心筋細胞と線維芽細胞の細胞識別方法
【課題】基板上に形成する流路を用いたセルソーター細胞検出領域で得られた画像の判断結果に基づき細胞分離領域で細胞の分離を行う。
【解決手段】心筋細胞と線維芽細胞の実体画像の表面の滑らかさ、あるいは、中央部の構造の複雑さに着目して、これらを指標として、両細胞を識別する。一つの実施例として、画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ適当数に分割したピクセルとして扱い、各ピクセルを、それぞれの明るさを所定の閾値と比較して２値化処理を行い、その結果により両細胞を識別する。
【解決手段】心筋細胞と線維芽細胞の実体画像の表面の滑らかさ、あるいは、中央部の構造の複雑さに着目して、これらを指標として、両細胞を識別する。一つの実施例として、画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ適当数に分割したピクセルとして扱い、各ピクセルを、それぞれの明るさを所定の閾値と比較して２値化処理を行い、その結果により両細胞を識別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上に構成される流路を、細胞を緩衝液とともに流下させて細胞分離を行うセルソーターに適用して好適な心筋細胞と線維芽細胞の細胞識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織片から特定細胞を分離する方法にはいくつかの方法が知られている。心筋細胞と線維芽細胞の細胞識別方法として、それぞれの細胞の比重の違いに着目して、パーコールを使用して密度勾配遠心により分離する方法が良く行われる。この方法は、遠心処理の結果、層状に分離した細胞の層を乱さないように分離、採取するものであるが、必ずしも、十分な精度で分離できないのが現状である。
【０００３】
特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術であり、例えば、蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収するセルソーターがある（非特許文献１：Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)）。
【０００４】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、本発明者らは、マイクロ加工技術を活用して、基板上に構成される流路を、細胞を緩衝液とともに流下させ、細胞の画像を採取して細胞分離を行うセルソーターを提案している（特開２００６−１８０８１０、特開２００６−２２０４２３）。
【特許文献１】特開２００６−１８０８１０号公報
【特許文献２】特開２００６−２２０４２３号公報
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記細胞の画像を採取して細胞分離を行うセルソーターによって、心筋細胞と線維芽細胞の実体画像により、細胞分離を高精度、高速度で可能とする心筋細胞と線維芽細胞の細胞識別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願の発明者は、心筋細胞と線維芽細胞の実体画像を精細に検討した結果、所定の基準によって評価することで、実体画像からそれぞれの細胞を識別できることを発見した。本発明では、緩衝液とともに流下してくる細胞を所定の位置でＣＣＤカメラなどを用いて実体像として検出し、上記基準により評価することで流路中を連続して高速で流れてくる細胞を識別する。
【０００７】
したがって、本発明は、以下の細胞識別方法、細胞識別・分離装置、および上記細胞識別方法に用いるコンピュータプログラムを提供する。
（１）基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
上記細胞検出領域で上記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出して、該実体像を所定の基準で評価する工程、および
上記評価に基づいて上記細胞分離領域で細胞を分離する工程を含み、
上記基準が上記細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（２）上記基準が細胞の断面積と周囲長の比を示す指標に代えて、上記断面積と周囲長の比から細胞の表面の滑らかさを示す指標とされた上記（１）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（３）上記基準が細胞の周囲長の長さを示す指標に代えて、細胞の内部構造の複雑さを示す指標とされた上記（１）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（４）上記細胞検出領域で検出される細胞の実体像は一つの細胞ごとに独立して撮像されるものである上記（１）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（５）基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
上記細胞検出領域で上記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出する工程、
該実体像をＸＹ平面の各軸方向で所定の間隔で区分したピクセルとして、各ピクセルの明るさを基準として２値化する工程、
上記２値化された実体像を複数の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価する工程、
所定の領域での所定の明るさのピクセルの数が所定の閾値を超えるか否か判断して細胞を識別する工程を含み、
上記閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比に関連する指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（６）基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
上記細胞検出領域で上記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出する工程、
該実体像をＸＹ平面の一つの軸から所定の角度ずつ回転させた軸方向で画像の明るさを検出する工程、
上記回転させた各軸で検出された画像の明るさが所定の閾値を超えるか否か判断して細胞の周囲長及び細胞の断面積を決定する工程、
上記決定された細胞の周囲長と細胞の断面積とから、該細胞の周囲長と断面積の比を求め、該比を所定の閾値と比較して細胞を識別する工程を含み、
上記閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（７）上記閾値が細胞の断面積と周囲長の比を示す指標に代えて、上記断面積と周囲長の比から細胞の表面の滑らかさを示す指標とされた上記（５）または（６）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（８）上記所定の閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標に代えて、細胞の内部構造の複雑さを示す指標とされた上記（５）または（６）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（９）上記細胞検出領域で検出される細胞の実体像は一つの細胞ごとに独立して撮像されるものである上記（５）または（６）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（１０）上記ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続するところでは隣接するピクセル間の明るさの変化率を基準として２値化すること、
上記それぞれの基準で２値化された実体像を所定の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価すること、
の処理が付加された上記（５）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（１１）上記（１）記載の方法において使用する細胞識別・分離装置であって、
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた上記検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた上記分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを設置する手段と、
上記細胞検出領域で上記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出するための手段と、
上記実体像のデジタルデータから該実体像を評価するための所定の評価値を算出し、該算出された評価値を所定の閾値と比較して上記細胞を識別するための手段と、
上記識別された細胞を上記細胞分離領域で分離するために電界を作用させる手段とを備える、細胞識別・分離装置。
（１２）上記（１）記載の方法において使用するコンピュータプログラムであって、
上記細胞検出領域で検出した上記細胞の実体像のデジタルデータから、上記細胞の断面積に対する周囲長の比を求める演算を行うステップ、および
上記比を所定の閾値と比較して、上記細胞分離領域を上記細胞が通過する際に該領域に電界を印加するか否かを判断するステップ、
を含む処理をコンピュータに実行させるための、コンピュータプログラム。
（１３）上記（５）記載の方法において使用するコンピュータプログラムであって、
上記細胞検出領域で検出した上記細胞の実体像のデジタルデータに基づいて、該実体像をＸＹ平面の各軸方向で所定の間隔で区分したピクセルとして表わし、各ピクセルの明るさを所定の基準に基づいて２値化するステップ、
上記２値化されたピクセルで表した実体像を複数の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価するステップ、
所定の領域での所定の明るさのピクセルの数が所定の閾値を超えるか否かを判断するステップ、および
上記判断に基づいて、上記細胞分離領域を上記細胞が通過する際に該領域に電界を印加するか否かを決定するステップ、
を含む処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、心筋細胞と線維芽細胞の細胞分離が高精度、高速度で可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
図１は、本願発明を適用して好都合なセルソーターの一例を、上記特開２００６−１８０８１０号公報に開示された細胞分離装置（セルソーター）を基礎とした構成として模式的に示す平面図である。
【００１０】
セルソーター１００は基板１０１を含む構造を有する。基板１０１の下面に流路となる溝を、上面にこの溝に連通する開口を設け、試料や必要な緩衝液の供給口とする。また、十分な緩衝液の供給と各流路での流量の調整のためにリザーバ（２０３，２１３）を設ける。溝や開口の作成はＰＭＭＡなどのプラスチックを金型に流し込むいわゆる射出成型で作成することができる。チップ基板１０１全体のサイズは、例えば、２０×３０×１ｍｍ（ｔ）であるが、このサイズに限定されない。チップ基板１０１の溝が刻まれた下面側に、例えば、０．１ｍｍ厚のラミネートフィルムを熱圧着することにより、基板１０１の下面に刻まれた溝や基板１０１の貫通穴を、流路やウェルとすることができる。例えば、開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いて、０．１ｍｍのラミネートフィルムを通して流路内を流れる細胞を観察できる。もちろんこれより低倍率のレンズでは問題なく観察することができる。チップ基板１０１の上面には、マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’，２０２および２０２’が設けられるとともに、これらを包括するリザーバ２０３が設けられる。具体的には、リザーバ２０３を形成するために基板１０１の上面に設けられたウェルの底面にそれぞれ穴２０１’、２０２、および２０２’が設けられる。
【００１１】
したがって、リザーバ２０３に十分な緩衝液を供給すると穴２０１，２０１’，２０２および２０２’は緩衝液でつながる。これにより、穴２０１および２０１’に連なる流路２０４と流路２０４’には同じ液面高さの緩衝液が供給される。したがって、両流路の流路幅（流路高さを等しいとすれば）、あるいは、断面積、さらに両流路の流路長を実質等しくすれば、両流路の流量を実質同量にすることができる。同様に、穴２０２，２０２’に連なる流路２０５，２０５’には同じ液面高さの緩衝液が供給され、流路２０５，２０５’を流れる緩衝液の流量を流路２０４に流れる流量と所定の比にそろえることができる。
【００１２】
穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液は、マイクロ流路２０４（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞検出領域２２１および細胞分離領域２２２まで導入される。他方、穴２０２，２０２’に導入された細胞を含まない緩衝液は流路２０５，２０５’（幅１２μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液と合流する。２４０は合流後のマイクロ流路であり、細胞検出領域２２１となる。さらに、マイクロ流路２４０は細胞分離領域２２２まで延伸される。
【００１３】
一方、穴２０１’に導入された細胞を含まない緩衝液は、マイクロ流路２０４’（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞分離領域２２２に導入され、マイクロ流路２４０からの細胞を含む緩衝液と合流する。合流後に溶液が通過する流路の流路幅については、後述する。また、この合流した流路は、細胞分離領域２２２の出口で、マイクロ流路２１８（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）および２１９（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）に分流する。
【００１４】
２０６，２０６’および２０７，２０７’は電解質を含むゲルを導入する穴であり、それぞれ、穴２０６および２０７に導入されたゲルは基板１０１の下面のマイクロ構造２０８，２０９（例えば、幅２００μｍ×高さ１５μｍの溝）を通して穴２０６’および２０７’に送り込まれる。したがって、マイクロ構造２０８，２０９は電解質を含むゲルで満たされている。マイクロ構造２０８，２０９の流路２４７側の端はマイクロ流路２０４，２０４’にそれぞれ接続する２０μｍ程度の長さの液絡構造の連結部２４１，２４２からなっていて、細胞分離領域２２２において、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが、直接、接触できる構造とされる。ゲルと緩衝液が接触する面積は、例えば、１５μｍ（流路に沿った長さ）×１５μｍ（高さ）である。ゲルを導入する穴２０６および２０７には、黒丸で示す電極が挿入され、これらの電極は、配線１０６，１０７およびスイッチ２１６を通して電源２１５に接続される。スイッチ２１６は、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に電圧をかける時のみＯＮとされる。
【００１５】
細胞分離領域２２２でマイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’とが合流して形成される流路２４７を流れる緩衝液に、連結部２４１と２４２からのゲルが接触する。図に示すように、連結部２４２よりも連結部２４１のほうが流路の上流に位置する構造となっている。これは、穴２０６の電極にプラス、穴２０７の電極にマイナスの電圧をかけたときに、マイクロ流路２４０を流れてくる細胞を流路２１８に効率よく移動させるためである。すなわち、電流を流したときにマイナスにチャージしている細胞には電気泳動的な力が働くが、この電気泳動力のベクトルと流路内を流れる緩衝液から受ける力のベクトルとの合成ベクトルが、実際に細胞に働く力になる。連結部２４２よりも連結部２４１を流路の上流に位置させたほうが、連結部２４１と２４２とを流路の流れ方向に対して同じレベルの位置に作成した場合に比べ、実際に細胞に働く力のベクトルの向きがより直接的に連結部２４２または２４１の方に向くようになる。したがって、より低電圧で安定した細胞のマイクロ流路２１８あるいはマイクロ流路２１９への移動が可能となり、効率のよい電界利用が可能となる。
【００１６】
マイクロ流路２１８，２１９の下流部には、細胞分離領域２２２で振り分けられた細胞の回収穴２１１，２１２が開けられている。それぞれの穴２１１，２１２には、これらを包括するリザーバ２１３が設けられる。具体的には、リザーバ２１３を形成するために基板１０１の上面に設けられたウェルの底面にそれぞれ穴２１１，２１２が設けられる。リザーバ２１３は緩衝液で満たされているが、この緩衝液の液面の位置は、リザーバ２０３に満たされている緩衝液の液面の位置よりは低いものとされる。
【００１７】
リザーバ２０３の緩衝液の液位はリザーバ２１３のそれよりも高いから、この落差が流路を流れる緩衝液の移動の駆動力となるとともに、脈動のない安定した流れを作り出す。リザーバ２１３の容積を十分大きなものとしておけば、穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液を、全て、流路２０４に流入させることができる。
【００１８】
細胞検出領域２２１を流下する細胞はカメラ２５１により実体像が撮影され、コンピュータ２５２により、後述する判別法に基づいて撮影された細胞が心筋細胞か線維芽細胞であるかを識別される。コンピュータ２５２は、この細胞が線維芽細胞であると判定した時のみ、細胞が細胞分離領域２２２に到達する時点に、スイッチ２１６をオンとする。これにより、心筋細胞はマイクロ流路２１８を流下し、線維芽細胞はマイクロ流路２１９を流下することになる。
【００１９】
図２は、マイクロ流路２０４からの細胞を含む緩衝液と、マイクロ流路２０５，２０５’からの緩衝液とが合流した後、マイクロ流路２４０上の細胞検出領域２２１に進入し、さらに、マイクロ流路２４０を流下して、マイクロ流路２０４’からの緩衝液と合流して、さらにマイクロ流路２４７を流下する状況を説明する図である。図に示すように、細胞分離領域２２２は、マイクロ流路２０４’の下流端と、マイクロ流路２４０の下流端と、連結部２４１の一部と、連結部２４２の一部と、マイクロ流路２４７とを含む。
【００２０】
ここで、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０５，２０５’を流下する細胞を含まない緩衝液を、マイクロ流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液と合流させる理由を説明する。細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４には、細胞を含まない緩衝液の流れる流路２０５，２０５’が細胞検出領域２２１の上流部で合流するが、それぞれの流路の最上流に設けられた穴２０１および２０２，２０２’は、共通の液位の緩衝液のリザーバ２０３中に開口部を有する。したがって、それぞれの流路を流下する緩衝液の流量は、流路の高さが同じであるから、流路幅に比例したものとなる。これらの緩衝液の合流後の流路２４０の幅を、細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４の幅と実質的に等しい幅を持つものとする。実質的に等しいとは、加工精度を考慮して等しいということで、厳密に等しいというわけではない。これにより、流路２０４を流下する緩衝液は流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって、一定の比率で中央部に押しやられるので、流路２０４では側壁に衝突しながら流れてくる細胞が、合流後の流路２４０中では側壁に衝突しなくなる。
【００２１】
細胞分離領域２２２におけるマイクロ流路２４７は、流路２４０と流路２０４’をそれぞれ流下する緩衝液が、それぞれの流れの層を維持しながら、同じ幅の流路を保って流下している。細胞検出領域２２１の流路２０４で流下する細胞を検出して、細胞分離領域２２２で、ゲルが流下する緩衝液と接触する連結部２４１と２４２により電界を作用させて分離するのである。
【００２２】
図３（Ａ）は細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像する構成を模式的に示す図である。図中の符号１１は実体顕微鏡の光源である。１２は光源１１の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞等の試料を用いる場合には、波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の用いることで試料の損傷を防ぐことができる。１３はシャッターで、ＸＹステージ１５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。１４はコンデンサレンズである。
【００２３】
ＸＹステージ１５の上に載っているのはマイクロ流路により構成されたセルソーター１００であり、駆動装置２２によって前記ＸＹステージを移動させることで前記セルソーター１００の位置を計測に適した位置に調整することができるようにしている。前記セルソーター１００の細胞検出領域２２１を流下する細胞は、対物レンズ１６で観察される。対物レンズ１６の焦点位置は駆動装置１７によって移動させることができる。たとえば、セルソーターの基板１０１の底面のラミネートフィルムの厚さを０．１８ｍｍ以下とすれば、対物レンズ１６は開口数を１．４、倍率を４０倍として、細胞を十分な大きさで観察できる。前記バンドパスフィルタ１２を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１８およびバンドパスフィルタ１９によって、流路内の細胞が高速カメラ２５１によって撮像され、たとえば、毎秒２００フレームで画像を取り込まれる。このカメラ２５１で取り込まれた画像は、コンピュータ２５２で後述するように処理され、画像が心筋細胞あるいは線維芽細胞のいずれであるか決定される。また、この画像処理に先行して、必要なら、細胞検出領域２２１を流下する細胞の焦点合わせ操作、移動速度の検出も行う。
【００２４】
ここで、細胞が移動していることに伴う画像の修正について説明する。
【００２５】
図３（Ｂ）は速度ｖで移動する物体をカメラのシャッターを時間ｔだけ開放して撮影したときの画像の問題を模視的に説明する図である。物体が破線で示すように大きさが１の真円であったとすると、ｖｔだけ移動方向に伸ばされた楕円としてカメラに捕らえられえることになる。図３（Ｃ）、（Ｄ）は、このことを考慮してカメラに捕らえられた画像を修正する考え方を説明する図である。すなわち、Ｌ×Ｌの画像領域に対して、物体の移動方向の大きさを次式（１）のように圧縮すればよい。その結果、図３（Ｃ）に楕円で示す形が、図３(Ｄ)に、真円で示すように修正される。
【数１】
【００２６】
図４を参照して、流路２０４の細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像して得られる心筋細胞と線維芽細胞の実体画像を説明する。図４で示す画像は、図３で説明したように、細胞が移動することによる影響を修正した画像である。ＣＣＤカメラは、例えば、毎秒２００フレームで画像を取り込む能力のあるものを使用する。この撮影能力があれば、細胞検出領域２２１の流路を流下する緩衝液の流速が１ｍｍ／ｓｅｃ程度であっても、細胞単位で認識できる。あるいは、図２に模視的に示すように、連続的に流下する細胞として認識できる。これらの画像から、細胞単位で画像を認識して以下のように識別する。
【００２７】
（実施例１）
図４（Ａ）、（Ｂ）は、ＣＣＤカメラで取り込まれた心筋細胞の実体画像の二つの例を示す写真である。一方、図４（Ｃ）、（Ｄ）は、ＣＣＤカメラで取り込まれた線維芽細胞の実体画像の二つの例を示す写真である。いずれの写真も大きさを示す指標１０μｍの線の長さから分かるように、約１２μｍの大きさであり、単純に大きさだけの比較では、両細胞を識別することはできない。
【００２８】
本願の発明者は、これらの心筋細胞と線維芽細胞の実体画像を精査して、その表面の滑らかさ、あるいは、中央部の構造の複雑さに着目して、これらを指標とすれば、両細胞を高精度に識別できることに気がついた。すなわち、心筋細胞は表面が滑らかであることから、画像として見たとき、細胞の周囲が連続したものと認識できる。一方、線維芽細胞は、中央部の構造の複雑さに起因して、画像として見たとき、中央部の明暗が複雑に変化している。
【００２９】
上記の特徴に着目して自動的に評価する一つの実施例として、画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ適当数に分割したピクセルとして扱い、各ピクセルは、それぞれの明るさを所定の閾値と比較して２値化処理をする例を説明する。
【００３０】
まず、図４（Ａ）、（Ｂ）に示す心筋細胞の実体画像を、図５（Ａ）、（Ｂ）に示すように、画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ２０分割したピクセルとして扱う。各ピクセルは、それぞれの明るさを所定の閾値と比較して２値化処理して、０，１に置き換える。図６（Ａ）、（Ｂ）は２値化処理の結果を示す図であり、図６（Ａ）は図５（Ａ）の処理結果、図６（Ｂ）は図５（Ｂ）の処理結果をそれぞれ示す。図では、閾値以上にあるピクセルのみを“１”で示す。
【００３１】
一方、図４（Ｃ）、（Ｄ）に示す線維芽細胞の実体画像を、図７（Ａ）、（Ｂ）に示すように、画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ２０分割したピクセルとして扱う。各ピクセルは、それぞれの明るさを所定の閾値と比較して２値化処理して、０，１に置き換える。図８（Ａ）、（Ｂ）は２値化処理の結果を示す図であり、図８（Ａ）は図７（Ａ）の処理結果、図（Ｂ）は図７（Ｂ）の処理結果をそれぞれ示す。図では、閾値以上にあるピクセルのみを“１”で示す。
【００３２】
図６（Ａ）、（Ｂ）では、画像の周辺部に閾値以上にあるピクセル“１”がほぼ連続した形で現われるのに対して、図８（Ａ）、（Ｂ）では画像の周辺部の閾値以上にあるピクセル“１”の連続性が失われている。代わりに、画像の中央部に閾値以上にあるピクセル“１”が多く現われる。
【００３３】
したがって、たとえば、図６（Ａ）、（Ｂ）および図８（Ａ）、（Ｂ）に破線で囲って示すように、座標（Ｘ４，Ｙ６），座標（Ｘ１７，Ｙ６），座標（Ｘ１７，Ｙ１７）および座標（Ｘ４，Ｙ１７）で囲われる領域にあるピクセル“１”の数を計数して、これが所定値以下又は等しい値であるときは心筋細胞の実体画像、所定値以上であれば線維芽細胞の実体画像と判断できる。細胞検出領域２２１で得られた画像の判断結果に基づき、細胞分離領域２２２で電界の印加あるいは非印加により細胞の分離を行う。
【００３４】
（実施例２）
実施例２では、細胞の実体画像をＸ軸から所定の角度刻みで傾けた軸上の画像の明るさの変化に着目して細胞の識別を行う。
【００３５】
図９（Ａ）は図４（Ａ）に示す心筋細胞の実体画像をＸ軸、Ｙ軸の原点（重心）から所定の角度刻みで傾けた軸θ0，θ1，θ2，---，θn上の画像の明るさの変化に着目し、最も外側でバックグラウンドの明るさから所定の変化率（微分値）以上で明るくなった位置を検出しこれらの位置を太線で結んで示す図である。図９（Ｂ）は軸θ0，θ1，θ2，---，θn上の画像の明るさの変化を示す図である。
【００３６】
図１０（Ａ）は図４（Ｃ）に示す線維芽細胞の実体画像をＸ軸から所定の角度刻みで傾けた軸θ0，θ1，θ2，---，θn上の画像の明るさの変化に着目し、最も外側でバックグラウンドの明るさから所定の変化率（微分値）以上で明るくなった位置を検出しこれらの位置を太線で結んで示す図である。図１０（Ｂ）は軸θ0，θ1，θ2，---，θn上の画像の明るさの変化を示す図である。
【００３７】
図９（Ａ）と図１０（Ａ）のそれぞれの太線は細胞の周囲を示す線ということになるが、両図を対比して明らかなように、心筋細胞の方が線維芽細胞に比較して、細胞の断面積に対する周囲長の比が小さいことは明らかである。すなわち、細胞の断面積に対する周囲長の比を評価すれば、細胞の識別ができる。
【００３８】
簡単のために、細胞が真円であるとしてこのことを簡単に説明する。細胞の半径をｒ、断面積をＳ、周囲長をｌとすると以下の式に示す関係がある。
【数２】
ここで、心筋細胞を図９（Ａ）に示す太線を周囲長とする細胞とみて、これの断面積をＳ１とし、線維芽細胞を図１０（Ａ）に示す太線を周囲長とする細胞とみて、これの断面積をＳ２とすると、心筋細胞の断面積Ｓ１＞線維芽細胞の断面積Ｓ２となることは明らかである。一方、心筋細胞の周囲長ｌ１＜線維芽細胞の周囲長ｌ２となることは明らかである。すなわち、細胞の表面の滑らかな細胞の方が細胞の周囲長はみじかいのである。
【００３９】
したがって、細胞の周囲長ｌに対する細胞の断面積Ｓ（＝ｌ／Ｓ）を所定の閾値と比較して細胞を評価する、すなわち、ｌ／ｓが所定の閾値より大きいときを線維芽細胞とすることができる。
【００４０】
（実施例３）
実施例３では、実施例１の所定の明るさ以上のピクセル（“１”で表示）に加えて、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときの処理を追加する。すなわち、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときは、隣接するピクセル間の明るさの変化率を基準として２値化する。図１１（Ａ）、（Ｂ）は図５（Ａ）、（Ｂ）に示す心筋細胞の実体画像のピクセルの２値化処理の結果に、この変化率に着目した処理結果を付記した図である。ただし、ここでは、最外面にある位置のもののみを“０”で表示した。
【００４１】
図１２（Ａ）、（Ｂ）は図７（Ａ）、（Ｂ）に示す線維芽細胞の実体画像ピクセルの２値化処理の結果に、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときの処理結果を、同様にして追加した図である。
【００４２】
実施例２と同様に隣接するピクセルの画像の明るさの変化率が所定値以上のピクセル（“０”で表示---ただし、災害部に対応するもののみを表示）の最外部を結ぶ線を実施例２の細胞の周囲長として、実施例２と同様に細胞を評価すれば、この場合も、細胞表面が滑らかでないものはｌ／ｓが所定の閾値より大きくなるから、これを線維芽細胞とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本願発明を適用して好都合なセルソーターの一例を模式的に示す平面図である。
【図２】マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流して、マイクロ流路２４０を流下し、細胞検出領域２２１の直前で、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ２４０を流下する状況を説明する図である。
【図３】（Ａ）は細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像する構成を模式的に示す図、（Ｂ）は速度ｖで移動する物体をカメラのシャッターを時間ｔだけ開放して撮影したときの画像の問題を模視的に説明する図、（Ｃ）、（Ｄ）はカメラに捕らえられた画像を修正する考え方を説明する図である。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）は、ＣＣＤカメラで取り込まれた心筋細胞の実体画像の二つの例を示す写真であり、（Ｃ）、（Ｄ）は、ＣＣＤカメラで取り込まれた線維芽細胞の実体画像の二つの例を示す写真である。
【図５】（Ａ）、（Ｂ）は図４（Ａ）、（Ｂ）に示す心筋細胞の実体画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ２０分割したピクセルとして扱う例を説明する図である。
【図６】（Ａ）、（Ｂ）は図５（Ａ）、（Ｂ）に示すピクセルの２値化処理の結果を示す図である。
【図７】（Ａ）、（Ｂ）は図４（Ｃ）、（Ｄ）に示す線維芽細胞の実体画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ２０分割したピクセルとして扱う例を説明する図である。
【図８】（Ａ）、（Ｂ）は図７（Ａ）、（Ｂ）に示すピクセルの２値化処理の結果を示す図である。
【図９】（Ａ）、（Ｂ）は図４（Ａ）に示す心筋細胞の実体画像をＸ軸から所定の角度刻みで傾けた軸上の画像の明るさの変化に着目して細胞の識別を行う考え方を説明する図である。
【図１０】（Ａ）、（Ｂ）は図４（Ｃ）に示す線維芽細胞の実体画像をＸ軸から所定の角度刻みで傾けた軸上の画像の明るさの変化に着目して細胞の識別を行う考え方を説明する図である。
【図１１】（Ａ）、（Ｂ）は図５（Ａ）、（Ｂ）に示す心筋細胞の実体画像のピクセルの２値化処理の結果に、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときの処理結果を追加した図である。
【図１２】（Ａ）、（Ｂ）は図７（Ａ）、（Ｂ）に示す線維芽細胞の実体画像ピクセルの２値化処理の結果に、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときの処理結果を追加した図である。
【符号の説明】
【００４４】
１００…セルソーター、１０１…基板、１０６，１０７…配線、２０１，２０１’，２０２，２０２’，２０６，２０７…穴、２０６’，２０７’…空気抜き、２０３，２１３…リザーバ、２０４，２０４’，２０５，２０５’，２４０，２１８，２１９…流路、２０８，２０９…マイクロ構造、２１５…電源、２１６…スイッチ、２２１…細胞検出領域、２２２…細胞分離領域、２４１，２４２…液絡構造の連結部、２５１…カメラ，２５２…コンピュータ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上に構成される流路を、細胞を緩衝液とともに流下させて細胞分離を行うセルソーターに適用して好適な心筋細胞と線維芽細胞の細胞識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織片から特定細胞を分離する方法にはいくつかの方法が知られている。心筋細胞と線維芽細胞の細胞識別方法として、それぞれの細胞の比重の違いに着目して、パーコールを使用して密度勾配遠心により分離する方法が良く行われる。この方法は、遠心処理の結果、層状に分離した細胞の層を乱さないように分離、採取するものであるが、必ずしも、十分な精度で分離できないのが現状である。
【０００３】
特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術であり、例えば、蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収するセルソーターがある（非特許文献１：Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)）。
【０００４】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、本発明者らは、マイクロ加工技術を活用して、基板上に構成される流路を、細胞を緩衝液とともに流下させ、細胞の画像を採取して細胞分離を行うセルソーターを提案している（特開２００６−１８０８１０、特開２００６−２２０４２３）。
【特許文献１】特開２００６−１８０８１０号公報
【特許文献２】特開２００６−２２０４２３号公報
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記細胞の画像を採取して細胞分離を行うセルソーターによって、心筋細胞と線維芽細胞の実体画像により、細胞分離を高精度、高速度で可能とする心筋細胞と線維芽細胞の細胞識別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願の発明者は、心筋細胞と線維芽細胞の実体画像を精細に検討した結果、所定の基準によって評価することで、実体画像からそれぞれの細胞を識別できることを発見した。本発明では、緩衝液とともに流下してくる細胞を所定の位置でＣＣＤカメラなどを用いて実体像として検出し、上記基準により評価することで流路中を連続して高速で流れてくる細胞を識別する。
【０００７】
したがって、本発明は、以下の細胞識別方法、細胞識別・分離装置、および上記細胞識別方法に用いるコンピュータプログラムを提供する。
（１）基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
上記細胞検出領域で上記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出して、該実体像を所定の基準で評価する工程、および
上記評価に基づいて上記細胞分離領域で細胞を分離する工程を含み、
上記基準が上記細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（２）上記基準が細胞の断面積と周囲長の比を示す指標に代えて、上記断面積と周囲長の比から細胞の表面の滑らかさを示す指標とされた上記（１）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（３）上記基準が細胞の周囲長の長さを示す指標に代えて、細胞の内部構造の複雑さを示す指標とされた上記（１）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（４）上記細胞検出領域で検出される細胞の実体像は一つの細胞ごとに独立して撮像されるものである上記（１）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（５）基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
上記細胞検出領域で上記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出する工程、
該実体像をＸＹ平面の各軸方向で所定の間隔で区分したピクセルとして、各ピクセルの明るさを基準として２値化する工程、
上記２値化された実体像を複数の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価する工程、
所定の領域での所定の明るさのピクセルの数が所定の閾値を超えるか否か判断して細胞を識別する工程を含み、
上記閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比に関連する指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（６）基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
上記細胞検出領域で上記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出する工程、
該実体像をＸＹ平面の一つの軸から所定の角度ずつ回転させた軸方向で画像の明るさを検出する工程、
上記回転させた各軸で検出された画像の明るさが所定の閾値を超えるか否か判断して細胞の周囲長及び細胞の断面積を決定する工程、
上記決定された細胞の周囲長と細胞の断面積とから、該細胞の周囲長と断面積の比を求め、該比を所定の閾値と比較して細胞を識別する工程を含み、
上記閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（７）上記閾値が細胞の断面積と周囲長の比を示す指標に代えて、上記断面積と周囲長の比から細胞の表面の滑らかさを示す指標とされた上記（５）または（６）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（８）上記所定の閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標に代えて、細胞の内部構造の複雑さを示す指標とされた上記（５）または（６）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（９）上記細胞検出領域で検出される細胞の実体像は一つの細胞ごとに独立して撮像されるものである上記（５）または（６）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（１０）上記ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続するところでは隣接するピクセル間の明るさの変化率を基準として２値化すること、
上記それぞれの基準で２値化された実体像を所定の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価すること、
の処理が付加された上記（５）記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
（１１）上記（１）記載の方法において使用する細胞識別・分離装置であって、
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた上記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた上記検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた上記分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを設置する手段と、
上記細胞検出領域で上記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出するための手段と、
上記実体像のデジタルデータから該実体像を評価するための所定の評価値を算出し、該算出された評価値を所定の閾値と比較して上記細胞を識別するための手段と、
上記識別された細胞を上記細胞分離領域で分離するために電界を作用させる手段とを備える、細胞識別・分離装置。
（１２）上記（１）記載の方法において使用するコンピュータプログラムであって、
上記細胞検出領域で検出した上記細胞の実体像のデジタルデータから、上記細胞の断面積に対する周囲長の比を求める演算を行うステップ、および
上記比を所定の閾値と比較して、上記細胞分離領域を上記細胞が通過する際に該領域に電界を印加するか否かを判断するステップ、
を含む処理をコンピュータに実行させるための、コンピュータプログラム。
（１３）上記（５）記載の方法において使用するコンピュータプログラムであって、
上記細胞検出領域で検出した上記細胞の実体像のデジタルデータに基づいて、該実体像をＸＹ平面の各軸方向で所定の間隔で区分したピクセルとして表わし、各ピクセルの明るさを所定の基準に基づいて２値化するステップ、
上記２値化されたピクセルで表した実体像を複数の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価するステップ、
所定の領域での所定の明るさのピクセルの数が所定の閾値を超えるか否かを判断するステップ、および
上記判断に基づいて、上記細胞分離領域を上記細胞が通過する際に該領域に電界を印加するか否かを決定するステップ、
を含む処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、心筋細胞と線維芽細胞の細胞分離が高精度、高速度で可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
図１は、本願発明を適用して好都合なセルソーターの一例を、上記特開２００６−１８０８１０号公報に開示された細胞分離装置（セルソーター）を基礎とした構成として模式的に示す平面図である。
【００１０】
セルソーター１００は基板１０１を含む構造を有する。基板１０１の下面に流路となる溝を、上面にこの溝に連通する開口を設け、試料や必要な緩衝液の供給口とする。また、十分な緩衝液の供給と各流路での流量の調整のためにリザーバ（２０３，２１３）を設ける。溝や開口の作成はＰＭＭＡなどのプラスチックを金型に流し込むいわゆる射出成型で作成することができる。チップ基板１０１全体のサイズは、例えば、２０×３０×１ｍｍ（ｔ）であるが、このサイズに限定されない。チップ基板１０１の溝が刻まれた下面側に、例えば、０．１ｍｍ厚のラミネートフィルムを熱圧着することにより、基板１０１の下面に刻まれた溝や基板１０１の貫通穴を、流路やウェルとすることができる。例えば、開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いて、０．１ｍｍのラミネートフィルムを通して流路内を流れる細胞を観察できる。もちろんこれより低倍率のレンズでは問題なく観察することができる。チップ基板１０１の上面には、マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’，２０２および２０２’が設けられるとともに、これらを包括するリザーバ２０３が設けられる。具体的には、リザーバ２０３を形成するために基板１０１の上面に設けられたウェルの底面にそれぞれ穴２０１’、２０２、および２０２’が設けられる。
【００１１】
したがって、リザーバ２０３に十分な緩衝液を供給すると穴２０１，２０１’，２０２および２０２’は緩衝液でつながる。これにより、穴２０１および２０１’に連なる流路２０４と流路２０４’には同じ液面高さの緩衝液が供給される。したがって、両流路の流路幅（流路高さを等しいとすれば）、あるいは、断面積、さらに両流路の流路長を実質等しくすれば、両流路の流量を実質同量にすることができる。同様に、穴２０２，２０２’に連なる流路２０５，２０５’には同じ液面高さの緩衝液が供給され、流路２０５，２０５’を流れる緩衝液の流量を流路２０４に流れる流量と所定の比にそろえることができる。
【００１２】
穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液は、マイクロ流路２０４（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞検出領域２２１および細胞分離領域２２２まで導入される。他方、穴２０２，２０２’に導入された細胞を含まない緩衝液は流路２０５，２０５’（幅１２μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液と合流する。２４０は合流後のマイクロ流路であり、細胞検出領域２２１となる。さらに、マイクロ流路２４０は細胞分離領域２２２まで延伸される。
【００１３】
一方、穴２０１’に導入された細胞を含まない緩衝液は、マイクロ流路２０４’（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞分離領域２２２に導入され、マイクロ流路２４０からの細胞を含む緩衝液と合流する。合流後に溶液が通過する流路の流路幅については、後述する。また、この合流した流路は、細胞分離領域２２２の出口で、マイクロ流路２１８（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）および２１９（例：幅２０μｍ、深さ１５μｍ）に分流する。
【００１４】
２０６，２０６’および２０７，２０７’は電解質を含むゲルを導入する穴であり、それぞれ、穴２０６および２０７に導入されたゲルは基板１０１の下面のマイクロ構造２０８，２０９（例えば、幅２００μｍ×高さ１５μｍの溝）を通して穴２０６’および２０７’に送り込まれる。したがって、マイクロ構造２０８，２０９は電解質を含むゲルで満たされている。マイクロ構造２０８，２０９の流路２４７側の端はマイクロ流路２０４，２０４’にそれぞれ接続する２０μｍ程度の長さの液絡構造の連結部２４１，２４２からなっていて、細胞分離領域２２２において、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが、直接、接触できる構造とされる。ゲルと緩衝液が接触する面積は、例えば、１５μｍ（流路に沿った長さ）×１５μｍ（高さ）である。ゲルを導入する穴２０６および２０７には、黒丸で示す電極が挿入され、これらの電極は、配線１０６，１０７およびスイッチ２１６を通して電源２１５に接続される。スイッチ２１６は、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に電圧をかける時のみＯＮとされる。
【００１５】
細胞分離領域２２２でマイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’とが合流して形成される流路２４７を流れる緩衝液に、連結部２４１と２４２からのゲルが接触する。図に示すように、連結部２４２よりも連結部２４１のほうが流路の上流に位置する構造となっている。これは、穴２０６の電極にプラス、穴２０７の電極にマイナスの電圧をかけたときに、マイクロ流路２４０を流れてくる細胞を流路２１８に効率よく移動させるためである。すなわち、電流を流したときにマイナスにチャージしている細胞には電気泳動的な力が働くが、この電気泳動力のベクトルと流路内を流れる緩衝液から受ける力のベクトルとの合成ベクトルが、実際に細胞に働く力になる。連結部２４２よりも連結部２４１を流路の上流に位置させたほうが、連結部２４１と２４２とを流路の流れ方向に対して同じレベルの位置に作成した場合に比べ、実際に細胞に働く力のベクトルの向きがより直接的に連結部２４２または２４１の方に向くようになる。したがって、より低電圧で安定した細胞のマイクロ流路２１８あるいはマイクロ流路２１９への移動が可能となり、効率のよい電界利用が可能となる。
【００１６】
マイクロ流路２１８，２１９の下流部には、細胞分離領域２２２で振り分けられた細胞の回収穴２１１，２１２が開けられている。それぞれの穴２１１，２１２には、これらを包括するリザーバ２１３が設けられる。具体的には、リザーバ２１３を形成するために基板１０１の上面に設けられたウェルの底面にそれぞれ穴２１１，２１２が設けられる。リザーバ２１３は緩衝液で満たされているが、この緩衝液の液面の位置は、リザーバ２０３に満たされている緩衝液の液面の位置よりは低いものとされる。
【００１７】
リザーバ２０３の緩衝液の液位はリザーバ２１３のそれよりも高いから、この落差が流路を流れる緩衝液の移動の駆動力となるとともに、脈動のない安定した流れを作り出す。リザーバ２１３の容積を十分大きなものとしておけば、穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液を、全て、流路２０４に流入させることができる。
【００１８】
細胞検出領域２２１を流下する細胞はカメラ２５１により実体像が撮影され、コンピュータ２５２により、後述する判別法に基づいて撮影された細胞が心筋細胞か線維芽細胞であるかを識別される。コンピュータ２５２は、この細胞が線維芽細胞であると判定した時のみ、細胞が細胞分離領域２２２に到達する時点に、スイッチ２１６をオンとする。これにより、心筋細胞はマイクロ流路２１８を流下し、線維芽細胞はマイクロ流路２１９を流下することになる。
【００１９】
図２は、マイクロ流路２０４からの細胞を含む緩衝液と、マイクロ流路２０５，２０５’からの緩衝液とが合流した後、マイクロ流路２４０上の細胞検出領域２２１に進入し、さらに、マイクロ流路２４０を流下して、マイクロ流路２０４’からの緩衝液と合流して、さらにマイクロ流路２４７を流下する状況を説明する図である。図に示すように、細胞分離領域２２２は、マイクロ流路２０４’の下流端と、マイクロ流路２４０の下流端と、連結部２４１の一部と、連結部２４２の一部と、マイクロ流路２４７とを含む。
【００２０】
ここで、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０５，２０５’を流下する細胞を含まない緩衝液を、マイクロ流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液と合流させる理由を説明する。細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４には、細胞を含まない緩衝液の流れる流路２０５，２０５’が細胞検出領域２２１の上流部で合流するが、それぞれの流路の最上流に設けられた穴２０１および２０２，２０２’は、共通の液位の緩衝液のリザーバ２０３中に開口部を有する。したがって、それぞれの流路を流下する緩衝液の流量は、流路の高さが同じであるから、流路幅に比例したものとなる。これらの緩衝液の合流後の流路２４０の幅を、細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４の幅と実質的に等しい幅を持つものとする。実質的に等しいとは、加工精度を考慮して等しいということで、厳密に等しいというわけではない。これにより、流路２０４を流下する緩衝液は流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって、一定の比率で中央部に押しやられるので、流路２０４では側壁に衝突しながら流れてくる細胞が、合流後の流路２４０中では側壁に衝突しなくなる。
【００２１】
細胞分離領域２２２におけるマイクロ流路２４７は、流路２４０と流路２０４’をそれぞれ流下する緩衝液が、それぞれの流れの層を維持しながら、同じ幅の流路を保って流下している。細胞検出領域２２１の流路２０４で流下する細胞を検出して、細胞分離領域２２２で、ゲルが流下する緩衝液と接触する連結部２４１と２４２により電界を作用させて分離するのである。
【００２２】
図３（Ａ）は細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像する構成を模式的に示す図である。図中の符号１１は実体顕微鏡の光源である。１２は光源１１の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞等の試料を用いる場合には、波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の用いることで試料の損傷を防ぐことができる。１３はシャッターで、ＸＹステージ１５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。１４はコンデンサレンズである。
【００２３】
ＸＹステージ１５の上に載っているのはマイクロ流路により構成されたセルソーター１００であり、駆動装置２２によって前記ＸＹステージを移動させることで前記セルソーター１００の位置を計測に適した位置に調整することができるようにしている。前記セルソーター１００の細胞検出領域２２１を流下する細胞は、対物レンズ１６で観察される。対物レンズ１６の焦点位置は駆動装置１７によって移動させることができる。たとえば、セルソーターの基板１０１の底面のラミネートフィルムの厚さを０．１８ｍｍ以下とすれば、対物レンズ１６は開口数を１．４、倍率を４０倍として、細胞を十分な大きさで観察できる。前記バンドパスフィルタ１２を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１８およびバンドパスフィルタ１９によって、流路内の細胞が高速カメラ２５１によって撮像され、たとえば、毎秒２００フレームで画像を取り込まれる。このカメラ２５１で取り込まれた画像は、コンピュータ２５２で後述するように処理され、画像が心筋細胞あるいは線維芽細胞のいずれであるか決定される。また、この画像処理に先行して、必要なら、細胞検出領域２２１を流下する細胞の焦点合わせ操作、移動速度の検出も行う。
【００２４】
ここで、細胞が移動していることに伴う画像の修正について説明する。
【００２５】
図３（Ｂ）は速度ｖで移動する物体をカメラのシャッターを時間ｔだけ開放して撮影したときの画像の問題を模視的に説明する図である。物体が破線で示すように大きさが１の真円であったとすると、ｖｔだけ移動方向に伸ばされた楕円としてカメラに捕らえられえることになる。図３（Ｃ）、（Ｄ）は、このことを考慮してカメラに捕らえられた画像を修正する考え方を説明する図である。すなわち、Ｌ×Ｌの画像領域に対して、物体の移動方向の大きさを次式（１）のように圧縮すればよい。その結果、図３（Ｃ）に楕円で示す形が、図３(Ｄ)に、真円で示すように修正される。
【数１】
【００２６】
図４を参照して、流路２０４の細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像して得られる心筋細胞と線維芽細胞の実体画像を説明する。図４で示す画像は、図３で説明したように、細胞が移動することによる影響を修正した画像である。ＣＣＤカメラは、例えば、毎秒２００フレームで画像を取り込む能力のあるものを使用する。この撮影能力があれば、細胞検出領域２２１の流路を流下する緩衝液の流速が１ｍｍ／ｓｅｃ程度であっても、細胞単位で認識できる。あるいは、図２に模視的に示すように、連続的に流下する細胞として認識できる。これらの画像から、細胞単位で画像を認識して以下のように識別する。
【００２７】
（実施例１）
図４（Ａ）、（Ｂ）は、ＣＣＤカメラで取り込まれた心筋細胞の実体画像の二つの例を示す写真である。一方、図４（Ｃ）、（Ｄ）は、ＣＣＤカメラで取り込まれた線維芽細胞の実体画像の二つの例を示す写真である。いずれの写真も大きさを示す指標１０μｍの線の長さから分かるように、約１２μｍの大きさであり、単純に大きさだけの比較では、両細胞を識別することはできない。
【００２８】
本願の発明者は、これらの心筋細胞と線維芽細胞の実体画像を精査して、その表面の滑らかさ、あるいは、中央部の構造の複雑さに着目して、これらを指標とすれば、両細胞を高精度に識別できることに気がついた。すなわち、心筋細胞は表面が滑らかであることから、画像として見たとき、細胞の周囲が連続したものと認識できる。一方、線維芽細胞は、中央部の構造の複雑さに起因して、画像として見たとき、中央部の明暗が複雑に変化している。
【００２９】
上記の特徴に着目して自動的に評価する一つの実施例として、画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ適当数に分割したピクセルとして扱い、各ピクセルは、それぞれの明るさを所定の閾値と比較して２値化処理をする例を説明する。
【００３０】
まず、図４（Ａ）、（Ｂ）に示す心筋細胞の実体画像を、図５（Ａ）、（Ｂ）に示すように、画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ２０分割したピクセルとして扱う。各ピクセルは、それぞれの明るさを所定の閾値と比較して２値化処理して、０，１に置き換える。図６（Ａ）、（Ｂ）は２値化処理の結果を示す図であり、図６（Ａ）は図５（Ａ）の処理結果、図６（Ｂ）は図５（Ｂ）の処理結果をそれぞれ示す。図では、閾値以上にあるピクセルのみを“１”で示す。
【００３１】
一方、図４（Ｃ）、（Ｄ）に示す線維芽細胞の実体画像を、図７（Ａ）、（Ｂ）に示すように、画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ２０分割したピクセルとして扱う。各ピクセルは、それぞれの明るさを所定の閾値と比較して２値化処理して、０，１に置き換える。図８（Ａ）、（Ｂ）は２値化処理の結果を示す図であり、図８（Ａ）は図７（Ａ）の処理結果、図（Ｂ）は図７（Ｂ）の処理結果をそれぞれ示す。図では、閾値以上にあるピクセルのみを“１”で示す。
【００３２】
図６（Ａ）、（Ｂ）では、画像の周辺部に閾値以上にあるピクセル“１”がほぼ連続した形で現われるのに対して、図８（Ａ）、（Ｂ）では画像の周辺部の閾値以上にあるピクセル“１”の連続性が失われている。代わりに、画像の中央部に閾値以上にあるピクセル“１”が多く現われる。
【００３３】
したがって、たとえば、図６（Ａ）、（Ｂ）および図８（Ａ）、（Ｂ）に破線で囲って示すように、座標（Ｘ４，Ｙ６），座標（Ｘ１７，Ｙ６），座標（Ｘ１７，Ｙ１７）および座標（Ｘ４，Ｙ１７）で囲われる領域にあるピクセル“１”の数を計数して、これが所定値以下又は等しい値であるときは心筋細胞の実体画像、所定値以上であれば線維芽細胞の実体画像と判断できる。細胞検出領域２２１で得られた画像の判断結果に基づき、細胞分離領域２２２で電界の印加あるいは非印加により細胞の分離を行う。
【００３４】
（実施例２）
実施例２では、細胞の実体画像をＸ軸から所定の角度刻みで傾けた軸上の画像の明るさの変化に着目して細胞の識別を行う。
【００３５】
図９（Ａ）は図４（Ａ）に示す心筋細胞の実体画像をＸ軸、Ｙ軸の原点（重心）から所定の角度刻みで傾けた軸θ0，θ1，θ2，---，θn上の画像の明るさの変化に着目し、最も外側でバックグラウンドの明るさから所定の変化率（微分値）以上で明るくなった位置を検出しこれらの位置を太線で結んで示す図である。図９（Ｂ）は軸θ0，θ1，θ2，---，θn上の画像の明るさの変化を示す図である。
【００３６】
図１０（Ａ）は図４（Ｃ）に示す線維芽細胞の実体画像をＸ軸から所定の角度刻みで傾けた軸θ0，θ1，θ2，---，θn上の画像の明るさの変化に着目し、最も外側でバックグラウンドの明るさから所定の変化率（微分値）以上で明るくなった位置を検出しこれらの位置を太線で結んで示す図である。図１０（Ｂ）は軸θ0，θ1，θ2，---，θn上の画像の明るさの変化を示す図である。
【００３７】
図９（Ａ）と図１０（Ａ）のそれぞれの太線は細胞の周囲を示す線ということになるが、両図を対比して明らかなように、心筋細胞の方が線維芽細胞に比較して、細胞の断面積に対する周囲長の比が小さいことは明らかである。すなわち、細胞の断面積に対する周囲長の比を評価すれば、細胞の識別ができる。
【００３８】
簡単のために、細胞が真円であるとしてこのことを簡単に説明する。細胞の半径をｒ、断面積をＳ、周囲長をｌとすると以下の式に示す関係がある。
【数２】
ここで、心筋細胞を図９（Ａ）に示す太線を周囲長とする細胞とみて、これの断面積をＳ１とし、線維芽細胞を図１０（Ａ）に示す太線を周囲長とする細胞とみて、これの断面積をＳ２とすると、心筋細胞の断面積Ｓ１＞線維芽細胞の断面積Ｓ２となることは明らかである。一方、心筋細胞の周囲長ｌ１＜線維芽細胞の周囲長ｌ２となることは明らかである。すなわち、細胞の表面の滑らかな細胞の方が細胞の周囲長はみじかいのである。
【００３９】
したがって、細胞の周囲長ｌに対する細胞の断面積Ｓ（＝ｌ／Ｓ）を所定の閾値と比較して細胞を評価する、すなわち、ｌ／ｓが所定の閾値より大きいときを線維芽細胞とすることができる。
【００４０】
（実施例３）
実施例３では、実施例１の所定の明るさ以上のピクセル（“１”で表示）に加えて、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときの処理を追加する。すなわち、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときは、隣接するピクセル間の明るさの変化率を基準として２値化する。図１１（Ａ）、（Ｂ）は図５（Ａ）、（Ｂ）に示す心筋細胞の実体画像のピクセルの２値化処理の結果に、この変化率に着目した処理結果を付記した図である。ただし、ここでは、最外面にある位置のもののみを“０”で表示した。
【００４１】
図１２（Ａ）、（Ｂ）は図７（Ａ）、（Ｂ）に示す線維芽細胞の実体画像ピクセルの２値化処理の結果に、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときの処理結果を、同様にして追加した図である。
【００４２】
実施例２と同様に隣接するピクセルの画像の明るさの変化率が所定値以上のピクセル（“０”で表示---ただし、災害部に対応するもののみを表示）の最外部を結ぶ線を実施例２の細胞の周囲長として、実施例２と同様に細胞を評価すれば、この場合も、細胞表面が滑らかでないものはｌ／ｓが所定の閾値より大きくなるから、これを線維芽細胞とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本願発明を適用して好都合なセルソーターの一例を模式的に示す平面図である。
【図２】マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流して、マイクロ流路２４０を流下し、細胞検出領域２２１の直前で、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ２４０を流下する状況を説明する図である。
【図３】（Ａ）は細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像する構成を模式的に示す図、（Ｂ）は速度ｖで移動する物体をカメラのシャッターを時間ｔだけ開放して撮影したときの画像の問題を模視的に説明する図、（Ｃ）、（Ｄ）はカメラに捕らえられた画像を修正する考え方を説明する図である。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）は、ＣＣＤカメラで取り込まれた心筋細胞の実体画像の二つの例を示す写真であり、（Ｃ）、（Ｄ）は、ＣＣＤカメラで取り込まれた線維芽細胞の実体画像の二つの例を示す写真である。
【図５】（Ａ）、（Ｂ）は図４（Ａ）、（Ｂ）に示す心筋細胞の実体画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ２０分割したピクセルとして扱う例を説明する図である。
【図６】（Ａ）、（Ｂ）は図５（Ａ）、（Ｂ）に示すピクセルの２値化処理の結果を示す図である。
【図７】（Ａ）、（Ｂ）は図４（Ｃ）、（Ｄ）に示す線維芽細胞の実体画像をＸ，Ｙ軸方向にそれぞれ２０分割したピクセルとして扱う例を説明する図である。
【図８】（Ａ）、（Ｂ）は図７（Ａ）、（Ｂ）に示すピクセルの２値化処理の結果を示す図である。
【図９】（Ａ）、（Ｂ）は図４（Ａ）に示す心筋細胞の実体画像をＸ軸から所定の角度刻みで傾けた軸上の画像の明るさの変化に着目して細胞の識別を行う考え方を説明する図である。
【図１０】（Ａ）、（Ｂ）は図４（Ｃ）に示す線維芽細胞の実体画像をＸ軸から所定の角度刻みで傾けた軸上の画像の明るさの変化に着目して細胞の識別を行う考え方を説明する図である。
【図１１】（Ａ）、（Ｂ）は図５（Ａ）、（Ｂ）に示す心筋細胞の実体画像のピクセルの２値化処理の結果に、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときの処理結果を追加した図である。
【図１２】（Ａ）、（Ｂ）は図７（Ａ）、（Ｂ）に示す線維芽細胞の実体画像ピクセルの２値化処理の結果に、各ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続したときの処理結果を追加した図である。
【符号の説明】
【００４４】
１００…セルソーター、１０１…基板、１０６，１０７…配線、２０１，２０１’，２０２，２０２’，２０６，２０７…穴、２０６’，２０７’…空気抜き、２０３，２１３…リザーバ、２０４，２０４’，２０５，２０５’，２４０，２１８，２１９…流路、２０８，２０９…マイクロ構造、２１５…電源、２１６…スイッチ、２２１…細胞検出領域、２２２…細胞分離領域、２４１，２４２…液絡構造の連結部、２５１…カメラ，２５２…コンピュータ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
前記細胞検出領域で前記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出して、該実体像を所定の基準で評価する工程、および
前記評価に基づいて前記細胞分離領域で細胞を分離する工程を含み、
前記基準が前記細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項２】
前記基準が細胞の断面積と周囲長の比を示す指標に代えて、前記断面積と周囲長の比から細胞の表面の滑らかさを示す指標とされた請求項１記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項３】
前記基準が細胞の周囲長の長さを示す指標に代えて、細胞の内部構造の複雑さを示す指標とされた請求項１記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項４】
前記細胞検出領域で検出される細胞の実体像は一つの細胞ごとに独立して撮像されるものである請求項１記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項５】
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
前記細胞検出領域で前記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出する工程、
該実体像をＸＹ平面の各軸方向で所定の間隔で区分したピクセルとして、各ピクセルの明るさを基準として２値化する工程、
前記２値化された実体像を複数の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価する工程、
所定の領域での所定の明るさのピクセルの数が所定の閾値を超えるか否か判断して細胞を識別する工程を含み、
前記閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比に関連する指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項６】
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
前記細胞検出領域で前記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出する工程、
該実体像をＸＹ平面の一つの軸から所定の角度ずつ回転させた軸方向で画像の明るさを検出する工程、
前記回転させた各軸で検出された画像の明るさが所定の閾値を超えるか否か判断して細胞の周囲長及び細胞の断面積を決定する工程、
前記決定された細胞の周囲長と細胞の断面積とから、該細胞の周囲長と断面積の比を求め、該比を所定の閾値と比較して細胞を識別する工程を含み、
前記閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項７】
前記閾値が細胞の断面積と周囲長の比を示す指標に代えて、前記断面積と周囲長の比から細胞の表面の滑らかさを示す指標とされた請求項５または６記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項８】
前記所定の閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標に代えて、細胞の内部構造の複雑さを示す指標とされた請求項５または６記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項９】
前記細胞検出領域で検出される細胞の実体像は一つの細胞ごとに独立して撮像されるものである請求項５または６記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項１０】
前記ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続するところでは隣接するピクセル間の明るさの変化率を基準として２値化すること、
前記それぞれの基準で２値化された実体像を所定の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価すること、
の処理が付加された請求項５記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において使用する細胞識別・分離装置であって、
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた前記検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた前記分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを設置する手段と、
前記細胞検出領域で前記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出するための手段と、
前記実体像のデジタルデータから該実体像を評価するための所定の評価値を算出し、該算出された評価値を所定の閾値と比較して前記細胞を識別するための手段と、
前記識別された細胞を前記細胞分離領域で分離するために電界を作用させる手段とを備える、細胞識別・分離装置。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において使用するコンピュータプログラムであって、
前記細胞検出領域で検出した前記細胞の実体像のデジタルデータから、前記細胞の断面積に対する周囲長の比を求める演算を行うステップ、および
前記比を所定の閾値と比較して、前記細胞分離領域を前記細胞が通過する際に該領域に電界を印加するか否かを判断するステップ、
を含む処理をコンピュータに実行させるための、コンピュータプログラム。
【請求項１３】
請求項５記載の方法において使用するコンピュータプログラムであって、
前記細胞検出領域で検出した前記細胞の実体像のデジタルデータに基づいて、該実体像をＸＹ平面の各軸方向で所定の間隔で区分したピクセルとして表わし、各ピクセルの明るさを所定の基準に基づいて２値化するステップ、
前記２値化されたピクセルで表した実体像を複数の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価するステップ、
所定の領域での所定の明るさのピクセルの数が所定の閾値を超えるか否かを判断するステップ、および
前記判断に基づいて、前記細胞分離領域を前記細胞が通過する際に該領域に電界を印加するか否かを決定するステップ、
を含む処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム。
【請求項１】
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
前記細胞検出領域で前記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出して、該実体像を所定の基準で評価する工程、および
前記評価に基づいて前記細胞分離領域で細胞を分離する工程を含み、
前記基準が前記細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項２】
前記基準が細胞の断面積と周囲長の比を示す指標に代えて、前記断面積と周囲長の比から細胞の表面の滑らかさを示す指標とされた請求項１記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項３】
前記基準が細胞の周囲長の長さを示す指標に代えて、細胞の内部構造の複雑さを示す指標とされた請求項１記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項４】
前記細胞検出領域で検出される細胞の実体像は一つの細胞ごとに独立して撮像されるものである請求項１記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項５】
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
前記細胞検出領域で前記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出する工程、
該実体像をＸＹ平面の各軸方向で所定の間隔で区分したピクセルとして、各ピクセルの明るさを基準として２値化する工程、
前記２値化された実体像を複数の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価する工程、
所定の領域での所定の明るさのピクセルの数が所定の閾値を超えるか否か判断して細胞を識別する工程を含み、
前記閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比に関連する指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項６】
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを利用した細胞分離における細胞識別方法であって、
前記細胞検出領域で前記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出する工程、
該実体像をＸＹ平面の一つの軸から所定の角度ずつ回転させた軸方向で画像の明るさを検出する工程、
前記回転させた各軸で検出された画像の明るさが所定の閾値を超えるか否か判断して細胞の周囲長及び細胞の断面積を決定する工程、
前記決定された細胞の周囲長と細胞の断面積とから、該細胞の周囲長と断面積の比を求め、該比を所定の閾値と比較して細胞を識別する工程を含み、
前記閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標である、心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項７】
前記閾値が細胞の断面積と周囲長の比を示す指標に代えて、前記断面積と周囲長の比から細胞の表面の滑らかさを示す指標とされた請求項５または６記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項８】
前記所定の閾値が細胞の断面積に対する周囲長の比を示す指標に代えて、細胞の内部構造の複雑さを示す指標とされた請求項５または６記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項９】
前記細胞検出領域で検出される細胞の実体像は一つの細胞ごとに独立して撮像されるものである請求項５または６記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項１０】
前記ピクセルの明るさが所定の明るさに達しないピクセルが連続するところでは隣接するピクセル間の明るさの変化率を基準として２値化すること、
前記それぞれの基準で２値化された実体像を所定の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価すること、
の処理が付加された請求項５記載の心筋細胞と繊維芽細胞の細胞識別方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において使用する細胞識別・分離装置であって、
基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための流路と、該流路の所定の位置に設けられた前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域と、該細胞検出領域の下流に設けられた前記検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域と、該細胞分離領域の下流に設けられた前記分離された細胞を流下させる二つの流路とを備える細胞分離チップを設置する手段と、
前記細胞検出領域で前記流路を緩衝液とともに流下する細胞の実体像を検出するための手段と、
前記実体像のデジタルデータから該実体像を評価するための所定の評価値を算出し、該算出された評価値を所定の閾値と比較して前記細胞を識別するための手段と、
前記識別された細胞を前記細胞分離領域で分離するために電界を作用させる手段とを備える、細胞識別・分離装置。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において使用するコンピュータプログラムであって、
前記細胞検出領域で検出した前記細胞の実体像のデジタルデータから、前記細胞の断面積に対する周囲長の比を求める演算を行うステップ、および
前記比を所定の閾値と比較して、前記細胞分離領域を前記細胞が通過する際に該領域に電界を印加するか否かを判断するステップ、
を含む処理をコンピュータに実行させるための、コンピュータプログラム。
【請求項１３】
請求項５記載の方法において使用するコンピュータプログラムであって、
前記細胞検出領域で検出した前記細胞の実体像のデジタルデータに基づいて、該実体像をＸＹ平面の各軸方向で所定の間隔で区分したピクセルとして表わし、各ピクセルの明るさを所定の基準に基づいて２値化するステップ、
前記２値化されたピクセルで表した実体像を複数の領域に区分して、それぞれの領域で所定の明るさのピクセルの数を評価するステップ、
所定の領域での所定の明るさのピクセルの数が所定の閾値を超えるか否かを判断するステップ、および
前記判断に基づいて、前記細胞分離領域を前記細胞が通過する際に該領域に電界を印加するか否かを決定するステップ、
を含む処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−２２８６１７（Ｐ２００８−２２８６１７Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７０７２６（Ｐ２００７−７０７２６）
【出願日】平成１９年３月１９日（２００７．３．１９）
【出願人】（５０５２８１０２３）株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１９日（２００７．３．１９）
【出願人】（５０５２８１０２３）株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ (8)
【Ｆターム（参考）】
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