学習記憶障害を改善する機能性食品
【課題】学習記憶障害を予防あるいは改善させるための副作用がなく、しかも周知の医療用医薬品と比較して遜色のない薬効および作用を有するエキスを含む安全性に優れた機能性食品を提供する。
【解決手段】ＣＲＥＢの活性化を作用機構とする学習記憶障害を改善する機能性食品として、柑橘類の全果の粉砕搾汁液および該粉砕搾汁液からの抽出物の少なくともいずれか一方を含有するものとする。
【解決手段】ＣＲＥＢの活性化を作用機構とする学習記憶障害を改善する機能性食品として、柑橘類の全果の粉砕搾汁液および該粉砕搾汁液からの抽出物の少なくともいずれか一方を含有するものとする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、学習記憶障害を改善する機能性食品に関し、特に、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）の活性化を作用機構とする学習記憶障害を改善する機能性食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、アルツハイマー病等の認知症を含む中枢神経疾患による学習記憶障害の対応策が深刻な社会問題の一つとなっているが、平均寿命が年々高くなり高齢化が急速に進行している現状に鑑み、これらの問題の一日も早い解決が待ち望まれている。
【０００３】
一方、学習記憶を制御調整する重要な神経細胞内シグナル伝達経路（脳の情報ネットワーク）として、サイクリックアデノシン３′，５′−１リン酸（ｃＡＭＰ）／ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）／ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）系が、近年、明らかになってきた。そして、この神経細胞内シグナル伝達経路を活性化すると、学習記憶能力が亢進することが確認された。そこで、このＣＲＥＢを活性化するための医療用医薬品の開発研究が急速に展開されつつあり、さまざまな治療薬が発表されている（特許文献１を参照されたい）。
【特許文献１】特開平１１−２２８４１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、医薬品の開発には長期に亘る期間並びに莫大な費用が必要である上、その使用には予測し得ない副作用を伴うという拭い去れないリスクをも背負わざるを得ない。
本発明は、このような問題点を解消すべく案出されたものであり、その主な目的は、学習記憶障害を予防あるいは改善させるための副作用がなく、しかも周知の医療用医薬品と比較して遜色のない薬効および作用を有するエキスを含む安全性に優れた機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような課題を解決するため、本発明は、柑橘類の全果の粉砕搾汁液および該粉砕搾汁液からの抽出物の少なくともいずれか一方を含有し、ＣＲＥＢの活性化を作用機構とすることを特徴とする学習記憶障害を改善する機能性食品を提供することとした。特に前記柑橘類としては、ハナユ、コウライタチバナ、シキキツ、キジツ、ナツミカン、ダイダイ、ポンカン、地中海マンダリン、ダンシータンジェリン、オオベニミカン、タチバナ、コベニミカン、無核キシュウ、シークワーサー、フクレミカン、カプチー、太田ポンカン、ヒラキシュウ、ウンシュウ、サンキツ、クレオパトラ、コウジ、ギリミカン、およびイーチャンレモンを含む柑橘類から選択されると良い。
【発明の効果】
【０００６】
このような本発明によれば、アルツハイマー病等の認知症を含む中枢神経疾患を安全に予防・治療する機能性食品を提供する上に多大な効果を奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に添付の図面を参照して本発明について詳細に説明する。
【０００８】
本発明によるＣＲＥＢの活性化作用機構を発揮して学習記憶障害を改善するエキスは、ある種の柑橘類から得られ、その柑橘類としては、渋味、酸味が比較的強く感じられるものとして一般に知られているものであり、ハナユ、コウライタチバナ、シキキツ、キジツ、ナツミカン、ダイダイ、ポンカン、地中海マンダリン、ダンシータンジェリン、オオベニミカン、タチバナ、コベニミカン、無核キシュウ、シークワーサー、フクレミカン、カプチー、太田ポンカン、ヒラキシュウ、ウンシュウ、サンキツ、クレオパトラ、コウジ、ギリミカン、及びイーチャンレモンの２４種がある。特に日本では、ポンカン、タチバナ、シークワーサー、およびウンシュウが比較的容易に入手可能である。ここでは、ポンカンでの事例について説明する。
【０００９】
ポンカンの全果（果皮を含む果実）を粉砕機で微粉砕し、８０％エタノール水で抽出操作を３回行った後、全抽出液から減圧下で溶媒除去することにより、粗抽出物（エキス）を得た。このエキスに、例えば、溶媒として０．５％（Ｖ／Ｖ）Tween80と０．５％（Ｗ／Ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）との混液を加えるか、或いはコーンオイル等の植物油を加えて乳化させた上で超音波処理によって均質な液体を得た。
【００１０】
この液体のままで充分な薬効が得られるので、これをソフトカプセルに充填してカプセル剤として、または、液体を吸着用粉体に吸着させて微粉末に整粉後、造粒して穎粒剤として、または打錠して粒剤（裸錠）、糖衣錠として、またはその他の公知の製剤技術により、内服用のあらゆる剤型で供給することができる。
【００１１】
次に、本発明物質のＣＲＥＢの活性化作用機構による学習記憶障害の改善効果の検証について説明する。なお、検証に当たっては、小動物によるIn vivo試験（記憶障害の病態モデル動物試験）、並びに、In vitro試験（ラットの海馬神経細胞の培養；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロッティング；プラスミドの導入及びレポータージーンアッセイ）によって評価することとした。
【００１２】
〔記憶学習障害モデル動物の作成〕
先ず、In vivo試験について説明する。
体重が２４〜２６ｇのｄｄＹ系雄性マウスに麻酔薬のネンブタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与しての麻酔下に、嗅球上部の頭蓋骨に歯科用ドリルで穿孔し、吸引アスピレータで嗅球の２／３以上を吸引除去した。それを止血縫合し、外科用接着剤で傷口を塗り固め、嗅球摘出（Olfactory Bulbectomy以下ＯＢＸと略称す）マウスの記憶学習障害モデル動物を作製した。
これに対し、外科的操作を施さない群を対照（Control）群とした。
【００１３】
〔記憶学習行動の測定〕
Step-through型受動回避反応装置を用いて行動評価を行った。具体的には、明室と電気刺激を与えられる暗室との２部屋が連結された明暗ボックスの明室側にマウスを入れ、暗室に完全に移動したことを確認してから暗室に入ったマウスに電気刺激（１ｍＡ、５００ｍｓｅｃ）を与え、これを学習試行とし、学習試行終了直後に、上述のＯＢＸ処置を施し、飼育ケージに戻した。試験時には、マウスを明室側に入れて暗室に入るまでの時間にてlatency time（反応潜時）を測定し、これを試験試行とし、この場合には、暗室に入ってもマウスに電気刺激を与えなかった。なお、これらの学習試行、試験試行のいずれも、cut-off timeを５分間に設定し、学習試行において５分以上明室に留まったマウスは、不適格個体として試験から除外した。
【００１４】
この測定法においては、記憶障害を起こしていないマウスは、電気刺激の記憶を恐怖感として保持しているために明室側に長く留まるが、記憶障害を起こしているマウスは恐怖感を保持していないために頻繁に暗室へ入る。この違いを利用して、反応潜時を記憶障害の指標とした。
【００１５】
〔記憶学習障害モデル動物に対する本発明物質による改善効果の検証〕
ＯＢＸ処置３日後から１１日間、被験物質としての全果均質液（５１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与（Extract）群と、被験物質非投与ＯＢＸ群と、Control群との比較を７〜１０回行った。その代表例を図１に示す。但し、Control群には溶媒（０．５％（Ｖ／Ｖ）Tween80と０．５％（Ｗ／Ｖ）ＣＭＣとの混液）のみを腹腔内投与した。
【００１６】
その結果、Control群の反応潜時が約３００秒（２９５±５秒）であったのに対し、被験物質非投与ＯＢＸ群では、それが約５０秒（４５±１１秒）まで低下し、顕著な記憶障害が認められた。
【００１７】
他方、被験物質を投与したExtract群では、反応潜時が約１１０秒（１１２±１５秒）となり、明らかな記憶学習障害の改善効果が確認された。
【００１８】
次に、In vitro試験について説明する。なお、神経細胞内のシグナルは、一連のタンパク質が順次リン酸化反応を起こすことによって上流から下流へと伝達されることが明らかになっている。そしてＣＲＥＢはリン酸化されると活性化され、遺伝子のスイッチオンを引き起こすＣＲＥに結合し、遺伝子の転写（発現）が開始されるので、転写活性の強弱を測定することにより、被験物質の効果を評価することとした。
【００１９】
〔ラット初代海馬神経細胞の培養〕
評価に用いる神経細胞として、ＳＤ系ラット（Ｅ１９；胎生１９日齢、日本ＳＬＣ製）から海馬神経細胞を単離した。具体的には、水冷したリン酸緩衝液中で海馬領域を切り出し、ＳＵＭＩＬＯＮ細胞分散キット（ＳＵＭＩＴＯＭＯ ＢＡＫＥＬＩＴＥ ＣＯ．，Ｌｔｄ．製）を用いて神経細胞の分散・精製を行った。分散・精製した海馬神経細胞は、ＧＩＢＣＯ製のNeurobasal Medium（１×Ｂ−２７ Supplement、０．５ｍＭ L-Glutamin、０．００５％ Penicillin-Streptmycinを含む）を用いて懸濁させ、さらにPoly-L-lysineでコーティングした培養器具に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞数で神経細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で４日間培養した。その後、培地をNeurobasal Medium（１×Ｂ−２７ Supplement、０．５ｍＭ L-Glutamin、０．００５％ Penicillin-Streptmycin、５μＭ Ａｒａ−Ｃを含む）に交換して培養を継続した。以降２〜３日毎に培地を交換した。
【００２０】
〔ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす本発明物質の亢進効果の検証〕
上述の初代海馬神経細胞を分散・精製し、培養器具（４８ウェルプレート）に８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１１日間培養後、Lipofect Amine 2000（Invitrogen製）を用い、ｐＣＲＥおよびウミシイタケｐＲＧ−ＴＫの内部標準プラスミドを細胞内へ導入し、１６時間培養した。その後、薬物刺激を８時間加えた後に細胞を回収し、Dual-Luciferase Reporter Assy System（Promega製）を用い、ｃＡＭＰ／ＰＡＫ／ＣＲＥＢ経路が活性化されるとスイッチが入るｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を持つ遺伝子を測定し、これによりＣＲＥ依存的転写活性の度合いを判定した。その結果の代表例を図２に示す。
【００２１】
その結果によると、最終濃度０．２％ジメチルスルオキサイド（ＤＭＳＯ）になるようにＤＭＳＯを添加した細胞培養液で細胞を処理したControl群を１とすると、被験物質を添加した細胞培養液によるものは、用量依存的で、２０μｇ／ｍｌにおいて約３倍（３．１４±０．３５）の転写活性となり、ほぼ最高値（飽和）を示すＣＲＥ依存的転写活性の亢進効果を確認した。
【００２２】
なお、本発明物質の薬効は、ｃＡＭＰの生合成酵素のアデニル酸シクラーゼを活性化する薬物として知られるForskolinを添加した培養液で処理した細胞と比較して遜色のないことが確認された。
【００２３】
〔ラット海馬神経細胞におけるＥＲＫ／ＣＲＥＢリン酸化に及ぼす本発明物質の亢進効果の検証〕
上記と同様に、初代海馬神経細胞を４８ウェルプレートにｌ×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１１日間培養後、１０分間薬物処置を行った後、その細胞をLysis buffer（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＮａＦ、１０ｎＭ calyculin、３２０ｎＭ okadaic acid、１ｎＭ sodium orthovanadate、１ｍＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬ antipain、１０μｇ／ｍＬ leuoeptin、１０μｇ／ｍＬ chymostain、１０μｇ／ｍＬ phosphoramidon、１０μｇ／ｍＬ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）にて回収し、これを９５℃で１０分間加熱後、超音波破砕して細胞溶解液とした。これを遠心分離（１４，０００ｒｐｍ／２０ｍｉｎ） した上清をＳＤＳ化した後、１２．５％ポリアクリルアミドゲルにてタンパク質を分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＰＶＤＦ膜に転写した。そのＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクでブロッキングした後、リン酸化ＣＲＥＢ抗体およびリン酸化ＥＲＫ抗体（Cell Signaling製）を用いて成分検索した。これについて２回の測定を行った結果の代表例を図３に示す。
【００２４】
その結果、被験物質を細胞培養液に添加することにより、用量依存的に、１０〜４０μｇ／ｍｌの添加で、リン酸化ＥＲＫ並びにリン酸化ＣＲＥＢの３〜５倍の増加が認められた。これにより、被験物質によるＥＲＫ並びにＣＲＥＢのリン酸化の亢進効果が確認された。
【００２５】
〔ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす本発明物質の亢進効果に対する各種シグナル阻害剤の影響の検証〕
上記と同様に、初代海馬神経細胞を４８ウェルプレートに８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１１日間培養後、プラスミド導入を行い、１６時間培養した。ここで、各種シグナル阻害剤として、カルモジュリンキナーゼII（ＣａＭＫII）阻害剤の３μＭ ＫＮ６２、ＰＫＡ阻害剤の５μＭ Ｈ８９、及びＭＡＰキナーゼ１／２（ＭＥＫ１／２）阻害剤の１０μＭ Ｕ０１２６で１時間前処置後に８時間の薬物刺激を加えた。
【００２６】
この細胞を回収し、Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて４回測定した。その代表例を図４に示す。
【００２７】
その結果、被験物質４０μｇ／ｍｌを細胞培養液に添加することにより、ＣＲＥ依存的転写活性は、Control群のそれを１とすると、約２（１．９５±０．１０）となった。
【００２８】
他方、上記の濃度のＫＮ６２、Ｈ８９及びＵ０１２６の存在下でのＣＲＥ依存的転写活性は、それぞれControl群のそれを１とすると、１．４７±０．０８、１．２６±０．０２、及び１．１８±０．０８であった。即ち、その亢進効果は、ＣＲＥＢが活性化するシグナル伝達系（ＣａＭＫII、ＰＫＡ、ＭＥＫ１／２）の阻害剤で抑制されることが明らかとなった。つまり本発明の作用機構がＣＲＥＢの活性化であることがこれによって証明された。
【００２９】
以上の如くして、２４種類の柑橘類の全果均質液についての記憶学習障害の改善作用について検討を行った結果、柑橘類の全果均質液が、ＣＲＥＢのリン酸化（ＣＲＥ転写活性の亢進）を促進し、ＣＲＥＢが仲介するシグナル伝達系を活性化させることで記憶障害を改善し得ることが明らかとなった。なお、この時の全果均質液の最適濃度は２０〜４０μｇ／ｍｌであった。またこの結果より、本発明による柑橘類の全果均質液を公知の製剤技術に適用することで、学習記憶障害の改善効果を生み出す薬剤をも提供できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明にかかる柑橘類の全果の粉砕搾汁液並びに該粉砕搾汁液からの抽出物は、機能性食品に適用可能である。この機能性食品は、生体機能の調節など、生理面での働き（３次機能）を十分に発揮するように製造された食品を指し、例えば、「健康・栄養食品アドバイザリー・スタッフ・テキストブック」（平成１５年７月３０日、第一出版株式会社発行、第９２、９３頁）に記載されている通り、一般の食品はもとより、いわゆる健康食品とは一線を画する別のものとして定義されたものである。
【００３１】
なお、このような機能性食品において、有効成分である本発明物質の担体成分に対する配合割合は、５〜８５重量％の範囲であり、特に３０〜６０重量％の範囲が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】学習記憶障害モデル動物に対する本発明物質の効果を示すグラフである。
【図２】ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす本発明物質の亢進効果の評価グラフである。
【図３】ラット海馬神経細胞におけるＥＲＫ／ＣＲＥＢリン酸化に及ぼす本発明物質の亢進効果の評価グラフである。
【図４】ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす本発明物質の亢進効果に対する各種シグナル阻害剤の影響の評価グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、学習記憶障害を改善する機能性食品に関し、特に、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）の活性化を作用機構とする学習記憶障害を改善する機能性食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、アルツハイマー病等の認知症を含む中枢神経疾患による学習記憶障害の対応策が深刻な社会問題の一つとなっているが、平均寿命が年々高くなり高齢化が急速に進行している現状に鑑み、これらの問題の一日も早い解決が待ち望まれている。
【０００３】
一方、学習記憶を制御調整する重要な神経細胞内シグナル伝達経路（脳の情報ネットワーク）として、サイクリックアデノシン３′，５′−１リン酸（ｃＡＭＰ）／ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）／ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）系が、近年、明らかになってきた。そして、この神経細胞内シグナル伝達経路を活性化すると、学習記憶能力が亢進することが確認された。そこで、このＣＲＥＢを活性化するための医療用医薬品の開発研究が急速に展開されつつあり、さまざまな治療薬が発表されている（特許文献１を参照されたい）。
【特許文献１】特開平１１−２２８４１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、医薬品の開発には長期に亘る期間並びに莫大な費用が必要である上、その使用には予測し得ない副作用を伴うという拭い去れないリスクをも背負わざるを得ない。
本発明は、このような問題点を解消すべく案出されたものであり、その主な目的は、学習記憶障害を予防あるいは改善させるための副作用がなく、しかも周知の医療用医薬品と比較して遜色のない薬効および作用を有するエキスを含む安全性に優れた機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような課題を解決するため、本発明は、柑橘類の全果の粉砕搾汁液および該粉砕搾汁液からの抽出物の少なくともいずれか一方を含有し、ＣＲＥＢの活性化を作用機構とすることを特徴とする学習記憶障害を改善する機能性食品を提供することとした。特に前記柑橘類としては、ハナユ、コウライタチバナ、シキキツ、キジツ、ナツミカン、ダイダイ、ポンカン、地中海マンダリン、ダンシータンジェリン、オオベニミカン、タチバナ、コベニミカン、無核キシュウ、シークワーサー、フクレミカン、カプチー、太田ポンカン、ヒラキシュウ、ウンシュウ、サンキツ、クレオパトラ、コウジ、ギリミカン、およびイーチャンレモンを含む柑橘類から選択されると良い。
【発明の効果】
【０００６】
このような本発明によれば、アルツハイマー病等の認知症を含む中枢神経疾患を安全に予防・治療する機能性食品を提供する上に多大な効果を奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に添付の図面を参照して本発明について詳細に説明する。
【０００８】
本発明によるＣＲＥＢの活性化作用機構を発揮して学習記憶障害を改善するエキスは、ある種の柑橘類から得られ、その柑橘類としては、渋味、酸味が比較的強く感じられるものとして一般に知られているものであり、ハナユ、コウライタチバナ、シキキツ、キジツ、ナツミカン、ダイダイ、ポンカン、地中海マンダリン、ダンシータンジェリン、オオベニミカン、タチバナ、コベニミカン、無核キシュウ、シークワーサー、フクレミカン、カプチー、太田ポンカン、ヒラキシュウ、ウンシュウ、サンキツ、クレオパトラ、コウジ、ギリミカン、及びイーチャンレモンの２４種がある。特に日本では、ポンカン、タチバナ、シークワーサー、およびウンシュウが比較的容易に入手可能である。ここでは、ポンカンでの事例について説明する。
【０００９】
ポンカンの全果（果皮を含む果実）を粉砕機で微粉砕し、８０％エタノール水で抽出操作を３回行った後、全抽出液から減圧下で溶媒除去することにより、粗抽出物（エキス）を得た。このエキスに、例えば、溶媒として０．５％（Ｖ／Ｖ）Tween80と０．５％（Ｗ／Ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）との混液を加えるか、或いはコーンオイル等の植物油を加えて乳化させた上で超音波処理によって均質な液体を得た。
【００１０】
この液体のままで充分な薬効が得られるので、これをソフトカプセルに充填してカプセル剤として、または、液体を吸着用粉体に吸着させて微粉末に整粉後、造粒して穎粒剤として、または打錠して粒剤（裸錠）、糖衣錠として、またはその他の公知の製剤技術により、内服用のあらゆる剤型で供給することができる。
【００１１】
次に、本発明物質のＣＲＥＢの活性化作用機構による学習記憶障害の改善効果の検証について説明する。なお、検証に当たっては、小動物によるIn vivo試験（記憶障害の病態モデル動物試験）、並びに、In vitro試験（ラットの海馬神経細胞の培養；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロッティング；プラスミドの導入及びレポータージーンアッセイ）によって評価することとした。
【００１２】
〔記憶学習障害モデル動物の作成〕
先ず、In vivo試験について説明する。
体重が２４〜２６ｇのｄｄＹ系雄性マウスに麻酔薬のネンブタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与しての麻酔下に、嗅球上部の頭蓋骨に歯科用ドリルで穿孔し、吸引アスピレータで嗅球の２／３以上を吸引除去した。それを止血縫合し、外科用接着剤で傷口を塗り固め、嗅球摘出（Olfactory Bulbectomy以下ＯＢＸと略称す）マウスの記憶学習障害モデル動物を作製した。
これに対し、外科的操作を施さない群を対照（Control）群とした。
【００１３】
〔記憶学習行動の測定〕
Step-through型受動回避反応装置を用いて行動評価を行った。具体的には、明室と電気刺激を与えられる暗室との２部屋が連結された明暗ボックスの明室側にマウスを入れ、暗室に完全に移動したことを確認してから暗室に入ったマウスに電気刺激（１ｍＡ、５００ｍｓｅｃ）を与え、これを学習試行とし、学習試行終了直後に、上述のＯＢＸ処置を施し、飼育ケージに戻した。試験時には、マウスを明室側に入れて暗室に入るまでの時間にてlatency time（反応潜時）を測定し、これを試験試行とし、この場合には、暗室に入ってもマウスに電気刺激を与えなかった。なお、これらの学習試行、試験試行のいずれも、cut-off timeを５分間に設定し、学習試行において５分以上明室に留まったマウスは、不適格個体として試験から除外した。
【００１４】
この測定法においては、記憶障害を起こしていないマウスは、電気刺激の記憶を恐怖感として保持しているために明室側に長く留まるが、記憶障害を起こしているマウスは恐怖感を保持していないために頻繁に暗室へ入る。この違いを利用して、反応潜時を記憶障害の指標とした。
【００１５】
〔記憶学習障害モデル動物に対する本発明物質による改善効果の検証〕
ＯＢＸ処置３日後から１１日間、被験物質としての全果均質液（５１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与（Extract）群と、被験物質非投与ＯＢＸ群と、Control群との比較を７〜１０回行った。その代表例を図１に示す。但し、Control群には溶媒（０．５％（Ｖ／Ｖ）Tween80と０．５％（Ｗ／Ｖ）ＣＭＣとの混液）のみを腹腔内投与した。
【００１６】
その結果、Control群の反応潜時が約３００秒（２９５±５秒）であったのに対し、被験物質非投与ＯＢＸ群では、それが約５０秒（４５±１１秒）まで低下し、顕著な記憶障害が認められた。
【００１７】
他方、被験物質を投与したExtract群では、反応潜時が約１１０秒（１１２±１５秒）となり、明らかな記憶学習障害の改善効果が確認された。
【００１８】
次に、In vitro試験について説明する。なお、神経細胞内のシグナルは、一連のタンパク質が順次リン酸化反応を起こすことによって上流から下流へと伝達されることが明らかになっている。そしてＣＲＥＢはリン酸化されると活性化され、遺伝子のスイッチオンを引き起こすＣＲＥに結合し、遺伝子の転写（発現）が開始されるので、転写活性の強弱を測定することにより、被験物質の効果を評価することとした。
【００１９】
〔ラット初代海馬神経細胞の培養〕
評価に用いる神経細胞として、ＳＤ系ラット（Ｅ１９；胎生１９日齢、日本ＳＬＣ製）から海馬神経細胞を単離した。具体的には、水冷したリン酸緩衝液中で海馬領域を切り出し、ＳＵＭＩＬＯＮ細胞分散キット（ＳＵＭＩＴＯＭＯ ＢＡＫＥＬＩＴＥ ＣＯ．，Ｌｔｄ．製）を用いて神経細胞の分散・精製を行った。分散・精製した海馬神経細胞は、ＧＩＢＣＯ製のNeurobasal Medium（１×Ｂ−２７ Supplement、０．５ｍＭ L-Glutamin、０．００５％ Penicillin-Streptmycinを含む）を用いて懸濁させ、さらにPoly-L-lysineでコーティングした培養器具に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞数で神経細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で４日間培養した。その後、培地をNeurobasal Medium（１×Ｂ−２７ Supplement、０．５ｍＭ L-Glutamin、０．００５％ Penicillin-Streptmycin、５μＭ Ａｒａ−Ｃを含む）に交換して培養を継続した。以降２〜３日毎に培地を交換した。
【００２０】
〔ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす本発明物質の亢進効果の検証〕
上述の初代海馬神経細胞を分散・精製し、培養器具（４８ウェルプレート）に８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１１日間培養後、Lipofect Amine 2000（Invitrogen製）を用い、ｐＣＲＥおよびウミシイタケｐＲＧ−ＴＫの内部標準プラスミドを細胞内へ導入し、１６時間培養した。その後、薬物刺激を８時間加えた後に細胞を回収し、Dual-Luciferase Reporter Assy System（Promega製）を用い、ｃＡＭＰ／ＰＡＫ／ＣＲＥＢ経路が活性化されるとスイッチが入るｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を持つ遺伝子を測定し、これによりＣＲＥ依存的転写活性の度合いを判定した。その結果の代表例を図２に示す。
【００２１】
その結果によると、最終濃度０．２％ジメチルスルオキサイド（ＤＭＳＯ）になるようにＤＭＳＯを添加した細胞培養液で細胞を処理したControl群を１とすると、被験物質を添加した細胞培養液によるものは、用量依存的で、２０μｇ／ｍｌにおいて約３倍（３．１４±０．３５）の転写活性となり、ほぼ最高値（飽和）を示すＣＲＥ依存的転写活性の亢進効果を確認した。
【００２２】
なお、本発明物質の薬効は、ｃＡＭＰの生合成酵素のアデニル酸シクラーゼを活性化する薬物として知られるForskolinを添加した培養液で処理した細胞と比較して遜色のないことが確認された。
【００２３】
〔ラット海馬神経細胞におけるＥＲＫ／ＣＲＥＢリン酸化に及ぼす本発明物質の亢進効果の検証〕
上記と同様に、初代海馬神経細胞を４８ウェルプレートにｌ×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１１日間培養後、１０分間薬物処置を行った後、その細胞をLysis buffer（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＮａＦ、１０ｎＭ calyculin、３２０ｎＭ okadaic acid、１ｎＭ sodium orthovanadate、１ｍＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬ antipain、１０μｇ／ｍＬ leuoeptin、１０μｇ／ｍＬ chymostain、１０μｇ／ｍＬ phosphoramidon、１０μｇ／ｍＬ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）にて回収し、これを９５℃で１０分間加熱後、超音波破砕して細胞溶解液とした。これを遠心分離（１４，０００ｒｐｍ／２０ｍｉｎ） した上清をＳＤＳ化した後、１２．５％ポリアクリルアミドゲルにてタンパク質を分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＰＶＤＦ膜に転写した。そのＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクでブロッキングした後、リン酸化ＣＲＥＢ抗体およびリン酸化ＥＲＫ抗体（Cell Signaling製）を用いて成分検索した。これについて２回の測定を行った結果の代表例を図３に示す。
【００２４】
その結果、被験物質を細胞培養液に添加することにより、用量依存的に、１０〜４０μｇ／ｍｌの添加で、リン酸化ＥＲＫ並びにリン酸化ＣＲＥＢの３〜５倍の増加が認められた。これにより、被験物質によるＥＲＫ並びにＣＲＥＢのリン酸化の亢進効果が確認された。
【００２５】
〔ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす本発明物質の亢進効果に対する各種シグナル阻害剤の影響の検証〕
上記と同様に、初代海馬神経細胞を４８ウェルプレートに８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１１日間培養後、プラスミド導入を行い、１６時間培養した。ここで、各種シグナル阻害剤として、カルモジュリンキナーゼII（ＣａＭＫII）阻害剤の３μＭ ＫＮ６２、ＰＫＡ阻害剤の５μＭ Ｈ８９、及びＭＡＰキナーゼ１／２（ＭＥＫ１／２）阻害剤の１０μＭ Ｕ０１２６で１時間前処置後に８時間の薬物刺激を加えた。
【００２６】
この細胞を回収し、Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いて４回測定した。その代表例を図４に示す。
【００２７】
その結果、被験物質４０μｇ／ｍｌを細胞培養液に添加することにより、ＣＲＥ依存的転写活性は、Control群のそれを１とすると、約２（１．９５±０．１０）となった。
【００２８】
他方、上記の濃度のＫＮ６２、Ｈ８９及びＵ０１２６の存在下でのＣＲＥ依存的転写活性は、それぞれControl群のそれを１とすると、１．４７±０．０８、１．２６±０．０２、及び１．１８±０．０８であった。即ち、その亢進効果は、ＣＲＥＢが活性化するシグナル伝達系（ＣａＭＫII、ＰＫＡ、ＭＥＫ１／２）の阻害剤で抑制されることが明らかとなった。つまり本発明の作用機構がＣＲＥＢの活性化であることがこれによって証明された。
【００２９】
以上の如くして、２４種類の柑橘類の全果均質液についての記憶学習障害の改善作用について検討を行った結果、柑橘類の全果均質液が、ＣＲＥＢのリン酸化（ＣＲＥ転写活性の亢進）を促進し、ＣＲＥＢが仲介するシグナル伝達系を活性化させることで記憶障害を改善し得ることが明らかとなった。なお、この時の全果均質液の最適濃度は２０〜４０μｇ／ｍｌであった。またこの結果より、本発明による柑橘類の全果均質液を公知の製剤技術に適用することで、学習記憶障害の改善効果を生み出す薬剤をも提供できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明にかかる柑橘類の全果の粉砕搾汁液並びに該粉砕搾汁液からの抽出物は、機能性食品に適用可能である。この機能性食品は、生体機能の調節など、生理面での働き（３次機能）を十分に発揮するように製造された食品を指し、例えば、「健康・栄養食品アドバイザリー・スタッフ・テキストブック」（平成１５年７月３０日、第一出版株式会社発行、第９２、９３頁）に記載されている通り、一般の食品はもとより、いわゆる健康食品とは一線を画する別のものとして定義されたものである。
【００３１】
なお、このような機能性食品において、有効成分である本発明物質の担体成分に対する配合割合は、５〜８５重量％の範囲であり、特に３０〜６０重量％の範囲が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】学習記憶障害モデル動物に対する本発明物質の効果を示すグラフである。
【図２】ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす本発明物質の亢進効果の評価グラフである。
【図３】ラット海馬神経細胞におけるＥＲＫ／ＣＲＥＢリン酸化に及ぼす本発明物質の亢進効果の評価グラフである。
【図４】ラット海馬神経細胞におけるＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす本発明物質の亢進効果に対する各種シグナル阻害剤の影響の評価グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘類の全果の粉砕搾汁液および該粉砕搾汁液からの抽出物の少なくともいずれか一方を含有し、ＣＲＥＢの活性化を作用機構とすることを特徴とする学習記憶障害を改善する機能性食品。
【請求項２】
前記柑橘類は、ハナユ、コウライタチバナ、シキキツ、キジツ、ナツミカン、ダイダイ、ポンカン、地中海マンダリン、 ダンシータンジェリン、オオベニミカン、タチバナ、コベニミカン、無核キシュウ、シークワーサー、フクレミカン、カプチー、太田ポンカン、ヒラキシュウ、ウンシュウ、サンキツ、クレオパトラ、コウジ、ギリミカン、およびイーチャンレモンを含む柑橘類から選択されることを特徴とする請求項１に記載の学習記憶障害を改善する機能性食品。
【請求項１】
柑橘類の全果の粉砕搾汁液および該粉砕搾汁液からの抽出物の少なくともいずれか一方を含有し、ＣＲＥＢの活性化を作用機構とすることを特徴とする学習記憶障害を改善する機能性食品。
【請求項２】
前記柑橘類は、ハナユ、コウライタチバナ、シキキツ、キジツ、ナツミカン、ダイダイ、ポンカン、地中海マンダリン、 ダンシータンジェリン、オオベニミカン、タチバナ、コベニミカン、無核キシュウ、シークワーサー、フクレミカン、カプチー、太田ポンカン、ヒラキシュウ、ウンシュウ、サンキツ、クレオパトラ、コウジ、ギリミカン、およびイーチャンレモンを含む柑橘類から選択されることを特徴とする請求項１に記載の学習記憶障害を改善する機能性食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−６１０２８（Ｐ２００７−６１０２８Ａ）
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２５２９７６（Ｐ２００５−２５２９７６）
【出願日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（５０５０３３５０３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（５０５０３３５０３）
【Ｆターム（参考）】
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