微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するためのベクターおよびその利用
【課題】微生物由来の菌体外プロテアーゼの自己触媒的切断活性に依存することなく、当該プロテアーゼを菌体外にて生産すること。
【解決手段】微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列とプロ配列とを、別々のポリペプチドとして独立して発現し得る発現ベクターを提供する。
【解決手段】微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列とプロ配列とを、別々のポリペプチドとして独立して発現し得る発現ベクターを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するための技術に関するものであり、より詳細には、微生物由来の菌体外プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、当該ベクターが導入された形質転換体、ならびに当該ベクターまたは当該形質転換体を用いた菌体外プロテアーゼを生産するための方法およびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物が菌体外に分泌するプロテアーゼ（すなわち、微生物由来の菌体外プロテアーゼ）は、不活性のプレプロ型酵素（シグナル配列、プロ配列および成熟配列が連続する１本のポリペプチド）として菌体内にて合成される。
【０００３】
菌体外プロテアーゼの生産において、シグナル配列は、プレプロ型酵素が細胞内膜を通過してペリプラズムに移行する際のシグナルとして機能する。ペリプラズムに移行したプレプロ型酵素は、そのシグナル配列がシグナルペプチターゼにより切断されることにより、プロ配列および成熟配列からなるプロ型酵素に変換される。プロ型酵素のプロ配列部分は、成熟配列部分をフォールディングする分子内シャペロンとして機能する。そして、プロ型酵素のプロ配列と成熟配列とをつなぐペプチド結合が、自己触媒的に切断されることによって、成熟型酵素（成熟ポリペプチド）に変換された菌体外プロテアーゼは、菌体外に分泌される。
【０００４】
プロテアーゼの成熟配列のフォールディングにプロ配列の存在が不可欠であるという知見に基づいた変異型プロテアーゼの発現方法として、主に以下の２つの方法が報告されている。非特許文献１に記載の第１の発現方法は、大腸菌内において、プロテアーゼの成熟配列およびプロ配列を別々のポリペプチド（成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチド）として発現させ、これらのポリペプチドをインクルージョンボディ（封入体）として回収した後に、可溶化およびリフォールディングすることによって活性回復させる方法である。非特許文献２に記載の第２の発現方法は、本発明者らが変異型サーモライシン（ＴＬＮ：Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）の発現方法として報告したプロテアーゼの発現方法であり、大腸菌内において、ＴＬＮをプレプロ型として発現させ、ＴＬＮの自己触媒的切断活性によって、成熟配列とプロ配列とを切断し、成熟型プロテアーゼを菌体外に分泌させる方法である。
【非特許文献１】Ｃ．Ｍａｒｉｅ−Ｃｌａｉｒｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８５：１９１１−１９１５（１９９９）
【非特許文献２】Ｋ．Ｉｎｏｕｙｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，４６：２４８−２５５（２００６）
【非特許文献３】遠藤滋俊、醗酵工学会誌，４０：３４６−３５３（１９６２）
【非特許文献４】井上國世、生化学，６６：４４６−４５０（１９９４）
【非特許文献５】井上國世、食品酵素化学の最新技術と応用，シーエムシー出版：１０５−１１４（２００４）
【非特許文献６】Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅら、Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３００：５９９−６０３（１９９４）
【非特許文献７】半澤敏、キラルテクノロジーの工業化，シーエムシー出版：６０−６９（１９９８）
【非特許文献８】Ｖ．Ｇ．Ｈ．Ｅｉｊｓｉｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１３：１０４−１２０（２００４）
【非特許文献９】Ｍ．Ｋｕｓａｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３９：１０１７−１０２３（２００６）
【非特許文献１０】Ｕ．Ｐ．Ｓｈｉｎｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３８９：５２０−５２２（１９９７）
【非特許文献１１】Ｕ．Ｓｈｉｎｄｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１５６１５−１５６２１（１９９９）
【非特許文献１２】Ｍ．Ｊ．Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２６４７７−２６４８１（１９９６）
【非特許文献１３】Ｃ．Ｍａｒｉｅ−Ｃｌａｉｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：５６９７−５７０１。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
代表的な亜鉛金属プロテアーゼである中等度好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓが生産するサーモライシン（ＴＬＮ：Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）は、菌体外プロテアーゼの１つであり（非特許文献３）、アミノ酸残基数２８のシグナル配列、アミノ酸残基数２０４のプロ配列、およびアミノ酸残基数３１６の成熟配列が連続する、総アミノ酸残基数５４８のプレプロ型として菌体内にて合成される。
【０００６】
ＴＬＮは、１分子あたりに、活性に必須の亜鉛イオン１個と安定化に必要なカルシウムイオン４個とを含有する。ＴＬＮは、疎水性アミノ酸残基のアミノ基側のペプチド結合を特異的に切断するが、その逆反応の縮合反応においても、同様の基質特異性を示す。また非特許文献４および５に記載されているように、ＴＬＮの活性、安定性、および溶解度が、高濃度の塩（１〜４Ｍ）によって著しく増大することが知られており、媒質の誘電率およびＴＬＮの分子表面のアミノ酸残基がＴＬＮの酵素特性に関して重要であることが示唆されている。Ｘ線構造解析により決定されたＴＬＮの立体構造から、Ｇｌｕ１４３およびＨｉｓ２３１が、触媒活性に重要なアミノ酸残基であると予想される。
【０００７】
このようにＴＬＮの化学構造、触媒活性発現機構等の基礎的な研究が進められているため、これらの知見に基づいてＴＬＮの組換体形成を計画的に行い得る。すなわち、ＴＬＮはタンパク質工学的な酵素機能改変の研究を行うのに適した題材であると言える。変異型ＴＬＮの発現系として、非特許文献６に記載の枯草菌または非特許文献４に記載の大腸菌を宿主としたものが開発されており、触媒活性、熱安定性等が向上し、酵素活性のｐＨ特性が改変された変異型ＴＬＮが作製されている（非特許文献７および８）。
【０００８】
しかしながら、非特許文献１に記載の第１の発現方法は、成熟型のプロテアーゼを菌体外に生産する方法ではなく、発現させた成熟配列およびプロ配列がインクルージョンボディに含まれてしまう。発現させたプロテアーゼを活性化するためには、インクルージョンボディを可溶化した後に得られた成熟ポリペプチドをリフォールディングする必要があるが、可溶化およびリフォールディングするための条件を最適化することが困難であり、かつ操作が煩雑である。また、非特許文献２に記載の第２の発現方法は、プロテアーゼが有する活性機構を用いた発現方法であるため、自己触媒的な切断活性が低下または消失した変異型プロテアーゼを発現させることができない。
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、自己触媒的切断活性を有さないプロテアーゼであっても成熟型のプロテアーゼを菌体外に生産するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、このプロテアーゼの自己触媒的切断活性の有無に依存しない、菌体外プロテアーゼの発現系を構築することを目的とし、その必要条件を検討した。しかし、目的のプロテアーゼが菌体外に分泌されず、特に、精製困難な封入体（インクルージョンボディ）中に目的のポリペプチドが含まれてしまい、微生物由来の菌体外プロテアーゼを細胞外に産生させることができなかった。しかし、本発明者らの独自の観点に基づく創意工夫の結果、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明に係る発現ベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、別個のプロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはそれぞれ第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードし、第１のポリペプチドは、該プロテアーゼの成熟配列が第１のシグナル配列に連結されており、第２のポリペプチドは、該プロテアーゼのプロ配列が第２のシグナル配列に連結されていることを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る発現ベクターにおいて、上記プロテアーゼは、ＴＬＮ、ズブチリシン、放線菌プロテアーゼＢ、α−溶菌プロテアーゼ、アクアリシンＩ、およびストレプトペインからなる群より選択されることが好ましい。
【００１３】
本発明に係る発現ベクターにおいて、上記プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号３に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有しているポリペプチド、であることが好ましい。
【００１４】
本発明に係る発現ベクターにおいて、上記プロテアーゼのプロ配列からなるポリペプチドが、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号５に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドに対するフォールディング活性を有しているポリペプチド、であることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る発現ベクターにおいて、第１のシグナル配列はｐｅｌＢリーダー配列であることが好ましい。
【００１６】
本発明に係る発現ベクターにおいて、第２のシグナル配列は上記プロテアーゼのプレ配列であることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る発現ベクターにおいて、第１のポリヌクレオチドは、ｎｐｒプロモーター配列に作動可能に連結されていることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る発現ベクターにおいて、第２のポリヌクレオチドは、ｎｐｒプロモーター配列に作動可能に連結されていることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る発現ベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、プロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは第１のポリペプチドをコードし、第１のポリペプチドは、該プロテアーゼの成熟配列が第１のシグナル配列に連結されていることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係る発現ベクターはまた、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、プロモーター配列に作動可能に連結された第２のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドは第２のポリペプチドをコードし、第２のポリペプチドは、該プロテアーゼのプロ配列が第２のシグナル配列に連結されていることを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る生産方法は、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、該プロテアーゼの成熟配列からなる第１のポリペプチドを、該プロテアーゼのプロ配列からなりかつ第１のポリペプチドのフォールディングを担う第２のポリペプチドとともに細胞内で発現させる工程を包含することを特徴としている。
【００２２】
本発明に係るキットは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、該プロテアーゼの成熟配列からなる第１のポリペプチドと、該プロテアーゼのプロ配列からなりかつ第１のポリペプチドのフォールディングを担う第２のポリペプチドとを細胞内で発現させるための発現ベクターを備えていることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係る発現ベクターセットは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、第１のベクターおよび第２のベクターを含み、第１のベクターは：プロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドを含み；第１のポリヌクレオチドは第１のポリペプチドをコードし；第１のポリペプチドは、該プロテアーゼの成熟配列が第１のシグナル配列に連結されており、第２のベクターは：プロモーター配列に作動可能に連結された第２のポリヌクレオチドを含み；第２のポリヌクレオチドは第２のポリペプチドをコードし；第２のポリペプチドは、該プロテアーゼのプロ配列が第２のシグナル配列に連結されていることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る形質転換体は、上記ベクターのいずれか１つを含んでいることを特徴としている。
【００２５】
本発明に係る生産方法は、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、上記形質転換体を用いる工程を包含することを特徴としている。
【００２６】
本発明に係るキットは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明を用いれば、活性部位への変異導入によって、自己触媒的な切断活性が変化した変異型プロテアーゼであっても成熟型のプロテアーゼを菌体外に生産し得る。また、本発明を用いれば、自己触媒的な切断活性が低下したことによって、発現量が低下した変異型プロテアーゼを大量に生産し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
上述したように、微生物の菌体内にて合成されるプロテアーゼを、菌体外に分泌させるためには、プロテアーゼの成熟ポリペプチドおよび成熟ポリペプチドのフォールディングに関与するプロ配列ポリペプチドを菌体内において発現させる必要がある。非特許文献４に記載の発現方法を用いた場合、成熟配列とプロ配列とが連続するプロ型配列として菌体内にて合成されたプロテアーゼは、成熟配列とプロ配列との間のペプチド結合を自己触媒的に切断することによって菌体外に分泌される。
【００２９】
本発明者らは、このプロテアーゼの自己触媒的切断活性の有無に依存しない、菌体外プロテアーゼの発現系を構築することを目的とし、その必要条件を検討した。
【００３０】
まず、プロテアーゼの成熟配列とプロ配列とを、菌体内においてそれぞれ独立したポリペプチドとして発現させることによって、成熟型プロテアーゼを菌体外に分泌させることを試みた。成熟配列とプロ配列とをそれぞれ独立したポリペプチドとして菌体内に発現させるために、それぞれ別個のプロモーターによって発現制御させる必要がある。このため、成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドを、それぞれ別個のプロモーター配列に作動可能に連結させ、発現ベクターを構築した。なお、プロ配列ポリペプチドによる成熟ポリペプチドのフォールディングを適切に行うためには、両ポリペプチドがペリプラズムに移行する必要がある。このため、独立した２つのポリペプチドをペリプラズムに移行させるために、成熟配列およびプロ配列にそれぞれ別個のシグナル配列を連結させた。
【００３１】
このように構築した発現ベクターを形質転換した細胞は、プロテアーゼの自己触媒的切断活性に依存することなく、成熟プロテアーゼを菌体外に分泌させた。
【００３２】
〔１：発現ベクター〕
本発明は、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するためのベクターを提供する。本明細書中で使用される場合、「微生物由来の菌体外プロテアーゼ」は、微生物によって産生される菌体外分泌型のプロテアーゼが意図され、単に「菌体外プロテアーゼ」と称する場合もある。
【００３３】
微生物由来の菌体外プロテアーゼとしては、ＴＬＮ、ズブチリシン、放線菌プロテアーゼＢ、α‐溶菌プロテアーゼ、アクアリシンＩ（ａｑｕａｌｙｓｉｎ Ｉ）およびストレプトペイン（ｓｔｒｅｐｔｏｐａｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。上述したように、微生物由来の菌体外プロテアーゼは、不活性のプレプロ型酵素（プレ配列、プロ配列および成熟配列が連続する１本のポリペプチド）として菌体内にて合成され、プレプロ型酵素はプロセッシングを受けた後に成熟型酵素（すなわち、成熟配列からなる「成熟ポリペプチド」）として菌体外へ分泌されることが知られている。
【００３４】
微生物由来の菌体外プロテアーゼのプレ配列は、シグナル配列として機能する部位である。「シグナル配列」は分泌タンパク質などが細胞外へ移行する際に必要な配列であり、当該分野において種々の配列が知られている。本明細書中で使用される場合、「シグナル配列」は、菌体内において発現したポリペプチドをペリプラズムに移行させる機能を有するポリペプチドが意図される。また、シグナル配列は、菌体内において発現した目的のペプチドをペリプラズムに移行させた後、シグナルペプチターゼにより消化され得るポリペプチドであることが意図される。
【００３５】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００３６】
本発明に係るベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するために、プロ配列部分からなるポリペプチド（プロ配列ポリペプチド）と成熟ポリペプチドとが別々のポリペプチドとして発現し得る構成を有していることを特徴としている。すなわち、本発明に係るベクターにおいて、プロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとは、別個のプロモーター配列に作動可能に連結されている。
【００３７】
本明細書中において使用される場合、「作動可能に連結される」は、目的の配列の発現が、特定の転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）の制御下に配置されることが意図される。目的のポリヌクレオチドの上流にプロモーターが配置されることにより、目的のポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結される。なお、プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドと隣接して配置される必要はない。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター配列」は、作動可能に連結されているポリヌクレオチドの転写開始に関与するポリヌクレオチドであることが意図される。本発明に係る発現ベクターに含まれるポリペプチドのプロ配列および成熟配列をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ別個のプロモーター配列に作動可能に連結されている。
【００３９】
このため、それぞれのプロモーター配列は、連結されているポリヌクレオチドの転写を別個独立に制御する。なお、本発明に係る発現ベクターに含まれるプロモーター配列として、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター配列、（ｃｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター）が挙げられるが、これに限定されない。
【００４０】
一実施形態において、本発明に係るベクターは、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。すなわち、本実施形態に係る発現ベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、該プロテアーゼのプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含み、これら２つのポリヌクレオチドは、それぞれ別個のプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴としている。
【００４１】
なお、本実施形態において、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドの両方がペリプラズムに移行する必要があるので、これら２つのポリペプチドはシグナル配列に連結されている。
【００４２】
他の実施形態において、本発明に係るベクターは、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、およびプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターからなるベクターセットであり得る。すなわち、本実施形態に係る発現ベクターは、第１のベクターおよび第２のベクターからなるベクターセットであって、第１のベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、該プロテアーゼのプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含み、これら２つのポリヌクレオチドは、それぞれプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴としている。
【００４３】
なお、本実施形態においてもまた、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドの両方がペリプラズムに移行する必要があるので、これら２つのポリペプチドはシグナル配列に連結されている。
【００４４】
本発明において使用されるシグナル配列としては、上述したように当該分野において公知の種々のシグナル配列が採用され得るが、成熟ポリペプチドに連結されるシグナル配列として好ましいものは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａから得られたペクテートリアーゼＢ（ｐｅｌＢ）リーダー配列、（ｏｍｐＴリーダー配列、ｐｈｏＡリーダー配列）が挙げられるが、これらに限定されない。また、微生物由来の菌体外プロテアーゼ由来のプロ配列ポリペプチドに連結されるシグナル配列として好ましいものは、当該プロテアーゼのプレ配列、（ｐｅｌＢリーダー配列、ｏｍｐＴリーダー配列、ｐｈｏＡリーダー配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
微生物由来の菌体外プロテアーゼ由来の成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドについて、ＴＬＮを例に挙げて説明する。
【００４６】
上述したように、サーモライシン（ＴＬＮ）は、菌体外プロテアーゼの１つであり、２８アミノ酸のシグナル配列、２０４アミノ酸のプロ配列、および３１６アミノ酸の成熟配列が連続する、５４８アミノ酸のポリペプチドとして菌体内にて合成される。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「成熟ポリペプチド」は、「成熟配列からなるポリペプチド」が意図され、「プロテアーゼ活性を有するポリペプチド」と交換可能に使用される。
【００４８】
ＴＬＮの成熟ポリペプチドを構成する成熟配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列として提供され、当該成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構成する塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列として提供される。
【００４９】
１つの局面において、ＴＬＮ成熟ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの変異体でありかつプロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００５０】
他の局面において、ＴＬＮ成熟ポリペプチドは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドの変異体によってコードされるポリペプチドであって、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００５１】
また、本明細書中で使用される場合、「プロ配列ポリペプチド」は、「プロ配列からなるポリペプチド」が意図され、「プロペプチド」または「フォールディング活性を有するポリペプチド」と交換可能に使用される。また、本明細書中で使用される場合、「フォールディング活性」は、菌体内において成熟配列をフォールディングする機能活性が意図され、「シャペロン活性」と交換可能に使用される。
【００５２】
ＴＬＮのプロ配列ポリペプチドを構成する成熟配列は、配列番号５に示されるアミノ酸配列として提供され、当該成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構成する塩基配列は、配列番号４に示される塩基配列として提供される。
【００５３】
１つの局面において、ＴＬＮプロ配列ポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの変異体でありかつプロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００５４】
他の局面において、ＴＬＮプロ配列ポリペプチドは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドの変異体によってコードされるポリペプチドであって、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００５５】
本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、野生型ポリペプチドの有する活性を保持するポリペプチドが意図される。すなわち、本明細書中において使用される場合、ポリペプチドの変異体は、特定のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む変異体であり得る。
【００５６】
ポリペプチドのアミノ酸配列におけるいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変し得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。
【００５７】
本明細書中において遺伝子またはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、具体的な塩基（ヌクレオチド）が異なっても、野生型ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの有する活性を保持したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。すなわち、本明細書中において使用される場合、ポリヌクレオチドの変異体は、（Ｉ）特定の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ＩＩ）特定の塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または（ＩＩＩ）特定の塩基配列と少なくとも８０％同一な塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが意図される。
【００５８】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
【００６０】
このように、微生物由来の菌体外プロテアーゼを具体的に説明するためにＴＬＮを例に挙げて説明したが、本発明において、微生物由来の菌体外プロテアーゼがＴＬＮに限定されないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００６１】
また、本明細書を読んだ当業者は、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するために、本発明に係る発現ベクターが、プロ配列部分からなるポリペプチド（プロ配列ポリペプチド）と成熟ポリペプチドとが別々のポリペプチドとして発現し得る構成を有していればよく、具体的なベクター種に限定される必要はない、ということを容易に理解する。
【００６２】
このように、本発明に係る発現ベクターを用いれば、本発明において目的とするポリペプチドを容易に生産することができる。
【００６３】
〔２：形質転換体〕
本発明はさらに、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するための形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図されるが、細胞（特に、原核生物細胞、菌類など）であることが好ましい。
【００６４】
本発明に係る形質転換体は、微生物由来の菌体外プロテアーゼをコードする遺伝子が導入されていることを特徴としており、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドが首尾よく細胞外に分泌され得る。本発明に係る形質転換体は、微生物由来の菌体外プロテアーゼが安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現していてもよい。
【００６５】
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するための発現ベクターを生物中に導入することによって取得され得る。
【００６６】
このように、本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明において目的とするポリペプチドを容易に生産することができる。
【００６７】
〔３：微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドを生産するための方法およびキット〕
上述したように、本発明は、上記ベクターまたは形質転換体を用いるポリペプチドの生産方法、上記ベクターまたは形質転換体を備えているポリペプチド生産用キットもまた提供する。
【００６８】
本発明に係るポリペプチド生産方法は、上述したベクターまたは形質転換体を用いることを特徴としている。また、本発明に係るポリペプチド生産用キットは、上述したベクターまたは形質転換体を備えていることを特徴としている。なお、本明細書中で使用される場合、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質（例えば、容器）中に含有されている形態であることが意図される。
【００６９】
本発明は、成熟型プロテアーゼを菌体外にて組換え的に生産する方法およびキットを提供する。本発明に係る成熟型プロテアーゼの菌体外生産方法を用いれば、自己触媒的な切断活性が変化した変異型プロテアーゼであっても成熟型のプロテアーゼを菌体外に生産し得る。また、自己触媒的な切断活性が低下したことによって、発現量が低下した変異型プロテアーゼを大量に生産し得る。
【００７０】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチド生産方法は、本発明に係る発現ベクターを用いることを特徴としており、本発明に係る発現ベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含する。上記の工程により形質転換された細胞内において、本発明に係る発現ベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現され、細胞外に分泌される。
【００７１】
上記の工程において形質転換された細胞内において、本発明に係る発現ベクター（または発現ベクターセット）に含まれている第１のポリヌクレオチド（すなわち、シグナル配列に連結された成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）および第２のポリヌクレオチド（すなわち、シグナル配列に連結されたプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）はそれぞれ別個のプロモーター配列に作動可能に連結されているため、成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドを別個独立して発現させることが可能である。
【００７２】
形質転換細胞内にて独立して発現した第１のポリペプチド、すなわち第１のシグナル配列に連結された成熟配列からなるポリペプチド、および第２のポリペプチド、すなわち第２のシグナル配列に連結されたプロ配列からなるポリペプチドが、それぞれのシグナル配列の機能によりペリプラズムに移行される。ペリプラズムに移行した成熟ポリペプチドはプロ配列ポリペプチドによってフォールディングされることにより成熟型プロテアーゼに変換され、次いで細胞外に分泌される。
【００７３】
上述したように、本発明に係るポリペプチド生産方法を用いれば、プロテアーゼの自己触媒的切断活性を必要とせずに、成熟型プロテアーゼを菌体外に生産し得る。
【００７４】
本発明に係る発現ベクターを宿主に導入する方法としては、特に限定されず、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、本発明の発現ベクターを用いて形質転換される細胞として、枯草菌細胞、大腸菌細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびバチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００７５】
本発明に係るポリペプチド生産用キットは、本発明に係る発現ベクターを備えていることを特徴としている。好ましい実施形態において、本発明に係るポリペプチド生産用キットは、形質転換すべき細胞をさらに備えていることが好ましい。これにより、本発明の発現ベクターを用いて細胞を形質転換し、形質転換細胞内において本発明の発現ベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードする成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドを、別個独立して発現させることが可能である。形質転換細胞内にて発現した成熟ポリペプチドはプロ配列ポリペプチドによってフォールディングされることにより成熟型プロテアーゼに変換され、次いで細胞外に分泌される。
【００７６】
なお、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドを生産するための方法およびキットは、上述した態様に限定される必要はなく、上述した以外のポリペプチドの生産方法およびポリペプチド生産用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００７７】
以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７８】
［１．材料および方法］
〔１．菌株、プラスミドベクター、および形質転換体の作製〕
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０９細胞（ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），Ｆ’（ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ，ｌａｃＺ ΔＭ１５））を、宿主として用いた。また、ｎｐｒ遺伝子およびプロモーター領域を含む発現プラスミドベクターｐＴＥ１（非特許文献２）を、ＰＣＲのテンプレートとして用いた。
【００７９】
プライマー対（５’−ＴＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＴ−３’（配列番号１０）、および５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＧ−３’（配列番号１１））を用いて、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター領域を含む２７９塩基対のＤＮＡ断片をクローニングした。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｄｅ Ｉ）で消化した。制限酵素で消化したＤＮＡ断片を、制限酵素（Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｄｅ Ｉ）で消化したｐＥＴ−２２ｂ（＋）（タカラバイオ製）に挿入し、ｐＥＴ−５’を作製した。
【００８０】
同様に、プライマー対（５’−ＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＡＡＣＡＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＴＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１２）、および５’−ＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＧＡ−３’（配列番号１３））を用いて、ＴＬＮの成熟配列をコードする遺伝子を含む１０２９塩基対のＤＮＡ断片をクローニングした。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉ）で消化した。制限酵素で消化したＤＮＡ断片をｐＵＣ１９（タカラバイオ製）に挿入し、ｐＵＣ−Ｍを作製した。
【００８１】
さらに、プライマー対（５’−ＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号１４）、および５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＴ−３（配列番号１５））を用いて、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター領域、およびＴＬＮのプレプロ配列をコードする遺伝子を含む９７５塩基対のＤＮＡ断片をクローニングした。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（Ｂｇｌ ＩＩおよびＥｃｏ ＲＩ）で消化した。制限酵素で消化したＤＮＡ断片を前述のｐＵＣ−Ｍに挿入し、ｐＵＣ−ＭＰ１を作製した。
【００８２】
また、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター領域、およびｐｅｌＢシグナル配列をコードする遺伝子を含むｐＥＴ−５’を制限酵素（Ｐｓｔ Ｉ−Ｎｃｏ Ｉ）で消化した。消化したＤＮＡ断片を、制限酵素（Ｐｓｔ ＩおよびＮｃｏ Ｉ）で切断したｐＵＣ−ＭＰ１、および制限酵素（Ｐｓｔ ＩおよびＮｃｏ Ｉ）で切断したｐＵＣ−Ｍにそれぞれ挿入し、プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１（図１（ｂ））およびｐＵＣ−ＴＭ１（図１（ｄ））を作製した。
【００８３】
次に、プライマー対（５’−ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号１６）、および５’−ＣＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＡＧＣＧＣＡＴＴＧＴＡＡＧＧＴＡＡＡ−３’（配列番号１７））を用いて、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター領域、およびプレ配列を含む３６３塩基対のＤＮＡ断片をクローニングした。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（ＰｓｔＩおよびＮｃｏＩ）を用いて消化した。消化したＤＮＡ断片を前述のｐＵＣ−ＭＰ１に挿入し、ｐＵＣ−ＴＭＰ２を作製した（図１（ｃ））。
【００８４】
部位特異的突然変異誘発を、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行った。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＤＳＱ−２０００（Ｋｙｏｔｏ）を用いて、変異ＴＬＮ遺伝子のヌクレオチド配列を照合した。上述したように作製したプラスミドベクターを導入したＪＭ１０９細胞を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ ｂｒｏｔｈ培地において培養した。
【００８５】
なお、図１（ａ）〜（ｄ）において、下線が付された塩基配列はプロモーター配列を示し、下線および“ＳＤ”が付された塩基配列は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を示す。また、図１（ａ）〜（ｃ）において塩基配列上に付された矢印は、プレ配列とプロ配列との間の推定切断部位を示し、図１（ｄ）において塩基配列上に付された矢印は、プレ配列と成熟配列との間の推定切断部位を示す。
【００８６】
〔２．発酵〕
形質転換ＪＭ１０９細胞のグリセロールストックを、５ｍｌのＬ ｂｒｏｔｈ培地に播種した。この培地を３７℃でインキュベートし、細胞数がＯＤ６００＝０．６になるまで増殖させた。次に、５００ｍｌフラスコ中のＬ ｂｒｏｔｈ培地２００ｍｌ中において、培地を１：１００に希釈した。適切な時間経過後に培地１ｍｌをピペットで採取し、遠心分離した。遠心分離により得られた上清を用いて、混濁度（ＯＤ６００）およびカゼイン加水分解活性を測定した。
【００８７】
〔３．カゼイン加水分解活性の測定〕
形質転換ＪＭ１０９細胞の上清を用いて、カゼイン加水分解活性を測定した。１．３３％（ｗ／ｖ）カゼインおよび４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液１．５ｍｌ中に、サンプル（０．５ｍｌ）を添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。この溶液中に、０．１１Ｍトリクロロ酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、および０．３３Ｍ酢酸を含む溶液２ｍｌを添加することによって反応を停止させた。反応液をＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．２ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ（直径７０ｍｍ）を用いてろ過し、Ａ２７５を測定した。０．００７４のＡ２７５（チロシン１μｇのＡ２７５）／ｍｉｎにおける増加に対応する量の酸溶ペプチドを遊離させるのに必要な酵素活性量を、活性１単位と規定した。
【００８８】
〔４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を、Ｌａｅｍｍｌｉ法による還元状態の下、１２．５％ポリアクリルアミドゲル中において行った。４０ｍＡの一定電流を１時間印加した。２．５％ ２−メルカプトエタノールと共に１００℃で１０分間処理することによって、上清を還元した。タンパク質バンドを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色した。ウサギ筋ホスホリラーゼｂ（分子量９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．３ｋＤａ）、ウサギ筋アルドラーゼ（４２．４ｋＤａ）、ウシ赤血球カルボニックアンヒドラーゼ（３０．０ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、および鶏卵白リゾチーム（１４．４ｋＤａ）を含む分子量マーカーキット（第一純薬）を用いた。
【００８９】
〔５．ＴＬＮの精製〕
ＴＬＮを以下のように精製した。形質転換ＪＭ１０９細胞のグリセロールストック５ｍｌをＬ ｂｒｏｔｈ培地に播種した。この細胞を３７℃で１２時間増殖させた後、１ｌフラスコ中のＬ ｂｒｏｔｈ培地５００ｍｌ中において培養し、３７℃、０．１％（ｗ／ｖ）ａｎｔｉ−ｆｏａｍ Ａ（Ｓｉｇｍａ社）、およびエアポンプによる活発な送風状態下において、インキュベートした。この培養大腸菌細胞の上清を、カラムクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーにより連続して精製した後に、親和性クロマトグラフィーに供することによって、活性化および成熟野生型ＴＬＮを均一に精製した。反応速度の測定の前に、この精製物を、ｐｒｅ−ｐａｃｋｅｄ ＰＤ−１０ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて脱塩した。
【００９０】
〔６．ＦＡＧＬＡ加水分解活性の測定〕
分子吸光係数ε３４５＝７６６Ｍ−１・ｃｍ−１を用いて分光測定的に決定した濃度のＮ−［３−（２−ｆｕｒｙｌ）ａｃｒｙｌｏｙｌ］−ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｄｅ（ＦＡＧＬＡ）（Ｌｏｔ １１１Ｋ１７６４：Ｓｉｇｍａ社）を用いた。ＴＬＮによるＦＡＧＬＡの加水分解を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（島津製作所製）を用いて、吸光度３４５ｎｍにおいて見られた減少度により測定した。分解したＦＡ−ジペプチドアミドの量を、２５℃における、Δε３４５＝−３１０Ｍ−１・ｃｍ−１により決定した。
【００９１】
それぞれ１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む、ｐＨ４．０〜５．５の４０ｍＭ酢酸ＮａＯＨバッファー、ｐＨ５．５〜７．０の４０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー、ｐＨ７．０〜８．５の４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー、およびｐＨ８．０〜９．０のＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー中において変異型ＴＬＮを反応させた。ＦＡＧＬＡの溶解度（＜６ｍＭ）が低いため、ミカエリス定数Ｋｍ（＞３０ｍＭ）より低い基質濃度でＦＡＧＬＡを添加し、偽一次反応として反応させた。この状態下において、反応速度パラメーターであるＫｍおよび分子活性ｋｃａｔを、それぞれ別々に決定することはできなかったが、ｐＨ４．０〜９．０の偽一次反応として酵素反応を行った。そしてこの酵素活性を、特異性定数ｋｃａｔ／Ｋｍにより評価した。
【００９２】
〔７．ＺＤＦＭ加水分解活性の測定〕
Ｎ−ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＺＤＦＭ）濃度を分子吸光係数ε２５７＝３８７Ｍ−１・ｃｍ−１を用いて決定した。ＴＬＮ触媒ＺＤＦＭ加水分解を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（島津製作所製）を用いて、吸光度２２４ｎｍにおいて見られた減少度により測定した。ＺＤＦＭ加水分解量を、２５℃における、Δε２２４＝−４９３Ｍ−１・ｃｍ−１により決定した。１０ｍＭＣａＣｌ２を含む４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー中に０．１μＭ ＴＬＮを添加し、２５℃で反応させた。反応速度パラメーターであるｋｃａｔおよびＫｍを、非線形最小二乗法を用いて、ミカエリスメンテン式に基づいて決定した。
【００９３】
［２．結果］
〔２−１．成熟配列およびプロ配列を共発現させるためのプラスミドベクターの作製〕
図１（ａ）は、本発明者らが、非特許文献２において報告した発現プラスミドベクターｐＴＥ１を示す図である。ｐＴＥ１は、大腸菌においてＴＬＮを菌体外に分泌させることができた。ｐＴＥ１は、変異プロモーター配列“ＴＴＴＣＣＣ”、および“ＡＡＴＡＴＴ”、変異ＳＤ配列“ＡＡＧＧＡＧＧ”、ならびにプレ配列（２８残基）、プロ配列（２０４残基）、および成熟配列（３１６残基）をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。プロ型ＴＬＮが菌体外に分泌されるために、プロ配列と成熟配列との間のペプチド結合が自己触媒的に切断されなければならない。本発明者らは、自己触媒的切断処理を必要とせずにＴＬＮを菌体外に分泌するために、ｐＴＥ１を起源とする２つのプラスミドベクター、ｐＵＣ−ＴＭＰ１（図１（ｂ））およびｐＵＣ−ＴＭＰ２（図１（ｃ））を作製した。
【００９４】
両プラスミドベクターを、ｎｐｒ遺伝子におけるオリジナルのプロモーター配列支配下において、Ｎ末端にｐｅｌＢリーダー配列（ｐＵＣ−ＴＭＰ１）またはＴＬＮのオリジナルのプレ配列（ｐＵＣ−ＴＭＰ２）のいずれかを含むＴＬＮの成熟配列、およびＴＬＮのプレプロ配列を共発現するように設計した。ここで、ＰｅｌＢは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａから得られるペクテートリアーゼＢであり、その２２アミノ酸シグナル配列は主として大腸菌における変異型タンパク質の細胞外生産のためのシグナル配列として用いられている。本発明者らは、プロペプチドの必要性を確認するために、Ｎ末端ｐｅｌＢリーダー配列を含むＴＬＮの成熟配列のみを含むｐＵＣ−ＴＭ１もまた作製した（図１（ｄ））。
【００９５】
〔２−２．変異型ＴＬＮの菌体外生産〕
ＴＬＮのＧｌｕ１４３は、ＴＬＮの触媒作用に重要な残基である。野生型ＴＬＮをコードするヌクレオチド、またはＧｌｕ１４３が変異したＥ１４３Ａをコードするヌクレオチドを含むプラスミドベクターを、それぞれＪＭ１０９細胞に導入した。形質転換細胞を、試験管内で２４時間培養し、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を、図２（ａ）に示す。図２（ａ）の第１レーンはマーカータンパク質、第２レーンはＢ. ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓから得た野生型ＴＬＮを示す。また、第３レーンから第９レーンは、それぞれ順にｐＵＣ１９、ｐＴＥ１、ｐＴＥ１−Ｅ１４３Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ２、およびｐＵＣ−ＴＭ１を示す。
【００９６】
従来の自己触媒的切断が必要な発現方法で発現させた場合、発現プラスミドベクターｐＴＥ１（第４レーン）では成熟型ＴＬＮに対応する３４ｋＤａのタンパク質バンドが検出されたが、変異型発現プラスミドベクターｐＴＥ１−Ｅ１４３Ａ（第５レーン）では検出されなかった。しかしながら、本発明の方法において発現させた場合、発現プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１（第６レーン）、および変異型発現プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａ（第７レーン）の両方において３４ｋＤａタンパク質バンドが検出された。この結果は、自己触媒的切断活性が欠落した変異型ＴＬＮが、成熟配列およびプロ配列を独立して発現させることにより、菌体外に分泌されることを示唆している。
【００９７】
一方、本発明の発現方法で発現させた場合、発現プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ２（第８レーン）では、３４ｋＤａタンパク質バンドは現れなかった。このことは、成熟配列が適切にフォールディングされるためにプロペプチドが必要であることを示している。ＴＬＮのプロペプチドに対応する２２ｋＤａタンパク質バンドは、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａ（第７レーン）でのみ検出された。
【００９８】
図３（ａ）〜（ｆ）は、図２（ａ）に示す結果に基づいて予想される変異型ＴＬＮの異成熟経路を示す。ｐＴＥ１（図３（ａ））およびｐＵＣ−ＴＭＰ１（図３（ｃ））において、プロペプチドが最終的に活性ＴＬＮおよび／または菌体外プロテアーゼに分解される一方で、非特許文献１に記載されているように、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａは触媒活性を喪失するが基質結合能は保持しているため、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａでは、成熟型ＴＬＮはプロペプチドとの複合体として存在することが予測される（図３（ｄ））。
【００９９】
図２（ｂ）は、Ａｓｎ１１２変異配列をそれぞれ含むプラスミドベクターを導入した大腸菌細胞の培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を示す。図２（ｂ）の第１レーンはマーカータンパク質、第２レーンはＢ. ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓから得た野生型ＴＬＮを示す。第３レーンから第１０レーンは、それぞれ順にｐＵＣ−１９、ｐＵＣ−ＴＭＰ１、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｄ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｅ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｈ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｋ、およびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｒを示す。
【０１００】
非特許文献９に示すように、自己触媒的切断が必要な従来の発現方法で発現させた場合、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２ＤおよびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｅにおいてのみ３４ｋＤａタンパク質バンドが検出された（図示せず）。一方で、本発明の発現方法で発現させた場合、すべてのＡｓｎ１１２変異体において３４ｋＤａタンパク質バンドが検出された（第５〜１０レーン）。Ａｓｎ１１２変異カゼイン加水分解活性は、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２ＤおよびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｅにおいてのみ検出され、その他のＡｓｎ１１２変異体ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｈ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｋ、およびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｒでは検出されなかった（データ示さず）。
【０１０１】
そして、これらすべてのＡｓｎ１１２変異型ＴＬＮにおいて、プロペプチドに対応する２２ｋＤａのタンパク質バンドは見られなかった。このことから、４つのＡｓｎ１１２変異体（ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｈ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｋ、およびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｒ）は、基質結合能を喪失したことが示唆される。
【０１０２】
図４（ａ）は、形質転換細胞培養培地における細胞数の時間推移を示す図であり、図４（ｂ）は、培養細胞の上清のカゼイン加水分解活性を示す図である。従来の発現方法および本発明の発現方法で発現させた、発現プラスミドベクターｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１においては、カゼイン加水分解活性が示され、培養液中の細胞数が最大レベルに達した後でさえその活性は徐々に増加した。一方で、従来の発現方法および本発明の発現方法で発現させた、変異型発現プラスミドベクターｐＴＥ１−Ｅ１４３ＡおよびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａにおいては、培養液中の細胞数（ＯＤ６００）は時間の経過に伴って増加したが、カゼイン加水分解活性は現れなかった。
【０１０３】
〔２−３．変異型ＴＬＮの精製〕
ｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１を導入した大腸菌細胞から得た上清を、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ親和性クロマトグラフィーを順に行うことによって、２つの野生型ＴＬＮをそれぞれ、均一になるまで精製した。カゼインプレートを用いて、この２つの野生型ＴＬＮ断片のカゼイン加水分解活性を測定し、活性を有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図５）。
【０１０４】
図５に示す第１レーンはマーカータンパク質、第２レーンはＢ. ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓから得た野生型ＴＬＮを示す。第３レーンおよび第６レーンはそれぞれｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１を導入した大腸菌細胞の上清を示し、第４レーンおよび第７レーンは、それぞれｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１を導入した大腸菌細胞の上清を疎水性相互作用クロマトグラフィー処理することにより得られた活性を有する画分を示し、第５レーンおよび第８レーンは、それぞれ上記の活性を有する画分をＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ親和性クロマトグラフィー処理することにより得られた活性を有する画分（すなわちＴＬＮ精製物）を示す。ＴＬＮ精製物（第５および第８レーン）において、３４ｋＤａの分子量を表す単一バンドが検出された。
【０１０５】
ｐＵＣ−ＴＭＰ１を導入した大腸菌細胞の培養上清から得たＴＬＮの代表的な精製データを表１に示す。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
８．０ｍｇＴＬＮを含む上清３５０ｍｌを用いて精製を開始し、最終的に２．４ｍｇのＴＬＮを回収した。これは、ｐＴＥ１が導入された大腸菌細胞の培養上清から得たＴＬＮの精製効率（上清３５０ｍｌからＴＬＮ１．５ｍｇを回収）に匹敵する（データ示さず）。
【０１０８】
〔２−４．ＴＬＮの特性〕
本発明の発現方法で発現させた、発現プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１から得たＴＬＮ、および従来の発現方法で発現させた、発現プラスミドベクターｐＴＥ１から得たＴＬＮの活性特性を比較した。２５℃におけるこれらのＦＡＧＬＡ加水分解活性のｐＨ依存性の測定結果を図６（ａ）に示し、速度パラメーターを表２に示す。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
図６（ａ）に示すように、ｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１から得たＴＬＮの最適ｐＨはそれぞれ６．５〜７．０周辺であり、両ＴＬＮはｐＨ依存性において類似していた。また、表２に示すように、両ＴＬＮのＦＡＧＬＡ加水分解反応速度は同等であった。
【０１１１】
０．１μＭ ＴＬＮを含む溶液中において、ＺＤＦＭ（０〜１．５ｍＭ）濃度を変化させた場合における加水分解活性、すなわちＴＬＮのＺＤＦＭ加水分解反応における基質濃度の影響を測定し、測定結果を図６（ｂ）に示す。さらに速度パラメーターを表３に示す。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
図６（ｂ）に示すように、ＺＤＦＭの濃度上昇に伴って、ＴＬＮの加水分解活性も上昇した。表３に示すように、Ｋｍ値およびｋｃａｔ値は２つのＴＬＮ間で相対的に同等であった。これらの結果から、この２つのＴＬＮ、ｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１から得たＴＬＮは、異なる成熟過程を経ているが、その活性特性は同一であることを示唆している。
【０１１４】
〔２−５．自己触媒的切断活性を有さない変異型ＴＬＮの生産〕
菌体外プロテアーゼのタンパク質工学における問題点の１つは、いくつかの変異体において自己触媒的切断活性が顕著に不足している、または完全に欠失する可能性を有することである。ＴＬＮの場合、いくつかの活性部位変異体は成熟酵素にまでプロセスされない。この問題を解決するために従来用いられていた主な技術は、インクルージョンボディ中にプロ配列および成熟配列を別々のポリペプチドとして菌体内で発現させた後に、可溶化およびリフォールディング処理するものである。この技術は、プロペプチドが分子内シャペロンとして機能することを示す先駆的な研究として、ズブチリシンおよびα‐溶菌プロテアーゼにおいて最初に報告され、後に、ＴＬＮ、アクアリシンＩ、およびストレプトペインにおいて報告された。
【０１１５】
しかしながら、上記の方法は、リフォールディング条件を経験的に調節する必要がある等最適化が困難であり、かつ処理が煩雑であるため、多種類の変異型プロテアーゼを生産するのに適さない。上記の問題を解決するその他の従来の方法は、基質特異性が変化した変異型プロテアーゼの自己触媒的切断部位において、アミノ酸配列を最適化する方法である。この方法は、ズブチリシンおよび放線菌プロテアーゼＢにおいて報告されたが、一般的ではない。
【０１１６】
本発明のプロテアーゼ発現方法においては、Ｎ末端にｐｅｌＢリーダー配列を含むＴＬＮの成熟配列およびＴＬＮのプレプロ配列を、独立したポリペプチドとして、菌体内に共発現させた。活性部位Ｅ１４３Ａ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１１２Ｈ、Ｎ１１２ＫおよびＮ１１２Ｒのような変異型ＴＬＮは、従来の自己触媒的切断を用いる発現方法では分泌されなかった。しかしながら、本発明の発現方法では、このような変異体であっても野生型とほぼ同じ発現レベルで培養液中に分泌された。
【０１１７】
本発明のプロテアーゼ発現方法における重要なポイントの１つは、最適なシグナルペプチドを選択することにある。成熟ポリペプチドおよびプロペプチドは、細胞質膜を横切ってペリプラズムに移動した後シグナルペプチターゼによる処理を受ける必要がある。野生型ＴＬＮでは、プレプロ酵素が大腸菌内において発現し、活性型ＴＬＮが細胞外に分泌される。本発明者らは、プロ配列のためのシグナルペプチドとして、ＴＬＮのオリジナルのプレ配列を用いた。そして成熟配列のためのシグナルペプチドとして、大腸菌における変異型タンパク質の発現に最もよく用いられるシグナルペプチドの１つである、ｐｅｌＢリーダー配列を用いた。図２（ａ）の第６レーンに示されるように、ＴＬＮのオリジナルのプレ配列およびプロ配列、ならびにｐｅｌＢリーダー配列およびＴＬＮの成熟配列を含む発現ベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１を用いた場合、成熟型ＴＬＮは菌体外に分泌された。しかしながら、ＴＬＮのオリジナルのプレ配列は、ＴＬＮ成熟配列のシグナルペプチドとして機能しなかった（図２（ａ）の第８レーンおよび図３（ｅ））。
【０１１８】
本発明のプロテアーゼ発現方法におけるもう１つの重要なポイントは、インクルージョンボディの形成を避けたことである。これは、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｎｐｒ遺伝子において、それぞれオリジナルのプロモーター配列の支配下でＴＬＮのプロ配列および成熟配列を発現させることによって達成した。図１（ａ）〜（ｄ）に示すように、大腸菌においてｎｐｒ遺伝子は、推定プロモーターおよびＳＤ配列を含む。本発明の発現方法で発現させた場合、封入体の構成を避けるのに十分であり、かつ可能な限り低いレベルで、成熟ポリペプチドおよびプロペプチドは別々のペプチドとして発現した。従来の発現方法と比較するために、本発明者らはＴ７プロモーターの支配下においてＮ末端にｐｅｌＢリーダー配列を含む成熟ＴＬＮとＴＬＮのプレプロ配列とを発現させる発現プラスミドベクターを作製した。この発現プラスミドベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて発現誘導したとき、培養液中に活性を有するＴＬＮは生産されなかった（データ示さず）。このことは、本発明に基づきを、Ｔ７プロモーターの支配下においてＮ末端にｐｅｌＢリーダー配列を含む成熟ＴＬＮとＴＬＮのプレプロ配列とを発現させた場合、ＴＬＮの成熟ポリペプチドおよびプロペプチドは、インクルージョンボディとして発現したため、菌体外に分泌されなかったことを示唆する。
【０１１９】
〔２−６．変異型プロテアーゼ成熟経路の示唆〕
野生型プロペプチドまたはその変異体Ｉ１ｅ（−４８）Ｔ（ズブチリシンＥのプロ配列のアミノ酸残基の番号は、Ｎ末端Ａｌａの−７７から始まり、Ｃ末端のＴｙｒの−１で終了する）のいずれかによりフォールディングされる野生型ズブチリシンＥ、またはその変異体Ｓ２２１Ｃを用いた過去の研究に基づくと、フォールディング処理を以下の２つのステージに分けることができる（非特許文献１０および１１）。それは、自己触媒的切断前の分子内フォールディング、および自己触媒的切断後の分子間フォールディングである。このことは、本発明の発現方法により生産されたＴＬＮが、従来の発現方法により生産されたＴＬＮとは異なるフォールディング機構を有する可能性を示唆する。
【０１２０】
しかしながら、図６、表２、および表３に示す、ＴＬＮのＦＡＧＬＡの加水分解における活性のｐＨ依存性、およびＺＤＦＭの加水分解における反応速度パラメーターが示すように、本発明の発現方法により発現した野生型ＴＬＮと、従来の発現方法により発現した野生型ＴＬＮとは活性特性において同等であった。このことは、分子内フォールディングが、分子間フォールディングに入れ替わり得ることを示唆している。これは、自己触媒的な切断の後に起こり、“プロテインメモリ”と定義されるプロペプチドによる構造的なインプリンティングに一致する。
【０１２１】
従来、ＴＬＮの成熟メカニズムに関するいくつかの研究結果が報告されている。第１の成熟メカニズムの報告においては、ＴＬＮペプチド単独で細胞内可溶タンパク質として発現させたとき、その精製ペプチドが非拮抗的にＴＬＮ活性を阻害したが、変性ＴＬＮのリフォールディングを促進した（非特許文献１２）。第２の成熟メカニズムの報告においては、Ｎ末端にヒスチジンタグが付加されたプロ型ＴＬＮをインクルージョンボディとして発現させ、コバルトを含む樹脂上に溶解および固定したとき、野生型ＴＬＮはリフォールディングバッファを外液として透析することによって自発的に成熟型酵素に変換したが、Ｅ１４３Ａ変異型ＴＬＮは成熟型酵素に変換しなかった（非特許文献１３）。Ｅ１４３Ａ変異型ＴＬＮは、活性を有する野生型ＴＬＮの存在下においてであっても成熟型酵素に変換しないので、ＴＬＮの成熟は分子間ではなく分子内切断を介して進行すると結論づけられている。
【０１２２】
第３の成熟メカニズムの報告において、成熟した野生型ＴＬＮまたはＥ１４３Ａ変異型ＴＬＮは、大腸菌内において独立したポリペプチドとしてプロペプチドとともに共発現させると、野生型ＴＬＮは加水分解活性を、Ｅ１４３Ａ変異型ＴＬＮは基質結合活性をそれぞれ有していた（非特許文献１）。それゆえに、プロペプチドが分子間シャペロンとして機能すると結論づけられている。しかしながら、プロペプチドおよび成熟ポリペプチドの化学量論数および解離定数のような物理化学解析、および複合体の結晶解析は行なわれていない。なぜならば、自己切断される一方でプロペプチドが消化されないズブチリジンＥ変異型Ｓ２２１Ｃのような変異型ＴＬＮはこれまでに得られていないので、上記のような解析が不可能だからである。本発明の発現方法をもちいれば、プロペプチドに結合し、かつプロペプチドを消化しないＥ１４３Ａ変異型ＴＬＮであっても、十分な量の変異型ＴＬＮを生産し得る。さらに本発明の発現方法は、ＴＬＮの成熟メカニズムのさらなる研究に寄与し得る。
【０１２３】
また、本発明の変異型ＴＬＮを菌体外生産する方法は、それぞれ適切なシグナルペプチドをＮ末端に含む成熟配列およびプロ配列を共発現させる工程を含む。本発明者らは、適切なシグナルペプチドおよびプロモーターを選択することによって、本発明のプロテアーゼ生産方法を他の菌体プロテアーゼの菌体外生産に適用可能であると予測する。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
自己触媒的切断活性が低下または消失したプロテアーゼを生産することが困難であったが、本発明を用いれば、このようなプロテアーゼを大量に生産することができるので、本発明は産業用酵素分野の発展に貢献し得る。また、本発明を用いれば、プロテアーゼを成分とする製品、プロテアーゼを生産手段に用いる製品等を大量に生産することができるので、酵素を用いた製品開発に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１（ａ）〜（ｄ）は、ＴＬＮプロテアーゼを発現する発現ベクターを示す図である。
【図２】図２（ａ）は、従来の発現方法および本発明の発現方法により発現させた、野生型ＴＬＮおよびＧｌｕ１４３変異型ＴＬＮ（Ｅ１４３Ａ）の発現を調べたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す写真である。図２（ｂ）は、本発明の発現方法により発現させた、野生型ＴＬＮおよびＡｓｎ１１２変異型ＴＬＮの発現を調べたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３】図３（ａ）〜（ｆ）は、図２（ａ）の結果に基づき予想される、野生型および変異型ＴＬＮの成熟経路を示す図である。
【図４】図４（ａ）は、形質転換体培養液の細胞数の時間推移を示す図であり、図４（ｂ）は、培養細胞の上清のカゼイン加水分解活性を示す図である。
【図５】図５は、従来の発現方法、および本発明の発現方法により発現させた野生型ＴＬＮの精製を調べたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。
【図６】図６（ａ）は、従来の発現方法、および本発明の発現方法により発現させた野生型ＴＬＮによるＦＡＧＬＡ加水分解におけるｐＨの効果を示す図である。図６（ｂ）は、従来の発現方法、および本発明の発現方法により発現させた野生型ＴＬＮのＺＤＦＭ加水分解活性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するための技術に関するものであり、より詳細には、微生物由来の菌体外プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、当該ベクターが導入された形質転換体、ならびに当該ベクターまたは当該形質転換体を用いた菌体外プロテアーゼを生産するための方法およびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物が菌体外に分泌するプロテアーゼ（すなわち、微生物由来の菌体外プロテアーゼ）は、不活性のプレプロ型酵素（シグナル配列、プロ配列および成熟配列が連続する１本のポリペプチド）として菌体内にて合成される。
【０００３】
菌体外プロテアーゼの生産において、シグナル配列は、プレプロ型酵素が細胞内膜を通過してペリプラズムに移行する際のシグナルとして機能する。ペリプラズムに移行したプレプロ型酵素は、そのシグナル配列がシグナルペプチターゼにより切断されることにより、プロ配列および成熟配列からなるプロ型酵素に変換される。プロ型酵素のプロ配列部分は、成熟配列部分をフォールディングする分子内シャペロンとして機能する。そして、プロ型酵素のプロ配列と成熟配列とをつなぐペプチド結合が、自己触媒的に切断されることによって、成熟型酵素（成熟ポリペプチド）に変換された菌体外プロテアーゼは、菌体外に分泌される。
【０００４】
プロテアーゼの成熟配列のフォールディングにプロ配列の存在が不可欠であるという知見に基づいた変異型プロテアーゼの発現方法として、主に以下の２つの方法が報告されている。非特許文献１に記載の第１の発現方法は、大腸菌内において、プロテアーゼの成熟配列およびプロ配列を別々のポリペプチド（成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチド）として発現させ、これらのポリペプチドをインクルージョンボディ（封入体）として回収した後に、可溶化およびリフォールディングすることによって活性回復させる方法である。非特許文献２に記載の第２の発現方法は、本発明者らが変異型サーモライシン（ＴＬＮ：Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）の発現方法として報告したプロテアーゼの発現方法であり、大腸菌内において、ＴＬＮをプレプロ型として発現させ、ＴＬＮの自己触媒的切断活性によって、成熟配列とプロ配列とを切断し、成熟型プロテアーゼを菌体外に分泌させる方法である。
【非特許文献１】Ｃ．Ｍａｒｉｅ−Ｃｌａｉｒｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８５：１９１１−１９１５（１９９９）
【非特許文献２】Ｋ．Ｉｎｏｕｙｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，４６：２４８−２５５（２００６）
【非特許文献３】遠藤滋俊、醗酵工学会誌，４０：３４６−３５３（１９６２）
【非特許文献４】井上國世、生化学，６６：４４６−４５０（１９９４）
【非特許文献５】井上國世、食品酵素化学の最新技術と応用，シーエムシー出版：１０５−１１４（２００４）
【非特許文献６】Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅら、Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３００：５９９−６０３（１９９４）
【非特許文献７】半澤敏、キラルテクノロジーの工業化，シーエムシー出版：６０−６９（１９９８）
【非特許文献８】Ｖ．Ｇ．Ｈ．Ｅｉｊｓｉｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１３：１０４−１２０（２００４）
【非特許文献９】Ｍ．Ｋｕｓａｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３９：１０１７−１０２３（２００６）
【非特許文献１０】Ｕ．Ｐ．Ｓｈｉｎｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３８９：５２０−５２２（１９９７）
【非特許文献１１】Ｕ．Ｓｈｉｎｄｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１５６１５−１５６２１（１９９９）
【非特許文献１２】Ｍ．Ｊ．Ｏ’Ｄｏｎｏｈｕｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２６４７７−２６４８１（１９９６）
【非特許文献１３】Ｃ．Ｍａｒｉｅ−Ｃｌａｉｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：５６９７−５７０１。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
代表的な亜鉛金属プロテアーゼである中等度好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓが生産するサーモライシン（ＴＬＮ：Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）は、菌体外プロテアーゼの１つであり（非特許文献３）、アミノ酸残基数２８のシグナル配列、アミノ酸残基数２０４のプロ配列、およびアミノ酸残基数３１６の成熟配列が連続する、総アミノ酸残基数５４８のプレプロ型として菌体内にて合成される。
【０００６】
ＴＬＮは、１分子あたりに、活性に必須の亜鉛イオン１個と安定化に必要なカルシウムイオン４個とを含有する。ＴＬＮは、疎水性アミノ酸残基のアミノ基側のペプチド結合を特異的に切断するが、その逆反応の縮合反応においても、同様の基質特異性を示す。また非特許文献４および５に記載されているように、ＴＬＮの活性、安定性、および溶解度が、高濃度の塩（１〜４Ｍ）によって著しく増大することが知られており、媒質の誘電率およびＴＬＮの分子表面のアミノ酸残基がＴＬＮの酵素特性に関して重要であることが示唆されている。Ｘ線構造解析により決定されたＴＬＮの立体構造から、Ｇｌｕ１４３およびＨｉｓ２３１が、触媒活性に重要なアミノ酸残基であると予想される。
【０００７】
このようにＴＬＮの化学構造、触媒活性発現機構等の基礎的な研究が進められているため、これらの知見に基づいてＴＬＮの組換体形成を計画的に行い得る。すなわち、ＴＬＮはタンパク質工学的な酵素機能改変の研究を行うのに適した題材であると言える。変異型ＴＬＮの発現系として、非特許文献６に記載の枯草菌または非特許文献４に記載の大腸菌を宿主としたものが開発されており、触媒活性、熱安定性等が向上し、酵素活性のｐＨ特性が改変された変異型ＴＬＮが作製されている（非特許文献７および８）。
【０００８】
しかしながら、非特許文献１に記載の第１の発現方法は、成熟型のプロテアーゼを菌体外に生産する方法ではなく、発現させた成熟配列およびプロ配列がインクルージョンボディに含まれてしまう。発現させたプロテアーゼを活性化するためには、インクルージョンボディを可溶化した後に得られた成熟ポリペプチドをリフォールディングする必要があるが、可溶化およびリフォールディングするための条件を最適化することが困難であり、かつ操作が煩雑である。また、非特許文献２に記載の第２の発現方法は、プロテアーゼが有する活性機構を用いた発現方法であるため、自己触媒的な切断活性が低下または消失した変異型プロテアーゼを発現させることができない。
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、自己触媒的切断活性を有さないプロテアーゼであっても成熟型のプロテアーゼを菌体外に生産するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、このプロテアーゼの自己触媒的切断活性の有無に依存しない、菌体外プロテアーゼの発現系を構築することを目的とし、その必要条件を検討した。しかし、目的のプロテアーゼが菌体外に分泌されず、特に、精製困難な封入体（インクルージョンボディ）中に目的のポリペプチドが含まれてしまい、微生物由来の菌体外プロテアーゼを細胞外に産生させることができなかった。しかし、本発明者らの独自の観点に基づく創意工夫の結果、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明に係る発現ベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、別個のプロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはそれぞれ第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードし、第１のポリペプチドは、該プロテアーゼの成熟配列が第１のシグナル配列に連結されており、第２のポリペプチドは、該プロテアーゼのプロ配列が第２のシグナル配列に連結されていることを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る発現ベクターにおいて、上記プロテアーゼは、ＴＬＮ、ズブチリシン、放線菌プロテアーゼＢ、α−溶菌プロテアーゼ、アクアリシンＩ、およびストレプトペインからなる群より選択されることが好ましい。
【００１３】
本発明に係る発現ベクターにおいて、上記プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号３に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有しているポリペプチド、であることが好ましい。
【００１４】
本発明に係る発現ベクターにおいて、上記プロテアーゼのプロ配列からなるポリペプチドが、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号５に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドに対するフォールディング活性を有しているポリペプチド、であることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る発現ベクターにおいて、第１のシグナル配列はｐｅｌＢリーダー配列であることが好ましい。
【００１６】
本発明に係る発現ベクターにおいて、第２のシグナル配列は上記プロテアーゼのプレ配列であることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る発現ベクターにおいて、第１のポリヌクレオチドは、ｎｐｒプロモーター配列に作動可能に連結されていることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る発現ベクターにおいて、第２のポリヌクレオチドは、ｎｐｒプロモーター配列に作動可能に連結されていることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る発現ベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、プロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドは第１のポリペプチドをコードし、第１のポリペプチドは、該プロテアーゼの成熟配列が第１のシグナル配列に連結されていることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係る発現ベクターはまた、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、プロモーター配列に作動可能に連結された第２のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドは第２のポリペプチドをコードし、第２のポリペプチドは、該プロテアーゼのプロ配列が第２のシグナル配列に連結されていることを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る生産方法は、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、該プロテアーゼの成熟配列からなる第１のポリペプチドを、該プロテアーゼのプロ配列からなりかつ第１のポリペプチドのフォールディングを担う第２のポリペプチドとともに細胞内で発現させる工程を包含することを特徴としている。
【００２２】
本発明に係るキットは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、該プロテアーゼの成熟配列からなる第１のポリペプチドと、該プロテアーゼのプロ配列からなりかつ第１のポリペプチドのフォールディングを担う第２のポリペプチドとを細胞内で発現させるための発現ベクターを備えていることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係る発現ベクターセットは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、第１のベクターおよび第２のベクターを含み、第１のベクターは：プロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドを含み；第１のポリヌクレオチドは第１のポリペプチドをコードし；第１のポリペプチドは、該プロテアーゼの成熟配列が第１のシグナル配列に連結されており、第２のベクターは：プロモーター配列に作動可能に連結された第２のポリヌクレオチドを含み；第２のポリヌクレオチドは第２のポリペプチドをコードし；第２のポリペプチドは、該プロテアーゼのプロ配列が第２のシグナル配列に連結されていることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る形質転換体は、上記ベクターのいずれか１つを含んでいることを特徴としている。
【００２５】
本発明に係る生産方法は、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、上記形質転換体を用いる工程を包含することを特徴としている。
【００２６】
本発明に係るキットは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明を用いれば、活性部位への変異導入によって、自己触媒的な切断活性が変化した変異型プロテアーゼであっても成熟型のプロテアーゼを菌体外に生産し得る。また、本発明を用いれば、自己触媒的な切断活性が低下したことによって、発現量が低下した変異型プロテアーゼを大量に生産し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
上述したように、微生物の菌体内にて合成されるプロテアーゼを、菌体外に分泌させるためには、プロテアーゼの成熟ポリペプチドおよび成熟ポリペプチドのフォールディングに関与するプロ配列ポリペプチドを菌体内において発現させる必要がある。非特許文献４に記載の発現方法を用いた場合、成熟配列とプロ配列とが連続するプロ型配列として菌体内にて合成されたプロテアーゼは、成熟配列とプロ配列との間のペプチド結合を自己触媒的に切断することによって菌体外に分泌される。
【００２９】
本発明者らは、このプロテアーゼの自己触媒的切断活性の有無に依存しない、菌体外プロテアーゼの発現系を構築することを目的とし、その必要条件を検討した。
【００３０】
まず、プロテアーゼの成熟配列とプロ配列とを、菌体内においてそれぞれ独立したポリペプチドとして発現させることによって、成熟型プロテアーゼを菌体外に分泌させることを試みた。成熟配列とプロ配列とをそれぞれ独立したポリペプチドとして菌体内に発現させるために、それぞれ別個のプロモーターによって発現制御させる必要がある。このため、成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドを、それぞれ別個のプロモーター配列に作動可能に連結させ、発現ベクターを構築した。なお、プロ配列ポリペプチドによる成熟ポリペプチドのフォールディングを適切に行うためには、両ポリペプチドがペリプラズムに移行する必要がある。このため、独立した２つのポリペプチドをペリプラズムに移行させるために、成熟配列およびプロ配列にそれぞれ別個のシグナル配列を連結させた。
【００３１】
このように構築した発現ベクターを形質転換した細胞は、プロテアーゼの自己触媒的切断活性に依存することなく、成熟プロテアーゼを菌体外に分泌させた。
【００３２】
〔１：発現ベクター〕
本発明は、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するためのベクターを提供する。本明細書中で使用される場合、「微生物由来の菌体外プロテアーゼ」は、微生物によって産生される菌体外分泌型のプロテアーゼが意図され、単に「菌体外プロテアーゼ」と称する場合もある。
【００３３】
微生物由来の菌体外プロテアーゼとしては、ＴＬＮ、ズブチリシン、放線菌プロテアーゼＢ、α‐溶菌プロテアーゼ、アクアリシンＩ（ａｑｕａｌｙｓｉｎ Ｉ）およびストレプトペイン（ｓｔｒｅｐｔｏｐａｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。上述したように、微生物由来の菌体外プロテアーゼは、不活性のプレプロ型酵素（プレ配列、プロ配列および成熟配列が連続する１本のポリペプチド）として菌体内にて合成され、プレプロ型酵素はプロセッシングを受けた後に成熟型酵素（すなわち、成熟配列からなる「成熟ポリペプチド」）として菌体外へ分泌されることが知られている。
【００３４】
微生物由来の菌体外プロテアーゼのプレ配列は、シグナル配列として機能する部位である。「シグナル配列」は分泌タンパク質などが細胞外へ移行する際に必要な配列であり、当該分野において種々の配列が知られている。本明細書中で使用される場合、「シグナル配列」は、菌体内において発現したポリペプチドをペリプラズムに移行させる機能を有するポリペプチドが意図される。また、シグナル配列は、菌体内において発現した目的のペプチドをペリプラズムに移行させた後、シグナルペプチターゼにより消化され得るポリペプチドであることが意図される。
【００３５】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００３６】
本発明に係るベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するために、プロ配列部分からなるポリペプチド（プロ配列ポリペプチド）と成熟ポリペプチドとが別々のポリペプチドとして発現し得る構成を有していることを特徴としている。すなわち、本発明に係るベクターにおいて、プロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとは、別個のプロモーター配列に作動可能に連結されている。
【００３７】
本明細書中において使用される場合、「作動可能に連結される」は、目的の配列の発現が、特定の転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）の制御下に配置されることが意図される。目的のポリヌクレオチドの上流にプロモーターが配置されることにより、目的のポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結される。なお、プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドと隣接して配置される必要はない。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター配列」は、作動可能に連結されているポリヌクレオチドの転写開始に関与するポリヌクレオチドであることが意図される。本発明に係る発現ベクターに含まれるポリペプチドのプロ配列および成熟配列をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ別個のプロモーター配列に作動可能に連結されている。
【００３９】
このため、それぞれのプロモーター配列は、連結されているポリヌクレオチドの転写を別個独立に制御する。なお、本発明に係る発現ベクターに含まれるプロモーター配列として、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター配列、（ｃｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター）が挙げられるが、これに限定されない。
【００４０】
一実施形態において、本発明に係るベクターは、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。すなわち、本実施形態に係る発現ベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、該プロテアーゼのプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含み、これら２つのポリヌクレオチドは、それぞれ別個のプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴としている。
【００４１】
なお、本実施形態において、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドの両方がペリプラズムに移行する必要があるので、これら２つのポリペプチドはシグナル配列に連結されている。
【００４２】
他の実施形態において、本発明に係るベクターは、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、およびプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターからなるベクターセットであり得る。すなわち、本実施形態に係る発現ベクターは、第１のベクターおよび第２のベクターからなるベクターセットであって、第１のベクターは、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、該プロテアーゼのプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含み、これら２つのポリヌクレオチドは、それぞれプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴としている。
【００４３】
なお、本実施形態においてもまた、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドの両方がペリプラズムに移行する必要があるので、これら２つのポリペプチドはシグナル配列に連結されている。
【００４４】
本発明において使用されるシグナル配列としては、上述したように当該分野において公知の種々のシグナル配列が採用され得るが、成熟ポリペプチドに連結されるシグナル配列として好ましいものは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａから得られたペクテートリアーゼＢ（ｐｅｌＢ）リーダー配列、（ｏｍｐＴリーダー配列、ｐｈｏＡリーダー配列）が挙げられるが、これらに限定されない。また、微生物由来の菌体外プロテアーゼ由来のプロ配列ポリペプチドに連結されるシグナル配列として好ましいものは、当該プロテアーゼのプレ配列、（ｐｅｌＢリーダー配列、ｏｍｐＴリーダー配列、ｐｈｏＡリーダー配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
微生物由来の菌体外プロテアーゼ由来の成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドについて、ＴＬＮを例に挙げて説明する。
【００４６】
上述したように、サーモライシン（ＴＬＮ）は、菌体外プロテアーゼの１つであり、２８アミノ酸のシグナル配列、２０４アミノ酸のプロ配列、および３１６アミノ酸の成熟配列が連続する、５４８アミノ酸のポリペプチドとして菌体内にて合成される。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「成熟ポリペプチド」は、「成熟配列からなるポリペプチド」が意図され、「プロテアーゼ活性を有するポリペプチド」と交換可能に使用される。
【００４８】
ＴＬＮの成熟ポリペプチドを構成する成熟配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列として提供され、当該成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構成する塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列として提供される。
【００４９】
１つの局面において、ＴＬＮ成熟ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの変異体でありかつプロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００５０】
他の局面において、ＴＬＮ成熟ポリペプチドは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドの変異体によってコードされるポリペプチドであって、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００５１】
また、本明細書中で使用される場合、「プロ配列ポリペプチド」は、「プロ配列からなるポリペプチド」が意図され、「プロペプチド」または「フォールディング活性を有するポリペプチド」と交換可能に使用される。また、本明細書中で使用される場合、「フォールディング活性」は、菌体内において成熟配列をフォールディングする機能活性が意図され、「シャペロン活性」と交換可能に使用される。
【００５２】
ＴＬＮのプロ配列ポリペプチドを構成する成熟配列は、配列番号５に示されるアミノ酸配列として提供され、当該成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構成する塩基配列は、配列番号４に示される塩基配列として提供される。
【００５３】
１つの局面において、ＴＬＮプロ配列ポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの変異体でありかつプロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００５４】
他の局面において、ＴＬＮプロ配列ポリペプチドは、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドの変異体によってコードされるポリペプチドであって、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００５５】
本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、野生型ポリペプチドの有する活性を保持するポリペプチドが意図される。すなわち、本明細書中において使用される場合、ポリペプチドの変異体は、特定のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む変異体であり得る。
【００５６】
ポリペプチドのアミノ酸配列におけるいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変し得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。
【００５７】
本明細書中において遺伝子またはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、具体的な塩基（ヌクレオチド）が異なっても、野生型ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの有する活性を保持したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。すなわち、本明細書中において使用される場合、ポリヌクレオチドの変異体は、（Ｉ）特定の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ＩＩ）特定の塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または（ＩＩＩ）特定の塩基配列と少なくとも８０％同一な塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが意図される。
【００５８】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
【００６０】
このように、微生物由来の菌体外プロテアーゼを具体的に説明するためにＴＬＮを例に挙げて説明したが、本発明において、微生物由来の菌体外プロテアーゼがＴＬＮに限定されないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００６１】
また、本明細書を読んだ当業者は、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するために、本発明に係る発現ベクターが、プロ配列部分からなるポリペプチド（プロ配列ポリペプチド）と成熟ポリペプチドとが別々のポリペプチドとして発現し得る構成を有していればよく、具体的なベクター種に限定される必要はない、ということを容易に理解する。
【００６２】
このように、本発明に係る発現ベクターを用いれば、本発明において目的とするポリペプチドを容易に生産することができる。
【００６３】
〔２：形質転換体〕
本発明はさらに、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するための形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図されるが、細胞（特に、原核生物細胞、菌類など）であることが好ましい。
【００６４】
本発明に係る形質転換体は、微生物由来の菌体外プロテアーゼをコードする遺伝子が導入されていることを特徴としており、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドが首尾よく細胞外に分泌され得る。本発明に係る形質転換体は、微生物由来の菌体外プロテアーゼが安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現していてもよい。
【００６５】
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するための発現ベクターを生物中に導入することによって取得され得る。
【００６６】
このように、本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明において目的とするポリペプチドを容易に生産することができる。
【００６７】
〔３：微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドを生産するための方法およびキット〕
上述したように、本発明は、上記ベクターまたは形質転換体を用いるポリペプチドの生産方法、上記ベクターまたは形質転換体を備えているポリペプチド生産用キットもまた提供する。
【００６８】
本発明に係るポリペプチド生産方法は、上述したベクターまたは形質転換体を用いることを特徴としている。また、本発明に係るポリペプチド生産用キットは、上述したベクターまたは形質転換体を備えていることを特徴としている。なお、本明細書中で使用される場合、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質（例えば、容器）中に含有されている形態であることが意図される。
【００６９】
本発明は、成熟型プロテアーゼを菌体外にて組換え的に生産する方法およびキットを提供する。本発明に係る成熟型プロテアーゼの菌体外生産方法を用いれば、自己触媒的な切断活性が変化した変異型プロテアーゼであっても成熟型のプロテアーゼを菌体外に生産し得る。また、自己触媒的な切断活性が低下したことによって、発現量が低下した変異型プロテアーゼを大量に生産し得る。
【００７０】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチド生産方法は、本発明に係る発現ベクターを用いることを特徴としており、本発明に係る発現ベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含する。上記の工程により形質転換された細胞内において、本発明に係る発現ベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現され、細胞外に分泌される。
【００７１】
上記の工程において形質転換された細胞内において、本発明に係る発現ベクター（または発現ベクターセット）に含まれている第１のポリヌクレオチド（すなわち、シグナル配列に連結された成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）および第２のポリヌクレオチド（すなわち、シグナル配列に連結されたプロ配列ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）はそれぞれ別個のプロモーター配列に作動可能に連結されているため、成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドを別個独立して発現させることが可能である。
【００７２】
形質転換細胞内にて独立して発現した第１のポリペプチド、すなわち第１のシグナル配列に連結された成熟配列からなるポリペプチド、および第２のポリペプチド、すなわち第２のシグナル配列に連結されたプロ配列からなるポリペプチドが、それぞれのシグナル配列の機能によりペリプラズムに移行される。ペリプラズムに移行した成熟ポリペプチドはプロ配列ポリペプチドによってフォールディングされることにより成熟型プロテアーゼに変換され、次いで細胞外に分泌される。
【００７３】
上述したように、本発明に係るポリペプチド生産方法を用いれば、プロテアーゼの自己触媒的切断活性を必要とせずに、成熟型プロテアーゼを菌体外に生産し得る。
【００７４】
本発明に係る発現ベクターを宿主に導入する方法としては、特に限定されず、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、本発明の発現ベクターを用いて形質転換される細胞として、枯草菌細胞、大腸菌細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびバチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００７５】
本発明に係るポリペプチド生産用キットは、本発明に係る発現ベクターを備えていることを特徴としている。好ましい実施形態において、本発明に係るポリペプチド生産用キットは、形質転換すべき細胞をさらに備えていることが好ましい。これにより、本発明の発現ベクターを用いて細胞を形質転換し、形質転換細胞内において本発明の発現ベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードする成熟ポリペプチドおよびプロ配列ポリペプチドを、別個独立して発現させることが可能である。形質転換細胞内にて発現した成熟ポリペプチドはプロ配列ポリペプチドによってフォールディングされることにより成熟型プロテアーゼに変換され、次いで細胞外に分泌される。
【００７６】
なお、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟ポリペプチドを生産するための方法およびキットは、上述した態様に限定される必要はなく、上述した以外のポリペプチドの生産方法およびポリペプチド生産用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００７７】
以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７８】
［１．材料および方法］
〔１．菌株、プラスミドベクター、および形質転換体の作製〕
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０９細胞（ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），Ｆ’（ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ，ｌａｃＺ ΔＭ１５））を、宿主として用いた。また、ｎｐｒ遺伝子およびプロモーター領域を含む発現プラスミドベクターｐＴＥ１（非特許文献２）を、ＰＣＲのテンプレートとして用いた。
【００７９】
プライマー対（５’−ＴＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＴ−３’（配列番号１０）、および５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＧ−３’（配列番号１１））を用いて、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター領域を含む２７９塩基対のＤＮＡ断片をクローニングした。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｄｅ Ｉ）で消化した。制限酵素で消化したＤＮＡ断片を、制限酵素（Ｂｇｌ ＩＩおよびＮｄｅ Ｉ）で消化したｐＥＴ−２２ｂ（＋）（タカラバイオ製）に挿入し、ｐＥＴ−５’を作製した。
【００８０】
同様に、プライマー対（５’−ＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＡＡＣＡＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＴＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１２）、および５’−ＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＧＡ−３’（配列番号１３））を用いて、ＴＬＮの成熟配列をコードする遺伝子を含む１０２９塩基対のＤＮＡ断片をクローニングした。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＳａｃ Ｉ）で消化した。制限酵素で消化したＤＮＡ断片をｐＵＣ１９（タカラバイオ製）に挿入し、ｐＵＣ−Ｍを作製した。
【００８１】
さらに、プライマー対（５’−ＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号１４）、および５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＴ−３（配列番号１５））を用いて、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター領域、およびＴＬＮのプレプロ配列をコードする遺伝子を含む９７５塩基対のＤＮＡ断片をクローニングした。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（Ｂｇｌ ＩＩおよびＥｃｏ ＲＩ）で消化した。制限酵素で消化したＤＮＡ断片を前述のｐＵＣ−Ｍに挿入し、ｐＵＣ−ＭＰ１を作製した。
【００８２】
また、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター領域、およびｐｅｌＢシグナル配列をコードする遺伝子を含むｐＥＴ−５’を制限酵素（Ｐｓｔ Ｉ−Ｎｃｏ Ｉ）で消化した。消化したＤＮＡ断片を、制限酵素（Ｐｓｔ ＩおよびＮｃｏ Ｉ）で切断したｐＵＣ−ＭＰ１、および制限酵素（Ｐｓｔ ＩおよびＮｃｏ Ｉ）で切断したｐＵＣ−Ｍにそれぞれ挿入し、プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１（図１（ｂ））およびｐＵＣ−ＴＭ１（図１（ｄ））を作製した。
【００８３】
次に、プライマー対（５’−ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号１６）、および５’−ＣＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＡＧＣＧＣＡＴＴＧＴＡＡＧＧＴＡＡＡ−３’（配列番号１７））を用いて、ｎｐｒ遺伝子のプロモーター領域、およびプレ配列を含む３６３塩基対のＤＮＡ断片をクローニングした。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（ＰｓｔＩおよびＮｃｏＩ）を用いて消化した。消化したＤＮＡ断片を前述のｐＵＣ−ＭＰ１に挿入し、ｐＵＣ−ＴＭＰ２を作製した（図１（ｃ））。
【００８４】
部位特異的突然変異誘発を、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行った。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＤＳＱ−２０００（Ｋｙｏｔｏ）を用いて、変異ＴＬＮ遺伝子のヌクレオチド配列を照合した。上述したように作製したプラスミドベクターを導入したＪＭ１０９細胞を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ ｂｒｏｔｈ培地において培養した。
【００８５】
なお、図１（ａ）〜（ｄ）において、下線が付された塩基配列はプロモーター配列を示し、下線および“ＳＤ”が付された塩基配列は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を示す。また、図１（ａ）〜（ｃ）において塩基配列上に付された矢印は、プレ配列とプロ配列との間の推定切断部位を示し、図１（ｄ）において塩基配列上に付された矢印は、プレ配列と成熟配列との間の推定切断部位を示す。
【００８６】
〔２．発酵〕
形質転換ＪＭ１０９細胞のグリセロールストックを、５ｍｌのＬ ｂｒｏｔｈ培地に播種した。この培地を３７℃でインキュベートし、細胞数がＯＤ６００＝０．６になるまで増殖させた。次に、５００ｍｌフラスコ中のＬ ｂｒｏｔｈ培地２００ｍｌ中において、培地を１：１００に希釈した。適切な時間経過後に培地１ｍｌをピペットで採取し、遠心分離した。遠心分離により得られた上清を用いて、混濁度（ＯＤ６００）およびカゼイン加水分解活性を測定した。
【００８７】
〔３．カゼイン加水分解活性の測定〕
形質転換ＪＭ１０９細胞の上清を用いて、カゼイン加水分解活性を測定した。１．３３％（ｗ／ｖ）カゼインおよび４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液１．５ｍｌ中に、サンプル（０．５ｍｌ）を添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。この溶液中に、０．１１Ｍトリクロロ酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、および０．３３Ｍ酢酸を含む溶液２ｍｌを添加することによって反応を停止させた。反応液をＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．２ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ（直径７０ｍｍ）を用いてろ過し、Ａ２７５を測定した。０．００７４のＡ２７５（チロシン１μｇのＡ２７５）／ｍｉｎにおける増加に対応する量の酸溶ペプチドを遊離させるのに必要な酵素活性量を、活性１単位と規定した。
【００８８】
〔４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を、Ｌａｅｍｍｌｉ法による還元状態の下、１２．５％ポリアクリルアミドゲル中において行った。４０ｍＡの一定電流を１時間印加した。２．５％ ２−メルカプトエタノールと共に１００℃で１０分間処理することによって、上清を還元した。タンパク質バンドを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色した。ウサギ筋ホスホリラーゼｂ（分子量９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．３ｋＤａ）、ウサギ筋アルドラーゼ（４２．４ｋＤａ）、ウシ赤血球カルボニックアンヒドラーゼ（３０．０ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、および鶏卵白リゾチーム（１４．４ｋＤａ）を含む分子量マーカーキット（第一純薬）を用いた。
【００８９】
〔５．ＴＬＮの精製〕
ＴＬＮを以下のように精製した。形質転換ＪＭ１０９細胞のグリセロールストック５ｍｌをＬ ｂｒｏｔｈ培地に播種した。この細胞を３７℃で１２時間増殖させた後、１ｌフラスコ中のＬ ｂｒｏｔｈ培地５００ｍｌ中において培養し、３７℃、０．１％（ｗ／ｖ）ａｎｔｉ−ｆｏａｍ Ａ（Ｓｉｇｍａ社）、およびエアポンプによる活発な送風状態下において、インキュベートした。この培養大腸菌細胞の上清を、カラムクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーにより連続して精製した後に、親和性クロマトグラフィーに供することによって、活性化および成熟野生型ＴＬＮを均一に精製した。反応速度の測定の前に、この精製物を、ｐｒｅ−ｐａｃｋｅｄ ＰＤ−１０ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて脱塩した。
【００９０】
〔６．ＦＡＧＬＡ加水分解活性の測定〕
分子吸光係数ε３４５＝７６６Ｍ−１・ｃｍ−１を用いて分光測定的に決定した濃度のＮ−［３−（２−ｆｕｒｙｌ）ａｃｒｙｌｏｙｌ］−ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｄｅ（ＦＡＧＬＡ）（Ｌｏｔ １１１Ｋ１７６４：Ｓｉｇｍａ社）を用いた。ＴＬＮによるＦＡＧＬＡの加水分解を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（島津製作所製）を用いて、吸光度３４５ｎｍにおいて見られた減少度により測定した。分解したＦＡ−ジペプチドアミドの量を、２５℃における、Δε３４５＝−３１０Ｍ−１・ｃｍ−１により決定した。
【００９１】
それぞれ１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む、ｐＨ４．０〜５．５の４０ｍＭ酢酸ＮａＯＨバッファー、ｐＨ５．５〜７．０の４０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー、ｐＨ７．０〜８．５の４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー、およびｐＨ８．０〜９．０のＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー中において変異型ＴＬＮを反応させた。ＦＡＧＬＡの溶解度（＜６ｍＭ）が低いため、ミカエリス定数Ｋｍ（＞３０ｍＭ）より低い基質濃度でＦＡＧＬＡを添加し、偽一次反応として反応させた。この状態下において、反応速度パラメーターであるＫｍおよび分子活性ｋｃａｔを、それぞれ別々に決定することはできなかったが、ｐＨ４．０〜９．０の偽一次反応として酵素反応を行った。そしてこの酵素活性を、特異性定数ｋｃａｔ／Ｋｍにより評価した。
【００９２】
〔７．ＺＤＦＭ加水分解活性の測定〕
Ｎ−ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＺＤＦＭ）濃度を分子吸光係数ε２５７＝３８７Ｍ−１・ｃｍ−１を用いて決定した。ＴＬＮ触媒ＺＤＦＭ加水分解を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（島津製作所製）を用いて、吸光度２２４ｎｍにおいて見られた減少度により測定した。ＺＤＦＭ加水分解量を、２５℃における、Δε２２４＝−４９３Ｍ−１・ｃｍ−１により決定した。１０ｍＭＣａＣｌ２を含む４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー中に０．１μＭ ＴＬＮを添加し、２５℃で反応させた。反応速度パラメーターであるｋｃａｔおよびＫｍを、非線形最小二乗法を用いて、ミカエリスメンテン式に基づいて決定した。
【００９３】
［２．結果］
〔２−１．成熟配列およびプロ配列を共発現させるためのプラスミドベクターの作製〕
図１（ａ）は、本発明者らが、非特許文献２において報告した発現プラスミドベクターｐＴＥ１を示す図である。ｐＴＥ１は、大腸菌においてＴＬＮを菌体外に分泌させることができた。ｐＴＥ１は、変異プロモーター配列“ＴＴＴＣＣＣ”、および“ＡＡＴＡＴＴ”、変異ＳＤ配列“ＡＡＧＧＡＧＧ”、ならびにプレ配列（２８残基）、プロ配列（２０４残基）、および成熟配列（３１６残基）をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。プロ型ＴＬＮが菌体外に分泌されるために、プロ配列と成熟配列との間のペプチド結合が自己触媒的に切断されなければならない。本発明者らは、自己触媒的切断処理を必要とせずにＴＬＮを菌体外に分泌するために、ｐＴＥ１を起源とする２つのプラスミドベクター、ｐＵＣ−ＴＭＰ１（図１（ｂ））およびｐＵＣ−ＴＭＰ２（図１（ｃ））を作製した。
【００９４】
両プラスミドベクターを、ｎｐｒ遺伝子におけるオリジナルのプロモーター配列支配下において、Ｎ末端にｐｅｌＢリーダー配列（ｐＵＣ−ＴＭＰ１）またはＴＬＮのオリジナルのプレ配列（ｐＵＣ−ＴＭＰ２）のいずれかを含むＴＬＮの成熟配列、およびＴＬＮのプレプロ配列を共発現するように設計した。ここで、ＰｅｌＢは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａから得られるペクテートリアーゼＢであり、その２２アミノ酸シグナル配列は主として大腸菌における変異型タンパク質の細胞外生産のためのシグナル配列として用いられている。本発明者らは、プロペプチドの必要性を確認するために、Ｎ末端ｐｅｌＢリーダー配列を含むＴＬＮの成熟配列のみを含むｐＵＣ−ＴＭ１もまた作製した（図１（ｄ））。
【００９５】
〔２−２．変異型ＴＬＮの菌体外生産〕
ＴＬＮのＧｌｕ１４３は、ＴＬＮの触媒作用に重要な残基である。野生型ＴＬＮをコードするヌクレオチド、またはＧｌｕ１４３が変異したＥ１４３Ａをコードするヌクレオチドを含むプラスミドベクターを、それぞれＪＭ１０９細胞に導入した。形質転換細胞を、試験管内で２４時間培養し、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を、図２（ａ）に示す。図２（ａ）の第１レーンはマーカータンパク質、第２レーンはＢ. ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓから得た野生型ＴＬＮを示す。また、第３レーンから第９レーンは、それぞれ順にｐＵＣ１９、ｐＴＥ１、ｐＴＥ１−Ｅ１４３Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ２、およびｐＵＣ−ＴＭ１を示す。
【００９６】
従来の自己触媒的切断が必要な発現方法で発現させた場合、発現プラスミドベクターｐＴＥ１（第４レーン）では成熟型ＴＬＮに対応する３４ｋＤａのタンパク質バンドが検出されたが、変異型発現プラスミドベクターｐＴＥ１−Ｅ１４３Ａ（第５レーン）では検出されなかった。しかしながら、本発明の方法において発現させた場合、発現プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１（第６レーン）、および変異型発現プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａ（第７レーン）の両方において３４ｋＤａタンパク質バンドが検出された。この結果は、自己触媒的切断活性が欠落した変異型ＴＬＮが、成熟配列およびプロ配列を独立して発現させることにより、菌体外に分泌されることを示唆している。
【００９７】
一方、本発明の発現方法で発現させた場合、発現プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ２（第８レーン）では、３４ｋＤａタンパク質バンドは現れなかった。このことは、成熟配列が適切にフォールディングされるためにプロペプチドが必要であることを示している。ＴＬＮのプロペプチドに対応する２２ｋＤａタンパク質バンドは、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａ（第７レーン）でのみ検出された。
【００９８】
図３（ａ）〜（ｆ）は、図２（ａ）に示す結果に基づいて予想される変異型ＴＬＮの異成熟経路を示す。ｐＴＥ１（図３（ａ））およびｐＵＣ−ＴＭＰ１（図３（ｃ））において、プロペプチドが最終的に活性ＴＬＮおよび／または菌体外プロテアーゼに分解される一方で、非特許文献１に記載されているように、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａは触媒活性を喪失するが基質結合能は保持しているため、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａでは、成熟型ＴＬＮはプロペプチドとの複合体として存在することが予測される（図３（ｄ））。
【００９９】
図２（ｂ）は、Ａｓｎ１１２変異配列をそれぞれ含むプラスミドベクターを導入した大腸菌細胞の培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を示す。図２（ｂ）の第１レーンはマーカータンパク質、第２レーンはＢ. ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓから得た野生型ＴＬＮを示す。第３レーンから第１０レーンは、それぞれ順にｐＵＣ−１９、ｐＵＣ−ＴＭＰ１、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｄ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｅ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｈ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｋ、およびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｒを示す。
【０１００】
非特許文献９に示すように、自己触媒的切断が必要な従来の発現方法で発現させた場合、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２ＤおよびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｅにおいてのみ３４ｋＤａタンパク質バンドが検出された（図示せず）。一方で、本発明の発現方法で発現させた場合、すべてのＡｓｎ１１２変異体において３４ｋＤａタンパク質バンドが検出された（第５〜１０レーン）。Ａｓｎ１１２変異カゼイン加水分解活性は、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２ＤおよびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｅにおいてのみ検出され、その他のＡｓｎ１１２変異体ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｈ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｋ、およびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｒでは検出されなかった（データ示さず）。
【０１０１】
そして、これらすべてのＡｓｎ１１２変異型ＴＬＮにおいて、プロペプチドに対応する２２ｋＤａのタンパク質バンドは見られなかった。このことから、４つのＡｓｎ１１２変異体（ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ａ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｈ、ｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｋ、およびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｎ１１２Ｒ）は、基質結合能を喪失したことが示唆される。
【０１０２】
図４（ａ）は、形質転換細胞培養培地における細胞数の時間推移を示す図であり、図４（ｂ）は、培養細胞の上清のカゼイン加水分解活性を示す図である。従来の発現方法および本発明の発現方法で発現させた、発現プラスミドベクターｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１においては、カゼイン加水分解活性が示され、培養液中の細胞数が最大レベルに達した後でさえその活性は徐々に増加した。一方で、従来の発現方法および本発明の発現方法で発現させた、変異型発現プラスミドベクターｐＴＥ１−Ｅ１４３ＡおよびｐＵＣ−ＴＭＰ１−Ｅ１４３Ａにおいては、培養液中の細胞数（ＯＤ６００）は時間の経過に伴って増加したが、カゼイン加水分解活性は現れなかった。
【０１０３】
〔２−３．変異型ＴＬＮの精製〕
ｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１を導入した大腸菌細胞から得た上清を、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ親和性クロマトグラフィーを順に行うことによって、２つの野生型ＴＬＮをそれぞれ、均一になるまで精製した。カゼインプレートを用いて、この２つの野生型ＴＬＮ断片のカゼイン加水分解活性を測定し、活性を有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図５）。
【０１０４】
図５に示す第１レーンはマーカータンパク質、第２レーンはＢ. ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓから得た野生型ＴＬＮを示す。第３レーンおよび第６レーンはそれぞれｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１を導入した大腸菌細胞の上清を示し、第４レーンおよび第７レーンは、それぞれｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１を導入した大腸菌細胞の上清を疎水性相互作用クロマトグラフィー処理することにより得られた活性を有する画分を示し、第５レーンおよび第８レーンは、それぞれ上記の活性を有する画分をＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ親和性クロマトグラフィー処理することにより得られた活性を有する画分（すなわちＴＬＮ精製物）を示す。ＴＬＮ精製物（第５および第８レーン）において、３４ｋＤａの分子量を表す単一バンドが検出された。
【０１０５】
ｐＵＣ−ＴＭＰ１を導入した大腸菌細胞の培養上清から得たＴＬＮの代表的な精製データを表１に示す。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
８．０ｍｇＴＬＮを含む上清３５０ｍｌを用いて精製を開始し、最終的に２．４ｍｇのＴＬＮを回収した。これは、ｐＴＥ１が導入された大腸菌細胞の培養上清から得たＴＬＮの精製効率（上清３５０ｍｌからＴＬＮ１．５ｍｇを回収）に匹敵する（データ示さず）。
【０１０８】
〔２−４．ＴＬＮの特性〕
本発明の発現方法で発現させた、発現プラスミドベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１から得たＴＬＮ、および従来の発現方法で発現させた、発現プラスミドベクターｐＴＥ１から得たＴＬＮの活性特性を比較した。２５℃におけるこれらのＦＡＧＬＡ加水分解活性のｐＨ依存性の測定結果を図６（ａ）に示し、速度パラメーターを表２に示す。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
図６（ａ）に示すように、ｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１から得たＴＬＮの最適ｐＨはそれぞれ６．５〜７．０周辺であり、両ＴＬＮはｐＨ依存性において類似していた。また、表２に示すように、両ＴＬＮのＦＡＧＬＡ加水分解反応速度は同等であった。
【０１１１】
０．１μＭ ＴＬＮを含む溶液中において、ＺＤＦＭ（０〜１．５ｍＭ）濃度を変化させた場合における加水分解活性、すなわちＴＬＮのＺＤＦＭ加水分解反応における基質濃度の影響を測定し、測定結果を図６（ｂ）に示す。さらに速度パラメーターを表３に示す。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
図６（ｂ）に示すように、ＺＤＦＭの濃度上昇に伴って、ＴＬＮの加水分解活性も上昇した。表３に示すように、Ｋｍ値およびｋｃａｔ値は２つのＴＬＮ間で相対的に同等であった。これらの結果から、この２つのＴＬＮ、ｐＴＥ１およびｐＵＣ−ＴＭＰ１から得たＴＬＮは、異なる成熟過程を経ているが、その活性特性は同一であることを示唆している。
【０１１４】
〔２−５．自己触媒的切断活性を有さない変異型ＴＬＮの生産〕
菌体外プロテアーゼのタンパク質工学における問題点の１つは、いくつかの変異体において自己触媒的切断活性が顕著に不足している、または完全に欠失する可能性を有することである。ＴＬＮの場合、いくつかの活性部位変異体は成熟酵素にまでプロセスされない。この問題を解決するために従来用いられていた主な技術は、インクルージョンボディ中にプロ配列および成熟配列を別々のポリペプチドとして菌体内で発現させた後に、可溶化およびリフォールディング処理するものである。この技術は、プロペプチドが分子内シャペロンとして機能することを示す先駆的な研究として、ズブチリシンおよびα‐溶菌プロテアーゼにおいて最初に報告され、後に、ＴＬＮ、アクアリシンＩ、およびストレプトペインにおいて報告された。
【０１１５】
しかしながら、上記の方法は、リフォールディング条件を経験的に調節する必要がある等最適化が困難であり、かつ処理が煩雑であるため、多種類の変異型プロテアーゼを生産するのに適さない。上記の問題を解決するその他の従来の方法は、基質特異性が変化した変異型プロテアーゼの自己触媒的切断部位において、アミノ酸配列を最適化する方法である。この方法は、ズブチリシンおよび放線菌プロテアーゼＢにおいて報告されたが、一般的ではない。
【０１１６】
本発明のプロテアーゼ発現方法においては、Ｎ末端にｐｅｌＢリーダー配列を含むＴＬＮの成熟配列およびＴＬＮのプレプロ配列を、独立したポリペプチドとして、菌体内に共発現させた。活性部位Ｅ１４３Ａ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１１２Ｈ、Ｎ１１２ＫおよびＮ１１２Ｒのような変異型ＴＬＮは、従来の自己触媒的切断を用いる発現方法では分泌されなかった。しかしながら、本発明の発現方法では、このような変異体であっても野生型とほぼ同じ発現レベルで培養液中に分泌された。
【０１１７】
本発明のプロテアーゼ発現方法における重要なポイントの１つは、最適なシグナルペプチドを選択することにある。成熟ポリペプチドおよびプロペプチドは、細胞質膜を横切ってペリプラズムに移動した後シグナルペプチターゼによる処理を受ける必要がある。野生型ＴＬＮでは、プレプロ酵素が大腸菌内において発現し、活性型ＴＬＮが細胞外に分泌される。本発明者らは、プロ配列のためのシグナルペプチドとして、ＴＬＮのオリジナルのプレ配列を用いた。そして成熟配列のためのシグナルペプチドとして、大腸菌における変異型タンパク質の発現に最もよく用いられるシグナルペプチドの１つである、ｐｅｌＢリーダー配列を用いた。図２（ａ）の第６レーンに示されるように、ＴＬＮのオリジナルのプレ配列およびプロ配列、ならびにｐｅｌＢリーダー配列およびＴＬＮの成熟配列を含む発現ベクターｐＵＣ−ＴＭＰ１を用いた場合、成熟型ＴＬＮは菌体外に分泌された。しかしながら、ＴＬＮのオリジナルのプレ配列は、ＴＬＮ成熟配列のシグナルペプチドとして機能しなかった（図２（ａ）の第８レーンおよび図３（ｅ））。
【０１１８】
本発明のプロテアーゼ発現方法におけるもう１つの重要なポイントは、インクルージョンボディの形成を避けたことである。これは、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｎｐｒ遺伝子において、それぞれオリジナルのプロモーター配列の支配下でＴＬＮのプロ配列および成熟配列を発現させることによって達成した。図１（ａ）〜（ｄ）に示すように、大腸菌においてｎｐｒ遺伝子は、推定プロモーターおよびＳＤ配列を含む。本発明の発現方法で発現させた場合、封入体の構成を避けるのに十分であり、かつ可能な限り低いレベルで、成熟ポリペプチドおよびプロペプチドは別々のペプチドとして発現した。従来の発現方法と比較するために、本発明者らはＴ７プロモーターの支配下においてＮ末端にｐｅｌＢリーダー配列を含む成熟ＴＬＮとＴＬＮのプレプロ配列とを発現させる発現プラスミドベクターを作製した。この発現プラスミドベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて発現誘導したとき、培養液中に活性を有するＴＬＮは生産されなかった（データ示さず）。このことは、本発明に基づきを、Ｔ７プロモーターの支配下においてＮ末端にｐｅｌＢリーダー配列を含む成熟ＴＬＮとＴＬＮのプレプロ配列とを発現させた場合、ＴＬＮの成熟ポリペプチドおよびプロペプチドは、インクルージョンボディとして発現したため、菌体外に分泌されなかったことを示唆する。
【０１１９】
〔２−６．変異型プロテアーゼ成熟経路の示唆〕
野生型プロペプチドまたはその変異体Ｉ１ｅ（−４８）Ｔ（ズブチリシンＥのプロ配列のアミノ酸残基の番号は、Ｎ末端Ａｌａの−７７から始まり、Ｃ末端のＴｙｒの−１で終了する）のいずれかによりフォールディングされる野生型ズブチリシンＥ、またはその変異体Ｓ２２１Ｃを用いた過去の研究に基づくと、フォールディング処理を以下の２つのステージに分けることができる（非特許文献１０および１１）。それは、自己触媒的切断前の分子内フォールディング、および自己触媒的切断後の分子間フォールディングである。このことは、本発明の発現方法により生産されたＴＬＮが、従来の発現方法により生産されたＴＬＮとは異なるフォールディング機構を有する可能性を示唆する。
【０１２０】
しかしながら、図６、表２、および表３に示す、ＴＬＮのＦＡＧＬＡの加水分解における活性のｐＨ依存性、およびＺＤＦＭの加水分解における反応速度パラメーターが示すように、本発明の発現方法により発現した野生型ＴＬＮと、従来の発現方法により発現した野生型ＴＬＮとは活性特性において同等であった。このことは、分子内フォールディングが、分子間フォールディングに入れ替わり得ることを示唆している。これは、自己触媒的な切断の後に起こり、“プロテインメモリ”と定義されるプロペプチドによる構造的なインプリンティングに一致する。
【０１２１】
従来、ＴＬＮの成熟メカニズムに関するいくつかの研究結果が報告されている。第１の成熟メカニズムの報告においては、ＴＬＮペプチド単独で細胞内可溶タンパク質として発現させたとき、その精製ペプチドが非拮抗的にＴＬＮ活性を阻害したが、変性ＴＬＮのリフォールディングを促進した（非特許文献１２）。第２の成熟メカニズムの報告においては、Ｎ末端にヒスチジンタグが付加されたプロ型ＴＬＮをインクルージョンボディとして発現させ、コバルトを含む樹脂上に溶解および固定したとき、野生型ＴＬＮはリフォールディングバッファを外液として透析することによって自発的に成熟型酵素に変換したが、Ｅ１４３Ａ変異型ＴＬＮは成熟型酵素に変換しなかった（非特許文献１３）。Ｅ１４３Ａ変異型ＴＬＮは、活性を有する野生型ＴＬＮの存在下においてであっても成熟型酵素に変換しないので、ＴＬＮの成熟は分子間ではなく分子内切断を介して進行すると結論づけられている。
【０１２２】
第３の成熟メカニズムの報告において、成熟した野生型ＴＬＮまたはＥ１４３Ａ変異型ＴＬＮは、大腸菌内において独立したポリペプチドとしてプロペプチドとともに共発現させると、野生型ＴＬＮは加水分解活性を、Ｅ１４３Ａ変異型ＴＬＮは基質結合活性をそれぞれ有していた（非特許文献１）。それゆえに、プロペプチドが分子間シャペロンとして機能すると結論づけられている。しかしながら、プロペプチドおよび成熟ポリペプチドの化学量論数および解離定数のような物理化学解析、および複合体の結晶解析は行なわれていない。なぜならば、自己切断される一方でプロペプチドが消化されないズブチリジンＥ変異型Ｓ２２１Ｃのような変異型ＴＬＮはこれまでに得られていないので、上記のような解析が不可能だからである。本発明の発現方法をもちいれば、プロペプチドに結合し、かつプロペプチドを消化しないＥ１４３Ａ変異型ＴＬＮであっても、十分な量の変異型ＴＬＮを生産し得る。さらに本発明の発現方法は、ＴＬＮの成熟メカニズムのさらなる研究に寄与し得る。
【０１２３】
また、本発明の変異型ＴＬＮを菌体外生産する方法は、それぞれ適切なシグナルペプチドをＮ末端に含む成熟配列およびプロ配列を共発現させる工程を含む。本発明者らは、適切なシグナルペプチドおよびプロモーターを選択することによって、本発明のプロテアーゼ生産方法を他の菌体プロテアーゼの菌体外生産に適用可能であると予測する。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
自己触媒的切断活性が低下または消失したプロテアーゼを生産することが困難であったが、本発明を用いれば、このようなプロテアーゼを大量に生産することができるので、本発明は産業用酵素分野の発展に貢献し得る。また、本発明を用いれば、プロテアーゼを成分とする製品、プロテアーゼを生産手段に用いる製品等を大量に生産することができるので、酵素を用いた製品開発に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１（ａ）〜（ｄ）は、ＴＬＮプロテアーゼを発現する発現ベクターを示す図である。
【図２】図２（ａ）は、従来の発現方法および本発明の発現方法により発現させた、野生型ＴＬＮおよびＧｌｕ１４３変異型ＴＬＮ（Ｅ１４３Ａ）の発現を調べたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す写真である。図２（ｂ）は、本発明の発現方法により発現させた、野生型ＴＬＮおよびＡｓｎ１１２変異型ＴＬＮの発現を調べたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３】図３（ａ）〜（ｆ）は、図２（ａ）の結果に基づき予想される、野生型および変異型ＴＬＮの成熟経路を示す図である。
【図４】図４（ａ）は、形質転換体培養液の細胞数の時間推移を示す図であり、図４（ｂ）は、培養細胞の上清のカゼイン加水分解活性を示す図である。
【図５】図５は、従来の発現方法、および本発明の発現方法により発現させた野生型ＴＬＮの精製を調べたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。
【図６】図６（ａ）は、従来の発現方法、および本発明の発現方法により発現させた野生型ＴＬＮによるＦＡＧＬＡ加水分解におけるｐＨの効果を示す図である。図６（ｂ）は、従来の発現方法、および本発明の発現方法により発現させた野生型ＴＬＮのＺＤＦＭ加水分解活性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するための発現ベクターであって、
別個のプロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはそれぞれ第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードし、
第１のポリペプチドは、該プロテアーゼの成熟配列が第１のシグナル配列に連結されており、
第２のポリペプチドは、該プロテアーゼのプロ配列が第２のシグナル配列に連結されていることを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
前記プロテアーゼが、サーモライシン、ズブチリシン、放線菌プロテアーゼＢ、α‐溶菌プロテアーゼ、アクアリシンＩ、およびストレプトペインからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドが、以下のポリペプチド：
・配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号３に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有しているポリペプチド
であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記プロテアーゼのプロ配列からなるポリペプチドが、以下のポリペプチド：
・配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号５に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドに対するフォールディング活性を有しているポリペプチド
であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
第１のシグナル配列が、ｐｅｌＢリーダー配列であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
第２のシグナル配列が、前記プロテアーゼのプレ配列であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
第１のポリヌクレオチドが、ｎｐｒプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項８】
第２のポリヌクレオチドが、ｎｐｒプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項９】
微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産する方法であって、
該プロテアーゼの成熟配列からなる第１のポリペプチドを、該プロテアーゼのプロ配列からなりかつ第１のポリペプチドのフォールディングを担う第２のポリペプチドとともに細胞内で発現させる工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記工程が、請求項１に記載のベクターを用いて細胞を形質転換することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程が、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクターと、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターとを前記細胞内に導入することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するためのキットであって、
該プロテアーゼの成熟配列からなる第１のポリペプチドと、該プロテアーゼのプロ配列からなりかつ第１のポリペプチドのフォールディングを担う第２のポリペプチドとを細胞内で発現させるための発現ベクター
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項１に記載のベクターを備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクターと、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターとを備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
請求項１〜８の何れか１項に記載のベクターを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換体を用いる工程を包含することを特徴とする、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産する方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の形質転換体を備えていることを特徴とする、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するためのキット。
【請求項１】
微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するための発現ベクターであって、
別個のプロモーター配列に作動可能に連結された第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはそれぞれ第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードし、
第１のポリペプチドは、該プロテアーゼの成熟配列が第１のシグナル配列に連結されており、
第２のポリペプチドは、該プロテアーゼのプロ配列が第２のシグナル配列に連結されていることを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
前記プロテアーゼが、サーモライシン、ズブチリシン、放線菌プロテアーゼＢ、α‐溶菌プロテアーゼ、アクアリシンＩ、およびストレプトペインからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドが、以下のポリペプチド：
・配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号３に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロテアーゼ活性を有しているポリペプチド
であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記プロテアーゼのプロ配列からなるポリペプチドが、以下のポリペプチド：
・配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号５に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドに対するフォールディング活性を有しているポリペプチド
であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
第１のシグナル配列が、ｐｅｌＢリーダー配列であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
第２のシグナル配列が、前記プロテアーゼのプレ配列であることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
第１のポリヌクレオチドが、ｎｐｒプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項８】
第２のポリヌクレオチドが、ｎｐｒプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項９】
微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産する方法であって、
該プロテアーゼの成熟配列からなる第１のポリペプチドを、該プロテアーゼのプロ配列からなりかつ第１のポリペプチドのフォールディングを担う第２のポリペプチドとともに細胞内で発現させる工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記工程が、請求項１に記載のベクターを用いて細胞を形質転換することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程が、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクターと、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターとを前記細胞内に導入することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するためのキットであって、
該プロテアーゼの成熟配列からなる第１のポリペプチドと、該プロテアーゼのプロ配列からなりかつ第１のポリペプチドのフォールディングを担う第２のポリペプチドとを細胞内で発現させるための発現ベクター
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項１に記載のベクターを備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクターと、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターとを備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
請求項１〜８の何れか１項に記載のベクターを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換体を用いる工程を包含することを特徴とする、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産する方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の形質転換体を備えていることを特徴とする、微生物由来の菌体外プロテアーゼの成熟配列からなるポリペプチドを細胞外にて生産するためのキット。
【図１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図２】
【図５】
【図３】
【図４】
【図６】
【図２】
【図５】
【公開番号】特開２００８−８６２２６（Ｐ２００８−８６２２６Ａ）
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２６８９３５（Ｐ２００６−２６８９３５）
【出願日】平成１８年９月２９日（２００６．９．２９）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２９日（２００６．９．２９）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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