実施例３：コホート調査における子宮頸部切屑の分析
子宮頸部切屑のＨＲＥ７−ＰＣＲアッセイの実績の分析について、本発明者らは、ＰＯＢＡＳＣＡＭ（Bulkmans et al., Int J Cancer ２００４年：１１０：９４−１０１）試験などの、種々の母集団に基づく子宮頸部スクリーニング試験の経過中に収集した子宮頸部切屑のより大きな系を調査した。この子宮頸部切屑は、合計で、ＣＩＮ３の女性の５６の切屑と、ＰＯＢＡＳＣＡＭ試験に参加した５年ごとの反復正常細胞診での３００の女性とを含んだ。さらなる分析は、種々のコホートにおけるprevalent/incident ＣＩＮ３の約１５００の女性から選ばれたＣＩＮ３の女性の粗細胞抽出物について行われた標準ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって陰性であった一連の３５の子宮頸部切屑に関連した。ＨＲＥ７ ＰＣＲは、単離されたＤＮＡについて行われたが、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲは、粗細胞抽出物（古典的ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ法；ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（粗細胞））と単離されたＤＮＡ（ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（単離））との両方について行われた。
【００６５】
ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（粗細胞）、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（単離）およびＨＲＥ７−ＰＣＲは、ＰＯＢＡＳＣＡＭのＣＩＮ３の女性の５６（１００％）の子宮頸部切屑のすべてに対して陽性の試験結果を明らかにした。正常サンプルに対する陽性率は、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（粗細胞）が１１／３００（３．７％、９５％ＣＩ：１．６〜５．９）であったのに対して、ＨＲＥ７−ＰＣＲが１９／３００（６．３％、９５％ＣＩ：３．５〜９．１）であった。ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（単離）は、ＨＲＥ７−ＰＣＲ（Ｐ＝０．５）と同様の数の正常切屑を陽性と判定した（すなわち１７／３００、５．６％、９５％ＣＩ：３．０〜８．２）。さらに、ＨＲＥ７−ＰＣＲは、２５／３５（７１％、９５％ＣＩ：５６〜８６）のＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（粗細胞）陰性のＣＩＮ３の女性の切屑に対して陽性であった。ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲ（単離）は３５の切屑のうちの１４（４０％、９５％ＣＩ：２４〜５６）に対して同様に陽性であったが、この陽性率は、ＨＲＥ７ ＰＣＲの陽性率よりも依然として低かった（Ｐ＜０．００１）。ＨＲＥ７−ＰＣＲを陽性と判定するが、ＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲを陰性と判定するこれらの場合に対して、ウイルス組込みがＡＰＯＴアッセイ（Klaes et al., Cancer Res. １９９９年，１５；５９：６１３２〜６１３６）によって実証されるであろう。
【００６６】
実施例４：リバースラインブロットを用いたＨＲＥ７ ＰＣＲおよびＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲによって遺伝子型決定する高リスクＨＰＶの比較
ＨＲＥ７−ＰＣＲおよびＧＰ５＋／６＋−ＰＣＲの両方において陽性であった実施例３に詳述したサンプルの全ＰＣＲ産物は、両ＰＣＲアッセイに関連したＲＬＢ法を用いる遺伝子型決定を受けた。これらの場合に対して、両アッセイによって検出可能な１５のｈｒＨＰＶ型のうちの１以上を遺伝子型決定するための一致は、１００％（Kappa＝１．０）であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、１以上のｈｒＨＰＶ型の存在の検出のための方法であって、
（ａ）前記ｈｒＨＰＶを有する疑いのあるサンプルを提供する工程と、
（ｂ）すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡに集合的に、実質的に相補的な複数のフォワードおよびバックワードプライマーを提供する工程と、
（ｃ）前記複数のプライマーを用いて前記サンプルに由来するＤＮＡを増幅させる反応を実行する工程と、
（ｄ）前記サンプル由来の１以上の前記ｈｒＨＰＶからのＤＮＡ増幅産物を検出する工程とを含み、
好ましくは、前記工程（ｄ）は、ＤＮＡ増幅反応の反応産物を、複数のｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによって実行されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記複数のフォワードおよびバックワードプライマーは、すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡにおける第１のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーを含むとともに、すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡにおける第２のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーをさらに含み、好ましくは、前記第１および第２のコンセンサス領域が、ｈｒＨＰＶのＥ７領域内にあり、より好ましくは、前記複数のプライマーが、図１のプライマーを含み、最も好ましくは、前記複数のプライマーのすべてのフォワードプライマーまたはすべてのバックワードプライマーがビオチン標識を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡを増幅する反応は、ストリンジェシーを下げた条件下で実行されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記複数のｈｒＨＰＶプローブは、すべてのｈｒＨＰＶからの前記ＤＮＡ増幅産物の核酸配列に実質的に相補的であり、好ましくは、前記ｈｒＨＰＶプローブは図２のプローブを含み、より好ましくは、前記プローブはＤＩＧ標識を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、１以上のｈｒＨＰＶ型の分類のための方法であって、
（ａ）複数のフォワードおよびバックワードプライマーを用いてｈｒＨＰＶのＤＮＡを増幅することによってＤＮＡ増幅産物を提供する工程と、
（ｂ）前記増幅産物を、少なくとも１つではあるがすべてではない前記ｈｒＨＰＶ型のＤＮＡに実質的に相補的な少なくとも１つのｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによって１以上の前記ｈｒＨＰＶ型からのＤＮＡ増幅産物を検出する工程とを含み、
好ましくは、前記複数のフォワードおよびバックワードプライマーは、すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡにおける第１のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーを含むとともに、すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡにおける第２のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーをさらに含み、より好ましくは、前記第１および第２のコンセンサス領域が、ｈｒＨＰＶのＥ７領域内にあり、最も好ましくは、前記複数の二方向プライマーが、図１のプライマーを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記複数のプライマーのすべてのフォワードプライマーまたはすべてのバックワードプライマーは、ビオチン標識を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのプローブは、ｈｒＨＰＶの正確に１つの型のＤＮＡに実質的に相補的であり、好ましくは、前記少なくとも１つのプローブは、図２または図３のいずれかのプローブから選ばれることを特徴とする請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
前記検出は、リバースラインブロットの使用を含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において使用されるフォワードプライマーであって、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、すべてのｈｒＨＰＶ型のＥ７領域内の第１のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーであり、より好ましくは、図１に示されるフォワードプライマーの群から選ばれるフォワードプライマーであることを特徴とするフォワードプライマー。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において使用されるバックワードプライマーであって、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、すべてのｈｒＨＰＶ型のＥ７領域内の第２のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーであり、より好ましくは、図１に示されるバックワードプライマーの群から選ばれるバックワードプライマーであることを特徴とするバックワードプライマー。
【請求項１１】
図１に記載されたすべてのフォワードおよびバックワードプライマーを含むことを特徴とするプライマーのセット。
【請求項１２】
ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、１以上のｈｒＨＰＶの検出のための検出プローブであって、ＨＰＶ１６のヌクレオチド位置６２２〜８４７間の、少なくとも１つではあるがすべてではないｈｒＨＰＶ型のＥ７領域内の領域と、他のｈｒＨＰＶ型の対応する領域とに実質的に相補的なプローブであることを特徴とする検出プローブ。
【請求項１３】
ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、１つのｈｒＨＰＶの検出のための型特異的検出プローブであって、ＨＰＶ１６のヌクレオチド位置６２２〜８４７間の、正確に１つの型のｈｒＨＰＶ型のＥ７領域内の領域と、他のｈｒＨＰＶ型の対応する領域とに実質的に相補的なプローブであり、好ましくは、図２および図３に記載されたプローブから成る群から選ばれる型特異的検出プローブであることを特徴とする型特異的検出プローブ。
【請求項１】
ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、１以上のｈｒＨＰＶ型の存在の検出のための方法であって、
（ａ）前記ｈｒＨＰＶを有する疑いのあるサンプルを提供する工程と、
（ｂ）すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡに集合的に、実質的に相補的な複数のフォワードおよびバックワードプライマーを提供する工程と、
（ｃ）前記複数のプライマーを用いて前記サンプルに由来するＤＮＡを増幅させる反応を実行する工程と、
（ｄ）前記サンプル由来の１以上の前記ｈｒＨＰＶからのＤＮＡ増幅産物を検出する工程とを含み、
好ましくは、前記工程（ｄ）は、ＤＮＡ増幅反応の反応産物を、複数のｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによって実行されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記複数のフォワードおよびバックワードプライマーは、すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡにおける第１のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーを含むとともに、すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡにおける第２のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーをさらに含み、好ましくは、前記第１および第２のコンセンサス領域が、ｈｒＨＰＶのＥ７領域内にあり、より好ましくは、前記複数のプライマーが、図１のプライマーを含み、最も好ましくは、前記複数のプライマーのすべてのフォワードプライマーまたはすべてのバックワードプライマーがビオチン標識を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡを増幅する反応は、ストリンジェシーを下げた条件下で実行されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記複数のｈｒＨＰＶプローブは、すべてのｈｒＨＰＶからの前記ＤＮＡ増幅産物の核酸配列に実質的に相補的であり、好ましくは、前記ｈｒＨＰＶプローブは図２のプローブを含み、より好ましくは、前記プローブはＤＩＧ標識を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、１以上のｈｒＨＰＶ型の分類のための方法であって、
（ａ）複数のフォワードおよびバックワードプライマーを用いてｈｒＨＰＶのＤＮＡを増幅することによってＤＮＡ増幅産物を提供する工程と、
（ｂ）前記増幅産物を、少なくとも１つではあるがすべてではない前記ｈｒＨＰＶ型のＤＮＡに実質的に相補的な少なくとも１つのｈｒＨＰＶプローブにハイブリダイズさせることによって１以上の前記ｈｒＨＰＶ型からのＤＮＡ増幅産物を検出する工程とを含み、
好ましくは、前記複数のフォワードおよびバックワードプライマーは、すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡにおける第１のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーを含むとともに、すべての前記ｈｒＨＰＶのＤＮＡにおける第２のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーをさらに含み、より好ましくは、前記第１および第２のコンセンサス領域が、ｈｒＨＰＶのＥ７領域内にあり、最も好ましくは、前記複数の二方向プライマーが、図１のプライマーを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記複数のプライマーのすべてのフォワードプライマーまたはすべてのバックワードプライマーは、ビオチン標識を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのプローブは、ｈｒＨＰＶの正確に１つの型のＤＮＡに実質的に相補的であり、好ましくは、前記少なくとも１つのプローブは、図２または図３のいずれかのプローブから選ばれることを特徴とする請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
前記検出は、リバースラインブロットの使用を含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において使用されるフォワードプライマーであって、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、すべてのｈｒＨＰＶ型のＥ７領域内の第１のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーであり、より好ましくは、図１に示されるフォワードプライマーの群から選ばれるフォワードプライマーであることを特徴とするフォワードプライマー。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において使用されるバックワードプライマーであって、ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、すべてのｈｒＨＰＶ型のＥ７領域内の第２のコンセンサス領域に集合的に、実質的に相補的なプライマーであり、より好ましくは、図１に示されるバックワードプライマーの群から選ばれるバックワードプライマーであることを特徴とするバックワードプライマー。
【請求項１１】
図１に記載されたすべてのフォワードおよびバックワードプライマーを含むことを特徴とするプライマーのセット。
【請求項１２】
ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、１以上のｈｒＨＰＶの検出のための検出プローブであって、ＨＰＶ１６のヌクレオチド位置６２２〜８４７間の、少なくとも１つではあるがすべてではないｈｒＨＰＶ型のＥ７領域内の領域と、他のｈｒＨＰＶ型の対応する領域とに実質的に相補的なプローブであることを特徴とする検出プローブ。
【請求項１３】
ＨＰＶ型１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６，６７および６８から成る群から選ばれる、１つのｈｒＨＰＶの検出のための型特異的検出プローブであって、ＨＰＶ１６のヌクレオチド位置６２２〜８４７間の、正確に１つの型のｈｒＨＰＶ型のＥ７領域内の領域と、他のｈｒＨＰＶ型の対応する領域とに実質的に相補的なプローブであり、好ましくは、図２および図３に記載されたプローブから成る群から選ばれる型特異的検出プローブであることを特徴とする型特異的検出プローブ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５０２４７７（Ｐ２０１１−５０２４７７Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１９７４（Ｐ２０１０−５３１９７４）
【出願日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５０５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５７９９３
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５１００４８６０２）
【住所又は居所原語表記】Ｄｅ Ｂｏｅｌｅｌａａｎ １１０５，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５０５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５７９９３
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５１００４８６０２）
【住所又は居所原語表記】Ｄｅ Ｂｏｅｌｅｌａａｎ １１０５，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
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