対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および利用方法
ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により一本鎖ＤＮＡを形成し、さらに該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、該二本鎖ＤＮＡライブラリーと、末端がリン酸化されていない核酸からなるアダプターとをライゲーションしてライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、該ライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、対応付け分子の形成に必要な配列を持つプライマーを用いたＰＣＲにより、対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを作成することにより、対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および利用方法に関する。
【背景技術】
現在、多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンスの研究では、第２幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の構造や機能解析（非特許文献１、非特許文献２）、および蛋白質間、核酸−蛋白質間相互作用解析などが期待されている（非特許文献３、非特許文献４）。
蛋白質間の相互作用を解析する方法としては、免疫沈降（非特許文献５）、ＧＳＴ融合蛋白質によるプルダウン・アッセイ（非特許文献６）、ＴＡＰ法（非特許文献７）、酵母ツーハイブリッド法（非特許文献８）などが知られている。一方、もともとは進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表現型）の対応付け」を特徴とする以下に示す方法も、ポストゲノム機能解析における蛋白質間などの相互作用を解析する方法として期待されている（非特許文献９）。代表的な方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法（非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１）、ＳＴＡＢＬＥ法（非特許文献１２）、ファージディスプレー法（非特許文献１３）、リボソーム・ディスプレイ法（非特許文献１４、特許文献２）、ｍＲＮＡ−ペプチドヒュージョン（ｍＲＮＡディスプレイ）法（非特許文献１５）などである。
このようなポストゲノム機能解析によって、蛋白質間および蛋白質−核酸間などの相互作用ネットワーク解析から重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創製などが期待され、医療、食料、エネルギー、環境など多くの分野の産業で優れたネットワーク解析技術が所望されている。蛋白質間および蛋白質−核酸間などの相互作用ネットワーク解析のためには、ベイト蛋白質との相互作用解析に用いるＲＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリー作成方法は欠かせない要素技術となる。
ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。どのような解析方法であっても、蛋白質間および蛋白質−核酸間の解析に共通して欠かせないものは、ＲＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーである。ライブラリーの質が高ければ、解析結果も質が高いものとなるため、要素技術としてライブラリー作成技術は重要である。ポストゲノム機能解析の蛋白質間および蛋白質−核酸間の解析方法であるｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス（ＩＶＶ）法（非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１、特許文献３）において、ＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー作りとしてこれまで知られていた技術は、組織から抽出したＲＮＡライブラリーから、あるいは既存のｃＤＮＡライブラリーから、発現ベクターにクローニングを介してライブラリーを構築する方法、あるいは、クローニングを介さずに直接ライブラリーを構築する方法（非特許文献１６）があった。
【非特許文献１】 Ｓａｅｇｕｓａ Ａ．Ｊａｐａｎ ｂｏｏｓｔｓ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．．．Ｎａｔｕｒｅ ４０１，６７５１（１９９９）
【非特許文献２】 Ｄａｌｔｏｎ Ｒ，Ａｂｂｏｔｔ Ａ．Ｃａｎ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｆｉｎｄ ｒｅｃｉｐｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｃｈｉｐｓ？ Ｎａｔｕｒｅ ４０２，６７６３（１９９９）
【非特許文献３】 宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１４５
【非特許文献４】 宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７
【非特許文献５】 Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６６，７０１−７０４
【非特許文献６】 Ｋａｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｃｅｌｌ ６４，５２１−５３２
【非特許文献７】 Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｒｉｇａｕｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７，１０３０（１９９９）
【非特許文献８】 Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ，Ｓｏｎｇ Ｏ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３４０，２４５（１９８９）
【非特許文献９】 Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ａ．Ｒ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ−ｔｏｗａｒｄ ａｎ ｅｎｄｇａｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１９４８（１９９９）
【非特許文献１０】 Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｉｖａ Ｏｒｉｇｉｎｏ ２５，３５（１９９７）
【非特許文献１１】 Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ： Ｂｏｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍＲＮＡ ｂｅａｒｉｎｇ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｔ ｔｈｅ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｏｆ ｉｔｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）
【特許文献１】 国際公開パンフレット第ＷＯ９８／１６６３６号
【非特許文献１２】 Ｄｏｉ Ｎ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｈ．ＳＴＡＢＬＥ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５７，２２７（１９９９）
【非特許文献１３】 Ｓｍｉｔｈ Ｇ．Ｐ．Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８，１３１５（１９８５）
【非特許文献１４】 Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９０２２−９０２６
【特許文献２】 国際公開パンフレット第ＷＯ９５／１１９２２号
【非特許文献１５】 Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１２２９７
【特許文献３】 国際公開パンフレット第ＷＯ０２／４６３９５号
【非特許文献１６】 Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｐ．Ｗ．，Ａｌｐｉｎ，Ｊ．，Ｒｉｓｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｋｒｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．２００１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ−ＸＬ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｍｉｘ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２０８９８−２０９０６
【発明の開示】
ポストゲノム機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。どのような解析方法であっても、蛋白質の解析に共通して欠かせないものは、質の高いＲＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーの構築である。ＩＶＶのためのライブラリー作成方法の従来法としては、ランダムプライミング法によりストップコドンを持たないＯＲＦ領域を多く含むように工夫したＤＮＡ断片を、ＩＶＶ形成のための５’ＵＴＲ、３’ｔａｉｌ配列を持った発現ベクターにクローニングしてライブラリーを構築する方法があったが、この方法では、クローニングを介するためライブラリーの規模が制限され、ライブラリーの質はよいものとは言えなかった。また、ライブラリーの構築に時間がかかった。さらに、上述の、クローニングを介さずに直接ライブラリーを構築する方法として、ランダムプライミング法によりストップコドンを持たないＯＲＦ領域を多く含むように工夫したＤＮＡ断片を、ＩＶＶ形成のための配列を持ったテンプレートを作成し、特定配列でＰＣＲによってライブラリーを構築する方法があった。この方法では、３’ランダムプライマーで逆転写し、さらに、５’ランダムプライマーで二本鎖ＤＮＡの相補鎖を形成しているので、３’および５’末端の両端ともランダムプライマーを使用することからライブラリーの平均長が短くなる問題点があった。
よって、本発明では、対応付け分子（ＩＶＶ）のライブラリーに適した３’ＵＴＲを含まないテンプレートを含み、両端にランダムプライマーを使用したときのようなライブラリーの平均長が短くならないライブラリーを実現することを課題とする。
本発明者らは、ランダムプライマーとアダプターを組み合わせて使用することにより、ｍＲＮＡライブラリーからでも、ＩＶＶに適した、３’ＵＴＲを含まないテンプレート効率の高いライブラリーが作成でき、両端にランダムプライマーを使用したときの平均長が短くなる問題が解決できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
１． ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により一本鎖ＤＮＡを形成し、さらに該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、
該二本鎖ＤＮＡライブラリーと、末端がリン酸化されていない核酸からなるアダプターとをライゲーションしてライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、
該ライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、対応付け分子の形成に必要な配列を持つプライマーを用いたＰＣＲにより、対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを作成する
ことを含む対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーの製造方法。
２． アダプターが二本鎖であり、ライゲーションされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなる１の製造方法。
３． 副鎖が本鎖よりも鎖長が短い２記載の製造方法。
４． 一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを、一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼ ＩおよびＤＮＡリガーゼ存在下で形成する１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
５． 対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを構成するｃＤＮＡが、５’末端にプロモーターとエンハンサーを有する配列を含み、３’末端にライゲーションのアクセプター配列を含む１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
６． プロモーター配列がＳＰ６プロモーターで、エンハンサー配列がオメガ配列又はオメガ配列の一部であり、アクセプター配列が２〜１０塩基のポリＡ配列である５記載の製造方法。
７． １〜６のいずれか１項に記載の製造方法により得られる対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを転写することを含む、対応付け分子ＲＮＡライブラリーの製造方法。
８． ７に記載の製造方法により得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを構成する対応付け分子ＲＮＡの３’末端にスペーサーをライゲーションすることを含む、対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーの製造方法。
９． スペーサーが、対応付けＲＮＡ分子にライゲーションする末端の反対の末端にピューロマイシン又はピューロマイシン誘導体を有し、かつ、塩基配列で１０−１００ｂｐ相当の長さを持ち、該スペーサーは、該ピューロマイシン又はピューロマイシン誘導体を介して、該対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーのテンプレートから翻訳された蛋白質と連結するものである８記載の製造方法。
１０． 該スペーサーが、該対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーから翻訳された蛋白質と連結しないものである８記載の製造方法。
１１． ７に記載の製造方法により得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１２． ８又は９に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１３． ８又は１０に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１４． ７に記載の製造方法で得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１５． ８又は９に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１６． ８又は１０に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１７． 該蛋白質をＣ末端ラベル化法で修飾することを含む、１１、１３、１４又は１６に記載の製造方法。
１８． 核酸のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質と核酸の相互作用解析方法であって、ライブラリーが、１、５、７〜１０のいずれか１項に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
１９． 蛋白質のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、１７に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
２０． 対応付け分子のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、１２又は１５に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
２１． 相互作用が共翻訳スクリーニング法により解析される、２０記載の方法。
２２． ライブラリーのスクリーニングを含む進化分子工学による機能蛋白質の創製方法であって、ライブラリーが、１２又は１５に記載の製造方法により得られるライブラリーである前記方法。
２３． ２０に記載の蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、１９又は２０に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。
２４． ２１に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、１９又は２０に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。
２５． ２２に記載の該機能蛋白質の創製方法を行い、ついで、１９又は２０に記載に記載の該蛋白質間相互作用解析を行うことを含む蛋白質の創製方法。
本発明においては、ライブラリーの規模を保ち、質の高いライブラリーを実現し、かつ簡単で短時間で作成可能なライブラリーを実現する手段として、ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、クローニングベクターを介することなく、対応付け分子（ＩＶＶ）形成に必要な配列（以下、「特定配列」ともいう）を５’および３’末端に含むことを特徴とするＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成する。すなわち、ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、５’末端に特定配列を持つアダプター領域を含むランダムプライマーで逆転写により一本鎖ＤＮＡを形成し、さらに該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡを形成したものであることを特徴とする二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡライブラリーを作成し、さらに、該ｄｓＤＮＡライブラリーに特定配列を含むアダプターをライゲーションすることによりライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーを作成する。該ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーをテンプレートとして対応付け分子（ＩＶＶ）形成に必要な５’および３’末端配列を持つプライマーでＰＣＲを行うことによりＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成する。ついで、該ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを転写したＩＶＶ ＲＮＡライブラリー、該ＩＶＶ ＲＮＡライブラリーを翻訳したＩＶＶランダムプライミングライブラリーを作成することができる。
従来は、一本鎖ＤＮＡを鋳型として相補鎖ＤＮＡを合成して二本鎖ＤＮＡを形成する際に５’末端にランダムプライマーを用いていたが、その方法では、作成された二本鎖ＤＮＡの３’末端および５’末端の両端ともにランダムプライマーを用いているためにライブラリーの平均長が短いものとなってしまう問題点がある。本発明では、ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により形成された一本鎖ＤＮＡを鋳型として形成された片側の相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されていることを特徴とするｄｓＤＮＡライブラリーとリン酸化されていないアダプターをライゲーションする手段を利用する。このとき、アダプターが二本鎖であり、ライゲーションされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなること、さらに副鎖は本鎖よりも鎖長が短いことを特徴とするアダプターを用いたライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーを作成することができる。また、このとき、該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーゼ存在下で形成されたものであるｄｓＤＮＡライブラリーを用いて、ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーを作成し、ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーをテンプレートとして特定配列を持つプライマーを用いたＰＣＲによりＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成することもできる。ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーは、５’末端にプロモーターとエンハンサーを有した特定の配列を含み、３’末端にライゲーションのアクセプター配列を含むものでもよい。
従来のアダプターのライゲーションでは、アダプターをリン酸化するために、セルフライゲーションやライブラリー・テンプレートの両端にライゲーションされてしまうためにクローニングでは方向性が決められない問題点があり、ＰＣＲでも方向性がまちまちのテンプレートが出来てしまいテンプレートの質が落ちてしまうなどの問題点がある。本発明では、アダプターは、用いるリガーゼに応じて選択することが好ましく、ライゲーションをＤＮＡリガーゼで行う場合は、アダプターは一部二本鎖とし、アダプターをリン酸化しないことでアダプターのセルフライゲーションによるコンカマーが出来ることを防ぎ、５’末端がリン酸化された二本鎖ＤＮＡと比較してアダプターの長さが十分短いことから、優先的にアダプターと二本鎖ＤＮＡのライゲーションが促進されることを利用している。このとき、アダプターの方向が定まってライゲーションされるように、アダプターがライゲーションされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなること、副鎖は本鎖よりも鎖長が短いことを特徴とするアダプターを用いることができる。また、ライゲーションをＲＮＡリガーゼで行う場合は、アダプターは一本鎖とし、ここでもアダプターをリン酸化しないことでアダプターのセルフライゲーションを防ぎ、かつアダプターの長さが５’末端がリン酸化された一本鎖ＤＮＡと比較して十分短いことから、優先的にアダプターと一本鎖ＤＮＡのライゲーションが促進されることを利用できる。ただし、ＩＶＶランダムライブラリー作成時では、テンプレートの３’末端がＲＮＡリガーゼの良いアクセプターとなるための配列（Ａ配列）を有しており、テンプレート同士のライゲーションが起こる確率は、ＤＮＡリガーゼを用いた作成方法より断然高くなる点が不利である。１つの回避手段としては、Ａ配列をライゲーション後にＰＣＲで付加するようにすれば問題ないが、それでも、ＲＮＡリガーゼはＤＮＡリガーゼに比較してライゲーション効率が落ちるので、総合的に見て、ライゲーションをＤＮＡリガーゼで行う手段が好ましい。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のランダムプライミングライブラリーとその構成要素と製法の説明図である。
図２は、本発明のライブラリーの評価の結果（電気泳動写真）を示す。
Ａ：マウス脳とマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーに含まれるＲＮＡの調査のために、１３種類の特定の遺伝子やＲＮＡのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりそれらの存在を確認した。レーン１−１３；ｃ−ｆｏｓ，ｆｏｓＢ，ｆｒａ１，ｆｒａ２，ｃ−ｊｕｎ，ｊｕｎＢ，ｊｕｎＤ，β−アクチン遺伝子，１８Ｓ リボゾームＲＮＡ，ｃ−ｒａｆ１，Ｈｒａｓ，Ｓ１５リボゾーム蛋白質遺伝子，ｊｍｊ遺伝子の順。
Ｂ：マウス脳とマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーから作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０２９）とＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０’）においても同様に、１３種類の特定の遺伝子やＲＮＡのプライマーを用いてＰＣＲによりそれらの存在を確認した。レーン１−１３；ｃ−ｆｏｓ，ｆｏｓＢ，ｆｒａ１，ｆｒａ２，ｃ−ｊｕｎ，ｊｕｎＢ，ｊｕｎＤ，β−アクチン遺伝子，１８Ｓ リボゾームＲＮＡ，ｃ−ｒａｆ１，Ｈｒａｓ，Ｓ１５ リボゾーム蛋白質，ｊｍｊ遺伝子の順。
図３は、本発明のライブラリーを用いたＩＶＶの共翻訳スクリーニング法による相互作用検出の概略および結果（電気泳動写真）を示す。
Ａ：マウス脳のＩＶＶライブラリーとベイトとしてｃ−ｆｏｓを用いて、無細胞共翻訳スクリーニングを行い、スクリーニング後のライブラリーをＲＴ−ＰＣＲで増幅して再びベイトと共に無細胞共翻訳スクリーニングすることを３回繰り返すことにより内在ｃ−ｊｕｎを濃縮した。
Ｂ：Ａにおいて、マウス脳のＩＶＶライブラリーの内在ｃ−ｊｕｎの濃縮について、各ラウンドごとのスクリーニング後のＲＴ−ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ｃ−ｊｕｎのプローブを用いてサザン・プロットした。Ｍ；ＤＩＧラベルしてある分子量マーカー（ロシュ・ダイアグノスティック）
図４は、本発明のライブラリーから検出されたベイトと相互作用のある蛋白質の例を示す。図３のＡに示す方法により得られた３ラウンド目のライブラリーをクローニングしシーケンスして検出した内在ｃ−ｊｕｎ配列の一例。
図５は、本発明のライブラリーを用いたＩＶＶの物質や蛋白質との相互作用解析の一次スクリーニングと二次スクリーニングの概略を示す。
図６は、翻訳テンプレート（Ａ）ならびにその構成要素であるコード分子（Ｂ）およびスペーサー分子（Ｃ）の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスペーサー分子由来のスペーサー部からなる。Ｆ１およびＦ２は蛍光色素を示す。
図７は、Ｃ末端修飾された蛋白質（Ｃ末端ラベル化蛋白質）（Ａ）、本発明の翻訳テンプレート（Ｂ）、および、修飾剤（Ｃ）の構成を示す。
図８は、無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。
Ａ： ベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。
Ｂ： ベイトの共存下、プレイが無細胞翻訳系で翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。
図９は、複合ベイトを用いた場合の無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。
複合ベイトを構成する一部のベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは、単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。また、複合ベイトは、図に示した無細胞翻訳系で翻訳されたポリペプチドとＤＮＡベイトの組合せに限られず、無細胞翻訳系で翻訳された複数又は単独のポリペプチドと、無細胞翻訳系で共存する複数又は単独のベイト（たとえば、ＤＮＡベイトなど）の組み合わせが挙げられる。
図１０は、無細胞共翻訳による複合体のスクリーニング方法の概略を示す。
図８および９で示したような無細胞共翻訳による複合体形成の工程（１）、その複合体のプレイをスクリーニングする工程（２）、および、プレイの解析の工程（３）により、無細胞共翻訳とスクリーニングをトータルにｉｎ ｖｉｔｒｏで実現することができる。プレイが対応付け分子でかつ複数であれば、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによってプレイをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡを再構成することにより再度（１）の工程からスクリーニングを繰り返すことができる。また、得られたプレイを解析後、ベイトとして（１）の工程からスクリーニングを新たに繰り返すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のライブラリーおよびその製法の概略を図１を参照して説明する。
本発明に使用されるＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーは、原核、真核生物、ウイルスなどあらゆる種のいかなる組織から抽出したＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーでも構わない。また、解読したゲノムやｃＤＮＡライブラリーを転写したＲＮＡライブラリーやそれを再現した人工のＲＮＡライブラリー、あるいは自然には存在しない配列を含む人工のｃＤＮＡライブラリーを転写したＲＮＡライブラリーでも構わない。
一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡライブラリーは、上記のＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーを特定配列を持つランダムプライマーで逆転写（図１、Ｉ）したライブラリーである。この際の逆転写酵素としては特に定めはなく、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）などで良い。また、ランダムプライマーのアダプター部分の特定配列については、最終的に対応付け分子のライブラリーを作成できるものあれば制限はないが、通常には、図１にあるように、３’ｔａｉｌ又はＴａｇ ２と３’ｔａｉｌを含む配列となる。ここで、３’ｔａｉｌは、Ａ配列としてポリＡｘ８配列、又はＸＡ配列としてＸｈｏＩ配列や４塩基以上で（Ｃ又はＧ）ＮＮ（Ｃ又はＧ）の配列とＡ配列の組み合わせが挙げられる。Ｔａｇ ２は、親和性タグ配列としてＦｌａｇ−ｔａｇ配列、ＨＡ−ｔａｇ、ＩｇＧのプロテインＡ（ｚドメイン）などの抗原抗体反応を利用したもの、Ｈｉｓ−ｔａｇなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、Ｃ末端ラベル化蛋白質合成の際は、ＸＡ配列の組み合わせが好ましく、ＩＶＶ形成の際は、Ａ配列が好ましい。また、３’ｔａｉｌのＸＡ配列又はＡ配列は、ＩＶＶのＰＥＧスペーサーや翻訳をさらに促進するＰＥＧ（Ｂｏｃ）スペーサーとのライゲーションの際に必要な配列でもある。
対応付け分子の構成は、例えば、ＷＯ ０２／４６３９５に記載されており、対応付け分子の形成に必要な配列、すなわち、特定配列は当業者であれば、このような公知の構成に基づき、適宜設定できる。
ｄｓＤＮＡライブラリーは、上記のｓｓＤＮＡライブラリーを二本鎖ＤＮＡに合成（図１、ＩＩ）したものである。この際、ＤＮＡポリメラーゼＩによる相補鎖ＤＮＡの合成とＲＮａｓｅ ＨによるＲＮＡ分解を同時に行い、さらに、ＤＮＡリガーゼで、ＤＮＡポリメラーゼＩにより合成されたＤＮＡ間のニックをつなぐ。合成された二本鎖ＤＮＡライブラリーは、ＤＮＡポリメラーゼＩにより合成された相補鎖のみ５’末端がリン酸化されており、３’末端に特定の配列を持つことが重要な特徴である。なお、ｄｓＤＮＡライブラリーは、この方法により形成されることが好ましいが、一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されているｄｓＤＮＡライブラリーが形成される限り、他の酵素を用いたり、他の原理によって形成してもよい。
ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーは、上記のｄｓＤＮＡライブラリーに、特定配列を持つアダプターをＤＮＡリガーゼによりライゲーション（図１、ＩＩＩ）したものである。この際に、アダプター主鎖の５’末端はリン酸化されていないことでセルフライゲーションを回避することが特徴であり、ライゲーション効率の良いＤＮＡリガーゼでライゲーションできるようにアダプターの３’末端に主鎖より短い副鎖をハイブリダイゼーションし二本鎖にしておくことが好ましい。ここで、アダプターの副鎖の５’末端もリン酸化されていないことが必要であり、理論的には主鎖より短ければよいが、ハイブリダイゼーションの有効性を考えると６ｂｐ以上であることが好ましい。ライゲーションをＲＮＡリガーゼで行う場合は、アダプターは一本鎖とし、ここでもアダプターをリン酸化しない。ただし、ＩＶＶランダムライブラリー作成時では、テンプレートの３’末端がＲＮＡリガーゼの良いアクセプターとなるための配列（Ａ配列）を有しており、テンプレート同士のライゲーションが起こる確率は、ＤＮＡリガーゼを用いた作成方法より断然高くなる点が不利である。また、ＲＮＡリガーゼはＤＮＡリガーゼに比較してライゲーション効率が落ちるので、総合的に見て、ライゲーションをＤＮＡリガーゼで行うことが好ましい。また、アダプターの特定配列については、最終的に対応付け分子のライブラリーを作成できるものあれば制限はないが、通常には、図１にあるように、５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲとＴａｇ １を含む配列となる。５’ＵＴＲは、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはＴ７／Ｔ３又はＳＰ６などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、転写プロモーターとしてはＳＰ６、翻訳のエンハンサー配列としてはオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部（０２９）は、ＴＭＶのオメガ配列の一部を含んだものである（Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ ０２／４８３４７の図３参照）。Ｔａｇ １については、先程のＴａｇ ２と同様であるが、Ｔａｇ １とＴａｇ ２の両方を配する場合は、異なるＴａｇ配列を配するようにする。ライゲーションされるアダプターには、これら５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲとＴａｇ １の一部又は全部の配列が含まれる場合がある。
本発明のＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーは、上記のライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、特定の配列を有する５’および３’プライマーでＰＣＲ（図１、ＩＶ）を行い合成する。５’および３’プライマーは、５’ＵＴＲ、Ｔａｇ １、Ｔａｇ ２、３’ｔａｉｌの特定の配列でアニーリングし、かつ５’ＵＴＲ、Ｔａｇ １、Ｔａｇ ２、３’ｔａｉｌの一部をアダプター配列として含む場合がある。このＰＣＲで５’ＵＴＲ、Ｔａｇ １、Ｔａｇ ２、３’ｔａｉｌなどの特定配列を持つｃＤＮＡライブラリーが完成する。
本発明のＩＶＶ ＲＮＡライブラリーは、上記のＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを転写（図１、Ｖ）して得られる。この際、このＩＶＶ ＲＮＡライブラリーをこのまま翻訳することやＣ末端ラベル化剤存在化に翻訳することでＣ末端ラベル化蛋白質ライブラリーを合成することが可能である。転写の酵素は、特定配列に選択したＴ３，Ｔ７又はＳＰ６などの酵素となる。
本発明のＩＶＶライゲーテッドＲＮＡライブラリーは、上記のＩＶＶ ＲＮＡライブラリーをスペーサーとライゲーション（図１、ＶＩ）して得られる。スペーサーとしては、ＩＶＶ形成の場合はＩＶＶのＰＥＧスペーサー、およびＣ末端ラベル化蛋白質合成のためのＰＥＧ（Ｂｏｃ）スペーサーなどが考えられる。ライゲーション酵素としては、ＲＮＡリガーゼを用いる方法が代表的だが、その他、ＤＮＡリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。
本発明のＩＶＶランダムプライミングライブラリーは、上記のＩＶＶライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系又は細胞内で翻訳（図１、ＶＩＩ）して得られる。
ＩＶＶのＰＥＧスペーサーおよびＣ末端ラベル化蛋白質合成のＰＥＧ（Ｂｏｃ）スペーサーは、ＣＣＡ領域、ＰＥＧ領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずＰＥＧ部を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、４００〜３０，０００で、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜６，０００である。また、ＣＣＡ領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。ＣＣＡ領域は、５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシンｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３，３７４−３７７）が適当である。Ｃ末端ラベル化蛋白質合成のためのＰＥＧ（Ｂｏｃ）スペーサーでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたＣＣＡ領域も考えられる。ＰＥＧ部は修飾物質を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、あるいは固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも１残基のＤＮＡおよび／又はＲＮＡの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、又はＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
Ｃ末端ラベル化剤は、タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基（残基を含む）をもつアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、得られるＣ末端修飾タンパク質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、タンパク質相互作用の検出が可能となる。修飾部には、ＰＥＧ部と同様に修飾物質が含まれる。修飾物質として、非放射性修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性タンパク質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。アクセプター部は、タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシン又はその誘導体の残基をもつ。ピューロマイシンはアミノアシルｔＲＮＡと類似した構造をもち、タンパク質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度ではタンパク質のＣ末端に結合することが知られている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２）。本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、タンパク質のＣ末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。修飾部とアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸又は核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（−ｒＣ−）又はデオキシリボヌクレオチド（−ｄＣ−）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とアクセプター部との間に挿入することによって修飾タンパク質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。本発明修飾剤においては、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。修飾剤は、上記修飾部とアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記アクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、機能性修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類又は結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用することもできる。また、機能性修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。
無細胞タンパク質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液等が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系の中に、翻訳テンプレートであるライブラリーを加え、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に１〜１００μＭの修飾剤を加え、２５〜３７℃で１〜数時間保温することによってＣ末端修飾タンパク質が合成される。対応付けの場合は、翻訳テンプレートであるライブラリーを加えて、２５〜３７℃で１〜数時間保温するだけで対応付け分子が合成される。合成された両修飾タンパク質は、そのまま次の精製プロセス又は検出プロセス、あるいは直接細胞への導入に供することができる。細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまでいかなる細胞でもよい。これらの細胞の中に、上記Ｃ末端ラベル化又は対応付けされた両修飾タンパク質を直接導入することもできるし、あるいは、翻訳テンプレートであるライブラリーを導入し、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に１〜１００μＭの修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾タンパク質が合成される。対応付けの場合は、対応付けテンプレートであるライブラリーを導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって対応付け分子が合成される。合成された両修飾タンパク質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセス又は検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。
対応付け分子のライブラリーは、進化分子工学として、ダーウイン進化機構を利用して、「変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）」、「選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」、「増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」の３つの単位操作を繰り返すことで漸進的に進化させ、所望の機能を獲得した物質を創製することで工学的に応用することが可能であり、また、ゲノム機能解析への応用として、ｃＤＮＡライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析可能である（図５）。本発明のライブラリーとしてＩＶＶのｃＤＮＡをもちいて、一次スクリーニングで物質や蛋白質と相互作用を検出し（図３の共翻訳スクリーニングはその一例）、さらに、相互作用の詳細をＦＣＣＳやマイクロアレイなどの二次スクリーニングで解析することが可能である。また、本発明のライブラリーは、ＩＶＶ又はＣ末端ラベル化蛋白質のライブラリーとして、単独でＦＣＣＳやマイクロアレイなどにより物質や蛋白質との相互作用解析に利用することも可能である。また、もちろん本発明のライブラリーをＩＶＶを用いた進化分子工学に応用し、一次スクリーニングにより機能性蛋白質の創出に利用することも可能であり、その際に、一次スクリーニングと二次スクリーニングを組み合わせて、創出した機能性蛋白質の相互作用の詳細を解析することも可能である。
この場合に、対応付け分子の共翻訳スクリーニング／セレクションを用いた解析は非常に有効である。なぜなら、共翻訳スクリーニング／セレクション法によって、ベイト蛋白質と直接又は間接的に相互作用のある蛋白質を網羅的に検出することが可能となったからである。さらに、共翻訳スクリーニング／セレクション法などによる一次スクリーニング後に、二次スクリーニングとして、物質や蛋白質と相互作用の詳細をＦＣＣＳやマイクロアレイなどにより解析することが可能である。以上の解析は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。また、一次スクリーニングで対応付け分子を利用するときはＡ配列のコード部を利用し、二次スクリーニングでは、対応付け分子を利用するときはＡ配列のコード部、Ｃ末端ラベル化蛋白質を利用するときはＸＡ配列のコード部をプライミングによって変更して使用することで、それぞれの効果を使い分けることが出来る。
上記で得られたＩＶＶライブラリー又はＣ末端ラベル化タンパク質のライブラリーと「標的分子」を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該修飾タンパク質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析することが出来る。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。「標的分子」とは、ＩＶＶ又はＣ末端ラベル化タンパク質と相互作用する分子を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。タンパク質としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製されたタンパク質を用いることができる。
これら標的分子とＩＶＶ又はＣ末端ラベル化タンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合および解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合および解離が挙げられる。
以下、共翻訳スクリーニング／セレクションを用いた解析方法の例について説明する。解析方法には、相互作用の検出方法および相互作用する蛋白質のスクリーニング方法が含まれる。
本発明検出方法は、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、プレイとして本発明のライブラリーを用いるものである。
好ましくは、ベイトおよびプレイに特定の様式で分離用修飾および検出用標識を行い、そして、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするものである。本明細書においては、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを「無細胞共翻訳」ともいう。
本明細書において、ベイトおよびプレイの用語は、物質間の相互作用の解析の技術分野で通常に用いられる意味を有する。すなわち、既知の物質である蛋白質や核酸などをベイト（おとり）と呼び、それと相互作用する物質である蛋白質や核酸などをプレイ（獲物）と呼ぶ。本発明では、プレイは蛋白質であることが好ましい。
ここで、ベイトとしては、あらゆる蛋白質（ペプチドを含む）、核酸、抗体、ホルモンなどのリガンド、金属などの任意のものから構成される複合体が挙げられ、天然のものでも人工のもののいずれでも構わない。ベイトとしての分子量の制限などは特にない。たとえば蛋白質であれば、機能ドメイン又は機能ドメインを含む完全長蛋白質などが挙げられる。プレイライブラリーを用いる場合は、完全長蛋白質とすることでより網羅的検出が可能となる。
また、プレイとしては、好ましくは、蛋白質のライブラリーが用いられる。プレイとしての分子量の制限などは特にない。
本発明検出方法は、好ましくは、上述のように、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明検出方法の好ましい構成は、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の通常の検出方法と同様でよい。
ベイトおよびプレイの分離用修飾および検出用標識は、複合体の検出に適合したものが適宜選択されるが、無細胞共翻訳において、ベイトとプレイとが共に検出用標識で標識されたり、分離用修飾を受けたりしないように行われる必要がある。そのため、プレイは、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされるか、又は、対応付け分子とされ、それに応じて、ベイトは分離用修飾を有するものとされる。
プレイが融合蛋白質とされる場合には、ベイトは分離用修飾を有するようにする。ベイトが蛋白質である場合には、ベイトは、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質として、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより無細胞翻訳系に存在させることが好ましい。
ベイトが蛋白質の場合の分離用修飾の例としては、蛋白質として、ＧＳＴ蛋白質やＴＡＰ法などに用いられているＣＢＰ（カルモジュリンビーズとの親和性により分離可能）やプロテインＡ（ＩｇＧ−プロテインＡ親和性により分離可能）、親和性タグとして、各種の抗体タグなどとの融合蛋白質とすることが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。プレイの検出用修飾としては、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光蛋白質との融合蛋白質とすることが挙げられる。
上記の融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの調製およびこのｍＲＮＡの無細胞翻訳系での翻訳は通常の方法に従って行うことができる。ｍＲＮＡは、無細胞転写翻訳系において、ＤＮＡの転写により生成するものであってもよい。
プレイが対応付け分子とされる場合には、ベイトには任意の分離用修飾を施すことができる。ベイトが蛋白質である場合には、上述の分離用修飾の例が挙げられる他、ベイトが核酸やドラッグなどの場合の分離用修飾の例としては、ストレプトアビジンやアビジンと相互作用のあるビオチンなどを利用することが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。
対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、通常には、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現形の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる分子である。この蛋白質としてプレイを用いることによりプレイを対応付け分子とすることができる。このような対応付け分子は、無細胞翻訳系において、プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うこと、又は、無細胞転写翻訳系において、プレイをコードするＤＮＡの転写および翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより形成することができる。従って、この製造の際に、ベイトを存在させることにより、無細胞共翻訳を行うことができる。すなわち、下記（１）又は（２）により無細胞共翻訳を行うことができる。
（１）無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
（２）無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写および翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
以下、上記（１）および（２）の態様について説明する。
（１）の態様では、ｍＲＮＡが、その３’末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス方法が挙げられる。
ｍＲＮＡは、好ましくは、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、プレイをコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含む核酸である。好ましくは、ポリＡ配列の５’側に、ＳＮＮＳ（ＳはＧ又はＣ）配列を含む発現増幅配列（例えば制限酵素ＸｈｏＩが認識する配列）が更に含まれる。５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。
ポリＡ配列は、少なくとも２残基以上のｄＡおよび／又はｒＡの混合あるいは単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリＡ連続鎖である。
翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる５’ＵＴＲ、および、ポリＡ配列を含む３’末端領域の組み合わせがある。３’末端領域のポリＡ配列の効果は通常には１０残基以下で発揮される。５’ＵＴＲの転写プロモーターはＴ７／Ｔ３又はＳＰ６などが利用でき、特に制限はない。好ましくはＳＰ６であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はＳＰ６を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、ＴＭＶのオメガ配列の一部（０２９；Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ ０２／４８３４７の図３参照）を含んだものが好ましい。
また、翻訳効率に関し、３’末端領域においては、ＸｈｏＩ配列とポリＡ配列の組み合わせが好ましい。さらに、ＯＲＦ領域の下流部分、すなわちＸｈｏＩ配列の上流に親和性タグがついたものとポリＡ配列の組み合わせが好ましい。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列又はＨｉｓ−ｔａｇ配列である。ポリＡ配列効果としては、Ｆｌａｇ−ｔａｇ等の親和性タグにＸｈｏＩ配列がついたものとそこへさらにポリＡ配列がついたものの翻訳効率が上昇する。ここで、Ｈｉｓ−ｔａｇについては、ＸｈｏＩ配列のない構成でも十分な翻訳効率を示し、有効である。
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
５’ＵＴＲをＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）又はＨｉｓ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’ＵＴＲで約４９ｂｐ、３’末端領域で約３８ｂｐ又は約２６ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、５’ＵＴＲと３’末端領域をもったコード領域を簡単に作成できる。コード領域において、翻訳はＯＲＦ領域を超えてされてもよい。すなわち、ＯＲＦ領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、ＰＡＮＳ−アミノ酸、ＡＡＮＳ−アミノ酸などが挙げられる。
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ，Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３，３７４−３７７）が適当である。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
スペーサー領域は、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域である。スペーサー領域は、通常には、ＰＥＧ領域の他に、核酸の３’末端に結合できるドナー領域を含む。
核酸の３’末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。ドナー領域は修飾物質を有していてもよい。
ドナー領域の５’末端の配列は、プレイをコードするコード領域とのライゲーション効率を左右する。コード領域とスペーサー領域をライゲーションさせるためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）又は２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
ＰＥＧ領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、ＰＥＧ領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が２０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が４００以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が１０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が１０００以上であることを意味する。
ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、４００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜８，０００である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約４００より低いと、このスペーサー領域を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３１８，２６８−２９３）、分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上のＰＥＧを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量１０００以上で良好であり、分子量４００以下ではＤＮＡスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
ポリエチレングリコールを主成分とするスペーサー領域を有することによって、対応付け分子がウサギ網状赤血球のみならず小麦胚芽の無細胞翻訳系でも形成可能となり、両翻訳系での遺伝子型分子の安定性が飛躍的に向上し、翻訳後の処理を施すことが不要となる。
（２）の態様では、ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写および翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、ＳＴＡＢＬＥ法が挙げられる。
エマルジョンは、通常には、２種の界面活性剤およびミネラルオイルと、無細胞転写翻訳系の反応液を混合して形成されるＷ／Ｏ型のエマルジョンである。Ｗ／Ｏ型のエマルジョンを形成するには、通常には、界面活性剤のＨＬＢ（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）値が３．５〜６である必要がある。２種の界面活性剤を混合した場合のＨＬＢ値は、個々の界面活性剤のＨＬＢ値から簡単な計算式で求められる。例えば、Ｓｐａｎ ８５（ＨＬＢ＝１．８およびＴｗｅｅｎ ８０（ＨＬＢ＝１５．０）を、それぞれ４０．２μｌおよび９．８μｌの割合で混合することによりＨＬＢ＝４．４となる。界面活性剤とミネラルオイルの割合は、通常１：１８（容量比）である。また、反応液の割合はエマルジョン全体に対して１〜５０％（容量比）であり、通常は５％である。界面活性剤とミネラルオイルの混合物に、撹拌しながら、低温で、反応液をいくつかに分けて添加し、混合することによりエマルジョンを形成することができる。転写および翻訳の反応は、エマルジョンの温度を上げることにより、開始させることができる。
プレイをコードするＤＮＡの調製およびこのＤＮＡの無細胞転写翻訳系での転写および翻訳は通常の方法に従って行うことができる。
上述のように、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行うことにより、無細胞共翻訳により形成された複合体を特異的に検出することができる。
ベイトとプレイの無細胞共翻訳において、無細胞共翻訳を行う無細胞翻訳系（無細胞転写翻訳系を含む）については、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法では、対応付け分子の形成は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉではかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系（Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ Ｅ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５；Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１２２９７）では安定であることが確認されており、さらに小麦胚芽の系（特開２００２−１７６９８７）ではより安定であることが確認されている。ＳＴＡＢＬＥ法では、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。
無細胞共翻訳における翻訳又は転写および翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に応じて適宜選択される。
無細胞翻訳系に添加するベイトとプレイのテンプレートは、無細胞翻訳系が転写も生じる無細胞転写翻訳系であれば、ＲＮＡおよびＤＮＡのどちらでも構わない。
以下、ベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるベイトとして、図６に示すように、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなることを特徴とする翻訳テンプレートを利用する。コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列でも良いが、好ましくは、コード部の３’末端領域にアクセプター（Ａ配列）を持つ、あるいは、コード部の３’末端領域にアクセプター（Ａ配列）を持ち、かつＡ配列の５’上流に翻訳増幅配列（Ｘ配列）を持つことを特徴とする。コード部のＡ配列として、短いポリＡ配列を含む。短いポリＡ配列とは、通常には２〜１０塩基のＡからなる配列である。Ｘ配列として、（Ｃ又はＧ）ＮＮ（Ｃ又はＧ）配列を有する配列、たとえば、ＸｈｏＩ配列を有することを特徴とする。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、コード部と連結するためのドナー領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つ。ＰＥＧスペーサー部は、ドナー領域のみ、ＣＣＡ領域のみでもかまわないが、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域を含む構成をとる。ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量は、５００以上であることを特徴とする。また、ドナー領域および／又はＣＣＡ領域において、少なくとも１つの機能付与ユニット（Ｆ）を含むことを特徴とする。機能付与ユニット（Ｆ１あるいは／かつＦ２）が、該翻訳テンプレートおよび／又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｃｙ５，又はローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これらのコード部や翻訳テンプレート、およびそのライブラリー、さらに、リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリーに関するものである。
ベイトの翻訳テンプレート（図６のＡ）は、コード分子（図６のＢ）に由来するコード部とＰＥＧスペーサー分子（図６のＣ）に由来するＰＥＧスペーサー部からなる。本態様では、基本的にはコード部の配列によらず、コード部にＰＥＧスペーサー部を連結（ライゲーション）することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。しかしながら、さらにコード部の構成やＰＥＧスペーサー部の種類によって、その翻訳効率をより向上させることが可能である。以下にその詳細を記載する。
本態様のコード部（図６のＢ）は、５’末端領域、ＯＲＦ領域、３’末端領域からなり、５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。また、コード部の配列には特に制限はなく、あらゆるベクターやプラスミドに組み込まれたものとしての利用が考えられる。また、コード部の３’末端領域は、Ａ配列としてポリＡｘ８配列、又はＸ配列としてＸｈｏＩ配列や４塩基以上でＳＮＮＳ（ＳはＧ又はＣ）の配列を持つもの、およびＡ配列とＸ配列の組み合わせとしてのＸＡ配列がある。Ａ配列、Ｘ配列、又はＸＡ配列の上流に親和性タグ配列としてＦｌａｇ−ｔａｇ配列、からなる構成が考えられる。ここで、親和性タグ配列としてはＨＡ−ｔａｇやＩｇＧのプロテインＡ（ｚドメイン）などの抗原抗体反応を利用したものやＨｉｓ−ｔａｇなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、ＸＡ配列の組み合わせが重要であり、Ｘ配列のなかで、最初の４塩基が重要であり、ＳＮＮＳの配列を持つものが好ましい。また、５’末端領域は、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはＴ７／Ｔ３又はＳＰ６などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、プロモーターとしては、ＳＰ６を用いることが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部（０２９）は、ＴＭＶのオメガ配列の一部を含んだものである（Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ ０２／４８３４７の図３参照）。コード部のＯＲＦ領域については、ＤＮＡおよび／又はＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、あるいは、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。
本態様のＰＥＧスペーサー分子（図６のＣ）は、ＣＣＡ領域、ＰＥＧ領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずＰＥＧ領域を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、４００〜３０，０００で、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜６，０００である。また、ＣＣＡ領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。本翻訳テンプレートでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたＣＣＡ領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、より翻訳効率を高められる。その理由は定かではないが、蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。ＣＣＡ領域（ＣＣＡ）の５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３，３７４−３７７）が適当である。本発明の一態様では、これらのピューロマイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。
本態様のＰＥＧスペーサー部は修飾物質（Ｆ１および／又はＦ２）を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、又は固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも１残基のＤＮＡおよび／又はＲＮＡの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、又はＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。また、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計可能な長さである。これによって新たな効果が生み出された。すなわち、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、３’ＵＴＲの代わりとしてＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。
本態様のＰＥＧスペーサー分子とコード分子のライゲーションは、その方法については、一般的なＤＮＡリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。ＲＮＡリガーゼを用いるライゲーションでは、コード部でライゲーション効率に影響を与える範囲としては３’末端領域のＡ配列が重要であり、少なくとも２残基以上のｄＡおよび／又はｒＡの混合又は単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６から８残基以上のポリＡ連続鎖である。ＰＥＧスペーサー部のドナー領域の５’末端のＤＮＡおよび／又はＲＮＡ配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とＰＥＧスペーサー部を、ＲＮＡリガーゼでライゲーションするためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）又は２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。さらに、ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。
次に、プレイとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるプレイとして、図７に示すように、翻訳テンプレートによってＣ末端修飾された蛋白質（＝対応付け分子）を利用する。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなる。コード部の３’末端にＡ配列を有し、Ａ配列は、短いポリＡ配列を含む。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域において、ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする、また、ドナー領域および／又はＣＣＡ領域において、少なくとも１つの修飾物質（Ｆ１および／又はＦ２）を含むことを特徴とする。また、ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的にはＣＣＡ領域にピューロマイシンを有する。また、修飾物質（Ｆ１および／又はＦ２）が、該翻訳テンプレートおよび／又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｃｙ５，又はローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝対応付け分子）および蛋白質（＝対応付け分子）のライブラリーに関するものである。
プレイは、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（図７のＡ；対応付け分子）であり、翻訳テンプレート（図７のＢ）と、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図７のＣ）の構成に特徴を持つ。以下詳細に記述する。
翻訳テンプレート（図７のＢ）のＰＥＧスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様である。また、コード部も上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、３’末端領域をＡ配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減する。ここでも、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、ＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。
本態様のＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図７のＣ）は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、ＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、ＲＮａｓｅ Ａなどで意図的に切断してもよい。切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、単独の対応付け分子をプレートやビーズやスライドガラスに固定することも可能である。
無細胞共翻訳を、図８を参照して説明する。図８に示すように、ベイトの存在下でプレイがｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳される。図８のＡおよびＢに示されるように、ベイトが蛋白質であって、無細胞翻訳系でプレイと同時に翻訳される場合と、ベイトが、核酸やホルモンなどであって、無細胞翻訳系に添加される場合がある。図８に示すように、プレイは融合蛋白質又は対応付け分子とされる。
複合体は、ベイトと一つのプレイが結合して形成されること（Ｉ）の他に、ベイトに結合したプレイにさらに別のプレイが結合することにより形成されること（ＩＩ）もある。
本発明検出方法によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体の形成を行うことができるので、一貫してｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質間又は核酸−蛋白質間などの相互作用を検出できる。
ベイトが蛋白質である場合は、ベイトとしては、目的蛋白質との相互作用のための機能ドメインのみの蛋白質、機能ドメインを含む蛋白質、又は完全長蛋白質などが挙げられる。ここで、完全長蛋白質を用いることは、複数の機能ドメインを有することが一般に予測されるため、さらに網羅的にプレイを検出可能となることから、好ましい。完全長蛋白質は、単独で完全長の蛋白質でもよいし、完全長の蛋白質を再構成する複数のベイトの集まりでもよい。
ベイトは、図９に示したように、複合体であってもよく、これを「複合ベイト」と呼ぶ。複合体にすることによって、より非特異的な吸着を減らすことができ、かつ完全長蛋白質と同様の効果として、より網羅的にプレイを検出することが可能となる。
以上のように、無細胞共翻訳で考えられる複合体としては、単独のベイトと単独のプレイの複合体、複合ベイトとプレイの複合体、ベイトと複数のプレイの複合体、および、複合ベイトと複数のプレイの複合体が可能である。従って、本発明検出法により検出可能な相互作用は、ベイトとプレイとの間の直接の相互作用だけでなく、複合体を形成するための間接的な相互作用をも包含するものである。
本発明における無細胞共翻訳で最も重要なことは、蛋白質がネイティブな状態でフォールディングしており、翻訳されたての変性していない状態であり、相互作用するべきベイトとプレイ又はベイトとベイトやプレイとプレイが無細胞翻訳系に共存しており、速やかに相互作用できると言うことと考えられる。このことは、別々に翻訳して翻訳直後に混合して共存させるよりも、共に翻訳したものの方が優れた結果が得られたことにより支持される。すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳された蛋白質がネイティブなフォールディング状態で、蛋白質又は核酸などと出会うことができるため、速やかに相互作用による複合体の形成が可能となったためと思われる。
従来の相互作用の検出法では、ベイトを大腸菌で大量に発現精製する必要があった。例えば、ＴＡＰ法などでベイトとプレイの相互作用を細胞で発現させる場合は、最低一ヶ月の準備が必要であった。また、ＧＳＴ融合蛋白によるプルダウン法を採用しているｍＲＮＡディスプレイ法では、ベイトを大腸菌などで大量に発現させて精製するため、最低２〜３週間かかり、大腸菌で発現しないものはベイトに出来ないなどの問題があり、さらに、プレイと相互作用させるにはプレイの５０〜１００倍の量のベイトを添加する必要があった。無細胞共翻訳では、無細胞翻訳系において、ほぼ同量のｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートを添加すればよいだけとなり、ベイトを細胞で発現させる必要は全くなくなり作業時間の大幅な短縮が行える。さらに、複合ベイトや完全長蛋白質によって、ベイトとプレイの相互作用をより強化し特異的なものとし、非特異的な結合の検出を回避することができる。また、複合ベイトによって、その第二のベイトと相互作用するより多くのプレイを網羅的に解析できる。
これまで、一貫してｉｎ ｖｉｔｒｏで相互作用による複合体形成とスクリーニングを実現するシステムは存在しなかったが、以上の本発明検出法によって、ベイトも含めて完全にｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳とスクリーニングを行って、蛋白質間又は蛋白質−核酸間の相互作用を非特異的な検出を回避しかつ網羅的に検出可能なシステムを構築できる。従って、本発明は、本発明検出方法を利用したスクリーニング方法も提供する。
本発明スクリーニング法は、ベイトとプレイが無細胞共翻訳を通して相互作用して複合体を形成し、複合体のスクリーニングによってベイトと相互作用するプレイを解析することを特長とする。従って、本発明スクリーニング方法は、本発明検出方法により、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程を含む他は、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、および、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイの通常のスクリーニング方法と同様でよい。
本発明スクリーニング方法は、選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程をさらに含み、調製されたプレイを、検出工程で使用されたベイトの代わりに又はそのベイトと共に用いて、検出工程、選択工程および調製工程を繰り返すことが好ましい。この態様は、例えば、図１０に示すように、１）プレイおよびベイトが相互作用を形成する無細胞翻訳系における無細胞共翻訳の工程、２）ベイトと相互作用しているプレイを検出するスクリーニングの工程、３）プレイを分析および解析する工程、および４）３）で分析および解析されたプレイを新たな次のベイトとし、１）から繰り返す工程から構成される。１）および２）の工程が検出工程および選択工程に相当し、３）の工程が調製工程に相当する。すなわち、検出工程のうちの、ベイトとプレイを接触させる工程が無細胞共翻訳の工程に相当し、検出工程のうちの複合体の検出および選択工程がスクリーニングの工程に相当する。
本発明スクリーニング法では、選択工程で選択されたプレイを再度検出工程に付してもよい。
本発明スクリーニング法では、ベイトと複数のプレイの集団であるプレイ・ライブラリーとの無細胞共翻訳を行い、スクリーニングの工程において、２つ以上のプレイが検出されてもよい。
図９に示すように、複合ベイトとプレイが共存し、相互作用によって複合ベイトとプレイの複合体を形成する場合がある。この無細胞共翻訳で、プレイ・ライブラリーの複数のプレイがベイトと共存し、相互作用によってベイトと複数のプレイの複合体を形成することによって、スクリーニングにおいて、一挙に網羅的な相互作用する複数のプレイを検出できる。また、ベイトが完全長蛋白質であることによって、完全長蛋白質は一般に相互作用の機能ドメインを複数含むので、より多くのプレイを網羅的に検出可能となる。
さらに、図９に示すように、複合ベイトと相互作用する複数のプレイの複合体を形成することによって、複合ベイトと相互作用する複数のプレイを検出でき、また、第二のベイトがベイトとプレイの相互作用の補強剤となり、より特異的な相互作用が実現されることによって、網羅的検出における非特異的検出の回避が可能となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法など進化分子工学的手法では、プレイは対応付け分子（ｆｕｓｉｏｎ）となる。プレイ・ライブラリーや複数のプレイを用いた場合の複合体の形成では、プレイは直接ベイトと相互作用する場合としない場合がある。
複合体のスクリーニングにより得られた複合体が対応付け分子である場合には、図１０に示すように、複合体を形成するプレイをＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲにより検出し、さらに、ＰＣＲ産物をプレイとして再スクリーニングする（プレイの再構築）、あるいは、ＰＣＲ産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングしてもよい。ここで、ＰＣＲ産物から再スクリーニングする、あるいは、ＰＣＲ産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングする方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法など進化分子工学的手法においてのみ可能であり、プルダウン法、ＴＡＰ法など蛋白質を直接解析する方法ではできない。
対応付け分子を用いた場合には、スクリーニングの後、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによって蛋白質プレイの遺伝子配列を知ることが出来る。図８および９に示すように、ここでの蛋白質プレイとは、ベイトと相互作用しているプレイ又はそのプレイと相互作用しているプレイなどであり、ベイトと相互作用しているすべての複数のプレイが網羅的に解析できる。さらにプレイの再スクリーニングが必要な場合は、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲの産物であるＤＮＡテンプレートを転写し、同じサイクルを繰り返す。また、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲとそれに続くシークエンスによってプレイが定まった場合は、その蛋白質プレイはベイトとして使えるようになる。はじめのベイトに対して相互作用するプレイが複数個見つかれば、複合ベイトを形成することが出来るようになり、さらにより多くのプレイを検出することが出来るようになる。
無細胞共翻訳を用いると、プルダウン法やＴＡＰ法においても一貫してｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質間相互作用を検出できることになるが、ＴＡＰ法では対応付け分子を形成していないので、プレイの解析において直接的に蛋白質を解析しなければならない。そこで、プルダウン法やＴＡＰ法をスクリーニングの方法としてｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法に応用すれば、対応付け分子を形成しているので、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによって、相互作用するプレイの解析においてその遺伝子配列を簡単に検出することが出来る。さらに、無細胞共翻訳を用いると、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法において、一貫してｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質間相互作用を検出できることになる。また、プレイの数が莫大な場合は、サイクルを回すことで再スクリーニングによりプレイを絞り込むことが可能である。また、解析されたプレイは、次の解析では、ベイトとして使うことができ、ベイトの数が増えれば、ベイトの複合化が進み、さらなるプレイが検出されることにつながる。このように、プレイをベイトとして次のサイクルで使用することは、対応付け分子を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法などでのみ簡単に実現できる。しかしながら、ｍＲＮＡディスプレイなどの方法では、新しいベイトのＧＳＴ融合蛋白を大腸菌で大量合成と精製が必要であり、ベイトの用意に時間がかかり困難である。無細胞共翻訳によれば、その必要もなく簡単にサイクルを回すことが出来る。
無細胞共翻訳後の複合体のスクリーニングにおいて、無細胞共翻訳によって出来た複合体を壊すことなくプレイを網羅的にスクリーニングできることが好ましい。このために、親和性タグなどによってベイトに固定化の仕組みを持たせ、ベイトと相互作用するプレイを検出してもよい。その固定化の仕組みは、いかなるものでも構わない。たとえば、既存のＴＡＰ法などのように、ＩｇＧ−プロテインＡ親和性やカルモジュリンビーズを用いた２段階のスクリーニングを行う方法、あるいはプルダウン法のように、ストレプトアビジン又はアビジン−ビオチン親和性、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ，Ｔ７−ｔａｇ，Ｈｉｓ−ｔａｇなどを利用した一段階又は二段階のスクリーニングを行う方法が挙げられる。
プレイ・ライブラリーとしては、ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライミング・ライブラリー、ｄＴプライミング・ライブラリー）、ランダム・ライブラリー、ペプチド・ライブラリー、ホルモン・ライブラリー、抗体・ライブラリー、リガンド・ライブラリー、医薬化合物ライブラリーなどが挙げられ、いかなるライブラリーでも構わない。たとえば、プレイ・ライブラリーとしてランダムプライミング・ｃＤＮＡライブラリーを用いた場合、このライブラリーには完全長プレイは望めないが、機能ドメインを含むプレイは期待できる。このようなライブラリーは、特に、複合ベイトや完全長蛋白質との組み合わせによるスクリーニングに用いると、プレイの網羅的検出に有効となる。
ランダムプライミングライブラリーの例としては、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の５’側に、転写プロモーターとしてＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（ＳＰ６）と、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルスのＴＭＶオメガ配列の一部（０２９）とを含んだ５’非翻訳（ＵＴＲ）領域を持ち、かつＭＣＳの３’側に親和タグ配列として、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を、ＭＣＳに組み込まれた挿入配列から発現した蛋白質のＣ末端にＦｌａｇ−ｔａｇが付加されるように含む３’末端を持つベクターのＭＣＳに、ランダムプライミングで得られたｃＤＮＡが組み込まれたものが挙げられる。
上記の本発明検出方法は、ベイトとプレイとを接触させ複合体を形成させる工程を含んでいる。従って、この工程に準じて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとの複合体を形成させる方法が提供される。
本発明形成方法は、ベイトとベイトと相互作用する蛋白質であるプレイとの複合体の形成において、プレイとして本発明のライブラリーを用いるものであり、好ましくは、さらに、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明形成方法の好ましい構成は、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の通常の形成方法と同様でよい。ベイトおよびプレイの特定の様式での検出用標識および分離用修飾ならびに無細胞共翻訳については、本発明検出方法に関し説明した通りでよい。
【実施例】
以下、具体的に本発明のＩＶＶランダムプライミングライブラリーとその作成に使用され得るライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリー、ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーおよびＩＶＶライゲーテッドＲＮＡライブラリーの作成についての実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
実施例１ ＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成とライブラリーからの共翻訳スクリーニング
図１に概略を示す方法に従ってＩＶＶランダムライブラリーを作成した。すなわち、ＲＮＡライブラリーを鋳型として、９塩基からなるランダム配列と特定配列（ｔａｇ２配列）を含むランダムプライマーを用いてランダムプライミング法により逆転写でｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーを合成する（Ｉ）。ＲＮａｓｅ ＨによりｃＤＮＡとＲＮＡの二本鎖からＲＮＡのみを分解すると同時に、ＤＮＡポリメラーゼＩによるｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、さらに、ＤＮＡリガーゼによりＤＮＡポリメラーゼＩにより合成されたＤＮＡ間にあるニックを修正してｄｓＤＮＡライブラリーを合成する（ＩＩ）。合成された二本鎖ｃＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼＩにより合成された側のみ５’末端にリン酸基を持つのでこれを利用し、特定配列（５’ＵＴＲ＝プロモーター＋エンハンサー）を持つアダプターをＤＮＡリガーゼを用いて結合し、ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリー）を合成する（ＩＩＩ）。アダプターとランダムプライマーの特定配列を利用してＰＣＲを行い、５’側にプロモーターとエンハンサーの配列、３’側にＡ ｔａｉｌをもつＩＶＶのｃＤＮＡライブラリーを作成する（ＩＶ）。次にＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを転写してＩＶＶ ＲＮＡライブラリーとし（Ｖ）、ＩＶＶとするためのスペーサーをライゲーションし（ＶＩ）、さらに、無細胞翻訳系で翻訳すれば、対応付け分子のライブラリーとなる（ＶＩＩ）。以下、詳細を説明する。
ＲＮＡライブラリーとして、市販のマウス脳又はマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（組織抽出ＲＮＡライブラリーをｏｌｉｇｏ ｄＴカラムで精製したもの；ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を購入した。
また、あらかじめ、アダプターを設計しＤＮＡを合成した。ここでは、対応付け分子の形成に適した５’ＵＴＲ配列（プロモーターＳＰ６＋エンハンサー０２９又は０’）をライブラリーに特定配列として付加するための設計を行った。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーには、エンハンサー０２９をもつアダプターを使用し、マウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーには、エンハンサー０’をもつアダプターを使用した。エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖（配列番号１）と副鎖（ｇａａｔｔｃｇｃ）、又は、エンハンサー０’用のアダプターの主鎖（配列番号２）と副鎖（ｇｇａａｔｔｃｇ）は、各々ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して１００μＭとし、主鎖と副鎖をそれぞれ１０μｌずつ等モルで混合した。９０℃で２分間加熱し、７０℃で５分加熱し、６０℃のウオーターバスにセットしてバスのヒーターを切ってゆっくりと６０℃から室温まで下げた。５μｌずつに分注して−２０℃に保存した。
まず、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーを一本鎖ＤＮＡに逆転写した（図１，Ｉ）。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（１．４ｐｍｏｌｅ／０．５μｇ）を０．５μｇ、３’ランダムプライマー（配列番号３）を２ｐｍｏｌとＤＥＰＣ水とを加えて１２．０μｌとし、７０℃で１０ｍｉｎ加熱し、氷上で１分間冷却した。これを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により４５℃で１ｈ逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で合成した一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーを全量用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により１６℃で２ｈ反応させ、さらにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより１６℃において５ｍｉｎの反応で末端を平滑化し、二本鎖ＤＮＡを合成した（図１，ＩＩ）。次に、この二本鎖ＤＮＡの５’末端がリン酸化されていることを利用して、先に準備したアタプターを用いてライゲーションした（図１，ＩＩＩ）。合成した二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ライブラリーをエタノール沈殿し、４μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。これに、１００μＭの準備したアダプターを１．０μｌ添加し、５０μｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて、１６℃で一晩反応させ、精製（ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ ；ＱＩＡＧＥＮ）した後５０μｌとした。次に、ＰＣＲ（ＥＸ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ；ＴａＫａＲａ）を行った（図１，ＩＶ）。５０μｌのライゲーションした二本鎖ＤＮＡ（ライゲーテッドｄｓＤＮＡ）ライブラリーから２μｌをテンプレートとして、ＩＶＶに必要な特定配列（０２９）を持つ５’ＰＣＲプライマー（配列番号４）と３’ＰＣＲプライマー（配列番号５）、又は、ＩＶＶに必要な特定配列（０’）を持つ５’ＰＣＲプライマー（配列番号６）と３’ＰＣＲプライマー（配列番号７）を用いて、ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０２９）、およびＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０’）を作成した。ＰＣＲの条件は、全量１００μｌ、２２サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとし、最後の伸長反応は、７２℃で１８０秒）とした。
作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを評価した。評価の結果は図２に示した。もとのマウス脳、又はマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーにどのような遺伝子が含まれるかを、遺伝子に特異的なプライマー（配列番号８〜３３）を用いてＲＴ−ＰＣＲで検出し（図２のＡ）、それらの遺伝子について、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーから作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０２９）とマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーから作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０’）において、もとのＲＮＡライブラリーと同様に遺伝子が存在しているかを確認した（図２のＢ）。どちらのライブラリーでも、もとのＲＮＡライブラリーを反映して各遺伝子が検出された。すなわち、ライブラリーの作成工程で、もとのＲＮＡライブラリーの質を落とすことなくＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成できた。
次に、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーから作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０２９）を用いて、ＩＶＶの共翻訳スクリーニングに従って、転写（図１，Ｖ）して、スペーサーをライゲーション（図１，ＶＩ）し、そして小麦胚芽の無細胞翻訳系で、ＩＶＶライゲーテッドライブラリーをプレイの翻訳テンプレートとし、ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡをベイトの翻訳テンプレートとし、共翻訳スクリーニングとＲＴ−ＰＣＲ（Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、プライマー；配列番号４と５、プログラム；ＲＴ−ＱＨ３０’）を３ラウンド回すとｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用するｃ−Ｊｕｎ蛋白質の遺伝子がサザンブロッティング（サザン）で明確に検出された（図３のＢ）。さらに、３ラウンド回したライブラリーをクローニングしたところ、ｃ−Ｊｕｎ蛋白質の遺伝子は約１／４を占めることがわかった。また、クローニングしたライブラリー内在のｃ−Ｊｕｎ蛋白質の遺伝子をシーケンスして確認した（図４）。詳細は以下の通りである。
ベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質の作成方法は以下の通りであった。ｐＣＭＶ−ＦｏｓＣＢＰｚｚベクター（配列番号３４）から、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用いて、ＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９）Ｔ７−ＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号３５）と３’ＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号３６）、ＰＣＲプログラムＣＹＣＢ１（表１参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ＤＮＡテンプレートをＲｉｂｏＭＡＸＴＭＬａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写（３７℃，２ｈ）を行い、ベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質のｍＲＮＡテンプレートを準備した。共存させるベイトＤＮＡは、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの結合配列を含むＤＮＡ−Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（配列番号３７）をテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＤＮＡ（配列番号３８）と３’ＤＮＡ（配列番号３９）、ＰＣＲプログラムＶ−２（表１参照））によって準備した。
プレイのマウス脳ｃＤＮＡライブラリーの作成方法は以下の通りであった。図１に従ってＩＶＶランダムライブラリーを作成した。ＲＮＡライブラリーとして、市販のマウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（組織抽出ＲＮＡライブラリーをｏｌｉｇｏ ｄＴカラムで精製したもの；ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を購入した。アダプター設計は、対応付け分子の形成に適した５’ＵＴＲ配列（プロモーターＳＰ６＋エンハンサー０２９又は０’）をライブラリーに、ＩＶＶ形成に必要な配列として付加するための設計を行った。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーには、エンハンサー０２９をもつアダプターを使用した。エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖（配列番号１）と副鎖（ｇａａｔｔｃｇｃ）は、各々ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して１００μＭとし、主鎖と副鎖をそれぞれ１０μｌずつ等モルで混合する。９０℃で２分間加熱し、７０℃で５分加熱し、６０℃のウオーターバスにセットしてバスのヒーターを切ってゆっくりと６０℃から室温まで下げる。５μｌづつに分注して−２０℃に保存する。次に、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーを一本鎖ＤＮＡに逆転写する（図１，Ｉ）。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（１．４ｐｍｏｌｅ／０．５μｇ）を０．５μｇ、３’ランダムプライマー（配列番号３）を２ｐｍｏｌとＤＥＰＣ水とを加えて１２．０μｌとし、７０℃で１０ｍｉｎ加熱し、氷上で１分間冷却した。これを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４５℃で１ｈ逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で合成した一本鎖ＤＮＡを全量用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ポリメラーゼＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１６℃で ２ｈ反応し、さらにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで１６℃で５ｍｉｎで末端を平滑化し、二本鎖ＤＮＡを合成した（図１，ＩＩ）。次に、この二本鎖ＤＮＡの５’末端がリン酸化されていることを利用して、先に準備したアダプターを用いてライゲーションした（図１，ＩＩＩ）。合成した二本鎖ＤＮＡライブラリーをエタノール沈殿し、４μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。これに、１００μＭの準備したアダプターを１．０μｌ添加し、５０μｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて、１６℃でオーバーナイトで反応させ、精製（ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）した後５０μｌとした。次に、ＰＣＲ（ＥＸ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ；ＴａＫａＲａ）を行った（図１，ＩＶ）。５０μｌのライゲーションした二本鎖ＤＮＡライブラリーから２μｌをテンプレートとして、ＩＶＶに必要な特定配列（０２９）を持つ５’ＰＣＲプライマー（配列番号４）と３’ＰＣＲプライマー（配列番号５）を用いて、ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成した。ＰＣＲの条件は、全量１００μｌ、２２サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとし、最後の伸長反応は、７２℃で１８０秒）とした。
これらベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質のｍＲＮＡテンプレート、プレイのマウス脳ｃＤＮＡライブラリー、そして共存させるベイトＤＮＡを小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて５０μｌで共翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）させた。５０μｌのサンプルに対し、ＩｇＧ結合バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ４０）５０μｌを添加し計１００μｌ（共翻訳サンプル）とした。その後、ＩｇＧアガロース（Ｓｉｇｍａ）をＩｇＧ結合バッファーで２回洗浄し、これに共翻訳サンプル（１００μｌ）を加え、４℃で２時間回転攪拌した。結合バッファーで３回、ＴＥＶ 切断バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ４０，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ）で１回洗浄、ＩｇＧアガロースに結合したベイト／プレイ複合体をＴＥＶプロテアーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で切断した（１６℃、２時間）。さらに、上清９０μｌを３００μｌカルモジュリン結合バッファーと０．３μｌ １Ｍ ＣａＣｌ２、さらに、５００μｌカルモジュリン結合バッファーで２回洗浄した５０μｌカルモジュリンビーズを加えて４℃で１時間回転攪拌した。遠心後、１０００μｌカルモジュリン結合バッファーで３回洗浄した。５０μｌカルモジュリン溶出バッファーを加えて、氷上で１〜２分放置し、遠心後、５０μｌを回収した。回収した溶液をテンプレートとして、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、プライマー；配列番号４と５、プログラム；ＲＴ−ＱＨ３０’（表１参照））を行った。この操作（図３）を３ラウンド繰り返した後のライブラリーをクローニングしてシーケンスした。
以上から、本発明のライブラリーは、ライブラリーとして非常に質が高いこと、および、ＩＶＶのライブラリーとして利用できることが証明された。
実施例２ ＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成
実施例１において、配列番号５の３’ＰＣＲプライマーの代わりに、配列番号４０の３’ＰＣＲプライマーを使用する他は、実施例１と同様にＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成および評価を行った。この結果、実施例１と同様の結果が得られた。
実施例３ ＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成
実施例２において、エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖および副鎖として、配列番号１およびｇａａｔｔｃｇｃの代わりに配列番号４１およびｇｇａａｔｔｃｇの配列を有するものを使用する他は、実施例２と同様にＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成および評価を行った。この結果、実施例１と同様の結果が得られた。
産業上の利用分野
本発明によれば、ＩＶＶのセレクション／スクリーニングに用いるライブラリーとその製法が提供される。従来、ランダムプライマーによるライブラリー作成では、平均長が短くなる問題がある。また、クローニングを介在する作成方法の場合、元のＲＮＡライブラリーの規模や質を下げる問題がある。本発明では、二本鎖ＤＮＡを合成する際にＫｌｅｎｏｗフラグメントで５’側ランダムプライマーを使用する方法（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｐ．Ｗ．，Ａｌｐｉｎ，Ｊ．，Ｒｉｓｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｋｒｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．２００１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ−ＸＬ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｍｉｘ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２０８９８−２０９０６．）の代わりに、ＲＮａｓｅ Ｈ，ＤＮＡポリメラーゼＩ，そしてＤＮＡリガーゼ存在下で二本鎖ＤＮＡを合成すると、合成された相補鎖のみがリン酸化されていることを利用して、アダプターを相補鎖にライゲーションすることで、ＤＮＡ鎖の方向性を定めると同時に、平均長が短くなることも回避し、このライゲーションした相補鎖ＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとし、クローニングを介さず直接ＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリーを作成するため、元のＲＮＡライブラリーの規模や質を損なわないランダムプライミングライブラリーが提供可能となる。また、クローニングが必要な従来法に比べて、ライブラリー作成作業は１ヶ月から３日へ１／１０に短縮される。
クローニングを介さない方法においては、テンプレート作成のためのランダムプライマーを５’および３’末端の両端に用いるためにライブラリーの平均長が短くなる問題があったが、本発明では、ランダムプライマー（特定配列を持つアダプター付き）を最初のＲＮＡライブラリーからの逆転写時のみに用いて、二本鎖ＤＮＡとする際には用いないで、アダプターをライゲーションする方法を採用する。二本鎖ＤＮＡとしたときの相補鎖ＤＮＡのみが５’がリン酸化されていることを利用して、特定配列を持つリン酸化されていないアダプターをライゲーションすることで（ここでは、ライゲーション効率が高いＤＮＡリガーゼを用い、ＰＣＲテンプレートの方向性を定めるために、長さの短い配列をハイブリダイゼーションした一部二本鎖のアダプターを用いる。）、平均長が短くなることを回避し、かつライゲーションの際の副産物も少なく質の良いＰＣＲのテンプレートを作成することで、質の高いライブラリーを実現できる。
一方、ランダムプライミングによる対応付けライブラリーを作成する際のライブラリーの質を左右する他の要因としては、ライブラリーのテンプレートの中で対応付け分子を形成できるテンプレートの存在率を向上させることが考えられる。この場合、フレームのズレが１／３、５’ＵＴＲ／ＯＲＦ／３’ＵＴＲの３領域の枠組みのズレが１／３、さらに、表と裏で１／２なので、組み合わせると１／１８の確率となる。さらに、ライブラリーの作成にクローニングを介すると、ベクターへのライゲーションでバイヤスがかかり、元のライブラリーの質を保つことは難しい。本発明では、クローニングを介することがないために元のライブラリーの質を保つことが容易になり、かつライブラリーの規模はクローニングを介して細胞を用いた場合は１０８／ｍｌであるのに対して試験管内で作成するので１０１４／ｍｌが実現できるため、最終的にライブラリーのテンプレートの中で対応付け分子を形成できるテンプレートの量は大幅に増加し、極微量存在しているテンプレートでもスクリーニングやセレクションの際のＲＴ−ＰＣＲで増幅可能なライブラリーが作成できることになる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【技術分野】
本発明は、対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および利用方法に関する。
【背景技術】
現在、多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンスの研究では、第２幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の構造や機能解析（非特許文献１、非特許文献２）、および蛋白質間、核酸−蛋白質間相互作用解析などが期待されている（非特許文献３、非特許文献４）。
蛋白質間の相互作用を解析する方法としては、免疫沈降（非特許文献５）、ＧＳＴ融合蛋白質によるプルダウン・アッセイ（非特許文献６）、ＴＡＰ法（非特許文献７）、酵母ツーハイブリッド法（非特許文献８）などが知られている。一方、もともとは進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表現型）の対応付け」を特徴とする以下に示す方法も、ポストゲノム機能解析における蛋白質間などの相互作用を解析する方法として期待されている（非特許文献９）。代表的な方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法（非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１）、ＳＴＡＢＬＥ法（非特許文献１２）、ファージディスプレー法（非特許文献１３）、リボソーム・ディスプレイ法（非特許文献１４、特許文献２）、ｍＲＮＡ−ペプチドヒュージョン（ｍＲＮＡディスプレイ）法（非特許文献１５）などである。
このようなポストゲノム機能解析によって、蛋白質間および蛋白質−核酸間などの相互作用ネットワーク解析から重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創製などが期待され、医療、食料、エネルギー、環境など多くの分野の産業で優れたネットワーク解析技術が所望されている。蛋白質間および蛋白質−核酸間などの相互作用ネットワーク解析のためには、ベイト蛋白質との相互作用解析に用いるＲＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリー作成方法は欠かせない要素技術となる。
ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。どのような解析方法であっても、蛋白質間および蛋白質−核酸間の解析に共通して欠かせないものは、ＲＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーである。ライブラリーの質が高ければ、解析結果も質が高いものとなるため、要素技術としてライブラリー作成技術は重要である。ポストゲノム機能解析の蛋白質間および蛋白質−核酸間の解析方法であるｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス（ＩＶＶ）法（非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１、特許文献３）において、ＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー作りとしてこれまで知られていた技術は、組織から抽出したＲＮＡライブラリーから、あるいは既存のｃＤＮＡライブラリーから、発現ベクターにクローニングを介してライブラリーを構築する方法、あるいは、クローニングを介さずに直接ライブラリーを構築する方法（非特許文献１６）があった。
【非特許文献１】 Ｓａｅｇｕｓａ Ａ．Ｊａｐａｎ ｂｏｏｓｔｓ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．．．Ｎａｔｕｒｅ ４０１，６７５１（１９９９）
【非特許文献２】 Ｄａｌｔｏｎ Ｒ，Ａｂｂｏｔｔ Ａ．Ｃａｎ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｆｉｎｄ ｒｅｃｉｐｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｃｈｉｐｓ？ Ｎａｔｕｒｅ ４０２，６７６３（１９９９）
【非特許文献３】 宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１４５
【非特許文献４】 宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７
【非特許文献５】 Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６６，７０１−７０４
【非特許文献６】 Ｋａｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｃｅｌｌ ６４，５２１−５３２
【非特許文献７】 Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｒｉｇａｕｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７，１０３０（１９９９）
【非特許文献８】 Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ，Ｓｏｎｇ Ｏ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３４０，２４５（１９８９）
【非特許文献９】 Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ａ．Ｒ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ−ｔｏｗａｒｄ ａｎ ｅｎｄｇａｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１９４８（１９９９）
【非特許文献１０】 Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｖｉｖａ Ｏｒｉｇｉｎｏ ２５，３５（１９９７）
【非特許文献１１】 Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ： Ｂｏｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍＲＮＡ ｂｅａｒｉｎｇ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｔ ｔｈｅ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｏｆ ｉｔｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）
【特許文献１】 国際公開パンフレット第ＷＯ９８／１６６３６号
【非特許文献１２】 Ｄｏｉ Ｎ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｈ．ＳＴＡＢＬＥ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５７，２２７（１９９９）
【非特許文献１３】 Ｓｍｉｔｈ Ｇ．Ｐ．Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８，１３１５（１９８５）
【非特許文献１４】 Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９０２２−９０２６
【特許文献２】 国際公開パンフレット第ＷＯ９５／１１９２２号
【非特許文献１５】 Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１２２９７
【特許文献３】 国際公開パンフレット第ＷＯ０２／４６３９５号
【非特許文献１６】 Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｐ．Ｗ．，Ａｌｐｉｎ，Ｊ．，Ｒｉｓｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｋｒｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．２００１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ−ＸＬ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｍｉｘ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２０８９８−２０９０６
【発明の開示】
ポストゲノム機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。どのような解析方法であっても、蛋白質の解析に共通して欠かせないものは、質の高いＲＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーの構築である。ＩＶＶのためのライブラリー作成方法の従来法としては、ランダムプライミング法によりストップコドンを持たないＯＲＦ領域を多く含むように工夫したＤＮＡ断片を、ＩＶＶ形成のための５’ＵＴＲ、３’ｔａｉｌ配列を持った発現ベクターにクローニングしてライブラリーを構築する方法があったが、この方法では、クローニングを介するためライブラリーの規模が制限され、ライブラリーの質はよいものとは言えなかった。また、ライブラリーの構築に時間がかかった。さらに、上述の、クローニングを介さずに直接ライブラリーを構築する方法として、ランダムプライミング法によりストップコドンを持たないＯＲＦ領域を多く含むように工夫したＤＮＡ断片を、ＩＶＶ形成のための配列を持ったテンプレートを作成し、特定配列でＰＣＲによってライブラリーを構築する方法があった。この方法では、３’ランダムプライマーで逆転写し、さらに、５’ランダムプライマーで二本鎖ＤＮＡの相補鎖を形成しているので、３’および５’末端の両端ともランダムプライマーを使用することからライブラリーの平均長が短くなる問題点があった。
よって、本発明では、対応付け分子（ＩＶＶ）のライブラリーに適した３’ＵＴＲを含まないテンプレートを含み、両端にランダムプライマーを使用したときのようなライブラリーの平均長が短くならないライブラリーを実現することを課題とする。
本発明者らは、ランダムプライマーとアダプターを組み合わせて使用することにより、ｍＲＮＡライブラリーからでも、ＩＶＶに適した、３’ＵＴＲを含まないテンプレート効率の高いライブラリーが作成でき、両端にランダムプライマーを使用したときの平均長が短くなる問題が解決できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
１． ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により一本鎖ＤＮＡを形成し、さらに該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、
該二本鎖ＤＮＡライブラリーと、末端がリン酸化されていない核酸からなるアダプターとをライゲーションしてライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、
該ライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、対応付け分子の形成に必要な配列を持つプライマーを用いたＰＣＲにより、対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを作成する
ことを含む対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーの製造方法。
２． アダプターが二本鎖であり、ライゲーションされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなる１の製造方法。
３． 副鎖が本鎖よりも鎖長が短い２記載の製造方法。
４． 一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを、一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼ ＩおよびＤＮＡリガーゼ存在下で形成する１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
５． 対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを構成するｃＤＮＡが、５’末端にプロモーターとエンハンサーを有する配列を含み、３’末端にライゲーションのアクセプター配列を含む１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
６． プロモーター配列がＳＰ６プロモーターで、エンハンサー配列がオメガ配列又はオメガ配列の一部であり、アクセプター配列が２〜１０塩基のポリＡ配列である５記載の製造方法。
７． １〜６のいずれか１項に記載の製造方法により得られる対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを転写することを含む、対応付け分子ＲＮＡライブラリーの製造方法。
８． ７に記載の製造方法により得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを構成する対応付け分子ＲＮＡの３’末端にスペーサーをライゲーションすることを含む、対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーの製造方法。
９． スペーサーが、対応付けＲＮＡ分子にライゲーションする末端の反対の末端にピューロマイシン又はピューロマイシン誘導体を有し、かつ、塩基配列で１０−１００ｂｐ相当の長さを持ち、該スペーサーは、該ピューロマイシン又はピューロマイシン誘導体を介して、該対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーのテンプレートから翻訳された蛋白質と連結するものである８記載の製造方法。
１０． 該スペーサーが、該対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーから翻訳された蛋白質と連結しないものである８記載の製造方法。
１１． ７に記載の製造方法により得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１２． ８又は９に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１３． ８又は１０に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１４． ７に記載の製造方法で得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１５． ８又は９に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１６． ８又は１０に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
１７． 該蛋白質をＣ末端ラベル化法で修飾することを含む、１１、１３、１４又は１６に記載の製造方法。
１８． 核酸のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質と核酸の相互作用解析方法であって、ライブラリーが、１、５、７〜１０のいずれか１項に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
１９． 蛋白質のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、１７に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
２０． 対応付け分子のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、１２又は１５に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
２１． 相互作用が共翻訳スクリーニング法により解析される、２０記載の方法。
２２． ライブラリーのスクリーニングを含む進化分子工学による機能蛋白質の創製方法であって、ライブラリーが、１２又は１５に記載の製造方法により得られるライブラリーである前記方法。
２３． ２０に記載の蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、１９又は２０に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。
２４． ２１に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、１９又は２０に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。
２５． ２２に記載の該機能蛋白質の創製方法を行い、ついで、１９又は２０に記載に記載の該蛋白質間相互作用解析を行うことを含む蛋白質の創製方法。
本発明においては、ライブラリーの規模を保ち、質の高いライブラリーを実現し、かつ簡単で短時間で作成可能なライブラリーを実現する手段として、ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、クローニングベクターを介することなく、対応付け分子（ＩＶＶ）形成に必要な配列（以下、「特定配列」ともいう）を５’および３’末端に含むことを特徴とするＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成する。すなわち、ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、５’末端に特定配列を持つアダプター領域を含むランダムプライマーで逆転写により一本鎖ＤＮＡを形成し、さらに該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡを形成したものであることを特徴とする二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡライブラリーを作成し、さらに、該ｄｓＤＮＡライブラリーに特定配列を含むアダプターをライゲーションすることによりライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーを作成する。該ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーをテンプレートとして対応付け分子（ＩＶＶ）形成に必要な５’および３’末端配列を持つプライマーでＰＣＲを行うことによりＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成する。ついで、該ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを転写したＩＶＶ ＲＮＡライブラリー、該ＩＶＶ ＲＮＡライブラリーを翻訳したＩＶＶランダムプライミングライブラリーを作成することができる。
従来は、一本鎖ＤＮＡを鋳型として相補鎖ＤＮＡを合成して二本鎖ＤＮＡを形成する際に５’末端にランダムプライマーを用いていたが、その方法では、作成された二本鎖ＤＮＡの３’末端および５’末端の両端ともにランダムプライマーを用いているためにライブラリーの平均長が短いものとなってしまう問題点がある。本発明では、ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により形成された一本鎖ＤＮＡを鋳型として形成された片側の相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されていることを特徴とするｄｓＤＮＡライブラリーとリン酸化されていないアダプターをライゲーションする手段を利用する。このとき、アダプターが二本鎖であり、ライゲーションされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなること、さらに副鎖は本鎖よりも鎖長が短いことを特徴とするアダプターを用いたライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーを作成することができる。また、このとき、該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーゼ存在下で形成されたものであるｄｓＤＮＡライブラリーを用いて、ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーを作成し、ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーをテンプレートとして特定配列を持つプライマーを用いたＰＣＲによりＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成することもできる。ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーは、５’末端にプロモーターとエンハンサーを有した特定の配列を含み、３’末端にライゲーションのアクセプター配列を含むものでもよい。
従来のアダプターのライゲーションでは、アダプターをリン酸化するために、セルフライゲーションやライブラリー・テンプレートの両端にライゲーションされてしまうためにクローニングでは方向性が決められない問題点があり、ＰＣＲでも方向性がまちまちのテンプレートが出来てしまいテンプレートの質が落ちてしまうなどの問題点がある。本発明では、アダプターは、用いるリガーゼに応じて選択することが好ましく、ライゲーションをＤＮＡリガーゼで行う場合は、アダプターは一部二本鎖とし、アダプターをリン酸化しないことでアダプターのセルフライゲーションによるコンカマーが出来ることを防ぎ、５’末端がリン酸化された二本鎖ＤＮＡと比較してアダプターの長さが十分短いことから、優先的にアダプターと二本鎖ＤＮＡのライゲーションが促進されることを利用している。このとき、アダプターの方向が定まってライゲーションされるように、アダプターがライゲーションされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなること、副鎖は本鎖よりも鎖長が短いことを特徴とするアダプターを用いることができる。また、ライゲーションをＲＮＡリガーゼで行う場合は、アダプターは一本鎖とし、ここでもアダプターをリン酸化しないことでアダプターのセルフライゲーションを防ぎ、かつアダプターの長さが５’末端がリン酸化された一本鎖ＤＮＡと比較して十分短いことから、優先的にアダプターと一本鎖ＤＮＡのライゲーションが促進されることを利用できる。ただし、ＩＶＶランダムライブラリー作成時では、テンプレートの３’末端がＲＮＡリガーゼの良いアクセプターとなるための配列（Ａ配列）を有しており、テンプレート同士のライゲーションが起こる確率は、ＤＮＡリガーゼを用いた作成方法より断然高くなる点が不利である。１つの回避手段としては、Ａ配列をライゲーション後にＰＣＲで付加するようにすれば問題ないが、それでも、ＲＮＡリガーゼはＤＮＡリガーゼに比較してライゲーション効率が落ちるので、総合的に見て、ライゲーションをＤＮＡリガーゼで行う手段が好ましい。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のランダムプライミングライブラリーとその構成要素と製法の説明図である。
図２は、本発明のライブラリーの評価の結果（電気泳動写真）を示す。
Ａ：マウス脳とマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーに含まれるＲＮＡの調査のために、１３種類の特定の遺伝子やＲＮＡのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりそれらの存在を確認した。レーン１−１３；ｃ−ｆｏｓ，ｆｏｓＢ，ｆｒａ１，ｆｒａ２，ｃ−ｊｕｎ，ｊｕｎＢ，ｊｕｎＤ，β−アクチン遺伝子，１８Ｓ リボゾームＲＮＡ，ｃ−ｒａｆ１，Ｈｒａｓ，Ｓ１５リボゾーム蛋白質遺伝子，ｊｍｊ遺伝子の順。
Ｂ：マウス脳とマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーから作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０２９）とＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０’）においても同様に、１３種類の特定の遺伝子やＲＮＡのプライマーを用いてＰＣＲによりそれらの存在を確認した。レーン１−１３；ｃ−ｆｏｓ，ｆｏｓＢ，ｆｒａ１，ｆｒａ２，ｃ−ｊｕｎ，ｊｕｎＢ，ｊｕｎＤ，β−アクチン遺伝子，１８Ｓ リボゾームＲＮＡ，ｃ−ｒａｆ１，Ｈｒａｓ，Ｓ１５ リボゾーム蛋白質，ｊｍｊ遺伝子の順。
図３は、本発明のライブラリーを用いたＩＶＶの共翻訳スクリーニング法による相互作用検出の概略および結果（電気泳動写真）を示す。
Ａ：マウス脳のＩＶＶライブラリーとベイトとしてｃ−ｆｏｓを用いて、無細胞共翻訳スクリーニングを行い、スクリーニング後のライブラリーをＲＴ−ＰＣＲで増幅して再びベイトと共に無細胞共翻訳スクリーニングすることを３回繰り返すことにより内在ｃ−ｊｕｎを濃縮した。
Ｂ：Ａにおいて、マウス脳のＩＶＶライブラリーの内在ｃ−ｊｕｎの濃縮について、各ラウンドごとのスクリーニング後のＲＴ−ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ｃ−ｊｕｎのプローブを用いてサザン・プロットした。Ｍ；ＤＩＧラベルしてある分子量マーカー（ロシュ・ダイアグノスティック）
図４は、本発明のライブラリーから検出されたベイトと相互作用のある蛋白質の例を示す。図３のＡに示す方法により得られた３ラウンド目のライブラリーをクローニングしシーケンスして検出した内在ｃ−ｊｕｎ配列の一例。
図５は、本発明のライブラリーを用いたＩＶＶの物質や蛋白質との相互作用解析の一次スクリーニングと二次スクリーニングの概略を示す。
図６は、翻訳テンプレート（Ａ）ならびにその構成要素であるコード分子（Ｂ）およびスペーサー分子（Ｃ）の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスペーサー分子由来のスペーサー部からなる。Ｆ１およびＦ２は蛍光色素を示す。
図７は、Ｃ末端修飾された蛋白質（Ｃ末端ラベル化蛋白質）（Ａ）、本発明の翻訳テンプレート（Ｂ）、および、修飾剤（Ｃ）の構成を示す。
図８は、無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。
Ａ： ベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。
Ｂ： ベイトの共存下、プレイが無細胞翻訳系で翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。
図９は、複合ベイトを用いた場合の無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。
複合ベイトを構成する一部のベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは、単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。また、複合ベイトは、図に示した無細胞翻訳系で翻訳されたポリペプチドとＤＮＡベイトの組合せに限られず、無細胞翻訳系で翻訳された複数又は単独のポリペプチドと、無細胞翻訳系で共存する複数又は単独のベイト（たとえば、ＤＮＡベイトなど）の組み合わせが挙げられる。
図１０は、無細胞共翻訳による複合体のスクリーニング方法の概略を示す。
図８および９で示したような無細胞共翻訳による複合体形成の工程（１）、その複合体のプレイをスクリーニングする工程（２）、および、プレイの解析の工程（３）により、無細胞共翻訳とスクリーニングをトータルにｉｎ ｖｉｔｒｏで実現することができる。プレイが対応付け分子でかつ複数であれば、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによってプレイをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡを再構成することにより再度（１）の工程からスクリーニングを繰り返すことができる。また、得られたプレイを解析後、ベイトとして（１）の工程からスクリーニングを新たに繰り返すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明のライブラリーおよびその製法の概略を図１を参照して説明する。
本発明に使用されるＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーは、原核、真核生物、ウイルスなどあらゆる種のいかなる組織から抽出したＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーでも構わない。また、解読したゲノムやｃＤＮＡライブラリーを転写したＲＮＡライブラリーやそれを再現した人工のＲＮＡライブラリー、あるいは自然には存在しない配列を含む人工のｃＤＮＡライブラリーを転写したＲＮＡライブラリーでも構わない。
一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡライブラリーは、上記のＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーを特定配列を持つランダムプライマーで逆転写（図１、Ｉ）したライブラリーである。この際の逆転写酵素としては特に定めはなく、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）などで良い。また、ランダムプライマーのアダプター部分の特定配列については、最終的に対応付け分子のライブラリーを作成できるものあれば制限はないが、通常には、図１にあるように、３’ｔａｉｌ又はＴａｇ ２と３’ｔａｉｌを含む配列となる。ここで、３’ｔａｉｌは、Ａ配列としてポリＡｘ８配列、又はＸＡ配列としてＸｈｏＩ配列や４塩基以上で（Ｃ又はＧ）ＮＮ（Ｃ又はＧ）の配列とＡ配列の組み合わせが挙げられる。Ｔａｇ ２は、親和性タグ配列としてＦｌａｇ−ｔａｇ配列、ＨＡ−ｔａｇ、ＩｇＧのプロテインＡ（ｚドメイン）などの抗原抗体反応を利用したもの、Ｈｉｓ−ｔａｇなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、Ｃ末端ラベル化蛋白質合成の際は、ＸＡ配列の組み合わせが好ましく、ＩＶＶ形成の際は、Ａ配列が好ましい。また、３’ｔａｉｌのＸＡ配列又はＡ配列は、ＩＶＶのＰＥＧスペーサーや翻訳をさらに促進するＰＥＧ（Ｂｏｃ）スペーサーとのライゲーションの際に必要な配列でもある。
対応付け分子の構成は、例えば、ＷＯ ０２／４６３９５に記載されており、対応付け分子の形成に必要な配列、すなわち、特定配列は当業者であれば、このような公知の構成に基づき、適宜設定できる。
ｄｓＤＮＡライブラリーは、上記のｓｓＤＮＡライブラリーを二本鎖ＤＮＡに合成（図１、ＩＩ）したものである。この際、ＤＮＡポリメラーゼＩによる相補鎖ＤＮＡの合成とＲＮａｓｅ ＨによるＲＮＡ分解を同時に行い、さらに、ＤＮＡリガーゼで、ＤＮＡポリメラーゼＩにより合成されたＤＮＡ間のニックをつなぐ。合成された二本鎖ＤＮＡライブラリーは、ＤＮＡポリメラーゼＩにより合成された相補鎖のみ５’末端がリン酸化されており、３’末端に特定の配列を持つことが重要な特徴である。なお、ｄｓＤＮＡライブラリーは、この方法により形成されることが好ましいが、一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されているｄｓＤＮＡライブラリーが形成される限り、他の酵素を用いたり、他の原理によって形成してもよい。
ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーは、上記のｄｓＤＮＡライブラリーに、特定配列を持つアダプターをＤＮＡリガーゼによりライゲーション（図１、ＩＩＩ）したものである。この際に、アダプター主鎖の５’末端はリン酸化されていないことでセルフライゲーションを回避することが特徴であり、ライゲーション効率の良いＤＮＡリガーゼでライゲーションできるようにアダプターの３’末端に主鎖より短い副鎖をハイブリダイゼーションし二本鎖にしておくことが好ましい。ここで、アダプターの副鎖の５’末端もリン酸化されていないことが必要であり、理論的には主鎖より短ければよいが、ハイブリダイゼーションの有効性を考えると６ｂｐ以上であることが好ましい。ライゲーションをＲＮＡリガーゼで行う場合は、アダプターは一本鎖とし、ここでもアダプターをリン酸化しない。ただし、ＩＶＶランダムライブラリー作成時では、テンプレートの３’末端がＲＮＡリガーゼの良いアクセプターとなるための配列（Ａ配列）を有しており、テンプレート同士のライゲーションが起こる確率は、ＤＮＡリガーゼを用いた作成方法より断然高くなる点が不利である。また、ＲＮＡリガーゼはＤＮＡリガーゼに比較してライゲーション効率が落ちるので、総合的に見て、ライゲーションをＤＮＡリガーゼで行うことが好ましい。また、アダプターの特定配列については、最終的に対応付け分子のライブラリーを作成できるものあれば制限はないが、通常には、図１にあるように、５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲとＴａｇ １を含む配列となる。５’ＵＴＲは、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはＴ７／Ｔ３又はＳＰ６などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、転写プロモーターとしてはＳＰ６、翻訳のエンハンサー配列としてはオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部（０２９）は、ＴＭＶのオメガ配列の一部を含んだものである（Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ ０２／４８３４７の図３参照）。Ｔａｇ １については、先程のＴａｇ ２と同様であるが、Ｔａｇ １とＴａｇ ２の両方を配する場合は、異なるＴａｇ配列を配するようにする。ライゲーションされるアダプターには、これら５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲとＴａｇ １の一部又は全部の配列が含まれる場合がある。
本発明のＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーは、上記のライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、特定の配列を有する５’および３’プライマーでＰＣＲ（図１、ＩＶ）を行い合成する。５’および３’プライマーは、５’ＵＴＲ、Ｔａｇ １、Ｔａｇ ２、３’ｔａｉｌの特定の配列でアニーリングし、かつ５’ＵＴＲ、Ｔａｇ １、Ｔａｇ ２、３’ｔａｉｌの一部をアダプター配列として含む場合がある。このＰＣＲで５’ＵＴＲ、Ｔａｇ １、Ｔａｇ ２、３’ｔａｉｌなどの特定配列を持つｃＤＮＡライブラリーが完成する。
本発明のＩＶＶ ＲＮＡライブラリーは、上記のＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを転写（図１、Ｖ）して得られる。この際、このＩＶＶ ＲＮＡライブラリーをこのまま翻訳することやＣ末端ラベル化剤存在化に翻訳することでＣ末端ラベル化蛋白質ライブラリーを合成することが可能である。転写の酵素は、特定配列に選択したＴ３，Ｔ７又はＳＰ６などの酵素となる。
本発明のＩＶＶライゲーテッドＲＮＡライブラリーは、上記のＩＶＶ ＲＮＡライブラリーをスペーサーとライゲーション（図１、ＶＩ）して得られる。スペーサーとしては、ＩＶＶ形成の場合はＩＶＶのＰＥＧスペーサー、およびＣ末端ラベル化蛋白質合成のためのＰＥＧ（Ｂｏｃ）スペーサーなどが考えられる。ライゲーション酵素としては、ＲＮＡリガーゼを用いる方法が代表的だが、その他、ＤＮＡリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。
本発明のＩＶＶランダムプライミングライブラリーは、上記のＩＶＶライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系又は細胞内で翻訳（図１、ＶＩＩ）して得られる。
ＩＶＶのＰＥＧスペーサーおよびＣ末端ラベル化蛋白質合成のＰＥＧ（Ｂｏｃ）スペーサーは、ＣＣＡ領域、ＰＥＧ領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずＰＥＧ部を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、４００〜３０，０００で、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜６，０００である。また、ＣＣＡ領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。ＣＣＡ領域は、５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシンｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３，３７４−３７７）が適当である。Ｃ末端ラベル化蛋白質合成のためのＰＥＧ（Ｂｏｃ）スペーサーでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたＣＣＡ領域も考えられる。ＰＥＧ部は修飾物質を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、あるいは固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも１残基のＤＮＡおよび／又はＲＮＡの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、又はＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
Ｃ末端ラベル化剤は、タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基（残基を含む）をもつアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、得られるＣ末端修飾タンパク質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、タンパク質相互作用の検出が可能となる。修飾部には、ＰＥＧ部と同様に修飾物質が含まれる。修飾物質として、非放射性修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性タンパク質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。アクセプター部は、タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシン又はその誘導体の残基をもつ。ピューロマイシンはアミノアシルｔＲＮＡと類似した構造をもち、タンパク質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度ではタンパク質のＣ末端に結合することが知られている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１８２）。本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、タンパク質のＣ末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。修飾部とアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸又は核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（−ｒＣ−）又はデオキシリボヌクレオチド（−ｄＣ−）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とアクセプター部との間に挿入することによって修飾タンパク質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。本発明修飾剤においては、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。修飾剤は、上記修飾部とアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記アクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、機能性修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類又は結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用することもできる。また、機能性修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。
無細胞タンパク質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液等が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系の中に、翻訳テンプレートであるライブラリーを加え、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に１〜１００μＭの修飾剤を加え、２５〜３７℃で１〜数時間保温することによってＣ末端修飾タンパク質が合成される。対応付けの場合は、翻訳テンプレートであるライブラリーを加えて、２５〜３７℃で１〜数時間保温するだけで対応付け分子が合成される。合成された両修飾タンパク質は、そのまま次の精製プロセス又は検出プロセス、あるいは直接細胞への導入に供することができる。細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまでいかなる細胞でもよい。これらの細胞の中に、上記Ｃ末端ラベル化又は対応付けされた両修飾タンパク質を直接導入することもできるし、あるいは、翻訳テンプレートであるライブラリーを導入し、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に１〜１００μＭの修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾タンパク質が合成される。対応付けの場合は、対応付けテンプレートであるライブラリーを導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって対応付け分子が合成される。合成された両修飾タンパク質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセス又は検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。
対応付け分子のライブラリーは、進化分子工学として、ダーウイン進化機構を利用して、「変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）」、「選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」、「増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」の３つの単位操作を繰り返すことで漸進的に進化させ、所望の機能を獲得した物質を創製することで工学的に応用することが可能であり、また、ゲノム機能解析への応用として、ｃＤＮＡライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析可能である（図５）。本発明のライブラリーとしてＩＶＶのｃＤＮＡをもちいて、一次スクリーニングで物質や蛋白質と相互作用を検出し（図３の共翻訳スクリーニングはその一例）、さらに、相互作用の詳細をＦＣＣＳやマイクロアレイなどの二次スクリーニングで解析することが可能である。また、本発明のライブラリーは、ＩＶＶ又はＣ末端ラベル化蛋白質のライブラリーとして、単独でＦＣＣＳやマイクロアレイなどにより物質や蛋白質との相互作用解析に利用することも可能である。また、もちろん本発明のライブラリーをＩＶＶを用いた進化分子工学に応用し、一次スクリーニングにより機能性蛋白質の創出に利用することも可能であり、その際に、一次スクリーニングと二次スクリーニングを組み合わせて、創出した機能性蛋白質の相互作用の詳細を解析することも可能である。
この場合に、対応付け分子の共翻訳スクリーニング／セレクションを用いた解析は非常に有効である。なぜなら、共翻訳スクリーニング／セレクション法によって、ベイト蛋白質と直接又は間接的に相互作用のある蛋白質を網羅的に検出することが可能となったからである。さらに、共翻訳スクリーニング／セレクション法などによる一次スクリーニング後に、二次スクリーニングとして、物質や蛋白質と相互作用の詳細をＦＣＣＳやマイクロアレイなどにより解析することが可能である。以上の解析は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。また、一次スクリーニングで対応付け分子を利用するときはＡ配列のコード部を利用し、二次スクリーニングでは、対応付け分子を利用するときはＡ配列のコード部、Ｃ末端ラベル化蛋白質を利用するときはＸＡ配列のコード部をプライミングによって変更して使用することで、それぞれの効果を使い分けることが出来る。
上記で得られたＩＶＶライブラリー又はＣ末端ラベル化タンパク質のライブラリーと「標的分子」を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該修飾タンパク質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析することが出来る。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。「標的分子」とは、ＩＶＶ又はＣ末端ラベル化タンパク質と相互作用する分子を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。タンパク質としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製されたタンパク質を用いることができる。
これら標的分子とＩＶＶ又はＣ末端ラベル化タンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合および解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合および解離が挙げられる。
以下、共翻訳スクリーニング／セレクションを用いた解析方法の例について説明する。解析方法には、相互作用の検出方法および相互作用する蛋白質のスクリーニング方法が含まれる。
本発明検出方法は、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、プレイとして本発明のライブラリーを用いるものである。
好ましくは、ベイトおよびプレイに特定の様式で分離用修飾および検出用標識を行い、そして、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするものである。本明細書においては、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを「無細胞共翻訳」ともいう。
本明細書において、ベイトおよびプレイの用語は、物質間の相互作用の解析の技術分野で通常に用いられる意味を有する。すなわち、既知の物質である蛋白質や核酸などをベイト（おとり）と呼び、それと相互作用する物質である蛋白質や核酸などをプレイ（獲物）と呼ぶ。本発明では、プレイは蛋白質であることが好ましい。
ここで、ベイトとしては、あらゆる蛋白質（ペプチドを含む）、核酸、抗体、ホルモンなどのリガンド、金属などの任意のものから構成される複合体が挙げられ、天然のものでも人工のもののいずれでも構わない。ベイトとしての分子量の制限などは特にない。たとえば蛋白質であれば、機能ドメイン又は機能ドメインを含む完全長蛋白質などが挙げられる。プレイライブラリーを用いる場合は、完全長蛋白質とすることでより網羅的検出が可能となる。
また、プレイとしては、好ましくは、蛋白質のライブラリーが用いられる。プレイとしての分子量の制限などは特にない。
本発明検出方法は、好ましくは、上述のように、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明検出方法の好ましい構成は、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の通常の検出方法と同様でよい。
ベイトおよびプレイの分離用修飾および検出用標識は、複合体の検出に適合したものが適宜選択されるが、無細胞共翻訳において、ベイトとプレイとが共に検出用標識で標識されたり、分離用修飾を受けたりしないように行われる必要がある。そのため、プレイは、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされるか、又は、対応付け分子とされ、それに応じて、ベイトは分離用修飾を有するものとされる。
プレイが融合蛋白質とされる場合には、ベイトは分離用修飾を有するようにする。ベイトが蛋白質である場合には、ベイトは、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質として、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより無細胞翻訳系に存在させることが好ましい。
ベイトが蛋白質の場合の分離用修飾の例としては、蛋白質として、ＧＳＴ蛋白質やＴＡＰ法などに用いられているＣＢＰ（カルモジュリンビーズとの親和性により分離可能）やプロテインＡ（ＩｇＧ−プロテインＡ親和性により分離可能）、親和性タグとして、各種の抗体タグなどとの融合蛋白質とすることが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。プレイの検出用修飾としては、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光蛋白質との融合蛋白質とすることが挙げられる。
上記の融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの調製およびこのｍＲＮＡの無細胞翻訳系での翻訳は通常の方法に従って行うことができる。ｍＲＮＡは、無細胞転写翻訳系において、ＤＮＡの転写により生成するものであってもよい。
プレイが対応付け分子とされる場合には、ベイトには任意の分離用修飾を施すことができる。ベイトが蛋白質である場合には、上述の分離用修飾の例が挙げられる他、ベイトが核酸やドラッグなどの場合の分離用修飾の例としては、ストレプトアビジンやアビジンと相互作用のあるビオチンなどを利用することが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。
対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、通常には、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現形の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる分子である。この蛋白質としてプレイを用いることによりプレイを対応付け分子とすることができる。このような対応付け分子は、無細胞翻訳系において、プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うこと、又は、無細胞転写翻訳系において、プレイをコードするＤＮＡの転写および翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより形成することができる。従って、この製造の際に、ベイトを存在させることにより、無細胞共翻訳を行うことができる。すなわち、下記（１）又は（２）により無細胞共翻訳を行うことができる。
（１）無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
（２）無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写および翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
以下、上記（１）および（２）の態様について説明する。
（１）の態様では、ｍＲＮＡが、その３’末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス方法が挙げられる。
ｍＲＮＡは、好ましくは、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、プレイをコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含む核酸である。好ましくは、ポリＡ配列の５’側に、ＳＮＮＳ（ＳはＧ又はＣ）配列を含む発現増幅配列（例えば制限酵素ＸｈｏＩが認識する配列）が更に含まれる。５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。
ポリＡ配列は、少なくとも２残基以上のｄＡおよび／又はｒＡの混合あるいは単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリＡ連続鎖である。
翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる５’ＵＴＲ、および、ポリＡ配列を含む３’末端領域の組み合わせがある。３’末端領域のポリＡ配列の効果は通常には１０残基以下で発揮される。５’ＵＴＲの転写プロモーターはＴ７／Ｔ３又はＳＰ６などが利用でき、特に制限はない。好ましくはＳＰ６であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はＳＰ６を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、ＴＭＶのオメガ配列の一部（０２９；Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ ０２／４８３４７の図３参照）を含んだものが好ましい。
また、翻訳効率に関し、３’末端領域においては、ＸｈｏＩ配列とポリＡ配列の組み合わせが好ましい。さらに、ＯＲＦ領域の下流部分、すなわちＸｈｏＩ配列の上流に親和性タグがついたものとポリＡ配列の組み合わせが好ましい。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列又はＨｉｓ−ｔａｇ配列である。ポリＡ配列効果としては、Ｆｌａｇ−ｔａｇ等の親和性タグにＸｈｏＩ配列がついたものとそこへさらにポリＡ配列がついたものの翻訳効率が上昇する。ここで、Ｈｉｓ−ｔａｇについては、ＸｈｏＩ配列のない構成でも十分な翻訳効率を示し、有効である。
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
５’ＵＴＲをＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）又はＨｉｓ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’ＵＴＲで約４９ｂｐ、３’末端領域で約３８ｂｐ又は約２６ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、５’ＵＴＲと３’末端領域をもったコード領域を簡単に作成できる。コード領域において、翻訳はＯＲＦ領域を超えてされてもよい。すなわち、ＯＲＦ領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、ＰＡＮＳ−アミノ酸、ＡＡＮＳ−アミノ酸などが挙げられる。
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ，Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３，３７４−３７７）が適当である。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
スペーサー領域は、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域である。スペーサー領域は、通常には、ＰＥＧ領域の他に、核酸の３’末端に結合できるドナー領域を含む。
核酸の３’末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。ドナー領域は修飾物質を有していてもよい。
ドナー領域の５’末端の配列は、プレイをコードするコード領域とのライゲーション効率を左右する。コード領域とスペーサー領域をライゲーションさせるためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）又は２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
ＰＥＧ領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、ＰＥＧ領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が２０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が４００以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が１０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が１０００以上であることを意味する。
ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、４００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜８，０００である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約４００より低いと、このスペーサー領域を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３１８，２６８−２９３）、分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上のＰＥＧを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量１０００以上で良好であり、分子量４００以下ではＤＮＡスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
ポリエチレングリコールを主成分とするスペーサー領域を有することによって、対応付け分子がウサギ網状赤血球のみならず小麦胚芽の無細胞翻訳系でも形成可能となり、両翻訳系での遺伝子型分子の安定性が飛躍的に向上し、翻訳後の処理を施すことが不要となる。
（２）の態様では、ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写および翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、ＳＴＡＢＬＥ法が挙げられる。
エマルジョンは、通常には、２種の界面活性剤およびミネラルオイルと、無細胞転写翻訳系の反応液を混合して形成されるＷ／Ｏ型のエマルジョンである。Ｗ／Ｏ型のエマルジョンを形成するには、通常には、界面活性剤のＨＬＢ（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）値が３．５〜６である必要がある。２種の界面活性剤を混合した場合のＨＬＢ値は、個々の界面活性剤のＨＬＢ値から簡単な計算式で求められる。例えば、Ｓｐａｎ ８５（ＨＬＢ＝１．８およびＴｗｅｅｎ ８０（ＨＬＢ＝１５．０）を、それぞれ４０．２μｌおよび９．８μｌの割合で混合することによりＨＬＢ＝４．４となる。界面活性剤とミネラルオイルの割合は、通常１：１８（容量比）である。また、反応液の割合はエマルジョン全体に対して１〜５０％（容量比）であり、通常は５％である。界面活性剤とミネラルオイルの混合物に、撹拌しながら、低温で、反応液をいくつかに分けて添加し、混合することによりエマルジョンを形成することができる。転写および翻訳の反応は、エマルジョンの温度を上げることにより、開始させることができる。
プレイをコードするＤＮＡの調製およびこのＤＮＡの無細胞転写翻訳系での転写および翻訳は通常の方法に従って行うことができる。
上述のように、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行うことにより、無細胞共翻訳により形成された複合体を特異的に検出することができる。
ベイトとプレイの無細胞共翻訳において、無細胞共翻訳を行う無細胞翻訳系（無細胞転写翻訳系を含む）については、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法では、対応付け分子の形成は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉではかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系（Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ Ｅ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５；Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１２２９７）では安定であることが確認されており、さらに小麦胚芽の系（特開２００２−１７６９８７）ではより安定であることが確認されている。ＳＴＡＢＬＥ法では、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。
無細胞共翻訳における翻訳又は転写および翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に応じて適宜選択される。
無細胞翻訳系に添加するベイトとプレイのテンプレートは、無細胞翻訳系が転写も生じる無細胞転写翻訳系であれば、ＲＮＡおよびＤＮＡのどちらでも構わない。
以下、ベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるベイトとして、図６に示すように、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなることを特徴とする翻訳テンプレートを利用する。コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列でも良いが、好ましくは、コード部の３’末端領域にアクセプター（Ａ配列）を持つ、あるいは、コード部の３’末端領域にアクセプター（Ａ配列）を持ち、かつＡ配列の５’上流に翻訳増幅配列（Ｘ配列）を持つことを特徴とする。コード部のＡ配列として、短いポリＡ配列を含む。短いポリＡ配列とは、通常には２〜１０塩基のＡからなる配列である。Ｘ配列として、（Ｃ又はＧ）ＮＮ（Ｃ又はＧ）配列を有する配列、たとえば、ＸｈｏＩ配列を有することを特徴とする。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、コード部と連結するためのドナー領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つ。ＰＥＧスペーサー部は、ドナー領域のみ、ＣＣＡ領域のみでもかまわないが、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域を含む構成をとる。ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量は、５００以上であることを特徴とする。また、ドナー領域および／又はＣＣＡ領域において、少なくとも１つの機能付与ユニット（Ｆ）を含むことを特徴とする。機能付与ユニット（Ｆ１あるいは／かつＦ２）が、該翻訳テンプレートおよび／又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｃｙ５，又はローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これらのコード部や翻訳テンプレート、およびそのライブラリー、さらに、リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリーに関するものである。
ベイトの翻訳テンプレート（図６のＡ）は、コード分子（図６のＢ）に由来するコード部とＰＥＧスペーサー分子（図６のＣ）に由来するＰＥＧスペーサー部からなる。本態様では、基本的にはコード部の配列によらず、コード部にＰＥＧスペーサー部を連結（ライゲーション）することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。しかしながら、さらにコード部の構成やＰＥＧスペーサー部の種類によって、その翻訳効率をより向上させることが可能である。以下にその詳細を記載する。
本態様のコード部（図６のＢ）は、５’末端領域、ＯＲＦ領域、３’末端領域からなり、５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。また、コード部の配列には特に制限はなく、あらゆるベクターやプラスミドに組み込まれたものとしての利用が考えられる。また、コード部の３’末端領域は、Ａ配列としてポリＡｘ８配列、又はＸ配列としてＸｈｏＩ配列や４塩基以上でＳＮＮＳ（ＳはＧ又はＣ）の配列を持つもの、およびＡ配列とＸ配列の組み合わせとしてのＸＡ配列がある。Ａ配列、Ｘ配列、又はＸＡ配列の上流に親和性タグ配列としてＦｌａｇ−ｔａｇ配列、からなる構成が考えられる。ここで、親和性タグ配列としてはＨＡ−ｔａｇやＩｇＧのプロテインＡ（ｚドメイン）などの抗原抗体反応を利用したものやＨｉｓ−ｔａｇなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、ＸＡ配列の組み合わせが重要であり、Ｘ配列のなかで、最初の４塩基が重要であり、ＳＮＮＳの配列を持つものが好ましい。また、５’末端領域は、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはＴ７／Ｔ３又はＳＰ６などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、プロモーターとしては、ＳＰ６を用いることが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部（０２９）は、ＴＭＶのオメガ配列の一部を含んだものである（Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ ０２／４８３４７の図３参照）。コード部のＯＲＦ領域については、ＤＮＡおよび／又はＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、あるいは、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。
本態様のＰＥＧスペーサー分子（図６のＣ）は、ＣＣＡ領域、ＰＥＧ領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずＰＥＧ領域を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、４００〜３０，０００で、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜６，０００である。また、ＣＣＡ領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。本翻訳テンプレートでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたＣＣＡ領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、より翻訳効率を高められる。その理由は定かではないが、蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。ＣＣＡ領域（ＣＣＡ）の５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３，３７４−３７７）が適当である。本発明の一態様では、これらのピューロマイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。
本態様のＰＥＧスペーサー部は修飾物質（Ｆ１および／又はＦ２）を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、又は固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも１残基のＤＮＡおよび／又はＲＮＡの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、又はＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。また、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計可能な長さである。これによって新たな効果が生み出された。すなわち、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、３’ＵＴＲの代わりとしてＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。
本態様のＰＥＧスペーサー分子とコード分子のライゲーションは、その方法については、一般的なＤＮＡリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。ＲＮＡリガーゼを用いるライゲーションでは、コード部でライゲーション効率に影響を与える範囲としては３’末端領域のＡ配列が重要であり、少なくとも２残基以上のｄＡおよび／又はｒＡの混合又は単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６から８残基以上のポリＡ連続鎖である。ＰＥＧスペーサー部のドナー領域の５’末端のＤＮＡおよび／又はＲＮＡ配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とＰＥＧスペーサー部を、ＲＮＡリガーゼでライゲーションするためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）又は２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。さらに、ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。
次に、プレイとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるプレイとして、図７に示すように、翻訳テンプレートによってＣ末端修飾された蛋白質（＝対応付け分子）を利用する。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなる。コード部の３’末端にＡ配列を有し、Ａ配列は、短いポリＡ配列を含む。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域において、ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする、また、ドナー領域および／又はＣＣＡ領域において、少なくとも１つの修飾物質（Ｆ１および／又はＦ２）を含むことを特徴とする。また、ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的にはＣＣＡ領域にピューロマイシンを有する。また、修飾物質（Ｆ１および／又はＦ２）が、該翻訳テンプレートおよび／又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｃｙ５，又はローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝対応付け分子）および蛋白質（＝対応付け分子）のライブラリーに関するものである。
プレイは、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（図７のＡ；対応付け分子）であり、翻訳テンプレート（図７のＢ）と、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図７のＣ）の構成に特徴を持つ。以下詳細に記述する。
翻訳テンプレート（図７のＢ）のＰＥＧスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様である。また、コード部も上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、３’末端領域をＡ配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減する。ここでも、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、ＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。
本態様のＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図７のＣ）は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、ＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、ＲＮａｓｅ Ａなどで意図的に切断してもよい。切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、単独の対応付け分子をプレートやビーズやスライドガラスに固定することも可能である。
無細胞共翻訳を、図８を参照して説明する。図８に示すように、ベイトの存在下でプレイがｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳される。図８のＡおよびＢに示されるように、ベイトが蛋白質であって、無細胞翻訳系でプレイと同時に翻訳される場合と、ベイトが、核酸やホルモンなどであって、無細胞翻訳系に添加される場合がある。図８に示すように、プレイは融合蛋白質又は対応付け分子とされる。
複合体は、ベイトと一つのプレイが結合して形成されること（Ｉ）の他に、ベイトに結合したプレイにさらに別のプレイが結合することにより形成されること（ＩＩ）もある。
本発明検出方法によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体の形成を行うことができるので、一貫してｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質間又は核酸−蛋白質間などの相互作用を検出できる。
ベイトが蛋白質である場合は、ベイトとしては、目的蛋白質との相互作用のための機能ドメインのみの蛋白質、機能ドメインを含む蛋白質、又は完全長蛋白質などが挙げられる。ここで、完全長蛋白質を用いることは、複数の機能ドメインを有することが一般に予測されるため、さらに網羅的にプレイを検出可能となることから、好ましい。完全長蛋白質は、単独で完全長の蛋白質でもよいし、完全長の蛋白質を再構成する複数のベイトの集まりでもよい。
ベイトは、図９に示したように、複合体であってもよく、これを「複合ベイト」と呼ぶ。複合体にすることによって、より非特異的な吸着を減らすことができ、かつ完全長蛋白質と同様の効果として、より網羅的にプレイを検出することが可能となる。
以上のように、無細胞共翻訳で考えられる複合体としては、単独のベイトと単独のプレイの複合体、複合ベイトとプレイの複合体、ベイトと複数のプレイの複合体、および、複合ベイトと複数のプレイの複合体が可能である。従って、本発明検出法により検出可能な相互作用は、ベイトとプレイとの間の直接の相互作用だけでなく、複合体を形成するための間接的な相互作用をも包含するものである。
本発明における無細胞共翻訳で最も重要なことは、蛋白質がネイティブな状態でフォールディングしており、翻訳されたての変性していない状態であり、相互作用するべきベイトとプレイ又はベイトとベイトやプレイとプレイが無細胞翻訳系に共存しており、速やかに相互作用できると言うことと考えられる。このことは、別々に翻訳して翻訳直後に混合して共存させるよりも、共に翻訳したものの方が優れた結果が得られたことにより支持される。すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳された蛋白質がネイティブなフォールディング状態で、蛋白質又は核酸などと出会うことができるため、速やかに相互作用による複合体の形成が可能となったためと思われる。
従来の相互作用の検出法では、ベイトを大腸菌で大量に発現精製する必要があった。例えば、ＴＡＰ法などでベイトとプレイの相互作用を細胞で発現させる場合は、最低一ヶ月の準備が必要であった。また、ＧＳＴ融合蛋白によるプルダウン法を採用しているｍＲＮＡディスプレイ法では、ベイトを大腸菌などで大量に発現させて精製するため、最低２〜３週間かかり、大腸菌で発現しないものはベイトに出来ないなどの問題があり、さらに、プレイと相互作用させるにはプレイの５０〜１００倍の量のベイトを添加する必要があった。無細胞共翻訳では、無細胞翻訳系において、ほぼ同量のｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートを添加すればよいだけとなり、ベイトを細胞で発現させる必要は全くなくなり作業時間の大幅な短縮が行える。さらに、複合ベイトや完全長蛋白質によって、ベイトとプレイの相互作用をより強化し特異的なものとし、非特異的な結合の検出を回避することができる。また、複合ベイトによって、その第二のベイトと相互作用するより多くのプレイを網羅的に解析できる。
これまで、一貫してｉｎ ｖｉｔｒｏで相互作用による複合体形成とスクリーニングを実現するシステムは存在しなかったが、以上の本発明検出法によって、ベイトも含めて完全にｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳とスクリーニングを行って、蛋白質間又は蛋白質−核酸間の相互作用を非特異的な検出を回避しかつ網羅的に検出可能なシステムを構築できる。従って、本発明は、本発明検出方法を利用したスクリーニング方法も提供する。
本発明スクリーニング法は、ベイトとプレイが無細胞共翻訳を通して相互作用して複合体を形成し、複合体のスクリーニングによってベイトと相互作用するプレイを解析することを特長とする。従って、本発明スクリーニング方法は、本発明検出方法により、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程を含む他は、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、および、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイの通常のスクリーニング方法と同様でよい。
本発明スクリーニング方法は、選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程をさらに含み、調製されたプレイを、検出工程で使用されたベイトの代わりに又はそのベイトと共に用いて、検出工程、選択工程および調製工程を繰り返すことが好ましい。この態様は、例えば、図１０に示すように、１）プレイおよびベイトが相互作用を形成する無細胞翻訳系における無細胞共翻訳の工程、２）ベイトと相互作用しているプレイを検出するスクリーニングの工程、３）プレイを分析および解析する工程、および４）３）で分析および解析されたプレイを新たな次のベイトとし、１）から繰り返す工程から構成される。１）および２）の工程が検出工程および選択工程に相当し、３）の工程が調製工程に相当する。すなわち、検出工程のうちの、ベイトとプレイを接触させる工程が無細胞共翻訳の工程に相当し、検出工程のうちの複合体の検出および選択工程がスクリーニングの工程に相当する。
本発明スクリーニング法では、選択工程で選択されたプレイを再度検出工程に付してもよい。
本発明スクリーニング法では、ベイトと複数のプレイの集団であるプレイ・ライブラリーとの無細胞共翻訳を行い、スクリーニングの工程において、２つ以上のプレイが検出されてもよい。
図９に示すように、複合ベイトとプレイが共存し、相互作用によって複合ベイトとプレイの複合体を形成する場合がある。この無細胞共翻訳で、プレイ・ライブラリーの複数のプレイがベイトと共存し、相互作用によってベイトと複数のプレイの複合体を形成することによって、スクリーニングにおいて、一挙に網羅的な相互作用する複数のプレイを検出できる。また、ベイトが完全長蛋白質であることによって、完全長蛋白質は一般に相互作用の機能ドメインを複数含むので、より多くのプレイを網羅的に検出可能となる。
さらに、図９に示すように、複合ベイトと相互作用する複数のプレイの複合体を形成することによって、複合ベイトと相互作用する複数のプレイを検出でき、また、第二のベイトがベイトとプレイの相互作用の補強剤となり、より特異的な相互作用が実現されることによって、網羅的検出における非特異的検出の回避が可能となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法など進化分子工学的手法では、プレイは対応付け分子（ｆｕｓｉｏｎ）となる。プレイ・ライブラリーや複数のプレイを用いた場合の複合体の形成では、プレイは直接ベイトと相互作用する場合としない場合がある。
複合体のスクリーニングにより得られた複合体が対応付け分子である場合には、図１０に示すように、複合体を形成するプレイをＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲにより検出し、さらに、ＰＣＲ産物をプレイとして再スクリーニングする（プレイの再構築）、あるいは、ＰＣＲ産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングしてもよい。ここで、ＰＣＲ産物から再スクリーニングする、あるいは、ＰＣＲ産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングする方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法など進化分子工学的手法においてのみ可能であり、プルダウン法、ＴＡＰ法など蛋白質を直接解析する方法ではできない。
対応付け分子を用いた場合には、スクリーニングの後、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによって蛋白質プレイの遺伝子配列を知ることが出来る。図８および９に示すように、ここでの蛋白質プレイとは、ベイトと相互作用しているプレイ又はそのプレイと相互作用しているプレイなどであり、ベイトと相互作用しているすべての複数のプレイが網羅的に解析できる。さらにプレイの再スクリーニングが必要な場合は、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲの産物であるＤＮＡテンプレートを転写し、同じサイクルを繰り返す。また、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲとそれに続くシークエンスによってプレイが定まった場合は、その蛋白質プレイはベイトとして使えるようになる。はじめのベイトに対して相互作用するプレイが複数個見つかれば、複合ベイトを形成することが出来るようになり、さらにより多くのプレイを検出することが出来るようになる。
無細胞共翻訳を用いると、プルダウン法やＴＡＰ法においても一貫してｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質間相互作用を検出できることになるが、ＴＡＰ法では対応付け分子を形成していないので、プレイの解析において直接的に蛋白質を解析しなければならない。そこで、プルダウン法やＴＡＰ法をスクリーニングの方法としてｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法に応用すれば、対応付け分子を形成しているので、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによって、相互作用するプレイの解析においてその遺伝子配列を簡単に検出することが出来る。さらに、無細胞共翻訳を用いると、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法において、一貫してｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質間相互作用を検出できることになる。また、プレイの数が莫大な場合は、サイクルを回すことで再スクリーニングによりプレイを絞り込むことが可能である。また、解析されたプレイは、次の解析では、ベイトとして使うことができ、ベイトの数が増えれば、ベイトの複合化が進み、さらなるプレイが検出されることにつながる。このように、プレイをベイトとして次のサイクルで使用することは、対応付け分子を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法などでのみ簡単に実現できる。しかしながら、ｍＲＮＡディスプレイなどの方法では、新しいベイトのＧＳＴ融合蛋白を大腸菌で大量合成と精製が必要であり、ベイトの用意に時間がかかり困難である。無細胞共翻訳によれば、その必要もなく簡単にサイクルを回すことが出来る。
無細胞共翻訳後の複合体のスクリーニングにおいて、無細胞共翻訳によって出来た複合体を壊すことなくプレイを網羅的にスクリーニングできることが好ましい。このために、親和性タグなどによってベイトに固定化の仕組みを持たせ、ベイトと相互作用するプレイを検出してもよい。その固定化の仕組みは、いかなるものでも構わない。たとえば、既存のＴＡＰ法などのように、ＩｇＧ−プロテインＡ親和性やカルモジュリンビーズを用いた２段階のスクリーニングを行う方法、あるいはプルダウン法のように、ストレプトアビジン又はアビジン−ビオチン親和性、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ，Ｔ７−ｔａｇ，Ｈｉｓ−ｔａｇなどを利用した一段階又は二段階のスクリーニングを行う方法が挙げられる。
プレイ・ライブラリーとしては、ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライミング・ライブラリー、ｄＴプライミング・ライブラリー）、ランダム・ライブラリー、ペプチド・ライブラリー、ホルモン・ライブラリー、抗体・ライブラリー、リガンド・ライブラリー、医薬化合物ライブラリーなどが挙げられ、いかなるライブラリーでも構わない。たとえば、プレイ・ライブラリーとしてランダムプライミング・ｃＤＮＡライブラリーを用いた場合、このライブラリーには完全長プレイは望めないが、機能ドメインを含むプレイは期待できる。このようなライブラリーは、特に、複合ベイトや完全長蛋白質との組み合わせによるスクリーニングに用いると、プレイの網羅的検出に有効となる。
ランダムプライミングライブラリーの例としては、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の５’側に、転写プロモーターとしてＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（ＳＰ６）と、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルスのＴＭＶオメガ配列の一部（０２９）とを含んだ５’非翻訳（ＵＴＲ）領域を持ち、かつＭＣＳの３’側に親和タグ配列として、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を、ＭＣＳに組み込まれた挿入配列から発現した蛋白質のＣ末端にＦｌａｇ−ｔａｇが付加されるように含む３’末端を持つベクターのＭＣＳに、ランダムプライミングで得られたｃＤＮＡが組み込まれたものが挙げられる。
上記の本発明検出方法は、ベイトとプレイとを接触させ複合体を形成させる工程を含んでいる。従って、この工程に準じて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとの複合体を形成させる方法が提供される。
本発明形成方法は、ベイトとベイトと相互作用する蛋白質であるプレイとの複合体の形成において、プレイとして本発明のライブラリーを用いるものであり、好ましくは、さらに、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明形成方法の好ましい構成は、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の通常の形成方法と同様でよい。ベイトおよびプレイの特定の様式での検出用標識および分離用修飾ならびに無細胞共翻訳については、本発明検出方法に関し説明した通りでよい。
【実施例】
以下、具体的に本発明のＩＶＶランダムプライミングライブラリーとその作成に使用され得るライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリー、ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーおよびＩＶＶライゲーテッドＲＮＡライブラリーの作成についての実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
実施例１ ＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成とライブラリーからの共翻訳スクリーニング
図１に概略を示す方法に従ってＩＶＶランダムライブラリーを作成した。すなわち、ＲＮＡライブラリーを鋳型として、９塩基からなるランダム配列と特定配列（ｔａｇ２配列）を含むランダムプライマーを用いてランダムプライミング法により逆転写でｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーを合成する（Ｉ）。ＲＮａｓｅ ＨによりｃＤＮＡとＲＮＡの二本鎖からＲＮＡのみを分解すると同時に、ＤＮＡポリメラーゼＩによるｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、さらに、ＤＮＡリガーゼによりＤＮＡポリメラーゼＩにより合成されたＤＮＡ間にあるニックを修正してｄｓＤＮＡライブラリーを合成する（ＩＩ）。合成された二本鎖ｃＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼＩにより合成された側のみ５’末端にリン酸基を持つのでこれを利用し、特定配列（５’ＵＴＲ＝プロモーター＋エンハンサー）を持つアダプターをＤＮＡリガーゼを用いて結合し、ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリー）を合成する（ＩＩＩ）。アダプターとランダムプライマーの特定配列を利用してＰＣＲを行い、５’側にプロモーターとエンハンサーの配列、３’側にＡ ｔａｉｌをもつＩＶＶのｃＤＮＡライブラリーを作成する（ＩＶ）。次にＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを転写してＩＶＶ ＲＮＡライブラリーとし（Ｖ）、ＩＶＶとするためのスペーサーをライゲーションし（ＶＩ）、さらに、無細胞翻訳系で翻訳すれば、対応付け分子のライブラリーとなる（ＶＩＩ）。以下、詳細を説明する。
ＲＮＡライブラリーとして、市販のマウス脳又はマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（組織抽出ＲＮＡライブラリーをｏｌｉｇｏ ｄＴカラムで精製したもの；ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を購入した。
また、あらかじめ、アダプターを設計しＤＮＡを合成した。ここでは、対応付け分子の形成に適した５’ＵＴＲ配列（プロモーターＳＰ６＋エンハンサー０２９又は０’）をライブラリーに特定配列として付加するための設計を行った。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーには、エンハンサー０２９をもつアダプターを使用し、マウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーには、エンハンサー０’をもつアダプターを使用した。エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖（配列番号１）と副鎖（ｇａａｔｔｃｇｃ）、又は、エンハンサー０’用のアダプターの主鎖（配列番号２）と副鎖（ｇｇａａｔｔｃｇ）は、各々ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して１００μＭとし、主鎖と副鎖をそれぞれ１０μｌずつ等モルで混合した。９０℃で２分間加熱し、７０℃で５分加熱し、６０℃のウオーターバスにセットしてバスのヒーターを切ってゆっくりと６０℃から室温まで下げた。５μｌずつに分注して−２０℃に保存した。
まず、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーを一本鎖ＤＮＡに逆転写した（図１，Ｉ）。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（１．４ｐｍｏｌｅ／０．５μｇ）を０．５μｇ、３’ランダムプライマー（配列番号３）を２ｐｍｏｌとＤＥＰＣ水とを加えて１２．０μｌとし、７０℃で１０ｍｉｎ加熱し、氷上で１分間冷却した。これを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により４５℃で１ｈ逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で合成した一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーを全量用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により１６℃で２ｈ反応させ、さらにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより１６℃において５ｍｉｎの反応で末端を平滑化し、二本鎖ＤＮＡを合成した（図１，ＩＩ）。次に、この二本鎖ＤＮＡの５’末端がリン酸化されていることを利用して、先に準備したアタプターを用いてライゲーションした（図１，ＩＩＩ）。合成した二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ライブラリーをエタノール沈殿し、４μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。これに、１００μＭの準備したアダプターを１．０μｌ添加し、５０μｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて、１６℃で一晩反応させ、精製（ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ ；ＱＩＡＧＥＮ）した後５０μｌとした。次に、ＰＣＲ（ＥＸ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ；ＴａＫａＲａ）を行った（図１，ＩＶ）。５０μｌのライゲーションした二本鎖ＤＮＡ（ライゲーテッドｄｓＤＮＡ）ライブラリーから２μｌをテンプレートとして、ＩＶＶに必要な特定配列（０２９）を持つ５’ＰＣＲプライマー（配列番号４）と３’ＰＣＲプライマー（配列番号５）、又は、ＩＶＶに必要な特定配列（０’）を持つ５’ＰＣＲプライマー（配列番号６）と３’ＰＣＲプライマー（配列番号７）を用いて、ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０２９）、およびＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０’）を作成した。ＰＣＲの条件は、全量１００μｌ、２２サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとし、最後の伸長反応は、７２℃で１８０秒）とした。
作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを評価した。評価の結果は図２に示した。もとのマウス脳、又はマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーにどのような遺伝子が含まれるかを、遺伝子に特異的なプライマー（配列番号８〜３３）を用いてＲＴ−ＰＣＲで検出し（図２のＡ）、それらの遺伝子について、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーから作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０２９）とマウス精巣（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーから作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０’）において、もとのＲＮＡライブラリーと同様に遺伝子が存在しているかを確認した（図２のＢ）。どちらのライブラリーでも、もとのＲＮＡライブラリーを反映して各遺伝子が検出された。すなわち、ライブラリーの作成工程で、もとのＲＮＡライブラリーの質を落とすことなくＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成できた。
次に、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーから作成したＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリー（０２９）を用いて、ＩＶＶの共翻訳スクリーニングに従って、転写（図１，Ｖ）して、スペーサーをライゲーション（図１，ＶＩ）し、そして小麦胚芽の無細胞翻訳系で、ＩＶＶライゲーテッドライブラリーをプレイの翻訳テンプレートとし、ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡをベイトの翻訳テンプレートとし、共翻訳スクリーニングとＲＴ−ＰＣＲ（Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、プライマー；配列番号４と５、プログラム；ＲＴ−ＱＨ３０’）を３ラウンド回すとｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用するｃ−Ｊｕｎ蛋白質の遺伝子がサザンブロッティング（サザン）で明確に検出された（図３のＢ）。さらに、３ラウンド回したライブラリーをクローニングしたところ、ｃ−Ｊｕｎ蛋白質の遺伝子は約１／４を占めることがわかった。また、クローニングしたライブラリー内在のｃ−Ｊｕｎ蛋白質の遺伝子をシーケンスして確認した（図４）。詳細は以下の通りである。
ベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質の作成方法は以下の通りであった。ｐＣＭＶ−ＦｏｓＣＢＰｚｚベクター（配列番号３４）から、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を用いて、ＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９）Ｔ７−ＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号３５）と３’ＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号３６）、ＰＣＲプログラムＣＹＣＢ１（表１参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ＤＮＡテンプレートをＲｉｂｏＭＡＸＴＭＬａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写（３７℃，２ｈ）を行い、ベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質のｍＲＮＡテンプレートを準備した。共存させるベイトＤＮＡは、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの結合配列を含むＤＮＡ−Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（配列番号３７）をテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＤＮＡ（配列番号３８）と３’ＤＮＡ（配列番号３９）、ＰＣＲプログラムＶ−２（表１参照））によって準備した。
プレイのマウス脳ｃＤＮＡライブラリーの作成方法は以下の通りであった。図１に従ってＩＶＶランダムライブラリーを作成した。ＲＮＡライブラリーとして、市販のマウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（組織抽出ＲＮＡライブラリーをｏｌｉｇｏ ｄＴカラムで精製したもの；ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を購入した。アダプター設計は、対応付け分子の形成に適した５’ＵＴＲ配列（プロモーターＳＰ６＋エンハンサー０２９又は０’）をライブラリーに、ＩＶＶ形成に必要な配列として付加するための設計を行った。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーには、エンハンサー０２９をもつアダプターを使用した。エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖（配列番号１）と副鎖（ｇａａｔｔｃｇｃ）は、各々ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して１００μＭとし、主鎖と副鎖をそれぞれ１０μｌずつ等モルで混合する。９０℃で２分間加熱し、７０℃で５分加熱し、６０℃のウオーターバスにセットしてバスのヒーターを切ってゆっくりと６０℃から室温まで下げる。５μｌづつに分注して−２０℃に保存する。次に、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーを一本鎖ＤＮＡに逆転写する（図１，Ｉ）。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（１．４ｐｍｏｌｅ／０．５μｇ）を０．５μｇ、３’ランダムプライマー（配列番号３）を２ｐｍｏｌとＤＥＰＣ水とを加えて１２．０μｌとし、７０℃で１０ｍｉｎ加熱し、氷上で１分間冷却した。これを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４５℃で１ｈ逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で合成した一本鎖ＤＮＡを全量用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ポリメラーゼＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１６℃で ２ｈ反応し、さらにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで１６℃で５ｍｉｎで末端を平滑化し、二本鎖ＤＮＡを合成した（図１，ＩＩ）。次に、この二本鎖ＤＮＡの５’末端がリン酸化されていることを利用して、先に準備したアダプターを用いてライゲーションした（図１，ＩＩＩ）。合成した二本鎖ＤＮＡライブラリーをエタノール沈殿し、４μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。これに、１００μＭの準備したアダプターを１．０μｌ添加し、５０μｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて、１６℃でオーバーナイトで反応させ、精製（ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）した後５０μｌとした。次に、ＰＣＲ（ＥＸ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ；ＴａＫａＲａ）を行った（図１，ＩＶ）。５０μｌのライゲーションした二本鎖ＤＮＡライブラリーから２μｌをテンプレートとして、ＩＶＶに必要な特定配列（０２９）を持つ５’ＰＣＲプライマー（配列番号４）と３’ＰＣＲプライマー（配列番号５）を用いて、ＩＶＶ ｃＤＮＡライブラリーを作成した。ＰＣＲの条件は、全量１００μｌ、２２サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとし、最後の伸長反応は、７２℃で１８０秒）とした。
これらベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質のｍＲＮＡテンプレート、プレイのマウス脳ｃＤＮＡライブラリー、そして共存させるベイトＤＮＡを小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて５０μｌで共翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）させた。５０μｌのサンプルに対し、ＩｇＧ結合バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ４０）５０μｌを添加し計１００μｌ（共翻訳サンプル）とした。その後、ＩｇＧアガロース（Ｓｉｇｍａ）をＩｇＧ結合バッファーで２回洗浄し、これに共翻訳サンプル（１００μｌ）を加え、４℃で２時間回転攪拌した。結合バッファーで３回、ＴＥＶ 切断バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ４０，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ）で１回洗浄、ＩｇＧアガロースに結合したベイト／プレイ複合体をＴＥＶプロテアーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で切断した（１６℃、２時間）。さらに、上清９０μｌを３００μｌカルモジュリン結合バッファーと０．３μｌ １Ｍ ＣａＣｌ２、さらに、５００μｌカルモジュリン結合バッファーで２回洗浄した５０μｌカルモジュリンビーズを加えて４℃で１時間回転攪拌した。遠心後、１０００μｌカルモジュリン結合バッファーで３回洗浄した。５０μｌカルモジュリン溶出バッファーを加えて、氷上で１〜２分放置し、遠心後、５０μｌを回収した。回収した溶液をテンプレートとして、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、プライマー；配列番号４と５、プログラム；ＲＴ−ＱＨ３０’（表１参照））を行った。この操作（図３）を３ラウンド繰り返した後のライブラリーをクローニングしてシーケンスした。
以上から、本発明のライブラリーは、ライブラリーとして非常に質が高いこと、および、ＩＶＶのライブラリーとして利用できることが証明された。
実施例２ ＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成
実施例１において、配列番号５の３’ＰＣＲプライマーの代わりに、配列番号４０の３’ＰＣＲプライマーを使用する他は、実施例１と同様にＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成および評価を行った。この結果、実施例１と同様の結果が得られた。
実施例３ ＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成
実施例２において、エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖および副鎖として、配列番号１およびｇａａｔｔｃｇｃの代わりに配列番号４１およびｇｇａａｔｔｃｇの配列を有するものを使用する他は、実施例２と同様にＩＶＶランダムプライミングライブラリーの作成および評価を行った。この結果、実施例１と同様の結果が得られた。
産業上の利用分野
本発明によれば、ＩＶＶのセレクション／スクリーニングに用いるライブラリーとその製法が提供される。従来、ランダムプライマーによるライブラリー作成では、平均長が短くなる問題がある。また、クローニングを介在する作成方法の場合、元のＲＮＡライブラリーの規模や質を下げる問題がある。本発明では、二本鎖ＤＮＡを合成する際にＫｌｅｎｏｗフラグメントで５’側ランダムプライマーを使用する方法（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｐ．Ｗ．，Ａｌｐｉｎ，Ｊ．，Ｒｉｓｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｋｒｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．２００１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ−ＸＬ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｍｉｘ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２０８９８−２０９０６．）の代わりに、ＲＮａｓｅ Ｈ，ＤＮＡポリメラーゼＩ，そしてＤＮＡリガーゼ存在下で二本鎖ＤＮＡを合成すると、合成された相補鎖のみがリン酸化されていることを利用して、アダプターを相補鎖にライゲーションすることで、ＤＮＡ鎖の方向性を定めると同時に、平均長が短くなることも回避し、このライゲーションした相補鎖ＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとし、クローニングを介さず直接ＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリーを作成するため、元のＲＮＡライブラリーの規模や質を損なわないランダムプライミングライブラリーが提供可能となる。また、クローニングが必要な従来法に比べて、ライブラリー作成作業は１ヶ月から３日へ１／１０に短縮される。
クローニングを介さない方法においては、テンプレート作成のためのランダムプライマーを５’および３’末端の両端に用いるためにライブラリーの平均長が短くなる問題があったが、本発明では、ランダムプライマー（特定配列を持つアダプター付き）を最初のＲＮＡライブラリーからの逆転写時のみに用いて、二本鎖ＤＮＡとする際には用いないで、アダプターをライゲーションする方法を採用する。二本鎖ＤＮＡとしたときの相補鎖ＤＮＡのみが５’がリン酸化されていることを利用して、特定配列を持つリン酸化されていないアダプターをライゲーションすることで（ここでは、ライゲーション効率が高いＤＮＡリガーゼを用い、ＰＣＲテンプレートの方向性を定めるために、長さの短い配列をハイブリダイゼーションした一部二本鎖のアダプターを用いる。）、平均長が短くなることを回避し、かつライゲーションの際の副産物も少なく質の良いＰＣＲのテンプレートを作成することで、質の高いライブラリーを実現できる。
一方、ランダムプライミングによる対応付けライブラリーを作成する際のライブラリーの質を左右する他の要因としては、ライブラリーのテンプレートの中で対応付け分子を形成できるテンプレートの存在率を向上させることが考えられる。この場合、フレームのズレが１／３、５’ＵＴＲ／ＯＲＦ／３’ＵＴＲの３領域の枠組みのズレが１／３、さらに、表と裏で１／２なので、組み合わせると１／１８の確率となる。さらに、ライブラリーの作成にクローニングを介すると、ベクターへのライゲーションでバイヤスがかかり、元のライブラリーの質を保つことは難しい。本発明では、クローニングを介することがないために元のライブラリーの質を保つことが容易になり、かつライブラリーの規模はクローニングを介して細胞を用いた場合は１０８／ｍｌであるのに対して試験管内で作成するので１０１４／ｍｌが実現できるため、最終的にライブラリーのテンプレートの中で対応付け分子を形成できるテンプレートの量は大幅に増加し、極微量存在しているテンプレートでもスクリーニングやセレクションの際のＲＴ−ＰＣＲで増幅可能なライブラリーが作成できることになる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により一本鎖ＤＮＡを形成し、さらに該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、
該二本鎖ＤＮＡライブラリーと、末端がリン酸化されていない核酸からなるアダプターとをライゲーションしてライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、
該ライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、対応付け分子の形成に必要な配列を持つプライマーを用いたＰＣＲにより、対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを作成する
ことを含む対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項２】
アダプターが二本鎖であり、ライゲーションされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなる請求項１の製造方法。
【請求項３】
副鎖が本鎖よりも鎖長が短い請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを、一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーゼ存在下で形成する請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを構成するｃＤＮＡが、５’末端にプロモーターとエンハンサーを有する配列を含み、３’末端にライゲーションのアクセプター配列を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
プロモーター配列がＳＰ６プロモーターで、エンハンサー配列がオメガ配列又はオメガ配列の一部であり、アクセプター配列が２〜１０塩基のポリＡ配列である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法により得られる対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを転写することを含む、対応付け分子ＲＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法により得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを構成する対応付け分子ＲＮＡの３’末端にスペーサーをライゲーションすることを含む、対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項９】
スペーサーが、対応付けＲＮＡ分子にライゲーションする末端の反対の末端にピューロマイシン又はピューロマイシン誘導体を有し、かつ、塩基配列で１０−１００ｂｐ相当の長さを持ち、該スペーサーは、該ピューロマイシン又はピューロマイシン誘導体を介して、該対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーのテンプレートから翻訳された蛋白質と連結するものである請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
該スペーサーが、該対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーから翻訳された蛋白質と連結しないものである請求項８記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の製造方法により得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１３】
請求項８又は１０に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１４】
請求項７に記載の製造方法で得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１５】
請求項８又は９に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１６】
請求項８又は１０に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１７】
該蛋白質をＣ末端ラベル化法で修飾することを含む、請求項１１、１３、１４又は１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
核酸のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質と核酸の相互作用解析方法であって、ライブラリーが、請求項１、５、７〜１０のいずれか１項に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
【請求項１９】
蛋白質のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、請求項１７に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
【請求項２０】
対応付け分子のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、請求項１２又は１５に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
【請求項２１】
相互作用が共翻訳スクリーニング法により解析される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ライブラリーのスクリーニングを含む進化分子工学による機能蛋白質の創製方法であって、ライブラリーが、請求項１２又は１５に記載の製造方法により得られるライブラリーである前記方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、請求項１９又は２０に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、請求項１９又は２０に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の該機能蛋白質の創製方法を行い、ついで、請求項１９又は２０に記載に記載の該蛋白質間相互作用解析を行うことを含む蛋白質の創製方法。
【請求項１】
ＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーから、ランダムプライマーで逆転写により一本鎖ＤＮＡを形成し、さらに該一本鎖ＤＮＡを鋳型として、該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、
該二本鎖ＤＮＡライブラリーと、末端がリン酸化されていない核酸からなるアダプターとをライゲーションしてライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーを形成し、
該ライゲーテッド二本鎖ＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、対応付け分子の形成に必要な配列を持つプライマーを用いたＰＣＲにより、対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを作成する
ことを含む対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項２】
アダプターが二本鎖であり、ライゲーションされる本鎖とライゲーションされない副鎖からなる請求項１の製造方法。
【請求項３】
副鎖が本鎖よりも鎖長が短い請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡの５’末端のみがリン酸化されている二本鎖ＤＮＡライブラリーを、一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーゼ存在下で形成する請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを構成するｃＤＮＡが、５’末端にプロモーターとエンハンサーを有する配列を含み、３’末端にライゲーションのアクセプター配列を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
プロモーター配列がＳＰ６プロモーターで、エンハンサー配列がオメガ配列又はオメガ配列の一部であり、アクセプター配列が２〜１０塩基のポリＡ配列である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法により得られる対応付け分子ｃＤＮＡライブラリーを転写することを含む、対応付け分子ＲＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法により得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを構成する対応付け分子ＲＮＡの３’末端にスペーサーをライゲーションすることを含む、対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項９】
スペーサーが、対応付けＲＮＡ分子にライゲーションする末端の反対の末端にピューロマイシン又はピューロマイシン誘導体を有し、かつ、塩基配列で１０−１００ｂｐ相当の長さを持ち、該スペーサーは、該ピューロマイシン又はピューロマイシン誘導体を介して、該対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーのテンプレートから翻訳された蛋白質と連結するものである請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
該スペーサーが、該対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーから翻訳された蛋白質と連結しないものである請求項８記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の製造方法により得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１３】
請求項８又は１０に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１４】
請求項７に記載の製造方法で得られる対応付け分子ＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１５】
請求項８又は９に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１６】
請求項８又は１０に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテッドＲＮＡライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、蛋白質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。
【請求項１７】
該蛋白質をＣ末端ラベル化法で修飾することを含む、請求項１１、１３、１４又は１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
核酸のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質と核酸の相互作用解析方法であって、ライブラリーが、請求項１、５、７〜１０のいずれか１項に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
【請求項１９】
蛋白質のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、請求項１７に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
【請求項２０】
対応付け分子のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互作用解析方法であって、ライブラリーが、請求項１２又は１５に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。
【請求項２１】
相互作用が共翻訳スクリーニング法により解析される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ライブラリーのスクリーニングを含む進化分子工学による機能蛋白質の創製方法であって、ライブラリーが、請求項１２又は１５に記載の製造方法により得られるライブラリーである前記方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、請求項１９又は２０に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行い、ついで、請求項１９又は２０に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、蛋白質間相互作用解析方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の該機能蛋白質の創製方法を行い、ついで、請求項１９又は２０に記載に記載の該蛋白質間相互作用解析を行うことを含む蛋白質の創製方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５３１２７
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５８３９８（Ｐ２００４−５５８３９８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４７５０
【国際出願日】平成１５年１１月１９日（２００３．１１．１９）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４７５０
【国際出願日】平成１５年１１月１９日（２００３．１１．１９）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
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