微生物検出用メンブランフィルタ
【課題】本発明は、蛍光バックグラウンドが低く、様々な波長の蛍光色素を組み合わせた染色に適応でき、操作性を向上させた微生物検出用メンブランフィルタを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、厚さが１０〜５００μｍのポリマー層と、前記ポリマー層上に厚さが０．１ｎｍ〜１μｍの金属層とを有する微生物検出用メンブランフィルタを提供する。
また、本発明は、請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物検出用メンブランフィルタを用いて微生物を検出する微生物の検出方法を提供する。
【解決手段】本発明は、厚さが１０〜５００μｍのポリマー層と、前記ポリマー層上に厚さが０．１ｎｍ〜１μｍの金属層とを有する微生物検出用メンブランフィルタを提供する。
また、本発明は、請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物検出用メンブランフィルタを用いて微生物を検出する微生物の検出方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光バックグラウンドが低く、平滑な微生物検出用メンブランフィルタに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物をメンブランフィルタで濾過し、フィルタ上にトラップされた微生物を蛍光染色して蛍光顕微鏡で観察する手法がある。しかし、メンブランフィルタも蛍光を発してしまうために感度よく微生物を検出できないという問題があった。観察には肉眼で行う方法、CCDカメラで撮像する方法などいくつかの選択があるが、いずれの手法においても、蛍光バックグラウンドと微生物の蛍光との区別がつきにくければ、感度よく微生物を検出できない。
この問題に対し、メンブランフィルタをイルガランブラックのような黒色染料で染色しバックグラウンドを下げる方法や、予め黒色染料で着色してある市販メンブラン（例；CycloblackTM、Whatman)を使用することが必要となる。しかしながら、そのようなメンブランを用いても、ある特定の波長についてバックグラウンド低減効果はあるものの、あらゆる波長についてバックグラウンドが低いわけではない。すなわち、従来技術では、様々な波長の蛍光色素を組み合わせた染色を行うことはできず、試験に制約があることが問題であった。
一方、蛍光染色に用いるメンブランフィルタの材質は、ポリカーボネートやポリエステルが一般的であるが、柔らかくて捲れ易い材質であるため、メンブラン表面がしわになりやすく、その後の顕微鏡観察では観察領域が異なるたびにフォーカス位置が変わるという問題があった。さらに、ピンセット等で挟んで扱う際の操作性が困難であることも問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明は、蛍光バックグラウンドが低く、様々な波長の蛍光色素を組み合わせた染色に適応でき、操作性を向上させた微生物検出用メンブランフィルタを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、メンブランフィルタの表面を金属でコーティングすることによって上記課題を効率的に解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、厚さが１０〜５００μｍのポリマー層と、前記ポリマー層上に厚さが０．１ｎｍ〜１μｍの金属層とを有する微生物検出用メンブランフィルタを提供する。
また、本発明は、請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物検出用メンブランフィルタを用いて微生物を検出する微生物の検出方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の微生物検出用メンブランフィルタは、ポリマー層と金属層を有する。
ポリマー層を構成するポリマーは、通常メンブランフィルタとして使用されるポリマーであれば特に限定されるものではないが、例えばニトロセルロース、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリスルホン、ポリフッ化エチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンが挙げられる。好ましくは、ポリエステル、ポリカーボネートである。ポリエステルやポリカーボネートなどで製造するメンブランフィルタは細孔サイズが均一であるため、細菌などを捕捉し、蛍光染色観察するのに適している。
ポリマー層を形成する方法は、通常用いられるいずれの方法であってもよく、また、CycloblackTM（Whatman）、NucleporeTM（Whatman）などの市販のメンブランフィルタを本発明のポリマー層として使用することもできる。
ポリマー層の厚さは、好ましくは１０〜５００μｍであり、より好ましくは２０〜３０μｍである。
【０００６】
金属層を構成する金属は、特に限定されるものではないが、例えば金、銀、銅、亜鉛、アルミニウム、チタン、タンタル、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、鉛、錫などの金属又はこれらの合金が挙げられる（但し、金属層がＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｐｔ-Ｐｄである場合を除く）。好ましくは、錫である。錫は微生物に対する毒性がなく、染色後の細菌観察が容易であるので特に効果的である。
前記ポリマー層上に金属層を形成する方法は、平滑な膜を形成できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば蒸着、スパッタリング、ＣＶＤなどが挙げられる。
金属層の厚さは、好ましくは０．１ｎｍ〜１μｍであり、より好ましくは１０〜１００ｎｍである。上記範囲内であれば、蛍光バックグラウンドを低減し、平滑で操作性に優れたメンブランフィルタを得ることができる。
【０００７】
本発明のメンブランフィルタの細孔サイズは、好ましくはφ０．１〜１０μｍであるが、対象となる微生物細胞のサイズにより細孔サイズを選択することが好ましい。
細孔密度は、好ましくは１０5〜１０8個/ｍ2である。細孔密度が大きければ大きいほど濾過性はよいが、メンブランフィルタの強度が低下する蛍光があるため、これらを考慮して細孔サイズと細孔密度を選択する必要がある。
【０００８】
本発明のメンブランフィルタは、ポリマー層上に金属層を形成した後に細孔を形成して作製してもよく、又は細孔を形成したポリマー層上に金属層を形成して作製してもよい。
細孔を形成する方法は、通常用いられるいずれの方法であってもよく、例えばポリマー層に荷電粒子や中性子を照射して飛跡を作り、この飛跡を化学的に腐食処理する方法などが挙げられる。細孔は、均一な口径と円筒状の孔道をフイルム面に対して直角に形成されるほどよい。なお、蒸着などによって金属層を形成する場合には、本発明のメンブランフィルタの細孔サイズは、ポリマー層の細孔サイズよりも小さくなるため、所望の細孔サイズよりも大きい細孔サイズでポリマー層に細孔を形成する必要がある。
【０００９】
本発明の微生物検出用メンブランフィルタを用いた微生物の検出は、従来のメンブランフィルタを用いる検出と同様にして行うことができる。微生物を本発明の微生物検出用メンブランフィルタで濾過し、フィルタ上にトラップされた微生物を蛍光染色して蛍光顕微鏡で観察する。本発明の方法における蛍光染色は、従来から用いられている任意の蛍光染色法であってもよく、例えば大腸菌特異的蛍光プローブ（vermicon AG）やＤＡＰＩ（4'6ジアミノ-2-フェニルインドール）等による染色が挙げられる。
【実施例】
【００１０】
（実施例１）
Whatman社CycloblackTM（直径２５ｍｍポアサイズφ０．８μｍ）に対し、スパッタリング法によりＳｎをコーティングした。コーティングにより、メンブランフィルタ表層にＳｎ層が形成され、最終のポアサイズはφ０．８μｍよりも小さくなり、一般に微生物試験に用いられるポアサイズφ０．５５μｍとなった（図１）。
また、ポアサイズφ０．６μｍのメンブランフィルタ（Whatman 社CycloblackTM）に対して、同様にＳｎをコーティングした場合は、最終のポアサイズは一般に微生物試験に用いられるφ０．４５μｍとなった。
また、ポアサイズφ０．４μｍのメンブランフィルタ（Whatman 社CycloblackTM）に対して、同様にＳｎをコーティングした場合は、最終のポアサイズはφ０．２５μｍとなった（図１）。
【００１１】
（実施例２）
実施例１のWhatman 社CycloblackTM（直径２５mmポアサイズφ０．８μｍ）に対してＳｎをコーティングしたメンブランフィルタについて、蛍光顕微鏡観察時のバックグランドを試験した。 用いたメンブランフィルタは、市販品メンブランフィルタ１として、Whatman 社CycloblackTMを、市販品メンブランフィルタ２としてWhatman 社CycloporeTM（black）を、市販品メンブランフィルタ３としてWhatman 社社CycloporeTM（plain）を用い、本発明のメンブランフィルタは市販品メンブランフィルタ１にSｎをイオンスパッターによりコーティングしたものを用いた。
測定方法は以下の通りである。すなわち、本発明のコーティングしたメンブランフィルタならびにコーティングしないメンブランフィルタを蛍光顕微鏡（Leica;ＤＭＲＸＡ２）の観察領域下にセットした。蛍光フィルターブロックＡ４（励起フィルター；ＢＰ３６０／４０、吸収フィルター；ＢＰ４７０／４０）、Ｌ５（励起フィルター；ＢＰ４８０／４０、吸収フィルター；ＢＰ５２７／３０） 、Ｙ３（励起フィルター；ＢＰ５３５／５０、吸収フィルター；ＢＰ６１０／７５）での蛍光像を各々冷却ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ）で撮像した。撮像時間（exposure time）は、６０ｍｓ（Ａ４）、１６０ｍｓ（Ｌ５）、１６０ｍｓ（Ｙ３）とした。この様に撮像した各メンブランフィルタの蛍光バックグラウンドは、画像解析ソフトＬｅｉｃａ−Ｑｗｉｎで、１画面あたりの蛍光画像（１３００＊１０３０画素）の１画素当たりの平均輝度（２５６階調）を算出した。その結果、市販メンブランフィルタ３が最も高い値を示したので、これを１００とし相対値を算出した。
試験結果は図２に示すように、Ｓｎをコーティングしたメンブランフィルタはコーティングしないメンブランフィルタより大幅にバックグランドが低いことが示された。
【００１２】
（実施例３）
大腸菌を実施例１のWhatman 社CycloblackTM（直径２５mmポアサイズφ０．８μｍ）に対してＳｎをコーティングしたメンブランフィルタについて、を用いて濾過し、そのメンブランフィルタをＳＴＡ培地で３７℃、４時間培養した。このように短時間培養したメタルメンブランフィルタに対し、エタノール固定後、市販の大腸菌特異的蛍光プローブ（vermicon AG）により染色した。染色方法は、記載のプロトコールに従った。その後、ＤＡＰＩ（4'6ジアミノ-2-フェニルインドール）による染色を行った後、そのメンブランフィルタをスライドグラスに貼り付けて、封入剤SlowFadeTM（Molecular Probe）で封入後カバーガラスを被せ、シールした。この試料を蛍光顕微鏡ＢＸ６０（オリンパス）のステージ上にセットし、対物レンズ６０倍、ＣＣＤカメラＣ５８１０（浜松フォトニクス）で撮像した。
図３は、左側は大腸菌特異プローブにより染色された大腸菌、右側はＤＡＰＩにより染色された大腸菌をそれぞれ示しており、同一の視野である。
図に見られるように、いずれの染色方法によっても大腸菌がクリアーに染色されていることがわかり、本染色方法の有効性が示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のメンブランフィルタの電子顕微鏡による表面観察像を示す。
【図２】市販メンブランフィルタと本発明のメンブランフィルタの蛍光バックグラウンドを示す。
【図３】本発明のメンブランフィルタ上の大腸菌の蛍光染色写真を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光バックグラウンドが低く、平滑な微生物検出用メンブランフィルタに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物をメンブランフィルタで濾過し、フィルタ上にトラップされた微生物を蛍光染色して蛍光顕微鏡で観察する手法がある。しかし、メンブランフィルタも蛍光を発してしまうために感度よく微生物を検出できないという問題があった。観察には肉眼で行う方法、CCDカメラで撮像する方法などいくつかの選択があるが、いずれの手法においても、蛍光バックグラウンドと微生物の蛍光との区別がつきにくければ、感度よく微生物を検出できない。
この問題に対し、メンブランフィルタをイルガランブラックのような黒色染料で染色しバックグラウンドを下げる方法や、予め黒色染料で着色してある市販メンブラン（例；CycloblackTM、Whatman)を使用することが必要となる。しかしながら、そのようなメンブランを用いても、ある特定の波長についてバックグラウンド低減効果はあるものの、あらゆる波長についてバックグラウンドが低いわけではない。すなわち、従来技術では、様々な波長の蛍光色素を組み合わせた染色を行うことはできず、試験に制約があることが問題であった。
一方、蛍光染色に用いるメンブランフィルタの材質は、ポリカーボネートやポリエステルが一般的であるが、柔らかくて捲れ易い材質であるため、メンブラン表面がしわになりやすく、その後の顕微鏡観察では観察領域が異なるたびにフォーカス位置が変わるという問題があった。さらに、ピンセット等で挟んで扱う際の操作性が困難であることも問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明は、蛍光バックグラウンドが低く、様々な波長の蛍光色素を組み合わせた染色に適応でき、操作性を向上させた微生物検出用メンブランフィルタを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、メンブランフィルタの表面を金属でコーティングすることによって上記課題を効率的に解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、厚さが１０〜５００μｍのポリマー層と、前記ポリマー層上に厚さが０．１ｎｍ〜１μｍの金属層とを有する微生物検出用メンブランフィルタを提供する。
また、本発明は、請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物検出用メンブランフィルタを用いて微生物を検出する微生物の検出方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明の微生物検出用メンブランフィルタは、ポリマー層と金属層を有する。
ポリマー層を構成するポリマーは、通常メンブランフィルタとして使用されるポリマーであれば特に限定されるものではないが、例えばニトロセルロース、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリスルホン、ポリフッ化エチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンが挙げられる。好ましくは、ポリエステル、ポリカーボネートである。ポリエステルやポリカーボネートなどで製造するメンブランフィルタは細孔サイズが均一であるため、細菌などを捕捉し、蛍光染色観察するのに適している。
ポリマー層を形成する方法は、通常用いられるいずれの方法であってもよく、また、CycloblackTM（Whatman）、NucleporeTM（Whatman）などの市販のメンブランフィルタを本発明のポリマー層として使用することもできる。
ポリマー層の厚さは、好ましくは１０〜５００μｍであり、より好ましくは２０〜３０μｍである。
【０００６】
金属層を構成する金属は、特に限定されるものではないが、例えば金、銀、銅、亜鉛、アルミニウム、チタン、タンタル、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、鉛、錫などの金属又はこれらの合金が挙げられる（但し、金属層がＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｐｔ-Ｐｄである場合を除く）。好ましくは、錫である。錫は微生物に対する毒性がなく、染色後の細菌観察が容易であるので特に効果的である。
前記ポリマー層上に金属層を形成する方法は、平滑な膜を形成できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば蒸着、スパッタリング、ＣＶＤなどが挙げられる。
金属層の厚さは、好ましくは０．１ｎｍ〜１μｍであり、より好ましくは１０〜１００ｎｍである。上記範囲内であれば、蛍光バックグラウンドを低減し、平滑で操作性に優れたメンブランフィルタを得ることができる。
【０００７】
本発明のメンブランフィルタの細孔サイズは、好ましくはφ０．１〜１０μｍであるが、対象となる微生物細胞のサイズにより細孔サイズを選択することが好ましい。
細孔密度は、好ましくは１０5〜１０8個/ｍ2である。細孔密度が大きければ大きいほど濾過性はよいが、メンブランフィルタの強度が低下する蛍光があるため、これらを考慮して細孔サイズと細孔密度を選択する必要がある。
【０００８】
本発明のメンブランフィルタは、ポリマー層上に金属層を形成した後に細孔を形成して作製してもよく、又は細孔を形成したポリマー層上に金属層を形成して作製してもよい。
細孔を形成する方法は、通常用いられるいずれの方法であってもよく、例えばポリマー層に荷電粒子や中性子を照射して飛跡を作り、この飛跡を化学的に腐食処理する方法などが挙げられる。細孔は、均一な口径と円筒状の孔道をフイルム面に対して直角に形成されるほどよい。なお、蒸着などによって金属層を形成する場合には、本発明のメンブランフィルタの細孔サイズは、ポリマー層の細孔サイズよりも小さくなるため、所望の細孔サイズよりも大きい細孔サイズでポリマー層に細孔を形成する必要がある。
【０００９】
本発明の微生物検出用メンブランフィルタを用いた微生物の検出は、従来のメンブランフィルタを用いる検出と同様にして行うことができる。微生物を本発明の微生物検出用メンブランフィルタで濾過し、フィルタ上にトラップされた微生物を蛍光染色して蛍光顕微鏡で観察する。本発明の方法における蛍光染色は、従来から用いられている任意の蛍光染色法であってもよく、例えば大腸菌特異的蛍光プローブ（vermicon AG）やＤＡＰＩ（4'6ジアミノ-2-フェニルインドール）等による染色が挙げられる。
【実施例】
【００１０】
（実施例１）
Whatman社CycloblackTM（直径２５ｍｍポアサイズφ０．８μｍ）に対し、スパッタリング法によりＳｎをコーティングした。コーティングにより、メンブランフィルタ表層にＳｎ層が形成され、最終のポアサイズはφ０．８μｍよりも小さくなり、一般に微生物試験に用いられるポアサイズφ０．５５μｍとなった（図１）。
また、ポアサイズφ０．６μｍのメンブランフィルタ（Whatman 社CycloblackTM）に対して、同様にＳｎをコーティングした場合は、最終のポアサイズは一般に微生物試験に用いられるφ０．４５μｍとなった。
また、ポアサイズφ０．４μｍのメンブランフィルタ（Whatman 社CycloblackTM）に対して、同様にＳｎをコーティングした場合は、最終のポアサイズはφ０．２５μｍとなった（図１）。
【００１１】
（実施例２）
実施例１のWhatman 社CycloblackTM（直径２５mmポアサイズφ０．８μｍ）に対してＳｎをコーティングしたメンブランフィルタについて、蛍光顕微鏡観察時のバックグランドを試験した。 用いたメンブランフィルタは、市販品メンブランフィルタ１として、Whatman 社CycloblackTMを、市販品メンブランフィルタ２としてWhatman 社CycloporeTM（black）を、市販品メンブランフィルタ３としてWhatman 社社CycloporeTM（plain）を用い、本発明のメンブランフィルタは市販品メンブランフィルタ１にSｎをイオンスパッターによりコーティングしたものを用いた。
測定方法は以下の通りである。すなわち、本発明のコーティングしたメンブランフィルタならびにコーティングしないメンブランフィルタを蛍光顕微鏡（Leica;ＤＭＲＸＡ２）の観察領域下にセットした。蛍光フィルターブロックＡ４（励起フィルター；ＢＰ３６０／４０、吸収フィルター；ＢＰ４７０／４０）、Ｌ５（励起フィルター；ＢＰ４８０／４０、吸収フィルター；ＢＰ５２７／３０） 、Ｙ３（励起フィルター；ＢＰ５３５／５０、吸収フィルター；ＢＰ６１０／７５）での蛍光像を各々冷却ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ）で撮像した。撮像時間（exposure time）は、６０ｍｓ（Ａ４）、１６０ｍｓ（Ｌ５）、１６０ｍｓ（Ｙ３）とした。この様に撮像した各メンブランフィルタの蛍光バックグラウンドは、画像解析ソフトＬｅｉｃａ−Ｑｗｉｎで、１画面あたりの蛍光画像（１３００＊１０３０画素）の１画素当たりの平均輝度（２５６階調）を算出した。その結果、市販メンブランフィルタ３が最も高い値を示したので、これを１００とし相対値を算出した。
試験結果は図２に示すように、Ｓｎをコーティングしたメンブランフィルタはコーティングしないメンブランフィルタより大幅にバックグランドが低いことが示された。
【００１２】
（実施例３）
大腸菌を実施例１のWhatman 社CycloblackTM（直径２５mmポアサイズφ０．８μｍ）に対してＳｎをコーティングしたメンブランフィルタについて、を用いて濾過し、そのメンブランフィルタをＳＴＡ培地で３７℃、４時間培養した。このように短時間培養したメタルメンブランフィルタに対し、エタノール固定後、市販の大腸菌特異的蛍光プローブ（vermicon AG）により染色した。染色方法は、記載のプロトコールに従った。その後、ＤＡＰＩ（4'6ジアミノ-2-フェニルインドール）による染色を行った後、そのメンブランフィルタをスライドグラスに貼り付けて、封入剤SlowFadeTM（Molecular Probe）で封入後カバーガラスを被せ、シールした。この試料を蛍光顕微鏡ＢＸ６０（オリンパス）のステージ上にセットし、対物レンズ６０倍、ＣＣＤカメラＣ５８１０（浜松フォトニクス）で撮像した。
図３は、左側は大腸菌特異プローブにより染色された大腸菌、右側はＤＡＰＩにより染色された大腸菌をそれぞれ示しており、同一の視野である。
図に見られるように、いずれの染色方法によっても大腸菌がクリアーに染色されていることがわかり、本染色方法の有効性が示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のメンブランフィルタの電子顕微鏡による表面観察像を示す。
【図２】市販メンブランフィルタと本発明のメンブランフィルタの蛍光バックグラウンドを示す。
【図３】本発明のメンブランフィルタ上の大腸菌の蛍光染色写真を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
厚さが１０〜５００μｍのポリマー層と、前記ポリマー層上に厚さが０．１ｎｍ〜１μｍの金属層とを有する微生物検出用メンブランフィルタ（但し、金属層がＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｐｔ-Ｐｄである場合を除く）。
【請求項２】
細孔サイズがφ０．１〜１０μｍである請求項１記載の微生物検出用メンブランフィルタ。
【請求項３】
細孔密度が１０5〜１０8個/ｍ2である請求項１又は２記載の微生物検出用メンブランフィルタ。
【請求項４】
金属層がＳｎを含む請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物検出用メンブランフィルタ。
【請求項５】
請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物検出用メンブランフィルタを用いて微生物を検出する微生物の検出方法。
【請求項１】
厚さが１０〜５００μｍのポリマー層と、前記ポリマー層上に厚さが０．１ｎｍ〜１μｍの金属層とを有する微生物検出用メンブランフィルタ（但し、金属層がＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｐｔ-Ｐｄである場合を除く）。
【請求項２】
細孔サイズがφ０．１〜１０μｍである請求項１記載の微生物検出用メンブランフィルタ。
【請求項３】
細孔密度が１０5〜１０8個/ｍ2である請求項１又は２記載の微生物検出用メンブランフィルタ。
【請求項４】
金属層がＳｎを含む請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物検出用メンブランフィルタ。
【請求項５】
請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物検出用メンブランフィルタを用いて微生物を検出する微生物の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−１２９７２２（Ｐ２００６−１２９７２２Ａ）
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３１９４７９（Ｐ２００４−３１９４７９）
【出願日】平成１６年１１月２日（２００４．１１．２）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２日（２００４．１１．２）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
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