微生物遺伝子検出チップ
【課題】本発明の目的は、非特異吸着の少ないシグナル／ノイズ比が優れた微生物検出チップを提供することである。
【解決手段】
光不透過性の少ない黒色顔料を含む樹脂素材からなる基板を成形し、該基板表面に、オリゴＤＮＡを固定化する為の官能基と、非特異吸着を抑制するための親水性基を同時に導入することにより、オリゴＤＮＡを共有結合にて固定し、夾雑物質の非特異的吸着を抑える目的を達した。
本発明を利用することにより、簡便、短時間で微生物、細菌のＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子レベルでの検査が可能な遺伝子検出チップを提供することができる。
【解決手段】
光不透過性の少ない黒色顔料を含む樹脂素材からなる基板を成形し、該基板表面に、オリゴＤＮＡを固定化する為の官能基と、非特異吸着を抑制するための親水性基を同時に導入することにより、オリゴＤＮＡを共有結合にて固定し、夾雑物質の非特異的吸着を抑える目的を達した。
本発明を利用することにより、簡便、短時間で微生物、細菌のＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子レベルでの検査が可能な遺伝子検出チップを提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出用の遺伝子検出チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物の検査は、微生物を培養することで増殖させ、生化学検査を行うことを主として行われている。例えば、サルモネラ菌の検出・同定には、増菌、分離培養、生化学性状による確認培養、菌体抗原、Ｖｉ莢膜抗原、鞭毛抗原による血清型別を実施し、各検査結果において総合的な判断が必要とされている。当然、この方法には時間と手間がかかる。各検査における簡便なキットも市販されているが、１検体１キットが必要で大量検体の処理には相当量のキットが必要であり、非効率的であった。
【０００３】
また、細菌種特有な塩基配列を有するプライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ法）により特定のＤＮＡ 断片の増幅の有無から細菌種を特定する方法が開発されている。しかしながら、微生物の多様性によりプライマーの伸長反応部分に変異が起こると、偽陰性の危険性を含んでいた。ＰＣＲは数百万ものＤＮＡコピーを合成できる一方で、混入物に非常に敏感なためごく微量の鋳型ＤＮＡから反応を開始する場合、前に行った反応の生成物（生成物のキャリーオーバー）あるいは反応系の外から入ってくる物質のコンタミネーションが問題となる。例えば標的配列を含むプラスミドが反応系に１コピー混入しただけで結果の解釈を誤らせる可能性がある。また、ＰＣＲ等の核酸増幅を用いる場合には、ポリメラーゼ等の高価な酵素を使用せねばならず、コストを下げることが困難であるという問題も持ち合わせていた。
【０００４】
非特許文献１には、ガラス基板の代わりにポリメチルメタクリレートを用いて、表面にＤＮＡ断片を固定化させたＤＮＡマイクロチップを用い、所定のＤＮＡ鎖のハイブリッド特性およびＰＣＲ環境下における熱安定性が評価されており、新規のデバイスが記載されている。
また、特許文献１には、基板表面に所定の高分子物質を配した基板を用いると、再現性良くプライマーが伸長し、菌の検出感度が向上できることが記載されている。しかしながら、この例では、実際にはあらかじめＰＣＲにより増幅した検体溶液を用意する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】F i x e， F . e t a l． “ F u n c t i o n a l i z a t i o n o f p o l y（ m e t h y l m e t h a c ｒy l a t e） （ P M M A） a s a s u b s t r a t e f o r D N A m i c r o a r r a y s” ， N u c l e i c A c i d s R e s ea r c h， 2 0 0 4， J a n u a r y 1 2， V o l . 3 2 N o .１ ， ｅ 9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、非特異吸着の少ないシグナル／ノイズ比が優れた微生物検出チップを得ることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）微生物検出用のＤＮＡ測定用チップ基板であって、
光不透過性素材からなる基板表面に、
ＤＮＡを固定化する為の官能基と、
親水性基を共に有することを特徴とする
ＤＮＡ測定用チップ基板
（２）前記基板表面が、ＤＮＡを固定化する為の官能基を有するモノマーと、親水性を有するモノマーを共重合した高分子物質をチップ基板上に配位した（１）記載のＤＡＮ測定用チップ基板
（３）ＤＮＡを固定化するための官能基が活性エステル基である（１）または（２）記載のＤＮＡ測定用チップ基板
（４）ＤＮＡを固定化するための活性エステル基が、ｐ−フェニルエステル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である（３）記載のＤＮＡ測定用チップ基板
（５）親水基を有するモノマーが側鎖にホスホリルコリン基を含む（１）または（２）記載のＤＮＡ測定用チップ基板
（６）前記高分子物質の主鎖が、（メタ）アクリル酸である（１）または（２）記載のＤＮＡ測定チップ基板
（７）（１）記載の光不透明素材が黒色顔料を含む樹脂からなるＤＮＡ測定用チップ基板
（８）前記基板が環状ポリオレフィン樹脂で成形される（１）〜（７）いずれか記載のＤＮＡ測定用チップ基板
（９）（１）〜（８）いずれか記載の基板にオリゴＤＮＡを固定化したＤＮＡ測定用チップ
（１０）前記オリゴＤＮＡが微生物由来配列のオリゴＤＮＡである（９）記載のＤＮＡ測定用チップ
（１１）前記微生物が、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌から選ばれる少なくとも１種類である（９）または（１０）記載のＤＮＡ測定用チップ
（１２）前記微生物由来のオリゴＤＮＡの配列が、配列式１〜４のオリゴヌクレオチドのいずれか１以上の組み合わせから構成されるオリゴＤＮＡが固定化した（９）〜（１１）いずれか記載のＤＮＡ測定用チップ。
（１３）前記配列の少なくとも１種類と、対象物質の配列を含む（１２）記載のＤＮＡ測定用チップ
（１４）（１）〜（１３）いずれか記載のＤＮＡ測定用チップを用いたＤＮＡ検出方法がプライマー伸長法、またはハイブリダイゼーション法のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ測定方法
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、非特異吸着の少ないシグナル／ノイズ比が優れた微生物検出チップを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の微生物遺伝子検出チップについて説明する。
【００１１】
微生物遺伝子検出チップにおいて、検出感度に直結するシグナル／ノイズ比を改善することが本発明の主たる目的である。この目的を達成するための方法としては、チップ基板において、対象物質の捕捉量を上げる、夾雑物質の非特異吸着を抑制する、蛍光測定において基板自体の自家蛍光を抑制する、ことがある。
【００１２】
本発明の微生物遺伝子検出チップは、基板上に対象物質であるＤＮＡを捕捉するための官能基と、夾雑物質の非特異吸着を抑制するための親水基とを有する高分子物質をその表面に層を構築させたものからなる。該高分子物質は、対象物質を共有結合によって固定化するための官能基を持つモノマーと夾雑物質の非特異的吸着を抑制する親水基を持つモノマーを共重合した合成高分子物質であってよい。
【００１３】
前記親水基は、親水性を付与するものであれば、特に限定はしないが、ホスホリルコリン基が、安定性、効果の点で好適である。
【００１４】
本発明に使用するホスホリルコリン基としては、例えば-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２-メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン 、６-メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０-メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン 、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン 、ヘキセニルホスホリルコリン 、オクテニルホスホリルコリン 、デセニルホスホリルコリン 等を挙げられるが、２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００１５】
本発明に使用する官能基は、特に限定するものでないが、安定性、反応性の点で活性エステル基が好適に用いることができる。
前記活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応性の高いエステル基を意味するので、各種化学反応、例えばペプチド結合、固定化酵素等の分野で慣用されているものである。例えば、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類が挙げられる。
具体的にはｐ−ニトロフェニル基、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３，−ジカルボキシイミド基等で活性化された活性エステル基が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル基で活性化されたｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシ基が好ましく用いられる。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基および活性エステル基以外の他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。
【００１６】
前記共重合体の主鎖は、ホスホリルコリン基を有する単量体が、２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましいことから、共重合反応のし易さから（メタ）アクリル酸であることが望ましい。
【００１７】
本発明において用いる高分子物質として、具体的には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体あるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）を用いることが好ましい。
【００１８】
前記共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡ の各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。前記共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００１９】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８ 対２ とした混合溶媒とすることができる。
【００２０】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；などが用いられる。
【００２１】
次に、基板の自家蛍光を抑制するための基板について以下に述べる。
基板はガラス製、樹脂製どちらでもかまわないが、加工性等で樹脂製が好ましい。用いる樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリメチルメタアクリレート、ポリビニルアセテート、ビニルアセテート共重合体、スチレンーメタアクリレート共重合体、アクリロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ナイロン、ポリメチルペンテン、シリコン樹脂、アミノ樹脂、ポリスルホン、フッ素樹脂、飽和環状ポリオレフィン樹脂などがあげられる。これらの中で、は自家蛍光の少ない樹脂として、環状ポリオレフィン樹脂を用いることが好ましい。
【００２２】
蛍光現象を用いた標識物質を測定するために、基板は光不透過性であることが好ましい。これは、外部や内部光の漏れの影響を排除し正確な測定値を得るために必要である。光不透過にする方法としては、着色樹脂で成形する方法、透明樹脂で成形した後、成形品を光不透過性塗料等で塗装する方法、同じく鍍金や蒸着により金属皮膜を形成し不透過性を付与する方法などが挙げられるが、着色樹脂材料を用いる方法が最も簡便である。
【００２３】
顔料を入れた基板成形においては、原料となる透明樹脂に顔料を加えて混練、成形してもよく、また、透明樹脂に顔料を混練した成形樹脂材料を用いて成形してもよい。顔料の分散性を考えると顔料を混練した成形樹脂材料を用いて成形することが好ましい。光不透過の程度は、基板の裏側への光透過率が少なければ少ないほど良く、１％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．１％以下であり、最も好ましくは０．０１％以下である。
【００２４】
不透明にする方法は、基板自体を着色樹脂により成形することにより達成できる。光透過度を下げるためには、黒色に着色することが好ましい。
黒色に着色する方法としては、酸化鉄またはカーボンブラックを用いることで達成できる。
酸化鉄またはカーボンブラックの添加量は樹脂に対して０．５〜６０ｗｔ％の添加量が好ましく、より好ましくは０．５〜５．０ｗｔ％であり、最も好ましくは１．０〜２．０ｗｔ％である。０．５ｗｔ％未満では添加効果が不十分となる。また、６０ｗｔ％を越えると成形品の機械的強度の点で好ましくない。
前記添加物により、蛍光測定において光不透過性を獲得するだけでなく、散乱光の発生を最小限に抑えることができ、自家蛍光を低くすることができるため高感度の測定が可能となる。
【００２５】
次に前記基板上に、前記高分子物質層を構築する方法について以下に述べる。
前記高分子物質は、有機溶媒、例えばエタノール溶液に溶解できるため、塗布により容易に基板表面に層を形成させることができる。
具体的には、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥させることにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００２６】
次に、微生物由来のオリゴＤＮＡの固相化について以下に述べる。
例えば、基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とオリゴＤＮＡ鎖とを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でオリゴＤＮＡ鎖を固定化する（工程１）。続いてオリゴＤＮＡ鎖を固定化した以外の基板表面で活性エステル基を不活性化する（工程２）。以下、それぞれの工程について説明する。
上記工程１においてオリゴＤＮＡ鎖を基板上に固定化する際には、オリゴＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。そうすることで、高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がオリゴＤＮＡ鎖と反応して、共有結合が形成される。
このオリゴＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
また、点着後、基板表面に固定化されなかったオリゴＤＮＡ鎖を除去するため、純水や緩衝液で洗浄しても良い。
【００２７】
また、上記工程２に示したように洗浄後はオリゴＤＮＡ鎖を固定化した以外の基板表面に残留する活性エステル基の不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００２８】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００２９】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９ − アミノアクアジン、アミノブタ
ノール、４ − アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５ − アミノ２ ， ３ − ジヒドロー１ ， ４ − ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２ − （ ２ − アミノエチルアミノ） エタノール、リン酸二水素２ − アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４ − （ ２ − アミノエチル） モルホリン、５ -アミノフルオレセイン、６ − アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ − アミノ馬尿酸、２ − アミノ− ２− ヒドロキシメチル− １ ， ３ − プロパンジオール、５ − アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２ − アミノオクタン、２ − アミノオクタン酸、１ − アミノ２ − プロパノール、３ − アミノ− １ − プロパノール、３ − アミノプロペン、３ − アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１ １ − アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４ − アミノフタロニトリル、３ − アミノフタルイミド、ｐ − アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００３０】
また、基板に固定化するオリゴＤＮＡ鎖には、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡ鎖を用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上にオリゴＤＮＡ鎖を固定化することができる。該アミノ基の導入位置はオリゴＤＮＡ鎖の末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングを一層効率よく行うことができる観点から、好ましい。
以上により、オリゴＤＮＡ鎖が固定化されたチップが構築される。
【００３１】
次に、固定化するオリゴＤＮＡ鎖について述べる。本特許のＤＮＡ測定用チップ基板は、微生物検出用途であるので、固定化するオリゴＤＮＡ鎖配列は微生物由来のものを用いる。この時、用いる微生物は特に限定しないが、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌の４種類から選ばれる少なくとも１種類の微生物由来のオリゴＤＮＡを固定化することが好適である。これらの微生物は食品や医薬品の検査において必要不可欠なものである。
【００３２】
次に、固相化した微生物由来オリゴＤＮＡの検出方法について以下に述べる。
基板に固定化されたオリゴＤＮＡ鎖を使用する反応系としては、２種類の反応系がある。一つはプライマー伸長反応であり、もう一方はハイブリダイゼーション反応である。
【００３３】
まず、プライマー伸長反応について述べる。
プライマー伸長反応系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼの何れかを用い、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなど）を含有するバッファーを用いる。
【００３４】
バッファー中に、少なくとも２ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２〜６ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンを含むことにより、遺伝子の検出感度が向上する。
また、ＤＮＡポリメラーゼの中でも、特に耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
【００３５】
また、これらのヌクレオチドモノマーを標識しておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光標識したＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡのアデニン（Ａ）に対応する 伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３で蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行うことができるようになる。
この蛍光標識は、他のヌクレオチドモノマーに施してもよく、また複数種のヌクレオチドモノマーをしてもよい。また、標識方法も光吸収体の導入、放射線標識、酵素標識などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
【００３６】
酵素標識においては、直接酵素で標識するより、ビオチン化、またはジゴキシゲニンを結合した核酸を使用することが好ましい。ビオチンを用いた場合は、プライマーを伸長した後、酵素標識アビジンを使用して検出することが可能である。まら、ジゴキシゲニンを用いた場合は、ジゴキシゲニンを特異的に認識する抗体が開発、市販されているので、その抗体を標識して用いることができる。
【００３７】
試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度以上、例えば９０〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖など見られる折れたたみ構造を有する鋳型ＤＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
【００３８】
続いて、反応系の温度プライマーと鋳型ＤＮＡ断片とがアニールする温度、例えば４〜７２℃、好ましくは５０〜７２℃まで下降させる。このアニール処理により、鋳型ＤＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するプライマー鎖と、この鋳型ＤＮＡ断片とが二本鎖になる。この反応系に対して、洗浄処理を行わずそのままＤＮＡ伸長反応に進める。また、アニールさせる工程において、熱変性温度以上から例えば４℃〜室温まで急冷させる工程を経たのちアニールする温度まで昇温させても良い。
【００３９】
従来であると、アニール処理の後、伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片を除くための洗浄が必要であったが、本実施形態では、非特異吸着を抑制した表面であるため、基板の洗浄処理が不要となり、試料導入からＤＮＡ鎖伸長反応までを同一の液相系、すなわち反応系をそのまま用いることができる。
【００４０】
ここでは、鋳型Ｄ Ｎ Ａ 断片に対して耐熱性Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼを用いた例を示したが、
Ｄ Ｎ Ａ 鎖を鋳型として新たなＤ Ｎ Ａ 鎖を合成する酵素であれば特に限定はされない。このようなＤ Ｎ Ａ ポリメラーゼとしては、ポルＩ 型Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ（ 大腸細菌Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼＩ 、クレノウ断片など） 、α 型Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ（ ピロコッカス・フリオサス由来Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ、Ｖ Ｅ Ｎ Ｔ Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ、Ｋ Ｏ Ｄ Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ、Ｄ Ｅ Ｅ Ｐ Ｖ Ｅ Ｎ Ｔ Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ） 及び非α 非ポルＩ 型Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ（ 国際公開第９ ７ ／ ２ ４ ４ ４ ４ 号パンフレット記載のＤ Ｎ Ａ ポリメラーゼ） 等が挙げられる。
【００４１】
次に、ハイブリダイゼーション反応について述べる。
ハイブリダイゼーション反応では、細菌検体のゲノムＤＮＡ特定部位をＰＣＲを用いて増幅、あるいは増幅と同時に標識し、チップにかけてハイブリダイゼーションさせて、検出する。
【００４２】
具体的は、まず検体からＤＮＡを回収する。回収方法は特に限定するものではなく、一般的なＤＮＡ抽出方法が使用でき、さらに市販の抽出キットを使用しても良い。
続いて、回収したＤＮＡをリボゾームＤＮＡのユニバーサルプライマーを用い、ＰＣＲ反応によりリボゾームＤＮＡの増幅を行う。菌類では一般的に５Ｓ、１６Ｓまたは２３ＳリボゾーマルＤＮＡのプライマーを用いる。
熱変性温度、アニール温度の反応条件は前述のプライマー伸長法と同様で、反応は１０サイクル以上実施することで目的となる菌由来ＤＮＡのＰＣＲ産物を得ることができる。
またこの時、前述のプライマー伸長法と同様、標識ヌクレオチドプライマー（例えばＣｙ３−ｄＵＴＰなど）を使用することで標識ＤＮＡ産物を得ることが可能である。
【００４３】
前記標識ＤＮＡ産物を用いて、本発明により得られた基板上において、ハイブリダイゼーション反応を行い、対象ＤＮＡの検出反応を行う。ハイブリダイゼーション方法としては、一般的に用いられるハイブリダイゼーション方法であれば、どのような方法でも用いることが可能であり、市販の自動ハイブリダイゼーション装置を用いて反応することも可能である。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
【００４５】
（プラスチック基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）に、カーボンブラック含有ポリスチレン樹脂（住化カラー製、ＳＰＡＢ−８Ａ２６２５、カーボンブラック含有量４０％）３７．５ｇ／飽和環状ポリオレフィン樹脂１ｋｇで混ぜ、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
【００４６】
（プローブＤＮＡ固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、各菌２３ＳリボゾームＤＮＡ配列特異なオリゴＤＮＡ鎖を０．２５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッター（日立ソフトウェアエンジニアリング社製MARKS-I）を用い、１００μｍ径スポットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした基板を、８０℃で１時間加熱して、オリゴＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を固定化させた。
スポットおよび固定化させた各菌２３ＳリボゾームＤＮＡ配列特異なオリゴＤＮＡの塩基配列を下記に示す。
黄色ブドウ球菌：agtaggataggcgaagcgtgcgatt ＳＡ
大腸菌： ctgatatgtaggtgaagcgacttgctcg ＥＣＯ
緑濃菌： gttaatcgacgcagggttagtcggtt ＰＡ
サルモネラ菌： tgtgtgttccaggtaaatccggttc ＳＡＬ
ポジティブコントロール：gacagccaggatgttggcttagaagcagc ＰＯＳ
【００４７】
（菌の培養）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）を寒天培地で培養し、３７℃、一昼夜(１４−１８時間)行った。培地はインスタント培地である"普通ブイヨン栄研"を用い、液体培地は" 普通ブイヨン栄研"の指示量を脱塩水に溶かし、寒天培地はそれに１．６％の寒天を加え、それぞれオートクレーブ後、使用した。
【００４８】
（２３ＳリボゾームＤＮＡの抽出）
上記菌培養における１つのコロニーを、２００μｌのＰＢＳ（−）中に分散させ、ＤＮＡ抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｋ２１００−０１）を用い、３μｌのＤＮＡ抽出液を得た。
（ＰＣＲによる２３ＳリボゾームＤＮＡ鎖増幅反応）
２３ＳリボゾームＤＮＡのユニバーサルプライマーを用い、ＰＣＲ反応により２３ＳリボゾームＤＮＡの増幅をおこなった。
ＰＣＲによる増幅に使用プライマーの配列を下記に示す。
プライマー配列：
センス ：５‘−gacagccaggatgttggcttagaagcagc
アンチセンス：下記を同量混合したものを用いた。
５‘−ggaatttcgctaccttaggaccgttatagttacg
５‘−ggaatttcgctaccttaggatggttatagttacc
２５μＬ中に上記プライマー各々を１２．５ｐｍｏｌ、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製、ＥｘＴａｑ）をＰＣＲバッファー中に溶解させ、サーマルサイクラーにより、熱変性９５℃１分、アニーリング７５℃２分、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃５分のヒートサイクルで、１０サイクル行い、Ｃｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物を得た。
【００４９】
（ハイブリダイゼーション）
自動ハイブリ装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製Ｈｙｂ４）を使用してハイブリダイゼーションを行った。
Ｃｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物４５μＬにハイブリバッファー８５μＬを加え、さらに、外部コントロール２（シロイヌナズナ）と相補鎖オリゴＤＮＡを加え、試料溶液とした（試料溶液の組成は、２ｘＳＳＣ（下組成）、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））。
試料溶液を９５℃で５分熱変性させた後、基板上に分注し、６５℃で３時間ハイブリ反応を行った。
２ｘＳＳＣ：塩化ナトリウム ３００ｍＭ、クエン酸ナトリウム ３０ｍＭ
【００５０】
（測定）
ハイブリ反応の後、基板を０．１％ＳＤＳ含有の２ｘＳＳＣ溶液、２ｘＳＳＣ、０．１ＸＳＳＣの順で洗浄して、終了した。
マイクロアレイ用スキャナー（Axon社製GenePix4000B）によりスポットの蛍光強度を測定した。
【００５１】
＜実施例２＞
実施例１と同様にして、大腸菌の検出を行った。なお検出には、Escherichia coli ATCC 25922の菌株を使用した。
【００５２】
＜実施例３＞
実施例１および２と同様にして、緑膿菌の検出を行った。なお検出には、Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785の菌株を使用した。
【００５３】
＜実施例４＞
実施例１〜３と同様にして、サルモネラ菌の検出を行った。なお検出には、Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028の菌株を使用した。
【００５４】
＜比較例１＞
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
前記プラスチック基板を用い、その後の手順は実施例１と同様にして、黄色ブドウ球菌の検出を行った。
【００５５】
＜比較例２＞
比較例１と同様にして、大腸菌の検出を行った。
【００５６】
＜比較例３＞
比較例１および２と同様にして、緑膿菌の検出を行った。
【００５７】
＜比較例４＞
比較例１〜３と同様にして、サルモネラ菌の検出を行った。
【００５８】
＜比較例５＞
石英ガラス製スライドガラス（松浪ガラス社製、Ｓ１１１１）を用いて、黄色ブドウ球菌の検出を行った。
【００５９】
＜比較例６＞
比較例５と同様にして、大腸菌の検出を行った。
【００６０】
＜比較例７＞
比較例５および６と同様にして、緑膿菌の検出を行った。
【００６１】
＜比較例８＞
比較例５〜７と同様にして、サルモネラ菌の検出を行った。
【００６２】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明を利用することにより、簡便、短時間で微生物、細菌のＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子レベルでの検査が可能な遺伝子検出チップを提供することができる。
また、微生物検出用遺伝子検出チップは、臨床検査、食品検査、感染検査等、種々の検査等に使用でき、短時間で結果を得ることが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出用の遺伝子検出チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物の検査は、微生物を培養することで増殖させ、生化学検査を行うことを主として行われている。例えば、サルモネラ菌の検出・同定には、増菌、分離培養、生化学性状による確認培養、菌体抗原、Ｖｉ莢膜抗原、鞭毛抗原による血清型別を実施し、各検査結果において総合的な判断が必要とされている。当然、この方法には時間と手間がかかる。各検査における簡便なキットも市販されているが、１検体１キットが必要で大量検体の処理には相当量のキットが必要であり、非効率的であった。
【０００３】
また、細菌種特有な塩基配列を有するプライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ法）により特定のＤＮＡ 断片の増幅の有無から細菌種を特定する方法が開発されている。しかしながら、微生物の多様性によりプライマーの伸長反応部分に変異が起こると、偽陰性の危険性を含んでいた。ＰＣＲは数百万ものＤＮＡコピーを合成できる一方で、混入物に非常に敏感なためごく微量の鋳型ＤＮＡから反応を開始する場合、前に行った反応の生成物（生成物のキャリーオーバー）あるいは反応系の外から入ってくる物質のコンタミネーションが問題となる。例えば標的配列を含むプラスミドが反応系に１コピー混入しただけで結果の解釈を誤らせる可能性がある。また、ＰＣＲ等の核酸増幅を用いる場合には、ポリメラーゼ等の高価な酵素を使用せねばならず、コストを下げることが困難であるという問題も持ち合わせていた。
【０００４】
非特許文献１には、ガラス基板の代わりにポリメチルメタクリレートを用いて、表面にＤＮＡ断片を固定化させたＤＮＡマイクロチップを用い、所定のＤＮＡ鎖のハイブリッド特性およびＰＣＲ環境下における熱安定性が評価されており、新規のデバイスが記載されている。
また、特許文献１には、基板表面に所定の高分子物質を配した基板を用いると、再現性良くプライマーが伸長し、菌の検出感度が向上できることが記載されている。しかしながら、この例では、実際にはあらかじめＰＣＲにより増幅した検体溶液を用意する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】F i x e， F . e t a l． “ F u n c t i o n a l i z a t i o n o f p o l y（ m e t h y l m e t h a c ｒy l a t e） （ P M M A） a s a s u b s t r a t e f o r D N A m i c r o a r r a y s” ， N u c l e i c A c i d s R e s ea r c h， 2 0 0 4， J a n u a r y 1 2， V o l . 3 2 N o .１ ， ｅ 9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、非特異吸着の少ないシグナル／ノイズ比が優れた微生物検出チップを得ることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）微生物検出用のＤＮＡ測定用チップ基板であって、
光不透過性素材からなる基板表面に、
ＤＮＡを固定化する為の官能基と、
親水性基を共に有することを特徴とする
ＤＮＡ測定用チップ基板
（２）前記基板表面が、ＤＮＡを固定化する為の官能基を有するモノマーと、親水性を有するモノマーを共重合した高分子物質をチップ基板上に配位した（１）記載のＤＡＮ測定用チップ基板
（３）ＤＮＡを固定化するための官能基が活性エステル基である（１）または（２）記載のＤＮＡ測定用チップ基板
（４）ＤＮＡを固定化するための活性エステル基が、ｐ−フェニルエステル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である（３）記載のＤＮＡ測定用チップ基板
（５）親水基を有するモノマーが側鎖にホスホリルコリン基を含む（１）または（２）記載のＤＮＡ測定用チップ基板
（６）前記高分子物質の主鎖が、（メタ）アクリル酸である（１）または（２）記載のＤＮＡ測定チップ基板
（７）（１）記載の光不透明素材が黒色顔料を含む樹脂からなるＤＮＡ測定用チップ基板
（８）前記基板が環状ポリオレフィン樹脂で成形される（１）〜（７）いずれか記載のＤＮＡ測定用チップ基板
（９）（１）〜（８）いずれか記載の基板にオリゴＤＮＡを固定化したＤＮＡ測定用チップ
（１０）前記オリゴＤＮＡが微生物由来配列のオリゴＤＮＡである（９）記載のＤＮＡ測定用チップ
（１１）前記微生物が、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌から選ばれる少なくとも１種類である（９）または（１０）記載のＤＮＡ測定用チップ
（１２）前記微生物由来のオリゴＤＮＡの配列が、配列式１〜４のオリゴヌクレオチドのいずれか１以上の組み合わせから構成されるオリゴＤＮＡが固定化した（９）〜（１１）いずれか記載のＤＮＡ測定用チップ。
（１３）前記配列の少なくとも１種類と、対象物質の配列を含む（１２）記載のＤＮＡ測定用チップ
（１４）（１）〜（１３）いずれか記載のＤＮＡ測定用チップを用いたＤＮＡ検出方法がプライマー伸長法、またはハイブリダイゼーション法のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ測定方法
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、非特異吸着の少ないシグナル／ノイズ比が優れた微生物検出チップを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の微生物遺伝子検出チップについて説明する。
【００１１】
微生物遺伝子検出チップにおいて、検出感度に直結するシグナル／ノイズ比を改善することが本発明の主たる目的である。この目的を達成するための方法としては、チップ基板において、対象物質の捕捉量を上げる、夾雑物質の非特異吸着を抑制する、蛍光測定において基板自体の自家蛍光を抑制する、ことがある。
【００１２】
本発明の微生物遺伝子検出チップは、基板上に対象物質であるＤＮＡを捕捉するための官能基と、夾雑物質の非特異吸着を抑制するための親水基とを有する高分子物質をその表面に層を構築させたものからなる。該高分子物質は、対象物質を共有結合によって固定化するための官能基を持つモノマーと夾雑物質の非特異的吸着を抑制する親水基を持つモノマーを共重合した合成高分子物質であってよい。
【００１３】
前記親水基は、親水性を付与するものであれば、特に限定はしないが、ホスホリルコリン基が、安定性、効果の点で好適である。
【００１４】
本発明に使用するホスホリルコリン基としては、例えば-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２-メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン 、６-メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０-メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン 、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン 、ヘキセニルホスホリルコリン 、オクテニルホスホリルコリン 、デセニルホスホリルコリン 等を挙げられるが、２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００１５】
本発明に使用する官能基は、特に限定するものでないが、安定性、反応性の点で活性エステル基が好適に用いることができる。
前記活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応性の高いエステル基を意味するので、各種化学反応、例えばペプチド結合、固定化酵素等の分野で慣用されているものである。例えば、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類が挙げられる。
具体的にはｐ−ニトロフェニル基、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３，−ジカルボキシイミド基等で活性化された活性エステル基が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニル基で活性化されたｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシ基が好ましく用いられる。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基および活性エステル基以外の他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。
【００１６】
前記共重合体の主鎖は、ホスホリルコリン基を有する単量体が、２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましいことから、共重合反応のし易さから（メタ）アクリル酸であることが望ましい。
【００１７】
本発明において用いる高分子物質として、具体的には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体あるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）を用いることが好ましい。
【００１８】
前記共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡ の各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。前記共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００１９】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８ 対２ とした混合溶媒とすることができる。
【００２０】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；などが用いられる。
【００２１】
次に、基板の自家蛍光を抑制するための基板について以下に述べる。
基板はガラス製、樹脂製どちらでもかまわないが、加工性等で樹脂製が好ましい。用いる樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリメチルメタアクリレート、ポリビニルアセテート、ビニルアセテート共重合体、スチレンーメタアクリレート共重合体、アクリロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ナイロン、ポリメチルペンテン、シリコン樹脂、アミノ樹脂、ポリスルホン、フッ素樹脂、飽和環状ポリオレフィン樹脂などがあげられる。これらの中で、は自家蛍光の少ない樹脂として、環状ポリオレフィン樹脂を用いることが好ましい。
【００２２】
蛍光現象を用いた標識物質を測定するために、基板は光不透過性であることが好ましい。これは、外部や内部光の漏れの影響を排除し正確な測定値を得るために必要である。光不透過にする方法としては、着色樹脂で成形する方法、透明樹脂で成形した後、成形品を光不透過性塗料等で塗装する方法、同じく鍍金や蒸着により金属皮膜を形成し不透過性を付与する方法などが挙げられるが、着色樹脂材料を用いる方法が最も簡便である。
【００２３】
顔料を入れた基板成形においては、原料となる透明樹脂に顔料を加えて混練、成形してもよく、また、透明樹脂に顔料を混練した成形樹脂材料を用いて成形してもよい。顔料の分散性を考えると顔料を混練した成形樹脂材料を用いて成形することが好ましい。光不透過の程度は、基板の裏側への光透過率が少なければ少ないほど良く、１％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．１％以下であり、最も好ましくは０．０１％以下である。
【００２４】
不透明にする方法は、基板自体を着色樹脂により成形することにより達成できる。光透過度を下げるためには、黒色に着色することが好ましい。
黒色に着色する方法としては、酸化鉄またはカーボンブラックを用いることで達成できる。
酸化鉄またはカーボンブラックの添加量は樹脂に対して０．５〜６０ｗｔ％の添加量が好ましく、より好ましくは０．５〜５．０ｗｔ％であり、最も好ましくは１．０〜２．０ｗｔ％である。０．５ｗｔ％未満では添加効果が不十分となる。また、６０ｗｔ％を越えると成形品の機械的強度の点で好ましくない。
前記添加物により、蛍光測定において光不透過性を獲得するだけでなく、散乱光の発生を最小限に抑えることができ、自家蛍光を低くすることができるため高感度の測定が可能となる。
【００２５】
次に前記基板上に、前記高分子物質層を構築する方法について以下に述べる。
前記高分子物質は、有機溶媒、例えばエタノール溶液に溶解できるため、塗布により容易に基板表面に層を形成させることができる。
具体的には、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥させることにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００２６】
次に、微生物由来のオリゴＤＮＡの固相化について以下に述べる。
例えば、基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とオリゴＤＮＡ鎖とを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でオリゴＤＮＡ鎖を固定化する（工程１）。続いてオリゴＤＮＡ鎖を固定化した以外の基板表面で活性エステル基を不活性化する（工程２）。以下、それぞれの工程について説明する。
上記工程１においてオリゴＤＮＡ鎖を基板上に固定化する際には、オリゴＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。そうすることで、高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がオリゴＤＮＡ鎖と反応して、共有結合が形成される。
このオリゴＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
また、点着後、基板表面に固定化されなかったオリゴＤＮＡ鎖を除去するため、純水や緩衝液で洗浄しても良い。
【００２７】
また、上記工程２に示したように洗浄後はオリゴＤＮＡ鎖を固定化した以外の基板表面に残留する活性エステル基の不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００２８】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００２９】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９ − アミノアクアジン、アミノブタ
ノール、４ − アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５ − アミノ２ ， ３ − ジヒドロー１ ， ４ − ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２ − （ ２ − アミノエチルアミノ） エタノール、リン酸二水素２ − アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４ − （ ２ − アミノエチル） モルホリン、５ -アミノフルオレセイン、６ − アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ − アミノ馬尿酸、２ − アミノ− ２− ヒドロキシメチル− １ ， ３ − プロパンジオール、５ − アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２ − アミノオクタン、２ − アミノオクタン酸、１ − アミノ２ − プロパノール、３ − アミノ− １ − プロパノール、３ − アミノプロペン、３ − アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１ １ − アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４ − アミノフタロニトリル、３ − アミノフタルイミド、ｐ − アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００３０】
また、基板に固定化するオリゴＤＮＡ鎖には、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡ鎖を用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上にオリゴＤＮＡ鎖を固定化することができる。該アミノ基の導入位置はオリゴＤＮＡ鎖の末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングを一層効率よく行うことができる観点から、好ましい。
以上により、オリゴＤＮＡ鎖が固定化されたチップが構築される。
【００３１】
次に、固定化するオリゴＤＮＡ鎖について述べる。本特許のＤＮＡ測定用チップ基板は、微生物検出用途であるので、固定化するオリゴＤＮＡ鎖配列は微生物由来のものを用いる。この時、用いる微生物は特に限定しないが、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌の４種類から選ばれる少なくとも１種類の微生物由来のオリゴＤＮＡを固定化することが好適である。これらの微生物は食品や医薬品の検査において必要不可欠なものである。
【００３２】
次に、固相化した微生物由来オリゴＤＮＡの検出方法について以下に述べる。
基板に固定化されたオリゴＤＮＡ鎖を使用する反応系としては、２種類の反応系がある。一つはプライマー伸長反応であり、もう一方はハイブリダイゼーション反応である。
【００３３】
まず、プライマー伸長反応について述べる。
プライマー伸長反応系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼの何れかを用い、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなど）を含有するバッファーを用いる。
【００３４】
バッファー中に、少なくとも２ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２〜６ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンを含むことにより、遺伝子の検出感度が向上する。
また、ＤＮＡポリメラーゼの中でも、特に耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
【００３５】
また、これらのヌクレオチドモノマーを標識しておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光標識したＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡのアデニン（Ａ）に対応する 伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３で蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行うことができるようになる。
この蛍光標識は、他のヌクレオチドモノマーに施してもよく、また複数種のヌクレオチドモノマーをしてもよい。また、標識方法も光吸収体の導入、放射線標識、酵素標識などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
【００３６】
酵素標識においては、直接酵素で標識するより、ビオチン化、またはジゴキシゲニンを結合した核酸を使用することが好ましい。ビオチンを用いた場合は、プライマーを伸長した後、酵素標識アビジンを使用して検出することが可能である。まら、ジゴキシゲニンを用いた場合は、ジゴキシゲニンを特異的に認識する抗体が開発、市販されているので、その抗体を標識して用いることができる。
【００３７】
試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度以上、例えば９０〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖など見られる折れたたみ構造を有する鋳型ＤＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
【００３８】
続いて、反応系の温度プライマーと鋳型ＤＮＡ断片とがアニールする温度、例えば４〜７２℃、好ましくは５０〜７２℃まで下降させる。このアニール処理により、鋳型ＤＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するプライマー鎖と、この鋳型ＤＮＡ断片とが二本鎖になる。この反応系に対して、洗浄処理を行わずそのままＤＮＡ伸長反応に進める。また、アニールさせる工程において、熱変性温度以上から例えば４℃〜室温まで急冷させる工程を経たのちアニールする温度まで昇温させても良い。
【００３９】
従来であると、アニール処理の後、伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片を除くための洗浄が必要であったが、本実施形態では、非特異吸着を抑制した表面であるため、基板の洗浄処理が不要となり、試料導入からＤＮＡ鎖伸長反応までを同一の液相系、すなわち反応系をそのまま用いることができる。
【００４０】
ここでは、鋳型Ｄ Ｎ Ａ 断片に対して耐熱性Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼを用いた例を示したが、
Ｄ Ｎ Ａ 鎖を鋳型として新たなＤ Ｎ Ａ 鎖を合成する酵素であれば特に限定はされない。このようなＤ Ｎ Ａ ポリメラーゼとしては、ポルＩ 型Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ（ 大腸細菌Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼＩ 、クレノウ断片など） 、α 型Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ（ ピロコッカス・フリオサス由来Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ、Ｖ Ｅ Ｎ Ｔ Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ、Ｋ Ｏ Ｄ Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ、Ｄ Ｅ Ｅ Ｐ Ｖ Ｅ Ｎ Ｔ Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ） 及び非α 非ポルＩ 型Ｄ Ｎ Ａ ポリメラーゼ（ 国際公開第９ ７ ／ ２ ４ ４ ４ ４ 号パンフレット記載のＤ Ｎ Ａ ポリメラーゼ） 等が挙げられる。
【００４１】
次に、ハイブリダイゼーション反応について述べる。
ハイブリダイゼーション反応では、細菌検体のゲノムＤＮＡ特定部位をＰＣＲを用いて増幅、あるいは増幅と同時に標識し、チップにかけてハイブリダイゼーションさせて、検出する。
【００４２】
具体的は、まず検体からＤＮＡを回収する。回収方法は特に限定するものではなく、一般的なＤＮＡ抽出方法が使用でき、さらに市販の抽出キットを使用しても良い。
続いて、回収したＤＮＡをリボゾームＤＮＡのユニバーサルプライマーを用い、ＰＣＲ反応によりリボゾームＤＮＡの増幅を行う。菌類では一般的に５Ｓ、１６Ｓまたは２３ＳリボゾーマルＤＮＡのプライマーを用いる。
熱変性温度、アニール温度の反応条件は前述のプライマー伸長法と同様で、反応は１０サイクル以上実施することで目的となる菌由来ＤＮＡのＰＣＲ産物を得ることができる。
またこの時、前述のプライマー伸長法と同様、標識ヌクレオチドプライマー（例えばＣｙ３−ｄＵＴＰなど）を使用することで標識ＤＮＡ産物を得ることが可能である。
【００４３】
前記標識ＤＮＡ産物を用いて、本発明により得られた基板上において、ハイブリダイゼーション反応を行い、対象ＤＮＡの検出反応を行う。ハイブリダイゼーション方法としては、一般的に用いられるハイブリダイゼーション方法であれば、どのような方法でも用いることが可能であり、市販の自動ハイブリダイゼーション装置を用いて反応することも可能である。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
【００４５】
（プラスチック基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）に、カーボンブラック含有ポリスチレン樹脂（住化カラー製、ＳＰＡＢ−８Ａ２６２５、カーボンブラック含有量４０％）３７．５ｇ／飽和環状ポリオレフィン樹脂１ｋｇで混ぜ、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
【００４６】
（プローブＤＮＡ固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、各菌２３ＳリボゾームＤＮＡ配列特異なオリゴＤＮＡ鎖を０．２５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッター（日立ソフトウェアエンジニアリング社製MARKS-I）を用い、１００μｍ径スポットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした基板を、８０℃で１時間加熱して、オリゴＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を固定化させた。
スポットおよび固定化させた各菌２３ＳリボゾームＤＮＡ配列特異なオリゴＤＮＡの塩基配列を下記に示す。
黄色ブドウ球菌：agtaggataggcgaagcgtgcgatt ＳＡ
大腸菌： ctgatatgtaggtgaagcgacttgctcg ＥＣＯ
緑濃菌： gttaatcgacgcagggttagtcggtt ＰＡ
サルモネラ菌： tgtgtgttccaggtaaatccggttc ＳＡＬ
ポジティブコントロール：gacagccaggatgttggcttagaagcagc ＰＯＳ
【００４７】
（菌の培養）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）を寒天培地で培養し、３７℃、一昼夜(１４−１８時間)行った。培地はインスタント培地である"普通ブイヨン栄研"を用い、液体培地は" 普通ブイヨン栄研"の指示量を脱塩水に溶かし、寒天培地はそれに１．６％の寒天を加え、それぞれオートクレーブ後、使用した。
【００４８】
（２３ＳリボゾームＤＮＡの抽出）
上記菌培養における１つのコロニーを、２００μｌのＰＢＳ（−）中に分散させ、ＤＮＡ抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｋ２１００−０１）を用い、３μｌのＤＮＡ抽出液を得た。
（ＰＣＲによる２３ＳリボゾームＤＮＡ鎖増幅反応）
２３ＳリボゾームＤＮＡのユニバーサルプライマーを用い、ＰＣＲ反応により２３ＳリボゾームＤＮＡの増幅をおこなった。
ＰＣＲによる増幅に使用プライマーの配列を下記に示す。
プライマー配列：
センス ：５‘−gacagccaggatgttggcttagaagcagc
アンチセンス：下記を同量混合したものを用いた。
５‘−ggaatttcgctaccttaggaccgttatagttacg
５‘−ggaatttcgctaccttaggatggttatagttacc
２５μＬ中に上記プライマー各々を１２．５ｐｍｏｌ、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製、ＥｘＴａｑ）をＰＣＲバッファー中に溶解させ、サーマルサイクラーにより、熱変性９５℃１分、アニーリング７５℃２分、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃５分のヒートサイクルで、１０サイクル行い、Ｃｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物を得た。
【００４９】
（ハイブリダイゼーション）
自動ハイブリ装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製Ｈｙｂ４）を使用してハイブリダイゼーションを行った。
Ｃｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物４５μＬにハイブリバッファー８５μＬを加え、さらに、外部コントロール２（シロイヌナズナ）と相補鎖オリゴＤＮＡを加え、試料溶液とした（試料溶液の組成は、２ｘＳＳＣ（下組成）、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））。
試料溶液を９５℃で５分熱変性させた後、基板上に分注し、６５℃で３時間ハイブリ反応を行った。
２ｘＳＳＣ：塩化ナトリウム ３００ｍＭ、クエン酸ナトリウム ３０ｍＭ
【００５０】
（測定）
ハイブリ反応の後、基板を０．１％ＳＤＳ含有の２ｘＳＳＣ溶液、２ｘＳＳＣ、０．１ＸＳＳＣの順で洗浄して、終了した。
マイクロアレイ用スキャナー（Axon社製GenePix4000B）によりスポットの蛍光強度を測定した。
【００５１】
＜実施例２＞
実施例１と同様にして、大腸菌の検出を行った。なお検出には、Escherichia coli ATCC 25922の菌株を使用した。
【００５２】
＜実施例３＞
実施例１および２と同様にして、緑膿菌の検出を行った。なお検出には、Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785の菌株を使用した。
【００５３】
＜実施例４＞
実施例１〜３と同様にして、サルモネラ菌の検出を行った。なお検出には、Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028の菌株を使用した。
【００５４】
＜比較例１＞
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
前記プラスチック基板を用い、その後の手順は実施例１と同様にして、黄色ブドウ球菌の検出を行った。
【００５５】
＜比較例２＞
比較例１と同様にして、大腸菌の検出を行った。
【００５６】
＜比較例３＞
比較例１および２と同様にして、緑膿菌の検出を行った。
【００５７】
＜比較例４＞
比較例１〜３と同様にして、サルモネラ菌の検出を行った。
【００５８】
＜比較例５＞
石英ガラス製スライドガラス（松浪ガラス社製、Ｓ１１１１）を用いて、黄色ブドウ球菌の検出を行った。
【００５９】
＜比較例６＞
比較例５と同様にして、大腸菌の検出を行った。
【００６０】
＜比較例７＞
比較例５および６と同様にして、緑膿菌の検出を行った。
【００６１】
＜比較例８＞
比較例５〜７と同様にして、サルモネラ菌の検出を行った。
【００６２】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明を利用することにより、簡便、短時間で微生物、細菌のＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子レベルでの検査が可能な遺伝子検出チップを提供することができる。
また、微生物検出用遺伝子検出チップは、臨床検査、食品検査、感染検査等、種々の検査等に使用でき、短時間で結果を得ることが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物検出用のＤＮＡ測定用チップ基板であって、
光不透過性素材からなる基板表面に、
ＤＮＡを固定化する為の官能基と、
親水性基を共に有することを特徴とする
ＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項２】
前記基板表面が、ＤＮＡを固定化する為の官能基を有するモノマーと、親水性を有するモノマーを共重合した高分子物質をチップ基板上に配位した請求項１記載のＤＡＮ測定用チップ基板
【請求項３】
ＤＮＡを固定化するための官能基が活性エステル基である請求項１または２記載のＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項４】
ＤＮＡを固定化するための活性エステル基が、ｐ−フェニルエステル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である請求項３記載のＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項５】
親水基を有するモノマーが側鎖にホスホリルコリン基を含む請求項１または２記載のＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項６】
前記高分子物質の主鎖が、（メタ）アクリル酸である請求項１または２記載のＤＮＡ測定チップ基板
【請求項７】
請求項１記載の光不透明素材が黒色顔料を含む樹脂からなるＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項８】
前記基板が環状ポリオレフィン樹脂で成形される請求項１〜７いずれか記載のＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載の基板にオリゴＤＮＡを固定化したＤＮＡ測定用チップ
【請求項１０】
前記オリゴＤＮＡが微生物由来配列のオリゴＤＮＡである請求項９記載のＤＮＡ測定用チップ
【請求項１１】
前記微生物が、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌から選ばれる少なくとも１種類である請求項９または１０記載のＤＮＡ測定用チップ
【請求項１２】
前記微生物由来のオリゴＤＮＡの配列が、配列式１〜４のオリゴヌクレオチドのいずれか１以上の組み合わせから構成されるオリゴＤＮＡが固定化した請求項９〜１１いずれか記載のＤＮＡ測定用チップ。
【請求項１３】
前記配列の少なくとも１種類と、対象物質の配列を含む請求項１２記載のＤＮＡ測定用チップ
【請求項１４】
請求項１〜１３いずれか記載のＤＮＡ測定用チップを用いたＤＮＡ検出方法がプライマー伸長法、またはハイブリダイゼーション法のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ測定方法
【請求項１】
微生物検出用のＤＮＡ測定用チップ基板であって、
光不透過性素材からなる基板表面に、
ＤＮＡを固定化する為の官能基と、
親水性基を共に有することを特徴とする
ＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項２】
前記基板表面が、ＤＮＡを固定化する為の官能基を有するモノマーと、親水性を有するモノマーを共重合した高分子物質をチップ基板上に配位した請求項１記載のＤＡＮ測定用チップ基板
【請求項３】
ＤＮＡを固定化するための官能基が活性エステル基である請求項１または２記載のＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項４】
ＤＮＡを固定化するための活性エステル基が、ｐ−フェニルエステル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である請求項３記載のＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項５】
親水基を有するモノマーが側鎖にホスホリルコリン基を含む請求項１または２記載のＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項６】
前記高分子物質の主鎖が、（メタ）アクリル酸である請求項１または２記載のＤＮＡ測定チップ基板
【請求項７】
請求項１記載の光不透明素材が黒色顔料を含む樹脂からなるＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項８】
前記基板が環状ポリオレフィン樹脂で成形される請求項１〜７いずれか記載のＤＮＡ測定用チップ基板
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載の基板にオリゴＤＮＡを固定化したＤＮＡ測定用チップ
【請求項１０】
前記オリゴＤＮＡが微生物由来配列のオリゴＤＮＡである請求項９記載のＤＮＡ測定用チップ
【請求項１１】
前記微生物が、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌から選ばれる少なくとも１種類である請求項９または１０記載のＤＮＡ測定用チップ
【請求項１２】
前記微生物由来のオリゴＤＮＡの配列が、配列式１〜４のオリゴヌクレオチドのいずれか１以上の組み合わせから構成されるオリゴＤＮＡが固定化した請求項９〜１１いずれか記載のＤＮＡ測定用チップ。
【請求項１３】
前記配列の少なくとも１種類と、対象物質の配列を含む請求項１２記載のＤＮＡ測定用チップ
【請求項１４】
請求項１〜１３いずれか記載のＤＮＡ測定用チップを用いたＤＮＡ検出方法がプライマー伸長法、またはハイブリダイゼーション法のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ測定方法
【公開番号】特開２０１１−１８８８２９（Ｐ２０１１−１８８８２９Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５９０１３（Ｐ２０１０−５９０１３）
【出願日】平成２２年３月１６日（２０１０．３．１６）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１６日（２０１０．３．１６）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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