心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘｖｉｖｏ心筋細胞、その作製方法および該心筋細胞を用いたスクリーニング方法
【課題】心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を簡易に評価するための実験系を提供する。
【解決手段】株化心筋芽細胞を心筋細胞に分化誘導した後、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養することによって、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞。また、該ｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を用いた、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝評価系による、心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法。
【解決手段】株化心筋芽細胞を心筋細胞に分化誘導した後、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養することによって、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞。また、該ｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を用いた、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝評価系による、心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞、その作製方法および該心筋細胞を用いた心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化が加速する中で心不全の患者数も増加の傾向をたどっている。増え続ける患者数と医療費に対して、入院頻度を減らし外来内服治療によって状態を安定化させるような心不全治療法を確立することが望まれている。
【０００３】
心不全とは体内の代謝的需要・静脈環流に対して、心臓がそれに見合う十分なポンプ機能を果たすことができない状態を示す。その原因としては虚血性心疾患（狭心症・心筋梗塞）、心臓弁膜症、心筋症、高血圧性心機能障害、心筋炎、先天性心疾患など様々な疾患があげられる。心不全治療ターゲットは病態生理の解明とともに変遷している。かつては心臓の機械的なポンプ不全（収縮不全）が注目され、機械的なポンプ不全に対する強心剤や利尿剤の投与が中心的な治療であった。しかし、１９８０年代からは神経体液因子との関連が注目され、アンギオテンシンＩＩの作用を抑制する目的でアンギオテンシン変換酵素阻害剤が投与され始めた。１９９０年代からは、慢性心不全に対するβ遮断薬の有効性が示され、アポトーシスや心筋リモデリングとの関連性が注目されている。また、近年では心筋細胞自体のエネルギー代謝に注目した心不全治療薬の開発が急がれている。
【０００４】
近年の報告では、心不全状態において心筋細胞がインスリン抵抗性（心不全の心筋インスリン抵抗性ともいう）を示し、かつ基礎代謝が変化する。心不全状態における心筋細胞のこのような変化が、心筋細胞のエネルギー代謝の効率を悪化させ、心不全の病態を悪化させる増悪因子であることが示されている（非特許文献１）。つまり、慢性心不全において心筋細胞のインスリン抵抗性はグルコースの代謝を低下させ、遊離脂肪酸の代謝を亢進させる。その結果、約１１〜１２％の心筋細胞のエネルギー効率低下を起こし、活性酸素やアポトーシスも誘導することによってさらなる病態の悪化を引き起こす（図１）。ここで、心筋インスリン抵抗性は、一般的な生活習慣病やメタボリックシンドロームから生じる全身性のインスリン抵抗性とは異なり、心筋細胞において特異的に生じるものである。心筋細胞代謝改善に注目した臨床研究も報告されており、一定の効果を示している（非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、心臓に特化した糖代謝改善薬剤が存在せず、従来の全身に作用する経口糖尿病薬を代用しているため、メトホルミン（ｍｅｔｏｆｏｒｍｉｎ）では、アシドーシスが生じ、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）では水分貯留が生じるなどの理由で心不全患者には禁忌とされている。そのため、心筋細胞の代謝改善、つまりインスリン抵抗性の改善に注目した心不全治療の開発と研究が求められている。
【０００５】
また、Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて心筋細胞の基質代謝を研究しようとする試みも行われている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Houman Ashrafian et al., "Metabolic Mechanisms in Heart Failure", Circulation: Jounal of American Heart Association 2007; 116; 434-448
【非特許文献２】Dean T. Eurich, et al., "Improved Clinical Outcomes Associated With Metformin in Patients With Diabetes and Heart Failure", Diabetes care 2005; 28; 2345-2351
【非特許文献３】George G. Sokos et al., "Glucagon-Like Peptide-1 Infusion Improves Left Ventricular Ejection Fraction and Functional Status in Patients With Chronic Heart Failure", Journal of Cardiac Failure 2006; 12 (9); 694-699
【非特許文献４】Mathias Uhlig et al., "Functional role of Rab11 in GLUT4 trafficking in cardiomyocytes", Molecular and Cellular Endocrinology 2005; 235; 1-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
心不全に関する従来のｉｎ ｖｉｖｏの基礎研究では、実験動物に対して冠動脈結紮や高頻度ペースメーカー刺激などを用いて機械的に心不全を発生させたり、遺伝子改変動物を用いたりしていた。高頻度ペーシングでは心不全モデル動物の作製に約２週間を要し、Ｄａｈｌ食塩感受性ラットなどの遺伝子改変動物を用いた場合では心不全が発生するまでに約１２週間を要する。このように上記方法では、モデル動物の作製に時間がかかるうえ、作成している間にサンプルが死亡してしまうことがしばしばあった。また実際にモデル動物に薬剤を投与して心筋代謝改善薬の効果を判定しようと試みても、全身反応の二次的効果であるのか心筋細胞に特異的な効果であるのかを判定することは困難であった。
【０００８】
また、非特許文献４に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏに心筋細胞の基質代謝を研究しようとしても、市販の心筋培養細胞（Ｈ９ｃ２細胞；ラット心筋芽細胞）は幼若なため、基礎代謝研究の評価が困難であった。すなわち、Ｈ９ｃ２細胞においてはインスリン刺激による糖取り込み経路の発現が未成熟であり、Ｈ９ｃ２細胞をインスリンで刺激した場合でも該細胞は糖をほとんど取り込まないため、Ｈ９ｃ２細胞は、インスリン抵抗性の評価には不適切だった。
【０００９】
本発明は、上記の事情を鑑みてなされたものであり、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を簡易に評価するための実験系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の観点に係る心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞の作製方法は、
株化心筋芽細胞を心筋細胞に分化誘導する工程と、
該心筋細胞を、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養する工程と、
を備えることを特徴とする。
【００１１】
前記株化心筋芽細胞はＨ９ｃ２細胞であることが好ましい。
【００１２】
前記遊離脂肪酸はパルミチン酸であることが好ましい。
【００１３】
前記遊離脂肪酸を含有する培養液中の該遊離脂肪酸の濃度が５０μＭ〜２ｍＭであることが好ましい。
【００１４】
前記心筋細胞は、前記遊離脂肪酸を含有する培養液で、６時間〜２日間培養されることが好ましい。
【００１５】
前記分化誘導する工程が、
前記株化心筋芽細胞をコンフルエントに達するまで増殖させる工程と、
該増殖させた心筋芽細胞を０．５％〜２％のウシ胎児血清を含有する培養液で培養して、心筋細胞に分化誘導する工程と、
を備えることが好ましい。
【００１６】
前記増殖させた心筋芽細胞を、前記ウシ胎児血清を含有する培養液で、３日〜７日間培養することが好ましい。
【００１７】
本発明の第２の観点に係る心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞は、上記の第１の観点に係るｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞の作製方法で作製されることを特徴とする。
【００１８】
本発明の第３の観点に係る心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法は、上記の第２の観点に係るｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る心筋細胞の作製方法によれば、株化された心筋芽細胞を分化誘導した後、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養することによって、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を作製することができ、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を簡易に評価するための実験系を提供することができる。この細胞を利用することにより、心不全時の心筋細胞代謝改善薬を簡易にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】心不全における代謝悪循環の様子を示す図である。
【図２Ａ】Ｈ９ｃ２細胞および１％ＦＢＳ含有培養液で分化した心筋細胞におけるマイオゲニンのタンパク質発現量を示す図である。
【図２Ｂ】Ｈ９ｃ２細胞および１％ＦＢＳ含有培養液で分化した心筋細胞におけるトロポニンＴのタンパク質発現量を示す図である。
【図３Ａ】Ｈ９ｃ２細胞および１％ＨＳ含有培養液で分化した心筋細胞におけるマイオゲニンのタンパク質発現量を示す図である。
【図３Ｂ】Ｈ９ｃ２細胞および１％ＨＳ＋１０％ＦＢＳ含有培養液で分化した心筋細胞におけるマイオゲニンのタンパク質発現量を示す図である。
【図４Ａ】Ｈ９ｃ２細胞および分化した心筋細胞におけるインスリンレセプター基質１（ＩＲＳ−１）のタンパク質発現量を示す図である。
【図４Ｂ】Ｈ９ｃ２細胞および分化した心筋細胞におけるグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）のタンパク質発現量を示す図である。
【図５】Ｈ９ｃ２細胞および分化した心筋細胞における、インスリン刺激の有無によるＧＬＵＴ４の細胞内局在の変化を示す図である。
【図６】Ｈ９ｃ２細胞および分化した心筋細胞における、インスリン刺激の有無による２−デオキシグルコースの取り込み量の変化を示す図である。
【図７】分化した心筋細胞における、パルミチン酸処理の有無による２−デオキシグルコースの取り込み量の変化を示す図である。
【図８】分化した心筋細胞における、パルミチン酸処理の有無によるＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化の変化を示す図である。
【図９】分化した心筋細胞における、パルミチン酸処理の有無によるＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化の変化を示す図である。
【図１０】ペルヘキシリン前処理の有無によるＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化の変化を示す図である。
【図１１】ペルヘキシリン前処理の有無によるＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を簡易に評価するための実験系を提供する。詳細には、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞、その作製方法および該ｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を用いた心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法を提供する。
本発明の発明者らは、株化された心筋芽細胞を、分化誘導（分化用）培養液で培養して心筋細胞に分化させた後に、遊離脂肪酸含有培養液で培養することにより、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞が得られることを見出して本発明を完成させたものである。
【００２２】
（１．心筋芽細胞および心筋細胞）
本明細書において「株化心筋芽細胞」、「株化された心筋芽細胞」とは、自己増殖能を有し、心筋細胞に分化するよう方向付けられた細胞であり、心筋細胞に比べて未分化な細胞である。株化心筋芽細胞では、後述する心筋細胞に特異的なタンパク質がほとんど検出されない又はその存在量が分化した心筋細胞に比べて低い状態にある。また、株化心筋芽細胞はインスリン刺激による糖の細胞内取り込みの機能を有さない又は分化した細胞に比べて低い状態にある。
【００２３】
本発明で用いる株化心筋芽細胞は、種々の動物、例えば鳥類又は哺乳動物由来の心筋芽細胞から樹立される株化心筋芽細胞であれば特に制限はなく、すでに樹立された心筋芽細胞株の他、動物から単離した心筋芽細胞を公知の方法を用いて株化することによって新たに樹立される細胞株であってもよい。例えば、ラット、ヒト、サル、マウス、ブタ、ウシ又はニワトリ等に由来する株化心筋芽細胞を用いることができる。
【００２４】
株化心筋芽細胞としては、好ましくは、ラット心臓由来のＨ９ｃ２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４４６）が挙げられる。これは米国Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手することができる。また、ラット心房筋由来のＨＬ−１細胞、ヒト心臓由来のＡＣ１６細胞、心筋細胞に分化しやすいＥＳ細胞であるＰ１９ＣＬ６細胞も利用可能である。
【００２５】
本明細書において「心筋細胞」とは、株化心筋芽細胞を分化誘導して作製した細胞であり、心筋芽細胞と比較して心室筋の細胞に特異的なタンパク質発現が亢進し、インスリン刺激による糖取り込みの亢進した細胞である。このため、株化心筋芽細胞を分化誘導することによって得られた細胞は、分化する前の株化心筋芽細胞と比べ心筋細胞により近い性質を有している。
【００２６】
心筋細胞に特異的なタンパク質およびその検出方法は、適宜選択することができる。心筋細胞に特異的なタンパク質（分化マーカー）としては、マイオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、トロポニンＴ（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ）、トロポニンＩおよびミオシン軽鎖、といった筋原性タンパク質などが挙げられる。特異的なタンパク質の検出方法としては、公知の生化学的または免疫化学的な方法を用いることができる。特に制限されないが、分化マーカーに特異的な標識抗体を用いる方法（染色法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなど）、ＲＴ−ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション解析などが挙げられる。分化マーカーに特異的な抗体は市販されており、容易に使用することができる。
【００２７】
（２．細胞培養）
上記の株化心筋芽細胞を増殖用培養液で培養する。増殖用培養液は、株化心筋芽細胞を培養するために一般的に用いられている培養液であれば、特に限定されるものではない。例えば、血清を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培養液を用いることができる。血清としては、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、ウマ血清（ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ，ＨＳ）などを用いることができる。好ましくは、ＦＢＳを用いる。血清濃度は、約５％〜約１５％であることが好ましく、約１０％であることがより好ましい。また、株化心筋芽細胞を増殖させることができれば、適当な増殖因子等を含有する無血清培養液を用いることができる。
【００２８】
増殖用培養液には、株化心筋芽細胞を培養するために一般的に用いられる抗生物質を添加することができる。例えば、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび／または１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加することができる。また、ファンギゾン（１％ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）等の抗真菌剤を添加してもよい。本発明に用いられる増殖用培養液は、さらに他の成分を含むことができる。例えば、１ｍＭ〜３ｍＭのグルタミンおよび０．５ｍＭ〜２ｍＭのピルビン酸を含むことができる。
【００２９】
このような増殖用培養液を用いて、心筋芽細胞をコンフルエント、つまりほぼ１００％のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅの状態になるまで単層培養する。培養条件は、心筋芽細胞を培養するための公知の条件を採用することができる。例えば、約５％ＣＯ２存在下、約３７℃で、３日〜７日間、細胞を培養する。
【００３０】
なお、Ｈ９ｃ２細胞は、継代回数が１０から２０の細胞を使用すると、後述する心筋細胞への分化誘導において、安定した分化が誘導でき、通常は分化用培養液に交換して３日間以上の培養によって心筋細胞に近い性質をもつことができる。
【００３１】
（３．心筋細胞への分化誘導）
続いて、上述のように増殖培養した細胞を分化用培養液中で培養する。
分化用培養液は、分化心筋芽細胞を心筋細胞に分化させることができる組成であればよく、所定の濃度の血清を含有するＤＭＥＭ培養液を用いることができる。安定した分化のためには、増殖用培養液よりも低濃度の血清を含有することが好ましい。
具体的には、分化用培養液中の好ましい血清濃度は約０．１％〜約１５％である。血清濃度が０．１％より低いと細胞障害性が認められ、１５％より高いと分化させることが困難となる。またより安定した分化のためには、約０．５％〜約２％の血清濃度であることがより好ましい。さらに好ましくは約１％である。
分化用培養液に含まれる血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などを用いることができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。なお、後続するパルミチン酸負荷工程における細胞障害の観点から、ＦＢＳを用いることがより好ましい。
本発明における分化用培養液としては、例えば、１％ＦＢＳ、１％ＨＳ、または１％ＨＳ＋１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培養液を用いることができる。
【００３２】
分化用培養液には、心筋芽細胞を培養するために一般的に用いられている抗生物質を添加することができる。例えば、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび／または１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加することができる。また、ファンギゾン（１％ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）等の抗真菌剤を添加してもよい。本発明に用いられる分化用培養液は、さらに他の成分を含むことができる。例えば、１ｍＭ〜３ｍＭのグルタミンおよび０．５ｍＭ〜２ｍＭのピルビン酸を含むことができる。
【００３３】
このような分化用培養液中で、約５％ＣＯ２、約３７℃の条件下で、３日間以上、心筋芽細胞を培養する。培養液の種類によっても異なるが、好ましくは約３日〜７日間培養する。なお、３日間より長く培養する場合は、２〜３日毎に新鮮な培養液に交換することが好ましい。これにより、心筋芽細胞は心筋細胞に近い性質を有する細胞に分化誘導される。分化用培養液中での培養期間が３日間より短いと分化が十分でなく、７日間より長いと細胞障害性を示す傾向があり、パルミチン酸負荷工程で細胞障害が認められる可能性が高くなる。
【００３４】
（４．糖代謝能の評価）
株化心筋芽細胞を分化誘導することにより得られた心筋細胞では、後述する実施例に示すように、分化前の心筋芽細胞に比べてインスリンレセプター基質１（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１：ＩＲＳ−１）およびグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）の発現が亢進している。ＩＲＳ−１は、インスリンシグナル経路のタンパク質の一つである。また、ＧＬＵＴ４は、インスリンに応答してグルコースを細胞内に取り込むグルコーストランスポーターである。ＩＲＳ−１およびＧＬＵＴ４の発現は、標識抗体を用いる方法（染色法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなど）、酵素活性を利用した染色法、ＲＴ−ＰＣＲ法およびハイブリダイズ解析などにより確認することができる。
【００３５】
インスリンシグナル伝達においては、細胞外に存在するインスリンがインスリンレセプターと結合することにより、細胞内へのグルコース取り込みを開始させるシグナル伝達が開始される。
まず、インスリンがインスリンレセプターと結合すると、内在するチロシンキナーゼが活性化され、インスリンレセプターは自己リン酸化される。そのリン酸化チロシンにＩＲＳ−１が結合し，このＩＲＳ−１がリン酸化される。リン酸化されたＩＲＳ−１はホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）に結合しＰＩ−３キナーゼを活性化する。活性化されたＰＩ−３キナーゼはさらにプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）を細胞膜に引き寄せ、ＰＫＢを活性化する。活性化されたＰＫＢはＧＬＵＴ４を細胞膜表面に移動させる。細胞膜表面に移動したＧＬＵＴ４を介してグルコースが細胞内に取り込まれる。
このように、インスリン刺激に応じてＧＬＵＴ４が細胞膜表面に移動し、グルコース取り込み能（糖代謝能）が亢進することを「インスリン応答性」という。
【００３６】
本発明に係る分化後の心筋細胞では、後述する実施例に示すように、インスリン刺激によってＧＬＵＴ４が細胞膜表面に移動し、かつ分化前の心筋芽細胞に比べてグルコースの取り込みが亢進している。一方、未分化の心筋芽細胞では、ＧＬＵＴ４の発現が低く、インスリン刺激によるＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移動は認められない。また、未分化の心筋芽細胞では、インスリン刺激によるグルコース取り込みの亢進は認められない。
このように、株化心筋芽細胞を分化誘導することにより得られる心筋細胞は、インスリンシグナル経路に関するタンパク質の発現が亢進し、インスリン応答性を示す。従って、株化心筋芽細胞を分化誘導することにより得られる心筋細胞は、より心筋細胞に近いグルコース代謝能を有する。
【００３７】
インスリン刺激は、インスリン（０．１ｎＭ〜１μＭ）を用いて、心筋芽細胞および分化後の心筋細胞を１分〜３０分間インキュベートすることによって行うことができる。負荷するインスリンの濃度は、分化後の心筋細胞がインスリン応答性を示す濃度であればよい。好ましくは０．１ｎＭ〜１μＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜１００ｎＭ、さらに好ましくは１００ｎＭである。インスリン刺激に用いるインスリン含有液は、例えば、ＨＥＰＥＳ−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）またはＫｒｅｂ Ｒｉｎｇｅｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＫＲＰ）バッファー等にインスリンを溶解することによって調整することができるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
インスリン刺激によるＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移動を評価する方法は、タンパク質の細胞内局在を評価することができる方法であれば、特に限定されない。例えば免疫染色法を用いてＧＬＵＴ４の細胞内分布を観察することによって評価することができる。具体的には、細胞をカバーガラス上で一晩培養し、ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液で細胞をガラス上に固定する。このガラスをジギトニン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＰＢＳに浸し、ＰＢＳで洗浄後、ＧＬＵＴ４に特異的な一次抗体を添加し、インキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、一次抗体に対する蛍光標識二次抗体を添加し、インキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、封入剤を滴下したスライドガラス上に、処理したカバーガラスを反転して載せる。このように染色した細胞を、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡などを用いて観察することにより、ＧＬＵＴ４が細胞膜表面に移動したかどうかを評価することができる。
【００３９】
グルコースの取り込み能は、培養液中に添加したグルコースの減少量を測定する方法、放射能ラベルしたグルコースもしくはグルコース類似化合物（例えば２−デオキシグルコース（２−ＤＧ））を用いて細胞内の放射能を測定する方法、または蛍光標識したグルコースもしくはグルコース類似化合物を用いて細胞内の蛍光を検出する方法などによって評価することができるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
他のインスリン応答性の評価方法として、例えば、インスリン刺激によって分化後の心筋細胞のインスリンシグナル伝達に関わるタンパク質（例えば、ＩＲＳ−１、プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）等）がリン酸化されていることを確認する方法等がある。
【００４１】
（５．インスリン抵抗性の付与）
上述のように分化された心筋細胞を、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養することにより、該心筋細胞にインスリン抵抗性を付与することができる。
本明細書において「インスリン抵抗性」とは、インスリン刺激されても、細胞が上述したインスリン応答性を示さなくなることをいう。つまり、インスリン抵抗性を示す心筋細胞では、該心筋細胞を、インスリンを含有する培養液中でインキュベートしても、ＧＬＵＴ４が細胞膜表面へ移動せず、グルコース取り込み量も増加しない。
【００４２】
本発明に用いられる遊離脂肪酸は特に限定されないが、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸などを含む。好ましくはパルミチン酸、ステアリン酸である。培養液中の遊離脂肪酸の濃度は、５０μＭ〜２ｍＭであることが好ましい。より好ましくは、１００μＭ〜４００μＭであり、さらに好ましくは、２００μＭである。培養液中の遊離脂肪酸の濃度が５０μＭよりも高い場合、負荷された心筋細胞は十分なインスリン抵抗性を示す。また、培養液中の遊離脂肪酸の濃度が２ｍＭよりも低い場合、心筋細胞に対する細胞障害性が低減され、遊離脂肪酸を負荷していない細胞に比べて細胞数が減少する可能性が低くなるため、インスリン抵抗性の評価に適する。
【００４３】
遊離脂肪酸を含む培養液には、上述する増殖用培養液を用いることができるが、これに限定されるものではない。
培養条件は、心筋細胞を培養するための公知の条件を採用することができる。例えば、約５％ＣＯ２存在下、約３７℃で細胞を培養する。培養時間は、心筋細胞にインスリン抵抗性を付与することができる条件であればよい。培養時間は、負荷する遊離脂肪酸の培養液中の濃度によっても異なるが、好ましくは６時間〜４８時間、より好ましくは１２時間〜３６時間、さらに好ましくは２４時間である。６時間より長いと、心筋細胞は十分なインスリン抵抗性を示すようになり、４８時間より短いと、心筋細胞に対する細胞障害性が低減され、遊離脂肪酸を負荷していない細胞に比べて細胞数が減少する可能性が低くなる。
【００４４】
遊離脂肪酸を含有する培養液は、例えば、次のように調製することができる。
パルミチン酸を、４０℃〜５０℃に温めた０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液に溶解させる。このパルミチン酸溶液を１２％ＢＳＡ含有培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＢＳＡ）に加え、パルミチン酸濃度が２ｍＭになるように希釈して保存する。この２ｍＭパルミチン酸−ＢＳＡ含有培養液と、増殖用培養液を１：１０で混合することにより、ＦＦＡ（ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）培養液（２００μＭ）を調製することができる。
【００４５】
このように調製したＦＦＡ培養液中で心筋細胞を培養することによって、該心筋細胞をインスリン含有培養液で培養しても、ＧＬＵＴ４は細胞膜表面へは移動せず、グルコース取り込みも亢進しない。つまり心筋細胞は、インスリン抵抗性を示すようになる。インスリン抵抗性が付与されたことは、上述したＧＬＵＴ４の細胞内局在を観察する方法および／またはグルコースの取り込み能の評価方法と同様にして確認することができる。また、インスリン抵抗性が付与されたことは、例えば、心筋細胞のインスリンシグナル伝達に関わるタンパク質（例えば、ＩＲＳ−１、Ａｋｔ等）のリン酸化抑制を観察する方法、心筋細胞のＩＲＳ−１のセリン部位（例えば、Ｓｅｒ６３６／Ｓｅｒ６３９）が過剰にリン酸化されていることを観察する方法（インスリン抵抗性の原因の一つとして、ＩＲＳ−１のセリン部位の過剰なリン酸化が挙げられる）等によっても確認することができる。
【００４６】
（６．心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング）
上述するように作製されたｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞は、インスリン抵抗性を再現している。そのため、該心筋細胞を利用して、心不全時の心筋細胞の代謝改善薬を簡易にスクリーニングすることができる。
スクリーニングされる代謝改善薬としては、インスリン抵抗性の改善薬（ＧＬＰ−１受容体作動薬であるリラグルチド、ＤＰＰ４拮抗剤であるシタグリプチリン酸塩水和物、ビグアナイド薬、グリタゾン類など）、脂肪酸代謝阻害剤（例えばｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ、ｔｒｉｍｅｔａｚｉｄｉｎｅ）などが挙げられる。
【００４７】
具体的には、まず、上述のように作製したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を、被検化合物である代謝改善候補薬を添加した培養液でインキュベートする。なお、代謝改善候補薬とのインキュベートの条件は、該代謝改善薬の種類や効果・効能に応じて適宜設定することができる。例えば、５％ＣＯ２存在下、３７℃で、１時間〜２４時間インキュベートしてもよい。また、代謝改善候補薬を添加する培養液は、上述した増殖用培養液を用いてもよく、さらにパルミチン酸などの遊離脂肪酸を含有してもよい。
その後、該心筋細胞の糖代謝能を評価し、例えばインスリン抵抗性が低減または消失すれば、添加した被検化合物は、心不全時に認められる心筋細胞のインスリン抵抗性の改善に有効であると判断することができる。
細胞の糖代謝能は、上述した「４．糖代謝能の評価」に記載した方法を用いて評価することができる。糖代謝能は、ＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移行の有無を観察することによって評価してもよく、細胞へのグルコースなどの糖取り込み量を測定することによって評価してもよい。また、その両方によって評価してもよい。さらに、細胞の糖代謝能は、例えば、細胞のインスリンシグナル経路に関わるタンパク質（例えば、ＩＲＳ−１、プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）等）がリン酸化されていることを観察する方法、細胞のＩＲＳ−１のセリン部位（例えば、Ｓｅｒ６３６／Ｓｅｒ６３９）の過剰なリン酸化のキャンセルを観察する方法等によっても確認することができる。
【００４８】
上述したように、株化された心筋芽細胞を分化誘導した後、心不全患者に起こる血中遊離不飽和脂肪酸の上昇を疑似した培養液、すなわち遊離脂肪酸を含有する培養液中で培養することによって、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を作製することができる。これにより、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を評価するための実験系を提供することができる。また、本発明に係る心筋細胞を利用することにより、心筋細胞を標的とした様々な薬剤、例えば、インスリン抵抗性改善薬および糖取込亢進薬といった代謝改善薬、を従来の実験動物等を用いた方法と比較して簡易にスクリーニングすることができる。
【００４９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。
【実施例】
【００５０】
（心筋細胞への分化誘導）
（１．１％ＦＢＳ）
市販のＨ９ｃ２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４４６）をシャーレに約２０万〜４０万／１０ｃｍディッシュで播種し、１０ｍＬの増殖用培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１０３１３），１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，カタログ番号１０４７３），２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号２５０３０），１ｍＭピルビン酸（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ２２５６），１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，カタログ番号１７−６０３Ｅ））中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で、１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅになるまで培養した。なお、Ｈ９ｃ２細胞は、継代回数が１０から２０の細胞を用いた。
【００５１】
Ｈ９ｃ２細胞が１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅになった時点で分化用培養液（低血清培養液：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，１％ＦＢＳ，２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン酸，１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に交換して細胞をさらに３日〜１４日間培養して分化を誘導した。なお、２〜３日毎に新鮮な分化用培養液に交換した。
【００５２】
分化誘導された細胞が、心筋細胞に近い性質を有していることを確認するために、筋原性タンパク質であるマイオゲニンおよびトロポニンＴのタンパク質発現量をウエスタンブロット法により評価した。なお、分化誘導された細胞は、分化用培養液で３，５，７，１０および１４日間培養した細胞を用いた。ウエスタンブロット法は、常法に従って行った。
【００５３】
具体的には、細胞溶解剤（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を使って心筋細胞の全タンパク質サンプルを溶解し抽出した。そのサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて１００Ｖで約１時間の電気泳動を行った。電気泳動によって分離されたタンパク質を電場によってニトロセルロース膜に移した。室温にて２４時間、目的とするタンパク質の一次特異抗体（マイオゲニン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号ｓｃ５２９０３）、トロポニンＴ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号ｓｃ５２２８２））溶解溶液に浸した。ニトロセルロース膜の一次抗体をよく洗い落としてから、一次抗体の動物種に従ったＨＲＰ標識二次抗体（Ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｗ４０２Ｂ））の溶解溶液に約１時間浸した。ＨＲＰによって発光する発光試薬を用いて目的とするタンパク質を標識し、ルミノメーター検出機（ＦＵＪＩＦＩＬＭ，ＬＡＳ３０００ｍｉｎｉ）によって撮像した。
【００５４】
図２Ａに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、マイオゲニンのバンドはほとんど検出されなかった。一方、分化誘導された細胞では、分化用培養液で培養して３，５，７，１０および１４日後のいずれにおいてもマイオゲニンのバンドが検出された。分化後の細胞におけるマイオゲニンのバンド強度は、分化前のＨ９ｃ２細胞に比べて４倍以上であった。
また、図２Ｂに示すように、トロポニンＴについても、未分化なＨ９ｃ２細胞では、ほとんどバンドが認められないのに対し、分化後の細胞では、分化用培養液で培養して３，５，７，１０および１４日後のいずれにおいても、トロポニンＴのバンドが検出された。分化後の細胞におけるトロポニンＴのバンド強度は、分化前のＨ９ｃ２細胞に比べて３倍以上であった。
このように、Ｈ９ｃ２細胞を分化誘導することにより得られた細胞は、筋原性タンパク質の発現が分化前に比べて亢進し、未分化なＨ９ｃ２細胞と比べ心筋細胞により近い性質を有し、心筋細胞に分化したことが確認された。
【００５５】
（２．１％ＨＳ）
上記と同様に、１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅの状態になったＨ９ｃ２細胞を、分化用培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，１％ＨＳ，２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン酸，１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に交換して細胞をさらに５日〜１４日間培養して分化を誘導した。なお、２〜３日毎に新鮮な分化用培養液に交換した。
【００５６】
分化誘導された細胞が、心筋細胞に近い性質を有していることを確認するために、筋原性タンパク質であるマイオゲニンの発現量をウエスタンブロット法により上記と同様に評価した。図３Ａに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞に比べて、５日〜１０日間分化誘導された細胞では、マイオゲニンのバンドがより強く検出された。
【００５７】
（３．１％ＨＳ＋１０％ＦＢＳ）
上記と同様に、１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅの状態になったＨ９ｃ２細胞を、分化用培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，１％ＨＳ，１０％ＦＢＳ，２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン酸，１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に交換して細胞をさらに５日〜１４日間培養して分化を誘導した。なお、２〜３日毎に新鮮な分化用培養液に交換した。
【００５８】
分化誘導された細胞が、心筋細胞に近い性質を有していることを確認するために、筋原性タンパク質であるマイオゲニンの発現量をウエスタンブロット法により上記と同様に評価した。図３Ｂに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞に比べて、分化誘導された細胞では、マイオゲニンのバンドがより強く検出された。
【００５９】
以上の結果から、分化用培養液に含まれる血清が１％ＦＢＳ、１％ＨＳ、または１％ＨＳ＋１０％ＦＢＳの何れの条件においても、Ｈ９ｃ２細胞は心筋細胞に分化誘導されて、心筋細胞に特異的なタンパク質を発現することが明らかとなった。そこで、以下の評価では、１％ＦＢＳの血清を含有する分化用培養液を用いて分化誘導させた心筋細胞を用いた。
【００６０】
（分化後の心筋細胞の糖代謝能の評価）
次に、分化後の心筋細胞の糖代謝能について評価した。
【００６１】
分化後の心筋細胞におけるＩＲＳ−１およびＧＬＵＴ４の発現が亢進しているかどうかをウエスタンブロット法により評価した。
具体的には、上記のマイオゲニンおよびトロポニンＴの発現量を検出したウエスタンブロット法と同様の方法で行った。なお、一次抗体としては、マイオゲニン抗体およびトロポニンＴ抗体の代わりにＩＲＳ−１抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号２３８２Ｓ）およびＧＬＵＴ４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号ｓｃ１６０８）を用いた。
【００６２】
図４Ａに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、ＩＲＳ−１のバンドはほとんど検出されなかった。一方、分化誘導された心筋細胞では、分化用培養液で培養して３，５，７，１０および１４日後のいずれにおいてもＩＲＳ−１のバンドが検出され、分化後の心筋細胞におけるＩＲＳ−１のバンド強度は、分化前のＨ９ｃ２細胞に比べて約１．２〜１．４倍であった。
【００６３】
また、図４Ｂに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、ＧＬＵＴ４のバンドはほとんど検出されなかった。一方、分化誘導された心筋細胞では、分化用培養液で培養して３，５，７，１０および１４日後のいずれにおいてもＧＬＵＴ４のバンドが検出された。分化後の心筋細胞におけるＧＬＵＴ４のバンド強度は、分化前のＨ９ｃ２細胞に比べて約２倍であった。
【００６４】
このように、Ｈ９ｃ２細胞を分化誘導することにより、インスリンシグナル経路に関連するタンパク質の発現が亢進することが確認された。
なお、分化用培養液で１０日間以上培養した細胞は、３日〜７日間培養した細胞に比べて、細胞障害性を示す傾向が認められた。そこで、以下の評価では、１％ＦＢＳの血清を含有する分化用培養液を用いて約５日間分化誘導させた心筋細胞を用いた。
【００６５】
（インスリン応答性）
次に、分化後の心筋細胞のインスリン応答性について評価した。
分化後の心筋細胞および未分化なＨ９ｃ２細胞を、スライド、カバーガラス、または光学用プラスチック支持体の上で培養し、それぞれ１００ｎＭのインスリンを含有するＨＥＰＥＳ−ＰＢＳ溶液（インスリン含有溶液）、およびインスリンを含有しない溶液（インスリン非含有溶液；対照）中で３０分間インキュベートした。インキュベーションは、５％ＣＯ２存在下、３７℃で行った。
【００６６】
インスリン含有および非含有溶液でそれぞれインキュベートした心筋細胞におけるＧＬＵＴ４の細胞内局在を免疫染色法によって観察した。具体的には、分化後の心筋細胞および未分化なＨ９ｃ２細胞を、それぞれ１００ｎＭでインスリンを含有する溶液中、および含有しない溶液（対照）中で３０分間インキュベート（５％ＣＯ２、３７℃）し、３０分経過した時点で４℃にしてインスリンの反応を停止させた。その後、細胞固定液（４％パラホルムアルデヒド）に１５分間静置して、細胞を固定した。固定した細胞に対しジギトニン（１００μｇ／ｍＬ）を用いて透過処理を行った。これにより、細胞膜の透過性を亢進させ、目的とするタンパク質と一次抗体が接触できるようにする。透過処理した細胞に抗ＧＬＵＴ４ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号ｓｃ−１６０８、希釈濃度１：５００）を溶解させた１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ、ＰＢＳ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて室温で１時間静置した。一次抗体を１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液でよく洗い流したあとで、蛍光標識された二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合ウサギ抗ヤギ抗体；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社，カタログ番号Ａ１１０７８）を溶解した溶液に浸して室温で３０分静置した。できあがったサンプルは蛍光顕微鏡（または共焦点レーザー顕微鏡）によって観察した。
【００６７】
図５はインスリン処理した心筋細胞におけるＧＬＵＴ４の細胞内局在を示す免疫染色写真である。図中、「Ｎ」は核を、矢印の「ＰＭ」は細胞膜を示す。図５に示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、培養液中のインスリンの有無によるＧＬＵＴ４の細胞内局在の違いは認められなかった。一方、分化後の心筋細胞では、培養液中にインスリンを含まない場合、ＧＬＵＴ４は細胞質全体に広がって局在しているのに対し、インスリン含有溶液で処理した場合、ＧＬＵＴ４は細胞膜上に局在していることが観察された。
【００６８】
次に、分化後の心筋細胞を、上記と同様にインスリン含有溶液で培養し、そのグルコース取り込み能について評価した。
分化後の心筋細胞および未分化なＨ９ｃ２細胞をそれぞれ、０，１，１０および１００ｎＭのインスリンと、１μＣｉ／ｍＬの三重水素（３Ｈ Ｔｒｉｔｉｕｍ）で標識された２−デオキシグルコース（日本パーキンエルマー社，カタログ番号ＮＥＴ５４９Ａ）とを含有するＫＲＰバッファー溶液中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、心筋細胞中に取り込まれた三重水素の放射活性を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定し、細胞に取り込まれた２−デオキシグルコース量を比較した。
【００６９】
図６は、それぞれの細胞をインスリン無添加の溶液中でインキュベートした場合（ＣＴＬ）のグルコース取り込み量を１としたときの、インスリン含有溶液中でインキュベートした場合のグルコース取り込み量を示す。図６に示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、いずれのインスリン濃度下においてもグルコースの取り込み能の亢進は認められなかった。一方、分化後の心筋細胞では、溶液中に含まれるインスリン濃度に応じてグルコース取り込み量が亢進していた。
【００７０】
このように分化後の心筋細胞では、インスリン刺激によりＧＬＵＴ４が細胞膜へ移行し、グルコース取り込み能が亢進した。従って、Ｈ９ｃ２細胞から分化誘導することによって得られた心筋細胞は、インスリン応答性を獲得していることが明らかとなった。
【００７１】
（インスリン抵抗性の付与）
上述のように分化誘導することによって得られた心筋細胞を、パルミチン酸含有培養液を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で、約２４時間培養した。対照として、分化後の心筋細胞を、パルミチン酸を含まない増殖用培養液で同様に培養した。
【００７２】
パルミチン酸含有培養液は、次のように調製した。まず、約４０〜５０℃に温めた０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液にパルミチン酸を溶解させた。このパルミチン酸溶液を１２％ＢＳＡ含有培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＢＳＡ）に加え、パルミチン酸濃度が２ｍＭになるように希釈した。この２ｍＭパルミチン酸−ＢＳＡ含有培養液と増殖用培養液とを１：１０で混合し、２００μＭのパルミチン酸を含有するパルミチン酸含有培養液とした。
【００７３】
このようにパルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞のグルコース取り込み能を評価した。
パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞、およびパルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞をそれぞれＫＲＰバッファーで洗浄し、０，１，１０および１００ｎＭのインスリンと１μＣｉ／ｍＬの三重水素（３Ｈ Ｔｒｉｔｉｕｍ）で標識された２−デオキシグルコース（日本パーキンエルマー社，ＮＥＴ５４９Ａ）とを含有するＫＲＰバッファー溶液中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、心筋細胞中に取り込まれた三重水素の放射活性を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定し、２−デオキシグルコースの取り込みを評価した。
図７に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞は、インスリン刺激により、そのグルコース取り込み量が亢進することが確認された。一方、パルミチン酸含有培養液中で培養した心筋細胞は、インスリン刺激によってもそのグルコース取り込み量が亢進しなかった。このように、パルミチン酸含有培養液で培養された心筋細胞は、インスリン抵抗性を示すことが明らかとなった。
【００７４】
パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞へのインスリン抵抗性付与ついてさらに確認するために、細胞のＩＲＳ−１およびプロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）のリン酸化、ならびにＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化について観察した。
【００７５】
前述と同様にパルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞、およびパルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞をそれぞれＫＲＰバッファーで洗浄し、０ｎＭおよび１００ｎＭのインスリンを含有するＫＲＰバッファー溶液中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化について、ウエスタンブロット法で観察した。
図８に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞においては、インスリン刺激によりＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化のバンドがより強く検出され、ＩＲＳ−１およびＡｋｔの両方がリン酸化されたことが確認された。一方、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞においては、インスリン刺激によってもＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化のバンドにほとんど変化は見られず、ＩＲＳ−１およびＡｋｔの両方でリン酸化が抑制されていることが確認された。このように、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞では、インスリンシグナリング反応が低下していることが示唆された。
【００７６】
前述と同様にパルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞、およびパルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞について、ＩＲＳ−１のセリン部位（Ｓｅｒ６３６／６３９）のリン酸化をウエスタンブロット法で観察した。
図９に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞においては、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化のバンドはほとんど検出されず、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化は確認されなかった。一方、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞においては、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化のバンドが強く検出され、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化が確認された。このように、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞は、インスリン抵抗性を有することが示唆された。
これらのことから、パルミチン酸含有培養液で培養された心筋細胞がインスリン抵抗性を示すことがさらに明らかとなった。
【００７７】
（心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング）
パルミチン酸含有培養液で培養された心筋細胞が心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニングに有用であるかについて、Ｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ Ｍａｌｅａｔｅ（マレイン酸ペルヘキシリン）（シグマ社，Ｐ３０２８）（以下、ペルヘキシリンという）を用いて検証した。ペルヘキシリンは狭心症薬として開発された薬剤であり、ミトコンドリアの脂質取り込みを制御するカルニチンパルミチン酸トランスフェラーゼ（ＣＰＴ）−１を阻害することにより心筋細胞の代謝を改善させると考えられている。この検証は、細胞のＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化、ならびにＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化を観察することで行った。
【００７８】
上述のように分化誘導することによって得られた心筋細胞を、０，０．１，１，２および５μＭのペルヘキシリンを含有する、前述と同様のパルミチン酸含有培養液を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で、約２４時間培養した。対照として、分化後の心筋細胞を、パルミチン酸を含まない増殖用培養液で同様に培養した。それぞれの細胞をＫＲＰバッファーで洗浄し、１００ｎＭのインスリンを含有するＫＲＰバッファー溶液中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化をウエスタンブロット法で観察した。
図１０に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞においては、インスリン刺激によるＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化のバンドが検出され、ＩＲＳ−１およびＡｋｔの両方でリン酸化が確認された。一方、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞（ペルヘキシリン濃度０μＭ）のＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化のバンドは、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞のそれに比して、弱く検出され、ＩＲＳ−１およびＡｋｔの両方でリン酸化が抑制されていることが確認された。このように、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞（ペルヘキシリン濃度０μＭ）においては、インスリンシグナリング反応が阻害されていることが確認された。さらに、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞をペルヘキシリンで前処理すると、ペルヘキシリンの用量依存的にＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化の度合いが強くなった。このように、インスリンシグナリング反応阻害において、ペルヘキシリンによる用量依存的な改善効果が確認された。
【００７９】
前述と同様のパルミチン酸含有培養液（０，０．１，１，２および５μＭのペルヘキシリンを含有する）を用いて培養した心筋細胞、ならびにパルミチン酸を含まない培養液を用いて培養した心筋細胞について、ＩＲＳ−１のセリン部位（Ｓｅｒ６３６／６３９及びＳｅｒ３０７）のリン酸化をウエスタンブロット法で観察した。
図１１に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞においては、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化のバンドは検出されず、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化は確認されなかった。一方、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞（ペルヘキシリン濃度０μＭ）においては、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化のバンドが検出され、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化が確認された。このように、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞（ペルヘキシリン濃度０μＭ）は、インスリン抵抗性を有することが確認された。さらに、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞をペルヘキシリンで前処理すると、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化の度合いが弱くなった。このように、ペルヘキシリンによるインスリン抵抗性の改善効果が確認された。
【００８０】
これらのことから、パルミチン酸含有培養液で培養された心筋細胞は、心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニングに有用であることが示された。特に、本スクリーニングにおいては、心筋細胞代謝改善薬の濃度を多段階で設定することができるため、至適用量の決定までに至る時間および費用を大幅に削減することが可能である。
【００８１】
以上の結果から、株化された心筋芽細胞を分化誘導した後、心不全患者に起こる血中遊離不飽和脂肪酸の上昇を疑似した培養液、すなわち遊離脂肪酸を含有する培養液中で培養することによって、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を作製できることが明らかとなった。また、このｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞は、心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニングに有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
以上説明したように、本発明に係るｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞の作製方法によれば、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現した心筋細胞モデルの形成までの時間を短縮することができ、１回の実験で多種設定の評価が可能になる。さらに、樹立された培養細胞系統から作製しているので、標的タンパク質の過剰発現やノックダウンが容易にできる。そのため、本発明に係るｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞は、医学研究、創薬開発、および代謝改善薬の効果判定などに広く応用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞、その作製方法および該心筋細胞を用いた心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化が加速する中で心不全の患者数も増加の傾向をたどっている。増え続ける患者数と医療費に対して、入院頻度を減らし外来内服治療によって状態を安定化させるような心不全治療法を確立することが望まれている。
【０００３】
心不全とは体内の代謝的需要・静脈環流に対して、心臓がそれに見合う十分なポンプ機能を果たすことができない状態を示す。その原因としては虚血性心疾患（狭心症・心筋梗塞）、心臓弁膜症、心筋症、高血圧性心機能障害、心筋炎、先天性心疾患など様々な疾患があげられる。心不全治療ターゲットは病態生理の解明とともに変遷している。かつては心臓の機械的なポンプ不全（収縮不全）が注目され、機械的なポンプ不全に対する強心剤や利尿剤の投与が中心的な治療であった。しかし、１９８０年代からは神経体液因子との関連が注目され、アンギオテンシンＩＩの作用を抑制する目的でアンギオテンシン変換酵素阻害剤が投与され始めた。１９９０年代からは、慢性心不全に対するβ遮断薬の有効性が示され、アポトーシスや心筋リモデリングとの関連性が注目されている。また、近年では心筋細胞自体のエネルギー代謝に注目した心不全治療薬の開発が急がれている。
【０００４】
近年の報告では、心不全状態において心筋細胞がインスリン抵抗性（心不全の心筋インスリン抵抗性ともいう）を示し、かつ基礎代謝が変化する。心不全状態における心筋細胞のこのような変化が、心筋細胞のエネルギー代謝の効率を悪化させ、心不全の病態を悪化させる増悪因子であることが示されている（非特許文献１）。つまり、慢性心不全において心筋細胞のインスリン抵抗性はグルコースの代謝を低下させ、遊離脂肪酸の代謝を亢進させる。その結果、約１１〜１２％の心筋細胞のエネルギー効率低下を起こし、活性酸素やアポトーシスも誘導することによってさらなる病態の悪化を引き起こす（図１）。ここで、心筋インスリン抵抗性は、一般的な生活習慣病やメタボリックシンドロームから生じる全身性のインスリン抵抗性とは異なり、心筋細胞において特異的に生じるものである。心筋細胞代謝改善に注目した臨床研究も報告されており、一定の効果を示している（非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、心臓に特化した糖代謝改善薬剤が存在せず、従来の全身に作用する経口糖尿病薬を代用しているため、メトホルミン（ｍｅｔｏｆｏｒｍｉｎ）では、アシドーシスが生じ、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）では水分貯留が生じるなどの理由で心不全患者には禁忌とされている。そのため、心筋細胞の代謝改善、つまりインスリン抵抗性の改善に注目した心不全治療の開発と研究が求められている。
【０００５】
また、Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて心筋細胞の基質代謝を研究しようとする試みも行われている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Houman Ashrafian et al., "Metabolic Mechanisms in Heart Failure", Circulation: Jounal of American Heart Association 2007; 116; 434-448
【非特許文献２】Dean T. Eurich, et al., "Improved Clinical Outcomes Associated With Metformin in Patients With Diabetes and Heart Failure", Diabetes care 2005; 28; 2345-2351
【非特許文献３】George G. Sokos et al., "Glucagon-Like Peptide-1 Infusion Improves Left Ventricular Ejection Fraction and Functional Status in Patients With Chronic Heart Failure", Journal of Cardiac Failure 2006; 12 (9); 694-699
【非特許文献４】Mathias Uhlig et al., "Functional role of Rab11 in GLUT4 trafficking in cardiomyocytes", Molecular and Cellular Endocrinology 2005; 235; 1-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
心不全に関する従来のｉｎ ｖｉｖｏの基礎研究では、実験動物に対して冠動脈結紮や高頻度ペースメーカー刺激などを用いて機械的に心不全を発生させたり、遺伝子改変動物を用いたりしていた。高頻度ペーシングでは心不全モデル動物の作製に約２週間を要し、Ｄａｈｌ食塩感受性ラットなどの遺伝子改変動物を用いた場合では心不全が発生するまでに約１２週間を要する。このように上記方法では、モデル動物の作製に時間がかかるうえ、作成している間にサンプルが死亡してしまうことがしばしばあった。また実際にモデル動物に薬剤を投与して心筋代謝改善薬の効果を判定しようと試みても、全身反応の二次的効果であるのか心筋細胞に特異的な効果であるのかを判定することは困難であった。
【０００８】
また、非特許文献４に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏに心筋細胞の基質代謝を研究しようとしても、市販の心筋培養細胞（Ｈ９ｃ２細胞；ラット心筋芽細胞）は幼若なため、基礎代謝研究の評価が困難であった。すなわち、Ｈ９ｃ２細胞においてはインスリン刺激による糖取り込み経路の発現が未成熟であり、Ｈ９ｃ２細胞をインスリンで刺激した場合でも該細胞は糖をほとんど取り込まないため、Ｈ９ｃ２細胞は、インスリン抵抗性の評価には不適切だった。
【０００９】
本発明は、上記の事情を鑑みてなされたものであり、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を簡易に評価するための実験系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の観点に係る心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞の作製方法は、
株化心筋芽細胞を心筋細胞に分化誘導する工程と、
該心筋細胞を、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養する工程と、
を備えることを特徴とする。
【００１１】
前記株化心筋芽細胞はＨ９ｃ２細胞であることが好ましい。
【００１２】
前記遊離脂肪酸はパルミチン酸であることが好ましい。
【００１３】
前記遊離脂肪酸を含有する培養液中の該遊離脂肪酸の濃度が５０μＭ〜２ｍＭであることが好ましい。
【００１４】
前記心筋細胞は、前記遊離脂肪酸を含有する培養液で、６時間〜２日間培養されることが好ましい。
【００１５】
前記分化誘導する工程が、
前記株化心筋芽細胞をコンフルエントに達するまで増殖させる工程と、
該増殖させた心筋芽細胞を０．５％〜２％のウシ胎児血清を含有する培養液で培養して、心筋細胞に分化誘導する工程と、
を備えることが好ましい。
【００１６】
前記増殖させた心筋芽細胞を、前記ウシ胎児血清を含有する培養液で、３日〜７日間培養することが好ましい。
【００１７】
本発明の第２の観点に係る心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞は、上記の第１の観点に係るｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞の作製方法で作製されることを特徴とする。
【００１８】
本発明の第３の観点に係る心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法は、上記の第２の観点に係るｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る心筋細胞の作製方法によれば、株化された心筋芽細胞を分化誘導した後、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養することによって、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を作製することができ、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を簡易に評価するための実験系を提供することができる。この細胞を利用することにより、心不全時の心筋細胞代謝改善薬を簡易にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】心不全における代謝悪循環の様子を示す図である。
【図２Ａ】Ｈ９ｃ２細胞および１％ＦＢＳ含有培養液で分化した心筋細胞におけるマイオゲニンのタンパク質発現量を示す図である。
【図２Ｂ】Ｈ９ｃ２細胞および１％ＦＢＳ含有培養液で分化した心筋細胞におけるトロポニンＴのタンパク質発現量を示す図である。
【図３Ａ】Ｈ９ｃ２細胞および１％ＨＳ含有培養液で分化した心筋細胞におけるマイオゲニンのタンパク質発現量を示す図である。
【図３Ｂ】Ｈ９ｃ２細胞および１％ＨＳ＋１０％ＦＢＳ含有培養液で分化した心筋細胞におけるマイオゲニンのタンパク質発現量を示す図である。
【図４Ａ】Ｈ９ｃ２細胞および分化した心筋細胞におけるインスリンレセプター基質１（ＩＲＳ−１）のタンパク質発現量を示す図である。
【図４Ｂ】Ｈ９ｃ２細胞および分化した心筋細胞におけるグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）のタンパク質発現量を示す図である。
【図５】Ｈ９ｃ２細胞および分化した心筋細胞における、インスリン刺激の有無によるＧＬＵＴ４の細胞内局在の変化を示す図である。
【図６】Ｈ９ｃ２細胞および分化した心筋細胞における、インスリン刺激の有無による２−デオキシグルコースの取り込み量の変化を示す図である。
【図７】分化した心筋細胞における、パルミチン酸処理の有無による２−デオキシグルコースの取り込み量の変化を示す図である。
【図８】分化した心筋細胞における、パルミチン酸処理の有無によるＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化の変化を示す図である。
【図９】分化した心筋細胞における、パルミチン酸処理の有無によるＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化の変化を示す図である。
【図１０】ペルヘキシリン前処理の有無によるＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化の変化を示す図である。
【図１１】ペルヘキシリン前処理の有無によるＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を簡易に評価するための実験系を提供する。詳細には、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞、その作製方法および該ｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を用いた心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法を提供する。
本発明の発明者らは、株化された心筋芽細胞を、分化誘導（分化用）培養液で培養して心筋細胞に分化させた後に、遊離脂肪酸含有培養液で培養することにより、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞が得られることを見出して本発明を完成させたものである。
【００２２】
（１．心筋芽細胞および心筋細胞）
本明細書において「株化心筋芽細胞」、「株化された心筋芽細胞」とは、自己増殖能を有し、心筋細胞に分化するよう方向付けられた細胞であり、心筋細胞に比べて未分化な細胞である。株化心筋芽細胞では、後述する心筋細胞に特異的なタンパク質がほとんど検出されない又はその存在量が分化した心筋細胞に比べて低い状態にある。また、株化心筋芽細胞はインスリン刺激による糖の細胞内取り込みの機能を有さない又は分化した細胞に比べて低い状態にある。
【００２３】
本発明で用いる株化心筋芽細胞は、種々の動物、例えば鳥類又は哺乳動物由来の心筋芽細胞から樹立される株化心筋芽細胞であれば特に制限はなく、すでに樹立された心筋芽細胞株の他、動物から単離した心筋芽細胞を公知の方法を用いて株化することによって新たに樹立される細胞株であってもよい。例えば、ラット、ヒト、サル、マウス、ブタ、ウシ又はニワトリ等に由来する株化心筋芽細胞を用いることができる。
【００２４】
株化心筋芽細胞としては、好ましくは、ラット心臓由来のＨ９ｃ２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４４６）が挙げられる。これは米国Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手することができる。また、ラット心房筋由来のＨＬ−１細胞、ヒト心臓由来のＡＣ１６細胞、心筋細胞に分化しやすいＥＳ細胞であるＰ１９ＣＬ６細胞も利用可能である。
【００２５】
本明細書において「心筋細胞」とは、株化心筋芽細胞を分化誘導して作製した細胞であり、心筋芽細胞と比較して心室筋の細胞に特異的なタンパク質発現が亢進し、インスリン刺激による糖取り込みの亢進した細胞である。このため、株化心筋芽細胞を分化誘導することによって得られた細胞は、分化する前の株化心筋芽細胞と比べ心筋細胞により近い性質を有している。
【００２６】
心筋細胞に特異的なタンパク質およびその検出方法は、適宜選択することができる。心筋細胞に特異的なタンパク質（分化マーカー）としては、マイオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、トロポニンＴ（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ）、トロポニンＩおよびミオシン軽鎖、といった筋原性タンパク質などが挙げられる。特異的なタンパク質の検出方法としては、公知の生化学的または免疫化学的な方法を用いることができる。特に制限されないが、分化マーカーに特異的な標識抗体を用いる方法（染色法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなど）、ＲＴ−ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション解析などが挙げられる。分化マーカーに特異的な抗体は市販されており、容易に使用することができる。
【００２７】
（２．細胞培養）
上記の株化心筋芽細胞を増殖用培養液で培養する。増殖用培養液は、株化心筋芽細胞を培養するために一般的に用いられている培養液であれば、特に限定されるものではない。例えば、血清を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培養液を用いることができる。血清としては、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、ウマ血清（ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ，ＨＳ）などを用いることができる。好ましくは、ＦＢＳを用いる。血清濃度は、約５％〜約１５％であることが好ましく、約１０％であることがより好ましい。また、株化心筋芽細胞を増殖させることができれば、適当な増殖因子等を含有する無血清培養液を用いることができる。
【００２８】
増殖用培養液には、株化心筋芽細胞を培養するために一般的に用いられる抗生物質を添加することができる。例えば、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび／または１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加することができる。また、ファンギゾン（１％ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）等の抗真菌剤を添加してもよい。本発明に用いられる増殖用培養液は、さらに他の成分を含むことができる。例えば、１ｍＭ〜３ｍＭのグルタミンおよび０．５ｍＭ〜２ｍＭのピルビン酸を含むことができる。
【００２９】
このような増殖用培養液を用いて、心筋芽細胞をコンフルエント、つまりほぼ１００％のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅの状態になるまで単層培養する。培養条件は、心筋芽細胞を培養するための公知の条件を採用することができる。例えば、約５％ＣＯ２存在下、約３７℃で、３日〜７日間、細胞を培養する。
【００３０】
なお、Ｈ９ｃ２細胞は、継代回数が１０から２０の細胞を使用すると、後述する心筋細胞への分化誘導において、安定した分化が誘導でき、通常は分化用培養液に交換して３日間以上の培養によって心筋細胞に近い性質をもつことができる。
【００３１】
（３．心筋細胞への分化誘導）
続いて、上述のように増殖培養した細胞を分化用培養液中で培養する。
分化用培養液は、分化心筋芽細胞を心筋細胞に分化させることができる組成であればよく、所定の濃度の血清を含有するＤＭＥＭ培養液を用いることができる。安定した分化のためには、増殖用培養液よりも低濃度の血清を含有することが好ましい。
具体的には、分化用培養液中の好ましい血清濃度は約０．１％〜約１５％である。血清濃度が０．１％より低いと細胞障害性が認められ、１５％より高いと分化させることが困難となる。またより安定した分化のためには、約０．５％〜約２％の血清濃度であることがより好ましい。さらに好ましくは約１％である。
分化用培養液に含まれる血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などを用いることができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。なお、後続するパルミチン酸負荷工程における細胞障害の観点から、ＦＢＳを用いることがより好ましい。
本発明における分化用培養液としては、例えば、１％ＦＢＳ、１％ＨＳ、または１％ＨＳ＋１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培養液を用いることができる。
【００３２】
分化用培養液には、心筋芽細胞を培養するために一般的に用いられている抗生物質を添加することができる。例えば、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび／または１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加することができる。また、ファンギゾン（１％ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）等の抗真菌剤を添加してもよい。本発明に用いられる分化用培養液は、さらに他の成分を含むことができる。例えば、１ｍＭ〜３ｍＭのグルタミンおよび０．５ｍＭ〜２ｍＭのピルビン酸を含むことができる。
【００３３】
このような分化用培養液中で、約５％ＣＯ２、約３７℃の条件下で、３日間以上、心筋芽細胞を培養する。培養液の種類によっても異なるが、好ましくは約３日〜７日間培養する。なお、３日間より長く培養する場合は、２〜３日毎に新鮮な培養液に交換することが好ましい。これにより、心筋芽細胞は心筋細胞に近い性質を有する細胞に分化誘導される。分化用培養液中での培養期間が３日間より短いと分化が十分でなく、７日間より長いと細胞障害性を示す傾向があり、パルミチン酸負荷工程で細胞障害が認められる可能性が高くなる。
【００３４】
（４．糖代謝能の評価）
株化心筋芽細胞を分化誘導することにより得られた心筋細胞では、後述する実施例に示すように、分化前の心筋芽細胞に比べてインスリンレセプター基質１（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１：ＩＲＳ−１）およびグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）の発現が亢進している。ＩＲＳ−１は、インスリンシグナル経路のタンパク質の一つである。また、ＧＬＵＴ４は、インスリンに応答してグルコースを細胞内に取り込むグルコーストランスポーターである。ＩＲＳ−１およびＧＬＵＴ４の発現は、標識抗体を用いる方法（染色法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなど）、酵素活性を利用した染色法、ＲＴ−ＰＣＲ法およびハイブリダイズ解析などにより確認することができる。
【００３５】
インスリンシグナル伝達においては、細胞外に存在するインスリンがインスリンレセプターと結合することにより、細胞内へのグルコース取り込みを開始させるシグナル伝達が開始される。
まず、インスリンがインスリンレセプターと結合すると、内在するチロシンキナーゼが活性化され、インスリンレセプターは自己リン酸化される。そのリン酸化チロシンにＩＲＳ−１が結合し，このＩＲＳ−１がリン酸化される。リン酸化されたＩＲＳ−１はホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３キナーゼ）に結合しＰＩ−３キナーゼを活性化する。活性化されたＰＩ−３キナーゼはさらにプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）を細胞膜に引き寄せ、ＰＫＢを活性化する。活性化されたＰＫＢはＧＬＵＴ４を細胞膜表面に移動させる。細胞膜表面に移動したＧＬＵＴ４を介してグルコースが細胞内に取り込まれる。
このように、インスリン刺激に応じてＧＬＵＴ４が細胞膜表面に移動し、グルコース取り込み能（糖代謝能）が亢進することを「インスリン応答性」という。
【００３６】
本発明に係る分化後の心筋細胞では、後述する実施例に示すように、インスリン刺激によってＧＬＵＴ４が細胞膜表面に移動し、かつ分化前の心筋芽細胞に比べてグルコースの取り込みが亢進している。一方、未分化の心筋芽細胞では、ＧＬＵＴ４の発現が低く、インスリン刺激によるＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移動は認められない。また、未分化の心筋芽細胞では、インスリン刺激によるグルコース取り込みの亢進は認められない。
このように、株化心筋芽細胞を分化誘導することにより得られる心筋細胞は、インスリンシグナル経路に関するタンパク質の発現が亢進し、インスリン応答性を示す。従って、株化心筋芽細胞を分化誘導することにより得られる心筋細胞は、より心筋細胞に近いグルコース代謝能を有する。
【００３７】
インスリン刺激は、インスリン（０．１ｎＭ〜１μＭ）を用いて、心筋芽細胞および分化後の心筋細胞を１分〜３０分間インキュベートすることによって行うことができる。負荷するインスリンの濃度は、分化後の心筋細胞がインスリン応答性を示す濃度であればよい。好ましくは０．１ｎＭ〜１μＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜１００ｎＭ、さらに好ましくは１００ｎＭである。インスリン刺激に用いるインスリン含有液は、例えば、ＨＥＰＥＳ−ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）またはＫｒｅｂ Ｒｉｎｇｅｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＫＲＰ）バッファー等にインスリンを溶解することによって調整することができるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
インスリン刺激によるＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移動を評価する方法は、タンパク質の細胞内局在を評価することができる方法であれば、特に限定されない。例えば免疫染色法を用いてＧＬＵＴ４の細胞内分布を観察することによって評価することができる。具体的には、細胞をカバーガラス上で一晩培養し、ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液で細胞をガラス上に固定する。このガラスをジギトニン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＰＢＳに浸し、ＰＢＳで洗浄後、ＧＬＵＴ４に特異的な一次抗体を添加し、インキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、一次抗体に対する蛍光標識二次抗体を添加し、インキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、封入剤を滴下したスライドガラス上に、処理したカバーガラスを反転して載せる。このように染色した細胞を、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡などを用いて観察することにより、ＧＬＵＴ４が細胞膜表面に移動したかどうかを評価することができる。
【００３９】
グルコースの取り込み能は、培養液中に添加したグルコースの減少量を測定する方法、放射能ラベルしたグルコースもしくはグルコース類似化合物（例えば２−デオキシグルコース（２−ＤＧ））を用いて細胞内の放射能を測定する方法、または蛍光標識したグルコースもしくはグルコース類似化合物を用いて細胞内の蛍光を検出する方法などによって評価することができるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
他のインスリン応答性の評価方法として、例えば、インスリン刺激によって分化後の心筋細胞のインスリンシグナル伝達に関わるタンパク質（例えば、ＩＲＳ−１、プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）等）がリン酸化されていることを確認する方法等がある。
【００４１】
（５．インスリン抵抗性の付与）
上述のように分化された心筋細胞を、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養することにより、該心筋細胞にインスリン抵抗性を付与することができる。
本明細書において「インスリン抵抗性」とは、インスリン刺激されても、細胞が上述したインスリン応答性を示さなくなることをいう。つまり、インスリン抵抗性を示す心筋細胞では、該心筋細胞を、インスリンを含有する培養液中でインキュベートしても、ＧＬＵＴ４が細胞膜表面へ移動せず、グルコース取り込み量も増加しない。
【００４２】
本発明に用いられる遊離脂肪酸は特に限定されないが、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸などを含む。好ましくはパルミチン酸、ステアリン酸である。培養液中の遊離脂肪酸の濃度は、５０μＭ〜２ｍＭであることが好ましい。より好ましくは、１００μＭ〜４００μＭであり、さらに好ましくは、２００μＭである。培養液中の遊離脂肪酸の濃度が５０μＭよりも高い場合、負荷された心筋細胞は十分なインスリン抵抗性を示す。また、培養液中の遊離脂肪酸の濃度が２ｍＭよりも低い場合、心筋細胞に対する細胞障害性が低減され、遊離脂肪酸を負荷していない細胞に比べて細胞数が減少する可能性が低くなるため、インスリン抵抗性の評価に適する。
【００４３】
遊離脂肪酸を含む培養液には、上述する増殖用培養液を用いることができるが、これに限定されるものではない。
培養条件は、心筋細胞を培養するための公知の条件を採用することができる。例えば、約５％ＣＯ２存在下、約３７℃で細胞を培養する。培養時間は、心筋細胞にインスリン抵抗性を付与することができる条件であればよい。培養時間は、負荷する遊離脂肪酸の培養液中の濃度によっても異なるが、好ましくは６時間〜４８時間、より好ましくは１２時間〜３６時間、さらに好ましくは２４時間である。６時間より長いと、心筋細胞は十分なインスリン抵抗性を示すようになり、４８時間より短いと、心筋細胞に対する細胞障害性が低減され、遊離脂肪酸を負荷していない細胞に比べて細胞数が減少する可能性が低くなる。
【００４４】
遊離脂肪酸を含有する培養液は、例えば、次のように調製することができる。
パルミチン酸を、４０℃〜５０℃に温めた０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液に溶解させる。このパルミチン酸溶液を１２％ＢＳＡ含有培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＢＳＡ）に加え、パルミチン酸濃度が２ｍＭになるように希釈して保存する。この２ｍＭパルミチン酸−ＢＳＡ含有培養液と、増殖用培養液を１：１０で混合することにより、ＦＦＡ（ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）培養液（２００μＭ）を調製することができる。
【００４５】
このように調製したＦＦＡ培養液中で心筋細胞を培養することによって、該心筋細胞をインスリン含有培養液で培養しても、ＧＬＵＴ４は細胞膜表面へは移動せず、グルコース取り込みも亢進しない。つまり心筋細胞は、インスリン抵抗性を示すようになる。インスリン抵抗性が付与されたことは、上述したＧＬＵＴ４の細胞内局在を観察する方法および／またはグルコースの取り込み能の評価方法と同様にして確認することができる。また、インスリン抵抗性が付与されたことは、例えば、心筋細胞のインスリンシグナル伝達に関わるタンパク質（例えば、ＩＲＳ−１、Ａｋｔ等）のリン酸化抑制を観察する方法、心筋細胞のＩＲＳ−１のセリン部位（例えば、Ｓｅｒ６３６／Ｓｅｒ６３９）が過剰にリン酸化されていることを観察する方法（インスリン抵抗性の原因の一つとして、ＩＲＳ−１のセリン部位の過剰なリン酸化が挙げられる）等によっても確認することができる。
【００４６】
（６．心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング）
上述するように作製されたｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞は、インスリン抵抗性を再現している。そのため、該心筋細胞を利用して、心不全時の心筋細胞の代謝改善薬を簡易にスクリーニングすることができる。
スクリーニングされる代謝改善薬としては、インスリン抵抗性の改善薬（ＧＬＰ−１受容体作動薬であるリラグルチド、ＤＰＰ４拮抗剤であるシタグリプチリン酸塩水和物、ビグアナイド薬、グリタゾン類など）、脂肪酸代謝阻害剤（例えばｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ、ｔｒｉｍｅｔａｚｉｄｉｎｅ）などが挙げられる。
【００４７】
具体的には、まず、上述のように作製したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を、被検化合物である代謝改善候補薬を添加した培養液でインキュベートする。なお、代謝改善候補薬とのインキュベートの条件は、該代謝改善薬の種類や効果・効能に応じて適宜設定することができる。例えば、５％ＣＯ２存在下、３７℃で、１時間〜２４時間インキュベートしてもよい。また、代謝改善候補薬を添加する培養液は、上述した増殖用培養液を用いてもよく、さらにパルミチン酸などの遊離脂肪酸を含有してもよい。
その後、該心筋細胞の糖代謝能を評価し、例えばインスリン抵抗性が低減または消失すれば、添加した被検化合物は、心不全時に認められる心筋細胞のインスリン抵抗性の改善に有効であると判断することができる。
細胞の糖代謝能は、上述した「４．糖代謝能の評価」に記載した方法を用いて評価することができる。糖代謝能は、ＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移行の有無を観察することによって評価してもよく、細胞へのグルコースなどの糖取り込み量を測定することによって評価してもよい。また、その両方によって評価してもよい。さらに、細胞の糖代謝能は、例えば、細胞のインスリンシグナル経路に関わるタンパク質（例えば、ＩＲＳ−１、プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）等）がリン酸化されていることを観察する方法、細胞のＩＲＳ−１のセリン部位（例えば、Ｓｅｒ６３６／Ｓｅｒ６３９）の過剰なリン酸化のキャンセルを観察する方法等によっても確認することができる。
【００４８】
上述したように、株化された心筋芽細胞を分化誘導した後、心不全患者に起こる血中遊離不飽和脂肪酸の上昇を疑似した培養液、すなわち遊離脂肪酸を含有する培養液中で培養することによって、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を作製することができる。これにより、心不全時の心筋細胞の基質代謝・エネルギー代謝を評価するための実験系を提供することができる。また、本発明に係る心筋細胞を利用することにより、心筋細胞を標的とした様々な薬剤、例えば、インスリン抵抗性改善薬および糖取込亢進薬といった代謝改善薬、を従来の実験動物等を用いた方法と比較して簡易にスクリーニングすることができる。
【００４９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。
【実施例】
【００５０】
（心筋細胞への分化誘導）
（１．１％ＦＢＳ）
市販のＨ９ｃ２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４４６）をシャーレに約２０万〜４０万／１０ｃｍディッシュで播種し、１０ｍＬの増殖用培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１０３１３），１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，カタログ番号１０４７３），２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号２５０３０），１ｍＭピルビン酸（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ２２５６），１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，カタログ番号１７−６０３Ｅ））中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で、１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅになるまで培養した。なお、Ｈ９ｃ２細胞は、継代回数が１０から２０の細胞を用いた。
【００５１】
Ｈ９ｃ２細胞が１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅになった時点で分化用培養液（低血清培養液：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，１％ＦＢＳ，２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン酸，１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に交換して細胞をさらに３日〜１４日間培養して分化を誘導した。なお、２〜３日毎に新鮮な分化用培養液に交換した。
【００５２】
分化誘導された細胞が、心筋細胞に近い性質を有していることを確認するために、筋原性タンパク質であるマイオゲニンおよびトロポニンＴのタンパク質発現量をウエスタンブロット法により評価した。なお、分化誘導された細胞は、分化用培養液で３，５，７，１０および１４日間培養した細胞を用いた。ウエスタンブロット法は、常法に従って行った。
【００５３】
具体的には、細胞溶解剤（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を使って心筋細胞の全タンパク質サンプルを溶解し抽出した。そのサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて１００Ｖで約１時間の電気泳動を行った。電気泳動によって分離されたタンパク質を電場によってニトロセルロース膜に移した。室温にて２４時間、目的とするタンパク質の一次特異抗体（マイオゲニン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号ｓｃ５２９０３）、トロポニンＴ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号ｓｃ５２２８２））溶解溶液に浸した。ニトロセルロース膜の一次抗体をよく洗い落としてから、一次抗体の動物種に従ったＨＲＰ標識二次抗体（Ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｗ４０２Ｂ））の溶解溶液に約１時間浸した。ＨＲＰによって発光する発光試薬を用いて目的とするタンパク質を標識し、ルミノメーター検出機（ＦＵＪＩＦＩＬＭ，ＬＡＳ３０００ｍｉｎｉ）によって撮像した。
【００５４】
図２Ａに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、マイオゲニンのバンドはほとんど検出されなかった。一方、分化誘導された細胞では、分化用培養液で培養して３，５，７，１０および１４日後のいずれにおいてもマイオゲニンのバンドが検出された。分化後の細胞におけるマイオゲニンのバンド強度は、分化前のＨ９ｃ２細胞に比べて４倍以上であった。
また、図２Ｂに示すように、トロポニンＴについても、未分化なＨ９ｃ２細胞では、ほとんどバンドが認められないのに対し、分化後の細胞では、分化用培養液で培養して３，５，７，１０および１４日後のいずれにおいても、トロポニンＴのバンドが検出された。分化後の細胞におけるトロポニンＴのバンド強度は、分化前のＨ９ｃ２細胞に比べて３倍以上であった。
このように、Ｈ９ｃ２細胞を分化誘導することにより得られた細胞は、筋原性タンパク質の発現が分化前に比べて亢進し、未分化なＨ９ｃ２細胞と比べ心筋細胞により近い性質を有し、心筋細胞に分化したことが確認された。
【００５５】
（２．１％ＨＳ）
上記と同様に、１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅの状態になったＨ９ｃ２細胞を、分化用培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，１％ＨＳ，２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン酸，１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に交換して細胞をさらに５日〜１４日間培養して分化を誘導した。なお、２〜３日毎に新鮮な分化用培養液に交換した。
【００５６】
分化誘導された細胞が、心筋細胞に近い性質を有していることを確認するために、筋原性タンパク質であるマイオゲニンの発現量をウエスタンブロット法により上記と同様に評価した。図３Ａに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞に比べて、５日〜１０日間分化誘導された細胞では、マイオゲニンのバンドがより強く検出された。
【００５７】
（３．１％ＨＳ＋１０％ＦＢＳ）
上記と同様に、１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅの状態になったＨ９ｃ２細胞を、分化用培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，１％ＨＳ，１０％ＦＢＳ，２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン酸，１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に交換して細胞をさらに５日〜１４日間培養して分化を誘導した。なお、２〜３日毎に新鮮な分化用培養液に交換した。
【００５８】
分化誘導された細胞が、心筋細胞に近い性質を有していることを確認するために、筋原性タンパク質であるマイオゲニンの発現量をウエスタンブロット法により上記と同様に評価した。図３Ｂに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞に比べて、分化誘導された細胞では、マイオゲニンのバンドがより強く検出された。
【００５９】
以上の結果から、分化用培養液に含まれる血清が１％ＦＢＳ、１％ＨＳ、または１％ＨＳ＋１０％ＦＢＳの何れの条件においても、Ｈ９ｃ２細胞は心筋細胞に分化誘導されて、心筋細胞に特異的なタンパク質を発現することが明らかとなった。そこで、以下の評価では、１％ＦＢＳの血清を含有する分化用培養液を用いて分化誘導させた心筋細胞を用いた。
【００６０】
（分化後の心筋細胞の糖代謝能の評価）
次に、分化後の心筋細胞の糖代謝能について評価した。
【００６１】
分化後の心筋細胞におけるＩＲＳ−１およびＧＬＵＴ４の発現が亢進しているかどうかをウエスタンブロット法により評価した。
具体的には、上記のマイオゲニンおよびトロポニンＴの発現量を検出したウエスタンブロット法と同様の方法で行った。なお、一次抗体としては、マイオゲニン抗体およびトロポニンＴ抗体の代わりにＩＲＳ−１抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号２３８２Ｓ）およびＧＬＵＴ４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号ｓｃ１６０８）を用いた。
【００６２】
図４Ａに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、ＩＲＳ−１のバンドはほとんど検出されなかった。一方、分化誘導された心筋細胞では、分化用培養液で培養して３，５，７，１０および１４日後のいずれにおいてもＩＲＳ−１のバンドが検出され、分化後の心筋細胞におけるＩＲＳ−１のバンド強度は、分化前のＨ９ｃ２細胞に比べて約１．２〜１．４倍であった。
【００６３】
また、図４Ｂに示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、ＧＬＵＴ４のバンドはほとんど検出されなかった。一方、分化誘導された心筋細胞では、分化用培養液で培養して３，５，７，１０および１４日後のいずれにおいてもＧＬＵＴ４のバンドが検出された。分化後の心筋細胞におけるＧＬＵＴ４のバンド強度は、分化前のＨ９ｃ２細胞に比べて約２倍であった。
【００６４】
このように、Ｈ９ｃ２細胞を分化誘導することにより、インスリンシグナル経路に関連するタンパク質の発現が亢進することが確認された。
なお、分化用培養液で１０日間以上培養した細胞は、３日〜７日間培養した細胞に比べて、細胞障害性を示す傾向が認められた。そこで、以下の評価では、１％ＦＢＳの血清を含有する分化用培養液を用いて約５日間分化誘導させた心筋細胞を用いた。
【００６５】
（インスリン応答性）
次に、分化後の心筋細胞のインスリン応答性について評価した。
分化後の心筋細胞および未分化なＨ９ｃ２細胞を、スライド、カバーガラス、または光学用プラスチック支持体の上で培養し、それぞれ１００ｎＭのインスリンを含有するＨＥＰＥＳ−ＰＢＳ溶液（インスリン含有溶液）、およびインスリンを含有しない溶液（インスリン非含有溶液；対照）中で３０分間インキュベートした。インキュベーションは、５％ＣＯ２存在下、３７℃で行った。
【００６６】
インスリン含有および非含有溶液でそれぞれインキュベートした心筋細胞におけるＧＬＵＴ４の細胞内局在を免疫染色法によって観察した。具体的には、分化後の心筋細胞および未分化なＨ９ｃ２細胞を、それぞれ１００ｎＭでインスリンを含有する溶液中、および含有しない溶液（対照）中で３０分間インキュベート（５％ＣＯ２、３７℃）し、３０分経過した時点で４℃にしてインスリンの反応を停止させた。その後、細胞固定液（４％パラホルムアルデヒド）に１５分間静置して、細胞を固定した。固定した細胞に対しジギトニン（１００μｇ／ｍＬ）を用いて透過処理を行った。これにより、細胞膜の透過性を亢進させ、目的とするタンパク質と一次抗体が接触できるようにする。透過処理した細胞に抗ＧＬＵＴ４ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，カタログ番号ｓｃ−１６０８、希釈濃度１：５００）を溶解させた１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ、ＰＢＳ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて室温で１時間静置した。一次抗体を１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液でよく洗い流したあとで、蛍光標識された二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合ウサギ抗ヤギ抗体；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社，カタログ番号Ａ１１０７８）を溶解した溶液に浸して室温で３０分静置した。できあがったサンプルは蛍光顕微鏡（または共焦点レーザー顕微鏡）によって観察した。
【００６７】
図５はインスリン処理した心筋細胞におけるＧＬＵＴ４の細胞内局在を示す免疫染色写真である。図中、「Ｎ」は核を、矢印の「ＰＭ」は細胞膜を示す。図５に示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、培養液中のインスリンの有無によるＧＬＵＴ４の細胞内局在の違いは認められなかった。一方、分化後の心筋細胞では、培養液中にインスリンを含まない場合、ＧＬＵＴ４は細胞質全体に広がって局在しているのに対し、インスリン含有溶液で処理した場合、ＧＬＵＴ４は細胞膜上に局在していることが観察された。
【００６８】
次に、分化後の心筋細胞を、上記と同様にインスリン含有溶液で培養し、そのグルコース取り込み能について評価した。
分化後の心筋細胞および未分化なＨ９ｃ２細胞をそれぞれ、０，１，１０および１００ｎＭのインスリンと、１μＣｉ／ｍＬの三重水素（３Ｈ Ｔｒｉｔｉｕｍ）で標識された２−デオキシグルコース（日本パーキンエルマー社，カタログ番号ＮＥＴ５４９Ａ）とを含有するＫＲＰバッファー溶液中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、心筋細胞中に取り込まれた三重水素の放射活性を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定し、細胞に取り込まれた２−デオキシグルコース量を比較した。
【００６９】
図６は、それぞれの細胞をインスリン無添加の溶液中でインキュベートした場合（ＣＴＬ）のグルコース取り込み量を１としたときの、インスリン含有溶液中でインキュベートした場合のグルコース取り込み量を示す。図６に示すように、未分化なＨ９ｃ２細胞では、いずれのインスリン濃度下においてもグルコースの取り込み能の亢進は認められなかった。一方、分化後の心筋細胞では、溶液中に含まれるインスリン濃度に応じてグルコース取り込み量が亢進していた。
【００７０】
このように分化後の心筋細胞では、インスリン刺激によりＧＬＵＴ４が細胞膜へ移行し、グルコース取り込み能が亢進した。従って、Ｈ９ｃ２細胞から分化誘導することによって得られた心筋細胞は、インスリン応答性を獲得していることが明らかとなった。
【００７１】
（インスリン抵抗性の付与）
上述のように分化誘導することによって得られた心筋細胞を、パルミチン酸含有培養液を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で、約２４時間培養した。対照として、分化後の心筋細胞を、パルミチン酸を含まない増殖用培養液で同様に培養した。
【００７２】
パルミチン酸含有培養液は、次のように調製した。まず、約４０〜５０℃に温めた０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液にパルミチン酸を溶解させた。このパルミチン酸溶液を１２％ＢＳＡ含有培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＢＳＡ）に加え、パルミチン酸濃度が２ｍＭになるように希釈した。この２ｍＭパルミチン酸−ＢＳＡ含有培養液と増殖用培養液とを１：１０で混合し、２００μＭのパルミチン酸を含有するパルミチン酸含有培養液とした。
【００７３】
このようにパルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞のグルコース取り込み能を評価した。
パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞、およびパルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞をそれぞれＫＲＰバッファーで洗浄し、０，１，１０および１００ｎＭのインスリンと１μＣｉ／ｍＬの三重水素（３Ｈ Ｔｒｉｔｉｕｍ）で標識された２−デオキシグルコース（日本パーキンエルマー社，ＮＥＴ５４９Ａ）とを含有するＫＲＰバッファー溶液中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、心筋細胞中に取り込まれた三重水素の放射活性を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定し、２−デオキシグルコースの取り込みを評価した。
図７に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞は、インスリン刺激により、そのグルコース取り込み量が亢進することが確認された。一方、パルミチン酸含有培養液中で培養した心筋細胞は、インスリン刺激によってもそのグルコース取り込み量が亢進しなかった。このように、パルミチン酸含有培養液で培養された心筋細胞は、インスリン抵抗性を示すことが明らかとなった。
【００７４】
パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞へのインスリン抵抗性付与ついてさらに確認するために、細胞のＩＲＳ−１およびプロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）のリン酸化、ならびにＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化について観察した。
【００７５】
前述と同様にパルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞、およびパルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞をそれぞれＫＲＰバッファーで洗浄し、０ｎＭおよび１００ｎＭのインスリンを含有するＫＲＰバッファー溶液中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化について、ウエスタンブロット法で観察した。
図８に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞においては、インスリン刺激によりＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化のバンドがより強く検出され、ＩＲＳ−１およびＡｋｔの両方がリン酸化されたことが確認された。一方、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞においては、インスリン刺激によってもＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化のバンドにほとんど変化は見られず、ＩＲＳ−１およびＡｋｔの両方でリン酸化が抑制されていることが確認された。このように、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞では、インスリンシグナリング反応が低下していることが示唆された。
【００７６】
前述と同様にパルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞、およびパルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞について、ＩＲＳ−１のセリン部位（Ｓｅｒ６３６／６３９）のリン酸化をウエスタンブロット法で観察した。
図９に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞においては、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化のバンドはほとんど検出されず、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化は確認されなかった。一方、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞においては、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化のバンドが強く検出され、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化が確認された。このように、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞は、インスリン抵抗性を有することが示唆された。
これらのことから、パルミチン酸含有培養液で培養された心筋細胞がインスリン抵抗性を示すことがさらに明らかとなった。
【００７７】
（心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング）
パルミチン酸含有培養液で培養された心筋細胞が心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニングに有用であるかについて、Ｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ Ｍａｌｅａｔｅ（マレイン酸ペルヘキシリン）（シグマ社，Ｐ３０２８）（以下、ペルヘキシリンという）を用いて検証した。ペルヘキシリンは狭心症薬として開発された薬剤であり、ミトコンドリアの脂質取り込みを制御するカルニチンパルミチン酸トランスフェラーゼ（ＣＰＴ）−１を阻害することにより心筋細胞の代謝を改善させると考えられている。この検証は、細胞のＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化、ならびにＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化を観察することで行った。
【００７８】
上述のように分化誘導することによって得られた心筋細胞を、０，０．１，１，２および５μＭのペルヘキシリンを含有する、前述と同様のパルミチン酸含有培養液を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で、約２４時間培養した。対照として、分化後の心筋細胞を、パルミチン酸を含まない増殖用培養液で同様に培養した。それぞれの細胞をＫＲＰバッファーで洗浄し、１００ｎＭのインスリンを含有するＫＲＰバッファー溶液中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化をウエスタンブロット法で観察した。
図１０に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞においては、インスリン刺激によるＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化のバンドが検出され、ＩＲＳ−１およびＡｋｔの両方でリン酸化が確認された。一方、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞（ペルヘキシリン濃度０μＭ）のＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化のバンドは、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞のそれに比して、弱く検出され、ＩＲＳ−１およびＡｋｔの両方でリン酸化が抑制されていることが確認された。このように、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞（ペルヘキシリン濃度０μＭ）においては、インスリンシグナリング反応が阻害されていることが確認された。さらに、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞をペルヘキシリンで前処理すると、ペルヘキシリンの用量依存的にＩＲＳ−１およびＡｋｔのリン酸化の度合いが強くなった。このように、インスリンシグナリング反応阻害において、ペルヘキシリンによる用量依存的な改善効果が確認された。
【００７９】
前述と同様のパルミチン酸含有培養液（０，０．１，１，２および５μＭのペルヘキシリンを含有する）を用いて培養した心筋細胞、ならびにパルミチン酸を含まない培養液を用いて培養した心筋細胞について、ＩＲＳ−１のセリン部位（Ｓｅｒ６３６／６３９及びＳｅｒ３０７）のリン酸化をウエスタンブロット法で観察した。
図１１に示すように、パルミチン酸を含まない培養液で培養した心筋細胞においては、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化のバンドは検出されず、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化は確認されなかった。一方、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞（ペルヘキシリン濃度０μＭ）においては、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化のバンドが検出され、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化が確認された。このように、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞（ペルヘキシリン濃度０μＭ）は、インスリン抵抗性を有することが確認された。さらに、パルミチン酸含有培養液で培養した心筋細胞をペルヘキシリンで前処理すると、ＩＲＳ−１のセリン部位のリン酸化の度合いが弱くなった。このように、ペルヘキシリンによるインスリン抵抗性の改善効果が確認された。
【００８０】
これらのことから、パルミチン酸含有培養液で培養された心筋細胞は、心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニングに有用であることが示された。特に、本スクリーニングにおいては、心筋細胞代謝改善薬の濃度を多段階で設定することができるため、至適用量の決定までに至る時間および費用を大幅に削減することが可能である。
【００８１】
以上の結果から、株化された心筋芽細胞を分化誘導した後、心不全患者に起こる血中遊離不飽和脂肪酸の上昇を疑似した培養液、すなわち遊離脂肪酸を含有する培養液中で培養することによって、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を作製できることが明らかとなった。また、このｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞は、心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニングに有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
以上説明したように、本発明に係るｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞の作製方法によれば、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現した心筋細胞モデルの形成までの時間を短縮することができ、１回の実験で多種設定の評価が可能になる。さらに、樹立された培養細胞系統から作製しているので、標的タンパク質の過剰発現やノックダウンが容易にできる。そのため、本発明に係るｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞は、医学研究、創薬開発、および代謝改善薬の効果判定などに広く応用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
株化心筋芽細胞を心筋細胞に分化誘導する工程と、
該心筋細胞を、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養する工程と、
を備える、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞の作製方法。
【請求項２】
前記株化心筋芽細胞がＨ９ｃ２細胞である、ことを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
前記遊離脂肪酸がパルミチン酸である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の作製方法。
【請求項４】
前記遊離脂肪酸を含有する培養液中の該遊離脂肪酸の濃度が５０μＭ〜２ｍＭである、ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項５】
前記心筋細胞は、前記遊離脂肪酸を含有する培養液で、６時間〜２日間培養される、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項６】
前記分化誘導する工程が、
前記株化心筋芽細胞をコンフルエントに達するまで増殖させる工程と、
該増殖させた心筋芽細胞を０．５％〜２％のウシ胎児血清を含有する培養液で培養して、心筋細胞に分化誘導する工程と、
を備える、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項７】
前記増殖させた心筋芽細胞を、前記ウシ胎児血清を含有する培養液で、３日〜７日間培養する、ことを特徴とする請求項６に記載の作製方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の作製方法で作製された、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞。
【請求項９】
請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を用いることを特徴とする、心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法。
【請求項１】
株化心筋芽細胞を心筋細胞に分化誘導する工程と、
該心筋細胞を、遊離脂肪酸を含有する培養液で培養する工程と、
を備える、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞の作製方法。
【請求項２】
前記株化心筋芽細胞がＨ９ｃ２細胞である、ことを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
前記遊離脂肪酸がパルミチン酸である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の作製方法。
【請求項４】
前記遊離脂肪酸を含有する培養液中の該遊離脂肪酸の濃度が５０μＭ〜２ｍＭである、ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項５】
前記心筋細胞は、前記遊離脂肪酸を含有する培養液で、６時間〜２日間培養される、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項６】
前記分化誘導する工程が、
前記株化心筋芽細胞をコンフルエントに達するまで増殖させる工程と、
該増殖させた心筋芽細胞を０．５％〜２％のウシ胎児血清を含有する培養液で培養して、心筋細胞に分化誘導する工程と、
を備える、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項７】
前記増殖させた心筋芽細胞を、前記ウシ胎児血清を含有する培養液で、３日〜７日間培養する、ことを特徴とする請求項６に記載の作製方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の作製方法で作製された、心不全の心筋インスリン抵抗性を再現したｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞。
【請求項９】
請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏ心筋細胞を用いることを特徴とする、心不全時の心筋細胞代謝改善薬のスクリーニング方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１５２２０８（Ｐ２０１２−１５２２０８Ａ）
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５５９４０（Ｐ２０１１−１５５９４０）
【出願日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５０４３００１８１）国立大学法人浜松医科大学 (96)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５０４３００１８１）国立大学法人浜松医科大学 (96)
【Ｆターム（参考）】
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