安定剤としての組換え又は合成ゼラチン様タンパク質の、凍結乾燥医薬組成物中の使用
本発明は、ガラス転移温度計算値が増大しているゼラチン様タンパク質若しくはポリペプチドの、凍結乾燥された生体材料組成物又は医薬組成物中の安定剤としての使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチン様タンパク質又はゼラチン様ポリペプチドの、凍結乾燥生体材料組成物又は医薬組成物中の安定剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
十分に定着しているゼラチンの適用例は、凍結乾燥された生体材料組成物又は医薬組成物中の生理活性物質のための安定剤としての使用である。生理活性物質の凍結乾燥又はフリーズドライは、一般に安定剤及び二糖類の存在下で行われる。凍結乾燥用の組成及び方法は、D. GreiffのDevelopments in Biological Standardization (1992), 7 Biol. Prod. Freeze Drying Formulation), 85-92に記載されているように、異なる種類の生理活性物質について経験的に決定される。凍結乾燥組成物の安定性は、生理活性物質の性質、凍結乾燥組成物の水分含有量及びガラス転移温度（Ｔｇ）のようないくつかの要因に応じて決まる。ワクチンは、凍結乾燥組成物として貯蔵される薬剤化合物の例である。
【０００３】
ワクチンは、特に開発途上国で使用されており、そうした国々では、時にワクチンの厳しい貯蔵条件を維持するのが困難となり得る。凍結乾燥ワクチンの安定性は、主要な関心事であり、世界保健機構は、このような組成物の貯蔵に関する厳しい規則を出している。
【０００４】
生理活性物質は、例えば、ワクチン、（治療用）タンパク質、酵素、（モノクローナル）抗体などである。ゼラチンは、免疫原性が低いことがわかっているので好ましい安定剤である。ゼラチン溶液を無菌にし、発熱物質及び抗原を含まないように注意を払うべきである。
【０００５】
現在使用されているゼラチンの欠点は、現在使用されているゼラチン誘導体を適用した後に起こり得る、アナフィラキシーショックとして知られている即時型アレルギー反応を起こす可能性である。
【０００６】
市販のゼラチン誘導体のもう一つの欠点は、使用されるゼラチンが、動物の骨や皮などの動物性供給源から単離されたものであり、特にウシ供給源由来であることである。この材料の欠点は、不純物が存在すること、並びに組成物の性質がはっきと規定されず、したがって再現可能でないことである。このために、誘導体化の過程から所望の特性を有する製品が確実に得られるようにすべく、追加のスクリーニングを行わなければならないこともあり、慎重な精製ステップが必要となることもある。昨今の追加の問題は、特にウシ供給源から単離したゼラチンに関して、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）発生の原因となる要因によってゼラチンが汚染されている危険である。そのため、医薬組成物中へのゼラチンの使用は禁止されかねない。
【０００７】
ＷＯ０１／３４８０１ Ａ２は、天然ゼラチンの使用に伴う明らかな問題を回避するための、組換えゼラチンのワクチン安定剤としての使用を一般に記載している。しかし、特別に設計された組換え構造によって実現することのできる更なる利点については記載がない。
【０００８】
欧州特許第０７８１７７９ Ａ２号は、コラゲナーゼによって特異的に加水分解して非抗原性にした２０キロダルトン（ｋＤａ）以下のゼラチンの使用を記載している。米国特許第４１４７７７２号は、約３ｋＤａの加水分解ゼラチンの、抗原性が少ない非ゲル化基材としての使用を開示している。
【０００９】
米国特許第４２７３７６２号は、部分的に加水分解されているゼラチンを安定剤として含むワクチンの凍結乾燥時間を短縮する試みを記載している。
【特許文献１】ＷＯ０１／３４８０１ Ａ２
【特許文献２】欧州特許第０７８１７７９ Ａ２号
【特許文献３】米国特許第４１４７７７２号
【特許文献４】米国特許第４２７３７６２号
【非特許文献１】D. GreiffのDevelopments in Biological Standardization (1992), 7 Biol. Prod. Freeze Drying Formulation), 85-92
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、生理活性物質を含む凍結乾燥組成物用の改良された安定剤を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、改良された安定剤を含んだ安定性が改良されている凍結乾燥組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、生理活性物質を含む組成物の凍結乾燥時間を改良した安定剤を用いて短縮することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、これらの目的は、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、アミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在し、かつFood Hydrocolloids Vol. 11 no.2 pp. 125-133, 1997で発表されているMatveevの式８及び式９によって算出されるガラス転移温度計算値が約１８０℃よりも高い組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドを安定剤として使用することで達成されたことがわかった。これらの特性を備えたペプチドを、以下では、その生産方法（すなわち、組換え発現によるか化学合成によるか）に応じて、「組換え」若しくは「合成」コラーゲン様ペプチド（若しくはポリペプチド）又は「組換え」若しくは「合成」ゼラチン様ペプチド（若しくはポリペプチド）と呼ぶ。
【００１４】
本発明の組換えポリペプチドがらせん構造でないとき、凍結乾燥方法を有意に最適化できることもわかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明によれば、ガラス転移温度計算値が約１８０℃よりも高く、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、かつアミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在している組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドを安定剤として含む凍結乾燥組成物が提供される。
【００１６】
この組成物のガラス転移温度測定値も、天然型コラーゲンペプチドを含む対照組成物のガラス転移温度測定値より有意に高く、好ましくは少なくとも約５℃、より好ましくは少なくとも約１０℃、最も好ましくは約２０℃高いはずである。「天然型コラーゲン」とは、本明細書では、選択又は合成によってガラス転移温度が高くなっていないコラーゲンペプチド又はコラーゲンポリペプチドを指す。一般に、天然型コラーゲンペプチドは、Ｔｇ計算値が約１７０℃以下である。
【００１７】
ゼラチン様ペプチドと１種又は複数の他の化合物とから構成された混合物のＴｇを測定するとき、その組成物のＴｇ測定値は、実質的に純粋なゼラチン様ペプチドのＴｇ測定値と有意に異なる場合もあることを留意されたい。例えば、ゼラチン様ペプチドとスクロースとを含む組成物のＴｇ測定値は、純粋なゼラチン様ペプチドのＴｇ測定値よりも有意に低くてよい。
【００１８】
血流中に導入される医薬製剤は、例えば、安定剤、薬物担体、又は浸透性コロイドとしてのタンパク質を含有する。ゼラチンが、免疫原性が低いために好ましいことは当業界で認められて久しい。天然供給源由来のゼラチンを組換えゼラチンに替えると、ゼラチンでない材料の導入が有利に回避できることも当業界で認められている。最近では、ＢＳＥが心配の種になっており、自然供給源由来のゼラチンの使用を避ける動機にもなっている。
【００１９】
組換えゼラチンの使用について言うまでもない理屈が記載され、組換え構造を最適化できることが示されているが、その最適化が何を含むかについては教示されていない。
【００２０】
コラーゲンの性質についての研究の中で、驚いたことに、コラーゲンは、繰返しのアミノ酸トリプレット構造Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａを有し、大半のトリプレットはプロリンを含んでいるが、ガラス転移温度（又はＴｇ）が分子全体に一様に分配されておらず、Ｔｇが平均的な（天然型）コラーゲンよりも高い配列を選択できることを発見した。
【００２１】
ガラス転移温度の重要性は、ワクチンのような生理活性物質を含有する製剤のフリーズドライ又は凍結乾燥を行う当業者に十分に知られている。凍結乾燥された製剤では、高いガラス転移温度を目指して努力が払われる。「Long-Term Stabilization of Biologicals」(Biotechnoloy vol.12 12 march 1994)の中で、F. Franksは、凍結乾燥による生体材料の保存における高いガラス転移温度の重要性、並びにそのような材料の保存期間をさらに改善したいという要望に焦点を当てている。凍結乾燥用の製剤中で、ゼラチンは、生理活性物質を保護する働きをしており、そのためアミノ酸残基の極性基に結合した水分子の存在が重要なものであると考えられる。残留水分は、ワクチンの保存期間において重要な役割を担う。残留水分レベルが増大すると、凍結乾燥ゼラチン／二糖類組成物のガラス転移温度は有意に低下し、保存期間が短縮される。
【００２２】
例えば、Phillipsらのcryobiology 18, 414-419 (1981)又は米国特許第８０１８５６号など、この題目についての発表は数多い。ＭＭＲ（おたふく風邪、麻疹、風疹）のようなワクチンは、現在の製剤では、限界Ｔｇが無水条件下で４７℃付近にあるが、少量の水分が材料に浸入すると急速に低下して室温に近づく。M.K. LalaのIndian Pediatrics 2003; 40:311-319では、３７℃で１週間以内に５０％の効力の損失が報告されている。わずかな程度でさえ、Ｔｇを増大させると、これらのワクチンの保存期間に非常に大きな影響を及ぼすことができる。ゼラチンによって安定化させた生理活性製剤の安定性が低下してしまう問題が、望ましくない免疫応答の発生を防ぐために、高められたＴｇと自然のヒトのゼラチンアミノ酸配列と一定の類似性とを併せ持つ、新しい組換えゼラチン又は合成ゼラチンの使用に基づく本発明によって解決された。
【００２３】
本発明による組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドは、天然型ヒトコラーゲン配列と同一又は相同性が高い配列であることが好ましい。天然型の配列からそのようなアミノ酸配列を選択するために、「移動Ｔｇ平均」（以下で定義する）を算出する。次いで、平均ガラス転移温度計算値が、天然型出発配列の平均コラーゲンガラス転移温度計算値より約１０℃、好ましくは約２０℃、より好ましくは約３０℃、より一層好ましくは約４０℃高い配列を選択する。この値は、異なる種類のコラーゲン間で若干異なっていてよく、プロペプチド、テロペプチド、又はシグナルペプチドの存在に応じて様々でよい。天然型コラーゲンの平均ガラス転移温度計算値は、約１７０℃であるので、本発明によるポリペプチドのＴｇは、約１８０度より高く、好ましくは約１９０度より高く、より好ましくは約２００度より高い。「約」とは、本明細書では、指定の温度よりも１〜４度高い及び／又は低い範囲の温度を指す。
【００２４】
１０度未満のＴｇの増大も考慮に入れるが、二糖類が存在する実際の製剤での効果は、あまり有意でないレベルにまで低下する場合もある。
【００２５】
ガラス転移温度の算出法は、Y. MatveevらのFood Hydrocolloids Vol. 11 no. 2 pp. 125-133, 1997で発表されている。次の方程式８及び９
【００２６】
【数１】
［式中、総和ｉ＝１〜２０は、以下に示す単独のアミノ酸のＴｇ及びΔＶの部分値に対する値の総和である（Ｖは、Matveevら（前掲書）に記載のｖｄ Ｗａａｌｓ体積についての測度である）。］
を実際の算出に使用した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
このモデルは、ヒドロキシプロリンの存在を考慮に入れていないと思われる。しかし、Matveevらの論文に提示されている測定値との相関は、ゼラチンの計算値と測定値の非常に良好な相関を示すものである。
【００２９】
適切な組換えコラーゲン様ペプチド又は合成コラーゲン様ペプチドを選択するために、出発点は、例えば、全配列から算出したＴｇが１６３℃であるヒトＣｏｌ１Ａ１（配列番号１）とする。
【００３０】
配列番号１（ヒトＣｏｌ１Ａ１）：
【００３１】
このＣｏｌ１Ａ１配列はなお、シグナル配列（アミノ酸１〜２２）及びアミノ末端プロペプチド（アミノ酸２３〜１６１及び１２１９〜１４６４）を含む。らせんコラーゲン配列は、アミノ酸１６２〜アミノ酸１２１８に存在する。スプレッドシートを使用すれば、いくつかのアミノ酸の移動平均を容易に算出し表示することができるはずである。図１〜４は、それぞれ１８、２７、５４、及び８１アミノ酸の移動平均の結果を示すものである。例えばｎ＝５４の「移動Ｔｇ平均」とは、まず１番目から５４番目のアミノ酸の平均Ｔｇを算出し、次いで２番目から５５番目のアミノ酸、次いで３番目から５６番目のアミノ酸へと続けることを意味する。次いで、これらの値を、最初のデータポイントを５４番目のアミノ酸のところでプロットして、図３のようにプロットする。この天然型コラーゲンの平均Ｔｇ計算値（すなわち、完全配列の平均Ｔｇ計算値）よりも高いＴｇ計算値を有するアミノ酸領域がこの時点で同定できる。ポリペプチドが小さいほど、Ｔｇのより高い領域の選択が可能になることは注目すべきである。５４アミノ酸の移動平均の算出では、Ｔｇが最高で約２００℃まで増大しているポリペプチド配列の選択が可能になる。例えば、配列番号１のアミノ酸１０３４〜１０８７の配列は、２０８℃というＴｇ計算値をもたらす。すなわち、このポリペプチドは、Ｔｇ計算値が、全配列について算出して１６３℃である天然型配列のＴｇ計算値よりも４５℃高い。それとして発現させると、約５，０００ダルトンのゼラチン様ポリペプチドが得られる。配列番号１のアミノ酸６００〜アミノ酸１１００のあたりから、それでも平均Ｔｇが約１７８℃であり、分子量が約４０，０００〜５０，０００ダルトンである約５００アミノ酸の配列を選択することができる。配列番号１のアミノ酸５９０〜７５０のあたりからは、分子量が最高で約１０，０００〜１３，０００ダルトンの、平均Ｔｇが１８０℃より高いポリペプチドを選択することができる。上述のような所望の平均Ｔｇを有するポリペプチド領域は、Ｃｏｌ１Ａ−２、Ｃｏｌ２Ａ−１、Ｃｏｌ３Ａ−１などの他のコラーゲン配列からも容易に算出することができる。このようなコラーゲン配列は、当業界では容易に入手できる。
【００３２】
所望時に、これらの配列の繰返し配列を発現させて、より大きな分子量を実現することができる。約３，０００〜１５，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜１０，０００ダルトン、より好ましくは６，０００〜８，０００ダルトンの従来の加水分解ゼラチンを適用する。所望時には、本発明によって、実現できるＴｇに特別な強みを付与しながらより大きい分子量を実現することもできる。したがって、一実施形態では、ゼラチン様ポリペプチドは、３，０００〜１５，０００ダルトン、より好ましくは５，０００〜１０，０００ダルトン、より一層好ましくは６，０００〜８，０００ダルトンの好ましい分子量を有する。別の実施形態では、ゼラチン様ポリペプチドは、分子量が３，０００〜８０，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜６０，０００ダルトン、最も好ましくは１０，０００〜４０，０００ダルトンである。
【００３３】
ポリペプチド断片のＴｇとその構造上の細目との相関関係を明らかにすることを試みた。図５に示すように、アラニン含有量との若干の相関が見出された。５４アミノ酸の移動平均について、Ｔｇのより高い区域の多くは、それに一致してアラニンレベルが高まっているが、Ｔｇが平均よりも高いすべての領域には当てはまらない。それにもかかわらず、５４アミノ酸の移動平均では、５４アミノ酸のポリペプチドのアラニン含有量が１０アミノ酸あたり約１アラニンを超えているとき、Ｔｇがより高い領域が見出されるものと思われる。嵩高なアミノ酸残基の存在は、ポリペプチドのＴｇにマイナスの影響を及ぼし得る。５４アミノ酸の移動平均に関して、ロイシン及びイソロイシンの存在とＴｇとに相関が生じた（図６）。すべてではないがＴｇの高い多くの区域では、これらの嵩高なアミノ酸残基の濃度が低く、又はこれらが存在しない。この相関にバリンが伴うとより悪くなり、バリンが嵩高さにより少ないが影響を及ぼすことが示唆される。豊富に存在するプロリンの側鎖の大きさを考えると、バリンよりもロイシン及びイソロイシンの方が嵩高さの一因となることが想像できる。さらに、凍結乾燥生理活性物質を保護するのに十分な水分子を結合できるように、極性アミノ酸残基の量が５％超、より好ましくは７％超かつ１５％未満であることが望ましい。
【００３４】
本発明によるゼラチン様組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドは、自然のヒトコラーゲンアミノ酸配列と同一又は本質的に類似であることが好ましいが、非ヒト配列（ラット、ウサギ、マウスなどの）を使用してもよく、或いは自然界に存在しない配列を設計してもよい。用語「本質的に類似」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトパラメーターを使用するＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴの各プログラムなどによって最適に並べたとき、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、又はそれ以上（例えば、９９若しくは１００パーセントの配列同一性）を有することを意味する。ＧＡＰは、Needleman及びWunschのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、マッチ数を最重要視し、ギャップ数を最小限に抑えながら、２種の配列をその全長にわたって並べるものである。一般に、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰデフォルトパラメーターが使用される。
【００３５】
このような配列は、アラニン含有量が高く、１００アミノ酸あたり１０アラニン残基、好ましくは１００アミノ酸あたり１２、より好ましくは１００アミノ酸あたり１４を超えていることが好ましいはずである。そうした望ましい構造は、自然のゼラチンに匹敵する極性アミノ酸残基を含む。嵩高なアミノ酸が混ざることは避ける。
【００３６】
自然のゼラチン分子は、その一次アミノ酸配列中が、基本的にＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの繰返しからなり、したがって、アミノ酸総数の約３分の１はグリシンである。ゼラチンの分子量は通常は大きく、分子量の値は１０，０００〜３００，０００ダルトンまで様々である。自然のゼラチン分子の主画分は、分子量が約９０，０００ダルトンである。平均分子量は、９０，０００ダルトンよりも大きい。
【００３７】
また、ゼラチンに特徴的なのは、プロリン残基の含有量が並外れて高いことである。さらにまた特徴的であるのは、自然のゼラチンではいくつかのプロリン残基がヒドロキシル化されていることである。ヒドロキシル化の最も顕著な部位は４位であり、そのためゼラチン分子中に珍しいアミノ酸４−ヒドロキシプロリンが存在するようになる。トリプレット中では、４−ヒドロキシプロリンは常にＹａａの位置に見られる。３位がヒドロキシル化されているプロリン残基はごくわずかしかない。４−ヒドロキシプロリンとは対照的に、３−ヒドロキシプロリンは常にグリシン残基のカルボキシル側、すなわちトリプレット中のＸａａの位置に見られる。３−若しくは４−ヒドロキシプロリンの生成には、異なる酵素が担当する。
【００３８】
既知のアミノ酸組成に基づき、哺乳動物由来のゼラチン分子では、アミノ酸の約２２％がプロリン又はヒドロキシプロリン残基であることが推測される。しかし、魚、特に冷水魚ではそれよりも少ない含有量のプロリン及びヒドロキシプロリンが見出される。概算では、プロリン残基とヒドロキシプロリン残基はほぼ等しい量で存在し、例えば、哺乳動物由来のゼラチン分子ではアミノ酸の約１１％がプロリンであり、約１１％がヒドロキシプロリンである。ほぼすべてのヒドロキシプロリンがＹａａの位置に見られるので、ゼラチン分子中の全トリプレットの約３分の１をヒドロキシプロリンが占めていることが推測される。ヒドロキシプロリン残基の存在は、ゼラチン分子がその二次構造でらせん構造を取り得ることの要因である。
【００３９】
さらに、自然のゼラチン中に存在する、他のタンパク質中にはごくわずかしか見られない別のアミノ酸が５−ヒドロキシリシンである。このようにして修飾されたリシン残基は、常にトリプレット中のＹａａの位置に見られる。
【００４０】
ゼラチンの最も際立つ特徴は、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの存在である。このトリプレットは、本発明のゼラチン様タンパク質中にも存在する。しかし、たんぱく質のゼラチン様の特質をそれほど変更せずに、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット又はＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの配列が１個又は複数のアミノ酸によって隔てられているタンパク質を設計することが可能である。そのようなゼラチン様タンパク質は、本発明のゼラチン様タンパク質の定義に含まれる。
【００４１】
本発明による使用のためのゼラチン様タンパク質は、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６で開示されているような組換え法によって生産することができる。本発明による組成物中に適切に使用することのできるゼラチン様タンパク質の生産及び精製を可能にするために、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６の実施例が特に参考文献として挙げられる。すなわち、ゼラチン様タンパク質は、このようなポリペプチドをコードしている核酸配列を適切な微生物によって発現させて生産することができる。この方法は、真菌細胞又は酵母細胞を用いて適切に実施できる。宿主細胞は、ハンゼヌラ、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウム、アカパンカビ、ピチアのような高発現宿主細胞であることが適する。真菌細胞及び酵母細胞の方が、繰返し配列の誤った発現を経験しにくいので、細菌よりも好まれる。宿主細胞は、発現されたコラーゲン構造を攻撃するプロテアーゼが高レベルでないことが最も好ましい。この点で、ピチアは、非常に適切な発現系の例である。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６に記載されているように、詳細にはPichia pastorisが発現系として使用される。一実施形態では、微生物を形質転換して、プロピル−４−ヒドロキシラーゼを発現させるための遺伝子も含める。別の実施形態では、微生物は、特にプロリンのヒドロキシル化など、活性のある翻訳後プロセッシング機構を含まない。
【００４２】
宿主細胞及び発現させる配列についての知識と合わせ、宿主細胞を本発明による組成物に適する組換えゼラチン様タンパク質の発現に適するものにする本明細書に記載の必要なパラメーターを基本原理とする、既知の工業用酵素産生真菌宿主細胞、特に酵母細胞からの適切な宿主細胞の選択は、当業者ならばできるであろう。
【００４３】
本発明で使用するゼラチン様タンパク質の設計に関して、このタンパク質のいくつかの特性に対処している。例えば、ロイシンやイソロイシンのような嵩高なアミノ酸などの、平均Ｔｇを下げる特定のアミノ酸が確実にタンパク質中に存在せず、又はまれにしか存在しないようにすることができる。或いは、特にアラニン又は極性アミノ酸について上で論じたように、ゼラチン様タンパク質中に一定数の特定のアミノ酸を導入すると有利な場合もある。さらにまた、ゼラチン様タンパク質中の酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基の組成によって等電点（ＩＥＰ）を調整することもできる。
【００４４】
一実施形態では、本発明による組成物は、性質がホモ（同質）分散（homodisperse）であるゼラチン様タンパク質を含む。ホモ（同質）分散とは、組成及び分子量が一定であるものを意味する。組換え製造法のために起こり得る組成の変化は許容される。分子量に関して、ホモ（同質）分散であることの実際的な定義では、組成物中のゼラチン様タンパク質総重量の少なくとも９０％の分子量が、選択された分子量の±１０％の範囲内にあるということになる。別の実施形態では、本発明による組成物は、それぞれ性質がホモ（同質）分散であるが分子量の異なる２種以上のゼラチン様タンパク質を含む（すなわち、二峰性の分子量分布である）。このことが凍結乾燥工程中又は冷蔵中の結晶化を防止する。分子量が違うと、それほど結晶化が起こらなくなる。分子量の差は、５０００〜２０，０００ダルトンであることが好ましく、約１０，０００ダルトンであることが最も好ましい。
【００４５】
別の実施形態では、本発明のゼラチン様組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドは、らせん構造を含まない。これは、プロリン残基のヒドロキシル化を部分的にしか可能にせず、又は好ましくはまったく可能にしないことによって実現される。部分的なヒドロキシル化とは、１０％未満、好ましくは５％未満のプロリンしかヒドロキシル化されないことを意味する。らせん構造がないことが、低い温度においてさえゼラチン様ポリペプチドのゲル化を防ぐ。このことは、例えば、注射前に水に溶解させられるワクチン製剤で有利である。溶解させたワクチンはその時点で、加熱してゲル化を防ぐ必要なく使用することができる。
【００４６】
ゲル化しないゼラチン様ポリペプチドは、凍結乾燥工程の中でも有利に使用される。ゼラチンの凍結乾燥では、実際の凍結乾燥を開始する前に、溶液をまず凍結させる。この方法は、例えば米国特許第３，８９２，８７６号に記載されている。ゼラチンは、ゲル状態でなくゾル状態で凍結させることが重要である。そうしないと凍結乾燥ゼラチンが凍結乾燥後に再び溶解しなくなるためである。本発明の組換えゼラチン様タンパク質は、より濃縮されたゼラチン溶液の凍結乾燥を可能にし、その結果、同じ時間で大量のワクチンが得られ、凍結乾燥時間が１０〜２０％短縮され、生理活性物質又はゼラチンの損傷が軽減され、凍結乾燥のコストが削減される。
【００４７】
本発明で使用するゼラチン様タンパク質の出発点は、自然に存在するゼラチン分子をコードしている単離された遺伝子でもよく、これを組換え手段によってさらに処理する。本発明に従って使用するゼラチン様タンパク質は、ヒト天然型アミノ酸配列に似ており、本質においてヒドロキシプロリン残基が存在しないという点が異なることが好ましい。
【００４８】
本発明に従って使用するタンパク質は、組換え手段、特に酵母中での組換え遺伝子の発現によって産生されるとき、１〜４位（Ｍｅｔ−Ｘａｙ−Ｘａｚ−Ａｒｇ）にメチオニンとアルギニンの組合せを含まないことが好ましい。このような配列は、酵素によるタンパク質分解に敏感であるためである。
【００４９】
本発明に従って使用するタンパク質は、一部又は全体をＤＮＡ発現以外の方法、例えば化学的なタンパク質合成によって製造してもよいことに留意されたい。
【００５０】
本発明の組成物を得るために、本発明の１種又は複数のゼラチン様タンパク質を、生理的に活性のある化合物と混合する。ガラス化を助けるものとして糖を加えることができる。これは、スクロースのような二糖類であることが好ましい。適用例に応じて、アミノ酸、ゼラチン以外のタンパク質などのような他の様々な化合物を加えることもできる。
【００５１】
本発明の組成物は、通常は２〜６０重量％の量のゼラチン様タンパク質を含む。
【実施例１】
【００５２】
組換えゼラチン様ペプチド
ヒトＣＯＬ１Ａ１−１のゼラチンアミノ酸配列の一部をコードしている核酸配列から出発して、ガラス転移温度が増大しているゼラチンを生成した。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６、及びＷＯ０１／３４６４６に記載の方法を使用した。本発明によるこのゼラチンの配列を以下に示す（配列番号２）。
ＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＡＰＧＡＰＧＡＰＧＰＶＧＰＡＧＫＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＡＧＡＲＧＰＡ（配列番号１のアミノ酸１０３４〜１０８７）
分子量：４５９０Ｄａ、等電点ｐＩ＝６．２
【００５３】
この配列は、本明細書に記載の方法によって全ＣＯＬ１Ａ１−１配列（配列番号１）から選択した。この選択された配列について２０８℃のガラス転移温度が算出された。全ＣＯＬ１Ａ１−１（配列番号１）の平均ガラス転移温度は１６３℃である。すなわち、ガラス転移温度の増大計算値は４５℃である。
【実施例２】
【００５４】
ガラス転移温度の測定
実施例１に記載の組換えゼラチンを、ＭＭＲワクチンに特有の６０／４０重量％のゼラチン／スクロース比でスクロースと混合した。この混合物の１０％水溶液をつくった。この溶液を液体窒素中で直ちに凍結させ、その後−５５℃で４８時間かけて凍結乾燥した。凍結乾燥サンプルを真空乾燥器に入れシリカゲルでさらに乾燥させた。
【００５５】
ＤＳＣ（示差走査熱量測定）は、窒素雰囲気（流量２０ｍｌ／分）中でPerkin Elmer社製ＤＳＣ７装置を使用して行った。適用した温度プログラムは次のとおりであった。
−６０℃で１分間待機
−毎分５℃の加熱速度で６０〜２３０℃
半Ｃｐ補外法（half Cp extrapolated method）に従ってガラス転移温度を求めた。
【００５６】
残留水分量は、窒素雰囲気（流量２０ｍｌ／分）中でPerkin Elmer社製ＴＧＡ７を使用するＴＧＡ（熱重量測定）によって求めた。適用した温度プログラムは次のとおりであった。
−毎分５℃の加熱速度で２５〜６０℃
−６０℃で１分間待機
−毎分５℃の加熱速度で６０〜３００℃
【００５７】
乾燥組換えゼラチン／スクロース混合物の残留水分量は、１〜２重量％の範囲にあることがわかった。
【００５８】
乾燥組換えゼラチン／スクロース混合物のガラス転移温度は、１３０度であると測定された。
【００５９】
参考として、スクロースとの同じ混合物にした天然型ＣＯＬ１Ａ１のガラス転移温度は、１１６度であることがわかった。
【００６０】
したがって、選択された組換えゼラチンを含む混合物のＴｇ測定値は、（選択されていない）天然型ゼラチンを含む類似した混合物よりも１４℃高く、Ｔｇ計算値がより高いゼラチン様ペプチドを選択すると、そのようなペプチドを含む、Ｔｇ測定値がより高い混合物も得られることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝ｌ８の移動平均Ｔｇを示すグラフである。
【図２】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝２７の移動平均Ｔｇを示すグラフである。
【図３】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝５４の移動平均Ｔｇを示すグラフである。
【図４】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝８１の移動平均Ｔｇを示すグラフである。
【図５】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝５４の移動平均Ｔｇ及びアラニン含有量との相関を示すグラフである。
【図６】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝５４の移動平均Ｔｇ及びロイシン＋イソロイシン含有量との相関を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチン様タンパク質又はゼラチン様ポリペプチドの、凍結乾燥生体材料組成物又は医薬組成物中の安定剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
十分に定着しているゼラチンの適用例は、凍結乾燥された生体材料組成物又は医薬組成物中の生理活性物質のための安定剤としての使用である。生理活性物質の凍結乾燥又はフリーズドライは、一般に安定剤及び二糖類の存在下で行われる。凍結乾燥用の組成及び方法は、D. GreiffのDevelopments in Biological Standardization (1992), 7 Biol. Prod. Freeze Drying Formulation), 85-92に記載されているように、異なる種類の生理活性物質について経験的に決定される。凍結乾燥組成物の安定性は、生理活性物質の性質、凍結乾燥組成物の水分含有量及びガラス転移温度（Ｔｇ）のようないくつかの要因に応じて決まる。ワクチンは、凍結乾燥組成物として貯蔵される薬剤化合物の例である。
【０００３】
ワクチンは、特に開発途上国で使用されており、そうした国々では、時にワクチンの厳しい貯蔵条件を維持するのが困難となり得る。凍結乾燥ワクチンの安定性は、主要な関心事であり、世界保健機構は、このような組成物の貯蔵に関する厳しい規則を出している。
【０００４】
生理活性物質は、例えば、ワクチン、（治療用）タンパク質、酵素、（モノクローナル）抗体などである。ゼラチンは、免疫原性が低いことがわかっているので好ましい安定剤である。ゼラチン溶液を無菌にし、発熱物質及び抗原を含まないように注意を払うべきである。
【０００５】
現在使用されているゼラチンの欠点は、現在使用されているゼラチン誘導体を適用した後に起こり得る、アナフィラキシーショックとして知られている即時型アレルギー反応を起こす可能性である。
【０００６】
市販のゼラチン誘導体のもう一つの欠点は、使用されるゼラチンが、動物の骨や皮などの動物性供給源から単離されたものであり、特にウシ供給源由来であることである。この材料の欠点は、不純物が存在すること、並びに組成物の性質がはっきと規定されず、したがって再現可能でないことである。このために、誘導体化の過程から所望の特性を有する製品が確実に得られるようにすべく、追加のスクリーニングを行わなければならないこともあり、慎重な精製ステップが必要となることもある。昨今の追加の問題は、特にウシ供給源から単離したゼラチンに関して、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）発生の原因となる要因によってゼラチンが汚染されている危険である。そのため、医薬組成物中へのゼラチンの使用は禁止されかねない。
【０００７】
ＷＯ０１／３４８０１ Ａ２は、天然ゼラチンの使用に伴う明らかな問題を回避するための、組換えゼラチンのワクチン安定剤としての使用を一般に記載している。しかし、特別に設計された組換え構造によって実現することのできる更なる利点については記載がない。
【０００８】
欧州特許第０７８１７７９ Ａ２号は、コラゲナーゼによって特異的に加水分解して非抗原性にした２０キロダルトン（ｋＤａ）以下のゼラチンの使用を記載している。米国特許第４１４７７７２号は、約３ｋＤａの加水分解ゼラチンの、抗原性が少ない非ゲル化基材としての使用を開示している。
【０００９】
米国特許第４２７３７６２号は、部分的に加水分解されているゼラチンを安定剤として含むワクチンの凍結乾燥時間を短縮する試みを記載している。
【特許文献１】ＷＯ０１／３４８０１ Ａ２
【特許文献２】欧州特許第０７８１７７９ Ａ２号
【特許文献３】米国特許第４１４７７７２号
【特許文献４】米国特許第４２７３７６２号
【非特許文献１】D. GreiffのDevelopments in Biological Standardization (1992), 7 Biol. Prod. Freeze Drying Formulation), 85-92
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、生理活性物質を含む凍結乾燥組成物用の改良された安定剤を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、改良された安定剤を含んだ安定性が改良されている凍結乾燥組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、生理活性物質を含む組成物の凍結乾燥時間を改良した安定剤を用いて短縮することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、これらの目的は、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、アミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在し、かつFood Hydrocolloids Vol. 11 no.2 pp. 125-133, 1997で発表されているMatveevの式８及び式９によって算出されるガラス転移温度計算値が約１８０℃よりも高い組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドを安定剤として使用することで達成されたことがわかった。これらの特性を備えたペプチドを、以下では、その生産方法（すなわち、組換え発現によるか化学合成によるか）に応じて、「組換え」若しくは「合成」コラーゲン様ペプチド（若しくはポリペプチド）又は「組換え」若しくは「合成」ゼラチン様ペプチド（若しくはポリペプチド）と呼ぶ。
【００１４】
本発明の組換えポリペプチドがらせん構造でないとき、凍結乾燥方法を有意に最適化できることもわかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明によれば、ガラス転移温度計算値が約１８０℃よりも高く、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、かつアミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在している組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドを安定剤として含む凍結乾燥組成物が提供される。
【００１６】
この組成物のガラス転移温度測定値も、天然型コラーゲンペプチドを含む対照組成物のガラス転移温度測定値より有意に高く、好ましくは少なくとも約５℃、より好ましくは少なくとも約１０℃、最も好ましくは約２０℃高いはずである。「天然型コラーゲン」とは、本明細書では、選択又は合成によってガラス転移温度が高くなっていないコラーゲンペプチド又はコラーゲンポリペプチドを指す。一般に、天然型コラーゲンペプチドは、Ｔｇ計算値が約１７０℃以下である。
【００１７】
ゼラチン様ペプチドと１種又は複数の他の化合物とから構成された混合物のＴｇを測定するとき、その組成物のＴｇ測定値は、実質的に純粋なゼラチン様ペプチドのＴｇ測定値と有意に異なる場合もあることを留意されたい。例えば、ゼラチン様ペプチドとスクロースとを含む組成物のＴｇ測定値は、純粋なゼラチン様ペプチドのＴｇ測定値よりも有意に低くてよい。
【００１８】
血流中に導入される医薬製剤は、例えば、安定剤、薬物担体、又は浸透性コロイドとしてのタンパク質を含有する。ゼラチンが、免疫原性が低いために好ましいことは当業界で認められて久しい。天然供給源由来のゼラチンを組換えゼラチンに替えると、ゼラチンでない材料の導入が有利に回避できることも当業界で認められている。最近では、ＢＳＥが心配の種になっており、自然供給源由来のゼラチンの使用を避ける動機にもなっている。
【００１９】
組換えゼラチンの使用について言うまでもない理屈が記載され、組換え構造を最適化できることが示されているが、その最適化が何を含むかについては教示されていない。
【００２０】
コラーゲンの性質についての研究の中で、驚いたことに、コラーゲンは、繰返しのアミノ酸トリプレット構造Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａを有し、大半のトリプレットはプロリンを含んでいるが、ガラス転移温度（又はＴｇ）が分子全体に一様に分配されておらず、Ｔｇが平均的な（天然型）コラーゲンよりも高い配列を選択できることを発見した。
【００２１】
ガラス転移温度の重要性は、ワクチンのような生理活性物質を含有する製剤のフリーズドライ又は凍結乾燥を行う当業者に十分に知られている。凍結乾燥された製剤では、高いガラス転移温度を目指して努力が払われる。「Long-Term Stabilization of Biologicals」(Biotechnoloy vol.12 12 march 1994)の中で、F. Franksは、凍結乾燥による生体材料の保存における高いガラス転移温度の重要性、並びにそのような材料の保存期間をさらに改善したいという要望に焦点を当てている。凍結乾燥用の製剤中で、ゼラチンは、生理活性物質を保護する働きをしており、そのためアミノ酸残基の極性基に結合した水分子の存在が重要なものであると考えられる。残留水分は、ワクチンの保存期間において重要な役割を担う。残留水分レベルが増大すると、凍結乾燥ゼラチン／二糖類組成物のガラス転移温度は有意に低下し、保存期間が短縮される。
【００２２】
例えば、Phillipsらのcryobiology 18, 414-419 (1981)又は米国特許第８０１８５６号など、この題目についての発表は数多い。ＭＭＲ（おたふく風邪、麻疹、風疹）のようなワクチンは、現在の製剤では、限界Ｔｇが無水条件下で４７℃付近にあるが、少量の水分が材料に浸入すると急速に低下して室温に近づく。M.K. LalaのIndian Pediatrics 2003; 40:311-319では、３７℃で１週間以内に５０％の効力の損失が報告されている。わずかな程度でさえ、Ｔｇを増大させると、これらのワクチンの保存期間に非常に大きな影響を及ぼすことができる。ゼラチンによって安定化させた生理活性製剤の安定性が低下してしまう問題が、望ましくない免疫応答の発生を防ぐために、高められたＴｇと自然のヒトのゼラチンアミノ酸配列と一定の類似性とを併せ持つ、新しい組換えゼラチン又は合成ゼラチンの使用に基づく本発明によって解決された。
【００２３】
本発明による組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドは、天然型ヒトコラーゲン配列と同一又は相同性が高い配列であることが好ましい。天然型の配列からそのようなアミノ酸配列を選択するために、「移動Ｔｇ平均」（以下で定義する）を算出する。次いで、平均ガラス転移温度計算値が、天然型出発配列の平均コラーゲンガラス転移温度計算値より約１０℃、好ましくは約２０℃、より好ましくは約３０℃、より一層好ましくは約４０℃高い配列を選択する。この値は、異なる種類のコラーゲン間で若干異なっていてよく、プロペプチド、テロペプチド、又はシグナルペプチドの存在に応じて様々でよい。天然型コラーゲンの平均ガラス転移温度計算値は、約１７０℃であるので、本発明によるポリペプチドのＴｇは、約１８０度より高く、好ましくは約１９０度より高く、より好ましくは約２００度より高い。「約」とは、本明細書では、指定の温度よりも１〜４度高い及び／又は低い範囲の温度を指す。
【００２４】
１０度未満のＴｇの増大も考慮に入れるが、二糖類が存在する実際の製剤での効果は、あまり有意でないレベルにまで低下する場合もある。
【００２５】
ガラス転移温度の算出法は、Y. MatveevらのFood Hydrocolloids Vol. 11 no. 2 pp. 125-133, 1997で発表されている。次の方程式８及び９
【００２６】
【数１】
［式中、総和ｉ＝１〜２０は、以下に示す単独のアミノ酸のＴｇ及びΔＶの部分値に対する値の総和である（Ｖは、Matveevら（前掲書）に記載のｖｄ Ｗａａｌｓ体積についての測度である）。］
を実際の算出に使用した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
このモデルは、ヒドロキシプロリンの存在を考慮に入れていないと思われる。しかし、Matveevらの論文に提示されている測定値との相関は、ゼラチンの計算値と測定値の非常に良好な相関を示すものである。
【００２９】
適切な組換えコラーゲン様ペプチド又は合成コラーゲン様ペプチドを選択するために、出発点は、例えば、全配列から算出したＴｇが１６３℃であるヒトＣｏｌ１Ａ１（配列番号１）とする。
【００３０】
配列番号１（ヒトＣｏｌ１Ａ１）：
【００３１】
このＣｏｌ１Ａ１配列はなお、シグナル配列（アミノ酸１〜２２）及びアミノ末端プロペプチド（アミノ酸２３〜１６１及び１２１９〜１４６４）を含む。らせんコラーゲン配列は、アミノ酸１６２〜アミノ酸１２１８に存在する。スプレッドシートを使用すれば、いくつかのアミノ酸の移動平均を容易に算出し表示することができるはずである。図１〜４は、それぞれ１８、２７、５４、及び８１アミノ酸の移動平均の結果を示すものである。例えばｎ＝５４の「移動Ｔｇ平均」とは、まず１番目から５４番目のアミノ酸の平均Ｔｇを算出し、次いで２番目から５５番目のアミノ酸、次いで３番目から５６番目のアミノ酸へと続けることを意味する。次いで、これらの値を、最初のデータポイントを５４番目のアミノ酸のところでプロットして、図３のようにプロットする。この天然型コラーゲンの平均Ｔｇ計算値（すなわち、完全配列の平均Ｔｇ計算値）よりも高いＴｇ計算値を有するアミノ酸領域がこの時点で同定できる。ポリペプチドが小さいほど、Ｔｇのより高い領域の選択が可能になることは注目すべきである。５４アミノ酸の移動平均の算出では、Ｔｇが最高で約２００℃まで増大しているポリペプチド配列の選択が可能になる。例えば、配列番号１のアミノ酸１０３４〜１０８７の配列は、２０８℃というＴｇ計算値をもたらす。すなわち、このポリペプチドは、Ｔｇ計算値が、全配列について算出して１６３℃である天然型配列のＴｇ計算値よりも４５℃高い。それとして発現させると、約５，０００ダルトンのゼラチン様ポリペプチドが得られる。配列番号１のアミノ酸６００〜アミノ酸１１００のあたりから、それでも平均Ｔｇが約１７８℃であり、分子量が約４０，０００〜５０，０００ダルトンである約５００アミノ酸の配列を選択することができる。配列番号１のアミノ酸５９０〜７５０のあたりからは、分子量が最高で約１０，０００〜１３，０００ダルトンの、平均Ｔｇが１８０℃より高いポリペプチドを選択することができる。上述のような所望の平均Ｔｇを有するポリペプチド領域は、Ｃｏｌ１Ａ−２、Ｃｏｌ２Ａ−１、Ｃｏｌ３Ａ−１などの他のコラーゲン配列からも容易に算出することができる。このようなコラーゲン配列は、当業界では容易に入手できる。
【００３２】
所望時に、これらの配列の繰返し配列を発現させて、より大きな分子量を実現することができる。約３，０００〜１５，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜１０，０００ダルトン、より好ましくは６，０００〜８，０００ダルトンの従来の加水分解ゼラチンを適用する。所望時には、本発明によって、実現できるＴｇに特別な強みを付与しながらより大きい分子量を実現することもできる。したがって、一実施形態では、ゼラチン様ポリペプチドは、３，０００〜１５，０００ダルトン、より好ましくは５，０００〜１０，０００ダルトン、より一層好ましくは６，０００〜８，０００ダルトンの好ましい分子量を有する。別の実施形態では、ゼラチン様ポリペプチドは、分子量が３，０００〜８０，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜６０，０００ダルトン、最も好ましくは１０，０００〜４０，０００ダルトンである。
【００３３】
ポリペプチド断片のＴｇとその構造上の細目との相関関係を明らかにすることを試みた。図５に示すように、アラニン含有量との若干の相関が見出された。５４アミノ酸の移動平均について、Ｔｇのより高い区域の多くは、それに一致してアラニンレベルが高まっているが、Ｔｇが平均よりも高いすべての領域には当てはまらない。それにもかかわらず、５４アミノ酸の移動平均では、５４アミノ酸のポリペプチドのアラニン含有量が１０アミノ酸あたり約１アラニンを超えているとき、Ｔｇがより高い領域が見出されるものと思われる。嵩高なアミノ酸残基の存在は、ポリペプチドのＴｇにマイナスの影響を及ぼし得る。５４アミノ酸の移動平均に関して、ロイシン及びイソロイシンの存在とＴｇとに相関が生じた（図６）。すべてではないがＴｇの高い多くの区域では、これらの嵩高なアミノ酸残基の濃度が低く、又はこれらが存在しない。この相関にバリンが伴うとより悪くなり、バリンが嵩高さにより少ないが影響を及ぼすことが示唆される。豊富に存在するプロリンの側鎖の大きさを考えると、バリンよりもロイシン及びイソロイシンの方が嵩高さの一因となることが想像できる。さらに、凍結乾燥生理活性物質を保護するのに十分な水分子を結合できるように、極性アミノ酸残基の量が５％超、より好ましくは７％超かつ１５％未満であることが望ましい。
【００３４】
本発明によるゼラチン様組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドは、自然のヒトコラーゲンアミノ酸配列と同一又は本質的に類似であることが好ましいが、非ヒト配列（ラット、ウサギ、マウスなどの）を使用してもよく、或いは自然界に存在しない配列を設計してもよい。用語「本質的に類似」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトパラメーターを使用するＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴの各プログラムなどによって最適に並べたとき、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、又はそれ以上（例えば、９９若しくは１００パーセントの配列同一性）を有することを意味する。ＧＡＰは、Needleman及びWunschのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、マッチ数を最重要視し、ギャップ数を最小限に抑えながら、２種の配列をその全長にわたって並べるものである。一般に、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰデフォルトパラメーターが使用される。
【００３５】
このような配列は、アラニン含有量が高く、１００アミノ酸あたり１０アラニン残基、好ましくは１００アミノ酸あたり１２、より好ましくは１００アミノ酸あたり１４を超えていることが好ましいはずである。そうした望ましい構造は、自然のゼラチンに匹敵する極性アミノ酸残基を含む。嵩高なアミノ酸が混ざることは避ける。
【００３６】
自然のゼラチン分子は、その一次アミノ酸配列中が、基本的にＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの繰返しからなり、したがって、アミノ酸総数の約３分の１はグリシンである。ゼラチンの分子量は通常は大きく、分子量の値は１０，０００〜３００，０００ダルトンまで様々である。自然のゼラチン分子の主画分は、分子量が約９０，０００ダルトンである。平均分子量は、９０，０００ダルトンよりも大きい。
【００３７】
また、ゼラチンに特徴的なのは、プロリン残基の含有量が並外れて高いことである。さらにまた特徴的であるのは、自然のゼラチンではいくつかのプロリン残基がヒドロキシル化されていることである。ヒドロキシル化の最も顕著な部位は４位であり、そのためゼラチン分子中に珍しいアミノ酸４−ヒドロキシプロリンが存在するようになる。トリプレット中では、４−ヒドロキシプロリンは常にＹａａの位置に見られる。３位がヒドロキシル化されているプロリン残基はごくわずかしかない。４−ヒドロキシプロリンとは対照的に、３−ヒドロキシプロリンは常にグリシン残基のカルボキシル側、すなわちトリプレット中のＸａａの位置に見られる。３−若しくは４−ヒドロキシプロリンの生成には、異なる酵素が担当する。
【００３８】
既知のアミノ酸組成に基づき、哺乳動物由来のゼラチン分子では、アミノ酸の約２２％がプロリン又はヒドロキシプロリン残基であることが推測される。しかし、魚、特に冷水魚ではそれよりも少ない含有量のプロリン及びヒドロキシプロリンが見出される。概算では、プロリン残基とヒドロキシプロリン残基はほぼ等しい量で存在し、例えば、哺乳動物由来のゼラチン分子ではアミノ酸の約１１％がプロリンであり、約１１％がヒドロキシプロリンである。ほぼすべてのヒドロキシプロリンがＹａａの位置に見られるので、ゼラチン分子中の全トリプレットの約３分の１をヒドロキシプロリンが占めていることが推測される。ヒドロキシプロリン残基の存在は、ゼラチン分子がその二次構造でらせん構造を取り得ることの要因である。
【００３９】
さらに、自然のゼラチン中に存在する、他のタンパク質中にはごくわずかしか見られない別のアミノ酸が５−ヒドロキシリシンである。このようにして修飾されたリシン残基は、常にトリプレット中のＹａａの位置に見られる。
【００４０】
ゼラチンの最も際立つ特徴は、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの存在である。このトリプレットは、本発明のゼラチン様タンパク質中にも存在する。しかし、たんぱく質のゼラチン様の特質をそれほど変更せずに、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット又はＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの配列が１個又は複数のアミノ酸によって隔てられているタンパク質を設計することが可能である。そのようなゼラチン様タンパク質は、本発明のゼラチン様タンパク質の定義に含まれる。
【００４１】
本発明による使用のためのゼラチン様タンパク質は、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６で開示されているような組換え法によって生産することができる。本発明による組成物中に適切に使用することのできるゼラチン様タンパク質の生産及び精製を可能にするために、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６の実施例が特に参考文献として挙げられる。すなわち、ゼラチン様タンパク質は、このようなポリペプチドをコードしている核酸配列を適切な微生物によって発現させて生産することができる。この方法は、真菌細胞又は酵母細胞を用いて適切に実施できる。宿主細胞は、ハンゼヌラ、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウム、アカパンカビ、ピチアのような高発現宿主細胞であることが適する。真菌細胞及び酵母細胞の方が、繰返し配列の誤った発現を経験しにくいので、細菌よりも好まれる。宿主細胞は、発現されたコラーゲン構造を攻撃するプロテアーゼが高レベルでないことが最も好ましい。この点で、ピチアは、非常に適切な発現系の例である。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６に記載されているように、詳細にはPichia pastorisが発現系として使用される。一実施形態では、微生物を形質転換して、プロピル−４−ヒドロキシラーゼを発現させるための遺伝子も含める。別の実施形態では、微生物は、特にプロリンのヒドロキシル化など、活性のある翻訳後プロセッシング機構を含まない。
【００４２】
宿主細胞及び発現させる配列についての知識と合わせ、宿主細胞を本発明による組成物に適する組換えゼラチン様タンパク質の発現に適するものにする本明細書に記載の必要なパラメーターを基本原理とする、既知の工業用酵素産生真菌宿主細胞、特に酵母細胞からの適切な宿主細胞の選択は、当業者ならばできるであろう。
【００４３】
本発明で使用するゼラチン様タンパク質の設計に関して、このタンパク質のいくつかの特性に対処している。例えば、ロイシンやイソロイシンのような嵩高なアミノ酸などの、平均Ｔｇを下げる特定のアミノ酸が確実にタンパク質中に存在せず、又はまれにしか存在しないようにすることができる。或いは、特にアラニン又は極性アミノ酸について上で論じたように、ゼラチン様タンパク質中に一定数の特定のアミノ酸を導入すると有利な場合もある。さらにまた、ゼラチン様タンパク質中の酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基の組成によって等電点（ＩＥＰ）を調整することもできる。
【００４４】
一実施形態では、本発明による組成物は、性質がホモ（同質）分散（homodisperse）であるゼラチン様タンパク質を含む。ホモ（同質）分散とは、組成及び分子量が一定であるものを意味する。組換え製造法のために起こり得る組成の変化は許容される。分子量に関して、ホモ（同質）分散であることの実際的な定義では、組成物中のゼラチン様タンパク質総重量の少なくとも９０％の分子量が、選択された分子量の±１０％の範囲内にあるということになる。別の実施形態では、本発明による組成物は、それぞれ性質がホモ（同質）分散であるが分子量の異なる２種以上のゼラチン様タンパク質を含む（すなわち、二峰性の分子量分布である）。このことが凍結乾燥工程中又は冷蔵中の結晶化を防止する。分子量が違うと、それほど結晶化が起こらなくなる。分子量の差は、５０００〜２０，０００ダルトンであることが好ましく、約１０，０００ダルトンであることが最も好ましい。
【００４５】
別の実施形態では、本発明のゼラチン様組換えポリペプチド又は合成ポリペプチドは、らせん構造を含まない。これは、プロリン残基のヒドロキシル化を部分的にしか可能にせず、又は好ましくはまったく可能にしないことによって実現される。部分的なヒドロキシル化とは、１０％未満、好ましくは５％未満のプロリンしかヒドロキシル化されないことを意味する。らせん構造がないことが、低い温度においてさえゼラチン様ポリペプチドのゲル化を防ぐ。このことは、例えば、注射前に水に溶解させられるワクチン製剤で有利である。溶解させたワクチンはその時点で、加熱してゲル化を防ぐ必要なく使用することができる。
【００４６】
ゲル化しないゼラチン様ポリペプチドは、凍結乾燥工程の中でも有利に使用される。ゼラチンの凍結乾燥では、実際の凍結乾燥を開始する前に、溶液をまず凍結させる。この方法は、例えば米国特許第３，８９２，８７６号に記載されている。ゼラチンは、ゲル状態でなくゾル状態で凍結させることが重要である。そうしないと凍結乾燥ゼラチンが凍結乾燥後に再び溶解しなくなるためである。本発明の組換えゼラチン様タンパク質は、より濃縮されたゼラチン溶液の凍結乾燥を可能にし、その結果、同じ時間で大量のワクチンが得られ、凍結乾燥時間が１０〜２０％短縮され、生理活性物質又はゼラチンの損傷が軽減され、凍結乾燥のコストが削減される。
【００４７】
本発明で使用するゼラチン様タンパク質の出発点は、自然に存在するゼラチン分子をコードしている単離された遺伝子でもよく、これを組換え手段によってさらに処理する。本発明に従って使用するゼラチン様タンパク質は、ヒト天然型アミノ酸配列に似ており、本質においてヒドロキシプロリン残基が存在しないという点が異なることが好ましい。
【００４８】
本発明に従って使用するタンパク質は、組換え手段、特に酵母中での組換え遺伝子の発現によって産生されるとき、１〜４位（Ｍｅｔ−Ｘａｙ−Ｘａｚ−Ａｒｇ）にメチオニンとアルギニンの組合せを含まないことが好ましい。このような配列は、酵素によるタンパク質分解に敏感であるためである。
【００４９】
本発明に従って使用するタンパク質は、一部又は全体をＤＮＡ発現以外の方法、例えば化学的なタンパク質合成によって製造してもよいことに留意されたい。
【００５０】
本発明の組成物を得るために、本発明の１種又は複数のゼラチン様タンパク質を、生理的に活性のある化合物と混合する。ガラス化を助けるものとして糖を加えることができる。これは、スクロースのような二糖類であることが好ましい。適用例に応じて、アミノ酸、ゼラチン以外のタンパク質などのような他の様々な化合物を加えることもできる。
【００５１】
本発明の組成物は、通常は２〜６０重量％の量のゼラチン様タンパク質を含む。
【実施例１】
【００５２】
組換えゼラチン様ペプチド
ヒトＣＯＬ１Ａ１−１のゼラチンアミノ酸配列の一部をコードしている核酸配列から出発して、ガラス転移温度が増大しているゼラチンを生成した。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６、及びＷＯ０１／３４６４６に記載の方法を使用した。本発明によるこのゼラチンの配列を以下に示す（配列番号２）。
ＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＰＧＡＰＧＡＰＧＡＰＧＰＶＧＰＡＧＫＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＡＧＡＲＧＰＡ（配列番号１のアミノ酸１０３４〜１０８７）
分子量：４５９０Ｄａ、等電点ｐＩ＝６．２
【００５３】
この配列は、本明細書に記載の方法によって全ＣＯＬ１Ａ１−１配列（配列番号１）から選択した。この選択された配列について２０８℃のガラス転移温度が算出された。全ＣＯＬ１Ａ１−１（配列番号１）の平均ガラス転移温度は１６３℃である。すなわち、ガラス転移温度の増大計算値は４５℃である。
【実施例２】
【００５４】
ガラス転移温度の測定
実施例１に記載の組換えゼラチンを、ＭＭＲワクチンに特有の６０／４０重量％のゼラチン／スクロース比でスクロースと混合した。この混合物の１０％水溶液をつくった。この溶液を液体窒素中で直ちに凍結させ、その後−５５℃で４８時間かけて凍結乾燥した。凍結乾燥サンプルを真空乾燥器に入れシリカゲルでさらに乾燥させた。
【００５５】
ＤＳＣ（示差走査熱量測定）は、窒素雰囲気（流量２０ｍｌ／分）中でPerkin Elmer社製ＤＳＣ７装置を使用して行った。適用した温度プログラムは次のとおりであった。
−６０℃で１分間待機
−毎分５℃の加熱速度で６０〜２３０℃
半Ｃｐ補外法（half Cp extrapolated method）に従ってガラス転移温度を求めた。
【００５６】
残留水分量は、窒素雰囲気（流量２０ｍｌ／分）中でPerkin Elmer社製ＴＧＡ７を使用するＴＧＡ（熱重量測定）によって求めた。適用した温度プログラムは次のとおりであった。
−毎分５℃の加熱速度で２５〜６０℃
−６０℃で１分間待機
−毎分５℃の加熱速度で６０〜３００℃
【００５７】
乾燥組換えゼラチン／スクロース混合物の残留水分量は、１〜２重量％の範囲にあることがわかった。
【００５８】
乾燥組換えゼラチン／スクロース混合物のガラス転移温度は、１３０度であると測定された。
【００５９】
参考として、スクロースとの同じ混合物にした天然型ＣＯＬ１Ａ１のガラス転移温度は、１１６度であることがわかった。
【００６０】
したがって、選択された組換えゼラチンを含む混合物のＴｇ測定値は、（選択されていない）天然型ゼラチンを含む類似した混合物よりも１４℃高く、Ｔｇ計算値がより高いゼラチン様ペプチドを選択すると、そのようなペプチドを含む、Ｔｇ測定値がより高い混合物も得られることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝ｌ８の移動平均Ｔｇを示すグラフである。
【図２】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝２７の移動平均Ｔｇを示すグラフである。
【図３】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝５４の移動平均Ｔｇを示すグラフである。
【図４】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝８１の移動平均Ｔｇを示すグラフである。
【図５】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝５４の移動平均Ｔｇ及びアラニン含有量との相関を示すグラフである。
【図６】ヒトＣＯＬ１Ａ１のｎ＝５４の移動平均Ｔｇ及びロイシン＋イソロイシン含有量との相関を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質及び安定剤を含む凍結乾燥組成物であって、前記安定剤が、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、アミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在している組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドであり、前記組換えポリペプチドのガラス転移温度計算値が１８０℃よりも高いことを特徴とする組成物。
【請求項２】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドの分子量が、３，０００〜８０，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜６０，０００ダルトン、より好ましくは１０，０００〜４０，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドの分子量が、３，０００〜１５，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜１０，０００ダルトン、より好ましくは６，０００〜８，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドのガラス転移温度が、１９０℃より高く、好ましくは２００℃より高いことを特徴とする請求項１〜３記載の組成物。
【請求項５】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドが二峰性分子量分布を有することを特徴とする請求項１〜４記載の組成物。
【請求項６】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドがらせん構造を含まないことを特徴とする請求項１〜５記載の組成物。
【請求項７】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチド中のヒドロキシプロリン残基数が、含まれる総アミノ酸残基数の５％未満、好ましくは２％未満であることを特徴とする請求項１〜６記載の組成物。
【請求項８】
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、アミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在し、組換えゼラチン様ポリペプチドのガラス転移温度計算値が１８０℃よりも高いことを特徴とする、組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチド。
【請求項９】
生理活性物質及び安定剤を含む組成物を凍結乾燥する方法であって、前記安定剤が、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、アミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在し、総アミノ酸残基数の５％未満がヒドロキシプロリン残基である、組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドであり、前記組換えゼラチン様ポリペプチドのガラス転移温度計算値が１８０℃よりも高いことを特徴とする方法。
【請求項１】
生理活性物質及び安定剤を含む凍結乾燥組成物であって、前記安定剤が、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、アミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在している組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドであり、前記組換えポリペプチドのガラス転移温度計算値が１８０℃よりも高いことを特徴とする組成物。
【請求項２】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドの分子量が、３，０００〜８０，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜６０，０００ダルトン、より好ましくは１０，０００〜４０，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドの分子量が、３，０００〜１５，０００ダルトン、好ましくは５，０００〜１０，０００ダルトン、より好ましくは６，０００〜８，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドのガラス転移温度が、１９０℃より高く、好ましくは２００℃より高いことを特徴とする請求項１〜３記載の組成物。
【請求項５】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドが二峰性分子量分布を有することを特徴とする請求項１〜４記載の組成物。
【請求項６】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドがらせん構造を含まないことを特徴とする請求項１〜５記載の組成物。
【請求項７】
組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチド中のヒドロキシプロリン残基数が、含まれる総アミノ酸残基数の５％未満、好ましくは２％未満であることを特徴とする請求項１〜６記載の組成物。
【請求項８】
Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、アミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在し、組換えゼラチン様ポリペプチドのガラス転移温度計算値が１８０℃よりも高いことを特徴とする、組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチド。
【請求項９】
生理活性物質及び安定剤を含む組成物を凍結乾燥する方法であって、前記安定剤が、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを１０回以上連続する繰返配列を少なくとも１つ含み、アミノ酸の少なくとも２０％が連続するＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットの形で存在し、総アミノ酸残基数の５％未満がヒドロキシプロリン残基である、組換えゼラチン様ポリペプチド又は合成ゼラチン様ポリペプチドであり、前記組換えゼラチン様ポリペプチドのガラス転移温度計算値が１８０℃よりも高いことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５０１２２４（Ｐ２００７−５０１２２４Ａ）
【公表日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２５１８（Ｐ２００６−５２２５１８）
【出願日】平成１６年８月４日（２００４．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００５５２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１１７４０
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（５０５２３２７８２）フジ フォト フィルム ビー．ブイ． (50)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月４日（２００４．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００５５２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１１７４０
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（５０５２３２７８２）フジ フォト フィルム ビー．ブイ． (50)
【Ｆターム（参考）】
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