富化された中枢神経系の幹細胞および始原細胞の集団、ならびにこのような集団を同定、単離、および富化するための方法
【課題】ヒトの非造血性の始原細胞および幹細胞、そして特に、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞および始原細胞を単離および特徴付けること。
【解決手段】富化された神経幹細胞および始原細胞の集団、ならびに細胞表面マーカーに結合する試薬を使用する、神経幹細胞を同定、単離、および富化するための方法が、提供される。詳細には、ニューロスフェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得るヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生するための方法を提供し、この方法は、神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程を包含する。
【解決手段】富化された神経幹細胞および始原細胞の集団、ならびに細胞表面マーカーに結合する試薬を使用する、神経幹細胞を同定、単離、および富化するための方法が、提供される。詳細には、ニューロスフェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得るヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生するための方法を提供し、この方法は、神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の請求）
本発明は、１９９９年２月１２日に出願された米国特許仮出願第６０／１１９，７２５号に対して；１９９９年１０月２１日に出願された米国特許出願第０９／４２２，８４４号に対して；および１９９９年１２月１日に出願された米国特許仮出願第６０／１６８，４０７号に対して、優先権を請求する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的には、富化された神経幹細胞および始原細胞の集団、ならびに神経幹細胞および始原細胞（詳細には、中枢神経系の神経幹細胞および始原細胞）について同定、単離、および富化するための方法に関し、そして最も詳細には、ニューロスフェアを開始する細胞（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）（ＮＳ−ＩＣ）の富化された集団に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
幹細胞の集団は、細胞の総数の低い割合のみを構成するが、それらの体に再配置する能力に起因してすばらしい目的である。幹細胞の寿命および幹細胞の子孫の散布（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）は所望される特徴である。これらの方法においては、有意な商業的な目的が存在する。なぜなら、幹細胞は多数の臨床的な用途を有するからである。遺伝子治療のためのビヒクルとしての幹細胞の使用においては、医学的な目的もまた存在する。
【０００４】
幹細胞および始原細胞の集団上に見出されるタンパク質および他の細胞表面マーカーは、これらの集団の分離および単離のための試薬を調製することにおいて有用である。細胞表面のマーカーもまた、これらの重要な細胞のさらなる特徴付けにおいて有用である。
【０００５】
本明細書中で参考として援用されるＹｉｎらの米国特許第５，８４３，６３３号は、ＡＣ１３３と呼ばれるモノクローナル抗体を記載している。この抗体は、造血幹細胞および始原細胞上の表面マーカーの糖タンパク質に結合する。ＡＣ１３３抗原は、１１７ｋＤａの分子量を有する５−膜貫通細胞表面抗原である。この抗原の発現は、高度に組織特異的であり、そしてヒトの骨髄、胎児の骨髄および肝臓、臍帯血、ならびに成体の末梢血に由来する、造血系の始原細胞のサブセット上で検出されている。ＡＣ１３３抗体によって認識される細胞のサブセットは、ＣＤ３４ｂｒｉｇｈｔであり、そしてＣＤ３４＋集団中に存在するＣＦＵ−ＧＭ活性の実質的に全てを含み、これによってＡＣ１３３を、ヒトの造血性の始原細胞および幹細胞の単離および特徴付けのための試薬として有用にする。
【０００６】
しかし、非造血性の幹細胞および始原細胞、ならびに特に、中枢神経系の神経幹細胞および始原細胞に特異的な表面マーカーは、同定されていない。さらに、ＡＣ１３３抗体は、非造血性の幹細胞または始原細胞、特に、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞および始原細胞について、同定、単離、または富化するための方法においては、使用されていない。ヒトの非造血性の始原細胞および幹細胞、そして特に、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞および始原細胞を単離および特徴付けることにおいて有用であるモノクローナル抗体のような、ツールについての必要性が残されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトの非造血性の始原細胞および幹細胞、そして特に、ニューロスフェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得る中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞、および始原細胞を、同定、単離、および富化するための方法を提供する。本発明はまた、ニューロスフェアを開始し得るＣＮＳの神経幹細胞、および始原細胞を含有している富化された集団を提供する。「ニューロスフェア開始細胞（ＮＳ−ＩＣ）」は、長期間のニューロスフェア培養を開始し得る細胞である。次に、「ニューロスフェア」は、細胞の凝集物またはクラスターであり、これは、神経幹細胞および初期始原細胞を含む。ニューロスフェアの同定、培養、増殖、および使用は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号、およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号（両方とも、本明細書中で参考として援用される）に開示されている。用語「ＮＳ−ＩＣ」は、ニューロスフェアを形成するその細胞の能力または機能によって定義されるが、これらの細胞は、付着性の培養地において適切に増殖され得（例えば、Ｊｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、そして本明細書中に記載されている方法および集団が、ＮＳ−ＩＣの懸濁培養物に限定されないことが留意されるはずである。ＮＳ−ＩＣは、ネスチン＋であり、そしてニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞への適切な分化条件下で分化する能力を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） ニューロスフェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得るヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生するための、方法であって、以下：
（ａ）神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程；および
（ｂ）該試薬と工程（ａ）の細胞の表面上の該決定基との間で接触している細胞について選択して、ＣＮＳ−ＳＣについて高度に富化された集団を産生する工程、
包含する、方法。
（項目２） 前記試薬が、モノクローナル抗体ＡＣ１３３によって認識される前記細胞表面マーカー上の決定基を認識する抗体である、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記試薬が、ＡＣ１３３モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、項目２に記載の方法。
（項目４） 前記試薬が、ＡＣ１３３抗体または５Ｅ１２抗体によって認識される前記細胞表面マーカーに対して結合するリガンドまたは低分子である、項目２に記載の方法。
（項目５） 前記試薬が、５Ｅ１２モノクローナル抗体によって認識される前記細胞表面マーカー上の決定基を認識する抗体である、項目１に記載の方法。
（項目６） 前記試薬が、５Ｅ１２モノクローナル抗体またはポリクリローナル抗体である、項目５に記載の方法。
（項目７） 前記試薬が蛍光色素を結合されている、項目１に記載の方法。
（項目８） 前記試薬が磁気粒子に対して結合されている、項目１に記載の方法。
（項目９） 前記選択工程がフローサイトメトリーによる、項目１に記載の方法。
（項目１０） 前記選択工程が、蛍光活性化細胞選別または高勾配磁気選択による、項目１に記載の方法。
（項目１１） 前記選択工程が、物理的陽性選択デバイスによる、項目１に記載の方法。
（項目１２） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、神経組織を生じる任意の組織から得られる、項目１に記載の方法。
（項目１３） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、神経組織から解離されている、項目１に記載の方法。
（項目１４） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、胎児の脳、成体の脳、胎児の脊髄、または成体の脊髄に由来する、項目１に記載の方法。
（項目１５） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、神経細胞培養物から得られる、項目１に記載の方法。
（項目１６） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、ニューロスフェア培養物または付着性の単層から得られる、項目１に記載の方法。
（項目１７） 項目１に記載の方法であって、
（ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ４５抗原に結合する試薬と接触させる工程；および
（ｄ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間で接触している細胞について選択し、そして該細胞と該ＣＤ４５抗原に結合する試薬との間での減少した接触について選択する工程であって、その結果、ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−である細胞、または５Ｅ１２＋ＣＤ４５−である細胞、またはＡＣ１３３＋５Ｅ１２＋ＣＤ４５−である細胞が選択される、工程、
をさらに包含する、方法。
（項目１８） 項目１に記載の方法であって、以下：
（ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ４５抗原に結合する試薬と接触させる工程；
（ｄ）該神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ３４抗原に結合する試薬と接触させる工程；および
（ｅ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間で接触している細胞について、ならびに該細胞と該ＣＤ４５抗原に結合する試薬との間、および該細胞と該ＣＤ３４抗原に結合する試薬との間での減少した接触について選択する工程であって、その結果、ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−である細胞、または５Ｅ１２＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−である細胞、またはＡＣ１３３＋５Ｅ１２＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−である細胞が選択される、工程、
をさらに包含する、方法。
（項目１９） 項目１に記載の方法であって、以下：
（ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体８Ｇ１によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程；
（ｂ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間で接触している細胞について、ならびに該細胞と該モノクローナル抗体８Ｇ１によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間での減少した接触について選択する工程であって、その結果、ＡＣ１３３＋８Ｇ１−／ｌｏである細胞、または５Ｅ１２＋８Ｇ１−／ｌｏである細胞、またはＡＣ１３３＋５Ｅ１２＋８Ｇ１−／ｌｏである細胞が選択される、工程、
をさらに包含する、方法。
（項目２０） 集団のニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）の画分について神経細胞の集団を富化するための方法であって、以下：
（ａ）ＮＳ−ＩＣの画分を含む、神経細胞または神経に由来する細胞を含有する集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と混合する工程；および
（ｂ）ＡＣ１３３＋および／または５Ｅ１２＋細胞について選択する工程であって、ここで、ＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋細胞は、該神経細胞の集団と比較した場合に、該ＮＳ−ＩＣの画分が富化されている、工程、
を包含する、方法。
（項目２１） ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を同定するための方法であって、
（ａ）神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程；および
（ｂ）該神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団の細胞と、該モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間での接触を検出する工程であって、ここで、ＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋であるとの細胞の同定により、ＮＳ−ＩＣとして細胞を同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目２２） ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を単離するための方法であって、以下：
（ａ）ＮＳ−ＩＣの画分を含む、神経細胞または神経に由来する細胞を含有する集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と混合する工程；
（ｂ）ＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋細胞を選択する工程であって、ここで、該選択されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞は、該神経細胞の集団と比較した場合に、該ＮＳ−ＩＣの画分において富化される、工程；
（ｃ）ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地に、少なくとも１つのＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を導入する工程；および
（ｄ）該培養培地中で該ＡＣ１３３細胞＋または該５Ｅ１２＋細胞を増殖させる工程、
を包含する、方法。
（項目２３） 項目２２に記載の方法によって産生された、細胞の集団。
（項目２４） 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、多能性の神経幹細胞の増殖を誘導しそして／または可能にするために有効な、１つ以上の予め決定された増殖因子を含有する無血清培地を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５） 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、さらに、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびそれらの組合せからなる群より選択される増殖因子を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、神経生存因子（ＮＳＦ）をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−細胞、または５Ｅ１２＋ＣＤ４５−細胞において富化された集団；および
（ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
（項目２８） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−細胞、または５Ｅ１２＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−細胞において富化された集団；および
（ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
（項目２９） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ＡＣ１３３＋８Ｇ１−／ｌｏ細胞、または５Ｅ１２＋８Ｇ１−／ｌｏ細胞において富化された集団；および
（ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
（項目３０） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ＡＣ１３３＋８Ｇ１ｈｉ細胞、または５Ｅ１２＋８Ｇ１ｈｉ細胞において富化された集団；および
（ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
（項目３１） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ネスチンについてポジティブに染色し、そして分化を誘導する条件の存在下で、ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞に分化する子孫細胞を産生する、少なくとも５０％のＡＣ１３３＋、または５Ｅ１２＋ニューロスフェア開始細胞（ＮＳ−ＩＣ）を含有する集団；ならびに
（ｂ）ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培地。
（項目３２） ＮＳ−ＩＣが付着される固体支持体をさらに含有する、項目３１に記載の組成物。
（項目３３） 前記細胞の集団が、少なくとも７０％のＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を有する、項目３１に記載の組成物。
（項目３４） 前記細胞の集団が、少なくとも９０％のＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を有する、項目３１に記載の組成物。
（項目３５） 前記ＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２―細胞の集団が、実質的に純粋な集団である、項目３１に記載の組成物。
（項目３６） 前記培地が、多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するために有効な、１つ以上の予め決定された増殖因子を含有する無血清培地を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３７） 前記培地が、さらに、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびそれらの組合せからなる群より選択される増殖因子を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３８） 前記培地が、さらに、神経生存因子を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３９） 前記ＮＳ−ＩＣがヒトＮＳ−ＩＣである、項目３１に記載の組成物。
（項目４０） ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を特徴付けるための方法であって、以下：
（ａ）単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を、ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地に対して導入する工程；
（ｂ）該培養培地中で該ＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を増殖させる工程；
（ｃ）該単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞がニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞に分化する条件下で、該単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞の子孫を培養する工程；ならびに
（ｄ）ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞の存在を検出する工程であって、ここで、ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞の存在は、該単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞をＮＳ−ＩＣとして特徴付ける、工程、
を包含する、方法。
（項目４１） 前記単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞の子孫がニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞に分化する前記条件が、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有し、そして有糸分裂促進性の増殖因子を含有しない培養培地中、ラミニンでコーティングされた表面上で、該単離されたＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋細胞の子孫を培養することを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２） ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）の増殖に影響を与える増殖因子の存在を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える少なくとも１つの増殖因子を含有すると予想される組成物を、ＮＳ−ＩＣを含有している組成物と混合する工程であって、ここで、該ＮＳ−ＩＣは、ＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋、ネスチン＋として特徴付けられ、そしてニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞系統に分化し得る、工程；ならびに
（ｂ）該組成物中の少なくとも１つの増殖因子の存在の関数として、該ＮＳ−ＩＣの増殖を決定する工程であって、ここで、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える少なくとも１つの増殖因子を含有していると予想される組成物と接触させていないＮＳ−ＩＣの増殖と比較した場合に、変化したＮＳ−ＩＣの増殖は、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える増殖因子の組成物中の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
（項目４３） 前記増殖因子が神経生存因子である、項目４２に記載の方法。
（項目４４） 哺乳動物への移植のための、ニューロスフェアを開始し得る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団の、使用。
（項目４５） 前記集団が、培養培地中で増殖させられた、項目４３に記載の使用。
（項目４６） 前記集団が、フローサイトメトリーによって選択された、項目４３に記載の使用。
（項目４７） 前記集団が、単離されたＮＳ−ＩＣを含む、項目４３に記載の使用。
（項目４８） 前記移植が、中枢神経系に対してである、項目４３に記載の使用。
（項目４９） 前記移植が、哺乳動物の中枢神経系の外側の領域に対してである、項目４３に記載の使用。
（項目５０） 中枢神経系の障害のための医薬品の製造における、ニューロスフェアを開始し得る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団の、使用。
（項目５１） 造血性障害のための医薬品の製造における、ニューロスフェアを開始し得る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団の、使用。
【０００８】
本発明の１つの実施形態に従って、非造血性の幹細胞および始原細胞（好ましくは、ＮＳ−ＩＣを含有しているＣＮＳの神経幹細胞、および始原細胞）の富化された集団、およびこのような細胞を同定、単離、または富化するための方法は、少なくとも１つの幹細胞もしくはＮＳ−ＩＣ、または始原細胞を含有している細胞の集団を、ＡＣ１３３抗体によって認識される表面マーカーの糖タンパク質抗原（「ＡＣ１３３抗原」）に結合する試薬と接触させることによって達成される。好ましい実施形態においては、試薬は、ＡＣ１３３抗体である（ＡＣ１３３抗体は、あるいは、「５Ｆ３」と本明細書中で呼ばれる）。次いで、免疫選択（例えば、ＦＡＣＳ）のような細胞の選別のための伝統的な技術の使用によって、試薬とＡＣ１３３抗原との間での接触が検出される細胞の、同定、単離、および／または富化が可能になる。
【０００９】
別の実施形態においては、本発明は、本明細書中で５Ｅ１２と呼ばれる、新規の抗体を提供する。この抗体は、非造血性の幹細胞および始原細胞（好ましくは、ニューロスフェアを開始し得る、ＣＮＳの神経幹細胞および始原細胞）の富化された集団を提供するために使用され得、そして少なくとも１つの幹細胞ＮＳ−ＩＣ、または始原細胞を含有している細胞の集団をＡＣ１３３抗原以外の表面マーカーの糖タンパク質抗原に結合する５Ｅ１２抗体と接触させることによってこのような細胞について同定、単離、または富化する方法において使用され得る。
【００１０】
好ましい実施形態においては、本発明の細胞（好ましくは、ＣＮＳの神経幹細胞）は、ＣＤ４５およびＣＤ３４についての細胞表面マーカーを欠失しているとしてさらに特徴付けられる。
さらなる実施形態においては、本発明は、本明細書中で８Ｇ１と呼ばれる、新規の抗体を提供する。この抗体は、ＣＮＳの神経幹細胞の集団（８Ｇ１−／ｌｏとして特徴付けられる）とＣＮＳの始原細胞の集団（８Ｇ１＋として特徴付けられる）との間での部分選択を可能にするＣＤ２４を認識すると考えられている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＮＳ−ＩＣの増殖および分化を説明する図である。
【図２】図２は、ニューロスフェアの培養が、単一の細胞に選別された５Ｆ３＋細胞から開始され得ることを示す一連の写真である。
【図３】図３は、モノクローナル抗体５Ｅ１２を使用する細胞表面マーカーを使用する、ヒトのＣＮＳ神経幹細胞の単離を示す、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）データのドットプロットである。ｘ軸は、ＣＤ３４およびＣＤ４５に対する抗体についての細胞の染色を示す。ｙ軸は、５Ｅ１２抗体での細胞の染色を示す。
【図４】図４は、細胞表面マーカーによるヒトの神経幹細胞の単離を示す、ＦＡＣＳ選別データの２つのパネルのドットプロットである。ヒトの胎児の脳の細胞を、記載されているように酵素的に解離した。パネルＡは、５Ｆ３＋細胞が、５Ｅ１２抗体についての抗原を同時発現することを示す。パネルＢは、５Ｆ３＋細胞が、代表的には、８Ｇ１（ＣＤ２４）抗体についての抗原を発現しないことを示す。
【図５】図５は、妊娠週数の関数としての、胎児の脳中の５Ｆ３＋細胞の分布を示すチャートである。
【図６】図６は、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスへのヒトの神経細胞の移植の結果を示す、一連の写真である。
【図７】図７は、げっ歯類モデルに移植された場合に、５Ｆ３＋に選別された細胞の子孫が吻方の移動性の流れ（ＲＭＳ）を通じて移動することを示す、一連の写真である。
【図８】図８は、げっ歯類モデルに移植された場合に、５Ｆ３＋に選別された細胞の子孫が嗅球中に（ＲＭＳ）を通じて移動することを示す、一連の写真である。
【図９】図９は、ＡＣ１３３＋細胞の特徴を示す。図９Ａは、ＡＣ１３３の発現に基づく新しい胎児の脳細胞のフローサイトメトリーによる分離である。ヒトの胎児の脳細胞を、酵素的に解離した。細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＡＣ１３３に対するｍＡｂで染色し、そしてＡＣ１３３−画分およびＡＣ１３３＋画分に分離した。残りの造血性の細胞および内皮細胞を、ＣＤ４５−およびＣＤ３４−をそれぞれ通過させることによって、排除した。選別されたＡＣ１３３−（図９Ｂ）およびＡＣ１３３＋（図９Ｃ）のサブセットを、血清を含有していない培地中で培養し、そしてこれらの選別された細胞の増殖を、１５日間モニターした。
【図１０】図１０は、限界稀釈および単一の細胞の選別による、ＮＳ−ＩＣ活性の定量的な分析を示す。図１０Ａは、細胞選別後の限界稀釈分析による、ＮＳ−ＩＣ活性の定量的な分析である。選別された細胞を、ＦＡＣＳ−ＡＣＤＵによって９６ウェルプレート中に一連の限界細胞容量で配置した。図１０Ｂは、神経幹細胞／始原細胞のクローンの拡大を示す。ニューロスフェアは、胎児の脳から直接単離された単一の選別されたＡＣ１３３＋細胞に、または選別され／拡大された培養されたニューロスフェアに由来する単一のＡＣ１３３＋細胞に由来し得る。図１０Ｃは、クローンに由来するニューロスフェア細胞の分化能力を示す。単一の細胞に由来するニューロスフェアの子孫は、ニューロン（−チューブリン、緑）、および星状細胞（ＧＦＡＰ、赤）に分化され得る。
【図１１】図１１は、非神経形成性部位中のヒトの神経細胞の検出を示す。いくつかの場合においては、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの新生児の脳に注入されたヒトの神経細胞が、脳梁、大脳皮質、および小脳において検出された。
【図１２】図１２は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのＳＶＺ中に移植されたヒトのニューロスフェア細胞の子孫の、インビボでの長期間の増殖を示す。ＡＣ１３３＋に選別され／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞は、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側方の脳室に移植された。ヒトの細胞の移植片を、移植から７ヶ月後に分析した。図１２Ａは、成体のマウスの脳の模式図である。ヒトの細胞の移植片が評価された部位を、図に示す。ＳＶＺ、脳室下の領域；ＲＭＳ（吻方の移動性の流れ）。図１２Ｂは、ＳＶＺ中でのヒトの神経細胞の検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核抗原（ＦＩＴＣ、緑）およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した。図１２Ｃは、ＳＶＺ中での増殖しつつあるヒトの神経細胞の検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核抗原（ＦＩＴＣ、緑）、Ｋｉ６７（Ｃｙ−３、赤）、およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した。ＳＶＺ中のヒト核抗原ポジティブ細胞のほとんどはまた、増殖マーカーであるＫｉ６７を同時発現した。
【図１３】図１３は、ＲＭＳおよび嗅球に移植されたヒトのニューロスフェア細胞の、インビボでの移動および分化を示す。ＡＣ１３３＋に選別され／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞を、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤの側方の脳室に移植した。ヒトの細胞の移植片を、移植から７ヶ月後に分析した。図１３Ａは、ＡＣ１３３＋選別され／拡大されたニューロスフェア細胞の子孫がＲＭＳを通じて移動することを示す。ＲＭＳにおいては、ヒト核抗原＋細胞の整列もまた、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２３４カウンター染色でポジティブ（ピンク）であった（ｉ）。ＲＭＳ中のヒトの核抗原ポジティブ細胞（Ｃｙ−３、赤）は、β−チューブリンの発現（Ａｌｅｘｉａ ４８８、緑）と共局在化された（ｉｉ）。これらの細胞のいくつかは、明らかに二重ポジティブであった（ｉｉ、矢印）。別の切片においては、ＲＭＳ中の細胞を、ヒト特異的Ｎ−ＣＡＭ（ＦＩＴＣ、緑）およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した（ｉｉｉ）。図１３Ｂは、嗅球へのヒトの神経細胞の移動および分化を示す。嗅球においては、ヒト核抗原ポジティブ細胞は、嗅球の糸球体層中に分布された（ｉおよびｉｉ）。いくつかの場合においては、ヒトのＮ−ＣＡＭ＋ニューロン細胞を検出した（ｉｉｉ）。
【図１４】図１４は、海馬の歯状回中に移植されたヒトのニューロスフェア細胞の子孫の、インビボでの長期間の増殖および分化を示す。ＡＣ１３３＋によって選別され／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞を、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側方の脳室に移植した。ＡＣ１３３＋に選別され／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞の新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側方の脳室への移植の７ヶ月後に、増殖しているヒトの細胞が、海馬において見出され得る。図１４Ａは、歯状回の顆粒状の領域の下での増殖しているヒトの神経細胞の検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核（ＦＩＴＣ、緑）、Ｋｉ６７（Ｃｙ−３、赤）、およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した。いくつかのヒト核抗原＋細胞を、Ｋｉ６７で同時に染色した（矢印）。図１４Ｂは、歯状回でのヒトのニューロンの検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核抗原（Ｃｙ−３、赤）、および抗チューブリン（Ａｌｅｘｉａ４８８、緑）で染色した。２つのヒト核抗原ポジティブ細胞の１つもまた、抗チューブリンについてポジティブであった（矢印）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
細胞の集団は、成体の中枢神経系（ＣＮＳ）中に存在する。これは、成体のＣＮＳの分化した成熟細胞の表現形を自己更新し、そしてそれを生じるそれらの能力において、幹細胞の特性を示す。これらの幹細胞は、ＣＮＳを通じて見出され、そして特に、脳室下の領域、および海馬の歯状回において見出される。
【００１３】
増殖因子応答性の幹細胞は、中枢神経軸の多くの領域から、そしてマウス、げっ歯類、およびヒトのＣＮＳ組織の発達の異なる段階で、単離され得る。これらの細胞は、ＥＧＦ、塩基性のＦＧＦ（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）、および形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）のような増殖因子に対するそれらの応答において変化し、そして長期間、分化していない状態で培養物中で維持され、そして拡大され得る。成体および胚性のマウスの始原細胞の両方が、ＥＧＦに対して応答し、そして未分化の細胞のスフェアとして増殖した。これらの細胞は、それらが多能性である点で幹細胞の特徴を示し、そして血清を含有している条件下では、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化し得、ＥＧＦの投与下では未分化のままでありそして増殖し続ける部分集団を維持する。マウスのＥＧＦ応答性の始原細胞は、インビトロでＥＧＦレセプターについてのｍＲＮＡを発現する。ヒトのＣＮＳの神経幹細胞培養物はもまた、同定された。ヒトを含む哺乳動物の神経幹細胞培養物（懸濁培養物または付着培養物のいずれかとして）の同定、培養、増殖、および使用は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号（両方とも、本明細書中で参考として援用される）に開示されている。同様に、Ｊｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号（本明細書中で参考として援用されている）は、付着ＣＮＳ神経幹細胞培養物について言及している。懸濁物中で培養された場合には、ＣＮＳの神経幹細胞培養物は、代表的には、ニューロスフェアを形成する。
【００１４】
図１は、ＮＳ−ＩＣがニューロスフェアに発達し、そして続いてニューロンおよびグリアの表現形への分化、ならびにＮＳ−ＩＣの子孫の生成に発達するような、ＮＳ−ＩＣの増殖を示す。１つ以上の増殖を誘導する増殖因子の存在下では、ＮＳ−ＩＣは分裂し、そしてさらなる幹細胞および始原細胞から構成される未分化の細胞のスフェア（「ニューロスフェア」）を生じる。クローンに由来するニューロスフェアが解離させられ、そして単一の細胞として、１つ以上の増殖を誘導する増殖因子の存在下に置かれる場合には、それぞれのＮＳ−ＩＣが新規のニューロスフェアを生じ得る。単一のニューロスフェアの細胞は、天然においてはクローンである。なぜなら、これらは、単一の神経幹細胞の子孫であるからである。ＥＧＦなどのような増殖を誘導する増殖因子の持続的な存在下では、ニューロスフェア中の前駆細胞は分裂し続け、それによって、ニューロスフェアの大きさの増大を生じ、そして多数の未分化の神経細胞を生じる。ニューロスフェアは、グリア筋原線維の酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；星状細胞についてのマーカー）、神経フィラメント（ＮＦ；ニューロンについてのマーカー）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；ニューロンについてのマーカー）、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；稀突起神経膠細胞についてのマーカー）に対しては免疫反応性ではない。しかし、ニューロスフェア中の細胞は、未分化のＣＮＳ細胞の多くの型において見出される中間体フィラメントタンパク質であるネスチンについて免疫反応性である（Ｌｅｈｎｄａｈｌら、６０、Ｃｅｌｌ ５８５−５９５（１９９０）、本明細書中で参考として援用される）。Ｒａｔ４０１と呼ばれるラットの抗体を含む抗体が、ネスチンを同定するために利用可能である。ニューロスフェアが、分化を可能にする条件下で培養される場合には、始原細胞は、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する。神経幹細胞の子孫に由来し得る分化した細胞型に関連する成熟表現形は、ネスチンの表現形については圧倒的にネガティブである。
【００１５】
未分化の、多能性の、自己更新する神経細胞に使用される専門用語は、これらの細胞が、「神経幹細胞」と本明細書中で呼ばれるように、展開される。神経幹細胞は、分裂することが可能であるクローン原性の多能性の幹細胞であり、そして適切な条件下では、ＮＳ−ＩＣについて自己更新する能力を有し、そして最終的にニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化し得るその子孫の娘細胞を含み得る。従って、神経幹細胞は、幹細胞の子孫が多数の分化の経路を有するので、「多能性」である。神経幹細胞は、自己維持することが可能であり、このことは、それぞれの細胞の分裂を伴って、１つの娘細胞もまた幹細胞に平均されることを意味する。
【００１６】
神経幹細胞の非幹細胞の子孫は、代表的には、「始原」細胞と呼ばれる。これは、１つ以上の系統において種々の細胞型を生じ得る。用語「神経の始原細胞」は、神経幹細胞に由来する未分化の細胞をいい、そして幹細胞自体ではない。いくつかの始原細胞は、１つより多くの細胞型に分化し得る子孫を生じ得る。例えば、Ｏ−２Ａ細胞は、グリア始原細胞である。これは、稀突起神経膠細胞およびＩＩ型星状細胞を生じ、従って、「二官能性の」始原細胞と呼ばれ得る。始原細胞の識別特性は、幹細胞とは異なり、それが自己維持を示さないこと、そして代表的には、分化の特定の経路を約束されていないと考えられ、そして最終的には、適切な条件下で、グリアまたはニューロンに分化する。
【００１７】
用語「前駆細胞」は、神経幹細胞の子孫をいい、従って、始原細胞および娘神経幹細胞の両方を含む。
【００１８】
（細胞マーカー）本発明は、ニューロスフェアを形成し得る（ＮＳ−ＩＣ）神経幹細胞の、同定、単離、富化、および培養を提供する。ＮＳ−ＩＣは、ＮＳ−ＩＣの表面上に見出される抗原の、細胞表面抗原を特異的に結合する試薬への結合を通じて同定されるか、または選択される。
【００１９】
これらの抗原の１つは、ＡＣ１３３モノクローナル抗体に結合する抗原である。ＡＣ１３３抗体（本明細書中では、５Ｆ３抗体と呼ばれる）は、プロミニンと呼ばれるヒトの細胞マーカーを認識する試薬の抗体の実施形態の例である。プロミニンは、種々の上皮細胞中で発現される多局所性（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ）膜タンパク質である（Ｗｅｉｇｍａｎｎら、９４（２３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１２４２５−３０（１９９７）；Ｃｏｒｂｅｉｌら、１１２（Ｐｔ７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２３−３３（１９９９）；Ｃｏｒｂｅｉｌら、９１（７）Ｂｌｏｏｄ ２６２５−６（１９９８）；Ｍｉｒｉｇｌｉａら、９１（１１）Ｂｌｏｏｄ ４３９０−１（１９９８））。種々のＡＣ１３３抗体が、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８４３，３３３号に記載されている。マウスのハイブリドーマ細胞株ＡＣ１３３の寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍｄ．２０８５２に、１９９７年４月２４日に行われ、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３４６が与えられた。これらのＡＣ１３３抗体は、本発明の目的のヒト細胞のサブセットについて免疫選択され得る。好ましいＡＣ１３３モノクローナル抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）から商業的に得られ得る。これには、ＡＣ１３３／１−ＰＥ抗体（Ｃａｔ＃８０８−０１）およびＡＣ１３３／２−ＰＥ抗体（Ｃａｔ＃８０９−０１）が含まれる。ＭＡＣＳ分離については、モノクローナル抗体の５０：５０混合物が好ましい。ＡＣ１３３発現の高い組織特異性は、高度に精製されたＮＳ−ＩＣ集団についての富化の間に特に有利である。
【００２０】
５Ｅ１２は、酵素的に解離させられたヒトの胎児の脳細胞に対して生成された新規のモノクローナル抗体である。５Ｅ１２モノクローナル抗体は、Ｙｉｎ、米国特許第５，８４３，６３３号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている対側性の（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）免疫化方法に実質的に従って生成された。５Ｅ１２が結合する抗原は、推定のＭＷ１２５ｋＤを有し、そしてプロミニンに由来する別の抗原であると、現在考えられている。
【００２１】
ＣＤ４５は、Ｔ２００／白血球共通抗原である。ＣＤ４５に対する抗体は、市販されている。好ましい実施形態においては、本発明の細胞およびそれらを含有している培養物は、ＣＤ４５のような細胞表面マーカーを欠失しているとして（プロミンポジティブであることに加えて）さらに特徴付けられる。
【００２２】
ＣＤ３４もまた、ｇｐ１０５−１２０として公知である。ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体は市販されており、そしてＣＤ３４モノクローナル抗体は、研究のため、および臨床的な骨髄移植のために、リンパ造血性幹細胞／始原細胞を定量および精製するために使用されている。
【００２３】
モノクローナル抗体８Ｇ１は、ＣＤ２４を認識する（ＣＤ２４に対する抗体は市販されている）と考えられ、そして、５１５キロダルトン（細胞型の制限されたスペクトルにおいて発現されるヒトのＬＲＰ／Ａ２ＭＲの鎖）と特異的に反応する。強力な免疫組織化学的反応が、肝細胞、組織マクロファージ、中枢神経系におけるニューロンおよび星状細胞のサブセット、繊維芽細胞、平滑筋細胞、ならびに動脈壁中のアテローム性動脈硬化症の病変中の単球に由来する泡沫細胞において見られる。抗体はまた、慢性および球性の白血病（ＣＤ９１）の骨髄単球性サブタイプのサブセットの特徴付けに使用され得る。ＣＤ９１に対する抗体は市販されている。
【００２４】
（細胞の蓄積）５Ｅ１２．５および８Ｇ１．７被検培養物は、特許および登録商標の特許庁長官によって決定されたものに対して、米国特許法施行規則§１．１４および米国特許法§１２２のもとでそれに対して権利を与えられた、それらを開示する特許出願の系属中に、利用可能である培養物に入手することを確実にする条件下で、寄託される。寄託物は、本出願の相当部分、またはその子孫が提出された国の外国の特許法によって必要とされる場合は、入手可能である。しかし、寄託物の利用可能性は、政府による指令によって特許権を与えられた特例において、本発明の実施のための特許使用権は構成しない。
【００２５】
さらに、５Ｅ１２．５および８Ｇ１．７の本発明の培養寄託物は、微生物の寄託についてのブダペスト条約の規則に従って、公に保存され、そして利用可能にされる。すなわち、これらは、寄託の日から少なくとも３０年間、またはこの培養物を開示している発行し得る任意の特許の施行可能期間および寄託物のサンプルについての最新の請求後５年間の間、それらを生存可能かつ未混入の状態で維持するために必要な全ての注意を伴って保存される。寄託者は、寄託物を後継する義務を認識し、寄託機関は、寄託物の状態に起因して、請求された場合にサンプルを提供することが可能でないべきである。本発明の培養寄託物の公に対する入手可能性の全ての制限は、これらを開示する特許の認可に際して確定的に排除される。
【００２６】
（細胞の単離、富化、および選択）ＮＳ−ＩＣが単離される細胞の集団は、神経組織であり得、細胞の集団は、神経組織または細胞培養物中の細胞の集団（例えば、ニューロスフェア培養物中の細胞、または接着性神経幹細胞培養物中の細胞）から解離される。
【００２７】
本発明は、ＮＳ−ＩＣの単離および同定を提供する。ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）の同定は、神経細胞の集団（または神経細胞もしくは神経に由来する細胞を含有している集団）にＡＣ１３３抗原に結合する試薬を接触させる工程、およびＡＣ１３３抗原に結合する試薬と細胞表面上のＡＣ１３３抗原との間の接触を検出する工程を包含する。試薬が結合するこれらの細胞は、ＮＳ−ＩＣとして同定される。これらの細胞の同定は、これら細胞が実際に、ニューロスフェアの開始、自己再生および多能性が可能であるＮＳ−ＩＣであることを実証するアッセイによって確認され得る。
【００２８】
本発明の方法はまた、ＡＣ１３３抗体を使用して、ＡＣ１３３―細胞からＡＣ１３３＋細胞を単離するために使用され得る。これは、ＮＳ−ＩＣの画分を含有する神経細胞の集団を、ＡＣ１３３抗原に特異的に結合する試薬と混合し、次いで、ＡＣ１３３＋細胞についてＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣにおいて富化された選択された集団を生じる。選択することにより、それによって、選択前の神経細胞の集団と比較した場合に、
従って、本発明はさらに、神経組織または神経幹細胞培養物（例えば、ニューロスフェア懸濁培養物または神経幹細胞接着性培養物）由来のＮＳ−ＩＣの富化を提供する。従って、本発明は、幹細胞および始原細胞が低頻度で生じるか、あるいは枯渇され得る神経組織（例えば、後期胚、若年性組織、および成体組織）に由来するＮＳ−ＩＣの富化に有用である。当業者は、ＮＳ−ＩＣの画分を含有している神経細胞の集団をＡＣ１３３抗原に特異的に結合する試薬と混合し；そしてＡＣ１３３＋細胞を選択し得る。この方法において、選択されたＡＣ１３３＋細胞は、神経細胞の集団と比較した場合に、そのＮＳ−ＩＣの画分において富化される。
【００２９】
細胞の選択は、フローサイトメトリー（例えば、蛍光色素結合体化ＡＣ１３３抗体を使用する蛍光活性化細胞選別による）を含む、当該分野で公知の任意の適切な手段により得る。選択はまた、磁性粒子に結合体化されたＡＣ１３３抗体を使用する、高勾配磁気的選択により得る。固相への接着および固相からの脱接着を含む任意の他の適切な方法もまた、本発明の範囲内で意図される。
【００３０】
当業者は、ＡＣ１３３抗体を使用する免疫選択によって細胞の集団を誘導し得る。細胞の集団は、少なくとも３０％のＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣ、好ましくは、少なくとも５０〜７０％のＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣ、そしてより好ましくは、９０％以上のＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣを含むはずである。最も好ましくは、ＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣの実質的に純粋な集団であり、これは、少なくとも９５％のＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣを含む。得られ、そして実際に使用される富化の程度は、選択の方法、増殖の方法、およびニューロスフェアの開始のために培養物中に配置される細胞の細胞用量を含む、多数の因子に依存する。
【００３１】
細胞の集団は、後期胚、若年性または成体の哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）組織から誘導され得るか、あるいは、Ｗｅｉｓｓ、米国特許第５，７５０，３７６号またはＪｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号に記載されているような、神経幹細胞の既存の培養物から誘導され得る。最も好ましい実施形態においては、ＮＳ−ＩＣはヒトである。いくつかの実施形態においては、集団中のＡＣ１３３＋細胞は、内皮細胞に複合体化され得る。
【００３２】
富化されたＡＣ１３３＋ＮＳＩＣの集団を含有している本明細書中で記載されるインビトロでの細胞培養物は、一般的には、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）についてポジティブであり、そして分化を誘導する条件の存在下で、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する始原細胞を生じる点で、特徴付けられる。
【００３３】
当業者は、単離されたＡＣ１３３＋細胞を培養培地に導入し得、培養物中で単離されたＡＣ１３３＋細胞を；特に、ニューロスフェアとして増殖させ得；単離されたＡＣ１３３＋細胞がニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する条件下でこの単離されたＡＣ１３３＋細胞の子孫を培養し得；次いで、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞の存在を検出し得る。ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞の存在は、単離されたＡＣ１３３＋細胞をＮＳ−ＩＣとして特徴付ける。
【００３４】
代表的には、ＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣは、ニューロスフェアの成長および増殖を可能にする培地中で培養される。単離されたＡＣ１３３＋細胞が増殖する培養物は、多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するために有効な１つ以上の予め決定された増殖因子を含有する無血清培地であり得る。培養培地は、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２；ｂＦＧＦ）、またはそれらの組合せから選択される増殖因子で補充され得る。培養培地は、神経生存因子（ＮＳＦ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＡ）でさらに補充され得る。ＡＣ１３３＋細胞がニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する条件は、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２またはＬＩＦを含有しないウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培養培地中で、ラミニンでコーティングされた表面上でＡＣ１３３＋細胞の子孫を培養し得る。
【００３５】
本発明はまた、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える増殖因子の存在を同定するための方法を提供する。当業者は、ＮＳ−ＩＣを含有する組成物と、ＮＳ−ＩＣの増殖をもたらす少なくとも１つの増殖因子を含有することが予想される組成物を混合し、次いで、ＮＳ−ＩＣの増殖を決定組成物の存在の関数として決定する。変更された（増大した、減少したなど）ＮＳ−ＩＣの増殖は、ＮＳ−ＩＣの増殖をもたらす増殖因子の組成物中の存在を示す。次いで、当業者はさらに、増殖因子を同定し得る。
【００３６】
（ＡＣ１３３に対する抗体）ＡＣ１３３に対する抗体は、米国特許第５，８４３，６３３号（本明細書中で参考として援用されている）において議論されているように、入手され得るかまたは調製され得る。ＡＣ１３３抗原は、種々のＡＣ１３３モノクローナル抗体（これは、ＡＣ１３３抗原に対して特異性を有する）のような抗体と接触させられ得る。ＡＣ１３３抗体は、還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるウェスタンブロット条件下でＡＣ１３３タンパク質に結合することによって特徴付けられる。ＡＣ１３３抗原は、市販のスタンダードに基づいて、約１１７ｋＤａの範囲の分子量を有する。ＡＣ１３３抗原は、ヒト骨髄、胎児骨髄および肝臓、臍帯血、ならびに生体の末梢血に由来する始原細胞のサブセット上で発現される。
【００３７】
ＡＣ１３３抗原に対する抗体は、異種免疫応答性を有する哺乳動物宿主（マウス、げっ歯類、ウサギ目、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む）を、ヒト始原細胞で免疫することによって得られ得る。特定の宿主の選択は、主に簡便なものであり得る。免疫化のために適切な始原細胞の集団は、サイトカインが動員された末梢血、骨髄、胎児臓肝臓などからＣＤ３４＋細胞を単離することによって得られ得る。免疫化のために適切な始原細胞の集団は、ＣＮＳ神経幹細胞または他のＮＳ−ＩＣから得られ得る。免疫化は、細胞が、皮下、筋肉内、腹膜内、脈管内などで注射され得る、従来技術に従って行われる。通常は、約１０６から１０８個までの細胞が、使用される。これは、１回以上の注射に分けられ得、通常は、約８回以下の注射に分けられ、約１から３週間までの期間にわたる。注射は、例えば、アジュバント（完全または不完全フロイトアジュバント、スペコール（ｓｐｅｃｏｌ）、ミョウバンなど）を伴って、または伴わずに行われ得る。
【００３８】
免疫化スケジュールの完了後、抗血清は、始原細胞の表面膜タンパク質（ＡＣ１３３抗原を含む）に特異的な多角形（ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）の抗血清を提供するための従来の方法に従って、回収され得る。リンパ球は、適切なリンパ系組織（例えば、脾臓、流入領域リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）など）から回収され、そして適切な融合パートナー（通常は、骨髄腫株）と融合され、それによって特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生する。目的の抗原特異性についてのハイブリドーマのクローンのスクリーニングは、従来の方法に従って行われる。
【００３９】
ＡＣ１３３抗体は、通常の多量体構造の代わりに、単鎖として産生され得る。単鎖抗体は、Ｊｏｓｔら、２６９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２６７−７３（１９９４）（本明細書中で参考として援用されている）などに記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、グリシンまたはセリンを含む、少なくとも約４個のアミノ酸の小さい中性のアミノ酸をコードするスペーサーに対して連結される。この融合体によってコードされるタンパク質は、元々の抗体の特異性および親和性を保持する機能的な可変領域のアセンブリを可能にする。
【００４０】
ＡＣ１３３抗体は、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ ｃＤＮＡの使用によって産生され得る（Ｌｉｕら、８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３４３９（１９８７）および１３９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５２１（１９８７）（本明細書中に参考として援用されている））。ｍＲＮＡは、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、そしてｃＤＮＡを産生するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特異的プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得る（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）。あるいは、ライブラリーを作製し、そして目的の配列を単離するためにスクリーニングする。次いで、この抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列が、ヒトの定常領域配列に対して融合される。ヒトの定常領域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）に見出され得る。ヒトＣ領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手可能である。次いで、キメラのヒト化抗体が、従来の方法によって発現される。
【００４１】
ＡＣ１３３抗体は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂのような抗体フラグメントとして産生され得る。抗体フラグメントは、インタクトなタンパク質の切断によって（例えば、プロテアーゼによるか、または化学的な切断による）調製され得る。あるいは、短縮型の遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、それに続く翻訳終止コドンを含み、短縮の分子を生じる。
【００４２】
（免疫染色）生物学的サンプルは、対象の抗体によって結合された表面分子を発現する細胞の存在についての任意の従来のイムノアッセイ方法によって、ＡＣ１３３＋細胞の存在についてアッセイされる。アッセイは、細胞の溶解物、インタクトな細胞、凍結切片などについて行われ得る。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）から入手可能な抗体は、細胞の直接的な免疫蛍光染色に適切である。
【００４３】
（細胞の選別）ＮＳ−ＩＣ細胞に対する細胞表面抗原の使用は、始原細胞集団のポジティブな免疫選択ならびにフローサイトメトリーを使用する始原細胞集団の表現型分析のための手段を提供する。ＡＣ１３３抗原の発現について選択された細胞は、さらに、他の幹細胞および始原細胞マーカーについての選択によって精製され得る。
【００４４】
実質的に純粋な始原細胞および幹細胞の調製のために、始原細胞のサブセットが、ＡＣ１３３結合に基づいて他の細胞から分離される。始原細胞および幹細胞は、当該分野で公知の他の表面マーカーに結合させることによって、さらに分離され得る。
【００４５】
分離のための手順は、磁気的分離（抗体でコーティングされた磁性ビーズを使用する）、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリクス（例えば、プレート）に結合された抗体での「パニング」、または他の従来技術を含み得る。正確な分離を提供する技術として、蛍光活性化細胞選別機が挙げられる。これは、複数の色のチャネル、鋭角および鈍角の光の散乱を検出するチャネル、インピーダンスチャネルなどのような、種々の程度の精巧性を有し得る。死細胞は、死細胞に関連する色素（ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］、ＬＤＳ）での選択によって排除され得る。選択された細胞の生存性について過度に有害でない任意の技術が、使用され得る。
【００４６】
簡便には、抗体は、特定の細胞型の分離を容易にすることを可能にするための標識（例えば、磁性ビーズ；ビオチン（これは、アビジンまたはストレプトアビインに対して高い親和性を有して結合する）；蛍光色素（これは、蛍光活性化細胞選別機とともに使用され得る）；ハプテンなど）と結合体化され得る。多色分析は、ＦＡＣＳとともに、または免疫磁気的分離とフローサイトメトリーとの組合せにおいて使用され得る。多色分析は、複数の表面抗原（例えば、ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−、ＡＣ１３３ーＣＤ３４＋など）に基づく細胞の分離のために関心深い。多色分析における使用を見出されている蛍光色素として、フィコビリンタンパク質（例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン）；フルオレセイン、およびテキサスレッドが挙げられる。ネガティブな指示は、染色のレベルが、アイソタイプ適合ネガティブコントロールの明るさ以下であることを示す。かすかな指示は、染色のレベルが、ネガティブの株のレベルに近く得るが、またアイソタイプ適合コントロールよりも明るくあり得ることを示す。
【００４７】
１つの実施形態においては、ＡＣ１３３抗体は、磁性試薬（例えば、超常磁性微粒子（微小粒子）に対して直接的または間接的に結合体化される。磁性粒子への直接的な結合体化は、当該分野で公知の種々の化学連結基の使用によって達成される。抗体は、側鎖のアミノ基またはスルフヒドリル基、ならびにヘテロ官能性の交差連結試薬を介して、微粒子にカップリングされ得る。多数のヘテロ官能性の化合物が、実体への連結のために利用可能である。好ましい連結基は、抗体上の反応性スルフヒドリル基および磁性粒子上の反応性アミノ基を用いる、３−（２−ピリジジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）である。
【００４８】
あるいは、ＡＣ１３３抗体は、磁性粒子に対して間接的にカップリングされる。この抗体は、ハプテンに対して直接的に結合体化され、そしてハプテン特異的な第２段階の抗体が、粒子に結合体化される。適切なハプテンとして、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。タンパク質へのハプテンの結合体化のための方法（すなわち、当該分野で公知である）、およびこのような結合のためのキットは、商業的に入手可能である。
【００４９】
この方法を実行するために、ＡＣ１３３抗体が細胞のサンプルに対して添加される。特定の細胞のサブセットに対して結合するために必要なＡＣ１３３ Ａｂの量は、試験分離および分析を実行することによって経験的に決定される。細胞およびＡＣ１３３抗体は、複合体が形成させるために十分な時間（通常は少なくとも５分間、より通常は少なくとも１０分間、そして通常は１時間以下、より通常は約３０分以下）でインキュベートされる。
【００５０】
さらに、細胞は、始原細胞または幹細胞上に存在するかまたは存在しないことが公知である細胞表面マーカーに対して特異的な抗体または結合分子とともにインキュベートされる。
【００５１】
標識された細胞は、特異的な抗体の調製に従って分離される。蛍光色素で標識された抗体は、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気的選択（特に、高勾配の磁気的選択（ＨＧＭＳ））のための磁性粒子などに有用である。例示的な磁気的分離デバイスは、ＷＯ９０／０７３８０、ＰＣＴ／ＵＳ９６／００９５３、およびＥＰ４３８，５２０に記載されている。ＡＣ１３３ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）は、ＡＣ１３３＋細胞のポジティブ選択のために使用され得る。このキットは、ＡＣ１３３＋細胞の単一の工程での単離のためのツールを提供する。ＡＣ１３３ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、ＦｃＲブロック試薬（ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）およびモノクローナルマウス抗ヒトＡＣ１３３抗体に結合体化されたＭＡＣＳコロイド状マイクロビーズ（ＭＡＣＳ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）を含む。
【００５２】
精製された細胞の集団は、任意の適切な培地中に回収され得る。ダルベッコ改変イーグル培地（ｄＭＥＭ）、ハンクス塩基性塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）などを含む、種々の培地が商業的に入手可能であり、そして使用され得る。これらはしばしば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などで補充される。
【００５３】
ヒトの始原細胞または幹細胞について高度に富化された集団は、この様式において達成される。所望される細胞は、３０％以上の細胞の組成物であり、好ましくは、５０％以上の細胞集団、より好ましくは、９０％以上の細胞集団であり、そして最も好ましくは、９５％以上（実質的に純粋な）の細胞集団である。
【００５４】
（精製された幹細胞／始原細胞の使用）ＡＣ１３３＋幹細胞／始原細胞が、種々の方法において有用である。ＡＣ１３３＋細胞は、その細胞が疾患または損傷によって失われた宿主を再構成するために使用され得る。細胞に関連する遺伝的な疾患は、遺伝的な欠損を修正するか、または疾患に対して防御するように処置するために、自己幹細胞または同種異系幹細胞の遺伝的改変によって処置され得る。あるいは、正常な同種異系の始原細胞が移植され得る。ホルモン、酵素、増殖因子などの特定の分泌された生成物の欠損に関連する、細胞に関連する疾患以外の疾患もまた、処置され得る。ＣＮＳ障害は、神経変性性の疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、急性脳損傷（例えば、発作、頭部の損傷、脳性麻痺）、および多数のＣＮＳ不全（例えば、うつ病、てんかん、および精神分裂病）のような多数の苦痛を含む。最近の数年間においては、神経変性性の疾患は、これらの障害についてのもっとも大きな危険性を有する高齢者の集団が増大しつつあることに起因して、重要な関心となっている。アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病を含むこれらの疾患は、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の変性に関連しており、これによって、これらの細胞または脳領域が、それらの意図される機能を実行することを不可能にする。特異的な異なる増殖因子による１つ以上の選択された系統への成熟、増殖、および分化を提供することによって、始原細胞は、約束された細胞の供給源として使用され得る。ニューロスフェアはまた、種々の血液細胞型（骨髄性細胞およびリンパ系細胞、ならびに初期の造血細胞を含む）を産生するためにも使用され得る（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、２８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ５３４（１９９９）（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。
【００５５】
ＡＣ１３３＋細胞もまた、細胞の分化および成熟に関連する因子の単離および評価において使用され得る。従って、細胞は、培地（例えば、馴化培地）の活性を決定するためのアッセイ、増殖因子活性、系統の専門性（ｄｅｄｉｃａｔｉｏｎ）との関係などについて、体液を評価するためのアッセイなどにおいて使用され得る。
【００５６】
ＡＣ１３３＋細胞は、液体窒素温度で凍結させられ得、そして長期間貯蔵され得、融解され得、そして再度使用され得る。細胞は、通常は、５％のＤＭＳＯおよび９５％のウシ胎児血清中で保存される。一旦融解されると、細胞は、幹細胞の増殖および分化に関連する増殖因子または間質細胞の使用によって、拡大され得る。
【００５７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために示される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような、本発明の範囲を限定するようには決して解釈されないべきである。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
（ＡＣ１３３磁気的細胞選別（ＭＡＣＳ）でポジティブ選択された胎児脳細胞は、ニューロスフェア惹起細胞（ＮＳ−ＩＣ）活性を含む）
ＡＣ１３３＋細胞は、以下の方法によって調製される：ヒト胎児脳（ＦＢＲ１０〜２０妊娠週数［「ｇ．ｗ．」］）を、インフォームドコンセントを得た後で、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，ＩＮＣ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）から得た。ヒト胎児脳組織をメスを使用して１〜３ｍｍの立方体の切片に切断し、５０ｍＬの遠心分離チューブ中に移し、そして０．０２％のＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で１回洗浄した。組織を、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの存在下で３７℃で１時間酵素的に解離させた。細片および凝集物を、７０ミクロンのフィルターカップを通して細胞懸濁物を濾過することによって除去した。
【００５９】
ＡＣ１３３＋のヒト胎児脳細胞を、常磁性抗体マイクロビーズ、ＡＣ１３３／１ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃５０８−０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用することによって分離した。ＭＡＣＳ分離を、キットに添付されている説明書に基づいて行った。代表的なＡＣ１３３＋の単離物からの代表的なフローサイトメトリー性ＭＡＣＳ分離において、約４４％の細胞がＡＣ１３３＋ＣＤ４５−であり、一方、約２％がＣＤ３４＋であった（これらのＣＤ３４＋細胞は、精製されたＮＳ−ＩＣに複合体化された内皮細胞であった）。
【００６０】
上記の方法（１８ｇ．ｗ．の脳を使用する）によって得られたＡＣ１３３＋選択細胞は、なお異種であった。この細胞は、内皮細胞と複合体を形成する傾向にあった。内皮細胞を、ＣＤ３４＋またはＣＤ１０５＋として同定した。ＡＣ１３３
ＭＡＣＳ分離はまた、ＡＣ１３３＋細胞に関連するＣＤ３４＋内皮細胞を富化する（継代後、ＮＳ−ＩＣは複合体化した内皮細胞から分離し、そして精製されたＮＳ−ＩＣが得られ得る）。
【００６１】
ＡＣ１３３＋のＭＡＣＳ分離された細胞を、上記のように、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、およびＬＩＦを含有している培地の存在下で培養した。一般的には、初期の妊娠期間の胎児脳（５〜１２ｇ．ｗ．）に由来する細胞を、ＮＳ−ＩＣについて富化し、そして富化は、ニューロスフェア培養物を開始するためには必要ではなかった。一方、より高週齢の胎児脳サンプル（１６〜２０ｇ．ｗ．）に由来する細胞は、はるかに低いＮＳ−ＩＣ活性を含み、そしてニューロスフェア培養物を開始するために富化を必要とした。換言すると、ＡＣ１３３＋は、より妊娠期間の長いヒト脳組織からのＮＳ−ＩＣの富化に有用である。胎児脳（１８ｇ．ｗ．）に由来するＡＣ１３３＋のＭＡＣＳ分離された細胞は、ＮＳ−ＩＣ活性について富化されたが、一方、ＡＣ１３３＋のＭＡＣＳ分離を伴わない全ヒト胎児脳細胞（１８ｇ．ｗ．）は、ニューロスフェア培養物を開始しなかった。
【００６２】
ＡＣ１３３ ＭＡＣＳ細胞から樹立されたニューロスフェア細胞は、培養物中で約７日目以後に試験し、そしてウサギ抗ヒトネスチンポリクローナル抗体によって検出されたように、ネスチンを発現した。例えば、Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から入手可能であるニューロスフェア細胞の中でも、ＦＢＲ １０６９（１８ｇ．ｗ．）、およびＦＢＲ １０７０（２０ｇ．ｗ．）がネスチンを発現した。分化が誘導された場合は、ＡＣ１３３＋ＭＡＣＳ由来ニューロスフェア細胞は、ニューロンについてのβ−チューブリン染色および星状細胞についてのＧＦＡＰ染色によって検出されるように、ニューロンおよび星状細胞に分化し得る。この特定の分化アッセイにおいて、ニューロスフェア細胞を、１％のＦＢＳの存在下で、そしてＥＧＦ、ＦＧＦ−２、およびＬＩＦを含まない、ラミニンコーティングした表面上で培養した。
【００６３】
他の分化アッセイが、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞へのＮＳ−ＩＣの分化を誘導するために使用され得る。
【００６４】
（実施例２）
（ＡＣ１３３は長期間のニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）培養によって細胞上に発現される重要な細胞表面マーカーである）
長期間のニューロスフェア細胞の培養物である、８．５ ＦＢＲを、Ｃｙｔｏ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）から入手した。８．５ ＦＢＲニューロスフェア細胞は、比較的均質にＡＣ１３３を発現する。これらの８．５ＦＢＲ細胞はまた、Ｔｈｙ−１＋、ＣＤ１６６＋、およびＨＬＡ−ＤＲ＋でもある。基本的な培地としてＥｘ Ｖｉｖｏ １５を使用した場合は、高い割合のニューロスフェア培養が、１８ｇ．ｗ．に由来する初代の脳組織から開始された。従って、発達しつつあるニューロスフェア培養物中の細胞のＡＣ１３３＋画分を評価することが可能である。ＡＣ１３３＋細胞の割合は、ニューロスフェアの発達に伴って増大した。一旦、ニューロスフェア細胞が十分に確立されると、ニューロスフェアを形成する実質的に全ての細胞がＡＣ１３３を発現した。
【００６５】
（実施例３）
（ニューロスフェアを開始する細胞はモノクローナル抗体ＡＣ１３３、フローサイトメトリーによる細胞選別（ＦＡＣＳ）アプローチを使用して分離され得る）
この実施例の目的は、ＡＣ１３３＋細胞が多能性のＮＳＣ活性を有する脳中の唯一の細胞であるかどうかを試験することである。ヒトのＣＤ４５に対するｍＡｂを、胎児の組織中の血液細胞の混入物を除くために使用した。いくつかの場合においては、ヒトのＣＤ３４に対する抗体を、内皮細胞および内皮性の神経先祖複合体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）を排除するために使用した。従って、胎児の脳細胞を、ＣＤ４５−ＣＤ３４−と定義した。神経幹細胞および最初の先祖（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）活性を測定するために、ＮＳ−ＩＣアッセイを、所定の集団中のＮＳ−ＩＣの頻度を決定するために確立した。ＮＳ−ＩＣが稀であり、そしてＡＣ１３３抗原を均一に発現する場合には、ＮＳ−ＩＣを、ＡＣ１３３＋選択によって富化し得、そして他の画分においては同様に枯渇し得た。
【００６６】
（モノクローナル抗体の供給源）ＡＣ１３３抗原を、２つのｍＡｂ（ＡＣ１３３／１およびＡＣ１３３／２）によって定義した。これらの両方ともが、フィコエリトリンと結合している。これらはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を通じて入手可能である。抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびグリコフィリン（Ｇｌｙｃｏｐｈｒｉｎ）Ａ−ＦＩＴＣを、ＣＡＬＴＡＧ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＣｏｕｌｔｅｒ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）からそれぞれ入手した。抗ヒトアロフィコシアニン結合ＣＤ３４を、ＢＤＩＳ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手した。
【００６７】
（細胞調製物）ＦＢＲを、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼによって解離させ、そしてこれらはなお内皮性の先祖複合体を含んだ。これは、単一の細胞懸濁物中の候補のＮＳＣの単離を妨げた（内皮細胞はＣＤ４５＋である）。この内皮細胞−ＮＳ−ＩＣ複合体を解離させるために、上記のように処理したＦＢＲ細胞をさらに、１０〜１５分間、トリプシンで処理した。ＡＣ１３３抗原、ＣＤ４５抗原、およびＣＤ３４抗原は、トリプシン処理について耐性であったが、一方グリコフィリンＡは感受性であった。
【００６８】
トリプシン消化後、細胞を洗浄し、そしてＣＤ４５、グリコフィリンＡ、ＡＣ１３３、およびＣＤ３４に対するｍＡｂで染色した。免疫磁気性のビーズでの選択は使用しなかった。細胞を、氷上で２０〜６０分間インキュベートした。最後の洗浄後に、細胞を、１μｇ／ｍＬのよう化プロピジウム（ＰＩ）を含有しているＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した。標識した細胞を分析し、そして二重レーザーＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）で選別した。死亡した細胞を、それらのＰＩ染色特性によって分析から排除した。選別した後、選別した細胞の集団の純度を、ＦＡＣＳ再分析によってチェックした。ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−細胞（ＮＳ−ＩＣ、約５％の出発細胞）およびＡＣ１３３−ＣＤ４５−細胞（約８７％の出発細胞）の、選別の前および選別の後での代表的なＦＡＣＳプロフィールを行った。
【００６９】
（ＮＳ−ＩＣ活性はＡＣ１３３＋サブセットにおいては高度に富化されるが、ＡＣ１３３−サブセットにおいては高度には富化されない）ＦＢＲ細胞（代表的には、１６〜２０ｇ．ｗ．）を、代表的には、ＣＤ４５−ＣＤ３４−ＡＣ１３３−およびＣＤ４５−ＣＤ３４−ＡＣ１３３＋画分に選別した。有意なＮＳ−ＩＣ活性は、ＦＢＲ中のＣＤ４５＋またはＣＤ４５−ＣＤ３４＋の集団中には残っていなかった。
【００７０】
選別した細胞を、上記のニューロスフェア培地中で培養した。代表的には、Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５またはＥｘ Ｖｉｖｏ １５、Ｄ−ＭＥＭ、Ｆ−１２培地の組合せを、基本的な培地として使用した。ニューロスフェアの発達を最大にするために、選別した細胞を、代表的には、ＬＩＦ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、および神経生存因子ＮＳＦ（Ｃａｔ．ＣＣ−４３２３，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養した。
【００７１】
単一の細胞懸濁物を、細胞の選別後に得た。インビトロでの培養の４〜５日後に、ＡＣ１３３＋細胞は増殖を開始し、そして小さいニューロスフェアが培養の開始後８〜１０日で観察された。細胞は、ＮＳＦを伴わないＬＩＦ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦの存在下で培養した場合に、ニューロスフェアを開始し得た。ニューロスフェア培養物は、ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−またはＡＣ１３３＋ＣＤ４５―ＣＤ３４−に選別された４つのＦＢＲ組織（１８−２０ｇ．ｗ．）のうちの４つから開始した。
【００７２】
対照的に、ＡＣ１３３−ＣＤ４５−ＦＢＲ細胞を、ＬＩＦ、ＦＧＦ−２、およびＥＧＦの存在下で培養物中に配置した場合には、ごくわずかなニューロスフェアの形成が見られ、そして新しいフラスコに継代することはできなかった。さらにＮＳＦを増殖培地に添加した場合には、いくつかのニューロスフェアの開始が観察された。従って、ＡＣ１３３−ＣＤ４５−ＦＢＲ細胞を、ＮＳ−ＩＣの有意な量で枯渇させた。
【００７３】
（実施例４）
（ＮＳ−ＩＣ細胞について富化させるためのＡＣ１３３＋細胞の分離）
ＡＣ１３３＋細胞の分離は、組織に由来するＮＳ−ＩＣ細胞を富化させるために有効に使用され得る。さらに、ＡＣ１３３＋細胞の分離は、確立された調製物に由来するＮＳ−ＩＣについてさらに富化し得る。１つの試験においては、解離させられたニューロスフェア（Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）のＡＣ１３３＋細胞の選別は、大きく富化されたＮＳ−ＩＣ培養物を提供し、そして増大したニューロスフェアの確立を示す。この培養物を使用すると、それぞれのウェル中でニューロスフェアを開始するために必要とされる細胞用量（すなわち、１００％ポジティブ）は、３，０００〜１０，０００個の細胞から約３０個の細胞にまで減少させることができる（以下の表１を参照のこと）。
【００７４】
【表１】
表１に示すように、本明細書中で使用した（ｇ．ｗ．２０）富化していない新しい脳組織（「ＦＢＲ」）は、全てのウェル中でニューロスフェアを開始するための、３，０００から１０，０００個の間の細胞用量を必要とするそのような数で、ＮＳ−ＩＣを含み得る。本発明の方法を使用することによって、富化された集団を得ることができ、その結果、１，０００個またはそれ未満の細胞およびより好ましくは富化された集団の用量が必要とされ、その結果、１００個の細胞未満である細胞用量が必要とされる。表１に示すように、本明細書中では富化は、わずか約３０個の細胞の細胞用量がそれぞれのウェル中でのニューロスフェア培養物を確立するために１つのウェル当たりに必要とされるように、達成されている。表１はまた、集団をＡＣ１３３＋細胞中で枯渇させる場合（ＦＢＲ １１０４ ＡＣ１３３ｎｅｇ．に選択された細胞）には、これらの集団からのニューロスフェア培養物の確立が明らかに減少することを示す。
【００７５】
（定量的なＮＳ−ＩＣアッセイ）ＮＳ−ＩＣの存在についてアッセイするために、多能性のＮＳ−ＩＣを含有していると予想される細胞の集団を、クローンの発達に供する。細胞を、ニューロスフェアを形成するように増殖培地中で増殖させ、次いで、ニューロン、星状細胞、およびオリゴ樹状細胞を形成するように分化を誘導する。ニューロン、星状細胞、およびオリゴ樹状細胞の存在は、免疫染色によって示され得る。例えば、β−チューブリンの存在についてのニューロンの染色；ＧＦＡＰの存在についての星状細胞の染色；およびＯ４の存在についてのオリゴ樹状細胞の染色。
【００７６】
定量的なＮＳ−ＩＣアッセイを、精製していない組織細胞に対して、ＡＣ１３３＋に選別した細胞に対して、そしてクローンのニューロスフェア細胞株に対して行い得る。
【００７７】
（実施例５）
（ＮＳ−ＩＣの増殖および継代のための細胞培養培地）
Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号は、「多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するのに有効な１つ以上の予め決定された増殖因子を含有している培養培地」、および「分化を誘導する条件」を開示している。しかし、以下を含むが、これらに限定されない、異なる基本的な培地を使用し得る：
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；
Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；
神経先祖基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；または、
上記の基本培地の組合せ。
【００７８】
ヒトのニューロスフェア細胞を培養するための代表的な培地処方物を、表２に提供する。
【００７９】
【表２】
ＥＧＦを、培地を濾過した後に、ヒトのニューロスフェアについての１００ｍｌの基本培地に添加する。ＥＧＦは、培地中では比較的安定である、ＦＧＦ−２およびＬＩＦを、使用するために培地を準備するときに添加する。補充試薬の最終濃度は以下のとおりである：
５ｍｇ／ｍｌ インシュリン
１００ｇ／ｍｌ ヒトのトランスフェリン
６．３ｎｇ／ｍｌ プロゲステロン
１６．１ｎｇ／ｍｌ プトラシン（Ｐｕｔｒａｓｃｉｎｅ）
５．２ｎｇ／ｍｌ セレナイト
２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ
２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２
１０ｎｇ／ｍｌ ＬＩＦ
２ｇ／ｍｌ ヘパリン
２ｍＭ Ｌ−グルタミン
６ｍｇ／ｍｌ グルコース
培地処方物の最適化は、確立される初代の脳組織から開始される高い割合のニューロスフェアを可能にする。本発明者らは、Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５培地を好む。培地処方物の最適化もまた、より一定のニューロスフェアの増殖可能にする。ニューロスフェアの発達を最大にするためには、ＮＳ−ＩＣを、代表的には、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、および神経生存因子ＮＳＦ（Ｃａｔ．ＣＣ−４３２３，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養する。１つの試験においては、トリプシン処理したＦＢＲ １１０１神経細胞およびトリプシン処理したＦＢＲ １１０４神経細胞（Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の両方が、ＬＩＦ，ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、およびＮＳＦを有するＥｘ Ｖｉｖｏ １５培地中で培養した場合に、増大した増殖を示す。
【００８０】
（実施例６）
（細胞の選別による胎児の脳に由来するヒトの神経幹細胞の直接的な単離）
広範囲のニューロンを再生し得る高度に定義された移植可能なヒト細胞の大量の供給源は、神経退行性の障害の処置のための有効な治療用産物であり得る。ヒトの神経幹細胞（ＮＳＣ）の富化のための再現性のある方法を定義するために、本発明者らは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＮＳＣを同定しそして精製するための、ヒトの神経細胞の表面マーカーに対して指向されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開発し、そして使用した。ＦＡＣＳおよび免疫組織化学的分析に基づいて、２つのｍＡｂ（５Ｆ３および５Ｅ１２）を同定した。これらは、胎児の脳細胞の小さなサブセットを定義し、そしてＣＮＳ幹細胞を含有することが公知の部位である、脊髄（１２ｇ．ｗ．）の底板および上衣層中の細胞に対して特異的な反応性を提示した。これらのｍＡｂは、ＦＢＲ細胞の５％未満を染色し、そして長期間のニューロスフェアの培養物に由来する９５％以上の細胞がポジティブであった。
【００８１】
一例として、２つの細胞の集団（５Ｆ３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−（５Ｆ３＋）および５Ｆ３−ＣＤ３４−ＣＤ４５−（５Ｆ３−））を選別し、そしてニューロスフェアの培養を開始するそれらの能力について試験した。５Ｆ３＋サブセットは、ニューロスフェアを開始する細胞活性について高度に富化された；これらは、培養物中で８〜１０日までに小さいニューロスフェアを形成するように増殖した。対照的に、選別された５Ｆ３−細胞は、単細胞懸濁物のままであり、ニューロスフェアを開始できず、そして最終的に死亡した。拡大した５Ｆ３＋に選別されたニューロスフェア細胞は、ネスチンの発現についてポジティブであり、そして分化条件への曝露後に、ニューロンおよびグリアに分化した。ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを使用するインビボでの研究は、移植後８週間で、５Ｆ３＋ニューロスフェア細胞が植え付けられ得、そして移動し得ることを示す。これらの研究は、本発明者らが、細胞表面マーカーおよびフローサイトメトリーに基づいて人のＮＳＣを同定しそれを富化したこと、ならびにインビトロおよびインビボでのアッセイを使用してそれらの活性を実証したを示す。
【００８２】
さらなる試験においては、本発明者らは、種々の在胎齢にわたって脳および脊髄組織を試験した。初期（５〜１２ｗｋの妊娠期間）の在胎齢は、後期の在胎齢（１６〜２０ｗｋの妊娠期間）よりも高い頻度のニューロスフェアを開始する細胞（ＮＳ−ＩＣ）を有する。例えば、図５を参照のこと。これらの組織に由来する細胞の直接の培養は、ニューロスフェアの開始を導く。
【００８３】
本発明者らのデータ（以下の表３に示す）は、５Ｆ３＋細胞について富化された神経細胞の細胞の集団が、ＮＳ−ＩＣ活性について２３倍も富化されることを実証する。
【００８４】
【表３】
さらに、図２に示すように、ニューロスフェアを、単一の細胞に選別した５Ｆ３＋細胞にから誘導し得る。本発明者らはまた、５Ｆ３＋に選別した細胞から誘導されたニューロスフェア細胞の自己更新が、単一の細胞に由来するニューロスフェアの再開始によって達成され得ることを実証した（データは示さない）。逆に、本発明者らのデータは、５Ｆ３＋細胞を除去された細胞の集団もまた、ＮＳ−ＩＣ活性について枯渇されることを示す。
【００８５】
（実施例７）
（異なるマーカーによるＮＳ−ＩＣの単離）
第２の実施例として、本発明者らは、本明細書中に記載する新規のモノクローナル抗体５Ｅ１２を使用して細胞の集団を選別した。５Ｅ１２＋サブセットを、以下の表４に示すように、ニューロスフェアを開始する細胞活性について富化した。図３をもまた参照のこと。本発明者らのデータは、５Ｅ１２抗体に対する抗原が、５Ｆ３＋細胞上のＡＣ１３３抗原と同時に発現されることを示唆する。
【００８６】
本発明者らはまた、以下の表４に示すように、神経幹細胞についてのサブセレクターとして８Ｇ１モノクローナル抗体を評価した。５Ｆ３＋および８Ｇ１−／ｌｏである細胞は、より幹細胞様の特性を提示し、一方、５Ｆ３＋および８Ｇ１ｍｅｄ／ｈｉである細胞は、より始原細胞様の特性を示した。
【００８７】
【表４】
（実施例９）
（ＮＳ−ＩＣのインビボでの研究）
本発明者らは、従来技術を使用して、新生児の免疫不全マウスの側脳室に、５Ｆ３＋−に選別したＮＳ−ＩＣ（上記のように得た）を移植した。ヒトのニューロスフェア細胞の植え付けおよび移動を、ヒト特異的Ｔｈｙ−１抗体を使用して、注射後の４〜８週間の間に検出した（図６を参照のこと）。図７に示すように、ヒトβ−チューブリン（ニューロンのマーカー）およびヒト核抗原（ヒト細胞の局在について）での染色は、嘴側の移動性の流れ（ＲＭＳ）を通じるヒトのニューロスフェア細胞の移動を明らかにした。さらに、図８に示すように、ヒト核抗原を使用する局在化は、ヒトのニューロスフェア細胞が、ＲＭＳを通じて嗅球に移動したことを実証した。
【００８８】
（実施例１０）
（ヒトの中枢神経系の幹細胞の直接的な単離および移植）
（序章および要約）自己更新特性および多重系列の分化特性を有する、幹細胞、クローン原性細胞は、損傷した組織を置換するかまたは修復するための能力を有する。この実施例においては、本発明者らは、クローン原性のヒトの脳の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）を単離した。これは、ニューロスフェアの培養を開始し、そして自己更新、ならびにニューロンおよびグリアへの分化の両方を示す。これらの遺伝的に改変されていないヒトのＣＮＳ−ＳＣは、表面マーカーについてのモノクローナル抗体によってマークされる。細胞は、５Ｆ３（ＡＣ１３３）＋、５Ｅ１２＋、ＣＤ３４−ＣＤ４５−、およびＣＤ２４−／ｌｏである。単一のＡＣ１３３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−選別された細胞は、ニューロスフェアの培養を開始し、そして多重系列の分化を提示した。一旦、免疫不全新生児マウスの脳に移植されると、選別されそして拡大されたＣＮＳ−ＳＣは、強力な植え付け、増殖、移動、および分化を、部位特異的な様式で示す。
【００８９】
この実施例においては、本発明者らは、ｍＡｂ ５Ｆ３および新規のｍＡｂである５Ｅ１２が、ヒトの胎児の脳（ＦＢｒ）細胞の異なるサブセットを検出することを示す。混入している血液および内皮細胞をマークするｍＡｂ（ＣＤ３４およびＣＤ４５）と組合せてこれらのｍＡｂを使用する蛍光活性化細胞選別は、ヒトのＦＢｒ細胞の、ＡＣ１３３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−のサブセットを生じる。細胞の選別後、選別された細胞は、単細胞のレベルで、ニューロスフェアを開始し得、自己更新し得、そして多重系列の分化をし得る、本発明者がヒトのＣＮＳ−ＳＣと指名する細胞であり得る。これらの候補のヒトのＣＮＳ−ＳＣは、自己更新し、そしてニューロスフェア培養物中で有意に拡大し、そしてインビトロでニューロンおよびグリアに分化した。選別されそして拡大された候補のＣＮＳ−ＳＣは、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脳の側脳室に移植され得る。ここではこれらは、明らかに適切な部位特異的植え付け、持続的な自己更新、移動、および分化を、少なくとも７ヶ月間受ける。
【００９０】
（ＣＮＳ神経幹細胞のマーカーについての検索；ストラテジー）本発明者らは、候補のＣＮＳ−ＳＣマーカーが、ＦＢｒ細胞の主要ではないサブセットのみにおいて発現されるはずであるという仮説をたてた。ニューロスフェア培養物が幹／始原細胞の富化された集団を含むという証拠が存在するので、本発明者らは、候補の神経幹細胞マーカーが、これらの細胞上でより豊富に発現されるはずであるという仮説をたてた。従って、本発明者らは、ヒトの造血幹細胞（ＨＳＣ）を定義するために以前に使用したｍＡｂを通じてスクリーニングした。
【００９１】
選別した集団を、それらがニューロスフェアを開始する細胞（ＮＳ−ＩＣ）について富化されたかどうかを決定するために試験した。２つの画分（１つの画分は確立されたニューロスフェア培養物であり、そして１つはそうではない）に清潔にＦＢｒを分離する任意のｍＡｂを、ＮＳ−ＩＣを同定することを助けるための候補のｍＡｂと考えた。最初のスクリーニングにおいては、ｍＡｂを、ＦＢｒのポジティブに染色された小さな画分、および長期間培養されたニューロスフェア細胞の大きな画分と考え、そして他のｍＡｂ（ネガティブ選択のための）を、ほとんどのＦＢｒ細胞を染色するが、ニューロスフェア細胞の小さな画分は染色しないと考えた。酵素によって解離させられたＦＢｒおよび長期間培養されたニューロスフェア細胞を、５０個以上の既知のｍＡｂで染色した。
【００９２】
長期間のニューロスフェア培養物である、８．５ＦＢｒが、以前に記載されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、１５８ Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２６５−７８（１９９９））。これらの細胞を、以下の標準的なヒトのニューロスフェア培地中で培養した：ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、およびＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｎ−２補充（Ｇｉｂｃｏ）、３％のグルコース、０．２Ｍのグルタミン、および０．２ｍｇ／ｍｌのヘパリンを有する、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。培養した細胞を回収し、そしてコラゲナーゼの存在下で、継代のために５〜１０分間酵素的に解離させるか、またはｍＡｂの染色のための単一の細胞懸濁物を得るためにトリプシン処理した。
【００９３】
ニューロスフェア細胞は、血管および造血性のマーカーであるＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しなかった。対照的に、マウスおよびヒトのＨＳＣの両方を同定した重要な細胞表面マーカーであるＴｈｙ−１は、実質的に全てのＦＢｒ細胞およびニューロスフェア細胞上で高レベルで発現され、そして従って、有用ではなかった。興味深いことに、最初の抗体スクリーニングは、別のＨＳＣマーカーであるＡＣ１３３が、１６〜２０の妊娠週数（ｇ．ｗ．）の組織に由来するＦＢｒ細胞のわずかに１〜５％において、そして培養されたニューロスフェア細胞の約９０％において発現されたことを明らかにした。
【００９４】
（モノクローナル抗体ＡＣ１３３は、ヒトのＣＮＳ−ＳＣについて富化する）ヒトのＦＢｒ組織を、ＮＩＨのガイドラインに従って、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．から１６〜２０の妊娠週（ｇ．ｗ．）の胎児の残りから得た。ＦＢｒ組織を、１〜３ｍｍの切片に、小刀を使用して切断し、５０ｍＬの遠心分離チューブに移し、そして０．０２％のＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で１回洗浄した。組織を、０．１％のコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および０．１％のヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，およびＤＮａｓｅを補充したＨＢＳＳ中で３７℃にて１時間、酵素的に解離した。単一の細胞の懸濁物を得るために、解離させたＦＢｒ細胞をさらに、０．０５％のトリプシン、５３ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて１０〜１５分間処理した。破片および凝集物を、７０ミクロンのフィルターユニットに通して細胞懸濁物を濾過することによって除去した。
【００９５】
単一の細胞懸濁物を、コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ処理、続くトリプシン処理後に得た。従って、スクリーニングによって、トリプシン耐性の細胞表面エピトープに限定した。
【００９６】
ＦＢｒに由来する選別したＣＤ４５＋またはＣＤ３４＋細胞の塊の培養物は、ニューロスフェアの培養を開始することができなかった。従って、ＣＤ３４およびＣＤ４５の両方が、ヒトのＣＮＳ−ＳＣについてのネガティブセレクターとして使用され得た。
【００９７】
ＣＮＳ−ＳＣが、ＡＣ１３３の発現に基づいて単離され得るかどうかを試験するために、ヒトのＦＢｒ細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ４５，およびＡＣ１３３に対する抗体を用いて染色した。ＡＣ１３３抗原を、両方ともフィコエリスリン（ＰＥ）に結合させた、２つのｍＡｂ（ＡＣ１３３／１およびＡＣ１３３／２）によって規定した。これらは、Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を通じて入手可能である。抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｎｉｎ）（ＡＰＣ）と結合させた抗ヒトＣＤ３４を、ＣＡＬＴＡＧ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＢＤＩＳ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からそれぞれ得た。解離させたＦＢＲ細胞を、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＡＣ１３３／１ ＡＣ１３３／２−ＰＥ、およびＣＤ３４−ＡＰＣに対するｍＡｂとともに、氷上で２０〜６０分間インキュベートした。最後の洗浄後、細胞を、０．５ｇ／ｍＬのヨー化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｎｅ）（ＰＩ）を含むＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した。標識された細胞を分析し、そして二重レーザーのＶａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤＩＳ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）を用いて選別した。死細胞を、それらのＰＩ染色特性によって分析から排除した。混入している血液細胞および内皮細胞を、ＣＤ４５＋細胞ＣＤ３４＋細胞をそれぞれゲートで制御することによって排除した。選別した後、選別した細胞集団の純度をチェックした。
【００９８】
２つの細胞の集団（ＡＣ１３３−ＣＤ３４−ＣＤ４５−（ＡＣ１３３−）およびＡＣ１３３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−（ＡＣ１３３＋））を選別し、そしてＮＳ−ＩＣ活性について培養した。ＡＣ１３３の発現は、連続的出ることが最初に明らかになったが（図９Ａ）、ＡＣ１３３＋細胞のＦＡＣＳでの予備富化、続く２回目の細胞の選別は、別のＡＣ１３３＋集団を明らかにした（図９Ａ）。全ての続く試験において、ＡＣ１３３−およびＡＣ１３３＋サブセットの両方を２回選別し、それによって高純度で、ＡＣ１３３−およびＡＣ１３３＋ＦＢｒ細胞の画分を得た（図９Ａ）。
【００９９】
ニューロスフェアの条件下で培養したＡＣ１３３＋の単一の細胞懸濁物は、芽細胞様（ｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ）になり、プラスチックプレート上に接着し、そして細胞分裂を開始し始めた。培養物中での４〜５日後、ＡＣ１３３＋細胞の大きな画分は増殖を開始し、そして数個の細胞のクラスターとして浮遊し始めた。小さなニューロスフェアは、培養の開始後７〜１０日のような初期に観察された（図９Ｃ）。対照的に、選別されたＡＣ１３３−細胞は、単一の細胞懸濁物のようなままであり、ニューロスフェアを開始することはできず、そして最終的には死亡した（図９Ｂ）。従って、ＮＳ−ＩＣ活性は、ＣＤ４５−ＣＤ３４−ＦＢｒ細胞の、ＡＣ１３３＋のサブセット中では見出されるが、ＡＣ１３３−のサブセット中では見出されなかった。
【０１００】
（ＡＣ１３３＋のヒトＦＢｒ細胞のみがＮＳ−ＩＣ活性を含む）定量的なＮＳ−ＩＣアッセイが、ＡＣ１３３−およびＡＣ１３３＋サブセット間での増殖において衝撃的な差異を示したので、本発明者らは、分画していない（すなわち、細胞の処理後）、および種々の分化したＦＢｒ細胞懸濁物中のＮＳ−ＩＣの頻度を決定することを望んだ。分画していないＦＢｒ細胞を、ＦＡＣＳ自動細胞沈着ユニット（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）（ＡＣＤＵ）を使用して９６ウェルプレート中に限界稀釈（１００〜１０，０００細胞／ウェル）によってプレートした。これらのプレートを６〜８週間培養し、そしてニューロスフェアを含むウェルをポジティブとして記録した。
【０１０１】
選別したＦＢｒ細胞を、ＦＧＦ−１（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、神経生存因子−１（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、および６０ｇ／ｍＬのＮ−アセチルシスチン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）を含むＥｘ Ｖｉｖｏ
１５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｅ，ＭＤ）培地（ニューロスフェア開始培地）中のニューロスフェア培養物中で培養した。培地処方物を、ＦＢｒ細胞の限界稀釈の頻度分析に基づいて最適化した。培養物に、毎週栄養を補給し、そしてニューロスフェアが大きくなった場合、継代した。いくつかの場合には、選別したＦＢｒ細胞を、ニューロスフェアの培養を開始する前駆体の頻度を評価するために、自動化された細胞蓄積ユニット（ＡＣＤＵ）によって９６ウェルプレート中に再度選別した。これらの９６ウェルプレートを、毎週栄養を補給し、そしてウェル中のニューロスフェアの存在を、培養の開始後６〜８週間で記録した。それぞれの細胞濃度でのネガティブなウェルの割合の直線状の退行の分析を、ＮＳ−ＩＣの頻度を決定するために使用した。
【０１０２】
多数のニューロスフェアを、高い細胞用量（すなわち、１ウェルあたり１０，０００細胞）でプレートしたウェル中で検出した。それにもかかわらず、低い細胞用量（すなわち、３００〜１０００細胞／ウェル）でプレートしたウェルにおいては、ポジティブなウェルは、わずかに１つのニューロスフェアを含んだ。１ウェルあたり１００〜３００個の細胞では、極まれなウェルが、単一のニューロスフェアを含んだ。ネガティブなウェルの対数を、１ウェル当たりにプレートした細胞の数に対してプロットした場合には、直線状の関数が見出された；３７％のネガティブなウェルで、ＮＳ−ＩＣについて単一のヒットを決定した（図１０Ａ）。図１０Ａに示される代表的な組織においては、コントロールの処理された脳細胞は、８８０個の細胞中１個の頻度でＮＳ−ＩＣ活性を含んだ。ＡＣ１３３−のサブセットにおいては、４８６０個の細胞中１個のＮＳ−ＩＣの頻度が減少した。対照的に、ＮＳ−ＩＣ活性は、３２個の細胞中１個の頻度で、ＡＣ１３３＋のサブセットにおいて高度に富化された（図１０Ａ）。８つの異なるＦＢｒ組織（１６〜２０の妊娠週）に由来するＮＳ−ＩＣの頻度を、図１０Ｂおよび表５にまとめるように評価した。
【０１０３】
【表５】
＊全ての選別された集団がまた、ＣＤ３４−ＣＤ４５−についてゲート（ｇａｔｅ）され、これは９８〜９９％のＦＢｒを示す。
＊＊実際に算出されたＮＳ−ＩＣ頻度のような１回の試験を除外したデータは、括弧中に示した。ほとんどのウェルがネガティブであったことに起因した。
【０１０４】
分画していない胎児の脳細胞においては、７３０個の細胞中の約１個が、ＮＳ−ＩＣ活性を含む。＞９５％のＦＢｒを示すＡＣ１３３−のサブセットは、ＮＳ−ＩＣを有する４３００個の細胞中に＜１個を含み、そして従って、約６倍減少された。対照的に、ＮＳ−ＩＣ活性は、ニューロスフェアを開始し得る新しいＦＢｒ細胞の約１／３１（１／６から１／７２の範囲）で、平均で、ＡＣ１３３＋サブセットにおいて２３倍富化された。ＡＣ１３３＋細胞は、約４．６％のＦＢｒを示した（すなわち、２２個の細胞のうちの１個）ので、ＮＳ−ＩＣ活性の富化は実質的には、ＦＢｒ中のＡＣ１３３＋細胞の頻度に相当した。従って、ＡＣ１３３＋細胞は、１６〜２０の妊娠週のＦＢｒ細胞懸濁物中の全ての検出可能なＮＳ−ＩＣ活性を含んだ。
【０１０５】
（単一のＡＣ１３３＋に選別された細胞からの、クローンのニューロスフェアの拡大、自己更新および分化）ニューロスフェアのクローナリティー（ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を確認するために、単一のＦＢｒに由来するＡＣ１３３―に選別された細胞を、ＡＣＤＵによって９６ウェルプレートのウェル中に直接プレートした。８週間後、いくつかのウェルは、単一のニューロスフェアを含み、これらが単一のＡＣ１３３＋に選別された細胞に由来することを確認した（図１０Ｃ）。
【０１０６】
ＡＣ１３３＋に由来するニューロスフェアの自己更新活性を、ニューロスフェアの培養を再度開始する能力について試験した。例えば、ＡＣ１３３＋に選別されたＦＢｒ細胞によって開始された最初のニューロスフェア培養物を解離させ、そして１ウェル当たり１つの細胞として再度プレートした。９個の９６ウェルが、単一のニューロスフェアの発達を示した。１つの試験においては、ニューロスフェアは、ＡＣ１３３＋に選別されたニューロスフェア細胞から約１０％の播種効率を伴って、クローン的に（ｃｌｏｎａｌｌｙ）誘導された。結果として、ＡＣ１３３−になるニューロスフェア細胞は、二次的なニューロスフェア培養を再度開始することはできなかった。従って、これらの定量的な結果は、ＮＳ−ＩＣ活性が、ＦＢｒ細胞のＡＣ１３３＋のサブセットにおいては高度に富化され、そしてＦＢｒ細胞のＡＣ１３３−のサブセットにおいては除去されることを実証した。
【０１０７】
クローン的に誘導されたニューロスフェア細胞の分化能力を試験するために、単一のニューロスフェアを回収し、プレートし、そして神経栄養因子であるＢＤＮＦおよびＧＤＮＦの存在下で分化を誘導した。ニューロスフェア細胞を回収し、そしてコラゲナーゼを用いて解離させ、そしてポリオルニチンでコーティングしたチャンバースライド上に置いた。これらを、ニューロスフェア開始培地中で、それらがプレート上に播種されるまで１日間培養した。培養物を、Ｅｘ Ｖｉｖｏ−１５，Ｎ２、ＮＡＣ、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびラミニン（１ｇ／ｍＬ）から構成される分化培地に再度プレートした。１〜２週間後、チャンバースライドをＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで固定し、そしてニューロンおよび星状細胞への分化を検出するために、チューブリンおよびグリア菌原繊維（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ）酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対するｍＡｂで染色した。
【０１０８】
これらの条件下では、ＡＣ１３３＋に由来するニューロスフェアは、ニューロンおよび星状細胞に分化した（図１０Ｄ）。まとめると、データは、ｍＡＢ ＡＣ１３３がＮＳ−ＩＣについてのマーカーであり、そしてヒトＣＮＳ−ＳＣについて富化するために使用され得ることを示唆する。これらのＡＣ１３３＋に由来するニューロスフェア培養物は、連続的に継代されている（凍結前に＞Ｐ１５）。大まかな推定においては、ＡＣ１３３＋細胞の絶対数は、５回の継代によって少なくとも１０００倍に増大し（表６）、そしてこれらは、ニューロスフェアを再現的に再度開始し得る。従って、ＡＣ１３３は、インビトロで連続的に拡大し、そして自己更新する神経細胞の集団を規定する。
【０１０９】
【表６】
（ＮＳ−ＩＣもまた、５Ｅ１２＋および８Ｇ１−／ｌｏ細胞において富化される；新規のｍＡｂの生成）利用可能なｍＡｂの有用性のスクリーニングと同時に、本発明者らは、ヒトの神経細胞上の新規の細胞表面マーカーを同定しようとした。ＦＢｒ細胞を、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの組合せを用いて解離させ、そして、組織特異的ｍＡｂを惹起するためのおとりの（ｄｅｃｏｙ）ストラテジーを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。約１９００個のウェルの増殖しつつあるハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、そしてハイブリドーマを選択し、拡大し、そしてヒトの脳に対する特異的反応性についてさらに試験した。ヒトの神経細胞に対するモノクローナル抗体を、Ｙｉｎら、９０ Ｂｌｏｏｄ ５００２−１２（１９９７）によって以前に記載されたおとりの免疫化ストラテジーを使用して産生した。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、おとりのヒトの白血球を富化させた末梢血で１回のフットパッド（ｏｎｅ ｆｏｏｔｐａｄ）において免疫し、そして酵素で解離させたヒトの胎児の脳細胞で反対側にフットパッドした。ヒトＦＢｒ細胞免疫を排出させたドナーのリンパ節の細胞を回収し、細胞懸濁物について処理し、そしてマウスの骨髄腫細胞株と融合させた。マウスの骨髄腫株に対するこの融合は、１９００個のウェルの増殖しつつあるハイブリドーマ細胞を生じた。約１８０個のハイブリドーマを選択し、拡大し、そしてヒトの脳細胞に対する特異的反応性についてさらに試験した。
【０１１０】
上記のように、ＣＮＳ−ＳＣを、ＡＣ１３３＋サブセットにおいて高度に富化した。ＣＮＳ−ＳＣの表現型をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ＡＣ１３３＋細胞が表現型的には不均質であるかどうかを試験した。従って、ＡＣ１３３＋細胞を、新規のｍＡｂのパネルに由来する他のマーカーの同時発現についてスクリーニングした。２つの新規のｍＡｂである５Ｅ１２および８Ｇ１を、同定した。Ｍａｂ ５Ｅ１２は、ＡＣ１３３＋細胞および長期間のニューロスフェア細胞を同時染色する。５Ｅ１２＋ＦＢｒ細胞を富化し、そして５Ｅ１２−細胞をＮＳ−ＩＣ活性において除去する（表５）。
【０１１１】
胎児の脳の発達においては、ＦＢｒ細胞の大部分（＞９０％）が、高レベルの８Ｇ１マーカーを発現した（図４）。ＡＣ１３３＋細胞は、８Ｇ１の発現において不均質であった；ほとんどの８Ｇ１−／ｌｏ、いくつかの８Ｇ１ｍｉｄ、および数個の８Ｇ１ｈｉ細胞（図１２）。興味深いことに、長期間培養したヒトのニューロスフェア細胞上での８Ｇ１の発現もまた、不均質であった。免疫沈降およびブロッキングの研究によって、８Ｇ１が抗ＣＤ２４ ｍＡｂであることを決定した。組織学的には、ＣＤ２４は、熱安定性の抗原（ＨＳＡ）として公知であり、そして血液のリンパ球産生においてマーカーとして広範に使用される（Ａｌｔｅｒｍａｎら、２０ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９７−６０２（１９９０））。ＨＳＡは、マウスのＨＳＣ上で低レベルで発現され（ＳｈｉｈおよびＯｇａｗａ、８１ Ｂｌｏｏｄ １１５５−６０（１９９３））；ＳｐａｎｇｒｕｄｅおよびＳｃｏｌｌａｙ、１８ Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９２０−６（１９９０））、そしてプロＢ細胞およびプレＢ細胞、ならびに胸腺細胞上で高レベルで発現され、そしてこれらの細胞が成熟リンパ球になる場合、完全に下方調節される（Ａｌｔｅｒｍａｎら、２０ Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１５９７−６０２（１９９０））。表５に示すように、ＮＳ−ＩＣの頻度は、ＡＣ１３３＋ＣＤ２４ｍｉｄ／ｈｉのサブセットと比較して、ＡＣ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ画分においてより高い。
【０１１２】
（ＡＣ１３３＋に由来するヒトのニューロスフェア細胞の強力な植え付け能力）ヒトの選別され／拡大されたＣＮＳ−ＳＣの、インビボでの移植、移動、および分化の能力を試験するために、１０５個または１０６個のニューロスフェア細胞（ＡＣ１３３＋に選別されたＦＢｒ細胞から開始された）を、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脳の側方の脳室に注射した。
【０１１３】
６〜１０の継代で拡大したＡＣ１３３＋に選別されたニューロスフェア細胞を回収し、そして細胞の小さなクラスターを得るためにコラゲナーゼで穏やかに乖離させた。細胞を、０．２５×１０５または２．５×１０５／Ｌの等量で再懸濁した。新生児のマウス（＜生後２４時間）を、氷を使用して低温麻酔した；一旦麻酔がかかると、定位的なデバイス上に新生児を置いた。小さな穴を針で軟骨にドリルで穴をあけ、そして細胞懸濁物を、両方の側方の脳室のスペースにＨａｍｉｌｉｔｏｎシリンジによって導入した。新生児のマウスを、１０５〜１０６個の細胞／注射の範囲の細胞の２１個を用いて注射した。新生児を、外科手術の回復についてモニターするために暖めることによって観察し、次いで、母親に返した。注射したマウスを、ヒトの細胞の植え付け（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を試験する前に７ヶ月間維持した。
【０１１４】
新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、神経学的な系に注射される細胞の参加を最大にするためのレシピエントとして選択した。なぜなら、細胞の形成が、新生児のマウスの脳のいくつかの部分における進行において、なお活性であるからである。さらに、免疫不全マウスは、ヒトの組織を拒絶せず、そしてＳＣＩＤおよびＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、ヒトの血球形成および組織の植え付けのインビボでの研究のための宿主として使用されている（ＭｃＣｕｎｅら、２４１ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６３２−９（１９８８）；Ｋａｍｅｌ−ＲｅｉｄおよびＤｉｃｋ、２４２ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７０６−９（１９８８）；Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅら、２ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３２９−３７（１９９６））。移植の７ヶ月後、動物を屠殺し、そして矢状方向の切片を、Ｎ−ＣＡＭおよびＴｈｙ−１、ならびにヒト核抗原に対するヒト特異的ｍＡｂで染色した。
【０１１５】
移植の７ヶ月後に、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、Ａｖｅｒｔｉｎで深く麻酔し、そしてＰＢＳで灌流し、続いてリン酸緩衝液中の４％のパラホルムアルデヒドで灌流した。その後、脳を、一晩固定し、３０％のスクロース溶液中に置き、そしてＯＣＴ化合物中で凍結させた。脳を、さらなる免疫組織化学のために５μｍの厚みに矢状方向に切断した。移植されたマウスの脳中のヒト細胞を検出するために、切片を、ヒトＴｈｙ−１に対するマウスのモノクローナル抗体（Ｐｈａｅｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｎ−ＣＡＭに対するモノクローナル抗体、チューブリンに対するモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、または核抗原に対するモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、続いて、Ａｌｅｘａ ４８８に結合させたヤギ抗マウスＩＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色した。
【０１１６】
マウスの脳のコントロールに対するこれらのｍＡｂの染色は、交差反応性を示さなかった。ＧＦＡＰおよびβ−チューブリンに対するＭａｂは、ヒトおよびマウスの細胞の両方を染色し、そして抗ヒト核抗体でのこのような二重の標識を、ヒトの系統特異的細胞の集団を実証するために使用した。詳細な分析は、特に、活性な神経形成の部位であることが以前に示されている脳の２つの部位（側方の脳室の脳室下の領域（ＳＶＺ）、および海馬の歯状回）に集中した（図１２Ａ）。
【０１１７】
ヒトの細胞は、マウスの脳全体にわたって見出され、そして注射の７ヶ月後に、ＳＶＺにおいて豊富であった（図１２）。例えば、１つの領域においては、ヒトの核＋である多くの細胞を、ＧＦＡＰ＋細胞によって取り囲んだ（図１２Ｂ）。コンフォーカルな顕微鏡試験は、ヒトの細胞のほとんどが、ＧＦＡＰ−であるが、時折、ヒトのＧＦＡＰ＋細胞もまた検出されたことを示した（図１２Ｂ、矢印）。
【０１１８】
移植されたマウスの脳を、ミクロトーム上で４０マイクロメートルの厚みの切片にし、そしてｍＡｂで染色し、そしてＳｕｈｏｎｅｎら、３８３ Ｎａｔｕｒｅ ６２４−７（１９９６）によって以前に記載されているように、Ｂｉｏ−Ｒａｄコンフォーカル散乱光顕微鏡を使用して分析した。
【０１１９】
ＳＶＺ中の幹細胞／始原細胞が持続的な増殖を示しているので、本発明者らは、移植されたヒトのＡＣ１３３＋に選別され／拡大されたニューロスフェア細胞の子孫がなお増殖しているかどうかを、インサイチュで試験した。移植された脳の１つの切片を、細胞増殖に関連するマーカーであるＫｉ６７で染色した。著しく、ＧＦＡＰ＋細胞中に入れ子（ｎｅｓｔ）にされたＳＶＺ中のヒトの細胞のクラスターは、Ｋｉ−６７を同時発現し、このことは、ＳＶＺ中のヒトの細胞が、それらのマウスの対応する部分と同様に、ＳＶＺ中での移植後７ヶ月間増殖し続けることを示した（図１２Ｃ）。
【０１２０】
げっ歯類の嗅覚の系においては、ＳＶＺ中で増殖した幹細胞／始原細胞の子孫は、吻方の移動性の流れ（ｒｏｓｔｒａｌ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｓｔｒｅａｍ）（ＲＭＳ）に入り、そして嗅球に移動する（ＬｏｉｓおよびＡｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ、２６４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４５−８（１９９４））。ＲＭＳ中の内因性のげっ歯類の先祖の「神経芽細胞の鎖」は、β−チューブリンおよびＮ−ＣＡＭを発現する（Ｆｒｉｃｋｅｒら、１９ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５９９０−６００５（１９９９）；ＧａｇｅおよびＣｒｉｓｔｅｎ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＮＳ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９７））。ＲＭＳを含有している矢状方向の切片を、ヒトの神経細胞の存在について試験した。ＡＣ１３３＋に選別されたニューロスフェア細胞を移植したマウスにおいては、多数のヒト細胞が検出され、これはＳＶＺで開始し、そしてＲＭＳ全体に拡大している（図１３Ａ）。これらのクラスターを形成するヒト細胞の多くは、β−チューブリンと同時に局在するがこのようなクラスター中で二重ポジティブの細胞を同定することは困難であった。数個のヒト細胞を含有している組織の注意深い試験によって、β−チューブリンおよびヒト核抗原の両方について二重ポジティブである複数の細胞が明らかになった（図１３Ｂ、矢印）。さらに、ＲＭＳ中のこれらの細胞の多くは、ヒト特異的マーカーであるＮ−ＣＡＭを発現した（図１３Ｃ）。
【０１２１】
ＲＭＳを通じる移動の後、幹／始原細胞の子孫は、嗅球に侵入し、そして嗅覚の糸球体に向かって嗅球のペリ糸球体（ｐｅｒｉｇｌｏｍｅｌｕｌａｒ）層にまで拡大すると予期される（ＬｏｉｓおよびＡｌｖｅｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ、２６４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４５−８（１９９４））。図１３Ｄに示すように、移植されたヒト細胞の子孫は、糸球体ならびにペリ糸球体層に分布した。これらの細胞のいくつかは、ヒトのＮ−ＣＡＭを発現し、このことは、これらの細胞が神経系統に拘束されていたことを示す。従って、移植された、選別され／拡大されたヒトのＣＮＳ−ＳＣの子孫は、ＲＭＳに移動し、分布し、そして嗅球中の神経系統に分化する。いくつかの例においては、チロシンヒドロキシラーゼポジティブであるヒト細胞が観察された。
【０１２２】
神経形成が成体の生活において起こる別の部位は、海馬の歯状回である（Ｇａｇｅら、９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１８７９−８３（１９９５））。この実施例においては、本発明者らは、海馬の歯状回において多数のヒト核細胞を見出した。やや顆粒状の細胞（ｓｕｂｇｒａｎｕｌａｒ
ｃｅｌｌ）帯中のヒトの細胞でいくつかは、Ｋｉ−６７を同時発現し、このことは、これらの細胞が移植の７ヶ月後に増殖することがなお可能であることを示す（図１４Ａ）。異なる分析においては、いくつかの他のヒト細胞は、海馬の門に向かって拡大するそれらのプロセスを有する、顆粒状のニューロンを発達させることが予期されるような、β−チューブリンであった（図１４Ｂ）。これらの結果は、これらの選別され／拡大されたヒトのＣＮＳ−ＳＣ移植片が、移動し、増殖しつづけ、そして分化するだけではなく、それらの挙動および細胞の運命もまた、部位特異的様式において宿主の合図によって調節することを示す。注射された細胞は、腫瘍を形成しない。
【０１２３】
（考察）この実施例の目的は、候補のヒトＣＮＳ−ＳＣの予想される単離を可能にする、ヒトの脳細胞上の表面マーカーを見出すことであった。本発明者らは、ヒトのニューロスフェア培養物が、ＣＮＳ−ＳＣからクローン的に開始され得ると仮定し、そして新しいヒトのＦＢｒ細胞懸濁物からＮＳ−ＩＣを単離にすることに着手した。本発明者らは、１６〜２０ｇ．ｗ．のヒトのＦＢｒ細胞がまれにクローン原性のＡＣ１３３＋、５Ｅ１２＋、８Ｇ１−／ｌｏＣＤ３４−ＣＤ４５−細胞のサブセットを含むことを実証した。このサブセットは、ニューロスフェアの培養を開始し得、これらの培養物中で広範囲にわたって自己更新し得、そしてニューロンおよびグリアにインビトロで分化し得る。免疫不全の新生児のマウスの側方の脳室への移植の際には、これらの細胞は、少なくとも７ヶ月間植え付け（ｅｎｇｒａｆｔ）、そして分化し、移動し、そしてそのいくつかは増殖し続ける、子孫を生じる（すなわち、ＳＶＺおよび歯状回中でのＫｉ−６７＋のヒトの神経細胞の存在）。植え付けされたヒトの細胞は、それらが、同じ事象を受けた内因性のマウスの神経細胞に対応する部位中に見出される。
【０１２４】
図１０および表５中のデータは、ヒトの胎児の脳中にＡＣ１３３＋サブセットの外側には他の検出可能なＮＳ−ＩＣ細胞が存在しないことを実証する。
【０１２５】
ＡＣ１３３染色パターンの分析の間には、本発明者らは、約０．２％のＦＢｒ細胞がＣＤ３４を発現し、そしてＡＣ１３３＋ＣＤ３４−である細胞に接着したままであることに注目した。これらのＣＤ３４＋細胞は、既知の内皮細胞マーカーであるＣＤ１０５およびＣＤ３１を同時に発現し、そしてトリプシン処理後にも、塊の培養物中に高密度で配置された場合に、いくつかのニューロスフェアから非効率的に形成され得る細胞の複合体として残っていた。本発明者らは、ＣＤ３４を発現する細胞についてのポジティブな選択の後、同様に複合体を観察した。従って、ＡＣ１３３＋ＣＮＳ−ＳＣおよび天然に存在するＣＤ３４＋内皮細胞の頻繁な連合が存在する。ＡＣ１３３＋ＣＮＳ−ＳＣが血管周囲にあるという知見は、神経形成が、血管形成と同時に進行するという仮説に一致する。
【０１２６】
候補のヒト胎児のＣＮＳ−ＳＣが、新生児のマウスの側方の脳室中への注射後に植え付けし、そしてマウスの脳全体にわたって拡大することは、驚くべきことである。これはマウスの持続的な神経形成の段階であるが、これらの細胞が分布する程度は、当業者が予期したよりも大きい。詳細には、ヒトの細胞は、脳室の空間に隣接して、海馬中、大脳皮質中、脳梁中、ならびに脳の小脳の領域に見出された（図１１）。さらに、細胞は、ＳＶＺ（自己更新しそして複製する領域）においておよびＲＭＳ（分化および移動の領域）沿っての両方で、ならびに嗅球内および嗅覚の糸球体周辺に直接、見出される。従って、注射されたヒトＣＮＳ−ＳＣは、これらの部位で神経形成のプロセスを継続している。
【０１２７】
Ｓｙｎｄｅｒらは、ｖ−ｍｙｃで固定したマウスおよびヒトの神経細胞株を使用して、細胞のこの広範な（「全体的な」）分布を実証した（Ｙａｎｄａｖａら、９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７０２９−３４（１９９９））。本明細書中では、本発明者らは、これが、マウス起源のｍｙｃ固定された細胞の特性だけではなく、非遺伝的に改変されたヒトのＣＮＳ−ＳＣの特性でもあることを示す。
【０１２８】
奇形癌細胞の移植とは対照的に（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉら、１２２ Ｅｘｐ
Ｎｅｕｒｏｌ ２８３−９４（１９９３））、ＣＮＳ−ＳＣ細胞は、完全に許容性の微環境中での注射の７ヶ月後に試験した場合でさえも、腫瘍性凝集物または増殖性凝集物を形成しない。従って、ＣＮＳ−ＳＣ細胞は、腫瘍遺伝子の機能によって改変されていないヒトの神経系、またはすでに腫瘍性に形質転換された細胞株において本来備わっている発生的経路および機能的経路を明らかにし得る。ＣＮＳ−ＳＣの単離は、以下の科学的な発見のためのいくつかの機会を提供する：（ｉ）特定の段階または分化の細胞に由来する系統を直接描写すること；（ｉｉ）ＣＮＳ−ＳＣの遺伝子発現プロフィールおよびインビトロまたはインビボでそれらのすぐ下流の子孫を得ること；（ｉｉｉ）細胞の特異的な遺伝子の改変がそれらの植え付け、移動、分化、および／または機能的な組込みを可能にするかどうかを試験すること。ヒトのＣＮＳ幹細胞の単離は、それらの移植可能性、分化能力、および腫瘍形成の欠失についての前臨床試験としての、ヒトの疾患のマウスのアナログにおいてこれらの細胞の移植を可能にする。
【０１２９】
上記の記載は、説明の目的のためのみに示されており、そして、開示される正確な形態に本発明を限定するようには意図されないが、本明細書中に添付される特許請求の範囲によって限定されるように意図される。
【技術分野】
【０００１】
（優先権の請求）
本発明は、１９９９年２月１２日に出願された米国特許仮出願第６０／１１９，７２５号に対して；１９９９年１０月２１日に出願された米国特許出願第０９／４２２，８４４号に対して；および１９９９年１２月１日に出願された米国特許仮出願第６０／１６８，４０７号に対して、優先権を請求する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的には、富化された神経幹細胞および始原細胞の集団、ならびに神経幹細胞および始原細胞（詳細には、中枢神経系の神経幹細胞および始原細胞）について同定、単離、および富化するための方法に関し、そして最も詳細には、ニューロスフェアを開始する細胞（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）（ＮＳ−ＩＣ）の富化された集団に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
幹細胞の集団は、細胞の総数の低い割合のみを構成するが、それらの体に再配置する能力に起因してすばらしい目的である。幹細胞の寿命および幹細胞の子孫の散布（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）は所望される特徴である。これらの方法においては、有意な商業的な目的が存在する。なぜなら、幹細胞は多数の臨床的な用途を有するからである。遺伝子治療のためのビヒクルとしての幹細胞の使用においては、医学的な目的もまた存在する。
【０００４】
幹細胞および始原細胞の集団上に見出されるタンパク質および他の細胞表面マーカーは、これらの集団の分離および単離のための試薬を調製することにおいて有用である。細胞表面のマーカーもまた、これらの重要な細胞のさらなる特徴付けにおいて有用である。
【０００５】
本明細書中で参考として援用されるＹｉｎらの米国特許第５，８４３，６３３号は、ＡＣ１３３と呼ばれるモノクローナル抗体を記載している。この抗体は、造血幹細胞および始原細胞上の表面マーカーの糖タンパク質に結合する。ＡＣ１３３抗原は、１１７ｋＤａの分子量を有する５−膜貫通細胞表面抗原である。この抗原の発現は、高度に組織特異的であり、そしてヒトの骨髄、胎児の骨髄および肝臓、臍帯血、ならびに成体の末梢血に由来する、造血系の始原細胞のサブセット上で検出されている。ＡＣ１３３抗体によって認識される細胞のサブセットは、ＣＤ３４ｂｒｉｇｈｔであり、そしてＣＤ３４＋集団中に存在するＣＦＵ−ＧＭ活性の実質的に全てを含み、これによってＡＣ１３３を、ヒトの造血性の始原細胞および幹細胞の単離および特徴付けのための試薬として有用にする。
【０００６】
しかし、非造血性の幹細胞および始原細胞、ならびに特に、中枢神経系の神経幹細胞および始原細胞に特異的な表面マーカーは、同定されていない。さらに、ＡＣ１３３抗体は、非造血性の幹細胞または始原細胞、特に、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞および始原細胞について、同定、単離、または富化するための方法においては、使用されていない。ヒトの非造血性の始原細胞および幹細胞、そして特に、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞および始原細胞を単離および特徴付けることにおいて有用であるモノクローナル抗体のような、ツールについての必要性が残されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトの非造血性の始原細胞および幹細胞、そして特に、ニューロスフェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得る中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞、および始原細胞を、同定、単離、および富化するための方法を提供する。本発明はまた、ニューロスフェアを開始し得るＣＮＳの神経幹細胞、および始原細胞を含有している富化された集団を提供する。「ニューロスフェア開始細胞（ＮＳ−ＩＣ）」は、長期間のニューロスフェア培養を開始し得る細胞である。次に、「ニューロスフェア」は、細胞の凝集物またはクラスターであり、これは、神経幹細胞および初期始原細胞を含む。ニューロスフェアの同定、培養、増殖、および使用は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号、およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号（両方とも、本明細書中で参考として援用される）に開示されている。用語「ＮＳ−ＩＣ」は、ニューロスフェアを形成するその細胞の能力または機能によって定義されるが、これらの細胞は、付着性の培養地において適切に増殖され得（例えば、Ｊｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、そして本明細書中に記載されている方法および集団が、ＮＳ−ＩＣの懸濁培養物に限定されないことが留意されるはずである。ＮＳ−ＩＣは、ネスチン＋であり、そしてニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞への適切な分化条件下で分化する能力を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） ニューロスフェア（ＮＳ−ＩＣ）を開始し得るヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生するための、方法であって、以下：
（ａ）神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程；および
（ｂ）該試薬と工程（ａ）の細胞の表面上の該決定基との間で接触している細胞について選択して、ＣＮＳ−ＳＣについて高度に富化された集団を産生する工程、
包含する、方法。
（項目２） 前記試薬が、モノクローナル抗体ＡＣ１３３によって認識される前記細胞表面マーカー上の決定基を認識する抗体である、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記試薬が、ＡＣ１３３モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、項目２に記載の方法。
（項目４） 前記試薬が、ＡＣ１３３抗体または５Ｅ１２抗体によって認識される前記細胞表面マーカーに対して結合するリガンドまたは低分子である、項目２に記載の方法。
（項目５） 前記試薬が、５Ｅ１２モノクローナル抗体によって認識される前記細胞表面マーカー上の決定基を認識する抗体である、項目１に記載の方法。
（項目６） 前記試薬が、５Ｅ１２モノクローナル抗体またはポリクリローナル抗体である、項目５に記載の方法。
（項目７） 前記試薬が蛍光色素を結合されている、項目１に記載の方法。
（項目８） 前記試薬が磁気粒子に対して結合されている、項目１に記載の方法。
（項目９） 前記選択工程がフローサイトメトリーによる、項目１に記載の方法。
（項目１０） 前記選択工程が、蛍光活性化細胞選別または高勾配磁気選択による、項目１に記載の方法。
（項目１１） 前記選択工程が、物理的陽性選択デバイスによる、項目１に記載の方法。
（項目１２） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、神経組織を生じる任意の組織から得られる、項目１に記載の方法。
（項目１３） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、神経組織から解離されている、項目１に記載の方法。
（項目１４） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、胎児の脳、成体の脳、胎児の脊髄、または成体の脊髄に由来する、項目１に記載の方法。
（項目１５） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、神経細胞培養物から得られる、項目１に記載の方法。
（項目１６） 前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団が、ニューロスフェア培養物または付着性の単層から得られる、項目１に記載の方法。
（項目１７） 項目１に記載の方法であって、
（ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ４５抗原に結合する試薬と接触させる工程；および
（ｄ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間で接触している細胞について選択し、そして該細胞と該ＣＤ４５抗原に結合する試薬との間での減少した接触について選択する工程であって、その結果、ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−である細胞、または５Ｅ１２＋ＣＤ４５−である細胞、またはＡＣ１３３＋５Ｅ１２＋ＣＤ４５−である細胞が選択される、工程、
をさらに包含する、方法。
（項目１８） 項目１に記載の方法であって、以下：
（ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ４５抗原に結合する試薬と接触させる工程；
（ｄ）該神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、ＣＤ３４抗原に結合する試薬と接触させる工程；および
（ｅ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間で接触している細胞について、ならびに該細胞と該ＣＤ４５抗原に結合する試薬との間、および該細胞と該ＣＤ３４抗原に結合する試薬との間での減少した接触について選択する工程であって、その結果、ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−である細胞、または５Ｅ１２＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−である細胞、またはＡＣ１３３＋５Ｅ１２＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−である細胞が選択される、工程、
をさらに包含する、方法。
（項目１９） 項目１に記載の方法であって、以下：
（ｃ）前記神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体８Ｇ１によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程；
（ｂ）該細胞と、前記モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間で接触している細胞について、ならびに該細胞と該モノクローナル抗体８Ｇ１によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間での減少した接触について選択する工程であって、その結果、ＡＣ１３３＋８Ｇ１−／ｌｏである細胞、または５Ｅ１２＋８Ｇ１−／ｌｏである細胞、またはＡＣ１３３＋５Ｅ１２＋８Ｇ１−／ｌｏである細胞が選択される、工程、
をさらに包含する、方法。
（項目２０） 集団のニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）の画分について神経細胞の集団を富化するための方法であって、以下：
（ａ）ＮＳ−ＩＣの画分を含む、神経細胞または神経に由来する細胞を含有する集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と混合する工程；および
（ｂ）ＡＣ１３３＋および／または５Ｅ１２＋細胞について選択する工程であって、ここで、ＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋細胞は、該神経細胞の集団と比較した場合に、該ＮＳ−ＩＣの画分が富化されている、工程、
を包含する、方法。
（項目２１） ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を同定するための方法であって、
（ａ）神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と接触させる工程；および
（ｂ）該神経細胞または神経に由来する細胞を含有している集団の細胞と、該モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬との間での接触を検出する工程であって、ここで、ＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋であるとの細胞の同定により、ＮＳ−ＩＣとして細胞を同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目２２） ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を単離するための方法であって、以下：
（ａ）ＮＳ−ＩＣの画分を含む、神経細胞または神経に由来する細胞を含有する集団を、モノクローナル抗体ＡＣ１３３によってまたはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって認識される細胞表面マーカー上の決定基を認識する試薬と混合する工程；
（ｂ）ＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋細胞を選択する工程であって、ここで、該選択されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞は、該神経細胞の集団と比較した場合に、該ＮＳ−ＩＣの画分において富化される、工程；
（ｃ）ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地に、少なくとも１つのＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を導入する工程；および
（ｄ）該培養培地中で該ＡＣ１３３細胞＋または該５Ｅ１２＋細胞を増殖させる工程、
を包含する、方法。
（項目２３） 項目２２に記載の方法によって産生された、細胞の集団。
（項目２４） 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、多能性の神経幹細胞の増殖を誘導しそして／または可能にするために有効な、１つ以上の予め決定された増殖因子を含有する無血清培地を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５） 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、さらに、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびそれらの組合せからなる群より選択される増殖因子を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地が、神経生存因子（ＮＳＦ）をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−細胞、または５Ｅ１２＋ＣＤ４５−細胞において富化された集団；および
（ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
（項目２８） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−細胞、または５Ｅ１２＋ＣＤ４５−ＣＤ３４−細胞において富化された集団；および
（ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
（項目２９） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ＡＣ１３３＋８Ｇ１−／ｌｏ細胞、または５Ｅ１２＋８Ｇ１−／ｌｏ細胞において富化された集団；および
（ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
（項目３０） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ＡＣ１３３＋８Ｇ１ｈｉ細胞、または５Ｅ１２＋８Ｇ１ｈｉ細胞において富化された集団；および
（ｂ）該細胞の増殖を支持し得る培地。
（項目３１） 以下を含有する、インビトロでの細胞培養組成物：
（ａ）ネスチンについてポジティブに染色し、そして分化を誘導する条件の存在下で、ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞に分化する子孫細胞を産生する、少なくとも５０％のＡＣ１３３＋、または５Ｅ１２＋ニューロスフェア開始細胞（ＮＳ−ＩＣ）を含有する集団；ならびに
（ｂ）ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培地。
（項目３２） ＮＳ−ＩＣが付着される固体支持体をさらに含有する、項目３１に記載の組成物。
（項目３３） 前記細胞の集団が、少なくとも７０％のＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を有する、項目３１に記載の組成物。
（項目３４） 前記細胞の集団が、少なくとも９０％のＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を有する、項目３１に記載の組成物。
（項目３５） 前記ＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２―細胞の集団が、実質的に純粋な集団である、項目３１に記載の組成物。
（項目３６） 前記培地が、多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するために有効な、１つ以上の予め決定された増殖因子を含有する無血清培地を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３７） 前記培地が、さらに、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、およびそれらの組合せからなる群より選択される増殖因子を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３８） 前記培地が、さらに、神経生存因子を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３９） 前記ＮＳ−ＩＣがヒトＮＳ−ＩＣである、項目３１に記載の組成物。
（項目４０） ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を特徴付けるための方法であって、以下：
（ａ）単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を、ＮＳ−ＩＣの増殖を支持し得る培養培地に対して導入する工程；
（ｂ）該培養培地中で該ＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞を増殖させる工程；
（ｃ）該単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞がニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞に分化する条件下で、該単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞の子孫を培養する工程；ならびに
（ｄ）ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞の存在を検出する工程であって、ここで、ニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞の存在は、該単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞をＮＳ−ＩＣとして特徴付ける、工程、
を包含する、方法。
（項目４１） 前記単離されたＡＣ１３３＋細胞または５Ｅ１２＋細胞の子孫がニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞に分化する前記条件が、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有し、そして有糸分裂促進性の増殖因子を含有しない培養培地中、ラミニンでコーティングされた表面上で、該単離されたＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋細胞の子孫を培養することを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２） ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）の増殖に影響を与える増殖因子の存在を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える少なくとも１つの増殖因子を含有すると予想される組成物を、ＮＳ−ＩＣを含有している組成物と混合する工程であって、ここで、該ＮＳ−ＩＣは、ＡＣ１３３＋または５Ｅ１２＋、ネスチン＋として特徴付けられ、そしてニューロン、星状細胞、および稀突起膠細胞系統に分化し得る、工程；ならびに
（ｂ）該組成物中の少なくとも１つの増殖因子の存在の関数として、該ＮＳ−ＩＣの増殖を決定する工程であって、ここで、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える少なくとも１つの増殖因子を含有していると予想される組成物と接触させていないＮＳ−ＩＣの増殖と比較した場合に、変化したＮＳ−ＩＣの増殖は、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える増殖因子の組成物中の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
（項目４３） 前記増殖因子が神経生存因子である、項目４２に記載の方法。
（項目４４） 哺乳動物への移植のための、ニューロスフェアを開始し得る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団の、使用。
（項目４５） 前記集団が、培養培地中で増殖させられた、項目４３に記載の使用。
（項目４６） 前記集団が、フローサイトメトリーによって選択された、項目４３に記載の使用。
（項目４７） 前記集団が、単離されたＮＳ−ＩＣを含む、項目４３に記載の使用。
（項目４８） 前記移植が、中枢神経系に対してである、項目４３に記載の使用。
（項目４９） 前記移植が、哺乳動物の中枢神経系の外側の領域に対してである、項目４３に記載の使用。
（項目５０） 中枢神経系の障害のための医薬品の製造における、ニューロスフェアを開始し得る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団の、使用。
（項目５１） 造血性障害のための医薬品の製造における、ニューロスフェアを開始し得る（ＮＳ−ＩＣ）ヒトの中枢神経系の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団の、使用。
【０００８】
本発明の１つの実施形態に従って、非造血性の幹細胞および始原細胞（好ましくは、ＮＳ−ＩＣを含有しているＣＮＳの神経幹細胞、および始原細胞）の富化された集団、およびこのような細胞を同定、単離、または富化するための方法は、少なくとも１つの幹細胞もしくはＮＳ−ＩＣ、または始原細胞を含有している細胞の集団を、ＡＣ１３３抗体によって認識される表面マーカーの糖タンパク質抗原（「ＡＣ１３３抗原」）に結合する試薬と接触させることによって達成される。好ましい実施形態においては、試薬は、ＡＣ１３３抗体である（ＡＣ１３３抗体は、あるいは、「５Ｆ３」と本明細書中で呼ばれる）。次いで、免疫選択（例えば、ＦＡＣＳ）のような細胞の選別のための伝統的な技術の使用によって、試薬とＡＣ１３３抗原との間での接触が検出される細胞の、同定、単離、および／または富化が可能になる。
【０００９】
別の実施形態においては、本発明は、本明細書中で５Ｅ１２と呼ばれる、新規の抗体を提供する。この抗体は、非造血性の幹細胞および始原細胞（好ましくは、ニューロスフェアを開始し得る、ＣＮＳの神経幹細胞および始原細胞）の富化された集団を提供するために使用され得、そして少なくとも１つの幹細胞ＮＳ−ＩＣ、または始原細胞を含有している細胞の集団をＡＣ１３３抗原以外の表面マーカーの糖タンパク質抗原に結合する５Ｅ１２抗体と接触させることによってこのような細胞について同定、単離、または富化する方法において使用され得る。
【００１０】
好ましい実施形態においては、本発明の細胞（好ましくは、ＣＮＳの神経幹細胞）は、ＣＤ４５およびＣＤ３４についての細胞表面マーカーを欠失しているとしてさらに特徴付けられる。
さらなる実施形態においては、本発明は、本明細書中で８Ｇ１と呼ばれる、新規の抗体を提供する。この抗体は、ＣＮＳの神経幹細胞の集団（８Ｇ１−／ｌｏとして特徴付けられる）とＣＮＳの始原細胞の集団（８Ｇ１＋として特徴付けられる）との間での部分選択を可能にするＣＤ２４を認識すると考えられている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＮＳ−ＩＣの増殖および分化を説明する図である。
【図２】図２は、ニューロスフェアの培養が、単一の細胞に選別された５Ｆ３＋細胞から開始され得ることを示す一連の写真である。
【図３】図３は、モノクローナル抗体５Ｅ１２を使用する細胞表面マーカーを使用する、ヒトのＣＮＳ神経幹細胞の単離を示す、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）データのドットプロットである。ｘ軸は、ＣＤ３４およびＣＤ４５に対する抗体についての細胞の染色を示す。ｙ軸は、５Ｅ１２抗体での細胞の染色を示す。
【図４】図４は、細胞表面マーカーによるヒトの神経幹細胞の単離を示す、ＦＡＣＳ選別データの２つのパネルのドットプロットである。ヒトの胎児の脳の細胞を、記載されているように酵素的に解離した。パネルＡは、５Ｆ３＋細胞が、５Ｅ１２抗体についての抗原を同時発現することを示す。パネルＢは、５Ｆ３＋細胞が、代表的には、８Ｇ１（ＣＤ２４）抗体についての抗原を発現しないことを示す。
【図５】図５は、妊娠週数の関数としての、胎児の脳中の５Ｆ３＋細胞の分布を示すチャートである。
【図６】図６は、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスへのヒトの神経細胞の移植の結果を示す、一連の写真である。
【図７】図７は、げっ歯類モデルに移植された場合に、５Ｆ３＋に選別された細胞の子孫が吻方の移動性の流れ（ＲＭＳ）を通じて移動することを示す、一連の写真である。
【図８】図８は、げっ歯類モデルに移植された場合に、５Ｆ３＋に選別された細胞の子孫が嗅球中に（ＲＭＳ）を通じて移動することを示す、一連の写真である。
【図９】図９は、ＡＣ１３３＋細胞の特徴を示す。図９Ａは、ＡＣ１３３の発現に基づく新しい胎児の脳細胞のフローサイトメトリーによる分離である。ヒトの胎児の脳細胞を、酵素的に解離した。細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＡＣ１３３に対するｍＡｂで染色し、そしてＡＣ１３３−画分およびＡＣ１３３＋画分に分離した。残りの造血性の細胞および内皮細胞を、ＣＤ４５−およびＣＤ３４−をそれぞれ通過させることによって、排除した。選別されたＡＣ１３３−（図９Ｂ）およびＡＣ１３３＋（図９Ｃ）のサブセットを、血清を含有していない培地中で培養し、そしてこれらの選別された細胞の増殖を、１５日間モニターした。
【図１０】図１０は、限界稀釈および単一の細胞の選別による、ＮＳ−ＩＣ活性の定量的な分析を示す。図１０Ａは、細胞選別後の限界稀釈分析による、ＮＳ−ＩＣ活性の定量的な分析である。選別された細胞を、ＦＡＣＳ−ＡＣＤＵによって９６ウェルプレート中に一連の限界細胞容量で配置した。図１０Ｂは、神経幹細胞／始原細胞のクローンの拡大を示す。ニューロスフェアは、胎児の脳から直接単離された単一の選別されたＡＣ１３３＋細胞に、または選別され／拡大された培養されたニューロスフェアに由来する単一のＡＣ１３３＋細胞に由来し得る。図１０Ｃは、クローンに由来するニューロスフェア細胞の分化能力を示す。単一の細胞に由来するニューロスフェアの子孫は、ニューロン（−チューブリン、緑）、および星状細胞（ＧＦＡＰ、赤）に分化され得る。
【図１１】図１１は、非神経形成性部位中のヒトの神経細胞の検出を示す。いくつかの場合においては、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの新生児の脳に注入されたヒトの神経細胞が、脳梁、大脳皮質、および小脳において検出された。
【図１２】図１２は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのＳＶＺ中に移植されたヒトのニューロスフェア細胞の子孫の、インビボでの長期間の増殖を示す。ＡＣ１３３＋に選別され／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞は、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側方の脳室に移植された。ヒトの細胞の移植片を、移植から７ヶ月後に分析した。図１２Ａは、成体のマウスの脳の模式図である。ヒトの細胞の移植片が評価された部位を、図に示す。ＳＶＺ、脳室下の領域；ＲＭＳ（吻方の移動性の流れ）。図１２Ｂは、ＳＶＺ中でのヒトの神経細胞の検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核抗原（ＦＩＴＣ、緑）およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した。図１２Ｃは、ＳＶＺ中での増殖しつつあるヒトの神経細胞の検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核抗原（ＦＩＴＣ、緑）、Ｋｉ６７（Ｃｙ−３、赤）、およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した。ＳＶＺ中のヒト核抗原ポジティブ細胞のほとんどはまた、増殖マーカーであるＫｉ６７を同時発現した。
【図１３】図１３は、ＲＭＳおよび嗅球に移植されたヒトのニューロスフェア細胞の、インビボでの移動および分化を示す。ＡＣ１３３＋に選別され／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞を、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤの側方の脳室に移植した。ヒトの細胞の移植片を、移植から７ヶ月後に分析した。図１３Ａは、ＡＣ１３３＋選別され／拡大されたニューロスフェア細胞の子孫がＲＭＳを通じて移動することを示す。ＲＭＳにおいては、ヒト核抗原＋細胞の整列もまた、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２３４カウンター染色でポジティブ（ピンク）であった（ｉ）。ＲＭＳ中のヒトの核抗原ポジティブ細胞（Ｃｙ−３、赤）は、β−チューブリンの発現（Ａｌｅｘｉａ ４８８、緑）と共局在化された（ｉｉ）。これらの細胞のいくつかは、明らかに二重ポジティブであった（ｉｉ、矢印）。別の切片においては、ＲＭＳ中の細胞を、ヒト特異的Ｎ−ＣＡＭ（ＦＩＴＣ、緑）およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した（ｉｉｉ）。図１３Ｂは、嗅球へのヒトの神経細胞の移動および分化を示す。嗅球においては、ヒト核抗原ポジティブ細胞は、嗅球の糸球体層中に分布された（ｉおよびｉｉ）。いくつかの場合においては、ヒトのＮ−ＣＡＭ＋ニューロン細胞を検出した（ｉｉｉ）。
【図１４】図１４は、海馬の歯状回中に移植されたヒトのニューロスフェア細胞の子孫の、インビボでの長期間の増殖および分化を示す。ＡＣ１３３＋によって選別され／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞を、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側方の脳室に移植した。ＡＣ１３３＋に選別され／拡大されたヒトのニューロスフェア細胞の新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側方の脳室への移植の７ヶ月後に、増殖しているヒトの細胞が、海馬において見出され得る。図１４Ａは、歯状回の顆粒状の領域の下での増殖しているヒトの神経細胞の検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核（ＦＩＴＣ、緑）、Ｋｉ６７（Ｃｙ−３、赤）、およびＧＦＡＰ（Ｃｙ−５、青）で染色した。いくつかのヒト核抗原＋細胞を、Ｋｉ６７で同時に染色した（矢印）。図１４Ｂは、歯状回でのヒトのニューロンの検出を示す。移植されたマウスの脳の矢状方向の切片を、抗ヒト核抗原（Ｃｙ−３、赤）、および抗チューブリン（Ａｌｅｘｉａ４８８、緑）で染色した。２つのヒト核抗原ポジティブ細胞の１つもまた、抗チューブリンについてポジティブであった（矢印）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
細胞の集団は、成体の中枢神経系（ＣＮＳ）中に存在する。これは、成体のＣＮＳの分化した成熟細胞の表現形を自己更新し、そしてそれを生じるそれらの能力において、幹細胞の特性を示す。これらの幹細胞は、ＣＮＳを通じて見出され、そして特に、脳室下の領域、および海馬の歯状回において見出される。
【００１３】
増殖因子応答性の幹細胞は、中枢神経軸の多くの領域から、そしてマウス、げっ歯類、およびヒトのＣＮＳ組織の発達の異なる段階で、単離され得る。これらの細胞は、ＥＧＦ、塩基性のＦＧＦ（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）、および形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）のような増殖因子に対するそれらの応答において変化し、そして長期間、分化していない状態で培養物中で維持され、そして拡大され得る。成体および胚性のマウスの始原細胞の両方が、ＥＧＦに対して応答し、そして未分化の細胞のスフェアとして増殖した。これらの細胞は、それらが多能性である点で幹細胞の特徴を示し、そして血清を含有している条件下では、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化し得、ＥＧＦの投与下では未分化のままでありそして増殖し続ける部分集団を維持する。マウスのＥＧＦ応答性の始原細胞は、インビトロでＥＧＦレセプターについてのｍＲＮＡを発現する。ヒトのＣＮＳの神経幹細胞培養物はもまた、同定された。ヒトを含む哺乳動物の神経幹細胞培養物（懸濁培養物または付着培養物のいずれかとして）の同定、培養、増殖、および使用は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号（両方とも、本明細書中で参考として援用される）に開示されている。同様に、Ｊｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号（本明細書中で参考として援用されている）は、付着ＣＮＳ神経幹細胞培養物について言及している。懸濁物中で培養された場合には、ＣＮＳの神経幹細胞培養物は、代表的には、ニューロスフェアを形成する。
【００１４】
図１は、ＮＳ−ＩＣがニューロスフェアに発達し、そして続いてニューロンおよびグリアの表現形への分化、ならびにＮＳ−ＩＣの子孫の生成に発達するような、ＮＳ−ＩＣの増殖を示す。１つ以上の増殖を誘導する増殖因子の存在下では、ＮＳ−ＩＣは分裂し、そしてさらなる幹細胞および始原細胞から構成される未分化の細胞のスフェア（「ニューロスフェア」）を生じる。クローンに由来するニューロスフェアが解離させられ、そして単一の細胞として、１つ以上の増殖を誘導する増殖因子の存在下に置かれる場合には、それぞれのＮＳ−ＩＣが新規のニューロスフェアを生じ得る。単一のニューロスフェアの細胞は、天然においてはクローンである。なぜなら、これらは、単一の神経幹細胞の子孫であるからである。ＥＧＦなどのような増殖を誘導する増殖因子の持続的な存在下では、ニューロスフェア中の前駆細胞は分裂し続け、それによって、ニューロスフェアの大きさの増大を生じ、そして多数の未分化の神経細胞を生じる。ニューロスフェアは、グリア筋原線維の酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；星状細胞についてのマーカー）、神経フィラメント（ＮＦ；ニューロンについてのマーカー）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；ニューロンについてのマーカー）、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；稀突起神経膠細胞についてのマーカー）に対しては免疫反応性ではない。しかし、ニューロスフェア中の細胞は、未分化のＣＮＳ細胞の多くの型において見出される中間体フィラメントタンパク質であるネスチンについて免疫反応性である（Ｌｅｈｎｄａｈｌら、６０、Ｃｅｌｌ ５８５−５９５（１９９０）、本明細書中で参考として援用される）。Ｒａｔ４０１と呼ばれるラットの抗体を含む抗体が、ネスチンを同定するために利用可能である。ニューロスフェアが、分化を可能にする条件下で培養される場合には、始原細胞は、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する。神経幹細胞の子孫に由来し得る分化した細胞型に関連する成熟表現形は、ネスチンの表現形については圧倒的にネガティブである。
【００１５】
未分化の、多能性の、自己更新する神経細胞に使用される専門用語は、これらの細胞が、「神経幹細胞」と本明細書中で呼ばれるように、展開される。神経幹細胞は、分裂することが可能であるクローン原性の多能性の幹細胞であり、そして適切な条件下では、ＮＳ−ＩＣについて自己更新する能力を有し、そして最終的にニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化し得るその子孫の娘細胞を含み得る。従って、神経幹細胞は、幹細胞の子孫が多数の分化の経路を有するので、「多能性」である。神経幹細胞は、自己維持することが可能であり、このことは、それぞれの細胞の分裂を伴って、１つの娘細胞もまた幹細胞に平均されることを意味する。
【００１６】
神経幹細胞の非幹細胞の子孫は、代表的には、「始原」細胞と呼ばれる。これは、１つ以上の系統において種々の細胞型を生じ得る。用語「神経の始原細胞」は、神経幹細胞に由来する未分化の細胞をいい、そして幹細胞自体ではない。いくつかの始原細胞は、１つより多くの細胞型に分化し得る子孫を生じ得る。例えば、Ｏ−２Ａ細胞は、グリア始原細胞である。これは、稀突起神経膠細胞およびＩＩ型星状細胞を生じ、従って、「二官能性の」始原細胞と呼ばれ得る。始原細胞の識別特性は、幹細胞とは異なり、それが自己維持を示さないこと、そして代表的には、分化の特定の経路を約束されていないと考えられ、そして最終的には、適切な条件下で、グリアまたはニューロンに分化する。
【００１７】
用語「前駆細胞」は、神経幹細胞の子孫をいい、従って、始原細胞および娘神経幹細胞の両方を含む。
【００１８】
（細胞マーカー）本発明は、ニューロスフェアを形成し得る（ＮＳ−ＩＣ）神経幹細胞の、同定、単離、富化、および培養を提供する。ＮＳ−ＩＣは、ＮＳ−ＩＣの表面上に見出される抗原の、細胞表面抗原を特異的に結合する試薬への結合を通じて同定されるか、または選択される。
【００１９】
これらの抗原の１つは、ＡＣ１３３モノクローナル抗体に結合する抗原である。ＡＣ１３３抗体（本明細書中では、５Ｆ３抗体と呼ばれる）は、プロミニンと呼ばれるヒトの細胞マーカーを認識する試薬の抗体の実施形態の例である。プロミニンは、種々の上皮細胞中で発現される多局所性（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ）膜タンパク質である（Ｗｅｉｇｍａｎｎら、９４（２３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１２４２５−３０（１９９７）；Ｃｏｒｂｅｉｌら、１１２（Ｐｔ７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２３−３３（１９９９）；Ｃｏｒｂｅｉｌら、９１（７）Ｂｌｏｏｄ ２６２５−６（１９９８）；Ｍｉｒｉｇｌｉａら、９１（１１）Ｂｌｏｏｄ ４３９０−１（１９９８））。種々のＡＣ１３３抗体が、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８４３，３３３号に記載されている。マウスのハイブリドーマ細胞株ＡＣ１３３の寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍｄ．２０８５２に、１９９７年４月２４日に行われ、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３４６が与えられた。これらのＡＣ１３３抗体は、本発明の目的のヒト細胞のサブセットについて免疫選択され得る。好ましいＡＣ１３３モノクローナル抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）から商業的に得られ得る。これには、ＡＣ１３３／１−ＰＥ抗体（Ｃａｔ＃８０８−０１）およびＡＣ１３３／２−ＰＥ抗体（Ｃａｔ＃８０９−０１）が含まれる。ＭＡＣＳ分離については、モノクローナル抗体の５０：５０混合物が好ましい。ＡＣ１３３発現の高い組織特異性は、高度に精製されたＮＳ−ＩＣ集団についての富化の間に特に有利である。
【００２０】
５Ｅ１２は、酵素的に解離させられたヒトの胎児の脳細胞に対して生成された新規のモノクローナル抗体である。５Ｅ１２モノクローナル抗体は、Ｙｉｎ、米国特許第５，８４３，６３３号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている対側性の（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）免疫化方法に実質的に従って生成された。５Ｅ１２が結合する抗原は、推定のＭＷ１２５ｋＤを有し、そしてプロミニンに由来する別の抗原であると、現在考えられている。
【００２１】
ＣＤ４５は、Ｔ２００／白血球共通抗原である。ＣＤ４５に対する抗体は、市販されている。好ましい実施形態においては、本発明の細胞およびそれらを含有している培養物は、ＣＤ４５のような細胞表面マーカーを欠失しているとして（プロミンポジティブであることに加えて）さらに特徴付けられる。
【００２２】
ＣＤ３４もまた、ｇｐ１０５−１２０として公知である。ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体は市販されており、そしてＣＤ３４モノクローナル抗体は、研究のため、および臨床的な骨髄移植のために、リンパ造血性幹細胞／始原細胞を定量および精製するために使用されている。
【００２３】
モノクローナル抗体８Ｇ１は、ＣＤ２４を認識する（ＣＤ２４に対する抗体は市販されている）と考えられ、そして、５１５キロダルトン（細胞型の制限されたスペクトルにおいて発現されるヒトのＬＲＰ／Ａ２ＭＲの鎖）と特異的に反応する。強力な免疫組織化学的反応が、肝細胞、組織マクロファージ、中枢神経系におけるニューロンおよび星状細胞のサブセット、繊維芽細胞、平滑筋細胞、ならびに動脈壁中のアテローム性動脈硬化症の病変中の単球に由来する泡沫細胞において見られる。抗体はまた、慢性および球性の白血病（ＣＤ９１）の骨髄単球性サブタイプのサブセットの特徴付けに使用され得る。ＣＤ９１に対する抗体は市販されている。
【００２４】
（細胞の蓄積）５Ｅ１２．５および８Ｇ１．７被検培養物は、特許および登録商標の特許庁長官によって決定されたものに対して、米国特許法施行規則§１．１４および米国特許法§１２２のもとでそれに対して権利を与えられた、それらを開示する特許出願の系属中に、利用可能である培養物に入手することを確実にする条件下で、寄託される。寄託物は、本出願の相当部分、またはその子孫が提出された国の外国の特許法によって必要とされる場合は、入手可能である。しかし、寄託物の利用可能性は、政府による指令によって特許権を与えられた特例において、本発明の実施のための特許使用権は構成しない。
【００２５】
さらに、５Ｅ１２．５および８Ｇ１．７の本発明の培養寄託物は、微生物の寄託についてのブダペスト条約の規則に従って、公に保存され、そして利用可能にされる。すなわち、これらは、寄託の日から少なくとも３０年間、またはこの培養物を開示している発行し得る任意の特許の施行可能期間および寄託物のサンプルについての最新の請求後５年間の間、それらを生存可能かつ未混入の状態で維持するために必要な全ての注意を伴って保存される。寄託者は、寄託物を後継する義務を認識し、寄託機関は、寄託物の状態に起因して、請求された場合にサンプルを提供することが可能でないべきである。本発明の培養寄託物の公に対する入手可能性の全ての制限は、これらを開示する特許の認可に際して確定的に排除される。
【００２６】
（細胞の単離、富化、および選択）ＮＳ−ＩＣが単離される細胞の集団は、神経組織であり得、細胞の集団は、神経組織または細胞培養物中の細胞の集団（例えば、ニューロスフェア培養物中の細胞、または接着性神経幹細胞培養物中の細胞）から解離される。
【００２７】
本発明は、ＮＳ−ＩＣの単離および同定を提供する。ニューロスフェアを開始する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）の同定は、神経細胞の集団（または神経細胞もしくは神経に由来する細胞を含有している集団）にＡＣ１３３抗原に結合する試薬を接触させる工程、およびＡＣ１３３抗原に結合する試薬と細胞表面上のＡＣ１３３抗原との間の接触を検出する工程を包含する。試薬が結合するこれらの細胞は、ＮＳ−ＩＣとして同定される。これらの細胞の同定は、これら細胞が実際に、ニューロスフェアの開始、自己再生および多能性が可能であるＮＳ−ＩＣであることを実証するアッセイによって確認され得る。
【００２８】
本発明の方法はまた、ＡＣ１３３抗体を使用して、ＡＣ１３３―細胞からＡＣ１３３＋細胞を単離するために使用され得る。これは、ＮＳ−ＩＣの画分を含有する神経細胞の集団を、ＡＣ１３３抗原に特異的に結合する試薬と混合し、次いで、ＡＣ１３３＋細胞についてＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣにおいて富化された選択された集団を生じる。選択することにより、それによって、選択前の神経細胞の集団と比較した場合に、
従って、本発明はさらに、神経組織または神経幹細胞培養物（例えば、ニューロスフェア懸濁培養物または神経幹細胞接着性培養物）由来のＮＳ−ＩＣの富化を提供する。従って、本発明は、幹細胞および始原細胞が低頻度で生じるか、あるいは枯渇され得る神経組織（例えば、後期胚、若年性組織、および成体組織）に由来するＮＳ−ＩＣの富化に有用である。当業者は、ＮＳ−ＩＣの画分を含有している神経細胞の集団をＡＣ１３３抗原に特異的に結合する試薬と混合し；そしてＡＣ１３３＋細胞を選択し得る。この方法において、選択されたＡＣ１３３＋細胞は、神経細胞の集団と比較した場合に、そのＮＳ−ＩＣの画分において富化される。
【００２９】
細胞の選択は、フローサイトメトリー（例えば、蛍光色素結合体化ＡＣ１３３抗体を使用する蛍光活性化細胞選別による）を含む、当該分野で公知の任意の適切な手段により得る。選択はまた、磁性粒子に結合体化されたＡＣ１３３抗体を使用する、高勾配磁気的選択により得る。固相への接着および固相からの脱接着を含む任意の他の適切な方法もまた、本発明の範囲内で意図される。
【００３０】
当業者は、ＡＣ１３３抗体を使用する免疫選択によって細胞の集団を誘導し得る。細胞の集団は、少なくとも３０％のＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣ、好ましくは、少なくとも５０〜７０％のＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣ、そしてより好ましくは、９０％以上のＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣを含むはずである。最も好ましくは、ＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣの実質的に純粋な集団であり、これは、少なくとも９５％のＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣを含む。得られ、そして実際に使用される富化の程度は、選択の方法、増殖の方法、およびニューロスフェアの開始のために培養物中に配置される細胞の細胞用量を含む、多数の因子に依存する。
【００３１】
細胞の集団は、後期胚、若年性または成体の哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）組織から誘導され得るか、あるいは、Ｗｅｉｓｓ、米国特許第５，７５０，３７６号またはＪｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号に記載されているような、神経幹細胞の既存の培養物から誘導され得る。最も好ましい実施形態においては、ＮＳ−ＩＣはヒトである。いくつかの実施形態においては、集団中のＡＣ１３３＋細胞は、内皮細胞に複合体化され得る。
【００３２】
富化されたＡＣ１３３＋ＮＳＩＣの集団を含有している本明細書中で記載されるインビトロでの細胞培養物は、一般的には、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）についてポジティブであり、そして分化を誘導する条件の存在下で、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する始原細胞を生じる点で、特徴付けられる。
【００３３】
当業者は、単離されたＡＣ１３３＋細胞を培養培地に導入し得、培養物中で単離されたＡＣ１３３＋細胞を；特に、ニューロスフェアとして増殖させ得；単離されたＡＣ１３３＋細胞がニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する条件下でこの単離されたＡＣ１３３＋細胞の子孫を培養し得；次いで、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞の存在を検出し得る。ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞の存在は、単離されたＡＣ１３３＋細胞をＮＳ−ＩＣとして特徴付ける。
【００３４】
代表的には、ＡＣ１３３＋ＮＳ−ＩＣは、ニューロスフェアの成長および増殖を可能にする培地中で培養される。単離されたＡＣ１３３＋細胞が増殖する培養物は、多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するために有効な１つ以上の予め決定された増殖因子を含有する無血清培地であり得る。培養培地は、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２；ｂＦＧＦ）、またはそれらの組合せから選択される増殖因子で補充され得る。培養培地は、神経生存因子（ＮＳＦ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＡ）でさらに補充され得る。ＡＣ１３３＋細胞がニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞に分化する条件は、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２またはＬＩＦを含有しないウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培養培地中で、ラミニンでコーティングされた表面上でＡＣ１３３＋細胞の子孫を培養し得る。
【００３５】
本発明はまた、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響を与える増殖因子の存在を同定するための方法を提供する。当業者は、ＮＳ−ＩＣを含有する組成物と、ＮＳ−ＩＣの増殖をもたらす少なくとも１つの増殖因子を含有することが予想される組成物を混合し、次いで、ＮＳ−ＩＣの増殖を決定組成物の存在の関数として決定する。変更された（増大した、減少したなど）ＮＳ−ＩＣの増殖は、ＮＳ−ＩＣの増殖をもたらす増殖因子の組成物中の存在を示す。次いで、当業者はさらに、増殖因子を同定し得る。
【００３６】
（ＡＣ１３３に対する抗体）ＡＣ１３３に対する抗体は、米国特許第５，８４３，６３３号（本明細書中で参考として援用されている）において議論されているように、入手され得るかまたは調製され得る。ＡＣ１３３抗原は、種々のＡＣ１３３モノクローナル抗体（これは、ＡＣ１３３抗原に対して特異性を有する）のような抗体と接触させられ得る。ＡＣ１３３抗体は、還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるウェスタンブロット条件下でＡＣ１３３タンパク質に結合することによって特徴付けられる。ＡＣ１３３抗原は、市販のスタンダードに基づいて、約１１７ｋＤａの範囲の分子量を有する。ＡＣ１３３抗原は、ヒト骨髄、胎児骨髄および肝臓、臍帯血、ならびに生体の末梢血に由来する始原細胞のサブセット上で発現される。
【００３７】
ＡＣ１３３抗原に対する抗体は、異種免疫応答性を有する哺乳動物宿主（マウス、げっ歯類、ウサギ目、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む）を、ヒト始原細胞で免疫することによって得られ得る。特定の宿主の選択は、主に簡便なものであり得る。免疫化のために適切な始原細胞の集団は、サイトカインが動員された末梢血、骨髄、胎児臓肝臓などからＣＤ３４＋細胞を単離することによって得られ得る。免疫化のために適切な始原細胞の集団は、ＣＮＳ神経幹細胞または他のＮＳ−ＩＣから得られ得る。免疫化は、細胞が、皮下、筋肉内、腹膜内、脈管内などで注射され得る、従来技術に従って行われる。通常は、約１０６から１０８個までの細胞が、使用される。これは、１回以上の注射に分けられ得、通常は、約８回以下の注射に分けられ、約１から３週間までの期間にわたる。注射は、例えば、アジュバント（完全または不完全フロイトアジュバント、スペコール（ｓｐｅｃｏｌ）、ミョウバンなど）を伴って、または伴わずに行われ得る。
【００３８】
免疫化スケジュールの完了後、抗血清は、始原細胞の表面膜タンパク質（ＡＣ１３３抗原を含む）に特異的な多角形（ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）の抗血清を提供するための従来の方法に従って、回収され得る。リンパ球は、適切なリンパ系組織（例えば、脾臓、流入領域リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）など）から回収され、そして適切な融合パートナー（通常は、骨髄腫株）と融合され、それによって特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生する。目的の抗原特異性についてのハイブリドーマのクローンのスクリーニングは、従来の方法に従って行われる。
【００３９】
ＡＣ１３３抗体は、通常の多量体構造の代わりに、単鎖として産生され得る。単鎖抗体は、Ｊｏｓｔら、２６９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２６７−７３（１９９４）（本明細書中で参考として援用されている）などに記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、グリシンまたはセリンを含む、少なくとも約４個のアミノ酸の小さい中性のアミノ酸をコードするスペーサーに対して連結される。この融合体によってコードされるタンパク質は、元々の抗体の特異性および親和性を保持する機能的な可変領域のアセンブリを可能にする。
【００４０】
ＡＣ１３３抗体は、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ ｃＤＮＡの使用によって産生され得る（Ｌｉｕら、８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３４３９（１９８７）および１３９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５２１（１９８７）（本明細書中に参考として援用されている））。ｍＲＮＡは、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、そしてｃＤＮＡを産生するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特異的プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得る（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）。あるいは、ライブラリーを作製し、そして目的の配列を単離するためにスクリーニングする。次いで、この抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列が、ヒトの定常領域配列に対して融合される。ヒトの定常領域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）に見出され得る。ヒトＣ領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手可能である。次いで、キメラのヒト化抗体が、従来の方法によって発現される。
【００４１】
ＡＣ１３３抗体は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂのような抗体フラグメントとして産生され得る。抗体フラグメントは、インタクトなタンパク質の切断によって（例えば、プロテアーゼによるか、または化学的な切断による）調製され得る。あるいは、短縮型の遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、それに続く翻訳終止コドンを含み、短縮の分子を生じる。
【００４２】
（免疫染色）生物学的サンプルは、対象の抗体によって結合された表面分子を発現する細胞の存在についての任意の従来のイムノアッセイ方法によって、ＡＣ１３３＋細胞の存在についてアッセイされる。アッセイは、細胞の溶解物、インタクトな細胞、凍結切片などについて行われ得る。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）から入手可能な抗体は、細胞の直接的な免疫蛍光染色に適切である。
【００４３】
（細胞の選別）ＮＳ−ＩＣ細胞に対する細胞表面抗原の使用は、始原細胞集団のポジティブな免疫選択ならびにフローサイトメトリーを使用する始原細胞集団の表現型分析のための手段を提供する。ＡＣ１３３抗原の発現について選択された細胞は、さらに、他の幹細胞および始原細胞マーカーについての選択によって精製され得る。
【００４４】
実質的に純粋な始原細胞および幹細胞の調製のために、始原細胞のサブセットが、ＡＣ１３３結合に基づいて他の細胞から分離される。始原細胞および幹細胞は、当該分野で公知の他の表面マーカーに結合させることによって、さらに分離され得る。
【００４５】
分離のための手順は、磁気的分離（抗体でコーティングされた磁性ビーズを使用する）、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリクス（例えば、プレート）に結合された抗体での「パニング」、または他の従来技術を含み得る。正確な分離を提供する技術として、蛍光活性化細胞選別機が挙げられる。これは、複数の色のチャネル、鋭角および鈍角の光の散乱を検出するチャネル、インピーダンスチャネルなどのような、種々の程度の精巧性を有し得る。死細胞は、死細胞に関連する色素（ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］、ＬＤＳ）での選択によって排除され得る。選択された細胞の生存性について過度に有害でない任意の技術が、使用され得る。
【００４６】
簡便には、抗体は、特定の細胞型の分離を容易にすることを可能にするための標識（例えば、磁性ビーズ；ビオチン（これは、アビジンまたはストレプトアビインに対して高い親和性を有して結合する）；蛍光色素（これは、蛍光活性化細胞選別機とともに使用され得る）；ハプテンなど）と結合体化され得る。多色分析は、ＦＡＣＳとともに、または免疫磁気的分離とフローサイトメトリーとの組合せにおいて使用され得る。多色分析は、複数の表面抗原（例えば、ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−、ＡＣ１３３ーＣＤ３４＋など）に基づく細胞の分離のために関心深い。多色分析における使用を見出されている蛍光色素として、フィコビリンタンパク質（例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン）；フルオレセイン、およびテキサスレッドが挙げられる。ネガティブな指示は、染色のレベルが、アイソタイプ適合ネガティブコントロールの明るさ以下であることを示す。かすかな指示は、染色のレベルが、ネガティブの株のレベルに近く得るが、またアイソタイプ適合コントロールよりも明るくあり得ることを示す。
【００４７】
１つの実施形態においては、ＡＣ１３３抗体は、磁性試薬（例えば、超常磁性微粒子（微小粒子）に対して直接的または間接的に結合体化される。磁性粒子への直接的な結合体化は、当該分野で公知の種々の化学連結基の使用によって達成される。抗体は、側鎖のアミノ基またはスルフヒドリル基、ならびにヘテロ官能性の交差連結試薬を介して、微粒子にカップリングされ得る。多数のヘテロ官能性の化合物が、実体への連結のために利用可能である。好ましい連結基は、抗体上の反応性スルフヒドリル基および磁性粒子上の反応性アミノ基を用いる、３−（２−ピリジジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）である。
【００４８】
あるいは、ＡＣ１３３抗体は、磁性粒子に対して間接的にカップリングされる。この抗体は、ハプテンに対して直接的に結合体化され、そしてハプテン特異的な第２段階の抗体が、粒子に結合体化される。適切なハプテンとして、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。タンパク質へのハプテンの結合体化のための方法（すなわち、当該分野で公知である）、およびこのような結合のためのキットは、商業的に入手可能である。
【００４９】
この方法を実行するために、ＡＣ１３３抗体が細胞のサンプルに対して添加される。特定の細胞のサブセットに対して結合するために必要なＡＣ１３３ Ａｂの量は、試験分離および分析を実行することによって経験的に決定される。細胞およびＡＣ１３３抗体は、複合体が形成させるために十分な時間（通常は少なくとも５分間、より通常は少なくとも１０分間、そして通常は１時間以下、より通常は約３０分以下）でインキュベートされる。
【００５０】
さらに、細胞は、始原細胞または幹細胞上に存在するかまたは存在しないことが公知である細胞表面マーカーに対して特異的な抗体または結合分子とともにインキュベートされる。
【００５１】
標識された細胞は、特異的な抗体の調製に従って分離される。蛍光色素で標識された抗体は、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気的選択（特に、高勾配の磁気的選択（ＨＧＭＳ））のための磁性粒子などに有用である。例示的な磁気的分離デバイスは、ＷＯ９０／０７３８０、ＰＣＴ／ＵＳ９６／００９５３、およびＥＰ４３８，５２０に記載されている。ＡＣ１３３ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）は、ＡＣ１３３＋細胞のポジティブ選択のために使用され得る。このキットは、ＡＣ１３３＋細胞の単一の工程での単離のためのツールを提供する。ＡＣ１３３ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、ＦｃＲブロック試薬（ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）およびモノクローナルマウス抗ヒトＡＣ１３３抗体に結合体化されたＭＡＣＳコロイド状マイクロビーズ（ＭＡＣＳ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）を含む。
【００５２】
精製された細胞の集団は、任意の適切な培地中に回収され得る。ダルベッコ改変イーグル培地（ｄＭＥＭ）、ハンクス塩基性塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）などを含む、種々の培地が商業的に入手可能であり、そして使用され得る。これらはしばしば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などで補充される。
【００５３】
ヒトの始原細胞または幹細胞について高度に富化された集団は、この様式において達成される。所望される細胞は、３０％以上の細胞の組成物であり、好ましくは、５０％以上の細胞集団、より好ましくは、９０％以上の細胞集団であり、そして最も好ましくは、９５％以上（実質的に純粋な）の細胞集団である。
【００５４】
（精製された幹細胞／始原細胞の使用）ＡＣ１３３＋幹細胞／始原細胞が、種々の方法において有用である。ＡＣ１３３＋細胞は、その細胞が疾患または損傷によって失われた宿主を再構成するために使用され得る。細胞に関連する遺伝的な疾患は、遺伝的な欠損を修正するか、または疾患に対して防御するように処置するために、自己幹細胞または同種異系幹細胞の遺伝的改変によって処置され得る。あるいは、正常な同種異系の始原細胞が移植され得る。ホルモン、酵素、増殖因子などの特定の分泌された生成物の欠損に関連する、細胞に関連する疾患以外の疾患もまた、処置され得る。ＣＮＳ障害は、神経変性性の疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、急性脳損傷（例えば、発作、頭部の損傷、脳性麻痺）、および多数のＣＮＳ不全（例えば、うつ病、てんかん、および精神分裂病）のような多数の苦痛を含む。最近の数年間においては、神経変性性の疾患は、これらの障害についてのもっとも大きな危険性を有する高齢者の集団が増大しつつあることに起因して、重要な関心となっている。アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病を含むこれらの疾患は、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の変性に関連しており、これによって、これらの細胞または脳領域が、それらの意図される機能を実行することを不可能にする。特異的な異なる増殖因子による１つ以上の選択された系統への成熟、増殖、および分化を提供することによって、始原細胞は、約束された細胞の供給源として使用され得る。ニューロスフェアはまた、種々の血液細胞型（骨髄性細胞およびリンパ系細胞、ならびに初期の造血細胞を含む）を産生するためにも使用され得る（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、２８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ５３４（１９９９）（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。
【００５５】
ＡＣ１３３＋細胞もまた、細胞の分化および成熟に関連する因子の単離および評価において使用され得る。従って、細胞は、培地（例えば、馴化培地）の活性を決定するためのアッセイ、増殖因子活性、系統の専門性（ｄｅｄｉｃａｔｉｏｎ）との関係などについて、体液を評価するためのアッセイなどにおいて使用され得る。
【００５６】
ＡＣ１３３＋細胞は、液体窒素温度で凍結させられ得、そして長期間貯蔵され得、融解され得、そして再度使用され得る。細胞は、通常は、５％のＤＭＳＯおよび９５％のウシ胎児血清中で保存される。一旦融解されると、細胞は、幹細胞の増殖および分化に関連する増殖因子または間質細胞の使用によって、拡大され得る。
【００５７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために示される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような、本発明の範囲を限定するようには決して解釈されないべきである。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
（ＡＣ１３３磁気的細胞選別（ＭＡＣＳ）でポジティブ選択された胎児脳細胞は、ニューロスフェア惹起細胞（ＮＳ−ＩＣ）活性を含む）
ＡＣ１３３＋細胞は、以下の方法によって調製される：ヒト胎児脳（ＦＢＲ１０〜２０妊娠週数［「ｇ．ｗ．」］）を、インフォームドコンセントを得た後で、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，ＩＮＣ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）から得た。ヒト胎児脳組織をメスを使用して１〜３ｍｍの立方体の切片に切断し、５０ｍＬの遠心分離チューブ中に移し、そして０．０２％のＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で１回洗浄した。組織を、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの存在下で３７℃で１時間酵素的に解離させた。細片および凝集物を、７０ミクロンのフィルターカップを通して細胞懸濁物を濾過することによって除去した。
【００５９】
ＡＣ１３３＋のヒト胎児脳細胞を、常磁性抗体マイクロビーズ、ＡＣ１３３／１ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃５０８−０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用することによって分離した。ＭＡＣＳ分離を、キットに添付されている説明書に基づいて行った。代表的なＡＣ１３３＋の単離物からの代表的なフローサイトメトリー性ＭＡＣＳ分離において、約４４％の細胞がＡＣ１３３＋ＣＤ４５−であり、一方、約２％がＣＤ３４＋であった（これらのＣＤ３４＋細胞は、精製されたＮＳ−ＩＣに複合体化された内皮細胞であった）。
【００６０】
上記の方法（１８ｇ．ｗ．の脳を使用する）によって得られたＡＣ１３３＋選択細胞は、なお異種であった。この細胞は、内皮細胞と複合体を形成する傾向にあった。内皮細胞を、ＣＤ３４＋またはＣＤ１０５＋として同定した。ＡＣ１３３
ＭＡＣＳ分離はまた、ＡＣ１３３＋細胞に関連するＣＤ３４＋内皮細胞を富化する（継代後、ＮＳ−ＩＣは複合体化した内皮細胞から分離し、そして精製されたＮＳ−ＩＣが得られ得る）。
【００６１】
ＡＣ１３３＋のＭＡＣＳ分離された細胞を、上記のように、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、およびＬＩＦを含有している培地の存在下で培養した。一般的には、初期の妊娠期間の胎児脳（５〜１２ｇ．ｗ．）に由来する細胞を、ＮＳ−ＩＣについて富化し、そして富化は、ニューロスフェア培養物を開始するためには必要ではなかった。一方、より高週齢の胎児脳サンプル（１６〜２０ｇ．ｗ．）に由来する細胞は、はるかに低いＮＳ−ＩＣ活性を含み、そしてニューロスフェア培養物を開始するために富化を必要とした。換言すると、ＡＣ１３３＋は、より妊娠期間の長いヒト脳組織からのＮＳ−ＩＣの富化に有用である。胎児脳（１８ｇ．ｗ．）に由来するＡＣ１３３＋のＭＡＣＳ分離された細胞は、ＮＳ−ＩＣ活性について富化されたが、一方、ＡＣ１３３＋のＭＡＣＳ分離を伴わない全ヒト胎児脳細胞（１８ｇ．ｗ．）は、ニューロスフェア培養物を開始しなかった。
【００６２】
ＡＣ１３３ ＭＡＣＳ細胞から樹立されたニューロスフェア細胞は、培養物中で約７日目以後に試験し、そしてウサギ抗ヒトネスチンポリクローナル抗体によって検出されたように、ネスチンを発現した。例えば、Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から入手可能であるニューロスフェア細胞の中でも、ＦＢＲ １０６９（１８ｇ．ｗ．）、およびＦＢＲ １０７０（２０ｇ．ｗ．）がネスチンを発現した。分化が誘導された場合は、ＡＣ１３３＋ＭＡＣＳ由来ニューロスフェア細胞は、ニューロンについてのβ−チューブリン染色および星状細胞についてのＧＦＡＰ染色によって検出されるように、ニューロンおよび星状細胞に分化し得る。この特定の分化アッセイにおいて、ニューロスフェア細胞を、１％のＦＢＳの存在下で、そしてＥＧＦ、ＦＧＦ−２、およびＬＩＦを含まない、ラミニンコーティングした表面上で培養した。
【００６３】
他の分化アッセイが、ニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細胞へのＮＳ−ＩＣの分化を誘導するために使用され得る。
【００６４】
（実施例２）
（ＡＣ１３３は長期間のニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）培養によって細胞上に発現される重要な細胞表面マーカーである）
長期間のニューロスフェア細胞の培養物である、８．５ ＦＢＲを、Ｃｙｔｏ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）から入手した。８．５ ＦＢＲニューロスフェア細胞は、比較的均質にＡＣ１３３を発現する。これらの８．５ＦＢＲ細胞はまた、Ｔｈｙ−１＋、ＣＤ１６６＋、およびＨＬＡ−ＤＲ＋でもある。基本的な培地としてＥｘ Ｖｉｖｏ １５を使用した場合は、高い割合のニューロスフェア培養が、１８ｇ．ｗ．に由来する初代の脳組織から開始された。従って、発達しつつあるニューロスフェア培養物中の細胞のＡＣ１３３＋画分を評価することが可能である。ＡＣ１３３＋細胞の割合は、ニューロスフェアの発達に伴って増大した。一旦、ニューロスフェア細胞が十分に確立されると、ニューロスフェアを形成する実質的に全ての細胞がＡＣ１３３を発現した。
【００６５】
（実施例３）
（ニューロスフェアを開始する細胞はモノクローナル抗体ＡＣ１３３、フローサイトメトリーによる細胞選別（ＦＡＣＳ）アプローチを使用して分離され得る）
この実施例の目的は、ＡＣ１３３＋細胞が多能性のＮＳＣ活性を有する脳中の唯一の細胞であるかどうかを試験することである。ヒトのＣＤ４５に対するｍＡｂを、胎児の組織中の血液細胞の混入物を除くために使用した。いくつかの場合においては、ヒトのＣＤ３４に対する抗体を、内皮細胞および内皮性の神経先祖複合体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）を排除するために使用した。従って、胎児の脳細胞を、ＣＤ４５−ＣＤ３４−と定義した。神経幹細胞および最初の先祖（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）活性を測定するために、ＮＳ−ＩＣアッセイを、所定の集団中のＮＳ−ＩＣの頻度を決定するために確立した。ＮＳ−ＩＣが稀であり、そしてＡＣ１３３抗原を均一に発現する場合には、ＮＳ−ＩＣを、ＡＣ１３３＋選択によって富化し得、そして他の画分においては同様に枯渇し得た。
【００６６】
（モノクローナル抗体の供給源）ＡＣ１３３抗原を、２つのｍＡｂ（ＡＣ１３３／１およびＡＣ１３３／２）によって定義した。これらの両方ともが、フィコエリトリンと結合している。これらはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を通じて入手可能である。抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびグリコフィリン（Ｇｌｙｃｏｐｈｒｉｎ）Ａ−ＦＩＴＣを、ＣＡＬＴＡＧ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＣｏｕｌｔｅｒ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）からそれぞれ入手した。抗ヒトアロフィコシアニン結合ＣＤ３４を、ＢＤＩＳ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手した。
【００６７】
（細胞調製物）ＦＢＲを、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼによって解離させ、そしてこれらはなお内皮性の先祖複合体を含んだ。これは、単一の細胞懸濁物中の候補のＮＳＣの単離を妨げた（内皮細胞はＣＤ４５＋である）。この内皮細胞−ＮＳ−ＩＣ複合体を解離させるために、上記のように処理したＦＢＲ細胞をさらに、１０〜１５分間、トリプシンで処理した。ＡＣ１３３抗原、ＣＤ４５抗原、およびＣＤ３４抗原は、トリプシン処理について耐性であったが、一方グリコフィリンＡは感受性であった。
【００６８】
トリプシン消化後、細胞を洗浄し、そしてＣＤ４５、グリコフィリンＡ、ＡＣ１３３、およびＣＤ３４に対するｍＡｂで染色した。免疫磁気性のビーズでの選択は使用しなかった。細胞を、氷上で２０〜６０分間インキュベートした。最後の洗浄後に、細胞を、１μｇ／ｍＬのよう化プロピジウム（ＰＩ）を含有しているＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した。標識した細胞を分析し、そして二重レーザーＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）で選別した。死亡した細胞を、それらのＰＩ染色特性によって分析から排除した。選別した後、選別した細胞の集団の純度を、ＦＡＣＳ再分析によってチェックした。ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−細胞（ＮＳ−ＩＣ、約５％の出発細胞）およびＡＣ１３３−ＣＤ４５−細胞（約８７％の出発細胞）の、選別の前および選別の後での代表的なＦＡＣＳプロフィールを行った。
【００６９】
（ＮＳ−ＩＣ活性はＡＣ１３３＋サブセットにおいては高度に富化されるが、ＡＣ１３３−サブセットにおいては高度には富化されない）ＦＢＲ細胞（代表的には、１６〜２０ｇ．ｗ．）を、代表的には、ＣＤ４５−ＣＤ３４−ＡＣ１３３−およびＣＤ４５−ＣＤ３４−ＡＣ１３３＋画分に選別した。有意なＮＳ−ＩＣ活性は、ＦＢＲ中のＣＤ４５＋またはＣＤ４５−ＣＤ３４＋の集団中には残っていなかった。
【００７０】
選別した細胞を、上記のニューロスフェア培地中で培養した。代表的には、Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５またはＥｘ Ｖｉｖｏ １５、Ｄ−ＭＥＭ、Ｆ−１２培地の組合せを、基本的な培地として使用した。ニューロスフェアの発達を最大にするために、選別した細胞を、代表的には、ＬＩＦ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、および神経生存因子ＮＳＦ（Ｃａｔ．ＣＣ−４３２３，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養した。
【００７１】
単一の細胞懸濁物を、細胞の選別後に得た。インビトロでの培養の４〜５日後に、ＡＣ１３３＋細胞は増殖を開始し、そして小さいニューロスフェアが培養の開始後８〜１０日で観察された。細胞は、ＮＳＦを伴わないＬＩＦ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦの存在下で培養した場合に、ニューロスフェアを開始し得た。ニューロスフェア培養物は、ＡＣ１３３＋ＣＤ４５−またはＡＣ１３３＋ＣＤ４５―ＣＤ３４−に選別された４つのＦＢＲ組織（１８−２０ｇ．ｗ．）のうちの４つから開始した。
【００７２】
対照的に、ＡＣ１３３−ＣＤ４５−ＦＢＲ細胞を、ＬＩＦ、ＦＧＦ−２、およびＥＧＦの存在下で培養物中に配置した場合には、ごくわずかなニューロスフェアの形成が見られ、そして新しいフラスコに継代することはできなかった。さらにＮＳＦを増殖培地に添加した場合には、いくつかのニューロスフェアの開始が観察された。従って、ＡＣ１３３−ＣＤ４５−ＦＢＲ細胞を、ＮＳ−ＩＣの有意な量で枯渇させた。
【００７３】
（実施例４）
（ＮＳ−ＩＣ細胞について富化させるためのＡＣ１３３＋細胞の分離）
ＡＣ１３３＋細胞の分離は、組織に由来するＮＳ−ＩＣ細胞を富化させるために有効に使用され得る。さらに、ＡＣ１３３＋細胞の分離は、確立された調製物に由来するＮＳ−ＩＣについてさらに富化し得る。１つの試験においては、解離させられたニューロスフェア（Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）のＡＣ１３３＋細胞の選別は、大きく富化されたＮＳ−ＩＣ培養物を提供し、そして増大したニューロスフェアの確立を示す。この培養物を使用すると、それぞれのウェル中でニューロスフェアを開始するために必要とされる細胞用量（すなわち、１００％ポジティブ）は、３，０００〜１０，０００個の細胞から約３０個の細胞にまで減少させることができる（以下の表１を参照のこと）。
【００７４】
【表１】
表１に示すように、本明細書中で使用した（ｇ．ｗ．２０）富化していない新しい脳組織（「ＦＢＲ」）は、全てのウェル中でニューロスフェアを開始するための、３，０００から１０，０００個の間の細胞用量を必要とするそのような数で、ＮＳ−ＩＣを含み得る。本発明の方法を使用することによって、富化された集団を得ることができ、その結果、１，０００個またはそれ未満の細胞およびより好ましくは富化された集団の用量が必要とされ、その結果、１００個の細胞未満である細胞用量が必要とされる。表１に示すように、本明細書中では富化は、わずか約３０個の細胞の細胞用量がそれぞれのウェル中でのニューロスフェア培養物を確立するために１つのウェル当たりに必要とされるように、達成されている。表１はまた、集団をＡＣ１３３＋細胞中で枯渇させる場合（ＦＢＲ １１０４ ＡＣ１３３ｎｅｇ．に選択された細胞）には、これらの集団からのニューロスフェア培養物の確立が明らかに減少することを示す。
【００７５】
（定量的なＮＳ−ＩＣアッセイ）ＮＳ−ＩＣの存在についてアッセイするために、多能性のＮＳ−ＩＣを含有していると予想される細胞の集団を、クローンの発達に供する。細胞を、ニューロスフェアを形成するように増殖培地中で増殖させ、次いで、ニューロン、星状細胞、およびオリゴ樹状細胞を形成するように分化を誘導する。ニューロン、星状細胞、およびオリゴ樹状細胞の存在は、免疫染色によって示され得る。例えば、β−チューブリンの存在についてのニューロンの染色；ＧＦＡＰの存在についての星状細胞の染色；およびＯ４の存在についてのオリゴ樹状細胞の染色。
【００７６】
定量的なＮＳ−ＩＣアッセイを、精製していない組織細胞に対して、ＡＣ１３３＋に選別した細胞に対して、そしてクローンのニューロスフェア細胞株に対して行い得る。
【００７７】
（実施例５）
（ＮＳ−ＩＣの増殖および継代のための細胞培養培地）
Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号は、「多能性の神経幹細胞の増殖を誘導するのに有効な１つ以上の予め決定された増殖因子を含有している培養培地」、および「分化を誘導する条件」を開示している。しかし、以下を含むが、これらに限定されない、異なる基本的な培地を使用し得る：
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；
Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；
神経先祖基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；または、
上記の基本培地の組合せ。
【００７８】
ヒトのニューロスフェア細胞を培養するための代表的な培地処方物を、表２に提供する。
【００７９】
【表２】
ＥＧＦを、培地を濾過した後に、ヒトのニューロスフェアについての１００ｍｌの基本培地に添加する。ＥＧＦは、培地中では比較的安定である、ＦＧＦ−２およびＬＩＦを、使用するために培地を準備するときに添加する。補充試薬の最終濃度は以下のとおりである：
５ｍｇ／ｍｌ インシュリン
１００ｇ／ｍｌ ヒトのトランスフェリン
６．３ｎｇ／ｍｌ プロゲステロン
１６．１ｎｇ／ｍｌ プトラシン（Ｐｕｔｒａｓｃｉｎｅ）
５．２ｎｇ／ｍｌ セレナイト
２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ
２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２
１０ｎｇ／ｍｌ ＬＩＦ
２ｇ／ｍｌ ヘパリン
２ｍＭ Ｌ−グルタミン
６ｍｇ／ｍｌ グルコース
培地処方物の最適化は、確立される初代の脳組織から開始される高い割合のニューロスフェアを可能にする。本発明者らは、Ｅｘ Ｖｉｖｏ １５培地を好む。培地処方物の最適化もまた、より一定のニューロスフェアの増殖可能にする。ニューロスフェアの発達を最大にするためには、ＮＳ−ＩＣを、代表的には、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、および神経生存因子ＮＳＦ（Ｃａｔ．ＣＣ−４３２３，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養する。１つの試験においては、トリプシン処理したＦＢＲ １１０１神経細胞およびトリプシン処理したＦＢＲ １１０４神経細胞（Ｃｙｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の両方が、ＬＩＦ，ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、およびＮＳＦを有するＥｘ Ｖｉｖｏ １５培地中で培養した場合に、増大した増殖を示す。
【００８０】
（実施例６）
（細胞の選別による胎児の脳に由来するヒトの神経幹細胞の直接的な単離）
広範囲のニューロンを再生し得る高度に定義された移植可能なヒト細胞の大量の供給源は、神経退行性の障害の処置のための有効な治療用産物であり得る。ヒトの神経幹細胞（ＮＳＣ）の富化のための再現性のある方法を定義するために、本発明者らは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＮＳＣを同定しそして精製するための、ヒトの神経細胞の表面マーカーに対して指向されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開発し、そして使用した。ＦＡＣＳおよび免疫組織化学的分析に基づいて、２つのｍＡｂ（５Ｆ３および５Ｅ１２）を同定した。これらは、胎児の脳細胞の小さなサブセットを定義し、そしてＣＮＳ幹細胞を含有することが公知の部位である、脊髄（１２ｇ．ｗ．）の底板および上衣層中の細胞に対して特異的な反応性を提示した。これらのｍＡｂは、ＦＢＲ細胞の５％未満を染色し、そして長期間のニューロスフェアの培養物に由来する９５％以上の細胞がポジティブであった。
【００８１】
一例として、２つの細胞の集団（５Ｆ３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−（５Ｆ３＋）および５Ｆ３−ＣＤ３４−ＣＤ４５−（５Ｆ３−））を選別し、そしてニューロスフェアの培養を開始するそれらの能力について試験した。５Ｆ３＋サブセットは、ニューロスフェアを開始する細胞活性について高度に富化された；これらは、培養物中で８〜１０日までに小さいニューロスフェアを形成するように増殖した。対照的に、選別された５Ｆ３−細胞は、単細胞懸濁物のままであり、ニューロスフェアを開始できず、そして最終的に死亡した。拡大した５Ｆ３＋に選別されたニューロスフェア細胞は、ネスチンの発現についてポジティブであり、そして分化条件への曝露後に、ニューロンおよびグリアに分化した。ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを使用するインビボでの研究は、移植後８週間で、５Ｆ３＋ニューロスフェア細胞が植え付けられ得、そして移動し得ることを示す。これらの研究は、本発明者らが、細胞表面マーカーおよびフローサイトメトリーに基づいて人のＮＳＣを同定しそれを富化したこと、ならびにインビトロおよびインビボでのアッセイを使用してそれらの活性を実証したを示す。
【００８２】
さらなる試験においては、本発明者らは、種々の在胎齢にわたって脳および脊髄組織を試験した。初期（５〜１２ｗｋの妊娠期間）の在胎齢は、後期の在胎齢（１６〜２０ｗｋの妊娠期間）よりも高い頻度のニューロスフェアを開始する細胞（ＮＳ−ＩＣ）を有する。例えば、図５を参照のこと。これらの組織に由来する細胞の直接の培養は、ニューロスフェアの開始を導く。
【００８３】
本発明者らのデータ（以下の表３に示す）は、５Ｆ３＋細胞について富化された神経細胞の細胞の集団が、ＮＳ−ＩＣ活性について２３倍も富化されることを実証する。
【００８４】
【表３】
さらに、図２に示すように、ニューロスフェアを、単一の細胞に選別した５Ｆ３＋細胞にから誘導し得る。本発明者らはまた、５Ｆ３＋に選別した細胞から誘導されたニューロスフェア細胞の自己更新が、単一の細胞に由来するニューロスフェアの再開始によって達成され得ることを実証した（データは示さない）。逆に、本発明者らのデータは、５Ｆ３＋細胞を除去された細胞の集団もまた、ＮＳ−ＩＣ活性について枯渇されることを示す。
【００８５】
（実施例７）
（異なるマーカーによるＮＳ−ＩＣの単離）
第２の実施例として、本発明者らは、本明細書中に記載する新規のモノクローナル抗体５Ｅ１２を使用して細胞の集団を選別した。５Ｅ１２＋サブセットを、以下の表４に示すように、ニューロスフェアを開始する細胞活性について富化した。図３をもまた参照のこと。本発明者らのデータは、５Ｅ１２抗体に対する抗原が、５Ｆ３＋細胞上のＡＣ１３３抗原と同時に発現されることを示唆する。
【００８６】
本発明者らはまた、以下の表４に示すように、神経幹細胞についてのサブセレクターとして８Ｇ１モノクローナル抗体を評価した。５Ｆ３＋および８Ｇ１−／ｌｏである細胞は、より幹細胞様の特性を提示し、一方、５Ｆ３＋および８Ｇ１ｍｅｄ／ｈｉである細胞は、より始原細胞様の特性を示した。
【００８７】
【表４】
（実施例９）
（ＮＳ−ＩＣのインビボでの研究）
本発明者らは、従来技術を使用して、新生児の免疫不全マウスの側脳室に、５Ｆ３＋−に選別したＮＳ−ＩＣ（上記のように得た）を移植した。ヒトのニューロスフェア細胞の植え付けおよび移動を、ヒト特異的Ｔｈｙ−１抗体を使用して、注射後の４〜８週間の間に検出した（図６を参照のこと）。図７に示すように、ヒトβ−チューブリン（ニューロンのマーカー）およびヒト核抗原（ヒト細胞の局在について）での染色は、嘴側の移動性の流れ（ＲＭＳ）を通じるヒトのニューロスフェア細胞の移動を明らかにした。さらに、図８に示すように、ヒト核抗原を使用する局在化は、ヒトのニューロスフェア細胞が、ＲＭＳを通じて嗅球に移動したことを実証した。
【００８８】
（実施例１０）
（ヒトの中枢神経系の幹細胞の直接的な単離および移植）
（序章および要約）自己更新特性および多重系列の分化特性を有する、幹細胞、クローン原性細胞は、損傷した組織を置換するかまたは修復するための能力を有する。この実施例においては、本発明者らは、クローン原性のヒトの脳の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）を単離した。これは、ニューロスフェアの培養を開始し、そして自己更新、ならびにニューロンおよびグリアへの分化の両方を示す。これらの遺伝的に改変されていないヒトのＣＮＳ−ＳＣは、表面マーカーについてのモノクローナル抗体によってマークされる。細胞は、５Ｆ３（ＡＣ１３３）＋、５Ｅ１２＋、ＣＤ３４−ＣＤ４５−、およびＣＤ２４−／ｌｏである。単一のＡＣ１３３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−選別された細胞は、ニューロスフェアの培養を開始し、そして多重系列の分化を提示した。一旦、免疫不全新生児マウスの脳に移植されると、選別されそして拡大されたＣＮＳ−ＳＣは、強力な植え付け、増殖、移動、および分化を、部位特異的な様式で示す。
【００８９】
この実施例においては、本発明者らは、ｍＡｂ ５Ｆ３および新規のｍＡｂである５Ｅ１２が、ヒトの胎児の脳（ＦＢｒ）細胞の異なるサブセットを検出することを示す。混入している血液および内皮細胞をマークするｍＡｂ（ＣＤ３４およびＣＤ４５）と組合せてこれらのｍＡｂを使用する蛍光活性化細胞選別は、ヒトのＦＢｒ細胞の、ＡＣ１３３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−のサブセットを生じる。細胞の選別後、選別された細胞は、単細胞のレベルで、ニューロスフェアを開始し得、自己更新し得、そして多重系列の分化をし得る、本発明者がヒトのＣＮＳ−ＳＣと指名する細胞であり得る。これらの候補のヒトのＣＮＳ−ＳＣは、自己更新し、そしてニューロスフェア培養物中で有意に拡大し、そしてインビトロでニューロンおよびグリアに分化した。選別されそして拡大された候補のＣＮＳ−ＳＣは、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脳の側脳室に移植され得る。ここではこれらは、明らかに適切な部位特異的植え付け、持続的な自己更新、移動、および分化を、少なくとも７ヶ月間受ける。
【００９０】
（ＣＮＳ神経幹細胞のマーカーについての検索；ストラテジー）本発明者らは、候補のＣＮＳ−ＳＣマーカーが、ＦＢｒ細胞の主要ではないサブセットのみにおいて発現されるはずであるという仮説をたてた。ニューロスフェア培養物が幹／始原細胞の富化された集団を含むという証拠が存在するので、本発明者らは、候補の神経幹細胞マーカーが、これらの細胞上でより豊富に発現されるはずであるという仮説をたてた。従って、本発明者らは、ヒトの造血幹細胞（ＨＳＣ）を定義するために以前に使用したｍＡｂを通じてスクリーニングした。
【００９１】
選別した集団を、それらがニューロスフェアを開始する細胞（ＮＳ−ＩＣ）について富化されたかどうかを決定するために試験した。２つの画分（１つの画分は確立されたニューロスフェア培養物であり、そして１つはそうではない）に清潔にＦＢｒを分離する任意のｍＡｂを、ＮＳ−ＩＣを同定することを助けるための候補のｍＡｂと考えた。最初のスクリーニングにおいては、ｍＡｂを、ＦＢｒのポジティブに染色された小さな画分、および長期間培養されたニューロスフェア細胞の大きな画分と考え、そして他のｍＡｂ（ネガティブ選択のための）を、ほとんどのＦＢｒ細胞を染色するが、ニューロスフェア細胞の小さな画分は染色しないと考えた。酵素によって解離させられたＦＢｒおよび長期間培養されたニューロスフェア細胞を、５０個以上の既知のｍＡｂで染色した。
【００９２】
長期間のニューロスフェア培養物である、８．５ＦＢｒが、以前に記載されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、１５８ Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２６５−７８（１９９９））。これらの細胞を、以下の標準的なヒトのニューロスフェア培地中で培養した：ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、およびＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｎ−２補充（Ｇｉｂｃｏ）、３％のグルコース、０．２Ｍのグルタミン、および０．２ｍｇ／ｍｌのヘパリンを有する、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。培養した細胞を回収し、そしてコラゲナーゼの存在下で、継代のために５〜１０分間酵素的に解離させるか、またはｍＡｂの染色のための単一の細胞懸濁物を得るためにトリプシン処理した。
【００９３】
ニューロスフェア細胞は、血管および造血性のマーカーであるＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しなかった。対照的に、マウスおよびヒトのＨＳＣの両方を同定した重要な細胞表面マーカーであるＴｈｙ−１は、実質的に全てのＦＢｒ細胞およびニューロスフェア細胞上で高レベルで発現され、そして従って、有用ではなかった。興味深いことに、最初の抗体スクリーニングは、別のＨＳＣマーカーであるＡＣ１３３が、１６〜２０の妊娠週数（ｇ．ｗ．）の組織に由来するＦＢｒ細胞のわずかに１〜５％において、そして培養されたニューロスフェア細胞の約９０％において発現されたことを明らかにした。
【００９４】
（モノクローナル抗体ＡＣ１３３は、ヒトのＣＮＳ−ＳＣについて富化する）ヒトのＦＢｒ組織を、ＮＩＨのガイドラインに従って、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．から１６〜２０の妊娠週（ｇ．ｗ．）の胎児の残りから得た。ＦＢｒ組織を、１〜３ｍｍの切片に、小刀を使用して切断し、５０ｍＬの遠心分離チューブに移し、そして０．０２％のＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で１回洗浄した。組織を、０．１％のコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および０．１％のヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，およびＤＮａｓｅを補充したＨＢＳＳ中で３７℃にて１時間、酵素的に解離した。単一の細胞の懸濁物を得るために、解離させたＦＢｒ細胞をさらに、０．０５％のトリプシン、５３ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて１０〜１５分間処理した。破片および凝集物を、７０ミクロンのフィルターユニットに通して細胞懸濁物を濾過することによって除去した。
【００９５】
単一の細胞懸濁物を、コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ処理、続くトリプシン処理後に得た。従って、スクリーニングによって、トリプシン耐性の細胞表面エピトープに限定した。
【００９６】
ＦＢｒに由来する選別したＣＤ４５＋またはＣＤ３４＋細胞の塊の培養物は、ニューロスフェアの培養を開始することができなかった。従って、ＣＤ３４およびＣＤ４５の両方が、ヒトのＣＮＳ−ＳＣについてのネガティブセレクターとして使用され得た。
【００９７】
ＣＮＳ−ＳＣが、ＡＣ１３３の発現に基づいて単離され得るかどうかを試験するために、ヒトのＦＢｒ細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ４５，およびＡＣ１３３に対する抗体を用いて染色した。ＡＣ１３３抗原を、両方ともフィコエリスリン（ＰＥ）に結合させた、２つのｍＡｂ（ＡＣ１３３／１およびＡＣ１３３／２）によって規定した。これらは、Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を通じて入手可能である。抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｎｉｎ）（ＡＰＣ）と結合させた抗ヒトＣＤ３４を、ＣＡＬＴＡＧ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＢＤＩＳ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からそれぞれ得た。解離させたＦＢＲ細胞を、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＡＣ１３３／１ ＡＣ１３３／２−ＰＥ、およびＣＤ３４−ＡＰＣに対するｍＡｂとともに、氷上で２０〜６０分間インキュベートした。最後の洗浄後、細胞を、０．５ｇ／ｍＬのヨー化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｎｅ）（ＰＩ）を含むＨＢＳＳ溶液中に再懸濁した。標識された細胞を分析し、そして二重レーザーのＶａｎｔａｇｅ ＳＥ（ＢＤＩＳ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）を用いて選別した。死細胞を、それらのＰＩ染色特性によって分析から排除した。混入している血液細胞および内皮細胞を、ＣＤ４５＋細胞ＣＤ３４＋細胞をそれぞれゲートで制御することによって排除した。選別した後、選別した細胞集団の純度をチェックした。
【００９８】
２つの細胞の集団（ＡＣ１３３−ＣＤ３４−ＣＤ４５−（ＡＣ１３３−）およびＡＣ１３３＋ＣＤ３４−ＣＤ４５−（ＡＣ１３３＋））を選別し、そしてＮＳ−ＩＣ活性について培養した。ＡＣ１３３の発現は、連続的出ることが最初に明らかになったが（図９Ａ）、ＡＣ１３３＋細胞のＦＡＣＳでの予備富化、続く２回目の細胞の選別は、別のＡＣ１３３＋集団を明らかにした（図９Ａ）。全ての続く試験において、ＡＣ１３３−およびＡＣ１３３＋サブセットの両方を２回選別し、それによって高純度で、ＡＣ１３３−およびＡＣ１３３＋ＦＢｒ細胞の画分を得た（図９Ａ）。
【００９９】
ニューロスフェアの条件下で培養したＡＣ１３３＋の単一の細胞懸濁物は、芽細胞様（ｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ）になり、プラスチックプレート上に接着し、そして細胞分裂を開始し始めた。培養物中での４〜５日後、ＡＣ１３３＋細胞の大きな画分は増殖を開始し、そして数個の細胞のクラスターとして浮遊し始めた。小さなニューロスフェアは、培養の開始後７〜１０日のような初期に観察された（図９Ｃ）。対照的に、選別されたＡＣ１３３−細胞は、単一の細胞懸濁物のようなままであり、ニューロスフェアを開始することはできず、そして最終的には死亡した（図９Ｂ）。従って、ＮＳ−ＩＣ活性は、ＣＤ４５−ＣＤ３４−ＦＢｒ細胞の、ＡＣ１３３＋のサブセット中では見出されるが、ＡＣ１３３−のサブセット中では見出されなかった。
【０１００】
（ＡＣ１３３＋のヒトＦＢｒ細胞のみがＮＳ−ＩＣ活性を含む）定量的なＮＳ−ＩＣアッセイが、ＡＣ１３３−およびＡＣ１３３＋サブセット間での増殖において衝撃的な差異を示したので、本発明者らは、分画していない（すなわち、細胞の処理後）、および種々の分化したＦＢｒ細胞懸濁物中のＮＳ−ＩＣの頻度を決定することを望んだ。分画していないＦＢｒ細胞を、ＦＡＣＳ自動細胞沈着ユニット（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｅｌｌ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）（ＡＣＤＵ）を使用して９６ウェルプレート中に限界稀釈（１００〜１０，０００細胞／ウェル）によってプレートした。これらのプレートを６〜８週間培養し、そしてニューロスフェアを含むウェルをポジティブとして記録した。
【０１０１】
選別したＦＢｒ細胞を、ＦＧＦ−１（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、神経生存因子−１（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、および６０ｇ／ｍＬのＮ−アセチルシスチン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）を含むＥｘ Ｖｉｖｏ
１５（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｅ，ＭＤ）培地（ニューロスフェア開始培地）中のニューロスフェア培養物中で培養した。培地処方物を、ＦＢｒ細胞の限界稀釈の頻度分析に基づいて最適化した。培養物に、毎週栄養を補給し、そしてニューロスフェアが大きくなった場合、継代した。いくつかの場合には、選別したＦＢｒ細胞を、ニューロスフェアの培養を開始する前駆体の頻度を評価するために、自動化された細胞蓄積ユニット（ＡＣＤＵ）によって９６ウェルプレート中に再度選別した。これらの９６ウェルプレートを、毎週栄養を補給し、そしてウェル中のニューロスフェアの存在を、培養の開始後６〜８週間で記録した。それぞれの細胞濃度でのネガティブなウェルの割合の直線状の退行の分析を、ＮＳ−ＩＣの頻度を決定するために使用した。
【０１０２】
多数のニューロスフェアを、高い細胞用量（すなわち、１ウェルあたり１０，０００細胞）でプレートしたウェル中で検出した。それにもかかわらず、低い細胞用量（すなわち、３００〜１０００細胞／ウェル）でプレートしたウェルにおいては、ポジティブなウェルは、わずかに１つのニューロスフェアを含んだ。１ウェルあたり１００〜３００個の細胞では、極まれなウェルが、単一のニューロスフェアを含んだ。ネガティブなウェルの対数を、１ウェル当たりにプレートした細胞の数に対してプロットした場合には、直線状の関数が見出された；３７％のネガティブなウェルで、ＮＳ−ＩＣについて単一のヒットを決定した（図１０Ａ）。図１０Ａに示される代表的な組織においては、コントロールの処理された脳細胞は、８８０個の細胞中１個の頻度でＮＳ−ＩＣ活性を含んだ。ＡＣ１３３−のサブセットにおいては、４８６０個の細胞中１個のＮＳ−ＩＣの頻度が減少した。対照的に、ＮＳ−ＩＣ活性は、３２個の細胞中１個の頻度で、ＡＣ１３３＋のサブセットにおいて高度に富化された（図１０Ａ）。８つの異なるＦＢｒ組織（１６〜２０の妊娠週）に由来するＮＳ−ＩＣの頻度を、図１０Ｂおよび表５にまとめるように評価した。
【０１０３】
【表５】
＊全ての選別された集団がまた、ＣＤ３４−ＣＤ４５−についてゲート（ｇａｔｅ）され、これは９８〜９９％のＦＢｒを示す。
＊＊実際に算出されたＮＳ−ＩＣ頻度のような１回の試験を除外したデータは、括弧中に示した。ほとんどのウェルがネガティブであったことに起因した。
【０１０４】
分画していない胎児の脳細胞においては、７３０個の細胞中の約１個が、ＮＳ−ＩＣ活性を含む。＞９５％のＦＢｒを示すＡＣ１３３−のサブセットは、ＮＳ−ＩＣを有する４３００個の細胞中に＜１個を含み、そして従って、約６倍減少された。対照的に、ＮＳ−ＩＣ活性は、ニューロスフェアを開始し得る新しいＦＢｒ細胞の約１／３１（１／６から１／７２の範囲）で、平均で、ＡＣ１３３＋サブセットにおいて２３倍富化された。ＡＣ１３３＋細胞は、約４．６％のＦＢｒを示した（すなわち、２２個の細胞のうちの１個）ので、ＮＳ−ＩＣ活性の富化は実質的には、ＦＢｒ中のＡＣ１３３＋細胞の頻度に相当した。従って、ＡＣ１３３＋細胞は、１６〜２０の妊娠週のＦＢｒ細胞懸濁物中の全ての検出可能なＮＳ−ＩＣ活性を含んだ。
【０１０５】
（単一のＡＣ１３３＋に選別された細胞からの、クローンのニューロスフェアの拡大、自己更新および分化）ニューロスフェアのクローナリティー（ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を確認するために、単一のＦＢｒに由来するＡＣ１３３―に選別された細胞を、ＡＣＤＵによって９６ウェルプレートのウェル中に直接プレートした。８週間後、いくつかのウェルは、単一のニューロスフェアを含み、これらが単一のＡＣ１３３＋に選別された細胞に由来することを確認した（図１０Ｃ）。
【０１０６】
ＡＣ１３３＋に由来するニューロスフェアの自己更新活性を、ニューロスフェアの培養を再度開始する能力について試験した。例えば、ＡＣ１３３＋に選別されたＦＢｒ細胞によって開始された最初のニューロスフェア培養物を解離させ、そして１ウェル当たり１つの細胞として再度プレートした。９個の９６ウェルが、単一のニューロスフェアの発達を示した。１つの試験においては、ニューロスフェアは、ＡＣ１３３＋に選別されたニューロスフェア細胞から約１０％の播種効率を伴って、クローン的に（ｃｌｏｎａｌｌｙ）誘導された。結果として、ＡＣ１３３−になるニューロスフェア細胞は、二次的なニューロスフェア培養を再度開始することはできなかった。従って、これらの定量的な結果は、ＮＳ−ＩＣ活性が、ＦＢｒ細胞のＡＣ１３３＋のサブセットにおいては高度に富化され、そしてＦＢｒ細胞のＡＣ１３３−のサブセットにおいては除去されることを実証した。
【０１０７】
クローン的に誘導されたニューロスフェア細胞の分化能力を試験するために、単一のニューロスフェアを回収し、プレートし、そして神経栄養因子であるＢＤＮＦおよびＧＤＮＦの存在下で分化を誘導した。ニューロスフェア細胞を回収し、そしてコラゲナーゼを用いて解離させ、そしてポリオルニチンでコーティングしたチャンバースライド上に置いた。これらを、ニューロスフェア開始培地中で、それらがプレート上に播種されるまで１日間培養した。培養物を、Ｅｘ Ｖｉｖｏ−１５，Ｎ２、ＮＡＣ、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびラミニン（１ｇ／ｍＬ）から構成される分化培地に再度プレートした。１〜２週間後、チャンバースライドをＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで固定し、そしてニューロンおよび星状細胞への分化を検出するために、チューブリンおよびグリア菌原繊維（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ）酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対するｍＡｂで染色した。
【０１０８】
これらの条件下では、ＡＣ１３３＋に由来するニューロスフェアは、ニューロンおよび星状細胞に分化した（図１０Ｄ）。まとめると、データは、ｍＡＢ ＡＣ１３３がＮＳ−ＩＣについてのマーカーであり、そしてヒトＣＮＳ−ＳＣについて富化するために使用され得ることを示唆する。これらのＡＣ１３３＋に由来するニューロスフェア培養物は、連続的に継代されている（凍結前に＞Ｐ１５）。大まかな推定においては、ＡＣ１３３＋細胞の絶対数は、５回の継代によって少なくとも１０００倍に増大し（表６）、そしてこれらは、ニューロスフェアを再現的に再度開始し得る。従って、ＡＣ１３３は、インビトロで連続的に拡大し、そして自己更新する神経細胞の集団を規定する。
【０１０９】
【表６】
（ＮＳ−ＩＣもまた、５Ｅ１２＋および８Ｇ１−／ｌｏ細胞において富化される；新規のｍＡｂの生成）利用可能なｍＡｂの有用性のスクリーニングと同時に、本発明者らは、ヒトの神経細胞上の新規の細胞表面マーカーを同定しようとした。ＦＢｒ細胞を、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの組合せを用いて解離させ、そして、組織特異的ｍＡｂを惹起するためのおとりの（ｄｅｃｏｙ）ストラテジーを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。約１９００個のウェルの増殖しつつあるハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、そしてハイブリドーマを選択し、拡大し、そしてヒトの脳に対する特異的反応性についてさらに試験した。ヒトの神経細胞に対するモノクローナル抗体を、Ｙｉｎら、９０ Ｂｌｏｏｄ ５００２−１２（１９９７）によって以前に記載されたおとりの免疫化ストラテジーを使用して産生した。簡潔には、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、おとりのヒトの白血球を富化させた末梢血で１回のフットパッド（ｏｎｅ ｆｏｏｔｐａｄ）において免疫し、そして酵素で解離させたヒトの胎児の脳細胞で反対側にフットパッドした。ヒトＦＢｒ細胞免疫を排出させたドナーのリンパ節の細胞を回収し、細胞懸濁物について処理し、そしてマウスの骨髄腫細胞株と融合させた。マウスの骨髄腫株に対するこの融合は、１９００個のウェルの増殖しつつあるハイブリドーマ細胞を生じた。約１８０個のハイブリドーマを選択し、拡大し、そしてヒトの脳細胞に対する特異的反応性についてさらに試験した。
【０１１０】
上記のように、ＣＮＳ−ＳＣを、ＡＣ１３３＋サブセットにおいて高度に富化した。ＣＮＳ−ＳＣの表現型をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ＡＣ１３３＋細胞が表現型的には不均質であるかどうかを試験した。従って、ＡＣ１３３＋細胞を、新規のｍＡｂのパネルに由来する他のマーカーの同時発現についてスクリーニングした。２つの新規のｍＡｂである５Ｅ１２および８Ｇ１を、同定した。Ｍａｂ ５Ｅ１２は、ＡＣ１３３＋細胞および長期間のニューロスフェア細胞を同時染色する。５Ｅ１２＋ＦＢｒ細胞を富化し、そして５Ｅ１２−細胞をＮＳ−ＩＣ活性において除去する（表５）。
【０１１１】
胎児の脳の発達においては、ＦＢｒ細胞の大部分（＞９０％）が、高レベルの８Ｇ１マーカーを発現した（図４）。ＡＣ１３３＋細胞は、８Ｇ１の発現において不均質であった；ほとんどの８Ｇ１−／ｌｏ、いくつかの８Ｇ１ｍｉｄ、および数個の８Ｇ１ｈｉ細胞（図１２）。興味深いことに、長期間培養したヒトのニューロスフェア細胞上での８Ｇ１の発現もまた、不均質であった。免疫沈降およびブロッキングの研究によって、８Ｇ１が抗ＣＤ２４ ｍＡｂであることを決定した。組織学的には、ＣＤ２４は、熱安定性の抗原（ＨＳＡ）として公知であり、そして血液のリンパ球産生においてマーカーとして広範に使用される（Ａｌｔｅｒｍａｎら、２０ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９７−６０２（１９９０））。ＨＳＡは、マウスのＨＳＣ上で低レベルで発現され（ＳｈｉｈおよびＯｇａｗａ、８１ Ｂｌｏｏｄ １１５５−６０（１９９３））；ＳｐａｎｇｒｕｄｅおよびＳｃｏｌｌａｙ、１８ Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９２０−６（１９９０））、そしてプロＢ細胞およびプレＢ細胞、ならびに胸腺細胞上で高レベルで発現され、そしてこれらの細胞が成熟リンパ球になる場合、完全に下方調節される（Ａｌｔｅｒｍａｎら、２０ Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１５９７−６０２（１９９０））。表５に示すように、ＮＳ−ＩＣの頻度は、ＡＣ１３３＋ＣＤ２４ｍｉｄ／ｈｉのサブセットと比較して、ＡＣ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ画分においてより高い。
【０１１２】
（ＡＣ１３３＋に由来するヒトのニューロスフェア細胞の強力な植え付け能力）ヒトの選別され／拡大されたＣＮＳ−ＳＣの、インビボでの移植、移動、および分化の能力を試験するために、１０５個または１０６個のニューロスフェア細胞（ＡＣ１３３＋に選別されたＦＢｒ細胞から開始された）を、新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脳の側方の脳室に注射した。
【０１１３】
６〜１０の継代で拡大したＡＣ１３３＋に選別されたニューロスフェア細胞を回収し、そして細胞の小さなクラスターを得るためにコラゲナーゼで穏やかに乖離させた。細胞を、０．２５×１０５または２．５×１０５／Ｌの等量で再懸濁した。新生児のマウス（＜生後２４時間）を、氷を使用して低温麻酔した；一旦麻酔がかかると、定位的なデバイス上に新生児を置いた。小さな穴を針で軟骨にドリルで穴をあけ、そして細胞懸濁物を、両方の側方の脳室のスペースにＨａｍｉｌｉｔｏｎシリンジによって導入した。新生児のマウスを、１０５〜１０６個の細胞／注射の範囲の細胞の２１個を用いて注射した。新生児を、外科手術の回復についてモニターするために暖めることによって観察し、次いで、母親に返した。注射したマウスを、ヒトの細胞の植え付け（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を試験する前に７ヶ月間維持した。
【０１１４】
新生児のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、神経学的な系に注射される細胞の参加を最大にするためのレシピエントとして選択した。なぜなら、細胞の形成が、新生児のマウスの脳のいくつかの部分における進行において、なお活性であるからである。さらに、免疫不全マウスは、ヒトの組織を拒絶せず、そしてＳＣＩＤおよびＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、ヒトの血球形成および組織の植え付けのインビボでの研究のための宿主として使用されている（ＭｃＣｕｎｅら、２４１ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６３２−９（１９８８）；Ｋａｍｅｌ−ＲｅｉｄおよびＤｉｃｋ、２４２ Ｓｃｉｅｎｃｅ １７０６−９（１９８８）；Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅら、２ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３２９−３７（１９９６））。移植の７ヶ月後、動物を屠殺し、そして矢状方向の切片を、Ｎ−ＣＡＭおよびＴｈｙ−１、ならびにヒト核抗原に対するヒト特異的ｍＡｂで染色した。
【０１１５】
移植の７ヶ月後に、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、Ａｖｅｒｔｉｎで深く麻酔し、そしてＰＢＳで灌流し、続いてリン酸緩衝液中の４％のパラホルムアルデヒドで灌流した。その後、脳を、一晩固定し、３０％のスクロース溶液中に置き、そしてＯＣＴ化合物中で凍結させた。脳を、さらなる免疫組織化学のために５μｍの厚みに矢状方向に切断した。移植されたマウスの脳中のヒト細胞を検出するために、切片を、ヒトＴｈｙ−１に対するマウスのモノクローナル抗体（Ｐｈａｅｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｎ−ＣＡＭに対するモノクローナル抗体、チューブリンに対するモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、または核抗原に対するモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、続いて、Ａｌｅｘａ ４８８に結合させたヤギ抗マウスＩＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色した。
【０１１６】
マウスの脳のコントロールに対するこれらのｍＡｂの染色は、交差反応性を示さなかった。ＧＦＡＰおよびβ−チューブリンに対するＭａｂは、ヒトおよびマウスの細胞の両方を染色し、そして抗ヒト核抗体でのこのような二重の標識を、ヒトの系統特異的細胞の集団を実証するために使用した。詳細な分析は、特に、活性な神経形成の部位であることが以前に示されている脳の２つの部位（側方の脳室の脳室下の領域（ＳＶＺ）、および海馬の歯状回）に集中した（図１２Ａ）。
【０１１７】
ヒトの細胞は、マウスの脳全体にわたって見出され、そして注射の７ヶ月後に、ＳＶＺにおいて豊富であった（図１２）。例えば、１つの領域においては、ヒトの核＋である多くの細胞を、ＧＦＡＰ＋細胞によって取り囲んだ（図１２Ｂ）。コンフォーカルな顕微鏡試験は、ヒトの細胞のほとんどが、ＧＦＡＰ−であるが、時折、ヒトのＧＦＡＰ＋細胞もまた検出されたことを示した（図１２Ｂ、矢印）。
【０１１８】
移植されたマウスの脳を、ミクロトーム上で４０マイクロメートルの厚みの切片にし、そしてｍＡｂで染色し、そしてＳｕｈｏｎｅｎら、３８３ Ｎａｔｕｒｅ ６２４−７（１９９６）によって以前に記載されているように、Ｂｉｏ−Ｒａｄコンフォーカル散乱光顕微鏡を使用して分析した。
【０１１９】
ＳＶＺ中の幹細胞／始原細胞が持続的な増殖を示しているので、本発明者らは、移植されたヒトのＡＣ１３３＋に選別され／拡大されたニューロスフェア細胞の子孫がなお増殖しているかどうかを、インサイチュで試験した。移植された脳の１つの切片を、細胞増殖に関連するマーカーであるＫｉ６７で染色した。著しく、ＧＦＡＰ＋細胞中に入れ子（ｎｅｓｔ）にされたＳＶＺ中のヒトの細胞のクラスターは、Ｋｉ−６７を同時発現し、このことは、ＳＶＺ中のヒトの細胞が、それらのマウスの対応する部分と同様に、ＳＶＺ中での移植後７ヶ月間増殖し続けることを示した（図１２Ｃ）。
【０１２０】
げっ歯類の嗅覚の系においては、ＳＶＺ中で増殖した幹細胞／始原細胞の子孫は、吻方の移動性の流れ（ｒｏｓｔｒａｌ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｓｔｒｅａｍ）（ＲＭＳ）に入り、そして嗅球に移動する（ＬｏｉｓおよびＡｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ、２６４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４５−８（１９９４））。ＲＭＳ中の内因性のげっ歯類の先祖の「神経芽細胞の鎖」は、β−チューブリンおよびＮ−ＣＡＭを発現する（Ｆｒｉｃｋｅｒら、１９ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５９９０−６００５（１９９９）；ＧａｇｅおよびＣｒｉｓｔｅｎ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＮＳ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９７））。ＲＭＳを含有している矢状方向の切片を、ヒトの神経細胞の存在について試験した。ＡＣ１３３＋に選別されたニューロスフェア細胞を移植したマウスにおいては、多数のヒト細胞が検出され、これはＳＶＺで開始し、そしてＲＭＳ全体に拡大している（図１３Ａ）。これらのクラスターを形成するヒト細胞の多くは、β−チューブリンと同時に局在するがこのようなクラスター中で二重ポジティブの細胞を同定することは困難であった。数個のヒト細胞を含有している組織の注意深い試験によって、β−チューブリンおよびヒト核抗原の両方について二重ポジティブである複数の細胞が明らかになった（図１３Ｂ、矢印）。さらに、ＲＭＳ中のこれらの細胞の多くは、ヒト特異的マーカーであるＮ−ＣＡＭを発現した（図１３Ｃ）。
【０１２１】
ＲＭＳを通じる移動の後、幹／始原細胞の子孫は、嗅球に侵入し、そして嗅覚の糸球体に向かって嗅球のペリ糸球体（ｐｅｒｉｇｌｏｍｅｌｕｌａｒ）層にまで拡大すると予期される（ＬｏｉｓおよびＡｌｖｅｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ、２６４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４５−８（１９９４））。図１３Ｄに示すように、移植されたヒト細胞の子孫は、糸球体ならびにペリ糸球体層に分布した。これらの細胞のいくつかは、ヒトのＮ−ＣＡＭを発現し、このことは、これらの細胞が神経系統に拘束されていたことを示す。従って、移植された、選別され／拡大されたヒトのＣＮＳ−ＳＣの子孫は、ＲＭＳに移動し、分布し、そして嗅球中の神経系統に分化する。いくつかの例においては、チロシンヒドロキシラーゼポジティブであるヒト細胞が観察された。
【０１２２】
神経形成が成体の生活において起こる別の部位は、海馬の歯状回である（Ｇａｇｅら、９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１８７９−８３（１９９５））。この実施例においては、本発明者らは、海馬の歯状回において多数のヒト核細胞を見出した。やや顆粒状の細胞（ｓｕｂｇｒａｎｕｌａｒ
ｃｅｌｌ）帯中のヒトの細胞でいくつかは、Ｋｉ−６７を同時発現し、このことは、これらの細胞が移植の７ヶ月後に増殖することがなお可能であることを示す（図１４Ａ）。異なる分析においては、いくつかの他のヒト細胞は、海馬の門に向かって拡大するそれらのプロセスを有する、顆粒状のニューロンを発達させることが予期されるような、β−チューブリンであった（図１４Ｂ）。これらの結果は、これらの選別され／拡大されたヒトのＣＮＳ−ＳＣ移植片が、移動し、増殖しつづけ、そして分化するだけではなく、それらの挙動および細胞の運命もまた、部位特異的様式において宿主の合図によって調節することを示す。注射された細胞は、腫瘍を形成しない。
【０１２３】
（考察）この実施例の目的は、候補のヒトＣＮＳ−ＳＣの予想される単離を可能にする、ヒトの脳細胞上の表面マーカーを見出すことであった。本発明者らは、ヒトのニューロスフェア培養物が、ＣＮＳ−ＳＣからクローン的に開始され得ると仮定し、そして新しいヒトのＦＢｒ細胞懸濁物からＮＳ−ＩＣを単離にすることに着手した。本発明者らは、１６〜２０ｇ．ｗ．のヒトのＦＢｒ細胞がまれにクローン原性のＡＣ１３３＋、５Ｅ１２＋、８Ｇ１−／ｌｏＣＤ３４−ＣＤ４５−細胞のサブセットを含むことを実証した。このサブセットは、ニューロスフェアの培養を開始し得、これらの培養物中で広範囲にわたって自己更新し得、そしてニューロンおよびグリアにインビトロで分化し得る。免疫不全の新生児のマウスの側方の脳室への移植の際には、これらの細胞は、少なくとも７ヶ月間植え付け（ｅｎｇｒａｆｔ）、そして分化し、移動し、そしてそのいくつかは増殖し続ける、子孫を生じる（すなわち、ＳＶＺおよび歯状回中でのＫｉ−６７＋のヒトの神経細胞の存在）。植え付けされたヒトの細胞は、それらが、同じ事象を受けた内因性のマウスの神経細胞に対応する部位中に見出される。
【０１２４】
図１０および表５中のデータは、ヒトの胎児の脳中にＡＣ１３３＋サブセットの外側には他の検出可能なＮＳ−ＩＣ細胞が存在しないことを実証する。
【０１２５】
ＡＣ１３３染色パターンの分析の間には、本発明者らは、約０．２％のＦＢｒ細胞がＣＤ３４を発現し、そしてＡＣ１３３＋ＣＤ３４−である細胞に接着したままであることに注目した。これらのＣＤ３４＋細胞は、既知の内皮細胞マーカーであるＣＤ１０５およびＣＤ３１を同時に発現し、そしてトリプシン処理後にも、塊の培養物中に高密度で配置された場合に、いくつかのニューロスフェアから非効率的に形成され得る細胞の複合体として残っていた。本発明者らは、ＣＤ３４を発現する細胞についてのポジティブな選択の後、同様に複合体を観察した。従って、ＡＣ１３３＋ＣＮＳ−ＳＣおよび天然に存在するＣＤ３４＋内皮細胞の頻繁な連合が存在する。ＡＣ１３３＋ＣＮＳ−ＳＣが血管周囲にあるという知見は、神経形成が、血管形成と同時に進行するという仮説に一致する。
【０１２６】
候補のヒト胎児のＣＮＳ−ＳＣが、新生児のマウスの側方の脳室中への注射後に植え付けし、そしてマウスの脳全体にわたって拡大することは、驚くべきことである。これはマウスの持続的な神経形成の段階であるが、これらの細胞が分布する程度は、当業者が予期したよりも大きい。詳細には、ヒトの細胞は、脳室の空間に隣接して、海馬中、大脳皮質中、脳梁中、ならびに脳の小脳の領域に見出された（図１１）。さらに、細胞は、ＳＶＺ（自己更新しそして複製する領域）においておよびＲＭＳ（分化および移動の領域）沿っての両方で、ならびに嗅球内および嗅覚の糸球体周辺に直接、見出される。従って、注射されたヒトＣＮＳ−ＳＣは、これらの部位で神経形成のプロセスを継続している。
【０１２７】
Ｓｙｎｄｅｒらは、ｖ−ｍｙｃで固定したマウスおよびヒトの神経細胞株を使用して、細胞のこの広範な（「全体的な」）分布を実証した（Ｙａｎｄａｖａら、９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７０２９−３４（１９９９））。本明細書中では、本発明者らは、これが、マウス起源のｍｙｃ固定された細胞の特性だけではなく、非遺伝的に改変されたヒトのＣＮＳ−ＳＣの特性でもあることを示す。
【０１２８】
奇形癌細胞の移植とは対照的に（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉら、１２２ Ｅｘｐ
Ｎｅｕｒｏｌ ２８３−９４（１９９３））、ＣＮＳ−ＳＣ細胞は、完全に許容性の微環境中での注射の７ヶ月後に試験した場合でさえも、腫瘍性凝集物または増殖性凝集物を形成しない。従って、ＣＮＳ−ＳＣ細胞は、腫瘍遺伝子の機能によって改変されていないヒトの神経系、またはすでに腫瘍性に形質転換された細胞株において本来備わっている発生的経路および機能的経路を明らかにし得る。ＣＮＳ−ＳＣの単離は、以下の科学的な発見のためのいくつかの機会を提供する：（ｉ）特定の段階または分化の細胞に由来する系統を直接描写すること；（ｉｉ）ＣＮＳ−ＳＣの遺伝子発現プロフィールおよびインビトロまたはインビボでそれらのすぐ下流の子孫を得ること；（ｉｉｉ）細胞の特異的な遺伝子の改変がそれらの植え付け、移動、分化、および／または機能的な組込みを可能にするかどうかを試験すること。ヒトのＣＮＳ幹細胞の単離は、それらの移植可能性、分化能力、および腫瘍形成の欠失についての前臨床試験としての、ヒトの疾患のマウスのアナログにおいてこれらの細胞の移植を可能にする。
【０１２９】
上記の記載は、説明の目的のためのみに示されており、そして、開示される正確な形態に本発明を限定するようには意図されないが、本明細書中に添付される特許請求の範囲によって限定されるように意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１０−２５２８０８（Ｐ２０１０−２５２８０８Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７３１６９（Ｐ２０１０−１７３１６９）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【分割の表示】特願２０００−５９８６５６（Ｐ２０００−５９８６５６）の分割
【原出願日】平成１２年２月１１日（２０００．２．１１）
【出願人】（５０１３１８４５３）ステム セルズ， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【分割の表示】特願２０００−５９８６５６（Ｐ２０００−５９８６５６）の分割
【原出願日】平成１２年２月１１日（２０００．２．１１）
【出願人】（５０１３１８４５３）ステム セルズ， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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