微生物培養装置
【課題】異なる培養因子を複数選択でき、これら培養因子の勾配を１つの培養器１内に形成できる微生物培養装置を提供すること。
【解決手段】培養装置は、微生物試料が充填される充填室１０を有する培養器１の側壁の一部に、微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填し得る第１収容部１１が形成され、第１収容部１１と培養器１の充填室１０とは取り外し可能な第１の仕切板１４で仕切られ、培養器１の側壁の他部に、微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填し得る第２収容部１２が形成され、第２収容部１２と培養器１の充填室１０とは取り外し可能な第２の仕切板１５で仕切られている。
【解決手段】培養装置は、微生物試料が充填される充填室１０を有する培養器１の側壁の一部に、微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填し得る第１収容部１１が形成され、第１収容部１１と培養器１の充填室１０とは取り外し可能な第１の仕切板１４で仕切られ、培養器１の側壁の他部に、微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填し得る第２収容部１２が形成され、第２収容部１２と培養器１の充填室１０とは取り外し可能な第２の仕切板１５で仕切られている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体培地で微生物培養や希釈平板培養を行う場合、固体培地内に栄養成分の勾配あるいは生育条件の勾配を発生させる装置に関するもので、更に詳しくは、培養条件を異なる勾配に制御あるいは予測できる培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
Robert Kochが1881年にゼラチン平板培養法を開発して以来、この純粋分離法によって応用微生物学が発展してきたと言っても過言ではない。この技術では、環境中に存在する微生物の１％以下しか分離できないと古くから言われている。
【０００３】
近年、微生物の分離培養を経ないで、環境中から直接DNAを単離し、遺伝子レベルから微生物叢の解析が可能になり、この分離できない微生物集団の中にVBNC(ViableBut Nonculturable)と名づけられた、これまで知られていない微生物群がにわかに注目されるようになってきた。
【０００４】
しかし、依然としてこれら９９％の分離できない微生物の全体像は謎につつまれたまま放置されている。この大きな原因は、余りに多くの培養因子（溶存酸素濃度、炭酸ガス濃度、酸化還元電位、培養温度、培地成分濃度、塩濃度、培地ｐＨなど）があるために、残り９９％の微生物を分離できるようにするためには、莫大な時間と人手のかかる仕事が予想され、宝の山を目の前にして、躊躇しているのが現状である。
【０００５】
近年、遺伝子工学の進歩により、応用微生物学分野でも遺伝子から出発する研究が多く、このような研究が先端的であると考えられる風潮にある。昔ながらの微生物のスクリーニング法で新しい微生物資源を探索し、応用しようとする研究は時間の掛かる、多くの人手が必要な、古臭い研究であると考えられがちである。
【０００６】
しかし、新しい遺伝子資源を掘り起こすためにも、微生物のスクリーニングをもう一度見直す必要があると発明者らは考えている。ちなみに堀越らは、ｐＨ一つをアルカリ側に移動させるだけで、「アルカリ世界」という新しい微生物世界の存在を我々に示し、新しい遺伝子資源の一端を垣間見せてくれた。しかし、あいかわらず、土壌中に生息する微生物の全体像はベールに包まれたままである。
【０００７】
一方、自然界からの微生物分離に関してみてみると、Kochから堀越までの培養条件はあいかわらず「点」であり、本発明者らが発想した「線」から「面」へ、さらに多次元へ広げようとする考えは過去に全く認められない。
【０００８】
上述したように、1881年RobertKochによる『病原微生物の研究方法』なる原著論文に記載された固体培地を用いる希釈平板純粋分離法は、1887年R.J.Petriの小改良を経て、今日までほとんど同じ方法のままで使用され続けている。
【０００９】
さて、微生物研究法の歴史を述べたが、Robert Kochの弟子、Martinus W.Beijerinckが1889年に発表した「培地選定法、微生物研究に役立つゼラチン内拡散法」を取り上げねばならない。この方法はオキサノグラフ法として知られており、とくに抗生物質とビタミン研究で現在でも利用されている。ペニシリンの定量のためのAlexanderFlemingが1929年に発表した方法はまさにこのオキサノグラフ法の応用である。すなわち、検定物質が固体培地内を拡散する際の生じる濃度勾配を検定菌生育阻止で定量しようとするものである。このような固体培地内での物質拡散現象を利用し、取得既知微生物の生育特性や食品保存剤の効果などを調べる方法が幾つか提案されている。
J.W.T.Wimpenny et.al.:J.Gen.Microbiol.,130,2921-2926(1984)（非特許文献１）;
J.W.T.Wimpennyet.al.; FEMSMicrobiol.,40,263-267(1987)（非特許文献２）;
P.J.McClure,et.al.:Lett.Appl.Microbiol.,9,95-99(1989)（非特許文献３）;
A.C.Peters,et.al.:Binary,3,147-155(1991)（非特許文献４）;
K,McGrath,et.al.,Int.Biodeter.Biodegrad.,29,45-52(1992)（非特許文献５）;
F.A. Gentile et.al.:LifeSci., 50,287-293(1992)（非特許文献６）;
L.V.Thomaset.al.:Int.J.Food.Microbiol.,17,289-301(1993)（非特許文献７）;
L.V.Thomaset.al.:Appl.Environ.Microbiol.,62,2006-2012(1996)（非特許文献８）;
N.Rattanasomboonet.al.:Int.J.Food.Sci.Technol.,36,369-376(2001)（非特許文献９）；
E.Z.Panagouet.al.:Appl.Environ.Microbiol.,71,392-399(2005)）（非特許文献１０）。
【００１０】
また、これらの研究方法の延長上に、物質拡散を定常状態に達せしめんとする試みもある（D.E. Caldwell et.al.:Can.J.Microbiol.,19,53-58 (1972)（非特許文献１１））。
【００１１】
また、特開平７−１７０９７３号公報（特許文献１）には、複数種の微生物が混在する試料を比重勾配遠心で処理して、微生物を比重に応じて選別するか、該試料を電解液中で電気泳動させ、微生物の移動経路中に所定の大きさの微生物選別用のフィルターを設置して微生物を選別する方法が記載されている。
さらに、特開２００４−３２９１２２号公報（特許文献２）には、細胞の組織再生を促進するための各種の培養条件に勾配を与えた条件下で細胞培養を行って組織を形成するようにした装置が記載されている。
【００１２】
ここまで述べたオキサノグラフ法の係る微生物生育特性の解析法提案を概観するに、科学的方法論として大きな致命的欠損を指摘することができる。その問題点を提示する前に、公知技術の具体例を示す。
【００１３】
すなわち、検定物質の固体培地内へのアプライする操作は種々な形態で実施することが可能で、検体物質溶液を含浸させた濾紙片・溶液そのものをあらかじめ固化させた固体培地表面に静置する、あるいは検体物質を含む溶液を寒天などで固化せしめた後、検体物質を含まない寒天層を重層するか接触させる、もしくは検定物質を結晶・粉体の状態で寒天内に抱埋する、などの方法で拡散を開始する。
【００１４】
これらの拡散開始形態の違いはあるものの、これらの公知技術には標的物質がどのような濃度勾配をもって固体培地内を拡散するかに関して、経時的かつ定量的把握がまったくなされていないことである。ましてや、この物質拡散を制御せんとする試みは皆無である。すなわち、さらに加えて詳細に説明すると、物質拡散は物理現象であるので理論的な数値解析による拡散係数の算出ならびに、物質拡散の予測が可能と本発明者らは考えるが、上記オキサノグラフ法に関する先行技術論文には、論理的試みはまったく記載がなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】J.W.T.Wimpenny et.al.:J.Gen.Microbiol.,130,2921-2926(1984)
【非特許文献２】J.W.T.Wimpennyet.al.; FEMSMicrobiol.,40,263-267(1987)
【非特許文献３】P.J.McClure,et.al.:Lett.Appl.Microbiol.,9,95-99(1989)
【非特許文献４】A.C.Peters,et.al.:Binary,3,147-155(1991)
【非特許文献５】K,McGrath,et.al.,Int.Biodeter.Biodegrad.,29,45-52(1992)
【非特許文献６】F.A. Gentile et.al.:Life Sci., 50,287-293(1992)
【非特許文献７】L.V.Thomaset.al.:Int.J.Food.Microbiol.,17,289-301(1993)
【非特許文献８】L.V.Thomaset.al.:Appl.Environ.Microbiol.,62,2006-2012(1996)
【非特許文献９】N.Rattanasomboonet.al.:Int.J.Food.Sci.Tech-nol.,36,369-376(2001)
【非特許文献１０】E.Z.Panagou et.al.:Appl.Environ.Microbiol.,71,392-399(2005)）
【非特許文献１１】（D.E. Caldwell et.al.:Can.J.Microbiol.,19,53-58(1972)
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開平７−１７０９７３号公報
【特許文献２】特開２００４−３２９１２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、異なる培養因子を複数選択でき、これら培養因子の勾配を１つの培養器内に形成することができる微生物培養装置を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明の他の目的は、同一のシャーレなど培養器内に異なる培養因子の勾配を形成し、且つ制御できる微生物培養装置を提供することにある。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、固体培地内に栄養成分あるいは生育条件の勾配を発生させることができる微生物の培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明においては、微生物試料（検体物質）を含む溶液を寒天などで固化させた後、検体物質を含まない寒天層を接触させる方法を採用した。
【００２１】
次いで、微生物培養因子からモデル検体物質を複数選定し、これらの物質がどのように固体培地内に拡散するかを定量的に把握する実験検証により、拡散方程式を誤差関数として数値解析した。
【００２２】
さらに得られたモデル化合物の拡散係数から、実測値と理論値を比較し、寒天培地内での培地成分因子の濃度分布を推定することを目標とした。また、これら数値解析と同時に、実施形態としての培養装置を設計するとともに、培地成分因子の拡散を制御する方法を考案することにより、任意の培養条件を生みだすこととする。
【００２３】
すなわち、本発明の培養装置は、微生物試料が充填される充填室を有する培養器の側壁の一部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填し得る第１収容部が形成され、該第１収容部と培養器の充填室とは取り外し可能な第１の仕切板で仕切られ、該培養器の側壁の他部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填し得る第２収容部が形成され、該第２収容部と培養器の充填室とは取り外し可能な第２の仕切板で仕切られており、そのことにより上記目的が達成される。
【００２４】
一つの実施形態では、前記培養器の底部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第３成分を含有する第３の寒天を充填し得る第３収容部が形成されている。
【００２５】
一つの実施形態では、前記培養器は箱状に形成され、該培養器の一側壁に前記第１収容部が形成され、該第１収容部に隣接する他の側壁に前記第２収容部が形成されている。
【００２６】
一つの実施形態では、前記培養器は略円筒状に形成され、該培養器の周壁に前記第１収容部および第２収容部が形成されている。
【００２７】
一つの実施形態では、前記培養器の側壁に３以上の収容部が形成されている。
【００２８】
一つの実施形態では、前記第１の寒天と前記第２の寒天とは、培地成分濃度、塩濃度、培地ｐＨの少なくともいずれかが異なる。
【００２９】
本発明の他の培養装置は、微生物試料が充填される充填室を有する培養器の側壁の一部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の溶液を供給し得る第１収容部が形成され、該第１収容部と培養器の充填室とは半透膜で仕切られ、該培養器の側壁の他部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の溶液を供給し得る第２収容部が形成され、該第２収容部と培養器の充填室とは半透膜で仕切られており、そのことにより上記目的が達成される。
【００３０】
一つの実施形態では、前記第１収容部に前記第１の溶液の供給口と排出口がそれぞれ形成され、前記第２収容部に前記第２の溶液の供給口と排出口がそれぞれ形成されている。
【００３１】
一つの実施形態では、前記第１収容部および第２収容部と対向する位置において、前記培養器の側壁に、透析水が還流される透析チャンバーが形成されている。
【００３２】
本発明の微生物をスクリーニングする方法は、上記培養装置を用いて、微生物試料に含まれる微生物をスクリーニングする方法であって、前記培養器の側壁に形成された第１収容部内に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填して第１の寒天層を形成する工程、前記第１の仕切板を外して該第１の寒天層を培養器の充填室に露出させる工程、前記培養器の側壁に形成された第２収容部内に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填して第２の寒天層を形成する工程、前記第２の仕切板を外して該第２の寒天層を培養器の充填室に露出させる工程、および該培養器の充填室内に、微生物試料を含む流動性を有する固体培地を充填して固化させる工程、を包含し、そのことにより上記目的が達成される。
【００３３】
一つの実施形態では、前記固体培地は、第１成分および第２成分を含有しない。
【発明の効果】
【００３４】
ちなみに、本発明で開示する多次元培養法は培養因子を連続的に変化させるが、培養基内で達成される因子を非連続な勾配とみなして仮に100段とすると、三次元に展開した培養容器は100万段となる。そして、微生物の生育因子に対する許容度を因子に対応させて10段とみなせば、1個の培養容器はトラディショナルシャーレ1000枚分に匹敵すると見積もられ、本装置を用いれば有効な網羅的培養方法となるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は培養装置の概略図である。
【図２】図２は培養装置に寒天を充填した状態の概略図である。
【図３】図３は２要素勾配角型培養装置の上面図である。
【図４】図４は３要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図５】図５は４要素勾配丸型深型培養装置の断面図である。
【図６】図６は３要素勾配角型培養装置の上面図である。
【図７】図７は３要素勾配角型培養装置の上面図である。
【図８】図８は４要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図９】図９は５要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図１０】図１０は６要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図１１】図１１は７要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図１２】図１２は拡散測定装置の断面図を示す。
【図１３】図１３はアルギニンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離３インチ）。
【図１４】図１４はグリシンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離３インチ）。
【図１５】図１５はアルギニンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離５インチ）。
【図１６】図１６はグリシンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離５インチ）。
【図１７】図１７はグリセリンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離５インチ）。
【図１８】図１８はグルコースが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離５インチ）。
【図１９】図１９は、拡散方程式（式（１））と本発明で解析するに用いた誤差関数積分式（式（２））の導き方を示したものである。
【図２０】図２０は、図１３ならびに図１５で示すアルギニンの濃度分布から、図１８式（２））によって求めた拡散係数Dを示すものである。
【図２１】図２１は、図１４ならびに図１６で示すグリシンの濃度分布から、図１８式（２）によって求めた拡散係数Dを示すものである。
【図２２】図２２は、図１７で示すグリセリンの濃度分布から、図１９式（２）によって求めた拡散係数Dを示すものである。
【図２３】図２３は、図１８で示すグルコースの濃度分布から、図１８式（２）によって求めた拡散係数Dを示すものである。
【図２４】図２４は、図１９の式（２）より求めたアルギニンの拡散係数Dから算出した濃度分布理論値と実測値の比較を示したものである。
【図２５】図２５は、図１９の式（２）より求めたグリシンの拡散係数Dから算出した濃度分布理論値と実測値の比較を示したものである。
【図２６】図２６は、図１９の式（２）より求めたグリセリンの拡散係数Dから算出した濃度分布理論値と実測値の比較を示したものである。
【図２７】図２７は、図１９の式（２）より求めたグルコースの拡散係数Dから算出した濃度分布理論値と実測値の比較を示したものである。
【図２８】図２８は、図１９の式（２）より求めたアルギニンの拡散係数Dから算出した種々の初発濃度C0の条件下における、拡散時間１０日目の推定濃度分布のシミュレーション結果を示す。
【図２９】図２９は、透析機能付き拡散測定装置（拡散距離５インチ）の断面図を示すものである。
【図３０】図３０は、透析機能付き拡散測定装置（拡散距離５インチ）を用いて、５％グリセリンを含む勾配形成寒天で拡散を調べた濃度分布パターンを示すものである。
【図３１】図３１は、透析機能付き、且つ勾配形成寒天の代わりに一定濃度の勾配形成成分溶液を還流する拡散測定装置（拡散距離５インチ）の断面図を示すものである。
【図３２】図３２は、透析機能付き、且つ勾配形成寒天の代わりに一定濃度の勾配形成成分溶液を還流する拡散測定装置（拡散距離５インチ）を用いて、５％グリセリンを含む勾配形成成分溶液で拡散を調べた濃度分布パターンを示すものである。
【図３３】図３３は３要素勾配丸型培養装置に還流・透析機能を付与した培養装置１の斜視図である。
【図３４】図３４は、拡散５日目に、レフレクター設置時と非設置時のリン酸緩衝液の拡散到達距離を比較したものである。
【図３５】図３５は、乳酸菌などの嫌気性菌を測定するための培養器の正面図である。
【図３６】図３６は図３５で示した培養器の断面図である。
【図３７】図３７はMcllvaine bufferを用いた場合のｐＨ勾配を示すグラフである。
【図３８】図３８はBritton-Robinson bufferを用いた場合のｐＨ勾配を示すグラフである。
【図３９】図３９は、溶存ガスの濃度勾配方向を説明するための模式図である。
【図４０】図４０は、溶存ガスの濃度勾配方向を説明するための模式図である。
【図４１】図４１は、溶存炭酸ガス濃度の検量線である。
【図４２】図４２は、培養装置の斜視図である。
【図４３】図４３は、培養装置の断面図である。
【図４４】図４４は、溶存酸素濃度勾配の形成状態を示すグラフである。
【図４５】図４５は、溶存酸素濃度勾配の形成状態を示すグラフである。
【図４６】図４６は、１０％炭酸ガス通気の場合の溶存炭酸ガス濃度勾配を示すグラフである。
【図４７】図４７は、２０％炭酸ガス通気した場合の溶存炭酸ガス濃度勾配を示すグラフである。
【図４８】図４８は、電気化学的手法を用いたＯＲＰ勾配形成の模式図である。
【図４９】図４９は、酸化還元剤の組み合わせ法によって形成せしたＯＲＰ匂配を示すグラフである。
【図５０】図５０は、電気化学的手法を用いたＯＲＰ勾配形成の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明を添付図面に基づいてより詳しく説明する。
【００３７】
図１〜図３は本発明に係る微生物培養装置Ａの概念図である。
【００３８】
この培養装置Ａは、微生物試料が充填される充填室１０を中央部に有する培養器１を備えている。該培養器１はプラスチック、ガラスなどの透明板を用いて上方が開口する箱状に形成されている。
【００３９】
該培養器１の側壁の一面に、第１成分を含有する第１の寒天を充填し得る第１収容部１１が形成され、該第１収容部１１と培養器１の充填室１０とは取り外し可能な第１の仕切板１４で仕切られている。
【００４０】
すなわち、培養器１の四隅には断面四角形のフレーム１７が固定され、一対のフレーム１７間に該第１仕切板１４が上方へスライド移動できるように配置されている。具体的には、フレーム１７に第１仕切板１４の端部を挿入する凹溝が設けられ、あるいはフレーム１７に係止片（図示せず）が設けられており、第１仕切板１４の両端部はこれらの溝又は係止片に上下移動可能に取り付けられている。
【００４１】
上記第１収容部１１に隣接する培養器１の側壁に、第２成分を含有する第２の寒天を充填し得る第２収容部１２が形成され、該第２収容部１２と培養器１の充填室１０とは取り外し可能な第２の仕切板１５で仕切られている。第２仕切板１５を培養器１に取り付ける場合も、第１仕切板１４の場合と同様に構成することができる。
【００４２】
培養器１の底面は平坦面に形成され、培養器１の底部には、第３成分を高濃度に含有する第３の寒天を充填し得る第３収容部１３が形成されている。この第３収容部１３には仕切板は不要である。
【００４３】
第１成分、第２成分、第３成分は、それぞれ微生物の培養に影響を及ぼすものであり、公知の培地成分、培地のｐＨ調製剤などがあげられる。
【００４４】
特に、(a)第１成分として窒素源化合物類、(b)第２成分として炭素源化合物類、(c)第３成分として微量塩類化合物類の組合せが好ましい。
【００４５】
第１の寒天における第１成分の濃度としては、１０〜１％程度が好ましい。
【００４６】
第２の寒天における第２成分の濃度としては、１０〜１％程度が好ましい。
【００４７】
第３の寒天における第３成分の濃度としては、0.01〜0.001％程度が好ましい。
【００４８】
培養器１の充填室１０内に充填される微生物試料とは、微生物を含む試料全てをいい、典型的には、微生物、寒天および水を含有する（固体培地ともいう）。この微生物試料は、通常は上記第１成分、第２成分および第３成分を含有しない。
【００４９】
この微生物試料は、流動性を有する状態で培養器１の充填室１０に充填される。
【００５０】
培養器１、充填室１０および収容部１１〜１３の形状、サイズ等は適宜設定することができる。また収容部の数も目的に応じて任意に設定することができる。培養器１の上端開口部には、通常蓋が取り付けられる。これらの具体例は後述する。
【００５１】
上記構成の培養装置Ａを用いて、微生物をスクリーニングするには、以下のように行うことができる。
【００５２】
本発明の培養装置Ａの第１および第２の収容部１１，１２に仕切板１４，１５を取り付けた状態で、第１収容部１１内に第１成分を含有する流動性の第１の寒天を充填して第１の寒天層２１を形成する（図２）。同様に、第２収容部１２内に第２成分を含有する流動性の第２の寒天を充填して第２の寒天層２２を形成する。また、培養器１の充填室１０の底部に第３成分を含有する流動性の第３の寒天を充填して第３の寒天層２３を形成する。
【００５３】
第１の寒天層２１、第２の寒天層２２および第３の寒天層２３の厚みは、適宜設定することができるが、例えば、それぞれ同じ厚みとすることができる。
【００５４】
第１の寒天層２１および第２の寒天層が固化した後、第１および第２の仕切板１４、１５をそれぞれ取り外す。第１の寒天層２１および第２の寒天層２２は、それぞれ培養器１の充填室１０に露出することになる。
【００５５】
次いで、培養器１の充填室１０内に、微生物試料を含む流動状態の寒天（固体培地）を充填して固化させる。
【００５６】
その後、この培養装置Ａを適当な培養温度内に静置し、充填室１０に充填された寒天層２４に微生物コロニーの出現を待つ。
【００５７】
この間、第１、第２および第３の各寒天層２１〜２３から、第１〜第３成分が充填室１０内の寒天層２４に拡散し、該中央の寒天層２４において拡散開始を起点にする経過時間に依存した第１〜第３成分の濃度勾配が形成される。その結果、「そうめん流し」、あるいは「藁をも掴む方式」で、上流から拡散してきた培地成分濃度に対応して微生物のコロニーが出現する。
【００５８】
なお、培養器１の形状は、図１に概念図として提示したものに限定されることなく、一般的に使用される丸型の形状など、いろいろな形状のものを用いることができる。代表的な形状を図４〜図１１に例示する。
【００５９】
図４に示す培養装置Ａは、有底の円筒状の培養器１の内面に３つの収容部１１〜１３を隣接して形成したものである。すなわち、培養器１の周壁の内面側にスペーサー２６を４つ固定し、該スペーサー２６の内側端部に仕切板１６をスライド可能に取り付けたものである。この仕切板１６は一枚のもので形成してもよく、あるいは各別の収容部毎に形成してもよい。
【００６０】
各収容部１１〜１３内にそれぞれ第１〜第３成分を含有する第１〜第３の寒天を充填して第１〜第３の寒天層を形成した後、仕切板１６を上方へスライドして取り外すことにより、各寒天層は培養器１の充填室１０に露出する。この充填室１０内に微生物試料を含む寒天を充填して固化させる。
【００６１】
なお、各収容部１１〜１３の位置は隣接する必要はなく、勾配形成の方向によっては、容器１内のどの位置に設置してもよい。この図面には示されていないが、これを覆う蓋９が付属する（以下の各実施例の図において同じであるので、説明を省略する。）。
【００６２】
図５に示した培養装置Ａは、図４に示した丸型培養器１を深型にしたものであり、底部に第４の収容部２８が形成され、この部分に第４の成分を含有する第４の寒天を充填固化することができる。
【００６３】
図５中、第１〜第３の収容部１１〜１３に第１〜第３の寒天を充填固化することができる。これら４種の培地成分を含有する寒天が固化した後、仕切板１６を取り除き、第１〜第４の収容部に形成された寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を培養器１の充填室１０に充填する。
【００６４】
なお、図５中、勾配形成寒天を充填固化する収容部１１〜１３は、この図面では明確に特定できないが、図４の平面図に示すように、その位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては容器１内のどの位置に設置してもよい。
【００６５】
培養器１の側壁に３以上の収容部を形成してもよい。図６は収容部を３つ有する培養装置Ａの上面図である。
【００６６】
この培養装置Ａでは、培養器１を断面６角形に形成し、その３つの壁面を仕切板１４〜１６とし、該仕切板１４〜１６に対応して培養器１の外側に断面略コ字形の壁部３０を設けたものである。
【００６７】
すなわち、第１〜第３の収容部１１〜１３は、図１〜図４に示す構成とは異なり、中央の充填室１０から外側へせり出した位置に設置した例である。
【００６８】
なお、図６中、収容部１１〜１３はこの図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、培養器１の壁面のどの位置に設置してもよい。
【００６９】
図中の収容部１１〜１３に勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１４〜１６を取り除き、収容部１１〜１３内の寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。
【００７０】
図７は収容部を３つ有する角型培養装置Ａの上面図である。
【００７１】
この培養装置Ａでは、培養器１を断面６角形に形成し、その３つの壁面を仕切板１４〜１６とし、該仕切板１４〜１６に対応して培養器１の外側に断面略コ字形の壁部３０を設けたものである。
【００７２】
すなわち、収容部１１〜１３は、図１〜図４に示す構成とは異なり、図６と同様に、培養器１の充填室１０から外側へせり出した位置に設置したものである。
【００７３】
なお、図中、第１〜第３の収容部１１〜１３は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、培養器１の側面のどの位置に設置してもよい。
【００７４】
図中第１〜第３の収容部１１〜１３には勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１４〜１６を取り除き、第１〜第３の収容部１１〜１３の寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。
【００７５】
図８は収容部を４つ有するほぼ丸型培養装置Ａの上面図である。
【００７６】
この培養装置Ａは、断面８角形に形成された培養器１の内面側に断面略コ字形の仕切板１９を上方へスライド可能に取り付けたものである。
【００７７】
すなわち、図中第１〜第４の収容部１１〜１３、２８に、勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１９を培養器１から取り除き、第１〜第４の収容部１１〜１３、２８内にそれぞれ形成された寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０へ充填する。なお、図中第１〜第４の収容部１１〜１３、２８は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、所望とする勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。
【００７８】
図９は収容部を５つ有するほぼ丸型培養装置Ａの上面図である。
【００７９】
図中、第１〜第５の収容部に勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１９を取り除き、第１〜第５の収容部に形成された寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。
【００８０】
なお、図中第１〜第５の収容部は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。
【００８１】
図１０は６つの収容部を有する丸型培養器１の上面図である。
【００８２】
第１〜第６の収容部に、勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１９を取り除き、第１〜第６の収容部に形成された寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。
【００８３】
なお、図中勾配形成寒天を充填固化する第１〜第６の収容部は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。
【００８４】
図１１は７つの収容部を有する丸型培養器１の上面図である。図中第１〜第７の収容部に、勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板を取り除き、第１〜第７の収容部に形成した寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。なお、図中第１〜第７の収容部は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。
【実施例１】
【００８５】
以上述べた本発明の微生物培養装置Ａにおいて、培地成分を含有する寒天から成分がどのような濃度勾配を以って拡散するかを調べた測定結果を提示し、先行技術で明確に示されていない固体培地内での物質拡散の濃度分布の全貌を明らかにする。
【００８６】
図１〜図１１に例示した培養器１内では、物質拡散は収容部から直線方向だけでなくある程度の角度を持って扇状に拡散すると予想されるので、拡散の定量的把握の検討のために、図１２に示す装置を用いた。
【００８７】
この測定装置３は、寒天を充填し得るパイプ３２と、該パイプ３２の一端部内に挿入される挿通棒３４と、を有する。パイプ３２の一端部にはネジ溝３６が形成され、挿通棒３４の一部がこのネジ溝３６に螺合することで、挿通棒３４を回転することにより、該挿通棒３４がパイプ３２内を移動できるように構成されている。
【００８８】
すなわち、一定の内径を持ったパイプ３２内で、拡散させる寒天３９と高濃度の培地成分を含有する勾配形成寒天４０を接触させて固化させ、一定の拡散時間の後、パイプ３２の後部に設置した繰り出し機構３８で寒天層を繰り出すと共に、２ミリ間隔で該寒天層を切り出し、各部分の成分濃度を測定する。なお、寒天４０の寒天３９と接触していない面は、実験期間内での乾燥を防止するために、サランラップ（登録商標）などを用いて封じた。
【００８９】
具体的には、パイプ３２の先端部３２ｉに１％アルギニン塩酸塩を含む１．５％寒天を充填（中和してｐＨ５付近）した。拡散温度２７．５℃、所定の時間経過した後に、上記のようにして、２ミリ厚に寒天層をスライスし、0.01規定塩酸で加熱抽出後、適宜希釈して自動アミノ酸分析計でアルギニンを定量した。この場合、拡散する寒天層３９はパイプ３２の中央部３２ｊに相当し、その長さは３インチである。
【００９０】
図１３は、培地成分を含有する勾配形成寒天４０を０．５インチ、拡散させる寒天３９を３インチとして、初発濃度１％のアルギニン塩酸塩、拡散温度２７．５℃にした場合の、培地成分を含有する勾配形成寒天先端からの距離をＸ軸、その部分のアルギニン濃度をＹ軸にプロットしたグラフである。
【００９１】
距離約１．３ｃｍの部分は培地成分を含有する勾配形成寒天４０に相当する。同図から見て取れるように、拡散１０日目にはアルギニンの拡散先端は寒天層３９の先端部分に到達する。この測定ではアクリル樹脂を使用した装置を使用したが、先端部分３５は寒天層を保持するために隔壁としているため、当該部分は鋼体としてはたらき、アルギニンの拡散方向が先端部分３５で反射反転し、４０日目の濃度分布データーを見る限り、装置内のアルギニン濃度は均質化の傾向にある。
【００９２】
要約すると、拡散距離３インチの場合、望ましい濃度勾配は、拡散開始後１０日位まで維持できる。
【００９３】
１％グリシンを高濃度成分として含有する勾配形成寒天に使用した場合の、同一条件下での拡散の状態を図１４に示す。図１４に示すグラフは図１２に示す装置を使用して得られた結果である。
【００９４】
図１２中のパイプ３２の先端部３２ｉに１％グリシンを含む１．５％寒天層を充填固化させる（中和してｐＨ５付近）。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、0.01規定塩酸で加熱抽出後、適宜希釈して自動アミノ酸分析計でグリシンを定量した。この場合、拡散する寒天層３９は図１２中３２ｊに相当し、その長さは３インチである。
【００９５】
約１０日間で終了する微生物培養の場合は、この規格の培養器１で満足する結果が得られる。より詳しく説明すると、第１〜第３収容部１１〜１３内の寒天層２１〜２２が固化した直後に、微生物サンプルを充填室１０に播種せしめ、「そうめん流し」、あるいは「藁をも掴む方式」で、上流から拡散してきた培地成分濃度に対応して微生物のコロニーが出現する方式である。
【００９６】
あるいは、望みの濃度勾配が形成される時間まで微生物サンプルの播種をしないで待ち、その拡散時間後に微生物サンプルを播種せしめ微生物のコロニーを出現させる方式でもよい。もしくは、微生物サンプルの播種後、望みの濃度勾配が形成される時間まで培養器１を微生物の生育ができない低温下に保存し、望みの濃度勾配が形成される時間後に生育至適の温度に移し、微生物のコロニーを出現させる方式でもよい。
【実施例２】
【００９７】
前項で結果を示したように、高濃度の培地成分を含有する勾配形成寒天の成分濃度は拡散時間とともに低下し、成分の拡散の駆動力が時間経過とともに著しく減少する。さらに長時間にわたり培地成分の濃度勾配を維持するには、拡散距離を増すことにより、達成できるものである。
【００９８】
実施例１で採用した拡散距離３インチという距離は、一般的に微生物培養に用いられる市販品のシャーレが直径９センチであることから設定した長さである。そこで、拡散距離を５インチに延長して検討を行った。
【００９９】
拡散測定は図１２に示す装置を使用し、図１２中のパイプ３２の先端部３２ｉに１％アルギニン塩酸塩を含む１．５％寒天層４０を充填固化させる（中和してｐＨ５付近）。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、0.01規定塩酸で加熱抽出後、適宜希釈して自動アミノ酸分析計でアルギニンを定量した。
【０１００】
この場合、拡散する寒天層３９は図１２中パイプ３２の中間部３２ｊに相当し、その長さは５インチである。
【０１０１】
図１５は、高濃度の培地成分を含有する勾配形成寒天を０．５インチ、拡散させる寒天を５インチとして、初発濃度１％のアルギニン、拡散温度２７．５℃にした場合の、高濃度成分を含有する勾配形成寒天先端からの距離をＸ軸、その部分のアルギニン濃度をＹ軸にプロットしたグラフである。距離約１．３ｃｍの部分は高濃度成分を含有する勾配形成寒天に相当する。
【０１０２】
同図より、拡散の先端は約１５日目に到達、その後拡散方向が壁面により反射反転し、４０日目の濃度分布データーを見る限り、装置内のアルギニン濃度は実施例１で記載した拡散距離３インチと同様に均質化の傾向にある。
【０１０３】
１％グリシン、５％グリセリンおよび５％グルコースを高濃度成分として含有する勾配形成寒天に使用した場合の、同様の条件での拡散の状態を、それぞれ図１６、図１７、図１８に示す。
【０１０４】
これらの結果から、約１５日間で終了する微生物培養の場合は、この規格の培養器１で満足する結果が得られることがわかる。
【０１０５】
図１６は次のようにして得られたグラフである。
【０１０６】
拡散測定は図１２に示す装置を使用し、図１２中パイプ３２の先端部３２ｉに１％グリシンを含む１．５％寒天層を充填固化させる（中和してｐＨ５付近）。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、0.01規定塩酸で加熱抽出後、適宜希釈して自動アミノ酸分析計でグリシンを定量した。この場合、拡散する寒天層３９は図１２中３２ｊに相当し、その長さは５インチである。
【０１０７】
図１７は次のようにして得られたグラフである。
【０１０８】
拡散測定は図１２に示す装置を使用し、図１２中パイプ３２の先端部３２ｉに５％グリセリンを含む１．５％寒天層を充填固化させる。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、脱イオン水で加熱抽出後、適宜希釈して高性能液体クロマトグラフィーでグリセリンを定量した。この場合、拡散する寒天層３９は図１２中パイプ３２の中央部３２ｊに相当し、その長さは５インチである。
【０１０９】
拡散測定は図１２に示す装置を使用し、図１２中パイプ３２の先端部３２ｉに５％グルコースを含む１．５％寒天層を充填固化させる。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、脱イオン水で加熱抽出後、適宜希釈して高性能液体クロマトグラフィーでグルコースを定量した。この場合、拡散する寒天層３９は図１２中パイプ３２の中央部３２ｊに相当し、その長さは５インチである。
【実施例３】
【０１１０】
前項で示した４種の化合物の固体培地内での物質濃度分布から、この物質拡散は、最初に広い領域に一定濃度で分布した場合の拡散として捉え、解析することができる。
【０１１１】
図１９の式１（出典：バーロー物理化学（下）（第５版）、ｐ845）、D：拡散係数、C0：最初の物質濃度、ｘ：拡散距離（勾配形成寒天先端からの距離）、ｙ：勾配形成寒天の距離、ｔ：拡散時間。この積分は、同図式（２）にしめす誤差関数積分の式にすることにより、拡散係数Dを算出することができる。
【０１１２】
実施例２にて説明した図１５（アルギニン）の測定データーを、市販数値解析ソフトMapleを使用して同誤差関数積分式（２）で拡散係数Dを算出した。図２０に示すアルギニンの場合、勾配形成寒天からの距離が近いほど、また拡散時間が長くなるほど拡散係数Dの値が変動するが、あるポイントから一定の値に収斂することが判明した。この収斂部分の測定値から、アルギニンの同条件下での拡散係数D は７．３４×１０−６±２．３６×１０−７ ｍ２／ｓ（ｎ＝８６、Ｃ．Ｖ．＝３．２％）となる。１％グリシン、５％グリセリンおよび５％グルコースを高濃度物質として含有する勾配形成寒天に使用した場合、同様の算出方法で拡散係数Dを求めた。
【０１１３】
それぞれ図２１、図２２、図２３に示す結果が得られ、アルギニンと同様に計算値の収斂部分から、グリシン：Ｄ＝１．０７×１０−５±４．７６×１０−７ｍ２／ｓ （ｎ＝９１、 Ｃ．Ｖ．＝４．４％）；グリセリン；Ｄ＝９．１６×１０−６±４．３２×１０−７ｍ２／ｓ （ｎ＝２００、 Ｃ．Ｖ．＝４．２％）；グルコース；Ｄ＝５．３６×１０−６±１．７２×１０−７ｍ２／ｓ （ｎ＝１３４、 Ｃ．Ｖ．＝３．１％）と算出することができた。
【実施例４】
【０１１４】
実施例３に記載した４種の化合物について、算出できた拡散係数を用いて、それぞれの拡散時間および拡散距離での成分濃度（理論値）を、図１９の式（２）で算出することができる。アルギニンの場合の、理論値と実測値を比較した結果を、図２４に示す。
【０１１５】
同図から、拡散時間１５日目までは理論値と実測値の良好な一致が認められ、拡散係数算出の誤差関数積分式が妥当なものであることを検証した。実施例３で示した他三種の物質についても、図２５（グリシン）、図２６（グリセリン）および図２７（グルコース）に示すように、理論値と実測値の良好な一致が認められる。
【実施例５】
【０１１６】
実施例４で述べたように、拡散物質の先端が容器壁に達するまでの拡散時間内では、拡散係数算出の誤差関数積分式が妥当なものであることを実証した。これまで述べた実施例は、勾配形成寒天のアルギニン濃度を１％で示したものである。この濃度設定は、一般に微生物培養の常識より設定したものであるが、低栄養微生物を標的にするなど、目的の実験のよってはさらに異なった濃度勾配パターンの設定が望ましい場合がある。そこで拡散係数算出の誤差関数積分式で初発濃度を5倍段階でシミュレーションした結果、図２８に示す結果が得られた。
【０１１７】
拡散係数は初発濃度により、わずか変化すると予想されるものの、このようなシミュレーションは本発明を実施するに当たり必要な目安となる。
【実施例６】
【０１１８】
前述してきたように、拡散物質の先端が容器壁に達するまでの拡散時間内では理論値と実測値の良き一致が認められるが、その後実測値は理論値より高くなる。この現象は、実施例２に記述したように、拡散方向が容器壁で反射反転し、折り返してくるものと推測する。もし、容器壁に拡散物質の抜け道を用意すれば、濃度勾配のさらに長時間の維持ができると推測した。そのために、透析膜を壁の代わりに設置し、拡散してくる物質を透析膜の外側を循環させる水で除くシステムを設定した（透析機能付き拡散とよぶ）。
【０１１９】
図２９にその測定装置の概念図を示す。
【０１２０】
この装置は、寒天が充填されるパイプ４２と、該パイプ４２の上端に固定された透析膜４４と、を有し、該パイプ４２の上端部はホルダー４６の下面に形成された筒部４８に接続されている。該筒部４８には透析チャンバー５０が形成されている。図中５２は透析水入り口、５４は透析水出口、５６は拡散寒天、５８は培地成分（拡散物質）を含有する勾配形成寒天である。５８に充填した寒天の拡散寒天５６に接触していない面は、サランラップ（登録商標）で封じた。
【０１２１】
この装置を用いて、約１ｍｌの容積の透析チャンバー５０内に、一日あたり約５００ｍｌの透析水を連続通液した結果、拡散物質としてグリセリンの場合、図３０に示すように、３０日以上にわたり拡散反射を有意に抑制することができる。
【０１２２】
この連続通液速度は約５００ｍｌとしたが、これに限定されることなく、個々の拡散物質の種類あるいは採用した濃度などで、適宜、個別に実験で求めることができる。
【０１２３】
この実施例では、生化学分野で使用される蛋白質脱塩に用いられるセルロース系素材の膜を透析膜４４として使用したが、これに限定されたものでなく、素材が半透膜なら何を使用してもよく、さらに効率のよい不織布あるいは中空糸膜もしくはナイロンメッシュシートなどの使用を例示することができる。
【実施例７】
【０１２４】
前項で述べた透析機能付き拡散は、拡散の先端での物質の折返しを有意に抑制できる。
【０１２５】
本発明の物質拡散のもう一つの問題点として、高濃度成分として含有する勾配形成寒天に近い部分の寒天内濃度は、拡散時間が長くなるにつれて低下することである（実施例１で説明した図１３〜１４、実施例２で説明した図１５〜１８）。
【０１２６】
これは、言い換えれば、高濃度成分を含有する勾配形成寒天の成分濃度は拡散時間とともに低下し、成分の拡散の駆動力が時間経過とともに著しく減少する点にある。拡散駆動力は高濃度成分を含有する勾配形成寒天の成分濃度に依存することより、勾配形成寒天を一定濃度の溶液に変えることにより駆動力を維持できる。
【０１２７】
この方式を還流機能付き拡散と本発明者らは呼称するが、実施例６で述べた透析機能とあわせて、濃度勾配を作成することもできる。
【０１２８】
図３１に装置図を示す。
【０１２９】
この装置は、拡散寒天５６が充填されるパイプ４２と、該パイプ４２の上端に固定された透析膜４４とを有し、パイプ４２の上端部はホルダー４６の下面に形成された筒部４８に接続されている。該筒部４８には透析チャンバー５０が形成されている。パイプ４２の下端部には、培地成分の入口７５、培地成分の出口７６がそれぞれ形成されている。なお、図中５２は透析水入り口、５４は透析水出口である。
【０１３０】
勾配形成寒天５６の空間は内径１ｃｍのパイプ４２で約１ｍｌの容積を占める。この部分に２０倍容の拡散物質溶液を還流させる（一日当たり約５０ｍｌの送液速度）。
【０１３１】
グリセリンを用いた拡散実験の例を図３２に示す。拡散先端が容器先端に到達する日数が、還流を行わない場合に約１５日要していたのに対して（図１６参照）、１０日に短縮されるとともに、高い濃度勾配の維持形成に有効である。この送液速度は約５０ｍｌとしたが、これに限定されることなく、個々の拡散物質の種類あるいは採用した濃度などで、適宜、個別に実験で求めることができる。
【実施例８】
【０１３２】
これまで記載した実施例より、モデル化合物４種の寒天内拡散の定量的把握から、拡散係数を求め実測値との一致を検証した。
【０１３３】
この結果から、本発明者らは、透析機能や還流機能を具備する装置を完成した。ここで、本発明者らは物質拡散の制御する第３番目の方法を提案する。寒天内の拡散現象は、寒天内を物質が滲みこむように移動すると漠然と推測していたが、むしろ波動が伝播すると考えると理解しやすいことを知った。拡散をコントロールする方法を発明した。
【０１３４】
図１２に示す拡散測定装置を用い、拡散させる寒天３９と高濃度成分を含有する勾配形成寒天４０の間に、厚み２ｍｍの円盤（図示せず）をレフレクターとして設置し、円盤中央部に一定口径の開口部を空けて拡散の状況を調べた。このとき用いた拡散物質は０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、拡散時間５日のデーターを図３４に示す。
【０１３５】
同図よりレフレクターがない場合と比較すると、開口径に依存して拡散が抑えられ、１２〜４８時間の拡散位置まで拡散先端が到達していないことが分かる。
【０１３６】
なお、図３３は、３つの収容部を有する丸型培養器に還流・透析機能を付与した培養装置Ａの斜視図である。
【０１３７】
この培養装置Ａは、底を有する筒体６２と、該筒体６２内に配置されたリング状の半透膜６４と、筒体６２の周壁と該半透膜６４との間に配置された複数のスペーサー６６と、を有する。
【０１３８】
筒体６２と、半透膜６４と、各スペーサー６６とで３つの収容部６７〜６９が形成されている。また、これらの収容部６７〜６９と対向する位置において筒体６２の周壁に透析水用の透析チャンバー７０が形成されている。これら収容部６７〜６９および７０は、密閉された空間を形成する。
【０１３９】
上記収容部６７〜６９には、それぞれ培地成分を含有する勾配形成成分溶液が供給され、透析チャンバー７０には透析水が供給される。
【０１４０】
すなわち、各収容部６７〜６９には、培地成分溶液を還流するための流入口と流出口がそれぞれ形成されている。また、透析チャンバー７０には透析水の流入口と流出口が形成されている。
【０１４１】
培養装置Ａの中央部に形成されている充填室６３に、微生物試料の寒天を充填し固化させると共に、各収容部６７〜６９に、第１〜第３の培地成分を含有する勾配形成成分溶液を供給して還流し、また透析チャンバー７０に透析水を供給して還流する。
【０１４２】
各収容部６７〜６９から第１〜第３の成分が充填室６３内に充填した寒天層に拡散し、該寒天層から各成分が透析チャンバー７０の透析水によって排出される。
【０１４３】
この培養装置Ａによれば、物質拡散を定常状態とすることができるから、培養時間が経過した場合でも、ある地点において一定の培養条件を長時間保つことができる。
【０１４４】
なお、収容部６７〜６９および透析水を通液する透析チャンバー７０は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。この図面には示されていないが、これを覆う蓋が付属する。
【実施例９】
【０１４５】
（ｐＨ勾配培養法）
乳酸菌は通性嫌気性菌であるために、他の好気性菌が増殖しにくい嫌気に近い条件下で培養する。本実施例では、連続的なｐＨ条件を嫌気に近い条件で設定するためにｐＨ３．０〜５．０勾配下でビニールチューブを用いた培養を行う。
【０１４６】
培養器７４は、図３５〜３６に示すように、市販のビニールチューブを所定寸法に切断して得られる菅体７１と、該菅体７１の両端部の開口部に栓をするシリコーン製の蓋７２と、を備えている。管体７１の開口部に栓をした状態で培養器７４をガス滅菌して用いた。
【０１４７】
基本培地にはBCP（ブロムクレゾールパープル）加プレート寒天培地（日水製薬）を用いた。
【０１４８】
培地はｐＨ調製のためにｐＨ３．０、３．５、４．０、４．５、５．０の２倍濃度Mcllvainebuffer（クエン酸とリン酸塩を基本としたもの）もしくは２倍濃度Britton-Robinson buffer（リン酸、酢酸およびホウ酸を基本としたもの）5ｍｌと２倍濃度BCP培地５ｍｌをオートクレーブで別滅菌したものをクリーンベンチ内で混合し、全量１０ｍｌを図３６に示すように、下部から重層して作成した。
【０１４９】
ｐＨ測定はチューブ内の寒天を押しだし、下部（酸性側）から０．５ｃｍ刻みにｐＨ測定した。なお、ｐＨメーターは、ラコムテスターｐＨ計（突き刺し電極・防水型）を用いた。
【０１５０】
上記のように調製したｐＨ勾配培地の５０℃におけるｐＨ変化を測定した結果、Mcllvaine bufferおよびBritton-Robinson bufferのいずれの場合においても、２４時間後、４８時間後でｐＨが安定していた（図３７、３８）。このことから、本培養系で乳酸菌の分離に十分なｐＨ勾配環境ができていると考えられた。
【０１５１】
この方法によれば、通常のスクリーニングでは分離できなかった菌株の自然界から分離することができる。特に、高温性乳酸菌のスクリーニング技術を提供することができる。
【０１５２】
また、１回の培養で、連続的なｐＨ条件を嫌気に近い条件で設定することができる。
【実施例１０】
【０１５３】
（酸素、炭酸ガスからなる二次元濃度勾配培養法）
本実施例では難培養性微生物の増殖因子としてガスに注目し、溶存酸素および溶存炭酸ガス濃度勾配をつけた培養装置Ａを開発した。
【０１５４】
そのために以下の図３９〜４０のような溶存ガス勾配をもつ装置を作製した。
【０１５５】
溶存酸素濃度は光ファイバー型酸素センサーを用いて測定した。溶存炭酸ガス濃度測定のために、種々の溶存炭酸ガスを含むLB培地のｐＨを測定し、溶存炭酸ガス濃度を検量線（図４１）から計算した。
【０１５６】
試作した装置の概略を図３９〜４０に示す。
【０１５７】
図３９に示すように、円筒型の培養装置Ａの中央部に炭酸ガスを供給すれば、炭酸ガスはその中心から同心円方向に拡散するので濃度勾配がつけられる。図４０に示すように、酸素を培養装置Ａの上部に供給することにより、酸素はその上部から下方に拡散するので酸素の濃度勾配がつけられる。
【０１５８】
培養装置Ａの具体例を図４２および図４３に示す。
【０１５９】
この培養装置Ａは、上端部および下端部が蓋にて閉塞された円筒形の本体８０の中央部に炭酸ガスを導入する炭酸ガス導入管８１が配設され、本体８０の上部の空間部８２内に空気を導入する空気導入菅８３が配設されている。また、空間部８２内の空気を排気する空気排気菅８４が配設されている。
【０１６０】
炭酸ガス導入管８１および空気導入菅８３は、それぞれ多孔性の膜を用いて形成されている。そのため、炭酸ガス導入管８１および空気導入菅８３の細孔を通してそれぞれ炭酸ガスおよび空気は外部へ漏れる。
【０１６１】
培養装置Ａの本体８０内に寒天培地８５を充填し、炭酸ガス導入管８１および空気導入菅８３からそれぞれ炭酸ガスおよび空気を供給し、所定時間が経過すると、図４３の矢印で示すように、寒天培地８５の中央部では周辺部に比べて炭酸ガス濃度が高くなり、かつ寒天培地８５の上部では下部に比べて酸素濃度が高くなる。
【０１６２】
図４１は溶存炭酸ガス濃度検量線を示したものである。
【０１６３】
ＬＢ培地に炭酸ガスを吹き込み、種々の溶液を作成した。これらの溶液のｐＨをｐＨガラス電極、溶存炭酸ガスは炭酸ガスセンサーを用いて測定した。
（１）溶存酸素濃度勾配： 培養装置Ａ空間部の体積６５ｍｌに空気の通気量２２５ｍｌ／分で一日通気し、その後通気を止めることにより一日目から三日目までほぼ定常状態に保たれていた。溶存酸素濃度範囲は０．４ｍｇ／ｌから８５ｍｇ／ｌであった（図４４）。図４４は、溶存酸素濃度勾配の形成状態を示す。
【０１６４】
２つの図は独立して行った２回の実験結果を示している（図４４−４５）。
（２）溶存炭酸ガス濃度勾配： 炭酸ガスを連続通気した場合の溶存炭酸ガス濃度勾配は、１日目では培地の深さに対して安定していた。３日目では培地の深さによって濃度差が出た。濃度差の範囲は、 10％炭酸ガス通気では６８ｍｇ／ｌ〜１２０ｍｇ／ｌとなり、２０％炭酸ガス通気では９２ｍｇ／ｌ〜１８５ｍｇ／ｌであった（図４６−４７）。
図４６は、１０％炭酸ガス通気の場合、図４７は２０％炭酸ガス通気した場合の溶存炭酸ガス濃度勾配を示す。
【０１６５】
炭酸ガスと窒素ガスの混合ガスを通気した。図４６中、○の連続線（緑色線）は１％炭酸ガスを１日通気した場合；赤色線：通気１日；青色線：通気３日の場合を示す。
（結論） ３次元空間において溶存炭酸ガスと酸素の濃度勾配をＸ−Ｙ平面およびＺ軸方向に作成できる培養装置Ａは、溶存ガスの勾配に対して応答する微生物のスクリーニングに有用である。
【実施例１１】
【０１６６】
（酸化還元電位（ＯＲＰ）匂配の形成法）
微生物の純粋分離培養法が確立されて以来、微生物学の中心は分離培養可能な単一微生物種を基に成り立ち、分離培養された微生物は広範囲な産業分野において我々に多大な貢献を果たしてきた。
【０１６７】
しかし、“生きてはいるが培養できない”微生物が、自然環境中の大部分の微生物の本来の姿であることが広く認知されつつあり、病原微生物，食品微生物，土壌微生物，環境微生物を含む微生物学全般の大きな課題として浮かび上がってきた。パスツール，コッホ以来の伝統的な手法では、栄養源を含有する平板寒天培地にコロニーを形成させ、分離・培養された微生物を研究や応用の対象とした。
【０１６８】
しかし、このような手法で取り扱い可能な微生物種は１％前後にすぎず、例えば土壌微生物でわずか０．３％、海洋微生物に至っては０．００１％と言われている。この大きな原因は、余りに多くの培養因子（培養温度, 培地組成, ｐＨなど）がある為である。
【０１６９】
自然界において、微生物が存在している環境の酸化還元電位（ｏｘｉｄａｔｉｏｎｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＯＲＰ）は一般的には、Ｏ２(＋８１０ｍＶ)〜Ｈ２(−４２０ｍＶ)の間の値を示し、生息している微生物の種類もＯＲＰの値によって異なる場合が多く、一般的にＯＲＰが低くければ嫌気度が高く、高ければ好気的であると言える。
【０１７０】
ＯＲＰを形成させるには酸化還元剤及び空気酸化による手法を用いるのが一般的である。本発明のように、電気化学的手法を用いてＯＲＰ勾配を形成させる方法では、酸化剤及び空気酸化による手法よりも迅速かつ長時間に亘り、良好にＯＲＰ勾配を形成・維持できると示唆される。ＯＲＰ勾配を形成させることで分離条件を「点」から「線」へと多次元化することを可能にし、培養できない微生物の数パーセントを純粋培養できる可能性があると考えられる。また、この技術による微生物探索の方法論が確立すれば、微生物を活用した産業の規模は現在の数倍になることが予測される。
【０１７１】
微生物培養のＯＲＰを制御する方法としては、酸化剤と還元剤を組合せて任意のＯＲＰに認定することは可能であるが、時間の経過と共に変化する。その為、一般には自然環境下で結果的には目的とするＯＲＰが形成されている場所を探索し、その場所に生息している微生物を採取する方法が採られている。但し、この方法では自然環境では形成されないと考えられる特殊なＯＲＰ下で生息・増殖できる特異な微生物を探索するのは非常に困難であり、簡便且効率的な方法は見当たらない。
【０１７２】
そこで、本実施例では電気化学的手法を用いて人為的にＯＲＰ勾配を形成し、特殊なＯＲＰ環境下で生育できる微生物を分離することを目的とする。更に、ＯＲＰを酸化還元色素の色の変化だけでなく、数値で確認するために針状白金電極と比較電極を作製し、実際にそれを用いて実験を行う。
【０１７３】
図４８は電気化学的手法を用いたＯＲＰ勾配形成の模式図である。
【０１７４】
一般には空気の存在下で微生物を探索することが多いので、還元剤は空気酸化され、ＯＲＰは徐々に上昇してくる。このように、常時ほぼ一定のＯＲＰを維持するには、適宜還元剤あるいは/または酸化剤を添加し続けなければならないので、結果的には薬剤の過剰添加により、微生物の増殖が抑制され、本来探索したい特定ＯＲＰ環境下で生息できる微生物を採取することができないことが課題となっている。
【０１７５】
上記課題を解決するために、本発明では、ＯＲＰ制御の手段として、連続かつ随時供給が可能であり、自動制御が容易である電気化学的方法を選択した。
【０１７６】
このシステムは、図５０に示すように、微生物探索試料９１を入れる閉鎖系容器９２と、該容器９２の開口部から試料９１内に挿入設置された陽電極９３および陰電極９４と、容器９２の開口部を塞ぐゴム栓９５と、を備えている。
【０１７７】
該陽電極９３および陰電極９４は導電線９６を介して電圧可変直流電源９７に接続されている。
【０１７８】
不溶性の陽極９３と陰極９４間に直流電圧を印加し、目的によって任意の電圧を設定して通電する。これにより電気化学的な陽極の酸化力と陰極の還元力を随時微生物の生息環境に供給することができると共に、過剰に酸化力・還元力が蓄積しないように、定点に設置したモニターＯＲＰ電極の設定値を外れると供給電力がＯＮ，ＯＦＦするというＯＲＰ制御が可能となる。
【０１７９】
本実施例の特徴は以下の通りである。
項目１．微生物の培養環境に陽極および陰極をそれぞれ挿入し、両極間に電圧を印加する工程、および両電極表面または両電極間の任意の場所にコロニーを形成した微生物を探索する工程、を包含する、微生物のスクリーニング方法。
項目２．請求項１を効率化する為に、さらに、適宜酸化還元色素を微生物の培養環境に添加する工程、を包含する。
【０１８０】
本発明システムを利用することによって、微生物生息環境に任意のＯＲＰ環境を形成させ、従来の自然環境下では形成されない特殊なＯＲＰ環境でも生息／増殖可能な微生物が分離できれば、未知あるいは／または高付加価値の物質・酵素などを生産する能力をもつ有用な微生物の探索が容易かつ効率的に実現できる。
【０１８１】
ＯＲＰ制御あるいは/またはＯＲＰ匂配形成効率を最良にするためには、微生物の増殖に悪い影響を与えない微量（０.０１〜１０ｍＭ程度）の酸化還元色素（例えば、メチレンブルー、メチルビオロゲン、ベンジルビオロゲン、ニュートラルレッド、ヤヌスグリーン、チオニン、o−フェナンスロリン、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム等）を電子運搬体（エレクトロンキャリア）として環境中に共存させると良い。
（実験例）
脱イオン水１００ｍｌに１．５％量になるよう寒天末を添加し、融解させた。寒天が融解した後、寒天が凝固する前にフェリシアン化カリウム溶液とフェロシアン化カリウム溶液をそれぞれ１００ｍＭになるようそれぞれ添加した。
【０１８２】
開放型容器の半分にフェロシアン化カリウムの寒天を流し込んだ。
【０１８３】
寒天が凝固した後、次にフェリシアン化カリウムの寒天を流し込んだ。陽極と陰極の電極間距離が２８８ｍｍになるように寒天ゲルに挿入し、２Ｖの直流電圧を印加した。針状白金電極と比較電極からなるＯＲＰ電極を一定間隔毎に順次挿入し、１時間後のＯＲＰを測定した。
【０１８４】
また、閉鎖型のアクリル管も同様の手順で測定した。測定の結果、この条件で通電を行うと、図４９に示すような酸化還元剤の組み合わせ法によってＯＲＰ匂配を形成するのに２８８時間必要であるが、本発明の方法ではほぼ１時間で同様のＯＲＰ匂配の形成が可能となった。
【０１８５】
開放型容器の方が閉鎖型アクリル管と比較し、高いＯＲＰ値を示すことが確認された。
【０１８６】
これは空気酸化と容器の大きさによる影響が示唆された。測定の結果、開放型容器の方が閉鎖型アクリル管と比較し、より拡散が進行し電位が上がっていることが確認できた。これは空気酸化と容器の大きさによる影響が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本原理を利用して、一般の微生物が生息できないような特殊なＯＲＰ環境下に生育可能な微生物は、特別な代謝システム、酵素等を有し、特殊な物質を生産する可能性を有していると考えられる。また、微生物が生息しない（またはしにくい）ＯＲＰ環境域では、微生物の増殖が抑制されていることを意味している。
【０１８８】
以上のような事実から、1）特殊微生物を探索・活用すれば、未知の物質および/または高付加価値物質を生産できる能力を有している可能性がある。２）微生物の増殖抑制ＯＲＰ域を常時形成することにより、食品、飲料水その他水分を含む様々な物品や自然環境下での微生物の増殖制御が比較的容易に実現することができる。
【０１８９】
また、本発明の対向型多次元勾配微生物培養装置は、例えば、有用微生物を始めとするあらゆる種類の微生物の自然界や検体サンプルからの探索分離、微生物の生育特性の簡単かつ網羅的解析、微生物の有用物質生産条件の網羅的解析、など複雑な培養条件の網羅的設定が必要なあらゆる実験に利用できるとともに、各種のバイオ関連産業上の幅広い用途に利用ができる。特に、動物細胞培養、植物組織培養に応用できるとともに、特定の物質の微生物・動物細胞・植物細胞への効果など複数の条件下での検討などの用途に活用することができる。
【符号の説明】
【０１９０】
１ 培養器
１０ 充填室
１１ 第１収容部
１２ 第２収容部
１３ 第３収容部
１４ 第１の仕切板
１５ 第２の仕切板
１６ 第３の仕切板
２１ 第１の寒天層
２２ 第２の寒天層
２３ 第３の寒天層
２４ 中央の寒天層
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体培地で微生物培養や希釈平板培養を行う場合、固体培地内に栄養成分の勾配あるいは生育条件の勾配を発生させる装置に関するもので、更に詳しくは、培養条件を異なる勾配に制御あるいは予測できる培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
Robert Kochが1881年にゼラチン平板培養法を開発して以来、この純粋分離法によって応用微生物学が発展してきたと言っても過言ではない。この技術では、環境中に存在する微生物の１％以下しか分離できないと古くから言われている。
【０００３】
近年、微生物の分離培養を経ないで、環境中から直接DNAを単離し、遺伝子レベルから微生物叢の解析が可能になり、この分離できない微生物集団の中にVBNC(ViableBut Nonculturable)と名づけられた、これまで知られていない微生物群がにわかに注目されるようになってきた。
【０００４】
しかし、依然としてこれら９９％の分離できない微生物の全体像は謎につつまれたまま放置されている。この大きな原因は、余りに多くの培養因子（溶存酸素濃度、炭酸ガス濃度、酸化還元電位、培養温度、培地成分濃度、塩濃度、培地ｐＨなど）があるために、残り９９％の微生物を分離できるようにするためには、莫大な時間と人手のかかる仕事が予想され、宝の山を目の前にして、躊躇しているのが現状である。
【０００５】
近年、遺伝子工学の進歩により、応用微生物学分野でも遺伝子から出発する研究が多く、このような研究が先端的であると考えられる風潮にある。昔ながらの微生物のスクリーニング法で新しい微生物資源を探索し、応用しようとする研究は時間の掛かる、多くの人手が必要な、古臭い研究であると考えられがちである。
【０００６】
しかし、新しい遺伝子資源を掘り起こすためにも、微生物のスクリーニングをもう一度見直す必要があると発明者らは考えている。ちなみに堀越らは、ｐＨ一つをアルカリ側に移動させるだけで、「アルカリ世界」という新しい微生物世界の存在を我々に示し、新しい遺伝子資源の一端を垣間見せてくれた。しかし、あいかわらず、土壌中に生息する微生物の全体像はベールに包まれたままである。
【０００７】
一方、自然界からの微生物分離に関してみてみると、Kochから堀越までの培養条件はあいかわらず「点」であり、本発明者らが発想した「線」から「面」へ、さらに多次元へ広げようとする考えは過去に全く認められない。
【０００８】
上述したように、1881年RobertKochによる『病原微生物の研究方法』なる原著論文に記載された固体培地を用いる希釈平板純粋分離法は、1887年R.J.Petriの小改良を経て、今日までほとんど同じ方法のままで使用され続けている。
【０００９】
さて、微生物研究法の歴史を述べたが、Robert Kochの弟子、Martinus W.Beijerinckが1889年に発表した「培地選定法、微生物研究に役立つゼラチン内拡散法」を取り上げねばならない。この方法はオキサノグラフ法として知られており、とくに抗生物質とビタミン研究で現在でも利用されている。ペニシリンの定量のためのAlexanderFlemingが1929年に発表した方法はまさにこのオキサノグラフ法の応用である。すなわち、検定物質が固体培地内を拡散する際の生じる濃度勾配を検定菌生育阻止で定量しようとするものである。このような固体培地内での物質拡散現象を利用し、取得既知微生物の生育特性や食品保存剤の効果などを調べる方法が幾つか提案されている。
J.W.T.Wimpenny et.al.:J.Gen.Microbiol.,130,2921-2926(1984)（非特許文献１）;
J.W.T.Wimpennyet.al.; FEMSMicrobiol.,40,263-267(1987)（非特許文献２）;
P.J.McClure,et.al.:Lett.Appl.Microbiol.,9,95-99(1989)（非特許文献３）;
A.C.Peters,et.al.:Binary,3,147-155(1991)（非特許文献４）;
K,McGrath,et.al.,Int.Biodeter.Biodegrad.,29,45-52(1992)（非特許文献５）;
F.A. Gentile et.al.:LifeSci., 50,287-293(1992)（非特許文献６）;
L.V.Thomaset.al.:Int.J.Food.Microbiol.,17,289-301(1993)（非特許文献７）;
L.V.Thomaset.al.:Appl.Environ.Microbiol.,62,2006-2012(1996)（非特許文献８）;
N.Rattanasomboonet.al.:Int.J.Food.Sci.Technol.,36,369-376(2001)（非特許文献９）；
E.Z.Panagouet.al.:Appl.Environ.Microbiol.,71,392-399(2005)）（非特許文献１０）。
【００１０】
また、これらの研究方法の延長上に、物質拡散を定常状態に達せしめんとする試みもある（D.E. Caldwell et.al.:Can.J.Microbiol.,19,53-58 (1972)（非特許文献１１））。
【００１１】
また、特開平７−１７０９７３号公報（特許文献１）には、複数種の微生物が混在する試料を比重勾配遠心で処理して、微生物を比重に応じて選別するか、該試料を電解液中で電気泳動させ、微生物の移動経路中に所定の大きさの微生物選別用のフィルターを設置して微生物を選別する方法が記載されている。
さらに、特開２００４−３２９１２２号公報（特許文献２）には、細胞の組織再生を促進するための各種の培養条件に勾配を与えた条件下で細胞培養を行って組織を形成するようにした装置が記載されている。
【００１２】
ここまで述べたオキサノグラフ法の係る微生物生育特性の解析法提案を概観するに、科学的方法論として大きな致命的欠損を指摘することができる。その問題点を提示する前に、公知技術の具体例を示す。
【００１３】
すなわち、検定物質の固体培地内へのアプライする操作は種々な形態で実施することが可能で、検体物質溶液を含浸させた濾紙片・溶液そのものをあらかじめ固化させた固体培地表面に静置する、あるいは検体物質を含む溶液を寒天などで固化せしめた後、検体物質を含まない寒天層を重層するか接触させる、もしくは検定物質を結晶・粉体の状態で寒天内に抱埋する、などの方法で拡散を開始する。
【００１４】
これらの拡散開始形態の違いはあるものの、これらの公知技術には標的物質がどのような濃度勾配をもって固体培地内を拡散するかに関して、経時的かつ定量的把握がまったくなされていないことである。ましてや、この物質拡散を制御せんとする試みは皆無である。すなわち、さらに加えて詳細に説明すると、物質拡散は物理現象であるので理論的な数値解析による拡散係数の算出ならびに、物質拡散の予測が可能と本発明者らは考えるが、上記オキサノグラフ法に関する先行技術論文には、論理的試みはまったく記載がなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】J.W.T.Wimpenny et.al.:J.Gen.Microbiol.,130,2921-2926(1984)
【非特許文献２】J.W.T.Wimpennyet.al.; FEMSMicrobiol.,40,263-267(1987)
【非特許文献３】P.J.McClure,et.al.:Lett.Appl.Microbiol.,9,95-99(1989)
【非特許文献４】A.C.Peters,et.al.:Binary,3,147-155(1991)
【非特許文献５】K,McGrath,et.al.,Int.Biodeter.Biodegrad.,29,45-52(1992)
【非特許文献６】F.A. Gentile et.al.:Life Sci., 50,287-293(1992)
【非特許文献７】L.V.Thomaset.al.:Int.J.Food.Microbiol.,17,289-301(1993)
【非特許文献８】L.V.Thomaset.al.:Appl.Environ.Microbiol.,62,2006-2012(1996)
【非特許文献９】N.Rattanasomboonet.al.:Int.J.Food.Sci.Tech-nol.,36,369-376(2001)
【非特許文献１０】E.Z.Panagou et.al.:Appl.Environ.Microbiol.,71,392-399(2005)）
【非特許文献１１】（D.E. Caldwell et.al.:Can.J.Microbiol.,19,53-58(1972)
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開平７−１７０９７３号公報
【特許文献２】特開２００４−３２９１２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、異なる培養因子を複数選択でき、これら培養因子の勾配を１つの培養器内に形成することができる微生物培養装置を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明の他の目的は、同一のシャーレなど培養器内に異なる培養因子の勾配を形成し、且つ制御できる微生物培養装置を提供することにある。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、固体培地内に栄養成分あるいは生育条件の勾配を発生させることができる微生物の培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明においては、微生物試料（検体物質）を含む溶液を寒天などで固化させた後、検体物質を含まない寒天層を接触させる方法を採用した。
【００２１】
次いで、微生物培養因子からモデル検体物質を複数選定し、これらの物質がどのように固体培地内に拡散するかを定量的に把握する実験検証により、拡散方程式を誤差関数として数値解析した。
【００２２】
さらに得られたモデル化合物の拡散係数から、実測値と理論値を比較し、寒天培地内での培地成分因子の濃度分布を推定することを目標とした。また、これら数値解析と同時に、実施形態としての培養装置を設計するとともに、培地成分因子の拡散を制御する方法を考案することにより、任意の培養条件を生みだすこととする。
【００２３】
すなわち、本発明の培養装置は、微生物試料が充填される充填室を有する培養器の側壁の一部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填し得る第１収容部が形成され、該第１収容部と培養器の充填室とは取り外し可能な第１の仕切板で仕切られ、該培養器の側壁の他部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填し得る第２収容部が形成され、該第２収容部と培養器の充填室とは取り外し可能な第２の仕切板で仕切られており、そのことにより上記目的が達成される。
【００２４】
一つの実施形態では、前記培養器の底部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第３成分を含有する第３の寒天を充填し得る第３収容部が形成されている。
【００２５】
一つの実施形態では、前記培養器は箱状に形成され、該培養器の一側壁に前記第１収容部が形成され、該第１収容部に隣接する他の側壁に前記第２収容部が形成されている。
【００２６】
一つの実施形態では、前記培養器は略円筒状に形成され、該培養器の周壁に前記第１収容部および第２収容部が形成されている。
【００２７】
一つの実施形態では、前記培養器の側壁に３以上の収容部が形成されている。
【００２８】
一つの実施形態では、前記第１の寒天と前記第２の寒天とは、培地成分濃度、塩濃度、培地ｐＨの少なくともいずれかが異なる。
【００２９】
本発明の他の培養装置は、微生物試料が充填される充填室を有する培養器の側壁の一部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の溶液を供給し得る第１収容部が形成され、該第１収容部と培養器の充填室とは半透膜で仕切られ、該培養器の側壁の他部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の溶液を供給し得る第２収容部が形成され、該第２収容部と培養器の充填室とは半透膜で仕切られており、そのことにより上記目的が達成される。
【００３０】
一つの実施形態では、前記第１収容部に前記第１の溶液の供給口と排出口がそれぞれ形成され、前記第２収容部に前記第２の溶液の供給口と排出口がそれぞれ形成されている。
【００３１】
一つの実施形態では、前記第１収容部および第２収容部と対向する位置において、前記培養器の側壁に、透析水が還流される透析チャンバーが形成されている。
【００３２】
本発明の微生物をスクリーニングする方法は、上記培養装置を用いて、微生物試料に含まれる微生物をスクリーニングする方法であって、前記培養器の側壁に形成された第１収容部内に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填して第１の寒天層を形成する工程、前記第１の仕切板を外して該第１の寒天層を培養器の充填室に露出させる工程、前記培養器の側壁に形成された第２収容部内に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填して第２の寒天層を形成する工程、前記第２の仕切板を外して該第２の寒天層を培養器の充填室に露出させる工程、および該培養器の充填室内に、微生物試料を含む流動性を有する固体培地を充填して固化させる工程、を包含し、そのことにより上記目的が達成される。
【００３３】
一つの実施形態では、前記固体培地は、第１成分および第２成分を含有しない。
【発明の効果】
【００３４】
ちなみに、本発明で開示する多次元培養法は培養因子を連続的に変化させるが、培養基内で達成される因子を非連続な勾配とみなして仮に100段とすると、三次元に展開した培養容器は100万段となる。そして、微生物の生育因子に対する許容度を因子に対応させて10段とみなせば、1個の培養容器はトラディショナルシャーレ1000枚分に匹敵すると見積もられ、本装置を用いれば有効な網羅的培養方法となるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は培養装置の概略図である。
【図２】図２は培養装置に寒天を充填した状態の概略図である。
【図３】図３は２要素勾配角型培養装置の上面図である。
【図４】図４は３要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図５】図５は４要素勾配丸型深型培養装置の断面図である。
【図６】図６は３要素勾配角型培養装置の上面図である。
【図７】図７は３要素勾配角型培養装置の上面図である。
【図８】図８は４要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図９】図９は５要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図１０】図１０は６要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図１１】図１１は７要素勾配丸型培養装置の上面図である。
【図１２】図１２は拡散測定装置の断面図を示す。
【図１３】図１３はアルギニンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離３インチ）。
【図１４】図１４はグリシンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離３インチ）。
【図１５】図１５はアルギニンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離５インチ）。
【図１６】図１６はグリシンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離５インチ）。
【図１７】図１７はグリセリンが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離５インチ）。
【図１８】図１８はグルコースが寒天内拡散する濃度分布を示す（拡散距離５インチ）。
【図１９】図１９は、拡散方程式（式（１））と本発明で解析するに用いた誤差関数積分式（式（２））の導き方を示したものである。
【図２０】図２０は、図１３ならびに図１５で示すアルギニンの濃度分布から、図１８式（２））によって求めた拡散係数Dを示すものである。
【図２１】図２１は、図１４ならびに図１６で示すグリシンの濃度分布から、図１８式（２）によって求めた拡散係数Dを示すものである。
【図２２】図２２は、図１７で示すグリセリンの濃度分布から、図１９式（２）によって求めた拡散係数Dを示すものである。
【図２３】図２３は、図１８で示すグルコースの濃度分布から、図１８式（２）によって求めた拡散係数Dを示すものである。
【図２４】図２４は、図１９の式（２）より求めたアルギニンの拡散係数Dから算出した濃度分布理論値と実測値の比較を示したものである。
【図２５】図２５は、図１９の式（２）より求めたグリシンの拡散係数Dから算出した濃度分布理論値と実測値の比較を示したものである。
【図２６】図２６は、図１９の式（２）より求めたグリセリンの拡散係数Dから算出した濃度分布理論値と実測値の比較を示したものである。
【図２７】図２７は、図１９の式（２）より求めたグルコースの拡散係数Dから算出した濃度分布理論値と実測値の比較を示したものである。
【図２８】図２８は、図１９の式（２）より求めたアルギニンの拡散係数Dから算出した種々の初発濃度C0の条件下における、拡散時間１０日目の推定濃度分布のシミュレーション結果を示す。
【図２９】図２９は、透析機能付き拡散測定装置（拡散距離５インチ）の断面図を示すものである。
【図３０】図３０は、透析機能付き拡散測定装置（拡散距離５インチ）を用いて、５％グリセリンを含む勾配形成寒天で拡散を調べた濃度分布パターンを示すものである。
【図３１】図３１は、透析機能付き、且つ勾配形成寒天の代わりに一定濃度の勾配形成成分溶液を還流する拡散測定装置（拡散距離５インチ）の断面図を示すものである。
【図３２】図３２は、透析機能付き、且つ勾配形成寒天の代わりに一定濃度の勾配形成成分溶液を還流する拡散測定装置（拡散距離５インチ）を用いて、５％グリセリンを含む勾配形成成分溶液で拡散を調べた濃度分布パターンを示すものである。
【図３３】図３３は３要素勾配丸型培養装置に還流・透析機能を付与した培養装置１の斜視図である。
【図３４】図３４は、拡散５日目に、レフレクター設置時と非設置時のリン酸緩衝液の拡散到達距離を比較したものである。
【図３５】図３５は、乳酸菌などの嫌気性菌を測定するための培養器の正面図である。
【図３６】図３６は図３５で示した培養器の断面図である。
【図３７】図３７はMcllvaine bufferを用いた場合のｐＨ勾配を示すグラフである。
【図３８】図３８はBritton-Robinson bufferを用いた場合のｐＨ勾配を示すグラフである。
【図３９】図３９は、溶存ガスの濃度勾配方向を説明するための模式図である。
【図４０】図４０は、溶存ガスの濃度勾配方向を説明するための模式図である。
【図４１】図４１は、溶存炭酸ガス濃度の検量線である。
【図４２】図４２は、培養装置の斜視図である。
【図４３】図４３は、培養装置の断面図である。
【図４４】図４４は、溶存酸素濃度勾配の形成状態を示すグラフである。
【図４５】図４５は、溶存酸素濃度勾配の形成状態を示すグラフである。
【図４６】図４６は、１０％炭酸ガス通気の場合の溶存炭酸ガス濃度勾配を示すグラフである。
【図４７】図４７は、２０％炭酸ガス通気した場合の溶存炭酸ガス濃度勾配を示すグラフである。
【図４８】図４８は、電気化学的手法を用いたＯＲＰ勾配形成の模式図である。
【図４９】図４９は、酸化還元剤の組み合わせ法によって形成せしたＯＲＰ匂配を示すグラフである。
【図５０】図５０は、電気化学的手法を用いたＯＲＰ勾配形成の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明を添付図面に基づいてより詳しく説明する。
【００３７】
図１〜図３は本発明に係る微生物培養装置Ａの概念図である。
【００３８】
この培養装置Ａは、微生物試料が充填される充填室１０を中央部に有する培養器１を備えている。該培養器１はプラスチック、ガラスなどの透明板を用いて上方が開口する箱状に形成されている。
【００３９】
該培養器１の側壁の一面に、第１成分を含有する第１の寒天を充填し得る第１収容部１１が形成され、該第１収容部１１と培養器１の充填室１０とは取り外し可能な第１の仕切板１４で仕切られている。
【００４０】
すなわち、培養器１の四隅には断面四角形のフレーム１７が固定され、一対のフレーム１７間に該第１仕切板１４が上方へスライド移動できるように配置されている。具体的には、フレーム１７に第１仕切板１４の端部を挿入する凹溝が設けられ、あるいはフレーム１７に係止片（図示せず）が設けられており、第１仕切板１４の両端部はこれらの溝又は係止片に上下移動可能に取り付けられている。
【００４１】
上記第１収容部１１に隣接する培養器１の側壁に、第２成分を含有する第２の寒天を充填し得る第２収容部１２が形成され、該第２収容部１２と培養器１の充填室１０とは取り外し可能な第２の仕切板１５で仕切られている。第２仕切板１５を培養器１に取り付ける場合も、第１仕切板１４の場合と同様に構成することができる。
【００４２】
培養器１の底面は平坦面に形成され、培養器１の底部には、第３成分を高濃度に含有する第３の寒天を充填し得る第３収容部１３が形成されている。この第３収容部１３には仕切板は不要である。
【００４３】
第１成分、第２成分、第３成分は、それぞれ微生物の培養に影響を及ぼすものであり、公知の培地成分、培地のｐＨ調製剤などがあげられる。
【００４４】
特に、(a)第１成分として窒素源化合物類、(b)第２成分として炭素源化合物類、(c)第３成分として微量塩類化合物類の組合せが好ましい。
【００４５】
第１の寒天における第１成分の濃度としては、１０〜１％程度が好ましい。
【００４６】
第２の寒天における第２成分の濃度としては、１０〜１％程度が好ましい。
【００４７】
第３の寒天における第３成分の濃度としては、0.01〜0.001％程度が好ましい。
【００４８】
培養器１の充填室１０内に充填される微生物試料とは、微生物を含む試料全てをいい、典型的には、微生物、寒天および水を含有する（固体培地ともいう）。この微生物試料は、通常は上記第１成分、第２成分および第３成分を含有しない。
【００４９】
この微生物試料は、流動性を有する状態で培養器１の充填室１０に充填される。
【００５０】
培養器１、充填室１０および収容部１１〜１３の形状、サイズ等は適宜設定することができる。また収容部の数も目的に応じて任意に設定することができる。培養器１の上端開口部には、通常蓋が取り付けられる。これらの具体例は後述する。
【００５１】
上記構成の培養装置Ａを用いて、微生物をスクリーニングするには、以下のように行うことができる。
【００５２】
本発明の培養装置Ａの第１および第２の収容部１１，１２に仕切板１４，１５を取り付けた状態で、第１収容部１１内に第１成分を含有する流動性の第１の寒天を充填して第１の寒天層２１を形成する（図２）。同様に、第２収容部１２内に第２成分を含有する流動性の第２の寒天を充填して第２の寒天層２２を形成する。また、培養器１の充填室１０の底部に第３成分を含有する流動性の第３の寒天を充填して第３の寒天層２３を形成する。
【００５３】
第１の寒天層２１、第２の寒天層２２および第３の寒天層２３の厚みは、適宜設定することができるが、例えば、それぞれ同じ厚みとすることができる。
【００５４】
第１の寒天層２１および第２の寒天層が固化した後、第１および第２の仕切板１４、１５をそれぞれ取り外す。第１の寒天層２１および第２の寒天層２２は、それぞれ培養器１の充填室１０に露出することになる。
【００５５】
次いで、培養器１の充填室１０内に、微生物試料を含む流動状態の寒天（固体培地）を充填して固化させる。
【００５６】
その後、この培養装置Ａを適当な培養温度内に静置し、充填室１０に充填された寒天層２４に微生物コロニーの出現を待つ。
【００５７】
この間、第１、第２および第３の各寒天層２１〜２３から、第１〜第３成分が充填室１０内の寒天層２４に拡散し、該中央の寒天層２４において拡散開始を起点にする経過時間に依存した第１〜第３成分の濃度勾配が形成される。その結果、「そうめん流し」、あるいは「藁をも掴む方式」で、上流から拡散してきた培地成分濃度に対応して微生物のコロニーが出現する。
【００５８】
なお、培養器１の形状は、図１に概念図として提示したものに限定されることなく、一般的に使用される丸型の形状など、いろいろな形状のものを用いることができる。代表的な形状を図４〜図１１に例示する。
【００５９】
図４に示す培養装置Ａは、有底の円筒状の培養器１の内面に３つの収容部１１〜１３を隣接して形成したものである。すなわち、培養器１の周壁の内面側にスペーサー２６を４つ固定し、該スペーサー２６の内側端部に仕切板１６をスライド可能に取り付けたものである。この仕切板１６は一枚のもので形成してもよく、あるいは各別の収容部毎に形成してもよい。
【００６０】
各収容部１１〜１３内にそれぞれ第１〜第３成分を含有する第１〜第３の寒天を充填して第１〜第３の寒天層を形成した後、仕切板１６を上方へスライドして取り外すことにより、各寒天層は培養器１の充填室１０に露出する。この充填室１０内に微生物試料を含む寒天を充填して固化させる。
【００６１】
なお、各収容部１１〜１３の位置は隣接する必要はなく、勾配形成の方向によっては、容器１内のどの位置に設置してもよい。この図面には示されていないが、これを覆う蓋９が付属する（以下の各実施例の図において同じであるので、説明を省略する。）。
【００６２】
図５に示した培養装置Ａは、図４に示した丸型培養器１を深型にしたものであり、底部に第４の収容部２８が形成され、この部分に第４の成分を含有する第４の寒天を充填固化することができる。
【００６３】
図５中、第１〜第３の収容部１１〜１３に第１〜第３の寒天を充填固化することができる。これら４種の培地成分を含有する寒天が固化した後、仕切板１６を取り除き、第１〜第４の収容部に形成された寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を培養器１の充填室１０に充填する。
【００６４】
なお、図５中、勾配形成寒天を充填固化する収容部１１〜１３は、この図面では明確に特定できないが、図４の平面図に示すように、その位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては容器１内のどの位置に設置してもよい。
【００６５】
培養器１の側壁に３以上の収容部を形成してもよい。図６は収容部を３つ有する培養装置Ａの上面図である。
【００６６】
この培養装置Ａでは、培養器１を断面６角形に形成し、その３つの壁面を仕切板１４〜１６とし、該仕切板１４〜１６に対応して培養器１の外側に断面略コ字形の壁部３０を設けたものである。
【００６７】
すなわち、第１〜第３の収容部１１〜１３は、図１〜図４に示す構成とは異なり、中央の充填室１０から外側へせり出した位置に設置した例である。
【００６８】
なお、図６中、収容部１１〜１３はこの図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、培養器１の壁面のどの位置に設置してもよい。
【００６９】
図中の収容部１１〜１３に勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１４〜１６を取り除き、収容部１１〜１３内の寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。
【００７０】
図７は収容部を３つ有する角型培養装置Ａの上面図である。
【００７１】
この培養装置Ａでは、培養器１を断面６角形に形成し、その３つの壁面を仕切板１４〜１６とし、該仕切板１４〜１６に対応して培養器１の外側に断面略コ字形の壁部３０を設けたものである。
【００７２】
すなわち、収容部１１〜１３は、図１〜図４に示す構成とは異なり、図６と同様に、培養器１の充填室１０から外側へせり出した位置に設置したものである。
【００７３】
なお、図中、第１〜第３の収容部１１〜１３は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、培養器１の側面のどの位置に設置してもよい。
【００７４】
図中第１〜第３の収容部１１〜１３には勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１４〜１６を取り除き、第１〜第３の収容部１１〜１３の寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。
【００７５】
図８は収容部を４つ有するほぼ丸型培養装置Ａの上面図である。
【００７６】
この培養装置Ａは、断面８角形に形成された培養器１の内面側に断面略コ字形の仕切板１９を上方へスライド可能に取り付けたものである。
【００７７】
すなわち、図中第１〜第４の収容部１１〜１３、２８に、勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１９を培養器１から取り除き、第１〜第４の収容部１１〜１３、２８内にそれぞれ形成された寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０へ充填する。なお、図中第１〜第４の収容部１１〜１３、２８は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、所望とする勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。
【００７８】
図９は収容部を５つ有するほぼ丸型培養装置Ａの上面図である。
【００７９】
図中、第１〜第５の収容部に勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１９を取り除き、第１〜第５の収容部に形成された寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。
【００８０】
なお、図中第１〜第５の収容部は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。
【００８１】
図１０は６つの収容部を有する丸型培養器１の上面図である。
【００８２】
第１〜第６の収容部に、勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板１９を取り除き、第１〜第６の収容部に形成された寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。
【００８３】
なお、図中勾配形成寒天を充填固化する第１〜第６の収容部は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。
【００８４】
図１１は７つの収容部を有する丸型培養器１の上面図である。図中第１〜第７の収容部に、勾配形成寒天を充填固化する。固化後、仕切板を取り除き、第１〜第７の収容部に形成した寒天層に含まれないその他培養成分あるいは任意の成分を含んだ寒天を充填室１０に充填する。なお、図中第１〜第７の収容部は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。
【実施例１】
【００８５】
以上述べた本発明の微生物培養装置Ａにおいて、培地成分を含有する寒天から成分がどのような濃度勾配を以って拡散するかを調べた測定結果を提示し、先行技術で明確に示されていない固体培地内での物質拡散の濃度分布の全貌を明らかにする。
【００８６】
図１〜図１１に例示した培養器１内では、物質拡散は収容部から直線方向だけでなくある程度の角度を持って扇状に拡散すると予想されるので、拡散の定量的把握の検討のために、図１２に示す装置を用いた。
【００８７】
この測定装置３は、寒天を充填し得るパイプ３２と、該パイプ３２の一端部内に挿入される挿通棒３４と、を有する。パイプ３２の一端部にはネジ溝３６が形成され、挿通棒３４の一部がこのネジ溝３６に螺合することで、挿通棒３４を回転することにより、該挿通棒３４がパイプ３２内を移動できるように構成されている。
【００８８】
すなわち、一定の内径を持ったパイプ３２内で、拡散させる寒天３９と高濃度の培地成分を含有する勾配形成寒天４０を接触させて固化させ、一定の拡散時間の後、パイプ３２の後部に設置した繰り出し機構３８で寒天層を繰り出すと共に、２ミリ間隔で該寒天層を切り出し、各部分の成分濃度を測定する。なお、寒天４０の寒天３９と接触していない面は、実験期間内での乾燥を防止するために、サランラップ（登録商標）などを用いて封じた。
【００８９】
具体的には、パイプ３２の先端部３２ｉに１％アルギニン塩酸塩を含む１．５％寒天を充填（中和してｐＨ５付近）した。拡散温度２７．５℃、所定の時間経過した後に、上記のようにして、２ミリ厚に寒天層をスライスし、0.01規定塩酸で加熱抽出後、適宜希釈して自動アミノ酸分析計でアルギニンを定量した。この場合、拡散する寒天層３９はパイプ３２の中央部３２ｊに相当し、その長さは３インチである。
【００９０】
図１３は、培地成分を含有する勾配形成寒天４０を０．５インチ、拡散させる寒天３９を３インチとして、初発濃度１％のアルギニン塩酸塩、拡散温度２７．５℃にした場合の、培地成分を含有する勾配形成寒天先端からの距離をＸ軸、その部分のアルギニン濃度をＹ軸にプロットしたグラフである。
【００９１】
距離約１．３ｃｍの部分は培地成分を含有する勾配形成寒天４０に相当する。同図から見て取れるように、拡散１０日目にはアルギニンの拡散先端は寒天層３９の先端部分に到達する。この測定ではアクリル樹脂を使用した装置を使用したが、先端部分３５は寒天層を保持するために隔壁としているため、当該部分は鋼体としてはたらき、アルギニンの拡散方向が先端部分３５で反射反転し、４０日目の濃度分布データーを見る限り、装置内のアルギニン濃度は均質化の傾向にある。
【００９２】
要約すると、拡散距離３インチの場合、望ましい濃度勾配は、拡散開始後１０日位まで維持できる。
【００９３】
１％グリシンを高濃度成分として含有する勾配形成寒天に使用した場合の、同一条件下での拡散の状態を図１４に示す。図１４に示すグラフは図１２に示す装置を使用して得られた結果である。
【００９４】
図１２中のパイプ３２の先端部３２ｉに１％グリシンを含む１．５％寒天層を充填固化させる（中和してｐＨ５付近）。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、0.01規定塩酸で加熱抽出後、適宜希釈して自動アミノ酸分析計でグリシンを定量した。この場合、拡散する寒天層３９は図１２中３２ｊに相当し、その長さは３インチである。
【００９５】
約１０日間で終了する微生物培養の場合は、この規格の培養器１で満足する結果が得られる。より詳しく説明すると、第１〜第３収容部１１〜１３内の寒天層２１〜２２が固化した直後に、微生物サンプルを充填室１０に播種せしめ、「そうめん流し」、あるいは「藁をも掴む方式」で、上流から拡散してきた培地成分濃度に対応して微生物のコロニーが出現する方式である。
【００９６】
あるいは、望みの濃度勾配が形成される時間まで微生物サンプルの播種をしないで待ち、その拡散時間後に微生物サンプルを播種せしめ微生物のコロニーを出現させる方式でもよい。もしくは、微生物サンプルの播種後、望みの濃度勾配が形成される時間まで培養器１を微生物の生育ができない低温下に保存し、望みの濃度勾配が形成される時間後に生育至適の温度に移し、微生物のコロニーを出現させる方式でもよい。
【実施例２】
【００９７】
前項で結果を示したように、高濃度の培地成分を含有する勾配形成寒天の成分濃度は拡散時間とともに低下し、成分の拡散の駆動力が時間経過とともに著しく減少する。さらに長時間にわたり培地成分の濃度勾配を維持するには、拡散距離を増すことにより、達成できるものである。
【００９８】
実施例１で採用した拡散距離３インチという距離は、一般的に微生物培養に用いられる市販品のシャーレが直径９センチであることから設定した長さである。そこで、拡散距離を５インチに延長して検討を行った。
【００９９】
拡散測定は図１２に示す装置を使用し、図１２中のパイプ３２の先端部３２ｉに１％アルギニン塩酸塩を含む１．５％寒天層４０を充填固化させる（中和してｐＨ５付近）。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、0.01規定塩酸で加熱抽出後、適宜希釈して自動アミノ酸分析計でアルギニンを定量した。
【０１００】
この場合、拡散する寒天層３９は図１２中パイプ３２の中間部３２ｊに相当し、その長さは５インチである。
【０１０１】
図１５は、高濃度の培地成分を含有する勾配形成寒天を０．５インチ、拡散させる寒天を５インチとして、初発濃度１％のアルギニン、拡散温度２７．５℃にした場合の、高濃度成分を含有する勾配形成寒天先端からの距離をＸ軸、その部分のアルギニン濃度をＹ軸にプロットしたグラフである。距離約１．３ｃｍの部分は高濃度成分を含有する勾配形成寒天に相当する。
【０１０２】
同図より、拡散の先端は約１５日目に到達、その後拡散方向が壁面により反射反転し、４０日目の濃度分布データーを見る限り、装置内のアルギニン濃度は実施例１で記載した拡散距離３インチと同様に均質化の傾向にある。
【０１０３】
１％グリシン、５％グリセリンおよび５％グルコースを高濃度成分として含有する勾配形成寒天に使用した場合の、同様の条件での拡散の状態を、それぞれ図１６、図１７、図１８に示す。
【０１０４】
これらの結果から、約１５日間で終了する微生物培養の場合は、この規格の培養器１で満足する結果が得られることがわかる。
【０１０５】
図１６は次のようにして得られたグラフである。
【０１０６】
拡散測定は図１２に示す装置を使用し、図１２中パイプ３２の先端部３２ｉに１％グリシンを含む１．５％寒天層を充填固化させる（中和してｐＨ５付近）。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、0.01規定塩酸で加熱抽出後、適宜希釈して自動アミノ酸分析計でグリシンを定量した。この場合、拡散する寒天層３９は図１２中３２ｊに相当し、その長さは５インチである。
【０１０７】
図１７は次のようにして得られたグラフである。
【０１０８】
拡散測定は図１２に示す装置を使用し、図１２中パイプ３２の先端部３２ｉに５％グリセリンを含む１．５％寒天層を充填固化させる。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、脱イオン水で加熱抽出後、適宜希釈して高性能液体クロマトグラフィーでグリセリンを定量した。この場合、拡散する寒天層３９は図１２中パイプ３２の中央部３２ｊに相当し、その長さは５インチである。
【０１０９】
拡散測定は図１２に示す装置を使用し、図１２中パイプ３２の先端部３２ｉに５％グルコースを含む１．５％寒天層を充填固化させる。拡散温度２７．５℃、所定の時間に２ミリ厚に寒天層をスライスし、脱イオン水で加熱抽出後、適宜希釈して高性能液体クロマトグラフィーでグルコースを定量した。この場合、拡散する寒天層３９は図１２中パイプ３２の中央部３２ｊに相当し、その長さは５インチである。
【実施例３】
【０１１０】
前項で示した４種の化合物の固体培地内での物質濃度分布から、この物質拡散は、最初に広い領域に一定濃度で分布した場合の拡散として捉え、解析することができる。
【０１１１】
図１９の式１（出典：バーロー物理化学（下）（第５版）、ｐ845）、D：拡散係数、C0：最初の物質濃度、ｘ：拡散距離（勾配形成寒天先端からの距離）、ｙ：勾配形成寒天の距離、ｔ：拡散時間。この積分は、同図式（２）にしめす誤差関数積分の式にすることにより、拡散係数Dを算出することができる。
【０１１２】
実施例２にて説明した図１５（アルギニン）の測定データーを、市販数値解析ソフトMapleを使用して同誤差関数積分式（２）で拡散係数Dを算出した。図２０に示すアルギニンの場合、勾配形成寒天からの距離が近いほど、また拡散時間が長くなるほど拡散係数Dの値が変動するが、あるポイントから一定の値に収斂することが判明した。この収斂部分の測定値から、アルギニンの同条件下での拡散係数D は７．３４×１０−６±２．３６×１０−７ ｍ２／ｓ（ｎ＝８６、Ｃ．Ｖ．＝３．２％）となる。１％グリシン、５％グリセリンおよび５％グルコースを高濃度物質として含有する勾配形成寒天に使用した場合、同様の算出方法で拡散係数Dを求めた。
【０１１３】
それぞれ図２１、図２２、図２３に示す結果が得られ、アルギニンと同様に計算値の収斂部分から、グリシン：Ｄ＝１．０７×１０−５±４．７６×１０−７ｍ２／ｓ （ｎ＝９１、 Ｃ．Ｖ．＝４．４％）；グリセリン；Ｄ＝９．１６×１０−６±４．３２×１０−７ｍ２／ｓ （ｎ＝２００、 Ｃ．Ｖ．＝４．２％）；グルコース；Ｄ＝５．３６×１０−６±１．７２×１０−７ｍ２／ｓ （ｎ＝１３４、 Ｃ．Ｖ．＝３．１％）と算出することができた。
【実施例４】
【０１１４】
実施例３に記載した４種の化合物について、算出できた拡散係数を用いて、それぞれの拡散時間および拡散距離での成分濃度（理論値）を、図１９の式（２）で算出することができる。アルギニンの場合の、理論値と実測値を比較した結果を、図２４に示す。
【０１１５】
同図から、拡散時間１５日目までは理論値と実測値の良好な一致が認められ、拡散係数算出の誤差関数積分式が妥当なものであることを検証した。実施例３で示した他三種の物質についても、図２５（グリシン）、図２６（グリセリン）および図２７（グルコース）に示すように、理論値と実測値の良好な一致が認められる。
【実施例５】
【０１１６】
実施例４で述べたように、拡散物質の先端が容器壁に達するまでの拡散時間内では、拡散係数算出の誤差関数積分式が妥当なものであることを実証した。これまで述べた実施例は、勾配形成寒天のアルギニン濃度を１％で示したものである。この濃度設定は、一般に微生物培養の常識より設定したものであるが、低栄養微生物を標的にするなど、目的の実験のよってはさらに異なった濃度勾配パターンの設定が望ましい場合がある。そこで拡散係数算出の誤差関数積分式で初発濃度を5倍段階でシミュレーションした結果、図２８に示す結果が得られた。
【０１１７】
拡散係数は初発濃度により、わずか変化すると予想されるものの、このようなシミュレーションは本発明を実施するに当たり必要な目安となる。
【実施例６】
【０１１８】
前述してきたように、拡散物質の先端が容器壁に達するまでの拡散時間内では理論値と実測値の良き一致が認められるが、その後実測値は理論値より高くなる。この現象は、実施例２に記述したように、拡散方向が容器壁で反射反転し、折り返してくるものと推測する。もし、容器壁に拡散物質の抜け道を用意すれば、濃度勾配のさらに長時間の維持ができると推測した。そのために、透析膜を壁の代わりに設置し、拡散してくる物質を透析膜の外側を循環させる水で除くシステムを設定した（透析機能付き拡散とよぶ）。
【０１１９】
図２９にその測定装置の概念図を示す。
【０１２０】
この装置は、寒天が充填されるパイプ４２と、該パイプ４２の上端に固定された透析膜４４と、を有し、該パイプ４２の上端部はホルダー４６の下面に形成された筒部４８に接続されている。該筒部４８には透析チャンバー５０が形成されている。図中５２は透析水入り口、５４は透析水出口、５６は拡散寒天、５８は培地成分（拡散物質）を含有する勾配形成寒天である。５８に充填した寒天の拡散寒天５６に接触していない面は、サランラップ（登録商標）で封じた。
【０１２１】
この装置を用いて、約１ｍｌの容積の透析チャンバー５０内に、一日あたり約５００ｍｌの透析水を連続通液した結果、拡散物質としてグリセリンの場合、図３０に示すように、３０日以上にわたり拡散反射を有意に抑制することができる。
【０１２２】
この連続通液速度は約５００ｍｌとしたが、これに限定されることなく、個々の拡散物質の種類あるいは採用した濃度などで、適宜、個別に実験で求めることができる。
【０１２３】
この実施例では、生化学分野で使用される蛋白質脱塩に用いられるセルロース系素材の膜を透析膜４４として使用したが、これに限定されたものでなく、素材が半透膜なら何を使用してもよく、さらに効率のよい不織布あるいは中空糸膜もしくはナイロンメッシュシートなどの使用を例示することができる。
【実施例７】
【０１２４】
前項で述べた透析機能付き拡散は、拡散の先端での物質の折返しを有意に抑制できる。
【０１２５】
本発明の物質拡散のもう一つの問題点として、高濃度成分として含有する勾配形成寒天に近い部分の寒天内濃度は、拡散時間が長くなるにつれて低下することである（実施例１で説明した図１３〜１４、実施例２で説明した図１５〜１８）。
【０１２６】
これは、言い換えれば、高濃度成分を含有する勾配形成寒天の成分濃度は拡散時間とともに低下し、成分の拡散の駆動力が時間経過とともに著しく減少する点にある。拡散駆動力は高濃度成分を含有する勾配形成寒天の成分濃度に依存することより、勾配形成寒天を一定濃度の溶液に変えることにより駆動力を維持できる。
【０１２７】
この方式を還流機能付き拡散と本発明者らは呼称するが、実施例６で述べた透析機能とあわせて、濃度勾配を作成することもできる。
【０１２８】
図３１に装置図を示す。
【０１２９】
この装置は、拡散寒天５６が充填されるパイプ４２と、該パイプ４２の上端に固定された透析膜４４とを有し、パイプ４２の上端部はホルダー４６の下面に形成された筒部４８に接続されている。該筒部４８には透析チャンバー５０が形成されている。パイプ４２の下端部には、培地成分の入口７５、培地成分の出口７６がそれぞれ形成されている。なお、図中５２は透析水入り口、５４は透析水出口である。
【０１３０】
勾配形成寒天５６の空間は内径１ｃｍのパイプ４２で約１ｍｌの容積を占める。この部分に２０倍容の拡散物質溶液を還流させる（一日当たり約５０ｍｌの送液速度）。
【０１３１】
グリセリンを用いた拡散実験の例を図３２に示す。拡散先端が容器先端に到達する日数が、還流を行わない場合に約１５日要していたのに対して（図１６参照）、１０日に短縮されるとともに、高い濃度勾配の維持形成に有効である。この送液速度は約５０ｍｌとしたが、これに限定されることなく、個々の拡散物質の種類あるいは採用した濃度などで、適宜、個別に実験で求めることができる。
【実施例８】
【０１３２】
これまで記載した実施例より、モデル化合物４種の寒天内拡散の定量的把握から、拡散係数を求め実測値との一致を検証した。
【０１３３】
この結果から、本発明者らは、透析機能や還流機能を具備する装置を完成した。ここで、本発明者らは物質拡散の制御する第３番目の方法を提案する。寒天内の拡散現象は、寒天内を物質が滲みこむように移動すると漠然と推測していたが、むしろ波動が伝播すると考えると理解しやすいことを知った。拡散をコントロールする方法を発明した。
【０１３４】
図１２に示す拡散測定装置を用い、拡散させる寒天３９と高濃度成分を含有する勾配形成寒天４０の間に、厚み２ｍｍの円盤（図示せず）をレフレクターとして設置し、円盤中央部に一定口径の開口部を空けて拡散の状況を調べた。このとき用いた拡散物質は０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、拡散時間５日のデーターを図３４に示す。
【０１３５】
同図よりレフレクターがない場合と比較すると、開口径に依存して拡散が抑えられ、１２〜４８時間の拡散位置まで拡散先端が到達していないことが分かる。
【０１３６】
なお、図３３は、３つの収容部を有する丸型培養器に還流・透析機能を付与した培養装置Ａの斜視図である。
【０１３７】
この培養装置Ａは、底を有する筒体６２と、該筒体６２内に配置されたリング状の半透膜６４と、筒体６２の周壁と該半透膜６４との間に配置された複数のスペーサー６６と、を有する。
【０１３８】
筒体６２と、半透膜６４と、各スペーサー６６とで３つの収容部６７〜６９が形成されている。また、これらの収容部６７〜６９と対向する位置において筒体６２の周壁に透析水用の透析チャンバー７０が形成されている。これら収容部６７〜６９および７０は、密閉された空間を形成する。
【０１３９】
上記収容部６７〜６９には、それぞれ培地成分を含有する勾配形成成分溶液が供給され、透析チャンバー７０には透析水が供給される。
【０１４０】
すなわち、各収容部６７〜６９には、培地成分溶液を還流するための流入口と流出口がそれぞれ形成されている。また、透析チャンバー７０には透析水の流入口と流出口が形成されている。
【０１４１】
培養装置Ａの中央部に形成されている充填室６３に、微生物試料の寒天を充填し固化させると共に、各収容部６７〜６９に、第１〜第３の培地成分を含有する勾配形成成分溶液を供給して還流し、また透析チャンバー７０に透析水を供給して還流する。
【０１４２】
各収容部６７〜６９から第１〜第３の成分が充填室６３内に充填した寒天層に拡散し、該寒天層から各成分が透析チャンバー７０の透析水によって排出される。
【０１４３】
この培養装置Ａによれば、物質拡散を定常状態とすることができるから、培養時間が経過した場合でも、ある地点において一定の培養条件を長時間保つことができる。
【０１４４】
なお、収容部６７〜６９および透析水を通液する透析チャンバー７０は、この図面に示す位置に限定されたものでなく、勾配形成の方向によっては、容器内のどの位置に設置してもよい。この図面には示されていないが、これを覆う蓋が付属する。
【実施例９】
【０１４５】
（ｐＨ勾配培養法）
乳酸菌は通性嫌気性菌であるために、他の好気性菌が増殖しにくい嫌気に近い条件下で培養する。本実施例では、連続的なｐＨ条件を嫌気に近い条件で設定するためにｐＨ３．０〜５．０勾配下でビニールチューブを用いた培養を行う。
【０１４６】
培養器７４は、図３５〜３６に示すように、市販のビニールチューブを所定寸法に切断して得られる菅体７１と、該菅体７１の両端部の開口部に栓をするシリコーン製の蓋７２と、を備えている。管体７１の開口部に栓をした状態で培養器７４をガス滅菌して用いた。
【０１４７】
基本培地にはBCP（ブロムクレゾールパープル）加プレート寒天培地（日水製薬）を用いた。
【０１４８】
培地はｐＨ調製のためにｐＨ３．０、３．５、４．０、４．５、５．０の２倍濃度Mcllvainebuffer（クエン酸とリン酸塩を基本としたもの）もしくは２倍濃度Britton-Robinson buffer（リン酸、酢酸およびホウ酸を基本としたもの）5ｍｌと２倍濃度BCP培地５ｍｌをオートクレーブで別滅菌したものをクリーンベンチ内で混合し、全量１０ｍｌを図３６に示すように、下部から重層して作成した。
【０１４９】
ｐＨ測定はチューブ内の寒天を押しだし、下部（酸性側）から０．５ｃｍ刻みにｐＨ測定した。なお、ｐＨメーターは、ラコムテスターｐＨ計（突き刺し電極・防水型）を用いた。
【０１５０】
上記のように調製したｐＨ勾配培地の５０℃におけるｐＨ変化を測定した結果、Mcllvaine bufferおよびBritton-Robinson bufferのいずれの場合においても、２４時間後、４８時間後でｐＨが安定していた（図３７、３８）。このことから、本培養系で乳酸菌の分離に十分なｐＨ勾配環境ができていると考えられた。
【０１５１】
この方法によれば、通常のスクリーニングでは分離できなかった菌株の自然界から分離することができる。特に、高温性乳酸菌のスクリーニング技術を提供することができる。
【０１５２】
また、１回の培養で、連続的なｐＨ条件を嫌気に近い条件で設定することができる。
【実施例１０】
【０１５３】
（酸素、炭酸ガスからなる二次元濃度勾配培養法）
本実施例では難培養性微生物の増殖因子としてガスに注目し、溶存酸素および溶存炭酸ガス濃度勾配をつけた培養装置Ａを開発した。
【０１５４】
そのために以下の図３９〜４０のような溶存ガス勾配をもつ装置を作製した。
【０１５５】
溶存酸素濃度は光ファイバー型酸素センサーを用いて測定した。溶存炭酸ガス濃度測定のために、種々の溶存炭酸ガスを含むLB培地のｐＨを測定し、溶存炭酸ガス濃度を検量線（図４１）から計算した。
【０１５６】
試作した装置の概略を図３９〜４０に示す。
【０１５７】
図３９に示すように、円筒型の培養装置Ａの中央部に炭酸ガスを供給すれば、炭酸ガスはその中心から同心円方向に拡散するので濃度勾配がつけられる。図４０に示すように、酸素を培養装置Ａの上部に供給することにより、酸素はその上部から下方に拡散するので酸素の濃度勾配がつけられる。
【０１５８】
培養装置Ａの具体例を図４２および図４３に示す。
【０１５９】
この培養装置Ａは、上端部および下端部が蓋にて閉塞された円筒形の本体８０の中央部に炭酸ガスを導入する炭酸ガス導入管８１が配設され、本体８０の上部の空間部８２内に空気を導入する空気導入菅８３が配設されている。また、空間部８２内の空気を排気する空気排気菅８４が配設されている。
【０１６０】
炭酸ガス導入管８１および空気導入菅８３は、それぞれ多孔性の膜を用いて形成されている。そのため、炭酸ガス導入管８１および空気導入菅８３の細孔を通してそれぞれ炭酸ガスおよび空気は外部へ漏れる。
【０１６１】
培養装置Ａの本体８０内に寒天培地８５を充填し、炭酸ガス導入管８１および空気導入菅８３からそれぞれ炭酸ガスおよび空気を供給し、所定時間が経過すると、図４３の矢印で示すように、寒天培地８５の中央部では周辺部に比べて炭酸ガス濃度が高くなり、かつ寒天培地８５の上部では下部に比べて酸素濃度が高くなる。
【０１６２】
図４１は溶存炭酸ガス濃度検量線を示したものである。
【０１６３】
ＬＢ培地に炭酸ガスを吹き込み、種々の溶液を作成した。これらの溶液のｐＨをｐＨガラス電極、溶存炭酸ガスは炭酸ガスセンサーを用いて測定した。
（１）溶存酸素濃度勾配： 培養装置Ａ空間部の体積６５ｍｌに空気の通気量２２５ｍｌ／分で一日通気し、その後通気を止めることにより一日目から三日目までほぼ定常状態に保たれていた。溶存酸素濃度範囲は０．４ｍｇ／ｌから８５ｍｇ／ｌであった（図４４）。図４４は、溶存酸素濃度勾配の形成状態を示す。
【０１６４】
２つの図は独立して行った２回の実験結果を示している（図４４−４５）。
（２）溶存炭酸ガス濃度勾配： 炭酸ガスを連続通気した場合の溶存炭酸ガス濃度勾配は、１日目では培地の深さに対して安定していた。３日目では培地の深さによって濃度差が出た。濃度差の範囲は、 10％炭酸ガス通気では６８ｍｇ／ｌ〜１２０ｍｇ／ｌとなり、２０％炭酸ガス通気では９２ｍｇ／ｌ〜１８５ｍｇ／ｌであった（図４６−４７）。
図４６は、１０％炭酸ガス通気の場合、図４７は２０％炭酸ガス通気した場合の溶存炭酸ガス濃度勾配を示す。
【０１６５】
炭酸ガスと窒素ガスの混合ガスを通気した。図４６中、○の連続線（緑色線）は１％炭酸ガスを１日通気した場合；赤色線：通気１日；青色線：通気３日の場合を示す。
（結論） ３次元空間において溶存炭酸ガスと酸素の濃度勾配をＸ−Ｙ平面およびＺ軸方向に作成できる培養装置Ａは、溶存ガスの勾配に対して応答する微生物のスクリーニングに有用である。
【実施例１１】
【０１６６】
（酸化還元電位（ＯＲＰ）匂配の形成法）
微生物の純粋分離培養法が確立されて以来、微生物学の中心は分離培養可能な単一微生物種を基に成り立ち、分離培養された微生物は広範囲な産業分野において我々に多大な貢献を果たしてきた。
【０１６７】
しかし、“生きてはいるが培養できない”微生物が、自然環境中の大部分の微生物の本来の姿であることが広く認知されつつあり、病原微生物，食品微生物，土壌微生物，環境微生物を含む微生物学全般の大きな課題として浮かび上がってきた。パスツール，コッホ以来の伝統的な手法では、栄養源を含有する平板寒天培地にコロニーを形成させ、分離・培養された微生物を研究や応用の対象とした。
【０１６８】
しかし、このような手法で取り扱い可能な微生物種は１％前後にすぎず、例えば土壌微生物でわずか０．３％、海洋微生物に至っては０．００１％と言われている。この大きな原因は、余りに多くの培養因子（培養温度, 培地組成, ｐＨなど）がある為である。
【０１６９】
自然界において、微生物が存在している環境の酸化還元電位（ｏｘｉｄａｔｉｏｎｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＯＲＰ）は一般的には、Ｏ２(＋８１０ｍＶ)〜Ｈ２(−４２０ｍＶ)の間の値を示し、生息している微生物の種類もＯＲＰの値によって異なる場合が多く、一般的にＯＲＰが低くければ嫌気度が高く、高ければ好気的であると言える。
【０１７０】
ＯＲＰを形成させるには酸化還元剤及び空気酸化による手法を用いるのが一般的である。本発明のように、電気化学的手法を用いてＯＲＰ勾配を形成させる方法では、酸化剤及び空気酸化による手法よりも迅速かつ長時間に亘り、良好にＯＲＰ勾配を形成・維持できると示唆される。ＯＲＰ勾配を形成させることで分離条件を「点」から「線」へと多次元化することを可能にし、培養できない微生物の数パーセントを純粋培養できる可能性があると考えられる。また、この技術による微生物探索の方法論が確立すれば、微生物を活用した産業の規模は現在の数倍になることが予測される。
【０１７１】
微生物培養のＯＲＰを制御する方法としては、酸化剤と還元剤を組合せて任意のＯＲＰに認定することは可能であるが、時間の経過と共に変化する。その為、一般には自然環境下で結果的には目的とするＯＲＰが形成されている場所を探索し、その場所に生息している微生物を採取する方法が採られている。但し、この方法では自然環境では形成されないと考えられる特殊なＯＲＰ下で生息・増殖できる特異な微生物を探索するのは非常に困難であり、簡便且効率的な方法は見当たらない。
【０１７２】
そこで、本実施例では電気化学的手法を用いて人為的にＯＲＰ勾配を形成し、特殊なＯＲＰ環境下で生育できる微生物を分離することを目的とする。更に、ＯＲＰを酸化還元色素の色の変化だけでなく、数値で確認するために針状白金電極と比較電極を作製し、実際にそれを用いて実験を行う。
【０１７３】
図４８は電気化学的手法を用いたＯＲＰ勾配形成の模式図である。
【０１７４】
一般には空気の存在下で微生物を探索することが多いので、還元剤は空気酸化され、ＯＲＰは徐々に上昇してくる。このように、常時ほぼ一定のＯＲＰを維持するには、適宜還元剤あるいは/または酸化剤を添加し続けなければならないので、結果的には薬剤の過剰添加により、微生物の増殖が抑制され、本来探索したい特定ＯＲＰ環境下で生息できる微生物を採取することができないことが課題となっている。
【０１７５】
上記課題を解決するために、本発明では、ＯＲＰ制御の手段として、連続かつ随時供給が可能であり、自動制御が容易である電気化学的方法を選択した。
【０１７６】
このシステムは、図５０に示すように、微生物探索試料９１を入れる閉鎖系容器９２と、該容器９２の開口部から試料９１内に挿入設置された陽電極９３および陰電極９４と、容器９２の開口部を塞ぐゴム栓９５と、を備えている。
【０１７７】
該陽電極９３および陰電極９４は導電線９６を介して電圧可変直流電源９７に接続されている。
【０１７８】
不溶性の陽極９３と陰極９４間に直流電圧を印加し、目的によって任意の電圧を設定して通電する。これにより電気化学的な陽極の酸化力と陰極の還元力を随時微生物の生息環境に供給することができると共に、過剰に酸化力・還元力が蓄積しないように、定点に設置したモニターＯＲＰ電極の設定値を外れると供給電力がＯＮ，ＯＦＦするというＯＲＰ制御が可能となる。
【０１７９】
本実施例の特徴は以下の通りである。
項目１．微生物の培養環境に陽極および陰極をそれぞれ挿入し、両極間に電圧を印加する工程、および両電極表面または両電極間の任意の場所にコロニーを形成した微生物を探索する工程、を包含する、微生物のスクリーニング方法。
項目２．請求項１を効率化する為に、さらに、適宜酸化還元色素を微生物の培養環境に添加する工程、を包含する。
【０１８０】
本発明システムを利用することによって、微生物生息環境に任意のＯＲＰ環境を形成させ、従来の自然環境下では形成されない特殊なＯＲＰ環境でも生息／増殖可能な微生物が分離できれば、未知あるいは／または高付加価値の物質・酵素などを生産する能力をもつ有用な微生物の探索が容易かつ効率的に実現できる。
【０１８１】
ＯＲＰ制御あるいは/またはＯＲＰ匂配形成効率を最良にするためには、微生物の増殖に悪い影響を与えない微量（０.０１〜１０ｍＭ程度）の酸化還元色素（例えば、メチレンブルー、メチルビオロゲン、ベンジルビオロゲン、ニュートラルレッド、ヤヌスグリーン、チオニン、o−フェナンスロリン、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム等）を電子運搬体（エレクトロンキャリア）として環境中に共存させると良い。
（実験例）
脱イオン水１００ｍｌに１．５％量になるよう寒天末を添加し、融解させた。寒天が融解した後、寒天が凝固する前にフェリシアン化カリウム溶液とフェロシアン化カリウム溶液をそれぞれ１００ｍＭになるようそれぞれ添加した。
【０１８２】
開放型容器の半分にフェロシアン化カリウムの寒天を流し込んだ。
【０１８３】
寒天が凝固した後、次にフェリシアン化カリウムの寒天を流し込んだ。陽極と陰極の電極間距離が２８８ｍｍになるように寒天ゲルに挿入し、２Ｖの直流電圧を印加した。針状白金電極と比較電極からなるＯＲＰ電極を一定間隔毎に順次挿入し、１時間後のＯＲＰを測定した。
【０１８４】
また、閉鎖型のアクリル管も同様の手順で測定した。測定の結果、この条件で通電を行うと、図４９に示すような酸化還元剤の組み合わせ法によってＯＲＰ匂配を形成するのに２８８時間必要であるが、本発明の方法ではほぼ１時間で同様のＯＲＰ匂配の形成が可能となった。
【０１８５】
開放型容器の方が閉鎖型アクリル管と比較し、高いＯＲＰ値を示すことが確認された。
【０１８６】
これは空気酸化と容器の大きさによる影響が示唆された。測定の結果、開放型容器の方が閉鎖型アクリル管と比較し、より拡散が進行し電位が上がっていることが確認できた。これは空気酸化と容器の大きさによる影響が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本原理を利用して、一般の微生物が生息できないような特殊なＯＲＰ環境下に生育可能な微生物は、特別な代謝システム、酵素等を有し、特殊な物質を生産する可能性を有していると考えられる。また、微生物が生息しない（またはしにくい）ＯＲＰ環境域では、微生物の増殖が抑制されていることを意味している。
【０１８８】
以上のような事実から、1）特殊微生物を探索・活用すれば、未知の物質および/または高付加価値物質を生産できる能力を有している可能性がある。２）微生物の増殖抑制ＯＲＰ域を常時形成することにより、食品、飲料水その他水分を含む様々な物品や自然環境下での微生物の増殖制御が比較的容易に実現することができる。
【０１８９】
また、本発明の対向型多次元勾配微生物培養装置は、例えば、有用微生物を始めとするあらゆる種類の微生物の自然界や検体サンプルからの探索分離、微生物の生育特性の簡単かつ網羅的解析、微生物の有用物質生産条件の網羅的解析、など複雑な培養条件の網羅的設定が必要なあらゆる実験に利用できるとともに、各種のバイオ関連産業上の幅広い用途に利用ができる。特に、動物細胞培養、植物組織培養に応用できるとともに、特定の物質の微生物・動物細胞・植物細胞への効果など複数の条件下での検討などの用途に活用することができる。
【符号の説明】
【０１９０】
１ 培養器
１０ 充填室
１１ 第１収容部
１２ 第２収容部
１３ 第３収容部
１４ 第１の仕切板
１５ 第２の仕切板
１６ 第３の仕切板
２１ 第１の寒天層
２２ 第２の寒天層
２３ 第３の寒天層
２４ 中央の寒天層
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物試料が充填される充填室を有する培養器の側壁の一部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填し得る第１収容部が形成され、該第１収容部と培養器の充填室とは取り外し可能な第１の仕切板で仕切られ、該培養器の側壁の他部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填し得る第２収容部が形成され、該第２収容部と培養器の充填室とは取り外し可能な第２の仕切板で仕切られている培養装置。
【請求項２】
前記培養器の底部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第３成分を含有する第３の寒天を充填し得る第３収容部が形成されている請求項１に記載の培養装置。
【請求項３】
前記培養器は箱状に形成され、該培養器の一側壁に前記第１収容部が形成され、該第１収容部に隣接する他の側壁に前記第２収容部が形成されている請求項１に記載の培養装置。
【請求項４】
前記培養器は略円筒状に形成され、該培養器の周壁に前記第１収容部および第２収容部が形成されている請求項１に記載の培養装置。
【請求項５】
前記培養器の側壁に３以上の収容部が形成されている請求項１に記載の培養装置。
【請求項６】
前記第１の寒天と前記第２の寒天とは、培地成分濃度、塩濃度、培地ｐＨの少なくともいずれかが異なる請求項１に記載の培養装置。
【請求項７】
微生物試料が充填される充填室を有する培養器の側壁の一部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の溶液を供給し得る第１収容部が形成され、該第１収容部と培養器の充填室とは半透膜で仕切られ、該培養器の側壁の他部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の溶液を供給し得る第２収容部が形成され、該第２収容部と培養器の充填室とは半透膜で仕切られている培養装置。
【請求項８】
前記第１収容部に前記第１の溶液の供給口と排出口がそれぞれ形成され、前記第２収容部に前記第２の溶液の供給口と排出口がそれぞれ形成されている請求項７に記載の培養装置。
【請求項９】
前記第１収容部および第２収容部と対向する位置において、前記培養器の側壁に、透析水が還流される透析チャンバーが形成されている請求項７に記載の培養装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の培養装置を用いて、微生物試料に含まれる微生物をスクリーニングする方法であって、前記培養器の側壁に形成された第１収容部内に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填して第１の寒天層を形成する工程、前記第１の仕切板を外して該第１の寒天層を培養器の充填室に露出させる工程、前記培養器の側壁に形成された第２収容部内に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填して第２の寒天層を形成する工程、前記第２の仕切板を外して該第２の寒天層を培養器の充填室に露出させる工程、および該培養器の充填室内に、微生物試料を含む流動性を有する固体培地を充填して固化させる工程、を包含する微生物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記固体培地は、第１成分および第２成分を含有しない請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
微生物試料が充填される充填室を有する培養器の側壁の一部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填し得る第１収容部が形成され、該第１収容部と培養器の充填室とは取り外し可能な第１の仕切板で仕切られ、該培養器の側壁の他部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填し得る第２収容部が形成され、該第２収容部と培養器の充填室とは取り外し可能な第２の仕切板で仕切られている培養装置。
【請求項２】
前記培養器の底部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第３成分を含有する第３の寒天を充填し得る第３収容部が形成されている請求項１に記載の培養装置。
【請求項３】
前記培養器は箱状に形成され、該培養器の一側壁に前記第１収容部が形成され、該第１収容部に隣接する他の側壁に前記第２収容部が形成されている請求項１に記載の培養装置。
【請求項４】
前記培養器は略円筒状に形成され、該培養器の周壁に前記第１収容部および第２収容部が形成されている請求項１に記載の培養装置。
【請求項５】
前記培養器の側壁に３以上の収容部が形成されている請求項１に記載の培養装置。
【請求項６】
前記第１の寒天と前記第２の寒天とは、培地成分濃度、塩濃度、培地ｐＨの少なくともいずれかが異なる請求項１に記載の培養装置。
【請求項７】
微生物試料が充填される充填室を有する培養器の側壁の一部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の溶液を供給し得る第１収容部が形成され、該第１収容部と培養器の充填室とは半透膜で仕切られ、該培養器の側壁の他部に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の溶液を供給し得る第２収容部が形成され、該第２収容部と培養器の充填室とは半透膜で仕切られている培養装置。
【請求項８】
前記第１収容部に前記第１の溶液の供給口と排出口がそれぞれ形成され、前記第２収容部に前記第２の溶液の供給口と排出口がそれぞれ形成されている請求項７に記載の培養装置。
【請求項９】
前記第１収容部および第２収容部と対向する位置において、前記培養器の側壁に、透析水が還流される透析チャンバーが形成されている請求項７に記載の培養装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の培養装置を用いて、微生物試料に含まれる微生物をスクリーニングする方法であって、前記培養器の側壁に形成された第１収容部内に、該微生物の培養に影響を及ぼす第１成分を含有する第１の寒天を充填して第１の寒天層を形成する工程、前記第１の仕切板を外して該第１の寒天層を培養器の充填室に露出させる工程、前記培養器の側壁に形成された第２収容部内に、該微生物の培養に影響を及ぼす第２成分を含有する第２の寒天を充填して第２の寒天層を形成する工程、前記第２の仕切板を外して該第２の寒天層を培養器の充填室に露出させる工程、および該培養器の充填室内に、微生物試料を含む流動性を有する固体培地を充填して固化させる工程、を包含する微生物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記固体培地は、第１成分および第２成分を含有しない請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図３１】
【図３３】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
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【図１５】
【図１６】
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【図１８】
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【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
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【図３２】
【図３４】
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【図４９】
【図５０】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３２】
【図３４】
【公開番号】特開２０１０−１６１９７９（Ｐ２０１０−１６１９７９Ａ）
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７５４１（Ｐ２００９−７５４１）
【出願日】平成２１年１月１６日（２００９．１．１６）
【出願人】（５０５２９８２３８）学校法人 君が淵学園 崇城大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１６日（２００９．１．１６）
【出願人】（５０５２９８２３８）学校法人 君が淵学園 崇城大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
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