安定なバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で製造するための方法
本発明は、バコパ・モニエラ抽出物から非吸湿性の形態でバコサイドが濃縮された画分を製造するための新規な方法を提供し、該方法は、以下のステップ：新たに収穫されたハーブを３７〜４２℃の乾熱オーブン中で乾燥して３０〜４０メッシュサイズとするために乾燥ハーブをふるいにかけ、改変されたソックスレー抽出機中、ヘキサンによって該乾燥ハーブを脱脂し、該脱脂された粉末化ハーブをアセトンで抽出し、再び同じハーブをメタノールで抽出してバコサイドを含有する抽出物を得て、該抽出物をもとの体積の２０分の１に減圧濃縮し、該濃縮物を徐々にアセトンに添加して、バコサイドを沈殿させ、Nutshce型真空ろ過装置中でバコサイドをろ過し、該粗製バコサイドを２〜１０部の水に溶解し、該バコサイド溶液をn−ブタノールで抽出してバコサイドを選択的に溶媒相へ移し、真空下で溶媒相を分離、濃縮して半乾燥物質を得て、該半乾燥物質を２〜１０部の水に溶解し、そして１〜５％のβ‐シクロデキストリンを攪拌しながら添加してバコサイドを安定化させ、安定化されたバコサイド溶液を熱空気の温度を９０〜１１０℃に保持することによってスプレー乾燥してバコサイドが濃縮された安定な自由流動性のバコパ・モニエラ画分を得る、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハーブであるバコパ・モニエラ（Bacopa monniera）から、安定なバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で製造するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物由来の薬物及び製剤は、それらが近年の合成医薬よりも生物的に安全な特質を有することができることにより、ヘルスケアに関して世界的な流行の高まりを示す。多数の伝統的なインドの薬用ハーブのなかでも、ヒンズー語で「ブラミ（Brahmi）」として知られているバコパ・モニエラの標準化された抽出物は、脳及び神経機能を支持し、そして記憶、機敏性及び精神的集中を高めることを目的とするハーブを用いた現代の栄養補助食品の成分としての使用が増大している（Ray Sahelian, M.D. "Mind Boosters", 1999, Amazon Publishing House, USA）。
【０００３】
バコパ・モニエラは、古代からインドにおいて脳及び神経の強壮剤としてのアーユルヴェーダ製剤中で使用されてきた（Chunekar K C, "Bhav Prakasha Nighantu",(ヒンズー語訳)、Varanasi, 1960:372）。Banaras Hindu大学において臨床試験が行われた（Singh R H and Singh Lallan, "Studies on the Anti-anxiety effect of the Medhya Rasayana Drug, Brahmi Bacopa monniera Wettst. Part 1, Journal of Res. Ayurveda & Sidha Vol 1: 133-148, 1980）。ブラミシロップの形態のバコパ・モニエラは、35人の不安神経症患者に投与されたとき、ブラミによる４週間の治療が顕著に患者の不安のレベルを低下させるとともに治療された患者の精神力及び記憶を改善したと結論付けられた。知性及び精神力に対するバコパ・モニエラの有益な効果は、Banaras Hindu大学での２０人の生徒に対して３ヶ月にわたって行われた試験においてさらに研究された（Sharma R, Chaturvedi C, Tewari P V, "Efficacy of Bacopa monniera in revitalizing intellectual functions in Children" Journal Res. Edu, Ind. Med, Jan-June: 1-12, 1987）。
【０００４】
バコパ・モニエラについての系統的な化学的試験は、N Chatterjee, R P Rastogi & M L Dhar, (Indian Journal of Chemistry, Vol 1, May 1963)によって最初に報告された。彼らは、乾燥植物中に２％超の濃度で存在するバコサイドA及びBと名づけられた２つのサポニンについて報告した。バコサイドA及びBの分子構造が続いて明らかにされた（Chatterjee N, Rastogi R P and Dhar M L, Indian J Chem, Vol 3: 24, 1965及びBasu N, Rastogi P and Dhar M L, Indian J Chem Vol 5: 84, 1967）。これらの研究はまた、バコサイドA及びBの以下の物性：
バコサイドA、 融点＝２５０．６℃（分解）
旋光度αD＝エタノール中で（−）４２°
バコサイドB、 融点＝２０３℃（分解）
旋光度αD＝エタノール中で（＋）８°
をも報告している。
【０００５】
バコパ・モニエラ中のバコサイドA含量の測定のための、高性能薄層クロマトグラフィーに基づく分析方法が、Guptaらによって報告された（A P Gupta, S Mathur, M M Gupta & Sushil Kumar, "Effect of the method of drying on the bacoside-A content of the harvested Bacopa monniera shoots revealed using a high performance thin layer chromatography method", Journal of Medicinal and Aromatic Plants Vol, 20: 1052-1055, 1998）。バコパ・モニエラ抽出物の生理活性は、Central Drug Research Institute, Lucknow, Indiaにおいて実施された広範な試験において、ラットの回避応答を評価することによって研究された(H K Singh, R P Rastogi, R C Srimal and B N Dhawan, Phytotherapy Research, Vol 2(2): 70-75,1988)。この研究において、バコサイドA及びBが、バコパ・モニエラの活性成分であって、亢進した精神力及び保持能力を生じさせることが結論された。
【０００６】
ブラミの伝統的な主張の確証を得るための調査が、記憶に関連する３つの応答である、習得、固定及び保持に対するこの植物のアルコール抽出物の効果をアルビノラットにおいて研究することにより、Central Drug Research Instituteにおいて行われた（Singh H K and Dhawan B N, "Neuropsychopharmacological effects of the Ayurvedic nootropic Bacopa monniera Linn(Brahmi）", Indian Journal of Pharmacology, Vol 29(5): S359-S365, 1997）。この研究において、バコサイドは、正常な健康男性ボランティアにおいて実施された調節性、薬理学的、及び毒性学的試験においても安全であることが発見された。この試験は、第１相臨床試験と名づけられた。バコパ抽出物が、ヒトボランティアに対して、二重盲検プラセボ対照および非クロスオーバー規制臨床試験（double blind placebo controlled and non-crossover regulatory clinical trial）において、単一及び複数用量で４週間の間投与された。バコサイドの促進効果の作用メカニズムは、亢進されたプロテインキナーゼ活性及び海馬におけるタンパク質レベルの増加によるものであった。この試験の他の結論としては、バコサイドが固定化により誘発されたストレス及びスコポラミンにより生じた逆行性健忘を軽減したということである。P A Thakurdesai, P L Kole及びA. N Nagappa(www. Pharmabiz.com/newsfeat/ feat112.com)は、標準化された抽出物を使用することが、所望の有効性を達成するために必要であることを強調した。
【０００７】
バコパ・モニエラ由来のバコサイドのヒトの健康における大いなる重要性及び能力を考慮すると、工業的生産に適した有効な方法に関する情報は文献中にはない。特許文献もバコサイドの有効な生産技術についての情報を開示していない。文献には、バコサイドを含有するバコパ・モニエラ抽出物の実験室規模での調製方法がいくつか記載されている。Chatterjeeらにより採用され（N Chatterjee, R.P. Rastogi & M.L.Dhar, Indian Journal of Chemistry, Vol 1, May 1963; Chatterjee N, Rastogi R P and Dhar, Indian Journal of Chemistry, Vol 3: 24, 1965）、Singhらによりさらに改変された（H K Singh, R P Rastogi, R C Srimal and B N Dhawan, Phytotherapy Research, Vol 2(2): 70-75, 1988）単離方法は、バコパ・モニエラの乾燥ハーブをアルコール抽出することを記載し、ここで、乾燥ハーブ材料は、最初に水で湿らされ、そしてアルコールで抽出され、これが減圧濃縮され、脱脂のために繰り返しベンゼンに浸される。ろ液はアルコールで６０％濃度に希釈され、過剰の酢酸鉛で処理される。鉛塩はろ過され、残った鉛は亜硫酸水素でろ液から除去される。ろ液のｐHは炭酸ナトリウムで６．４に調節され、５０℃で３分の１の体積に真空濃縮され、ブタノール及び水の間で繰り返し分配される。ブタノール画分を真空濃縮すると、バコサイドA及びBを含む粉末が堆積する。そして、その粉末は、アルコールから無色の針状物として結晶化される。溶媒から除去することによって、追加の量のバコサイドをろ液から得て、残渣をアセトンに浸す。非常に冗長且つ時間がかかることは別としても、この方法は、（潜在的に発がん性である）ベンゼン及び（非常に毒性である）鉛塩の使用を含む。上記プロセスが残留する鉛を亜硫酸水素ガスで除去することを試みるにもかかわらず、高い効率を達成することが難しい気液物質移動が含まれることからして、完全な除去は疑わしい。これらの毒性化学物質の存在はたとえそれが痕跡量であったとしても、最終生成物の質を疑わしいものとするであろう。冗長且つ健康に有害であるため、この方法は、工業的生産まで規模を拡大するのには適さない。H K Singh及びB N Dhawanにより行われた試験で使用された方法においては、ブラミ抽出物のラット回避応答に対する効果を評価するために、空気乾燥された植物材料がソックスレー抽出装置により９０％エタノールで抽出され、得られた抽出物は、ラットに給餌するために１０％アカシアゴムと混合される（Journal of Ethanopharmacology, Vol 5: 205-214, 1982）。この試験においては、抽出物のバコサイド含量をモニターすることは試みられなかった。University of Madrasにおいてバコパ・モニエラの抗癌活性について実施された他の試験においては、バコサイド抽出法は、粉末化植物材料を９５％エタノールに４８時間浸漬し、抽出物を真空濃縮し、そして凍結乾燥によって乾燥させることを含む（V. Elangovan, S Govindasamy, N Ramamoorthy and K. Balasubramanian, "In vitro studies on the anticancer activity of Bacopa monniera, Fitoterapia Vol LXVI(3): 211-215, 1995）。抽出物のバコサイド濃度を測定することは試みられなかった。２０〜３０％のバコサイドA及びBを含む、標準化されたバコパ・モニエラ抽出物は、いくつかの商業的企業によって製造販売されているが、製造方法は開示されていない（Product Information Brochure of M/s Sabinsa Corporation, 121, Ethel Road West, Piscataway, NJ 08854, USA and M/s Himalaya USA, M/s Velvette International, Chennai, India, M/s Dalmia Industries Ltd, India）。
【０００８】
上記方法の間に遭遇する主な問題は、活性成分（バコサイド）が非常に吸湿性であるため、安定な最終生成物を乾燥した自由流動性粉末の形態で得ることが困難であることであった。
【発明の開示】
【０００９】
発明の目的
本発明の主要な目的は、ハーブであるバコパ・モニエラから非吸湿性の形態でバコサイドが濃縮された画分を調製するための改善された方法であって、従来の既知の方法の欠点を克服した方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、ヘキサン、アセトン及びメタノールのような比較的無毒性の溶媒を用いてバコパ・モニエラからバコサイドが濃縮された画分を調製するための改善された方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、アセトンで脱脂ハーブを抽出することによって、バコパ・モニエラハーブの望ましくない成分を除去するための改善された方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のなおさらに他の目的は、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン又はポリビニルアルコールなどの無毒性の安定化剤を添加することによって、バコサイド含有抽出物を安定化させるための改善された方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、往復攪拌機を備えた向流「KARR」液液抽出カラムを用いてバコパ・モニエラ抽出物を精製するための改善された方法を提供することにある。
【００１４】
発明の要約
したがって、本発明は、ハーブであるバコパ・モニエラから安定なバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で調製するための有効な方法を提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、バーブであるバコパ・モニエラの抽出物から、安定なバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性形態で調製するための改善された方法を提供し、該方法は以下のステップ：
（ｉ）新たに収穫されたバコパ・モニエラハーブを３７〜４２℃の温度範囲のオーブン中で４〜６時間、乾燥させ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の乾燥ハーブを離解機中で粉にひき、そしてふるいにかけて、粉にひいたハーブ抽出物を得て；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の粉にひいたハーブを、改変ソックスレー装置中でヘキサンで抽出してヘキサン抽出物を得て；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたヘキサン抽出物をソックスレー装置から取り出し、該ハーブを循環熱水で乾燥させ；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の乾燥ハーブを、４〜８時間、アセトンで抽出して、望ましくない色及び非バコサイド成分を含むアセトン抽出物を得て；
（ｖｉ）ステップ（ｖ）のアセトン抽出されたハーブを、メタノールで抽出して、バコサイドを含むメタノール抽出物を得て；
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）のメタノール抽出物を減圧濃縮して；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の濃縮メタノール抽出物を、攪拌しながらアセトンに徐々に添加して、粗製バコサイドを優先的に沈殿させ；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の粗製バコサイドを、Nutsche型真空ろ過装置中でろ過し、粗製バコサイド残渣を得て；
（ｘ）ステップ（ｉｘ）の粗製バコサイド残渣を水で溶解し、水溶液を得て；
（ｘｉ）ステップ（ｘ）の水溶液をｎ−ブタノールで抽出してｎ−ブタノール抽出物を得て；
（ｘｉｉ）ステップ（ｘｉ）のｎ−ブタノール抽出物をロータリー真空エバポレーター中、高度の真空下で濃縮して、バコサイドが濃縮された乾燥残渣を得て；
（ｘｉｉｉ）ステップ（ｘｉｉ）の乾燥残渣を、攪拌しながら、２〜１０部の水に溶解し、１〜５重量％の無毒性安定化剤を添加し、安定なバコサイド溶液を得て；そして、
（ｘｉｖ）ステップ（ｘｉｉｉ）の安定なバコサイド溶液を、９０〜１１０℃の温度でスプレー乾燥し、自由流動性の安定且つ非吸湿性粉末の形態のバコサイドを得ること；
を含む。
【００１６】
本発明の実施態様においては、ステップ（ｉｉ）において、粉に引いたハーブの粒子サイズは、３０〜４０メッシュの範囲にある。
【００１７】
本発明の他の実施態様においては、ステップ（ｉｉｉ）において、乾燥バコパ・モニエラハーブは、薬物容器に熱水ジャケットが備えられた改変されたソックスレー抽出機において抽出される。
【００１８】
本発明のさらに他の実施態様においては、ステップ（ｉｉｉ）において、粉にひいたハーブがヘキサンで抽出されて、ハーブが脱脂される。
【００１９】
本発明のなおさらに他の実施態様においては、ステップ（ｉｖ）において、ハーブは、ジャケット中を循環する７０〜７５℃の温度範囲の熱水によって乾燥される。
【００２０】
本発明のもう一つの実施態様においては、ステップ（ｖｉｉ）において、バコサイドを含有する抽出物は、そのもとの体積の２０分の１に濃縮される。
【００２１】
本発明の他のもう一つの実施態様においては、抽出物は、高度の真空下、４５〜５５℃の温度範囲で攪拌薄膜蒸留装置（agitated wiped film evaporator）を使用して濃縮される。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様においては、ステップ（ｖｉｉｉ）において、過剰量のアセトンとともに攪拌することによって、濃縮メタノール抽出液から粗製バコサイドが沈殿させられる。
【００２３】
本発明の実施態様においては、メタノール抽出物及びアセトンの重量／重量比は、１：４〜１：１０の範囲にある。
【００２４】
本発明の他の実施態様においては、ステップ（ｘｉ）において、ｎ−ブタノールがバコサイド濃度を濃縮するための選択的溶媒として使用されて、それによってより高い生成物純度を得る。
【００２５】
本発明のさらに他の実施態様においては、ステップ（ｘｉ）において、バコパ・モニエラ抽出物は、往復攪拌機を備えた向流「ＫＡＲＲ」液液抽出カラムを使用して有効に精製されることができる。
【００２６】
本発明のなおさらなる他の実施態様においては、ステップ（ｘｉｉｉ）において、使用される無毒性の安定化剤は、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン及びポリビニルアルコールから成る群から選ばれる。
【００２７】
本発明のもう一つの実施態様においては、バコパ・モニエラ乾燥重量に対するバコサイドの収率は、１．５〜２．５％の範囲である。
【００２８】
本発明の他の実施態様においては、得られた粉末は、２０〜３０％のバコサイドＡ及びＢを含む。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様においては、上記粉末中のバコサイドのパーセンテージは、ＨＰＴＬＣ分析によって推定される。
【００３０】
本発明の方法によれば、最初のステップは、新たに収穫されたハーブを、３７〜４２℃のトレイ型の乾熱オーブン中で４〜８時間乾燥することからなる。均一に乾燥するためには、穿孔処理された乾燥トレイ上に、２〜３インチの厚さの均一な薄い層でハーブを広げることに注意する。ハーブのサンプルは、水分含量について試験され、それは３．５〜５．５％であることが好ましい。乾燥ハーブを離解機中で粉末化する。得られた粗い粉末を３０メッシュのふるいにかけ、大きすぎる材料を再び離解機へ戻す。粉末化された乾燥ハーブを改変されたソックスレー装置の薬物容器に、炭化水素溶媒「ヘキサン」とともに入れる。この溶媒は、望ましくない脂質、植物ワックス及び着色物質の一部を除去するその能力のために選ばれた。また、バコサイドは、完全にヘキサンに不溶性であり、植物材料中にそのまま残される。バコパ・モニエラハーブの完全な脱脂を達成するために、４〜８時間にわたって何回かの浸出（percolation）が行われる。抽出の完了後、溶媒の回収のためにハーブ抽出物が除去され、そして、７０〜７５℃の熱水を薬物容器ジャケットに通すことによって、バコパ・モニエラ層が乾燥される。次に、同じハーブの層を弱い極性溶媒「アセトン」によって４〜８時間、抽出する。バコサイドが不溶性であるアセトンによるハーブの２回目の抽出は、残留する望ましくない成分及び着色物質をハーブから最大限に除去するために実施される。抽出後、アセトン抽出物は、溶媒の回収のために除去され、上記の手順に従ってハーブの層が乾燥される。上記層は次に、バコサイド及び他の微量成分を溶解する極性の高い溶媒「メタノール」を使用してさらに４〜８時間抽出される。そして、メタノール抽出物をソックスレー装置から取り出し、４５〜５５℃のロータリー真空エバポレーター中で最初の体積の２０分の１に真空濃縮される。バコサイドを含む濃縮された抽出物を、１〜４部のアセトンを含む容器に攪拌しながらゆっくりと添加し、バコサイドA及びBを他のアセトン不溶性物質とともに沈殿させた。スラリーをNutsche型真空ろ過装置を通してろ過し、溶媒を除去する。沈殿物を次に２〜１０部の水に溶解する。この溶液を、極性が高く、水と混和しない溶媒で抽出し、バコサイドを溶媒相へ移す。我々は、ｎ−ブタノールをこのステップのための溶媒として選んだ。それは、ｎ−ブタノールがバコサイドに対する高い選択性の要求を満たし、且つ水と混和しないためである。ブタノール抽出物は、５０〜５５℃のロータリー真空エバポレーター中、高度な真空下で濃縮される。効果的に乾燥された物質は、容器中の２〜１０部の水に攪拌しながら溶解され、β‐シクロデキストリン（１〜５％）が安定化剤として添加される。マンニトール、マルトデキストリン、ポリビニルアルコールのような他の安定化剤もまた、この目的に適している。攪拌を１〜２時間続ける。次に、溶液をスプレーノズルと生成物を集めるためのサイクロン装置を備えた乾熱スプレー乾燥機に入れる。空気及び溶液の流速並びに熱空気の温度は慎重に制御され、バコサイド混合物を薄黄色の、自由流動性のそして非吸湿性の粉末として得る。最終生成物中のバコサイドのパーセンテージは、Guptaらにより報告されたHPTLC法によって推定される（A P Gupta, S Mathur, M M Gupta & Sushil Kumar, Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 20: 1052-1055, 1998）。本発明の方法によれば、２０〜３０％のバコサイドＡ及びＢを含む生成物が得られる。バコパ・モニエラ乾燥重量に基づく生成物収率は、１．５〜２．５％の範囲である。バコパ・モニエラのこの標準化された抽出物は、かなり安定であり、栄養補助食品中へ製剤されるのに適している。
【００３１】
本発明の方法は、以下の実施例によって例解されるが、これらは本発明の範囲を限定するものと解するべきでない。以下の実施例はまた、本発明の具体的実施態様を例解する。
【実施例】
【００３２】
実施例１
CIMAP農場で栽培された１．０ｋｇのバコパ・モニエラハーブを暗所、３０℃において２４時間、そして、４２℃のトレイ型乾熱オーブン中で８時間乾燥した。オーブンの穿孔処理されたトレイ上に、ハーブを３インチの層で均一に広げた。乾燥後、ハーブサンプルの水分含量をチェックし、４．５％と評価した。乾燥ハーブを離解機中で粉末化し、粗い粉末を３０メッシュサイズのふるいを通した。サイズの大きすぎる物質を離解機中に戻した。４００グラムの粉末乾燥ハーブを、改変されたガラスソックスレー装置の薬物容器中に入れた。２．５リッターのヘキサンを再沸フラスコ中にとり、水浴上で加熱して溶媒を沸騰させ、溶媒のハーブ層中での循環を開始した。ソックスレー装置をこのようにして持続的に５時間作動させ、ハーブ材料を脱脂した。ヘキサン抽出物を溶媒の回収のために取り出した。７０〜７５℃の熱水をソックスレー装置の改変された薬物容器ジャケットを通して、残りの溶媒を蒸発させることによってハーブ層を乾燥させた。次に、２．５リッターのアセトン溶媒を再沸フラスコにとり、水浴上で加熱して、溶媒のハーブ層中での循環を開始した。ソックスレー装置を５時間作動させて、望ましくない成分及び着色物質をハーブから除去した。溶媒の回収のために、アセトン抽出物を再沸フラスコから取り出し、ハーブ層を上記と同じ方法で乾燥させた。乾燥後、２．５リッターのメタノール溶媒によってハーブ層の３回目の抽出を行った。ソックスレー装置を６時間作動させて、完全にバコサイドを溶解させた。そして、メタノール抽出物をソックスレー装置から取り出し、ロータリー真空エバポレーターに移して、溶媒を回収した。抽出物を約１００ｍｌの最終体積まで濃縮した。バコサイドを含む濃縮された抽出物を、４００ｍｌのアセトンを入れた容器に攪拌しながらゆっくりと加えて、バコサイドを他のアセトン不溶性物質とともに沈殿させた。Nutsche型真空ろ過装置中でスラリーをろ過し、溶媒を除去した。次に、沈殿を５０ｍｌの水に溶解した。そして、この溶液を５×１５ｍｌのｎ−ブタノールで抽出して、バコサイドを溶媒相へ移した。２つの相を分離し、ブタノール抽出物をロータリー真空エバポレーターへ移し、５０〜５５℃の温度において高度の真空下で濃縮した。バコサイドを含む、効果的に乾燥された物質（９．８０グラム）を１００ｍｌの水に容器中で攪拌しながら溶解し、０．２グラムのβ‐シクロデキストリンを安定化剤として溶液に添加した。攪拌をさらに１．５時間続けた。次に、溶液をスプレーノズル及び生成物を集めるためのサイクロン装置を備えた乾熱スプレー乾燥機に入れた。サイクロン装置における熱空気の温度は、１００〜１１０℃に維持した。最終生成物（７．８０グラム）を、薄黄色の自由流動性且つ非吸湿性の粉末として回収した。生成物中のバコサイドAのパーセンテージは、HPTLC法によって推定した。５．０ｍｇのサンプルを２ｍｌのメタノールに溶解した。バコサイドA標準品とともにサンプルをTLCプレート（６０F254、シリカゲル、Merck）に適用し、酢酸エチル：メタノール：蒸留水（６０：１４：１０）で流した。プレートを８ｃｍの高さまで展開し、プレートをバニリン‐硫酸試薬（バニリン：硫酸：酢酸エチル‐１ｇ：５ｍｌ：５ｍｌ）に浸漬し、次いでプレートを１１０℃で１５分間加熱することによってスポットを可視化した。青色のバコサイドAスポットを二重波長吸収‐反射モードを使用し、バックグラウンドを差し引いて、１×２の光スリットを使用して（高さ０．４ｍｍ×幅１．２ｍｍ：Shimadzu CS930デンシトメーター使用）、６２０nm及び４３０nmにおいてスキャンした。可変量のバコサイドAを使用してプロットした較正曲線を、サンプル中のバコサイドA含量％を推定するために使用した。本発明のこの方法によって、２８％のバコサイドAを含む生成物が得られた。バコパ・モニエラ乾燥重量に基づく生成物の回収率は、１．９５％であった。
【００３３】
実施例２
同じ方法を、３５Kgの乾燥バコパ・モニエラハーブを用いるパイロットプラント規模で実施したが、ステンレススチールパイロットプラント装置を使用した。CIMAP農場で栽培された１５０Kgのバコパ・モニエラハーブを暗所、３２℃で２４時間乾燥させ、さらに乾熱トレイ型オーブン中、４０〜４２℃で８時間乾燥させて、最終水分含量４％とした。乾燥ハーブ材料を離解機中で粉にひいて、約３０メッシュサイズとした。３５Kgの乾燥ハーブ材料をステンレススチールのソックスレープラントの薬物容器中に負荷した。２００リッターのヘキサン溶媒をポンプを用いて薬物容器中に入れ、完全にハーブ材料を浸漬した。２．０時間の接触時間の後、抽出物を再沸ケトル（抽出物の体積：１６５リッター）に流し込んだ。１０psigのライン圧の蒸気を再沸ケトルのジャケット中に通し、ヘキサンを蒸留し、これを薬物容器中へ、ハーブ層よりも２インチ上のレベルとなるまで再びスプレーした。２回目の洗浄のためには、２．０時間の接触時間とした。３回目および４回目の洗浄を上記と同じ方法で行った。ヘキサンを蒸留によって抽出物から回収し、濃く着色した残渣は除いた。ハーブに付着した残った溶媒は、薬物容器ジャケット中の７５℃の循環熱水によって回収した。ハーブ層を乾燥後、２７℃の２００リッターのアセトンを薬物容器にポンプを使用して入れ、乾燥した脱脂ハーブを完全に浸漬した。ハーブを２．０時間の接触時間で４回洗浄して、望ましくない成分および着色物質を除去した。アセトン抽出物を蒸留して溶媒を回収した。ハーブ層を上記と同じ方法で乾燥させた。乾燥後、２００リッターのメタノールをポンプを使用して薬物容器中に入れた。ハーブを２．０時間の接触時間で４回洗浄して、バコサイドを溶解させた。ソックスレー装置の再沸ケトル中でメタノール抽出物を２分の１の体積に濃縮した。さらなる処理のために、濃縮物をステンレスチールの攪拌薄膜蒸留装置（WFE）へ移した。系を２７５ミリバールの真空下に保持した。テフロン（登録商標）ワイパーの回転速度を２９０rpmに設定し、６０℃の熱水をエバポレータージャケット内で循環させた。WFE処理から、１０．５リッターの濃縮抽出物が得られた。抽出物をその後、ゆっくりと４５リッターのアセトンを入れた機械的攪拌機のステンレススチール容器に移した。溶液の攪拌を１時間続けた。そして、内容物を密閉したステンレススチール真空ろ過装置に移してアセトン溶媒を除去した。ろ過ケーキを取り除き、８リッターの水に溶解した。その後、溶液を往復攪拌機を備えた「KARR」液液抽出カラムに移した。水溶液を向流モードの液液抽出カラム中で１０リッターのn−ブタノールと接触させ、バコサイドをブタノール相に移した。そして、５〜１０トルの高度の真空下、温度４５〜５０℃において抽出物を濃縮するために、ブタノール相をステンレススチールの攪拌薄膜蒸留装置にポンプを使用して入れた。バコサイドを含む濃縮された物質（１．００ｋｇ）を、ステンレススチール容器中で４．０リッターの水に攪拌しながら溶解し、安定化剤として１８グラムのβ‐シクロデキストリンを添加し、１．５時間攪拌した。次に、溶液を、スプレーノズルと生成物を集めるためのサイクロン装置を備えた乾熱スプレー乾燥機に入れた。サイクロンにおける熱い空気の温度は、１００〜１１０℃に維持した。バコサイドを含む生成物（７１０グラム）を薄黄色の自由流動性且つ非吸湿性の粉末として得た。乾燥ハーブに基づく回収率は２．０２％であった。生成物中のバコサイド含量は、HPTLC法により推定し、実施例１に例解された分析方法によれば、生成物中のバコサイドAのパーセンテージは２６％であった。
【００３４】
発明の新規性
１． ベンゼン及び鉛塩のような有毒且つ潜在的に発がん性の化学物質を必要とする従来技術による方法とは異なり、改善された方法は、ヘキサン、アセトン及びメタノールなどの比較的無毒性の溶媒を使用することによって、バコパ・モニエラからバコサイドが濃縮された抽出物を製造することを達成する。
２． 改善された方法においては、ハーブの脱脂はベンゼンの代わりにヘキサンを使用することによって実施される。ヘキサンは、より低い沸点及び１８％低い蒸発潜熱によって、方法にかかる加熱の費用をより低くし、そしてより重要なことは、ヘキサンの場合、残留溶媒のレベルが低くなる。
３． 改善された方法は、薬物容器に熱水ジャケットを備えた改変されたソックスレー抽出機を使用する。この変更は、第二の溶媒による抽出の開始前に、ハーブ層から残留する第一の溶媒を除去するために有用であり、したがって、同じ抽出系において複数の溶媒による抽出を可能とする。従来技術のいずれも、それらにおいて使用される抽出装置及び技術についての情報を提供していない。
４． バコサイドを含有するバコパ・モニエラから得られた抽出物が非常に吸湿性であり、乾燥することが非常に困難で、さらなる製剤化をきわめて困難且つ不正確なものとすることが観察されてきた。V Elangovanらにより報告された従来技術の方法は、彼らの実験的試験において使用するために、バコパ・モニエラの乾燥に凍結乾燥を使用した。乾燥技術としての凍結乾燥は、時間がかかり、非常に低い温度と１０-3〜１０-4ミリバールの高度の真空を作り出すことを必要とし、それは、非常に費用のかかる装置と非常にエネルギーを必要とする操作によって達成されなければならなかった。本発明の改善された方法は、最終生成物を非吸湿性で均一な粒子サイズの自由流動性粉末として得るための、より迅速で低コストの代替法として、安定化された抽出物のスプレー乾燥法を使用する。
５． 改善された方法におけるバコサイドを含有する抽出物の安定化は、医薬製剤中の賦形剤として十分に受け入れられている、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン、ポリビニルアルコールなどの無毒性の安定化剤の賢明な使用（１〜５％のレベル）によって達成される。バコパ・モニエラのバコサイド含有抽出物の安定化は、これまで報告されていない。
６． 従来技術による方法は、いやな苦い味を有する抽出物を生じた。それは、濃い緑色をしていた。バコパ・モニエラ抽出物は栄養補助食品及び健康食品を製剤するために使用されるため、抽出物が美味で色が薄いことは、味がよく外観の美しい最終製剤を達成するために最も重要なことである。本発明の方法は、選択的な溶媒を使用することによって、苦い味の成分を除去することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハーブであるバコパ・モニエラ（Bacopa monniera）から、安定なバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で製造するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物由来の薬物及び製剤は、それらが近年の合成医薬よりも生物的に安全な特質を有することができることにより、ヘルスケアに関して世界的な流行の高まりを示す。多数の伝統的なインドの薬用ハーブのなかでも、ヒンズー語で「ブラミ（Brahmi）」として知られているバコパ・モニエラの標準化された抽出物は、脳及び神経機能を支持し、そして記憶、機敏性及び精神的集中を高めることを目的とするハーブを用いた現代の栄養補助食品の成分としての使用が増大している（Ray Sahelian, M.D. "Mind Boosters", 1999, Amazon Publishing House, USA）。
【０００３】
バコパ・モニエラは、古代からインドにおいて脳及び神経の強壮剤としてのアーユルヴェーダ製剤中で使用されてきた（Chunekar K C, "Bhav Prakasha Nighantu",(ヒンズー語訳)、Varanasi, 1960:372）。Banaras Hindu大学において臨床試験が行われた（Singh R H and Singh Lallan, "Studies on the Anti-anxiety effect of the Medhya Rasayana Drug, Brahmi Bacopa monniera Wettst. Part 1, Journal of Res. Ayurveda & Sidha Vol 1: 133-148, 1980）。ブラミシロップの形態のバコパ・モニエラは、35人の不安神経症患者に投与されたとき、ブラミによる４週間の治療が顕著に患者の不安のレベルを低下させるとともに治療された患者の精神力及び記憶を改善したと結論付けられた。知性及び精神力に対するバコパ・モニエラの有益な効果は、Banaras Hindu大学での２０人の生徒に対して３ヶ月にわたって行われた試験においてさらに研究された（Sharma R, Chaturvedi C, Tewari P V, "Efficacy of Bacopa monniera in revitalizing intellectual functions in Children" Journal Res. Edu, Ind. Med, Jan-June: 1-12, 1987）。
【０００４】
バコパ・モニエラについての系統的な化学的試験は、N Chatterjee, R P Rastogi & M L Dhar, (Indian Journal of Chemistry, Vol 1, May 1963)によって最初に報告された。彼らは、乾燥植物中に２％超の濃度で存在するバコサイドA及びBと名づけられた２つのサポニンについて報告した。バコサイドA及びBの分子構造が続いて明らかにされた（Chatterjee N, Rastogi R P and Dhar M L, Indian J Chem, Vol 3: 24, 1965及びBasu N, Rastogi P and Dhar M L, Indian J Chem Vol 5: 84, 1967）。これらの研究はまた、バコサイドA及びBの以下の物性：
バコサイドA、 融点＝２５０．６℃（分解）
旋光度αD＝エタノール中で（−）４２°
バコサイドB、 融点＝２０３℃（分解）
旋光度αD＝エタノール中で（＋）８°
をも報告している。
【０００５】
バコパ・モニエラ中のバコサイドA含量の測定のための、高性能薄層クロマトグラフィーに基づく分析方法が、Guptaらによって報告された（A P Gupta, S Mathur, M M Gupta & Sushil Kumar, "Effect of the method of drying on the bacoside-A content of the harvested Bacopa monniera shoots revealed using a high performance thin layer chromatography method", Journal of Medicinal and Aromatic Plants Vol, 20: 1052-1055, 1998）。バコパ・モニエラ抽出物の生理活性は、Central Drug Research Institute, Lucknow, Indiaにおいて実施された広範な試験において、ラットの回避応答を評価することによって研究された(H K Singh, R P Rastogi, R C Srimal and B N Dhawan, Phytotherapy Research, Vol 2(2): 70-75,1988)。この研究において、バコサイドA及びBが、バコパ・モニエラの活性成分であって、亢進した精神力及び保持能力を生じさせることが結論された。
【０００６】
ブラミの伝統的な主張の確証を得るための調査が、記憶に関連する３つの応答である、習得、固定及び保持に対するこの植物のアルコール抽出物の効果をアルビノラットにおいて研究することにより、Central Drug Research Instituteにおいて行われた（Singh H K and Dhawan B N, "Neuropsychopharmacological effects of the Ayurvedic nootropic Bacopa monniera Linn(Brahmi）", Indian Journal of Pharmacology, Vol 29(5): S359-S365, 1997）。この研究において、バコサイドは、正常な健康男性ボランティアにおいて実施された調節性、薬理学的、及び毒性学的試験においても安全であることが発見された。この試験は、第１相臨床試験と名づけられた。バコパ抽出物が、ヒトボランティアに対して、二重盲検プラセボ対照および非クロスオーバー規制臨床試験（double blind placebo controlled and non-crossover regulatory clinical trial）において、単一及び複数用量で４週間の間投与された。バコサイドの促進効果の作用メカニズムは、亢進されたプロテインキナーゼ活性及び海馬におけるタンパク質レベルの増加によるものであった。この試験の他の結論としては、バコサイドが固定化により誘発されたストレス及びスコポラミンにより生じた逆行性健忘を軽減したということである。P A Thakurdesai, P L Kole及びA. N Nagappa(www. Pharmabiz.com/newsfeat/ feat112.com)は、標準化された抽出物を使用することが、所望の有効性を達成するために必要であることを強調した。
【０００７】
バコパ・モニエラ由来のバコサイドのヒトの健康における大いなる重要性及び能力を考慮すると、工業的生産に適した有効な方法に関する情報は文献中にはない。特許文献もバコサイドの有効な生産技術についての情報を開示していない。文献には、バコサイドを含有するバコパ・モニエラ抽出物の実験室規模での調製方法がいくつか記載されている。Chatterjeeらにより採用され（N Chatterjee, R.P. Rastogi & M.L.Dhar, Indian Journal of Chemistry, Vol 1, May 1963; Chatterjee N, Rastogi R P and Dhar, Indian Journal of Chemistry, Vol 3: 24, 1965）、Singhらによりさらに改変された（H K Singh, R P Rastogi, R C Srimal and B N Dhawan, Phytotherapy Research, Vol 2(2): 70-75, 1988）単離方法は、バコパ・モニエラの乾燥ハーブをアルコール抽出することを記載し、ここで、乾燥ハーブ材料は、最初に水で湿らされ、そしてアルコールで抽出され、これが減圧濃縮され、脱脂のために繰り返しベンゼンに浸される。ろ液はアルコールで６０％濃度に希釈され、過剰の酢酸鉛で処理される。鉛塩はろ過され、残った鉛は亜硫酸水素でろ液から除去される。ろ液のｐHは炭酸ナトリウムで６．４に調節され、５０℃で３分の１の体積に真空濃縮され、ブタノール及び水の間で繰り返し分配される。ブタノール画分を真空濃縮すると、バコサイドA及びBを含む粉末が堆積する。そして、その粉末は、アルコールから無色の針状物として結晶化される。溶媒から除去することによって、追加の量のバコサイドをろ液から得て、残渣をアセトンに浸す。非常に冗長且つ時間がかかることは別としても、この方法は、（潜在的に発がん性である）ベンゼン及び（非常に毒性である）鉛塩の使用を含む。上記プロセスが残留する鉛を亜硫酸水素ガスで除去することを試みるにもかかわらず、高い効率を達成することが難しい気液物質移動が含まれることからして、完全な除去は疑わしい。これらの毒性化学物質の存在はたとえそれが痕跡量であったとしても、最終生成物の質を疑わしいものとするであろう。冗長且つ健康に有害であるため、この方法は、工業的生産まで規模を拡大するのには適さない。H K Singh及びB N Dhawanにより行われた試験で使用された方法においては、ブラミ抽出物のラット回避応答に対する効果を評価するために、空気乾燥された植物材料がソックスレー抽出装置により９０％エタノールで抽出され、得られた抽出物は、ラットに給餌するために１０％アカシアゴムと混合される（Journal of Ethanopharmacology, Vol 5: 205-214, 1982）。この試験においては、抽出物のバコサイド含量をモニターすることは試みられなかった。University of Madrasにおいてバコパ・モニエラの抗癌活性について実施された他の試験においては、バコサイド抽出法は、粉末化植物材料を９５％エタノールに４８時間浸漬し、抽出物を真空濃縮し、そして凍結乾燥によって乾燥させることを含む（V. Elangovan, S Govindasamy, N Ramamoorthy and K. Balasubramanian, "In vitro studies on the anticancer activity of Bacopa monniera, Fitoterapia Vol LXVI(3): 211-215, 1995）。抽出物のバコサイド濃度を測定することは試みられなかった。２０〜３０％のバコサイドA及びBを含む、標準化されたバコパ・モニエラ抽出物は、いくつかの商業的企業によって製造販売されているが、製造方法は開示されていない（Product Information Brochure of M/s Sabinsa Corporation, 121, Ethel Road West, Piscataway, NJ 08854, USA and M/s Himalaya USA, M/s Velvette International, Chennai, India, M/s Dalmia Industries Ltd, India）。
【０００８】
上記方法の間に遭遇する主な問題は、活性成分（バコサイド）が非常に吸湿性であるため、安定な最終生成物を乾燥した自由流動性粉末の形態で得ることが困難であることであった。
【発明の開示】
【０００９】
発明の目的
本発明の主要な目的は、ハーブであるバコパ・モニエラから非吸湿性の形態でバコサイドが濃縮された画分を調製するための改善された方法であって、従来の既知の方法の欠点を克服した方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、ヘキサン、アセトン及びメタノールのような比較的無毒性の溶媒を用いてバコパ・モニエラからバコサイドが濃縮された画分を調製するための改善された方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、アセトンで脱脂ハーブを抽出することによって、バコパ・モニエラハーブの望ましくない成分を除去するための改善された方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のなおさらに他の目的は、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン又はポリビニルアルコールなどの無毒性の安定化剤を添加することによって、バコサイド含有抽出物を安定化させるための改善された方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、往復攪拌機を備えた向流「KARR」液液抽出カラムを用いてバコパ・モニエラ抽出物を精製するための改善された方法を提供することにある。
【００１４】
発明の要約
したがって、本発明は、ハーブであるバコパ・モニエラから安定なバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で調製するための有効な方法を提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、バーブであるバコパ・モニエラの抽出物から、安定なバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性形態で調製するための改善された方法を提供し、該方法は以下のステップ：
（ｉ）新たに収穫されたバコパ・モニエラハーブを３７〜４２℃の温度範囲のオーブン中で４〜６時間、乾燥させ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の乾燥ハーブを離解機中で粉にひき、そしてふるいにかけて、粉にひいたハーブ抽出物を得て；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の粉にひいたハーブを、改変ソックスレー装置中でヘキサンで抽出してヘキサン抽出物を得て；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたヘキサン抽出物をソックスレー装置から取り出し、該ハーブを循環熱水で乾燥させ；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の乾燥ハーブを、４〜８時間、アセトンで抽出して、望ましくない色及び非バコサイド成分を含むアセトン抽出物を得て；
（ｖｉ）ステップ（ｖ）のアセトン抽出されたハーブを、メタノールで抽出して、バコサイドを含むメタノール抽出物を得て；
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）のメタノール抽出物を減圧濃縮して；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の濃縮メタノール抽出物を、攪拌しながらアセトンに徐々に添加して、粗製バコサイドを優先的に沈殿させ；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の粗製バコサイドを、Nutsche型真空ろ過装置中でろ過し、粗製バコサイド残渣を得て；
（ｘ）ステップ（ｉｘ）の粗製バコサイド残渣を水で溶解し、水溶液を得て；
（ｘｉ）ステップ（ｘ）の水溶液をｎ−ブタノールで抽出してｎ−ブタノール抽出物を得て；
（ｘｉｉ）ステップ（ｘｉ）のｎ−ブタノール抽出物をロータリー真空エバポレーター中、高度の真空下で濃縮して、バコサイドが濃縮された乾燥残渣を得て；
（ｘｉｉｉ）ステップ（ｘｉｉ）の乾燥残渣を、攪拌しながら、２〜１０部の水に溶解し、１〜５重量％の無毒性安定化剤を添加し、安定なバコサイド溶液を得て；そして、
（ｘｉｖ）ステップ（ｘｉｉｉ）の安定なバコサイド溶液を、９０〜１１０℃の温度でスプレー乾燥し、自由流動性の安定且つ非吸湿性粉末の形態のバコサイドを得ること；
を含む。
【００１６】
本発明の実施態様においては、ステップ（ｉｉ）において、粉に引いたハーブの粒子サイズは、３０〜４０メッシュの範囲にある。
【００１７】
本発明の他の実施態様においては、ステップ（ｉｉｉ）において、乾燥バコパ・モニエラハーブは、薬物容器に熱水ジャケットが備えられた改変されたソックスレー抽出機において抽出される。
【００１８】
本発明のさらに他の実施態様においては、ステップ（ｉｉｉ）において、粉にひいたハーブがヘキサンで抽出されて、ハーブが脱脂される。
【００１９】
本発明のなおさらに他の実施態様においては、ステップ（ｉｖ）において、ハーブは、ジャケット中を循環する７０〜７５℃の温度範囲の熱水によって乾燥される。
【００２０】
本発明のもう一つの実施態様においては、ステップ（ｖｉｉ）において、バコサイドを含有する抽出物は、そのもとの体積の２０分の１に濃縮される。
【００２１】
本発明の他のもう一つの実施態様においては、抽出物は、高度の真空下、４５〜５５℃の温度範囲で攪拌薄膜蒸留装置（agitated wiped film evaporator）を使用して濃縮される。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様においては、ステップ（ｖｉｉｉ）において、過剰量のアセトンとともに攪拌することによって、濃縮メタノール抽出液から粗製バコサイドが沈殿させられる。
【００２３】
本発明の実施態様においては、メタノール抽出物及びアセトンの重量／重量比は、１：４〜１：１０の範囲にある。
【００２４】
本発明の他の実施態様においては、ステップ（ｘｉ）において、ｎ−ブタノールがバコサイド濃度を濃縮するための選択的溶媒として使用されて、それによってより高い生成物純度を得る。
【００２５】
本発明のさらに他の実施態様においては、ステップ（ｘｉ）において、バコパ・モニエラ抽出物は、往復攪拌機を備えた向流「ＫＡＲＲ」液液抽出カラムを使用して有効に精製されることができる。
【００２６】
本発明のなおさらなる他の実施態様においては、ステップ（ｘｉｉｉ）において、使用される無毒性の安定化剤は、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン及びポリビニルアルコールから成る群から選ばれる。
【００２７】
本発明のもう一つの実施態様においては、バコパ・モニエラ乾燥重量に対するバコサイドの収率は、１．５〜２．５％の範囲である。
【００２８】
本発明の他の実施態様においては、得られた粉末は、２０〜３０％のバコサイドＡ及びＢを含む。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様においては、上記粉末中のバコサイドのパーセンテージは、ＨＰＴＬＣ分析によって推定される。
【００３０】
本発明の方法によれば、最初のステップは、新たに収穫されたハーブを、３７〜４２℃のトレイ型の乾熱オーブン中で４〜８時間乾燥することからなる。均一に乾燥するためには、穿孔処理された乾燥トレイ上に、２〜３インチの厚さの均一な薄い層でハーブを広げることに注意する。ハーブのサンプルは、水分含量について試験され、それは３．５〜５．５％であることが好ましい。乾燥ハーブを離解機中で粉末化する。得られた粗い粉末を３０メッシュのふるいにかけ、大きすぎる材料を再び離解機へ戻す。粉末化された乾燥ハーブを改変されたソックスレー装置の薬物容器に、炭化水素溶媒「ヘキサン」とともに入れる。この溶媒は、望ましくない脂質、植物ワックス及び着色物質の一部を除去するその能力のために選ばれた。また、バコサイドは、完全にヘキサンに不溶性であり、植物材料中にそのまま残される。バコパ・モニエラハーブの完全な脱脂を達成するために、４〜８時間にわたって何回かの浸出（percolation）が行われる。抽出の完了後、溶媒の回収のためにハーブ抽出物が除去され、そして、７０〜７５℃の熱水を薬物容器ジャケットに通すことによって、バコパ・モニエラ層が乾燥される。次に、同じハーブの層を弱い極性溶媒「アセトン」によって４〜８時間、抽出する。バコサイドが不溶性であるアセトンによるハーブの２回目の抽出は、残留する望ましくない成分及び着色物質をハーブから最大限に除去するために実施される。抽出後、アセトン抽出物は、溶媒の回収のために除去され、上記の手順に従ってハーブの層が乾燥される。上記層は次に、バコサイド及び他の微量成分を溶解する極性の高い溶媒「メタノール」を使用してさらに４〜８時間抽出される。そして、メタノール抽出物をソックスレー装置から取り出し、４５〜５５℃のロータリー真空エバポレーター中で最初の体積の２０分の１に真空濃縮される。バコサイドを含む濃縮された抽出物を、１〜４部のアセトンを含む容器に攪拌しながらゆっくりと添加し、バコサイドA及びBを他のアセトン不溶性物質とともに沈殿させた。スラリーをNutsche型真空ろ過装置を通してろ過し、溶媒を除去する。沈殿物を次に２〜１０部の水に溶解する。この溶液を、極性が高く、水と混和しない溶媒で抽出し、バコサイドを溶媒相へ移す。我々は、ｎ−ブタノールをこのステップのための溶媒として選んだ。それは、ｎ−ブタノールがバコサイドに対する高い選択性の要求を満たし、且つ水と混和しないためである。ブタノール抽出物は、５０〜５５℃のロータリー真空エバポレーター中、高度な真空下で濃縮される。効果的に乾燥された物質は、容器中の２〜１０部の水に攪拌しながら溶解され、β‐シクロデキストリン（１〜５％）が安定化剤として添加される。マンニトール、マルトデキストリン、ポリビニルアルコールのような他の安定化剤もまた、この目的に適している。攪拌を１〜２時間続ける。次に、溶液をスプレーノズルと生成物を集めるためのサイクロン装置を備えた乾熱スプレー乾燥機に入れる。空気及び溶液の流速並びに熱空気の温度は慎重に制御され、バコサイド混合物を薄黄色の、自由流動性のそして非吸湿性の粉末として得る。最終生成物中のバコサイドのパーセンテージは、Guptaらにより報告されたHPTLC法によって推定される（A P Gupta, S Mathur, M M Gupta & Sushil Kumar, Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 20: 1052-1055, 1998）。本発明の方法によれば、２０〜３０％のバコサイドＡ及びＢを含む生成物が得られる。バコパ・モニエラ乾燥重量に基づく生成物収率は、１．５〜２．５％の範囲である。バコパ・モニエラのこの標準化された抽出物は、かなり安定であり、栄養補助食品中へ製剤されるのに適している。
【００３１】
本発明の方法は、以下の実施例によって例解されるが、これらは本発明の範囲を限定するものと解するべきでない。以下の実施例はまた、本発明の具体的実施態様を例解する。
【実施例】
【００３２】
実施例１
CIMAP農場で栽培された１．０ｋｇのバコパ・モニエラハーブを暗所、３０℃において２４時間、そして、４２℃のトレイ型乾熱オーブン中で８時間乾燥した。オーブンの穿孔処理されたトレイ上に、ハーブを３インチの層で均一に広げた。乾燥後、ハーブサンプルの水分含量をチェックし、４．５％と評価した。乾燥ハーブを離解機中で粉末化し、粗い粉末を３０メッシュサイズのふるいを通した。サイズの大きすぎる物質を離解機中に戻した。４００グラムの粉末乾燥ハーブを、改変されたガラスソックスレー装置の薬物容器中に入れた。２．５リッターのヘキサンを再沸フラスコ中にとり、水浴上で加熱して溶媒を沸騰させ、溶媒のハーブ層中での循環を開始した。ソックスレー装置をこのようにして持続的に５時間作動させ、ハーブ材料を脱脂した。ヘキサン抽出物を溶媒の回収のために取り出した。７０〜７５℃の熱水をソックスレー装置の改変された薬物容器ジャケットを通して、残りの溶媒を蒸発させることによってハーブ層を乾燥させた。次に、２．５リッターのアセトン溶媒を再沸フラスコにとり、水浴上で加熱して、溶媒のハーブ層中での循環を開始した。ソックスレー装置を５時間作動させて、望ましくない成分及び着色物質をハーブから除去した。溶媒の回収のために、アセトン抽出物を再沸フラスコから取り出し、ハーブ層を上記と同じ方法で乾燥させた。乾燥後、２．５リッターのメタノール溶媒によってハーブ層の３回目の抽出を行った。ソックスレー装置を６時間作動させて、完全にバコサイドを溶解させた。そして、メタノール抽出物をソックスレー装置から取り出し、ロータリー真空エバポレーターに移して、溶媒を回収した。抽出物を約１００ｍｌの最終体積まで濃縮した。バコサイドを含む濃縮された抽出物を、４００ｍｌのアセトンを入れた容器に攪拌しながらゆっくりと加えて、バコサイドを他のアセトン不溶性物質とともに沈殿させた。Nutsche型真空ろ過装置中でスラリーをろ過し、溶媒を除去した。次に、沈殿を５０ｍｌの水に溶解した。そして、この溶液を５×１５ｍｌのｎ−ブタノールで抽出して、バコサイドを溶媒相へ移した。２つの相を分離し、ブタノール抽出物をロータリー真空エバポレーターへ移し、５０〜５５℃の温度において高度の真空下で濃縮した。バコサイドを含む、効果的に乾燥された物質（９．８０グラム）を１００ｍｌの水に容器中で攪拌しながら溶解し、０．２グラムのβ‐シクロデキストリンを安定化剤として溶液に添加した。攪拌をさらに１．５時間続けた。次に、溶液をスプレーノズル及び生成物を集めるためのサイクロン装置を備えた乾熱スプレー乾燥機に入れた。サイクロン装置における熱空気の温度は、１００〜１１０℃に維持した。最終生成物（７．８０グラム）を、薄黄色の自由流動性且つ非吸湿性の粉末として回収した。生成物中のバコサイドAのパーセンテージは、HPTLC法によって推定した。５．０ｍｇのサンプルを２ｍｌのメタノールに溶解した。バコサイドA標準品とともにサンプルをTLCプレート（６０F254、シリカゲル、Merck）に適用し、酢酸エチル：メタノール：蒸留水（６０：１４：１０）で流した。プレートを８ｃｍの高さまで展開し、プレートをバニリン‐硫酸試薬（バニリン：硫酸：酢酸エチル‐１ｇ：５ｍｌ：５ｍｌ）に浸漬し、次いでプレートを１１０℃で１５分間加熱することによってスポットを可視化した。青色のバコサイドAスポットを二重波長吸収‐反射モードを使用し、バックグラウンドを差し引いて、１×２の光スリットを使用して（高さ０．４ｍｍ×幅１．２ｍｍ：Shimadzu CS930デンシトメーター使用）、６２０nm及び４３０nmにおいてスキャンした。可変量のバコサイドAを使用してプロットした較正曲線を、サンプル中のバコサイドA含量％を推定するために使用した。本発明のこの方法によって、２８％のバコサイドAを含む生成物が得られた。バコパ・モニエラ乾燥重量に基づく生成物の回収率は、１．９５％であった。
【００３３】
実施例２
同じ方法を、３５Kgの乾燥バコパ・モニエラハーブを用いるパイロットプラント規模で実施したが、ステンレススチールパイロットプラント装置を使用した。CIMAP農場で栽培された１５０Kgのバコパ・モニエラハーブを暗所、３２℃で２４時間乾燥させ、さらに乾熱トレイ型オーブン中、４０〜４２℃で８時間乾燥させて、最終水分含量４％とした。乾燥ハーブ材料を離解機中で粉にひいて、約３０メッシュサイズとした。３５Kgの乾燥ハーブ材料をステンレススチールのソックスレープラントの薬物容器中に負荷した。２００リッターのヘキサン溶媒をポンプを用いて薬物容器中に入れ、完全にハーブ材料を浸漬した。２．０時間の接触時間の後、抽出物を再沸ケトル（抽出物の体積：１６５リッター）に流し込んだ。１０psigのライン圧の蒸気を再沸ケトルのジャケット中に通し、ヘキサンを蒸留し、これを薬物容器中へ、ハーブ層よりも２インチ上のレベルとなるまで再びスプレーした。２回目の洗浄のためには、２．０時間の接触時間とした。３回目および４回目の洗浄を上記と同じ方法で行った。ヘキサンを蒸留によって抽出物から回収し、濃く着色した残渣は除いた。ハーブに付着した残った溶媒は、薬物容器ジャケット中の７５℃の循環熱水によって回収した。ハーブ層を乾燥後、２７℃の２００リッターのアセトンを薬物容器にポンプを使用して入れ、乾燥した脱脂ハーブを完全に浸漬した。ハーブを２．０時間の接触時間で４回洗浄して、望ましくない成分および着色物質を除去した。アセトン抽出物を蒸留して溶媒を回収した。ハーブ層を上記と同じ方法で乾燥させた。乾燥後、２００リッターのメタノールをポンプを使用して薬物容器中に入れた。ハーブを２．０時間の接触時間で４回洗浄して、バコサイドを溶解させた。ソックスレー装置の再沸ケトル中でメタノール抽出物を２分の１の体積に濃縮した。さらなる処理のために、濃縮物をステンレスチールの攪拌薄膜蒸留装置（WFE）へ移した。系を２７５ミリバールの真空下に保持した。テフロン（登録商標）ワイパーの回転速度を２９０rpmに設定し、６０℃の熱水をエバポレータージャケット内で循環させた。WFE処理から、１０．５リッターの濃縮抽出物が得られた。抽出物をその後、ゆっくりと４５リッターのアセトンを入れた機械的攪拌機のステンレススチール容器に移した。溶液の攪拌を１時間続けた。そして、内容物を密閉したステンレススチール真空ろ過装置に移してアセトン溶媒を除去した。ろ過ケーキを取り除き、８リッターの水に溶解した。その後、溶液を往復攪拌機を備えた「KARR」液液抽出カラムに移した。水溶液を向流モードの液液抽出カラム中で１０リッターのn−ブタノールと接触させ、バコサイドをブタノール相に移した。そして、５〜１０トルの高度の真空下、温度４５〜５０℃において抽出物を濃縮するために、ブタノール相をステンレススチールの攪拌薄膜蒸留装置にポンプを使用して入れた。バコサイドを含む濃縮された物質（１．００ｋｇ）を、ステンレススチール容器中で４．０リッターの水に攪拌しながら溶解し、安定化剤として１８グラムのβ‐シクロデキストリンを添加し、１．５時間攪拌した。次に、溶液を、スプレーノズルと生成物を集めるためのサイクロン装置を備えた乾熱スプレー乾燥機に入れた。サイクロンにおける熱い空気の温度は、１００〜１１０℃に維持した。バコサイドを含む生成物（７１０グラム）を薄黄色の自由流動性且つ非吸湿性の粉末として得た。乾燥ハーブに基づく回収率は２．０２％であった。生成物中のバコサイド含量は、HPTLC法により推定し、実施例１に例解された分析方法によれば、生成物中のバコサイドAのパーセンテージは２６％であった。
【００３４】
発明の新規性
１． ベンゼン及び鉛塩のような有毒且つ潜在的に発がん性の化学物質を必要とする従来技術による方法とは異なり、改善された方法は、ヘキサン、アセトン及びメタノールなどの比較的無毒性の溶媒を使用することによって、バコパ・モニエラからバコサイドが濃縮された抽出物を製造することを達成する。
２． 改善された方法においては、ハーブの脱脂はベンゼンの代わりにヘキサンを使用することによって実施される。ヘキサンは、より低い沸点及び１８％低い蒸発潜熱によって、方法にかかる加熱の費用をより低くし、そしてより重要なことは、ヘキサンの場合、残留溶媒のレベルが低くなる。
３． 改善された方法は、薬物容器に熱水ジャケットを備えた改変されたソックスレー抽出機を使用する。この変更は、第二の溶媒による抽出の開始前に、ハーブ層から残留する第一の溶媒を除去するために有用であり、したがって、同じ抽出系において複数の溶媒による抽出を可能とする。従来技術のいずれも、それらにおいて使用される抽出装置及び技術についての情報を提供していない。
４． バコサイドを含有するバコパ・モニエラから得られた抽出物が非常に吸湿性であり、乾燥することが非常に困難で、さらなる製剤化をきわめて困難且つ不正確なものとすることが観察されてきた。V Elangovanらにより報告された従来技術の方法は、彼らの実験的試験において使用するために、バコパ・モニエラの乾燥に凍結乾燥を使用した。乾燥技術としての凍結乾燥は、時間がかかり、非常に低い温度と１０-3〜１０-4ミリバールの高度の真空を作り出すことを必要とし、それは、非常に費用のかかる装置と非常にエネルギーを必要とする操作によって達成されなければならなかった。本発明の改善された方法は、最終生成物を非吸湿性で均一な粒子サイズの自由流動性粉末として得るための、より迅速で低コストの代替法として、安定化された抽出物のスプレー乾燥法を使用する。
５． 改善された方法におけるバコサイドを含有する抽出物の安定化は、医薬製剤中の賦形剤として十分に受け入れられている、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン、ポリビニルアルコールなどの無毒性の安定化剤の賢明な使用（１〜５％のレベル）によって達成される。バコパ・モニエラのバコサイド含有抽出物の安定化は、これまで報告されていない。
６． 従来技術による方法は、いやな苦い味を有する抽出物を生じた。それは、濃い緑色をしていた。バコパ・モニエラ抽出物は栄養補助食品及び健康食品を製剤するために使用されるため、抽出物が美味で色が薄いことは、味がよく外観の美しい最終製剤を達成するために最も重要なことである。本発明の方法は、選択的な溶媒を使用することによって、苦い味の成分を除去することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハーブであるバコパ・モニエラの抽出物からバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で調製するための改善された方法であって、以下のステップ：
（ｉ）新たに収穫されたバコパ・モニエラハーブを３７〜４２℃の温度範囲のオーブン中で４〜６時間、乾燥させ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の乾燥ハーブを離解機中で粉にひき、そしてふるいにかけて、粉にひいたハーブ抽出物を得て；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の粉にひいたハーブを、改変ソックスレー装置中でヘキサンで抽出してヘキサン抽出物を得て；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたヘキサン抽出物をソックスレー装置から取り出し、該ハーブを循環熱水で乾燥させ；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の乾燥ハーブを、４〜８時間、アセトンで抽出して、望ましくない色及び非バコサイド成分を含むアセトン抽出物を得て；
（ｖｉ）ステップ（ｖ）のアセトン抽出されたハーブを、メタノールで抽出して、バコサイドを含むメタノール抽出物を得て；
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）のメタノール抽出物を減圧濃縮して；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の濃縮メタノール抽出物を、攪拌しながらアセトンに徐々に添加して、粗製バコサイドを優先的に沈殿させ；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の粗製バコサイドを、Nutsche型真空ろ過装置中でろ過し、粗製バコサイド残渣を得て；
（ｘ）ステップ（ｉｘ）の粗製バコサイド残渣を水で溶解し、水溶液を得て；
（ｘｉ）ステップ（ｘ）の水溶液をｎ−ブタノールで抽出してｎ−ブタノール抽出物を得て；
（ｘｉｉ）ステップ（ｘｉ）のｎ−ブタノール抽出物をロータリー真空エバポレーター中、高度の真空下で濃縮して、バコサイドが濃縮された乾燥残渣を得て；
（ｘｉｉｉ）ステップ（ｘｉｉ）の乾燥残渣を、攪拌しながら、２〜１０部の水に溶解し、１〜５重量％の無毒性安定化剤を添加し、安定なバコサイド溶液を得て；そして、
（ｘｉｖ）ステップ（ｘｉｉｉ）の安定なバコサイド溶液を、９０〜１１０℃の温度でスプレー乾燥し、自由流動性の安定且つ非吸湿性粉末の形態のバコサイドを得ること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）において、上記粉にひかれたハーブの粒子サイズが、３０〜４０メッシュの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉｉ）において、上記乾燥バコパ・モニエラハーブが、薬物容器に熱水ジャケットが取り付けられた改変ソックスレー抽出機中で抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉｉ）において、上記粉にひかれたハーブを脱脂するために、該ハーブがヘキサンで抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｖ）において、上記ハーブが、上記ジャケット中を循環する、７０〜７５℃の温度範囲の熱水によって乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｖｉｉ）において、バコサイドを含有する上記抽出物が、そのもとの体積の２０分の１に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記抽出物が、高度の真空下、４５〜５５℃の温度範囲において、攪拌薄膜蒸留装置を使用して濃縮される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｖｉｉｉ）において、粗製バコサイドが、過剰量のアセトンとともに攪拌することによって、濃縮メタノール抽出物から沈殿させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記メタノール抽出物とアセトンの重量／重量比が、１：４〜１：１０の範囲にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｘｉ）において、バコサイドの濃度を濃縮し、それによってより高い生成物純度を得るための選択的溶媒として、ｎ−ブタノールが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｘｉ）において、往復攪拌機を備えた向流「ＫＡＲＲ」液液抽出カラムを使用して、上記バコパ・モニエラ抽出物が有効に精製されることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｘｉｉｉ）において、使用される無毒性の安定化剤が、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン及びポリビニルアルコールから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
バコパ・モニエラの乾燥重量に対するバコサイドの回収率が、１．５〜２．５％の間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
得られた上記粉末が、２０〜３０％のバコサイドＡ及びＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記粉末中のバコサイドの上記パーセンテージが、ＨＰＴＬＣ分析によって推定される、請求項１４に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハーブであるバコパ・モニエラの抽出物からバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で調製するための改善された方法であって、以下のステップ：
（ｉ）新たに収穫されたバコパ・モニエラハーブを３７〜４２℃の温度範囲のオーブン中で４〜６時間、乾燥させ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の乾燥ハーブを離解機中で粉にひき、そしてふるいにかけて、粉にひいたハーブを得て；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の粉にひいたハーブを、改変ソックスレー装置中でヘキサンで抽出してヘキサン抽出物を得て；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたヘキサン抽出物をソックスレー装置から取り出し、該ハーブを循環熱水で乾燥させ；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の乾燥ハーブを、４〜８時間、アセトンで抽出して、望ましくない色及び非バコサイド成分を含むアセトン抽出物を得て；
（ｖｉ）ステップ（ｖ）のアセトン抽出されたハーブを、メタノールで抽出して、バコサイドを含むメタノール抽出物を得て；
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）のメタノール抽出物を減圧濃縮して；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の濃縮メタノール抽出物を、攪拌しながらアセトンに徐々に添加して、粗製バコサイドを優先的に沈殿させ；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の粗製バコサイドを、Nutsche型真空ろ過装置中でろ過し、粗製バコサイド残渣を得て；
（ｘ）ステップ（ｉｘ）の粗製バコサイド残渣を水で溶解し、水溶液を得て；
（ｘｉ）ステップ（ｘ）の水溶液をｎ−ブタノールで抽出してｎ−ブタノール抽出物を得て；
（ｘｉｉ）ステップ（ｘｉ）のｎ−ブタノール抽出物をロータリー真空エバポレーター中、高度の真空下で濃縮して、バコサイドが濃縮された乾燥残渣を得て；
（ｘｉｉｉ）ステップ（ｘｉｉ）の乾燥残渣を、攪拌しながら、２〜１０部の水に溶解し、１〜５重量％の無毒性安定化剤を添加し、安定なバコサイド溶液を得て；そして、
（ｘｉｖ）ステップ（ｘｉｉｉ）の安定なバコサイド溶液を、９０〜１１０℃の温度でスプレー乾燥し、自由流動性の安定且つ非吸湿性粉末の形態のバコサイドを得ること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）において、上記粉にひかれたハーブの粒子サイズが、３０〜４０メッシュの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉｉ）において、上記乾燥バコパ・モニエラハーブが、薬物容器に熱水ジャケットが取り付けられた改変ソックスレー抽出機中で抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉｉ）において、上記粉にひかれたハーブを脱脂するために、該ハーブがヘキサンで抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｖ）において、上記ハーブが、上記ジャケット中を循環する、７０〜７５℃の温度範囲の熱水によって乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｖｉｉ）において、バコサイドを含有する上記抽出物が、そのもとの体積の２０分の１に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記抽出物が、高度の真空下、４５〜５５℃の温度範囲において、攪拌薄膜蒸留装置を使用して濃縮される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｖｉｉｉ）において、粗製バコサイドが、過剰量のアセトンとともに攪拌することによって、濃縮メタノール抽出物から沈殿させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記メタノール抽出物とアセトンの重量／重量比が、１：４〜１：１０の範囲にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｘｉ）において、バコサイドの濃度を濃縮し、それによってより高い生成物純度を得るための選択的溶媒として、ｎ−ブタノールが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｘｉ）において、往復攪拌機を備えた向流「ＫＡＲＲ」液液抽出カラムを使用して、上記バコパ・モニエラ抽出物が有効に精製されることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｘｉｉｉ）において、使用される無毒性の安定化剤が、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン及びポリビニルアルコールから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
バコパ・モニエラの乾燥重量に対するバコサイドの回収率が、１．５〜２．５％の間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
得られた上記粉末が、２０〜３０％のバコサイドＡ及びＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記粉末中のバコサイドの上記パーセンテージが、ＨＰＴＬＣ分析によって推定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
ハーブであるバコパ・モニエラの抽出物からバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で調製するための改善された方法であって、以下のステップ：
（ｉ）新たに収穫されたバコパ・モニエラハーブを３７〜４２℃の温度範囲のオーブン中で４〜６時間、乾燥させ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の乾燥ハーブを離解機中で粉にひき、そしてふるいにかけて、粉にひいたハーブ抽出物を得て；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の粉にひいたハーブを、改変ソックスレー装置中でヘキサンで抽出してヘキサン抽出物を得て；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたヘキサン抽出物をソックスレー装置から取り出し、該ハーブを循環熱水で乾燥させ；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の乾燥ハーブを、４〜８時間、アセトンで抽出して、望ましくない色及び非バコサイド成分を含むアセトン抽出物を得て；
（ｖｉ）ステップ（ｖ）のアセトン抽出されたハーブを、メタノールで抽出して、バコサイドを含むメタノール抽出物を得て；
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）のメタノール抽出物を減圧濃縮して；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の濃縮メタノール抽出物を、攪拌しながらアセトンに徐々に添加して、粗製バコサイドを優先的に沈殿させ；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の粗製バコサイドを、Nutsche型真空ろ過装置中でろ過し、粗製バコサイド残渣を得て；
（ｘ）ステップ（ｉｘ）の粗製バコサイド残渣を水で溶解し、水溶液を得て；
（ｘｉ）ステップ（ｘ）の水溶液をｎ−ブタノールで抽出してｎ−ブタノール抽出物を得て；
（ｘｉｉ）ステップ（ｘｉ）のｎ−ブタノール抽出物をロータリー真空エバポレーター中、高度の真空下で濃縮して、バコサイドが濃縮された乾燥残渣を得て；
（ｘｉｉｉ）ステップ（ｘｉｉ）の乾燥残渣を、攪拌しながら、２〜１０部の水に溶解し、１〜５重量％の無毒性安定化剤を添加し、安定なバコサイド溶液を得て；そして、
（ｘｉｖ）ステップ（ｘｉｉｉ）の安定なバコサイド溶液を、９０〜１１０℃の温度でスプレー乾燥し、自由流動性の安定且つ非吸湿性粉末の形態のバコサイドを得ること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）において、上記粉にひかれたハーブの粒子サイズが、３０〜４０メッシュの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉｉ）において、上記乾燥バコパ・モニエラハーブが、薬物容器に熱水ジャケットが取り付けられた改変ソックスレー抽出機中で抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉｉ）において、上記粉にひかれたハーブを脱脂するために、該ハーブがヘキサンで抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｖ）において、上記ハーブが、上記ジャケット中を循環する、７０〜７５℃の温度範囲の熱水によって乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｖｉｉ）において、バコサイドを含有する上記抽出物が、そのもとの体積の２０分の１に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記抽出物が、高度の真空下、４５〜５５℃の温度範囲において、攪拌薄膜蒸留装置を使用して濃縮される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｖｉｉｉ）において、粗製バコサイドが、過剰量のアセトンとともに攪拌することによって、濃縮メタノール抽出物から沈殿させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記メタノール抽出物とアセトンの重量／重量比が、１：４〜１：１０の範囲にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｘｉ）において、バコサイドの濃度を濃縮し、それによってより高い生成物純度を得るための選択的溶媒として、ｎ−ブタノールが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｘｉ）において、往復攪拌機を備えた向流「ＫＡＲＲ」液液抽出カラムを使用して、上記バコパ・モニエラ抽出物が有効に精製されることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｘｉｉｉ）において、使用される無毒性の安定化剤が、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン及びポリビニルアルコールから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
バコパ・モニエラの乾燥重量に対するバコサイドの回収率が、１．５〜２．５％の間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
得られた上記粉末が、２０〜３０％のバコサイドＡ及びＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記粉末中のバコサイドの上記パーセンテージが、ＨＰＴＬＣ分析によって推定される、請求項１４に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハーブであるバコパ・モニエラの抽出物からバコサイドが濃縮された画分を非吸湿性の形態で調製するための改善された方法であって、以下のステップ：
（ｉ）新たに収穫されたバコパ・モニエラハーブを３７〜４２℃の温度範囲のオーブン中で４〜６時間、乾燥させ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の乾燥ハーブを離解機中で粉にひき、そしてふるいにかけて、粉にひいたハーブを得て；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の粉にひいたハーブを、改変ソックスレー装置中でヘキサンで抽出してヘキサン抽出物を得て；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で形成されたヘキサン抽出物をソックスレー装置から取り出し、該ハーブを循環熱水で乾燥させ；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の乾燥ハーブを、４〜８時間、アセトンで抽出して、望ましくない色及び非バコサイド成分を含むアセトン抽出物を得て；
（ｖｉ）ステップ（ｖ）のアセトン抽出されたハーブを、メタノールで抽出して、バコサイドを含むメタノール抽出物を得て；
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）のメタノール抽出物を減圧濃縮して；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の濃縮メタノール抽出物を、攪拌しながらアセトンに徐々に添加して、粗製バコサイドを優先的に沈殿させ；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の粗製バコサイドを、Nutsche型真空ろ過装置中でろ過し、粗製バコサイド残渣を得て；
（ｘ）ステップ（ｉｘ）の粗製バコサイド残渣を水で溶解し、水溶液を得て；
（ｘｉ）ステップ（ｘ）の水溶液をｎ−ブタノールで抽出してｎ−ブタノール抽出物を得て；
（ｘｉｉ）ステップ（ｘｉ）のｎ−ブタノール抽出物をロータリー真空エバポレーター中、高度の真空下で濃縮して、バコサイドが濃縮された乾燥残渣を得て；
（ｘｉｉｉ）ステップ（ｘｉｉ）の乾燥残渣を、攪拌しながら、２〜１０部の水に溶解し、１〜５重量％の無毒性安定化剤を添加し、安定なバコサイド溶液を得て；そして、
（ｘｉｖ）ステップ（ｘｉｉｉ）の安定なバコサイド溶液を、９０〜１１０℃の温度でスプレー乾燥し、自由流動性の安定且つ非吸湿性粉末の形態のバコサイドを得ること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）において、上記粉にひかれたハーブの粒子サイズが、３０〜４０メッシュの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉｉ）において、上記乾燥バコパ・モニエラハーブが、薬物容器に熱水ジャケットが取り付けられた改変ソックスレー抽出機中で抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉｉ）において、上記粉にひかれたハーブを脱脂するために、該ハーブがヘキサンで抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｖ）において、上記ハーブが、上記ジャケット中を循環する、７０〜７５℃の温度範囲の熱水によって乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｖｉｉ）において、バコサイドを含有する上記抽出物が、そのもとの体積の２０分の１に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記抽出物が、高度の真空下、４５〜５５℃の温度範囲において、攪拌薄膜蒸留装置を使用して濃縮される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｖｉｉｉ）において、粗製バコサイドが、過剰量のアセトンとともに攪拌することによって、濃縮メタノール抽出物から沈殿させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記メタノール抽出物とアセトンの重量／重量比が、１：４〜１：１０の範囲にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｘｉ）において、バコサイドの濃度を濃縮し、それによってより高い生成物純度を得るための選択的溶媒として、ｎ−ブタノールが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｘｉ）において、往復攪拌機を備えた向流「ＫＡＲＲ」液液抽出カラムを使用して、上記バコパ・モニエラ抽出物が有効に精製されることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｘｉｉｉ）において、使用される無毒性の安定化剤が、マンニトール、マルトデキストリン、β‐シクロデキストリン及びポリビニルアルコールから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
バコパ・モニエラの乾燥重量に対するバコサイドの回収率が、１．５〜２．５％の間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
得られた上記粉末が、２０〜３０％のバコサイドＡ及びＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記粉末中のバコサイドの上記パーセンテージが、ＨＰＴＬＣ分析によって推定される、請求項１４に記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５１４０２２（Ｐ２００６−５１４０２２Ａ）
【公表日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５９９４９（Ｐ２００４−５５９９４９）
【出願日】平成１４年１２月１８日（２００２．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００２／００５４５２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５４５９９
【国際公開日】平成１６年７月１日（２００４．７．１）
【出願人】（５９５０５９８７２）カウンシル オブ サイエンティフィク アンド インダストリアル リサーチ (81)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年１２月１８日（２００２．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００２／００５４５２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５４５９９
【国際公開日】平成１６年７月１日（２００４．７．１）
【出願人】（５９５０５９８７２）カウンシル オブ サイエンティフィク アンド インダストリアル リサーチ (81)
【Ｆターム（参考）】
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