本発明は、未分化の、または分化したＥＳ細胞単独細胞懸濁液から、未分化の、または分化したＥＳ細胞集合体懸濁液を生成する方法、およびそれらを分化する方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、ｈＥＳ単独細胞懸濁液からの懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させる方法；
（ａ） 未分化状態でのエキスパンションを許容する接着性の成長培養条件でｈＥＳ細胞を培養すること；
（ｂ） （ａ）の接着性のｈＥＳ細胞培養物をｈＥＳ単独細胞の懸濁培地内に解離すること；および
（ｄ） ｈＥＳ単独細胞懸濁培地を、単独細胞懸濁培地がｈＥＳ−由来の細胞集合体を懸濁液中で形成するまでの期間撹拌した際に、懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を形成することを許容する分化培地条件と接触させ、懸濁液中のｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させること。
【請求項２】
前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培地が少なくとも３０分間撹拌される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培地が８０ｒｐｍから１６０ｒｐｍで、ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物のオービタルローテーションにより撹拌される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培地が１００ｒｐｍから１４０ｒｐｍで、ｈＥＳ単独細胞懸濁培養物のオービタルローテーションにより撹拌される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
複数のｈＥＳ−由来の細胞集合体が懸濁培養で製造され、懸濁液中のｈＥＳ−由来の細胞集合体のサイズと形状が本質的に一定である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ｈＥＳ−由来の細胞集合体が内胚葉リネッジ特異性細胞集合体である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記内胚葉リネッジ特異性細胞集合体が、膵性リネッジタイプ細胞集合体、肝臓リネッジタイプ細胞集合体、上皮性リネッジタイプ細胞集合体、甲状腺リネッジ細胞集合体、および胸腺リネッジ細胞集合体から成る群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記内胚葉リネッジ特異性細胞集合体が膵性リネッジタイプ細胞集合体である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記ｈＥＳ−由来の細胞集合体は、多分化能膵性前駆細胞集合体または内分泌性細胞集合体である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記分化培養条件と接触させる工程に引き続いて、１種以上の選択性マーカまたは薬剤の使用により希望のｈＥＳ−由来の細胞集合体を選択するかまたは精製する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記選択性マーカまたは薬剤が、ＣＤ３０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５５、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１４２、ＣＤ１６５、ＣＤ２００、ＣＤ３１８、ＣＤ３３４、およびＣＤ３４０から成る群から選ばれる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記希望のｈＥＳ−由来の細胞集合体の選択または精製がセルソ−ティングの使用により行われる、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記分化培養条件と接触させる工程に引き続いて、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン、およびレチノイン酸から成る群から選択される増殖因子の低濃度と接触させることにより膵性内胚葉細胞を富化する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記分化培養条件と接触させる工程に引き続いて、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン、およびレチノイン酸から成る群から選択される増殖因子の高濃度と接触させることにより膵性内分泌細胞を富化することを許容する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記ｈＥＳ単独細胞懸濁培地に、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、およびインスリン／鉄結合性グロブリン／セレニウム（ＩＴＳ）を含む混合物から成る群から選ばれる、細胞生存を促進できる薬剤を追加することをさらに含む、特許請求の範囲１の方法。
【請求項１６】
前記接着培養条件が、細胞外マトリクス、細胞外基質蛋白質およびヒトまたはマウスフィーダー層から成る群から選択される基体またはマトリツクスを欠いている、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記接着性の成長培養条件は、異物性がなく、無マトリツクス、およびフィーダなしである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記第一の分化培養条件が、ＴＧＦｂｅｔａファミリーメンバー受容体を活性化するＴＧＦｂｅｔａファミリーメンバーを含み、該ＴＧＦｂｅｔａファミリーメンバーがアクチビン Ａ、アクチビン Ｂ、ノーダル、ＧＤＦ−８、およびＧＤＦ−１１から成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
以下を含む、ｈＥＳ−由来単独細胞懸濁液から、懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させる方法；
（ａ） 未分化状態でのエキスパンションを許容する接着性の成長培養条件でｈＥＳ細胞を培養すること；
（ｂ） ｈＥＳ細胞を分化するのに好適な第一の培養条件に未分化のｈＥＳ細胞を接触させ、接着性のｈＥＳ−由来の細胞を与えること；
（ｃ） 接着性のｈＥＳ−由来の細胞を単独細胞懸濁培養物に解離すること；
および
（ｄ） 単独細胞懸濁培養物を、単独細胞懸濁培地がｈＥＳ−由来の細胞集合体を懸濁液中で形成するまでの期間撹拌した際に、懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を形成することを許容する第二の分化培地条件と接触させ、それにより懸濁液中にｈＥＳ−由来の細胞集合体を発生させること。
【請求項２０】
前記第二の分化培養条件が、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギンおよびレチノイン酸から成る群から選ばれた非ＴＧＦｂｅｔａファミリーメンバーを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン、およびレチノイン酸から成る群から選択された増殖因子の低濃度を使用することを含む膵性前駆細胞を富化する方法。
【請求項２２】
ＦＧＦ１０、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ノギン、およびレチノイン酸から成る群から選択された増殖因子の高濃度を使用することを含む内分泌前駆細胞を富化するための方法。
【請求項２３】
ｈＥＳ細胞培地から膵性前駆細胞を富化する方法であって、膵性前駆細胞が由来するｈＥＳ細胞培地密度を大きくすることを含む、方法。
【請求項２４】
ｈＥＳ細胞培地から内分泌前駆細胞を富化する方法であって、膵性前駆細胞が由来するｈＥＳ細胞培地密度を小さくすることを含む、方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図５Ｆ】

【図６】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図６Ｆ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図７Ｅ】

【図７Ｆ】

【図７Ｇ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｅ】


【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１０Ｅ】

【図１１Ａ−１１Ｂ】

【図１１Ｃ−１１Ｄ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１６Ｃ】

【図１６Ｄ】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２２Ｃ】

【図２２Ｄ】

【図２２Ｅ】

【図２２Ｆ】

【図２２Ｇ】

【図２２Ｈ】

【図２２Ｉ】

【図２２Ｊ】

【図２２Ｋ】

【図２２Ｌ】

【図２２Ｍ】

【図２２Ｎ】

【図２２Ｏ】

【図２２Ｐ】

【図２３】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２４Ｃ】

【図２４Ｄ】

【図４】

【公表番号】特表２０１２−５０７２８１（Ｐ２０１２−５０７２８１Ａ）
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３４４７８（Ｐ２０１１−５３４４７８）
【出願日】平成２０年１１月４日（２００８．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２３５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５３４７２
【国際公開日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（５１１１０９７９９）バイアサイト　インク (2)
【Ｆターム（参考）】