悪性かつ形質転換した哺乳動物細胞を選択的に殺すペプチド
【課題】悪性または形質転換された細胞を選択的に殺すペプチド、並びにこれらのペプチドをコードするトランス遺伝子を配合するアデノウイルスベクター（ＡｄＶ）の提供。
【解決手段】ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合されたプロモーター配列からなり、該ペプチドがアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるかまたはそのアナログまたは誘導体である複製不能アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター。
【解決手段】ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合されたプロモーター配列からなり、該ペプチドがアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるかまたはそのアナログまたは誘導体である複製不能アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潰瘍性疾患の治療用の薬剤に関する。さらに特に、本発明は、悪性かつ形質転換した細胞を選択的に破壊する合成ペプチド、並びにそれに基づく潰瘍性疾患の治療方法を含む。本発明は、またガンに対するウイルス治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３蛋白は、細胞サイクルの重要な調節物である。それは、一部分、有糸分裂を誘導する蛋白の転写をブロックすることによりそして有糸分裂をブロックする蛋白の転写を誘導することにより有糸分裂を誘導しそしてアポトーシスを促進する多数のガン遺伝子蛋白のガン遺伝子作用をブロックする。ｐ５３細胞がないことは、細胞の形質転換および悪性疾患と関係がある。（非特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ＆Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０
【０００４】
ｐ５３蛋白分子は、３９３のアミノ酸からなる。それは、残基９３〜３１３からなるＤＮＡ結合ドメイン中のＤＮＡの特定配列に結合するドメインを含む。この領域の結晶構造は、Ｘ線結晶分析により決定されている。残基３１２〜３９３は、ｐ５３蛋白のホモテトラマーの形成に含まれる。残基１〜９３は、ｐ５３蛋白の活性および半減期の調節に含まれる。
【０００５】
ｐ５３蛋白は、他の重要な調節蛋白であるＭＤＭ−２蛋白に結合する。ＭＤＭ−２蛋白をエンコードするＭＤＭ遺伝子は、周知のガン遺伝子である。ＭＤＭ−２蛋白は、ｐ５３蛋白と複合体を形成し、それは、ユビキネーション経路によりｐ５３蛋白の分解を生ずる。ｐ５３蛋白は、ｐ５３蛋白の残基１４〜２２（インバリアント）を含むアミノ酸配列を使用してＭＤＭ−２蛋白に結合する。ｐ５３蛋白の全ＭＤＭ−２蛋白結合ドメインは、残基１２〜２６に及ぶ。（非特許文献２）。
【０００６】
【非特許文献２】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ＆Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０
【０００７】
ＭＤＭ−２蛋白が周知のガン遺伝子の発現生成物であることを考えて、ＭＤＭ−２蛋白が非常に重要な調節蛋白であることは驚くにあたらない。その上、ＭＤＭ−２蛋白の過剰発現または増幅は、ヒト乳房腫瘍の５０％を含むヒトの悪性の４０〜６０％に見いだされている。ｐ５３蛋白とＭＤＭ−２蛋白との間の複合体の形成が、ｐ５３蛋白の転写活性の阻害を生じ、そのためｐ５３蛋白の活性化ドメインまたはそのなかのＤＮＡ結合部位のブロックによる分子の抗腫瘍作用を生ずることが示唆されている。さらに一般的に、これらおよび他の実験の観察は、ｐ５３蛋白の抗腫瘍作用が、ｐ５３蛋白へのＭＤＭ−２蛋白の結合を干渉できるペプチドによって増強されるかもしれないことを示唆していると解釈されてきている。事実、多数の研究が、ＭＤＭ−２／ｐ５３複合体が合理的なドラッグデザインの標的であるかもしれないことを示唆している。（非特許文献３）および（特許文献１）参照。
【０００８】
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｗａｓｙｌｙｋ ｅｔａｌ．，「ｐ５３ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅａｔｈ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＤＭ２ ｂｙ ａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＤＭ２ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ５３」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，１９２１−３４（１９９９）
【特許文献１】米国特許５７７０３７７
【０００９】
広範囲のスペクトルの細胞に感染するアデノウイルスの能力およびその高い感染能力は、それをガン治療の顕著な候補者にしている（非特許文献４）。アデノウイルスは、二十面体のキャプシドからなる。ウイルスのゲノムを包んでいるキャプシドは、３つの主な蛋白すなわちヘキソン、ペントン塩基そしてこぶ状になった繊維からなる。さらに、いくつかの小さい蛋白、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２並びにウイルスをエンコードしたプロテアーゼも存在する。ウイルスのゲノムは、長い末端の繰り返し（ＬＴＲ）を有する５’末端に共有結合で結合した末端蛋白を有する線状の二本鎖ＤＮＡである。ＤＮＡは、また蛋白ＶＩＩおよびｍｕとして周知のペプチドと伴生している（非特許文献５）。アデノウイルスのゲノムは、３つの機能的なカテゴリーにさらに分類でき、初期の遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４蛋白についてエンコードする）、遅滞遺伝子および単一の主な後期のユニットである。ＤＮＡ複製、ウイルス遺伝子の転写、宿主細胞の免疫抑制および宿主細胞のアポトーシスの阻害は、初期遺伝子生成物に起因する。後期遺伝子の生成は、ウイルスアセンブリを必要とする（非特許文献６）。
【００１０】
【非特許文献４】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【非特許文献５】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【非特許文献６】Ｗａｎｇ Ｉ．Ｉ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｉ．Ｉ．（２０００）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｉｙ Ｔｏｄａｙ ５，１０−１６
【００１１】
アデノウイルスの感染性サイクルは、初期の相および後期の相で規定できる。初期の相は、宿主細胞中へのウイルスの侵入次に核中へのウイルスゲノムの移動および初期遺伝子の選択的転写および翻訳をカバーする（非特許文献７）。これらの初期の事象では、ウイルスは、後期の遺伝子の翻訳を導くウイルスＤＮＡの複製を助けるために、宿主細胞の機能を引き継ぐ。細胞の屈性における主要なファクターは、受容体の認識である。蛋白のこぶ状になった繊維は、高い親和性で、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）として周知の細胞表面の受容体に結合する。細胞の感染は、先ずこぶ状になった繊維のＣＡＲへの結合により開始される。ウイルスのインターナリゼーションは、表面のインテグリン−蛋白（細胞接着、細胞−細胞結合および他の細胞−細胞関連現象における細胞外マトリックスに含まれる）へのペントン塩基の追加の結合を含む（非特許文献８）、（非特許文献９）。多数のシグナル経路が、次に誘導され、ウイルス粒子のクラスリン仲介エンドサイトーシスを助ける。エンドサイトーシスは、ウイルス粒子の陥入、次にエンドサイトーシス小胞の発生を生ずるプラズマ膜の切り取りを含む。ウイルスをエンコードするプロテアーゼは、次に構造蛋白ＶＩの分解によりウイルスキャプシドを分裂させる。ウイルスは、次に核膜に移動し、そこでゲノムは核中に入り、最初の転写を導く。ウイルスゲノムは、細胞蛋白ｐ３２の助けにより宿主の核に近づくことができると思われる。ｐ３２は、主としてミトコンドリアに見いだされるが、また核にも存在する。蛋白は、ミトコンドリアと核との間の細胞内シャトルとして働く。ウイルスは、核へ近づくためにこの細胞内シャトルシステムを支配できるように見える（非特許文献１０）。
【００１２】
【非特許文献７】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【非特許文献８】Ｍａｔｈｉａｓ，Ｐ．，Ｇａｌｌｅｎｏ，Ｍ．＆Ｎｅｒｎｅｒｏｗ，Ｇ．Ｒ．（１９９８）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｌｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖ β５ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，３３６５−３３７４．
【非特許文献９】Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ，Ｗｉｎｉｔｚ，Ｓ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅｓｓ，Ｓ．，Ｒｅｎ，Ｘ．Ｄ．，Ｒｅｎｓｈａｗ，Ｍ．Ｗ．＆Ｓｃｈｗａｒｔｚ；Ｍ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １７，２０７−２２０．
【非特許文献１０】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【００１３】
低い病的状態および高いレベルのトランス遺伝子発現は、アデノウイルスを機能的な研究において非常に魅力的なベクターにする。しかし、生体内の免疫反応の優越性は、ベクターの実際的な展開において制限ファクターである。トランス遺伝子発現の持続時間は、生体内では、感染した細胞に向かう宿主の抗アデノウイルス免疫反応により大幅に制限される（非特許文献１１）。上皮細胞は、例えば、アデノウイルス感染を阻害する抗細菌性ペプチドを放出できる（非特許文献１２）。他の防御機構は、感染初期におけるインターフェロンとして周知の細胞性蛋白の放出を含む。インターフェロンは、細胞のＪａｋ／ＳＴＡＴ経路を活性化し、それは感染された細胞を排除しそして感染から健康な細胞を保護できる一連の遺伝子生成物の転写を制御するインターフェロン反応要素の活性化を生ずる（非特許文献１３）。ＭＨＣクラスＩ抗原の範囲における感染された細胞の表面に存在するウイルス抗原のＴ細胞の認識は、細胞毒性Ｔ細胞からのパーフォリンの移動および感染された細胞の溶解を生ずる。ウイルスの活性は、またプログラムされた細胞死を導くアポトーシス経路を生ずる。特にガン治療では、その目的がすべての形質転換された細胞を排除することであるが、免疫反応の活性化が望ましい作用である。
【００１４】
【非特許文献１１】Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｎｕｎｅｓ，Ｆ．Ａ．，Ｂｅｒｅｎｃｓｉ，Ｋ．，Ｆｕｒｔｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｇｏｎｃｚｏｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４，９１：４４０７−４４１１：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｌｉｍｉｔｓ Ｅｌ−ｄｅｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ
【非特許文献１２】Ｇｒｏｐｐ，Ｒ．，Ｆｒｙｅ，Ｍ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｏ．＆Ｂａｒｇｏｎ，Ｊ．（１９９９）．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ ｉｍｐａｉｒ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｄｅｉｏｖｉｒｕｓ−ｒｎｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｘ，９５７−９６４
【非特許文献１３】Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ，Ｓ．，Ｄｉｄｃｏｃｋ，Ｌ．＆Ｒａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｅ．（２０００）．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１，２３４１−２３６５
【００１５】
腫瘍サプレッサーｐ５３は、アポトーシスおよび細胞サイクル阻止において主要な役割をはたす（非特許文献１４）。この蛋白は、Ｂａｘのような抗増殖蛋白の転写を制御する。Ｂａｘは、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を刺激し、それはアダプター蛋白Ａｐａｆ−１および全複合体に結合し、次にプロカスパスを活性化して細胞死を導く（非特許文献１５）。ｐ５３は、腫瘍蛋白マウスダブルマイニュート２、ｍｄｍ２により制御される。ｍｄｍ２は、ｐ５３蛋白と複合体を形成でき、そのユビキチン化およびプロテアソームによるその分解を導く（非特許文献１６）。ｐ５３は、細胞に生ずるかもしれないコントロールされない細胞の増殖および突然変異のような危険な事象からの保護をもたらす。防御性ｐ５３遺伝子は、細胞について多数の有害な結果を有する。ｐ５３を欠く細胞または突然変異したｐ５３を含む細胞は、アポトーシスを回避できそしてそれらの増殖を続ける。これらの細胞内のＤＮＡ損傷は、それぞれの新しい部分に蓄積し、一方細胞はそれらを修復できない。従って、ｐ５３の機能の損失は、ガンの発生に密接に関連している。ｐ５３の機能の損失により、突然変異細胞は、細胞サイクルを通してアポトーシスそしてそれらが分裂するときガン促進突然変異の蓄積を回避し続けることができる（非特許文献１７）。
【００１６】
【非特許文献１４】Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．，Ｌｅｗｉｓ Ｊ．，ＲａｆｆＭ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．（２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ
【非特許文献１５】Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．，Ｌｅｗｉｓ Ｊ．，ＲａｆｆＭ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．（２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ
【非特許文献１６】Ｕｃｈｉｄａ Ｔ．，Ｍｉｎｅｉ Ｓ．，Ｇａｏ，Ｊ．，Ｗａｎｇ Ｃ．，Ｓａｔｏｈ Ｔ．，Ｂａｂａ Ｓ．（２００２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆｐ５３，ＭＤＭ２ ａｎｄ ｂｃｌ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｄｄｅｒ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：２５３−２５９
【非特許文献１７】Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．，Ｌｅｗｉｓ Ｊ．，ＲａｆｆＭ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．（２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ
【００１７】
ｐ５３遺伝子の突然変異並びに広範囲のヒトの腫瘍の発生へのその関連は、野生型ｐ５３を配合したベクターの開発を促している。これらのベクターは、未分化甲状腺ガン、ヒト悪性グリオームおよび乳ガンについて生体外および生体内でテストして成功している（非特許文献１８）。
【００１８】
【非特許文献１８】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
悪性または形質転換された細胞を選択的に殺すペプチドを提供することに加えて、本発明は、これらのペプチドをコードするトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を配合するアデノウイルスベクター（ＡｄＶ）を提供する。これらのベクターを悪性および形質転換された細胞への投与は、これら細胞の死を生ずる。目的のＡｄＶ発現伝達体は、膵臓ガンを含む異なる潰瘍性疾患を治療するのにそれらの抗増殖性について特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体を提供し、該ペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、膜浸透リーダー配列に融合しそして悪性または形質転換した細胞を選択的に死に至らしめる。
【００２１】
これらペプチドの例は、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはそのアナログまたは誘導体、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはそのアナログまたは誘導体、ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログまたは誘導体である。細胞膜を通って輸送されそして悪性または形質転換された細胞を選択的に殺すために、リーダー配列は、好ましくは、ペプチド、そのアナログまたは誘導体のカルボキシル末端に位置する。好ましくは、リーダー配列は、主として正の電荷を有するアミノ酸残基からなる。本発明に従って使用できるリーダー配列の例は、ペネトラチン、Ａｒｇｓ、ＨＩＶ１のＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｒ−ＴＡＴ、ＳＶ４０−ＮＬＳ、ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ、ＨＩＶ ＲＥＶ（３４−５０）、ＦＨＶコート（３５−４９）、ＢＭＶ ＧＡＧ（７−２５）、ＨＴＬＶ−ＩＩＲＥＸ（４−１６）、ＣＣＭＶ ＧＡＧ（７−２５）、Ｐ２２Ｎ（１４−３０）、ラムダＮ（１−２２）、デルタＮ（１２−２９）、酵母ＧＣＮ４、およびｐ−ｖｅｃを含むが、これらに限定されない。好ましくは、リーダー配列は、アミノ酸配列ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）を有するアンテナペディア蛋白からのペネトラチン配列である。
【００２２】
製薬上許容できる担体と混合された本発明のペプチドの少なくとも１つを含む製薬組成物も提供される。さらに、患者の潰瘍性疾患を治療するすなわち患者の悪性または潰瘍性細胞を選択的に殺す方法が提供される。１つの態様では、方法は、患者に、治療上有効な量のアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体を投与し、該ペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、そのカルボキシル末端で膜浸透リーダー配列に融合しそして悪性または形質転換した細胞を選択的に死に至らしめる。他の態様では、方法は、患者に、治療上有効な量の配列番号１、配列番号２または配列番号３に示される配列を有する少なくとも１つのペプチドまたはそのアナログまたは誘導体を投与することであり、膜浸透リーダー配列は、ペプチド、そのアナログまたは誘導体のカルボキシル末端に融合する。
【００２３】
本発明は、また本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーターからなる複製不能アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターを提供する。複製不能ＡｄＶの例は、例えば、欠失したＥ１およびＥ３遺伝子を有するＡｄＶを含む。１つの態様では、ペプチドがアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体からなる、本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーターからなる複製不能ＡｄＶベクターが提供される。例えば、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーター配列からなる複製不能ＡｄＶベクターが提供される。本発明の他の態様では、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーター配列からなる複製不能ＡｄＶベクターが提供される。本発明のなお他の態様では、アミノ酸配列ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーター配列からなる複製不能ＡｄＶベクターが提供される。
【００２４】
本発明の他の構成では、患者の悪性または潰瘍性細胞を選択的に殺す方法を提供する。方法は、患者に、前記のペプチドの任意のものまたはそのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーターからなる本発明の複製不能ＡｄＶベクターの治療上有効な量を投与することからなる。好ましくは、悪性または潰瘍性細胞は、膵臓ガン細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明によれば、悪性および形質転換した細胞が、単一の連続するポリペプチド鎖としてｐ５３蛋白内のアミノ酸の配列およびリーダー配列からなる合成ペプチドの投与により選択的に破壊されることが見いだされた。作用の機構は、ｐ５３ペプチドがｐ５３蛋白を全く生成しない形質転換した細胞を選択的に殺すので、ＭＤＭ−２蛋白に結合しているｐ５３蛋白に無関係なように思われる。ｐ５３ペプチドは、また正常の細胞を殺すことなく正常または高レベルのｐ５３蛋白を発現する悪性および形質転換した細胞を選択的に殺す。
【００２６】
本発明によれば、ヒトｐ５３のアミノ酸残基１２−２６のすべてまたは一部に相当するペプチドからなる組成物が提供される。この領域は、ｈｄｍ−２およびｍｄｍ−２蛋白と接触しそしていずれかの蛋白に結合したときα−らせん構造をとることが知られている。膜浸透リーダー配列によりカルボキシ末端に融合するとき、本発明のペプチドは、悪性および形質転換したヒト細胞を選択的に殺す。
【００２７】
本発明の第一の構成では、以下のアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドが提供され、少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドは、リーダー配列に融合する。好ましくは、ペプチドは、少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸残基からなる。好ましい態様では、配列番号１に示される配列の少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸からなるペプチドは、以下のアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）を有する。他の好ましい態様では、配列番号１に示される配列の少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸からなるペプチドは、以下のアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）を有する。なお他の態様では、配列番号１に示される配列の少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸からなるペプチドは、以下のアミノ酸配列ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を有する。
【００２８】
本発明のペプチドを細胞に運ぶ機能のリーダー配列は、種々の源から由来する。好ましくは、リーダー配列は、正の電荷を有するリーダー配列が本発明のペプチドのアルファらせんを安定化するために、圧倒的に正の電荷を有するアミノ酸残基からなる。本発明のペプチドに結合するリーダー配列の例は、（非特許文献１９）に記載されており、以下の膜浸透リーダー配列を含むが、これらに限定されない（蛋白のリーダー配列を構成しているアミノ酸残基の数は、多くの場合、蛋白の名の直後にかっこで示されている）。ペネトラチン（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ）（配列番号４）；（Ａｒｇ）８または（Ｒ）４−（Ｒ）１６からの任意のポリ−Ｒ；ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４７−６０）（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５）；Ｄ−ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号６）；Ｒ−ＴＡＴ Ｇ（Ｒ）９ＰＰＱ（配列番号７）；ＳＶ４０−ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号８）；ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＩＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号９）；ＨＩＶ ＲＥＶ（３４−５０）−（ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）（配列番号１０）；ＦＨＶ（３５−４９）コート−（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ）（配列番号１１）；ＢＭＶ ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）（配列番号１２）；ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲＥＸ４−１６−（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ）（配列番号１３）；ＣＣＭＶ ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ）（配列番号１４）；Ｐ２２Ｎ（１４−３０）（ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ）（配列番号１５）；ＬＡＭＢＤＡ Ｎ（１−２２）（ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ）（配列番号１６）；ＰｈｉＮ（１２−２９）（ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ）（配列番号１７）；ＹＥＡＳＴ ＰＲＰ６（１２９−１２４）（ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ）（配列番号１８）；ＨＵＭＡＮ Ｕ２ＡＦ（ＳＱＭＴＲＱＡＲＲＬＹＶ）（配列番号１９）；ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＦＯＳ（１３９−１６４）ＫＲＲＩＲＲＥＲＮＫＭＡＡＡＫＳＲＮＲＲＲＥＬＴＤＴ（配列番号２０）；ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＪＵＮ（２５２−２７９）（ＲＩＫＡＥＲＫＲＭＲＮＲＩＡＡＳＫＳＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ）（配列番号２１）；ＹＥＡＳＴ ＧＣＮ４（ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ）（配列番号２２）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２３）；ｐ−ｖｅｃ ＬＬＩＩＲＲＲＩＲＫＱＡＫＡＨＳＫ（配列番号２４）。他の膜浸透リーダー配列も使用できる。これらの配列は、非常に容易に入手でき、そして例えば（非特許文献２０）および（非特許文献２１）に記載されている。
【００２９】
【非特許文献１９】Ｓｃｈｅｌｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６０４３−６０４９
【非特許文献２０】Ｅｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６９：２３７−２４４
【非特許文献２１】Ｅｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６９：２３７−２４４
【００３０】
好ましくは、アンテナペディア蛋白のペネトラチンリーダー配列の正の電荷を有するリーダー配列が使用される。このリーダー配列は、以下のアミノ酸配列を有する。ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）。好ましくは、リーダー配列は、ｐ５３ペプチドのカルボキシル末端に付着して、合成ペプチドが形質転換した悪性の細胞を殺すことができる。
【００３１】
構造的に関連のあるアミノ酸配列は、本発明を実施するに当たって、配列番号１、２、３または４に示される開示された配列の代わりをすることができる。それらのアナログまたは誘導体を含む配列番号１、２または３に記載される任意の配列は、配列番号４に記載される配列を含むがこれに限定されないリーダー配列と結合するとき、本明細書では、「合成ペプチド」または「複数の合成ペプチド」と呼称される。これらの合成ペプチドの三次元構造を真似る固定した分子は、ペプチド類似物とよばれ、そしてまた本発明の範囲内に含まれる。ｐ５３ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端の何れかまたはそれらの両者でのアルファらせん安定化アミノ酸残基を、それがＭＤＭ−２蛋白に結合するとき、ｐ５３蛋白のこの領域の立体配座であることが知られているアルファらせん立体配座を安定化するために添加できる。アルファらせん安定化アミノ酸の例は、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ（特にらせんのアミノ末端において）、ＭｅｔおよびＰｈｅを含む。
【００３２】
本発明のペプチドのアミノ酸挿入誘導体は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列の変異型は、ランダムな挿入も得られる生成物の好適なスクリーニングにより可能であるが、本発明のペプチドにおける予定された部位中に１つ以上のアミノ酸残基が誘導されるものである。欠失変異型は、本発明のペプチドの配列から１つ以上のアミノ酸を除くことにより生成できる。置換アミノ酸変異型は、配列中の少なくとも１つの残基が除かれそして異なる残基がその位置に挿入されているものである。代表的な置換は、以下の表１に従って生成されるものである。
【００３３】
【表１】
【００３４】
合成ペプチドがアミノ酸置換により誘導されるとき、アミノ酸は、一般に、同様な性質例えば疎水性、親水性、電気陰性、かさ高な側鎖などを有する他のアミノ酸によって置換される。本明細書で使用されるとき、用語「誘導体」、「アナログ」、「フラグメント」、「部分」および「同様な分子」は、該誘導体、アナログ、フラグメント、部分または同様な分子が形質転換したまたは新生物の細胞に入りそして選択的に殺す能力を維持する限り、アミノ酸置換、挿入、付加または欠失を有する配列番号１、２、３または４に示されるようなアミノ酸配列を有する本発明のペプチドをいう。
【００３５】
本発明の合成ペプチドは、多数の周知の技術により合成できる。例えば、ペプチドは、（非特許文献２２）により最初に記述された固相技術を使用して製造できる。他のペプチド合成技術は、（非特許文献２３）および当業者が容易に入手できる他の参考文献に見いだすことができる。ポリペプチドの合成技術の要約は、（非特許文献２４）に見いだすことができる。ペプチドは、また（非特許文献２５）に記述されたように溶液法により合成できる。異なるペプチド合成に使用される適切な保護基は、上記のテキスト並びに（非特許文献２６）に記述されている。本発明のペプチドは、またｐ５３蛋白の大部分からまたはｐ５３蛋白全体から化学または酵素による切断によって製造できる。同様に、本発明の合成ペプチドで使用されるリーダー配列は、これらのリーダー配列が由来する蛋白の大部分または蛋白全体からの化学または酵素による切断により製造できる。
【００３６】
【非特許文献２２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）
【非特許文献２３】Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ．ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第二版（１９７６）
【非特許文献２４】Ｊ．Ｓｔｒｕｒａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．，（１９８４）
【非特許文献２５】Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＩＩ巻、第三版、Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）
【非特許文献２６】Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）
【００３７】
さらに、本発明のペプチドは、また組み換えＤＮＡ技術により製造できる。蛋白をつくるのに使用されるほとんどのアミノ酸では、１つより多いコーディングヌクレオチドトリプレット（コドン）は、特別のアミノ酸残基についてコードする。遺伝コードのこの性質は、重複性として周知である。そのため、多数のヌクレオチド配列は、悪性および形質転換した哺乳動物の細胞を選択的に殺す特別の本発明のペプチドについてコードできる。本発明は、またそれから本発明のペプチドが酵素的または化学的に切断されるキメラペプチドまたは本発明のペプチドをコードするすなわち発現できる遺伝子を規定するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包含する。
【００３８】
培地で成長する細胞に適用されるとき、合成ペプチドは、悪性または形質転換した細胞を選択的に殺し、細胞の数を投与量に依存して低下させる。効果は、２時間内または３時間内そしてせいぜい４８時間内で一般に観察できる。培地で成長したラットの膵臓腺房細胞の系（ＢＭＲＰＡ．４３０）は、Ｋ−ｒａｓにより形質転換された。正常の細胞系は、膵臓腺房細胞に典型的な構造を示し、形質転換した細胞（ＴＵＣ−３）は、腺房細胞の文化した形態を欠き、典型的な膵臓ガン細胞と思われる。ＢＭＲＰＡ．４３０細胞が、リーダー配列番号４にカップリングした配列番号１の一次構造を有する合成ペプチドにより５０μｇ／ｍＬの投与量で処理されたとき、細胞は影響されなかった。しかし、ＴＵＣ−３細胞が、リーダー配列番号４にカップリングした配列番号１の一次構造を有するペプチドにより１００μｇ／ｍＬの投与量で処理されたとき、それらは３−４日以内に死んだ。同様な結果は、同じ実験が行われたが配列番号１が配列番号２または配列番号３の何れかにより置換されたとき、得られた。さらに、形質転換したおよび悪性の細胞の死は、リーダー配列番号にカップリングした配列番号１の一次構造を有する合成ペプチドにより１００μｇ／ｍＬの投与量で処理されたヒト乳ガン細胞系および黒色腫およびＨｅｌａ細胞について観察された。対照的に、同じ投与量で同じ合成ペプチドは、非悪性および非形質転換したヒト胸部または繊維芽細胞系に対してなんら作用しなかった。
【００３９】
配列番号４に示されるリーダー配列がＰＮＣ２９すなわち以下のアミノ酸配列ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有するコントロール蛋白のカルボキシ末端に位置したとき、悪性または正常の細胞になんら作用しなかった。
【００４０】
さらに、配列番号４に示されるリーダー配列へカルボキシ末端で融合した配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、成長因子の存在下造血細胞系に分化するヒト幹細胞の能力になんら作用しない。これは、このペプチドが、化学治療薬として投与されるとき、骨髄細胞に有害ではないことを示している。（非特許文献２７）参照。この記述は、十分に示されるならば、本明細書に参考として引用される。
【００４１】
【非特許文献２７】Ｋａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ．ａｌ．，（２００１年１０月２３日）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（２２）：１２４３８−１２４４３
【００４２】
培養されたガン細胞が、１００μｇ／ｍＬの投与量で、結合したリーダー配列なしの配列番号１の一次構造を有するペプチドにより処理されたとき、細胞は影響されなかった。同様に、培養されたガン細胞が、同じ投与量で、リーダー配列番号４すなわち現在好ましいリーダー配列により処理されたとき、細胞は、また影響されなかった。これらの結果は、合成ペプチドのリーダー配列が合成ペプチドを処理された細胞の細胞膜を通ることを可能にすることを示し、そして合成ペプチドの作用が必ず細胞内であることを示している。
【００４３】
合成ペプチドが、ｐ５３蛋白およびＭＤＭ−２蛋白の結合と干渉することにより働いたかどうかを決定するために、合成ペプチドは、ホモ接合の欠失によりｐ５３蛋白を作ることができなくされた形質転換した結腸直腸腺ガン細胞についてテストされた。驚くべきことに、合成ペプチドは、形質転換した細胞を選択的に殺すが、正常な細胞に対して作用しなかった。これらの結果は、作用のメカニズムが、ＭＤＭ−２蛋白に結合したｐ５３蛋白に関係がないように見える。それは、ｐ５３ペプチドが、ｐ５３蛋白を全く生成しない形質転換した細胞を選択的に殺すからである。これらの結果は、ＭＤＭ−２蛋白へのｐ５３蛋白の結合との干渉が、それにより合成ペプチドが悪性および形質転換した細胞の選択的死を生じさせるメカニズムではないことを示している。本明細書で開示された合成ペプチド、それらの誘導体、アナログおよびペプチド類似分子は、ガンのような新生物疾患の治療に有用であるが、形質転換および悪性の細胞に対する作用メカニズムは、見いだされていない。
【００４４】
本発明のペプチドは、生体内で新生物細胞に対して有効である。例えば、膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３を異種移植されしかも約３−６ｍｍの発育した腫瘍サイズを有するマウスは、本発明の合成ペプチド、例えばカルボキシ末端でリーダー配列に融合した配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するペプチドの投与後、これらの腫瘍のサイズを劇的に低下させる。
【００４５】
本発明のペプチドの観察された性質と一致して、本発明のペプチドは、新生物または悪性の細胞すなわち動物殊にヒトのガン細胞を選択的に殺すのに使用できる。本発明の合成ペプチドは、従って有効量で投与されて、患者のヒトまたは動物の新生物細胞を殺す。
【００４６】
本発明の合成ペプチドは、好ましくは、製薬上許容できる担体とともに本発明による少なくとも１つの合成ペプチドを治療上有効な量で含む製薬組成物としてヒトの患者に投与できる。用語「治療上有効量」または「製薬上有効量」は、新生物または悪性の細胞すなわちガン細胞を選択的に殺すことを含む抑制された成長を個体に生成するのに必要な投与量を意味する。
【００４７】
好ましくは、本発明の１つ以上の合成ペプチドを含む組成物は、新生物細胞を選択的に殺す従って新生物または悪性の疾患例えばガンを治療する目的で静脈内に投与される。本発明の１つ以上のペプチドを使用して有効に治療できる異なるガンの例は、乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、子宮頸ガン、結腸ガン、黒色腫、膵臓ガンおよびすべての固形組織腫瘍（上皮細胞腫瘍）を含むがこれらに限定されず、そしてリンパ腫および白血病を含むがこれらに限定されない血液のガンを含む。
【００４８】
本発明の合成ペプチドの投与は、経口、静脈内、鼻孔内、直腸内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下の投与によりまたは注入または埋め込みによる。これらの方法で投与されるとき、本発明の合成ペプチドは、他の成分例えば担体および／または助剤と組み合わせることができる。他の成分の性質には制限がないが、ただしそれらは製薬上許容でき、それらの目的とする投与に有効でなければならず、組成物の活性成分の活性を低下させてはならずそして本発明のペプチドの細胞中への移入を妨げてはならない。ペプチド組成物は、また好ましくは、それからパッチまたは挿入物が、本発明の合成ペプチドの１つ以上を治療上有効な量で時間依存で放出する液状または半液状の皮膚伝達パッチに含浸でき、または皮下挿入物に含まれることができる。
【００４９】
注射に好適な製薬の形は、滅菌の注射可能な溶液または分散物の即時の調製のための滅菌粉末、および滅菌溶液または分散物を含む。最終の溶液の形は、すべての場合で、滅菌かつ流体でなければならない。典型的な担体は、例えば水緩衝した水溶液すなわち生体適合性緩衝液、エタノール、ポリオール例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、これらの好適な混合物、界面活性剤または植物油を含む溶媒または分散媒体を含む。滅菌は、濾過または抗菌剤または抗かび剤の添加を含むがこれらに限定されない任意の当該技術に認められている方法を利用して達成できる。これらの剤の例は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールを含む。等張剤例えば砂糖または塩化ナトリウムも本発明の組成物中に配合できる。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「製薬上許容できる担体」は、任意かつすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗かび剤、等張剤などを含む。これらの媒体および剤の使用は、当業者に周知である。
【００５１】
本発明の合成ペプチドを含む滅菌の注射可能な溶液の製造は、必要に応じ上記の種々の成分の１つ以上を含む適切な溶媒中に、必要な量で上記の本発明の合成ペプチドの１つ以上を配合し、次に滅菌好ましくは濾過滅菌により達成される。滅菌粉末を得るために、上記の溶液は、必要に応じ真空乾燥または凍結乾燥される。
【００５２】
不活性希釈剤および／または同化可能な可食性の担体などは、ペプチドが経口的に投与されるとき、製薬組成物の一部にできる。製薬組成物は、ハードまたはソフトのゼラチンカプセル中に存在するか、または錠剤に打錠されるかまたはエリキシル、懸濁物、シロップなどに製造される。
【００５３】
本発明の合成ペプチドは、従って治療上有効な投与量で好適な製薬上許容できる担体ともに製薬上有効な量で好都合かつ有効な投与に製造される。製薬上有効な量の例は、少なくとも約２５μｇ／ｍＬから少なくとも約３００μｇ／ｍＬの範囲のペプチド濃度を含む。
【００５４】
ヒトに適用される本発明の方法で使用されるべき合成ペプチドの精密な治療上有効な量は、新生物疾患の段階、腫瘍のサイズおよび強さ、転移の存在または程度などの変動により述べることができない。さらに、個体の体重、性別および全体の健康は、考慮されねばならずそして投与量に影響するだろう。しかし、本発明の合成ペプチドが１投与あたり少なくとも約１０ｍｇの量、さらに好ましくは１投与あたり約１０００ｍｇまでの量で投与されることが、一般に述べることができる。本発明のペプチド組成物は最終的に血流から排除されるので、製薬組成物の再投与が指示され好まれる。
【００５５】
本発明の合成ペプチドは、投与処方と適合するやり方でそして治療上有効である量で投与できる。合成ペプチドは、年齢、体重および患者の症状および投与の経路に依存する。ヒト成人への投与の好適な投与量の例は、体重１ｋｇあたり約０．１〜約２０ｍｇに及ぶ。好ましくは、投与量は、体重１ｋｇあたり約０．１〜約１０ｍｇである。
【００５６】
本発明によって、また新生物疾患を治療する方法が提供される。方法は、この治療を要する患者に、そのアナログおよび誘導体を含む上記の合成ペプチドを治療上有効な量で投与することからなる。従って、例えば、１つの態様では、リーダー配列へそのカルボキシ末端で融合した配列番号１に示される少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与される。他の態様では、リーダー配列へそのカルボキシ末端で融合した配列番号１に示される少なくとも約８から少なくとも約１０の連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与される。例えば、リーダー配列へそのカルボキシ末端で融合した配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与される。リーダー配列へそのカルボキシ末端で融合した配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与できる。なお他の態様では、リーダー配列にそのカルボキシ末端で融合した配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与できる。治療法によれば、合成ペプチドの混合物が投与できる。従って、例えば、有効な量で上記のペプチドまたはそのアナログまたは誘導体の１つを投与することに加えて、２つ以上の上記のペプチドまたはアナログまたは誘導体の混合物が患者に投与できる。
【００５７】
本発明の他の構成では、上記で十分に記述された、複製不能アデノウイルス（ＡｄＶ）を含みそして本発明のペプチドのためのコーディング配列に実施可能に結合したプロモーター配列例えば上記のペプチドすなわち配列番号１、配列番号２，配列番号３またはそれらのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列を有する発現媒体が提供される。上記のように、１つより多いトリプレット（コドン）は、特定のアミノ酸残基についてコードできる。表２は、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されたアミノ酸配列をエンコードするのに使用できるコドンの異なる組み合わせを示す。配列番号１のアミノ酸配列は、太字で表の一番上のラインに示される。配列番号２および配列番号３の両者のアミノ酸配列は、この太字の部分内に見いだすことができる。表２の太字のヌクレオチド配列は、ＰＮＣ−２８ＥＧのヌクレオチド配列に相当する。
【００５８】
【表２】
【００５９】
配列番号１、２または３に示されるアミノ酸配列のアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列を使用するには、当業者は、遺伝コードの表を参照して適切なコドンを選ぶことができる。
【００６０】
Ａｄの多数の異なるクラスが存在し、そして本発明の方法で使用できる。これらのＡｄベクターは、文献に記載されておりそして容易に入手できる。例えば、（非特許文献２８）、（非特許文献２９）参照。例えば、本発明によれば、Ｅ１および／またはＥ３遺伝子が除かれたＡｄベクターが使用でき、異種プロモーターのコントロールの下約６．５ｋｂまでのトランス遺伝子の導入を可能にする。（非特許文献３０）。欠陥Ｅ１ウイルスは、Ｅ１相補細胞系例えば２９３Ａ細胞（Ｅ１遺伝子をトランスでもたらす）で増殖できる。
【００６１】
【非特許文献２８】Ｂｒａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｇａｕｌｄｉｅ，Ｊ．；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ １９９５，６：５９０−５９５：Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ
【非特許文献２９】Ｈｉｔｔ，Ｍ．Ｍ．，Ａｄｄｉｓｏｎ，ＣＬ．ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．；Ａｄｖ．ＰｈａｒｍａｃｏＬ １９９６，４０：１３７−２０６：Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．
【非特許文献３０】Ｇｒａｈａｍ ＦＬ．Ｓｍｉｌｅｙ．Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．，ａｎｄ Ｎａｒｉｎ，Ｒ．（１９７７）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｔｒａｓｎｆｏｒｍ３ｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５．Ｊ．Ｇｅｎ．ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７４．
【００６２】
別に、Ｅ１およびＥ３遺伝子を欠くことに加えてまたＥ２遺伝子を欠くＡｄベクターが使用できる。例えば、（非特許文献３１）および（非特許文献３２）参照。
【００６３】
【非特許文献３１】Ｌｕｓｋｙ，Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｅｌ，Ｅ１／Ｅ２Ａ，ｏｒ Ｅ１／Ｅ４ ｄｅｌｅｔｅｄ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（３）：２０２２−３
【非特許文献３２】Ｏ’Ｎｅａｌ，Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８“Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｅ２ａ−ｄｅｌｅｔｅｄ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｌｐｈａｌ−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．９（１１）：１５９７−９８
【００６４】
さらに、ほとんどまたはすべてのＡｄコーディング配列を欠くヘルパー依存（ＨＤ）または実質を失った（ｇｕｔｔｅｄ）ベクターは、本発明に従って使用できる。これらのベクターは、治療遺伝子の長期にわたる発現が、マウスおよびモンキーで観察されているので、遺伝子治療用の遺伝子伝達ベクターとして大きな可能性を有する。組織培養におけるこれらの実質を失ったベクターの生成は、トランスの実質を失ったベクターの成長および組み立てに必要な蛋白を提供するために、相補的ヘルパーウイルスを要する。（非特許文献３３）、（非特許文献３４）、（非特許文献３５）参照。これらの文献およびそれらに引用されているすべての文献を、もし十分に示されているならば、参考として引用する。
【００６５】
【非特許文献３３】Ｃｈｅｎ，Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７“Ｐｅｒｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｌａｃｋｓ ａｌｌ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（４）：１４１４−１４１９
【非特許文献３４】Ｍｏｒｒａｌ，Ｎ．，ＲＪ Ｐａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）“Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｙｉｅｌｄ ｓｕｐｒａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｌｐｈａ １−ａｎｔｒｉｔｒｙｐｓｉｎ ｗｉｔｈ ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（１８）：２７０９−２７１６
【非特許文献３５】Ｍｏｒｒａｌ，Ｏ’Ｎｅａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９“Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｆｏｒ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ．“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（２２）：ｌ２８１６−１２８２１
【００６６】
上述のように、新生物疾患例えばガンのウイルス治療に関する本発明では、治療の目的が目標組織の取り除きである場合、ベクター感染細胞を目標とする宿主抗Ａｄ免疫反応が望ましいと考えられている。従って、実質を失ったＡｄベクターは、宿主のより強い免疫反応を誘発する初期の世代のいくつかと同様に、好ましくない。
【００６７】
Ａｄベクターは、２つのプラスミド系、すなわちエントリープラスミド、並びに上記のペプチド（配列番号１−３）およびそのアナログまたは誘導体の１つをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーターを含むＥ１およびＥ３遺伝子欠失アデノウイルスゲノムから作られたデスチネーションベクターに基づく。２つのプラスミド系は、（非特許文献３６）、（非特許文献３７）、および（非特許文献３８）に十分に記載されている。Ｅ１およびＥ３の遺伝子欠失により、ウイルスは、Ｅ１およびＥ３蛋白を発現しない細胞を複製することを妨げられる。
【００６８】
【非特許文献３６】Ｇｒａｈａｍ ＦＬ．Ｓｍｉｌｅｙ．Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．，ａｎｄ Ｎａｒｉｎ，Ｒ．（１９７７）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｔｒａｓｎｆｏｒｍ３ｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５．Ｊ．Ｇｅｎ．ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７４
【非特許文献３７】Ｋｏｚａｒｓｋｙ，ＫＦ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ （１９９３） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｒｏｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３，４９９−５０３
【非特許文献３８】Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ Ｖ，ａｎｄ ＧｒａｈａｍＰＬ （１９９５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ Ｅｌ，Ｅ４，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＸ Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５ Ｍｕｔａｎｔｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６，１５７５−１５８６
【００６９】
例えば、エントリープラスミドは、そのプラスミドがラムダ組み換え反応によりＡｄＶ中にクローンされる本発明のペプチドをエンコードする遺伝子を含む。複製不能ベクターは、２９３Ａ細胞で増殖し、それはＡｄＶゲノムＤＮＡにより形質転換されたバイオエンジニアリングにより作られたヒト胚腎細胞である（非特許文献３９）。この細胞系は、ウイルス複製に必要な欠失遺伝子を補給する。
【００７０】
【非特許文献３９】Ｗａｎｇ Ｉ．Ｉ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｉ．Ｉ．（２０００）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖｅｉｙ Ｔｏｄａｙ ５，１０−１６
【００７１】
本発明の複製不能ＡｄＶベクターは、標準の組み換えＤＮＡ法を使用して構築できる。ベクターの構築のための標準の技術は、当業者に周知であり、そして文献例えば（非特許文献４０）、または非常に入手可能な組み換えＤＮＡ技術に関する多数の実験マニュアルの任意のものに見いだされる。種々の戦略は、ＤＮＡの連結フラグメントについて利用可能であり、その選択は、ＤＮＡフラグメントの末端の性質に依存しそして当業者によって容易に決定できる。本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合できる多数の異なるプロモーターが存在する。プロモーターは、本発明のＡｄＶベクターによる本発明の実施されるウイルス治療の細胞において機能しなければならない。本発明のＡｄＶベクターで使用できる多数の広く利用できるプロモーターが存在する。これらプロモーターの例は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＬＴＲ、ベータ−アクチン、ＥＦ−アルファ、Ｇａｌ−Ｅｌｂ、ＵｂＣ、ベータ−カゼイン、ＥＭ−７、ＥＦ、ＴＥＦ１、ＣＭＶ−２およびＢｓｄを含むが、これらに限定されない。好ましい態様では、プロモーターはＣＭＶである。
【００７２】
【非特許文献４０】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
【００７３】
組み換えベクターは、次に（非特許文献４１）Ｓｔｏｗ，Ｎ．Ｄ．１９８１（もし十分に示されるならば、参考として引用される）に記載されたような標準の方法を使用して未処理のウイルス中に再建される。未処理のウイルス中へ組み換えベクターを再建することを記述している他の文献は、（非特許文献４２）Ｃｒｏｕｚｅｔ Ｊ．Ｌ．Ｎａｕｄｉｎら、１９９７（また十分に示されるならば、参考として引用される）を含む。
【００７４】
【非特許文献４１】Ｓｔｏｗ，Ｎ．Ｄ．，１９８１，“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅｆｔ−ｈａｎｄ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：１７１−１８０
【非特許文献４２】Ｃｒｏｕｚｅｔ Ｊ，Ｌ．Ｎａｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，“Ｒｅｃｏｎｉｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（４）：１４１４−１４１９
【００７５】
一度本発明のＡｄＶベクターが構築されるならば、それは異なるタイプのガンにかかった患者を治療するのに使用できる。新生物疾患（ガン）の治療は、これらの疾患にかかった患者に、本発明のアデノウイルスベクターからなる組成物を投与することにより達成される。ガンにかかったヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物は、有効な抗新生物投与量の本発明のベクターを投与することにより治療できる。本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチドに実施可能に結合したプロモーターからなる本発明のＡｄＶベクターは、乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、子宮頸ガン、結腸ガン、黒色腫、膵臓ガンおよびすべての固形組織腫瘍（上皮細胞腫瘍）を含むがこれらに限定されず、そしてリンパ腫および白血病を含むがこれらに限定されない血液のガンを含む。好ましい態様では、治療されるガンは、膵臓ガンである。
【００７６】
感染性アデノウイルス粒子の懸濁物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下および局所を含む種々の経路により新生物組織に適用できる。他の経路は、霧としての吸入（例えば、肺ガンの治療）、または例えばもし必要ならば手術中または子宮頸ガンのような腫瘍部位を綿棒で塗るような直接の適用を含む。アデノウイルス懸濁物は、また例えば卵巣ガンを治療するための腹腔中への点滴により投与できる。他の好適な経路は、浣腸（結腸ガン）またはカテーテル（膀胱ガンの場合）により、腫瘍の塊例えば乳ガン中への直接の注射を含む。
【００７７】
実際の投与は、年齢、体重、ガンのタイプおよび進行度、１つ以上の腫瘍の位置、転移の存在および患者の全体の状態に基づいて患者ごとに異なる。しかし、１ｍＬあたり約１０３〜約１０１５またはそれ以上のビリオン粒子を含むアデノウイルス懸濁物が投与されると、一般にいわれる。ＡｄＶベクター懸濁物の再投与は、必要に応じ行われる。
【００７８】
本発明のＡｄＶベクターは、薬理学的に有効な量の１つ以上の本発明のＡｄＶベクターを含む滅菌組成物で混合される。一般に、組成物は、水性懸濁物中で約１０３〜約１０１５またはそれ以上のＡｄＶ粒子を含む。滅菌組成物は、通常、例えば水、緩衝された水、０．４％塩水、０．３％グリシンなどのような水溶液である。これら組成物は、例えば生理学的な条件を模倣するための製薬上許容できる補助物質、例えばｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含むことができる。組成物は、また本発明のＡｄＶベクターによる細胞の感染を増加する助剤を含むことができる。
【００７９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明しそしてその範囲を制限することを意味するものではない。
【実施例１】
【００８０】
以下の実験は、アミノ酸の末端に付着したリーダー配列を有する本発明のペプチドの有効性を比較するために行われた。上述したように、カルボキシ末端においてリーダー配列により合成されたペプチドは、ＭＤＭ−２に結合したとき、このペプチドのｐ５３部分の活性なコンホメーションであるペプチドのへリックスらせん形成を促進した。上述のように、配列番号１、２および３に示されたアミノ酸配列を有する本発明のペプチドは、同型的にｐ５３遺伝子を欠失したものを含む広範囲のヒトガン細胞に対して強い毒性を有する。配列番号１、２および３に示されたアミノ酸配列を有するそれぞれのペプチドに関するα−へリックスの確率のプロフィルは、２つの異なる方法、すなわち１つは蛋白のデータベースからのへリックスの確率を使用するもの（非特許文献４３）そして他は、（非特許文献４４）および（非特許文献４５）に記載されたように、これらのパラメーターに対する電荷の影響を含むことにより改変された、２０の天然Ｌアミノ酸のそれぞれに関するブロックコポリマーから実験的に決定された平衡定数、らせん核形成（σ）および成長（ｓ）に基づくＩｓｉｎｇモデルを使用するものを使用して行われた。確率プロフィルは、もしリーダー配列がアミノ酸末端にあるならば、たとえペプチドが細胞膜を横切っているとしても、α−へリックス定数は、遙かに低いことを示した。
【００８１】
【非特許文献４３】Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：８４６−８５６
【非特許文献４４】Ｖａｓｑｕｅｚ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９８７，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２６：３５１−３７２
【非特許文献４５】Ｖａｓｑｕｅｚ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９８７，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２６：３７３−３９３
【００８２】
配列番号３に示された配列を有するペプチドは、アミノ酸の末端に付着したリーダー配列による固相合成により合成された。このペプチドは、以下の表３においてＰＮＣ２８’とラベルされる。ＰＮＣ２８’ペプチドは、３つの異なる濃度すなわち２５、５０および１００μｇ／ｍＬで、形質転換した膵臓ガン（ＴＵＣ−３）細胞とインキュベートされた。インキュベーション２週後、最高の投与量のペプチドで、細胞の死がなく、そして細胞のほぼ半分が腺房を形成するのが見られ、そして未形質転換の形態の表現型を示した。同じ現象は、５０μｇ／ｍＬで観察され、そして２５μｇ／ｍＬでは、顕著に少ない細胞が復帰したのが見られた。対照的に、リーダー配列がペプチドのカルボキシ末端に付着したとき（表３のＰＮＣ２８）、５０および１００μｇ／ｍＬの投与量で、１００％の細胞の死が約４日で生じた。
【００８３】
これらの結果は、リーダー配列が、ｐ５３ペプチドのＭＤＭ−２部分のカルボキシル末端に選択的に付加して、ペプチドをして細胞膜を横切らせそして特異的に悪性細胞を殺すことを可能にすることを示す。表３では、リーダー配列は、ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）である。
【００８４】
【表３】
【００８５】
これらの結果は、本発明の特異性、すなわち正の電荷を有する残基のリーダーまたはクラスターがガン細胞の毒性に関して任意のエフェクターペプチドのカルボキシ末端に配置されなければならないことを示す。
【実施例２】
【００８６】
体重２０−２２ｇのＮｕ／Ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ｎ＝１０）に、左の後脚の領域に、生きている膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／マウス）を皮下（ｓ．ｃ．）に異種移植した。腫瘍は、発生し成長させ、そして毎日の検査中すべてのマウスが、非常に同様の成長速度で腫瘍を発育させることが観察された。
【００８７】
１２日後、腫瘍は直径３−６ｍｍのサイズに達し、そしてマウスをそれぞれ５匹ずつの２つの群に分けた。それぞれの群には、Ａｌｚｅｔ（商標）浸透圧ポンプをｓ．ｃ．で埋め込み、一定速度かつ１４日間の規定された期間で、２０ｍｇ／マウスの濃度でそれぞれのペプチドを含む全体積０．０９５ｍＬの規定の塩水を注入した。マウスの１つの群は、ペネトラチンリーダー配列（配列番号４）へそのカルボキシ末端で融合したＰＮＣ−２８（配列番号３に示されたアミノ酸を有するペプチド）を用い、そしてマウスの他の群は、ＰＮＣ−２９すなわち以下のアミノ酸配列ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有する同様なサイズのコントロールペプチドを用いた。ポンプは、製造者のガイドラインに従いそして滅菌条件で満たされた。ポンプを、そのなかに小さいポンプが挿入されたマウスの皮膚の下にポケットをつくることにより麻酔されたマウスの左の脇腹にｓ．ｃ．で埋め込んだ。それぞれのポケットは、簡単な縫合により閉じられた。それらの内側の室から、ポンプは、それぞれのマウスに０．２５μＬ／時で連続して注入した。マウスは、かれらが動物施設の分離棟へ戻されるとき、手術から回復するまで観察された。動物がＮｕ／Ｎｕマウスであり従って易感染性であるため、かれらは病原体に曝されたとき、非常に影響を受けやすい。手術並びにすべての手術前および後の処置は、そのため、滅菌フードの環境で行われた。
【００８８】
図１に明らかに示されるように、マウス中への注入４８〜７２時間以内のＰＮＣ−２８は、腫瘍の成長を有効に停止させる。対照的に、コントロールペプチドＰＮＣ−２９は、正常または腫瘍の細胞になんら作用しなかった。ＰＮＣ−２９で処理されたマウスでは、腫瘍は、連続する速度で成長を続け、２週間の処置そしてポンプが全くペプチド溶液を放出することを止めた以後の期間にわたり１０〜１６ｍｍの直径の腫瘍になった。マウスの両方の群における腫瘍のサイズの測定の統計分析は、ｐ＜０．００１のそれらの間の有意をもたらした。
【実施例３】
【００８９】
実施例２の同じ方法を用い、生きた膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／マウス）がマウス（ｎ＝１０）中に異種移植されたときと同時にポンプを開始した。５匹のマウスにはＰＮＣ２８が投与され、そして５匹のマウスは全く処置されなかった（偽処置）。結果は以下の通りである。
【００９０】
【表４】
【００９１】
【実施例４】
【００９２】
実施例２に記載されたのと同じ方法を用い、生きた膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／マウス）を５匹のマウスの腹腔に移植した。ポンプを、腫瘍細胞の移植と同時に右肩の領域に入れた。５匹のマウス全部では、３週間後肉眼で腫瘍は見られなかった。
【実施例５】
【００９３】
ＡｄＶベクター構築における材料および方法
細胞および細胞培養：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得られた２９３Ａ細胞を、クリオバイアルから解凍し、そしてＤＭＥＭ，２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ，Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｃＤＭＥＭ）からなる培地中で７５ｃｍ２組織培養フラスコ（ＴＣＦ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）で成長させた。細胞は、ＣＯ２−９５％空気の混合物を供給されたインキュベータで３７℃で成長した。培地を２日置きに変えた。細胞が９０〜９５％密集成長したとき、それらを１ｘＰＢＳで洗い、１ｘトリプシンにより外し、そして新しいＴＣＦ中に継代した。
【００９４】
ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞（生きた膵臓ガン細胞）は、コドン１２における発ガン突然変異（Ｇｌｙ１２→Ｖａｌ１２）を有するヒトｋ−ｒａｓ遺伝子およびネオマイシン抵抗性遺伝子を含むプラスミドによる正常のラット膵臓腺房細胞（ＢＭＲＰＡ１）のトランスフェクションにより生成された。生体外のコントロールされない細胞増殖、接触阻害の損失、低栄養素培地における成長および生体内の腫瘍の形成は、この形質転換した膵臓細胞系の特徴である。（非特許文献４６）または（特許文献２）２００３年１月１７日に出願された継続中の予備特許出願番号６０／４４０６９９、この出願はもし十分に示されるならば本明細書で参考として引用される）。ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞は、微量元素、成長因子および１０％ＦＢＳを含む半合成ＲＰＭＩ培地（ｃＲＰＭＩ）で成長させた（Ｂｒａｄｕ，２０００）。培地を２日置きに変えそして細胞を９０−９５％の密集成長で継代した。
【００９５】
【非特許文献４６】Ｂｒａｄｕ Ｓ（２０００）．Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅｔｏｂａｃｃｏ ｓｍｏｋｅ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ ＮＮＫ ｉｎ ｒａｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ＢＭＲＰＡ１ ｃｅｌｌｓ．ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ，ＳＵＮＹ−ＨＳＣ ａｔ Ｂｒｏｏｋｌｙｎ
【特許文献２】２００３年１月１７日に出願された継続中の予備特許出願番号６０／４４０６９９
【００９６】
ＰＮＣ−２８ＥＧの合成：ペプチド配列、開始コドン（ＡＴＧ）、停止コドン（ＴＡＧ）、Ｎｏｔ ＩおよびＫｐｎ Ｉ制限部位（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および追加の４塩基対（適切な制限酵素結合のために必要である）を含む２つの一本鎖ＤＮＡフラグメントを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡによりこの研究のために合成した。２つの一本鎖を９５℃で５分間アニーリングし、そして以下のプライマーＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧ（ＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｒｅｖ）、ＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣ（ＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｆｒｗ）およびＴａｑポリメラーゼを使用して２５μＬの反応体積でＰＣＲによって増幅した。誤った初回免疫の可能性を防ぐために、ＰＮＣ−２８ＥＧ−ＦｒｗおよびＲｅｖを１０ｐモルの濃度で使用した。次に、５μＬのＰＣＲ生成物を１００ｂｐマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに２％アガロースゲルで分析して、６２ｂｐの遺伝子の長さを立証した。
【００９７】
ポリメラーゼ連鎖反応：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、生体外で別個のＤＮＡフラグメントを増幅するのに役立つ方法である。この目的のために、二本鎖ＤＮＡは、まず変性されそして複製されるべきＤＮＡフラグメントに並ぶ２つの相補性オリゴヌクレオチド（プライマー）によりアニーリングされる。２つのプライマーの間のＤＮＡフラグメントは、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて合成された。これらの３つの段階の繰り返しにより、最初のセグメントは理想的に２ｘ倍に増幅され、この場合ｘはサイクルの数である（非特許文献４７）。最後に、すべての不完全な鎖合成は、追加の長い延長時間により完成された。他に述べていない限り、ＰＣＲの条件は、以下の通りであった。５分９５℃（変性）、次に１分９５℃（変性）、１分５０℃（アニーリング）、１分７２℃（延長）の３０サイクル、次に７２℃で１０分の最終の延長時間。
【００９８】
【非特許文献４７】Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｆａｌｏｏｎａ，Ｆ．，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｈｏｒｎ Ｇ．Ｔ．，Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ａｒｎｈｅｉｍ，Ｎ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０
【００９９】
他に述べていない限り、すべてのＰＣＲ生成物は、ＤＮＡバンドを染めるためのエチジウムブロミド（１０ｍｇ／ｍＬ）７．５μＬを含む１ｘＴＢＥ（トリス、硼酸、ＥＤＴＡ）１００ｍＬあたり２ｇのアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により製造された２％アガロースゲルで分析された。ＤＮＡ生成物は、７０ボルトで分離されそして紫外線照明により分析された。
【０１００】
ｐＣＲ２．１におけるＰＮＣ−２８ＥＧのクローニングおよびＴＯＰ１０感応Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換：ＰＮＣ−２８ＥＧを配列するために、ＰＣＲ生成物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯクローニングおよび形質転換のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンした。ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧベクター（２μＬ）をＴＯＰ１０化学的感応Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、そして３０分間氷上でインキュベートし、４２℃で水浴でヒートショックし、２５０μＬのＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でインキュベートし、そして３７℃で１時間２００ｒｐｍでショックをかけた。１００μＬのこの混合物を選択アンピシリン（５０μｇ／μＬ）アガロースプレートにおいた。細菌を１晩増殖させ、そしてコロニーを正確なサイズにされた遺伝子の存在についてＰＣＲにより分析した。
【０１０１】
ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧに関する細菌コロニーの分析：いくつかの反応混合物を、１μＬのＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｒｅｖ（１０ｐモル）、１μＬのＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｆｒｗ（１０ｐモル）、０．５μＬのｄＮＴＰ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ、２．５μＬの１０ｘＢｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）および１９．５μＬの滅菌水をそれぞれ含むことにより調製した。選択されたコロニーは、接種ループにより取り出し、そして反応混合物を含む予めラベルされた０．５ｍＬのポリプロピレン管（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｃａｌａ，ＦＬ）中に移し、そしてＰＣＲを行った。添加する緩衝液（５μＬ）および５ｘＦｉｃｏｌｌを８μＬのＰＣＲ生成物に添加し、そしてＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルで分析した。
【０１０２】
組み換えプラスミドを含むコロニーを、Ｌｕｒｅａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（５０μｇ／μＬのアンピシリンを含むＬＢブロス）で３７℃で１晩成長させた。細菌を採集し、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧを、ＱｉａｇｅｎのＭｉｎｉｐｒｅｐプラスミド単離キットを使用して単離した。単離したプラスミドの濃度を、配列決定前にＯＤ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで測定した。
【０１０３】
エントリーベクター（ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧ）の構築：エントリーベクターは、ＰＮＣ−２８ＥＧをｐＥＮＴＲ１１にクローニングすることにより構築された。ＰＮＣ−２８ＥＧをｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏから精製し、そして製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってｐＥＮＴＲ１１の曝された末端に結合した。連結反応のために、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧおよびｐＥＮＴＲ−１１をＫｐｎ１，Ｎｏｔ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）により消化し、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで分離しそしてゲル抽出により精製した。
【０１０４】
Ｋｐｎ１消化：６０μｇのｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８を、３０μＬのｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８（２μｇ／μＬ）、６μＬのＫｐｎ １（１０単位／μＬ）、５μＬの１０ｘＢｕｆｆｅｒ（酵素を補充する）および９μＬの滅菌水を含む５０μＬの反応物中で６０単位のＫｐｎ １により１時間３７℃で消化した。消化は、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿を次に行い、Ｎｏｔ１によるさらなる消化と干渉する蛋白および酵素を除いた。２５μＬの１：１フェノール クロロホルムを消化したサンプルに添加した。サンプルを１５秒攪拌しそして３分間１３，０００ｒで遠心分離した。３層は、遠心分離後サンプル中で確認でき、プラスミドを含む重ねるものを、中間層または界面を乱すことなく新しい管に注意して移した。プラスミドを次に１００μＬの１００％エタノールおよび５μＬの３Ｍ Ｎａ−アセテートを添加することにより沈殿させ、次に−８０℃においた。１時間後、管を−８０℃から取り出し、２０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離してプラスミドをペレットにした。上澄をペレットを乱すことなく取り出した。予冷した７０％エタノール（１５０μＬ）を添加しそして管をさらに５分間の遠心分離にかけた。エタノールのすべての痕跡を管から除き、ペレットを残して１０分間風乾した。
【０１０５】
Ｎｏｔ１消化：ペレットを３８．５μＬの滅菌水により再溶出し、そして上述したＫｐｎ １消化と同じ条件下でＮｏｔ１により消化した。すなわち６０単位のＮｏｔ１（６μＬ）、５μＬの１０ｘＢｕｆｆｅｒ（Ｎｏｔ１酵素を補充する）、０．５μＬの１００ｘＢＳＡおよび３８．５μＬの滅菌水、３７℃、１時間。
【０１０６】
ｐＥＮＴＲ１１（２０μｇ）を、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧエントリーベクターについて記述したのと同じ方法で、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターと平行してＫｐｎ ＩおよびＮｏｔ１制限酵素消化により処理した。
【０１０７】
ゲル抽出：Ｆｉｃｏｌｌ（５ｘ、２０μＬ）を５０μＬの反応物に添加し、全混合物を５分間７０Ｖで１％アガロースゲルで分離した。ゲルを、ＰＮＣ−２８ＥＧを含む適切なサイズのバンドを削り取る場所についてＵＶ光の下分析した。ＰＮＣ−２８ＥＧを、Ｑｉａｇｅｎのゲル抽出キットを使用してアガローススラブから精製した。ＰＮＣ−２８ＥＧを次にＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）により線状化ｐＥＮＴＲ１１に連結して、ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧエントリーベクターを構築した。
【０１０８】
連結反応：両方のサンプルをＯＤ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで定量し、連結反応に必要な両方のサンプルの最後の濃度を決定した。８．５μＬのＰＮＣ−２８ＥＧ、８．５μＬのｐＥＮＴＲ１１、１μＬのＴ４−ＤＮＡリガーゼ、２μＬの１０ｘＢｕｆｆｅｒ（リガーゼを補充する）を含む連結反応を実施した。反応混合物を１６℃で４時間インキュベートした。２μＬの連結反応物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉ混合物（１００μＬ）を選択カナマイシン（５０μＬ／ｍＬ）アガロースプレートに広げた（５０μＬ／μＬ）。プレートで成長したコロニーを、特異的プライマーとしてＰＮＣ−２８ＥＧ初回免疫オリゴヌクレオチド（ＰＮＣ−２８ＥＧ ＦｒｗおよびＲｅｖ）を使用してＰＣＲ増幅にかけた。生成物を２％アガロースゲルで分析してｐＥＮＴＲ１１へのＰＮＣ−２８ＥＧの適切な連結反応を決定した。ＰＮＣ−２８ＥＧポジティブコロニーを選択しそして５０μＬのカナマイシンを含む２５ｍＬの液体培地で１晩成長させた。ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ベクターを、Ｑｉａｇｅｎのミニプレップ単離キットを使って細菌から単離した。
【０１０９】
ＰＮＣ−２８を含むＡｄＶ（ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ）の構築：完全ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧ（２０２．５ｎｇ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのラムダ組み換え（ＬＲ）プロトコールに従って、２時間２５℃のインキュベーション中１５０ｎｇのｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターにクローンした。反応混合物（１μＬ）を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換して、次に選択アンピシリンアガロースプレートにおいた。１晩の成長後、コロニーをランダムに取り出し、そして特異的プライマーとしてＰＮＣ−２８ＥＧオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅にかけた。ＰＮＣ−２８ＥＧポジティブコロニーを選択アンピシリンＬＢブロスで培養し、そしてそれらのベクターをＤＮＡ配列決定のために単離した。ＰＮＣ−２８ＥＧの正確なＤＮＡ配列を含むベクターから、４μｇをＰａｃ Ｉ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）により消化し、そして２９３Ａ細胞中に形質転換して新しく構築されたウイルス（ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ）を増殖した。
【０１１０】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスを増殖するための２９３Ａ細胞のトランスフェクション：２９３Ａ細胞を、トランスフェクションの前日に２ｍＬのｃＤＭＥＭを含む６穴の皿に１穴あたり５ｘ１０５細胞で接種した。トランスフェクションの日に、ｃＤＭＥＭを、１０％のＦＢＳを含む１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により置換した。１μｇのｐａｃ Ｉ消化ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺベクターを２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈し、そして３μＬのリポフェクタミン２０００を２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈した。溶液を５分間室温でインキュベートし、混合しそしてさらに室温で２０分間インキュベートした。混合した溶液を６穴皿の穴に添加し、細胞を３７℃でインキュベートしそして２−３日毎に養分をあたえた。細胞を、細胞分解が明らかになるまで（１４日以内）成長させた。細胞の８０−９０％が分解した後、ウイルスを含む上澄を採集し、次に細胞懸濁物を凍結（−８０℃）および解凍（３７℃）した。凍結と乾燥との３サイクル後、細胞のフラグメントを１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離することによりペレット化し、上澄を回収し、１ｍＬ容のクリオバイアルに入れ、将来の使用のために−８０℃で貯蔵した。
【０１１１】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスによるＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ−３のトランスフェクション：細胞は、ウイルスが細胞系で複製できないとき、トランスフェクションされるよりもむしろ形質導入されるといわれている。形質導入の前日に、ＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ−３細胞を１穴あたり１ｘ１０５細胞の濃度で６穴のプレートに接種した。形質導入の日に、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスを、ｃＲＰＭＩ中に１０−９から１０−４の１０倍希釈で希釈して最終体積を１ｍＬにした。培地の廃物を除き、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスの１ｍＬ希釈物をそれらのそれぞれの穴に添加した。次の日、ウイルスを含む培地をそれぞれの穴から取り出し、そしてプラーク化培地（３％のＦＢＳを含むｃＲＰＭＩ）および４％のアガロースからなる予め加温（６５℃）されたアガロースの重ねるもの２ｍＬをそれぞれの穴に添加した。プレートを３７℃の加湿ＣＯ２インキュベータに戻した。最初の重ねるものの添加３日後、１ｍＬの追加の重ねるものをそれぞれの穴に加えた。２９３Ａ細胞は、コントロールＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ−３を提供するためにｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスと同じ方法でトランスフェクションされ、そして２９３Ａ細胞は、細胞分解の徴候のために１４日にわたってモニターされた。
【０１１２】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターによるＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞のトランスフェクション：トラスフェクションの日、ＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ３細胞を離し、そして１０％ＦＢＳを含む抗生物質のないｃＲＰＭＩ培地中で１ｘ１０５細胞の濃度で６穴のプレート中に接種し、そして４時間接着させた。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクター（４．０μｇ）を２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに希釈し、そして１０μＬのリポフェクタミン２０００を２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈した。溶液を室温で５分間インキュベートし、混合しそしてさらに室温で２０分間インキュベートした。次に、混合物を細胞に添加した。コントロールのために、ＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ３細胞のセットをｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺベクターによりトランスフェクションし、そして細胞の第三のセットは１０μＬのリポフェクタミン２０００のみを用いた。プレートを３７℃の加湿ＣＯ２インキュベータに戻した。２４時間および４８時間後、穴のそれぞれのセットの上澄を集め（２ｍＬ）、遠心分離し、そしてペレット化非接着細胞をカウントした。それぞれの場合、穴を２ｍＬの新鮮な培地で補充した。トランスフェクション７２時間後、各穴からの上澄を集めそして非接着細胞をカウントし、接着細胞を０．５ｍＬの１ｘトリプシンに離し、血球計およびトリプシンブルー排除（非特許文献４８）によりカウントした。写真は、４００ＡＳＡ富士フィルムをつけた倒立サイズＺｅｉｓｓ顕微鏡で撮った。
【実施例６】
【０１１３】
【非特許文献４８】Ｍｉｃｈｌ Ｊ．ＤＪ Ｏｈｌｂａｕｍ，ＳＣ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，１９７６．２−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｆｃ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．ＪＥｘｐ Ｍｅｄ，１４４：１４６５−１４８３
【０１１４】
結果
アデノウイルスベクターの構築は、保守的部位特異性組み換えに基づく。細菌ウイルスであるバクテリオファージラムダは、保守的部位特異性組み換えを示したと理解される最初のミクロ実体であった。ウイルスがその宿主細胞中に入るとき、ラムダインテグラーゼとよばれる酵素が合成される。この酵素は、細菌染色体中へのウイルスＤＮＡの共有結合を仲介し、ウイルスＤＮＡをして宿主のＤＮＡの必須部分として複製を可能にする（非特許文献４９）。組み換えは、バクテリオファージおよび細菌染色体に見いだされる関連するが異なるＤＮＡ認識部位に基づく。バクテリオファージインテグラーゼは、バクテリオファージに見いだされるＤＮＡ配列に結合し、そしてＤＮＡ−蛋白複合体を形成する。この複合体は、細菌染色体に見いだされる付着ＤＮＡ配列に結合できる。インテグラーゼは、次に部位特異的鎖交換を生ずるＤＮＡを切断かつ再閉する反応を触媒化できる。
【０１１５】
【非特許文献４９】Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．，Ｌｅｗｉｓ Ｊ．，Ｒａｆｆ Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ
【０１１６】
バクテリオファージ−宿主組み込みを行う同じメカニズムは、アデノウイルスベクターｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧのデザインに存在する。ＰＮＣ−２８（ＰＮＣ−２８ＥＧ）をエンコードする遺伝子は、ＰＮＣ−２８ＥＧの発現に必要なプロモーターを欠くエントリープラスミド中にクローンされ、従って転写的に不活動といわれる。エントリープラスミドは、特異的な組み換え部位を含み、それはトラス遺伝子と並びそしてアデノウイルスデスチネーションベクターｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴの組み換え部位に相当する。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターは、ＰＮＣ−２８ＥＧの転写および翻訳を行う必要なプロモーターを含む。組み換え反応によって、ＰＮＣ−２８ＥＧは、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター中にサブクローンされて、アデノウイルスベクターｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧを生ずる。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧは、適切なウイルスパッケージングおよびアデノウイルス生成に必要な遺伝子および要素をエンコードするヒトアデノウイルスタイプ５配列を含む。しかし、それはＥ１およびＥ３配列を欠いて、これらの遺伝子を補給しない細胞系においてそれを複製不能にする。
【０１１７】
新しく構築されたｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターが膵臓ガン細胞における抗ガン剤としてテストされる前に、ウイルスの複製可能な性質を知ることがｚベクターが膵臓ガン細胞における抗ガン剤としてテストされる前に、ウイルスの複製可能な性質を知ることが重要である。上述のように、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧは、アデノウイルスゲノムに見いだされるＥ１およびＥ３配列を欠き、そしてこれらの不足した遺伝子を発現するようにバイオエンジニアリングによりつくられた２９３Ａのような細胞系でのみ複製可能である（非特許文献５０）。すべての哺乳動物の細胞系の完全なゲノムは、なお未知であり、そのため、膵臓ガン細胞系ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３がこれらの遺伝子を発現するかどうか、そして細胞死をおそらくもたらすＡｄウイルスのこのタイプの複製を支持するかどうかは未知数であった。ＰＮＣ−２８は、膵臓ガンで細胞分解を誘導するが、感応細胞においてウイルス複製を行うメカニズムも細胞死を誘導する。治療手段へのｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧの開発では、膵臓ガン細胞における細胞死が、ＰＮＣ−２８遺伝子の転写および翻訳に基づくものでありそしてウイルス複製によらなかったことを確かめることが重要であった。
【０１１８】
【非特許文献５０】Ｗａｎｇ Ｉ．Ｉ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｉ．Ｉ．（２０００） Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５，１０−１６
【０１１９】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧトランスフェクション細胞の細胞分解の原因を確かめるために、ＰＮＣ−２８ＥＧを欠いたコントロールアデノウイルスベクターすなわちｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺを要した。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺは、構築されたｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターと同じであるが、ただしそれはＰＮＣ−２８ＥＧの代わりにＬａｃＺ遺伝子を含んだ。コントロールベクターは２つの利点をもたらした。すなわち、それはＰＮＣ−２８ＥＧを欠いておりそのためコントロールとして働きそしてガラクトシダーゼ発現が容易に検出される。粗製のウイルス原料は、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺ、脂質に基づくトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００により２９３Ａ細胞をトランスフェクションすることにより得られた。接着細胞の８０〜９０％が分解したとき、ウイルスを採集した。この最初の原料は、１ｘ１０７−１ｘ１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルス力価を含んだ。粗製ウイルス原料は、より高い力価を生成するために再び２９３Ａ細胞をトランスフェクションするのに使用した。１ｘ１０８−１ｘ１０９ｐｆｕの力価が得られそしてこのような高い力価が望ましい。６つの１０倍希釈がｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺに行われ、１ｘ１０−９−１ｘ１０−４に及んだ。これらの希釈物は、それぞれ２９３Ａを含む６穴プレートの穴並びにＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ３細胞を含む第二の６穴のプレートの穴に添加された。ウイルスは２９３Ａ細胞で複製したので、２９３Ａ細胞の分解は、ウイルスが適切に働いていたことを立証するコントロールとして働いた。次の日、アガロースの重ねるものを細胞の上に置き、そしてそれらは２週間の間プラークの形成についてモニターされ、初めの日から４日後、第二のアガロースの重ねるものを加えた。図２に示されるように、明らかな形態上の変化が２９３Ａについて見られるが、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞ではそうではなかった。
【０１２０】
図２Ａ−２Ｈは、２９３ＡおよびＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞に対するｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺの作用を示す。図２Ａ−２Ｆは、２９３Ａ細胞の希釈物（ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスの１０−９−１０−４）の顕微鏡写真である。１４日後、２９３Ａ細胞の形態は変化した。１０−９希釈物では、９０％の細胞はなお密集成長しているが、しかし細胞分解は肉眼では認められない。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスの濃度を上げると、丸くなり死んだ細胞の大きな面積が肉眼で確認される。密集成長が低い少数の領域のみが、１０−５より高い濃度のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺで検出できる。
【０１２１】
図２Ｇおよび２Ｈは、１０−９〜１０−４のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスが添加されたＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞の希釈物の顕微鏡写真である。細胞分解の肉眼で確認できる徴候は、任意のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺ希釈物（１０−８〜１０−５は示されず）でＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３培養物で検出できず、細胞は、それらが最低の濃度１０−９希釈（図２Ｇ）と同じく、１０−４希釈で密集成長する（図２Ｈ）。
【０１２２】
ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３細胞は、細胞分解または細胞死の徴候を示さなかった。これは、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞が欠失したＥ１およびＥ３遺伝子を補充せず、その結果ウイルスは複製不能であることを示す。もしウイルスがＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３培養物に細胞分解を生じさせるならば、それは目標細胞中への細胞毒性ＰＮＣ−２８遺伝子の導入のための好適な候補者と考えられないだろう。
【０１２３】
Ａｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８の構築：ＰＮＣ−２８ＥＧの合成は、Ａｄベクター構築の最初の段階であった。（非特許文献５１）により公開されたＰＮＣ−２８のアミノ酸配列（ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ）に相当する２つのオリゴヌクレオチドが合成された。ＰＮＣ−２８ペプチドをエンコードするのに加えて、オリゴヌクレオチド配列も開始コドン、停止コドン、Ｋｐｎ １およびＮｏｔＩ解裂部位およびそれぞれの末端の４つの追加の塩基（ＤＮＡフラグメントを安定化しそして制限部位への適切な酵素結合に必要であった）を含んだ。Ｋｐｎ １およびＮｏｔＩ制限部位は、それらがｐＥＮＴＲ−１１ベクターの複数のクローニング部位（ＭＣＳ）に存在したために、選ばれた。ｐＥＮＴＲ−１１のＫｐｎ １およびＮｏｔＩ制限部位の解裂は、突き出した末端を曝し、そしてｐＥＮＴＲ１１ベクター中への６２ｂｐの全配列（図３）とのＰＮＣ−２８ＥＧの連結を可能にした。
【０１２４】
【非特許文献５１】Ｋａｎｏｖｓｋｙ Ｍ，Ｒａｆｆｏ Ａ，Ｄｒｅｗ Ｌ，Ｒｏｓａｌ Ｒ，Ｄｏ Ｔ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＦＫ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｐ，Ｖｉｓｓｅｒ Ｊ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｒ，Ｂｒａｎｄｔ−ＲａｕｆＰＷ，Ｍｉｃｈｌ Ｊ，Ｆｉｎｅ ＲＬ，Ｐｉｎｃｕｓ ＭＲ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ．２００１ Ｏｃｔ ２３；９８（２２）：１２４３８−４３：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ｔｅｒｍｉｎａ１ ｍｄｍ−２− ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐ５３，ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｒｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ
【０１２５】
オリゴヌクレオチドの合成中製造者の情報（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、不正確な合成の確率は、１ヌクレオチドあたり０．９９である。従って、正確に合成されるこのオリゴヌクレオチドの確率は、０．９９６２であり、所望のダイマーを形成するための２つの正確な鎖アニーリングの確率は、（０．９９６２）２である。そのため、アニーリングされたＰＮＣ−２８ＥＧは、所望のアニーリング生成物を指数的に増幅するためのＰＣＲ増幅用のテンプレートとして使用し、そうすることにおいて、それぞれのベクター中にクローンされるこのＤＮＡの超過の確率を上げることになる。欠失または点突然変異は、蛋白合成中ＤＮＡ翻訳に関する読み枠を変化またはシフトし勝ちであり、そして無効なまたは短い蛋白が転写されるかまたは全く蛋白が転写されないことになり勝ちであろう。
【０１２６】
２つの初回免疫オリゴヌクレオチドが合成された。１つは、５’−３’方向のＰＮＣ−２８ＥＧ、ＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧ（ＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｆｒｗ）に相補的であり、他は３’−５’方向のもの、ＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣ（ＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｒｅｖ）に相補的であった。ゲル電気泳動を次に使用して、増幅したＰＮＣ−２８ＥＧの分子サイズを同定した。６２ｂｐのサイズは、ＰＮＣ−２８ＥＧの適切なアニーリングおよび増幅を示す。図４は、１００ｂｐマーカー（レーン４）と比較することにより決定された、ＰＣＲ生成物（レーン１、２、３）を示す。ＰＣＲ生成物の３つの異なる希釈物（１：２０、１：５０および１：１００）。それらは、それぞれレーン１、２および３で分離された。
【０１２７】
６２ｂｐのバンドの適切な分子サイズは、どんな欠失も配列ではなかったことを示す。削り取ったバンドのＤＮＡ配列決定（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によるさらなる分析は、どんな改変も存在しなかったことを示した。この段階は、反応に使用されるＤＮＡのＴａｑポリメラーゼが１サイクルあたり２ｘ１０−４ヌクレオチドの率でヌクレオチドを誤って配合するために、重要であった。
【０１２８】
ＰＮＣ−２８ＥＧの配列決定に使用される戦略は、普遍的初回免疫部位を含んだプラスミド中に遺伝子をクローンし、感応Ｅ．ｃｏｌｉ中にこの組み換えプラスミドを形質転換し、プラスミドを含んだ選択的に成長したコロニーから組み換えプラスミドを精製し、そしてプラスミドＤＮＡを配列決定に送ることであった。ＰＮＣ−２８ＥＧは、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクター中にクローンされた。このプラスミドは、それがトポイソメラーゼＩの使用によってベクター中へのＰＣＲ生成物の迅速かつ有効な挿入をもたらすために、選ばれた。トポイソメラーゼＩは、ＰＮＣ−２８ＥＧの３’末端におけるＴａｑポリメラーゼにより生成されたデオキシアデノシン（Ａ）のオーバーハングを、線状化されたベクターに存在するデオキシチミジン（Ｔ）の３’オーバーハングに連結する。ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターは、アンピシリン、カナマイシン選択性マーカーおよびｌａｃＺ遺伝子を含み、それは組み換えプラスミドを含む細菌コロニーの選択を可能にした。ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏに関するクローニング部位は、図５に示される。図５に示されるように、クローンされた遺伝子は、配列決定のプライマーとして使用される普遍的Ｍ１３プライマーの配列範囲内にある。ベクターは、アンピシリンおよびカナマイシン抵抗性遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含む。
【０１２９】
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧ組み換えプラスミドは、次に解凍したＴＯＰ１０感応細菌細胞へ連結したプラスミド混合物を加えそして細胞を短く加熱することにより、感応Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換された。この温度の短い変化は、細菌細胞がプラスミドを取り上げるのを可能にした。形質転換した細菌細胞を、ｘ−ｇａｌを含んだ選択アンピシリンプレートで成長させた。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧに存在するＬａｃＺ遺伝子は、ポジティブなコロニーすなわちプラスミドを含むコロニーについてスクリーニングするのに使用された。ＬａｃＺは、β−ガラクトシダーゼについてエンコードし、それはβ−ガラクトシドＸ−ｇａｌを代謝しそしてこれは青い色を生成する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ｐＣＲ２．１ＴｏｐｏプラスミドへのＰＮＣ−２８ＥＧのクローニングは、ＬａｃＺの発現を防ぐ。そのため、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧポジティブコロニーは、青い色を発しない。培養プレートに添加されたアンピシリンは、それらがプラスミドに見いだされるアンピシリン抵抗性遺伝子を欠いているために、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧネガティブ細菌の成長を防ぐ。最後に、ＰＣＲは、偽のポジティブの白色のコロニー、またはＰＮＣ−２８ＥＧを含まないコロニーをスクリーニングするのに使用される。細菌コロニーは、上記のように初回免疫オリゴヌクレオチドＰＮＣ−２８ＥＧ−ＦｒｗおよびＰＮＣ−２８−Ｒｅｖのためのテンプレートとして用いられた。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲルで分析されて、組み換えプラスミド中の遺伝子を含むコロニーを同定した。
【０１３０】
形質転換は、数百の白色コロニーおよび数少ない青色のコロニーを生じた。１９のランダムに選択した白色のコロニーおよび１０のランダムに選択した青色のコロニー（図示せず）をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧについてスクリーニングした。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧを含むコロニーは、６２ｂｐの蛍光バンドを示すことが予想された。図６は、白色のコロニーの分析の結果を示す。図６は、ＰＮＣ−２８ＥＧ形質転換した白色コロニーからの増幅したＰＣＲ生成物を示すゲル写真である。１９の選択されたポジティブコロニーからのＰＣＲ生成物は、２％アガロースゲルで分離された。エチジウムブルー染色ＤＮＡバンドは、１００ｂｐマークを越えて移動し（レーン２０）、ＰＣＲ生成物（１−１８）のサイズが正確でありそしてこれらのコロニーがＰＮＣ−２８ＥＧ／ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏを含むことを示す。
【０１３１】
レーン１９（図６）は、予想されたサイズ以下の弱いバンドを示す。この現象は、プライマーがＰＣＲ生成物に配合されなかったときに通常生じ、それは次にテンプレート（ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧ）が存在せずそしてこのＰＣＲ生成物が偽のポジティブの結果であるように思われることを示唆している。
【０１３２】
ＰＣＲ増幅は、ポジティブと思われるコロニーの中の偽のポジティブをスクリーニングする手段を提供する。これは、挿入物の正確なサイズにより、どのコロニーが組み換えプラスミドを含んでいるかを示した。これらのコロニーのいくつかのプラスミドは、次に配列決定されて、ＰＮＣ−２８ＥＧが適切な配向で挿入されそして配列にどんな点突然変異も存在しなかったことを立証した。レーン１、５および８（図６）に相当したコロニーから単離されたプラスミドは、自動ＤＮＡ配列決定装置に送られた。３つのプラスミドのうち、コロニー８（図６）に存在するものは、ＰＮＣ−２８ＥＧに関する正確な配列を含んだ。コロニー８から得られた配列と合成したＰＮＣ−２８ＥＧ配列との間の比較は、図７に示される。
【０１３３】
ＰＮＣ−２８についてエンコードするセグメントにおいて位置９６（星印図７参照）で１つの点突然変異が存在する。ＴからＣへの変化がある。しかし、これはアミノ酸配列の同定に影響しない。それは、コドンＴＴＣもＴＴＴフェニルアミンと同じアミノ酸をエンコードするからである。また、Ｋｐｎ１制限部位において３つの未知のヌクレオチド（Ｎ）が存在する。これは、自動配列決定装置により生じた誤りの結果と思われる。もしこれらの３つのヌクレオチドが問題を生ずるとしたならば、Ｋｐｎ１は、制限部位を解裂することができず、以後のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターの構築は不可能であったろう。しかし、Ｋｐｎ１制限は影響されないままであり、そしてｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターの構築は、以下のように進行した。
【０１３４】
細菌コロニー８は、細菌が採取されそして上記のようにプラスミドが単離されたとき、１６時間３７℃で液体培地で成長した。
【０１３５】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ構築の次の段階は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ−１１へＰＮＣ−２８ＥＧをクローンすることである。図８は、ｐＥＮＴＲ−１１のベクターマップを示す。エントリーベクターは、組み換え部位ａｔｔＬ １およびａｔｔＬ ２を含み、それらは、アデノウイルス発現ベクターｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴへのＰＮＣ−２８ＥＧの組み換えクローニングを可能にする。それは、またカナマイシン抵抗性遺伝子、ａｔｔＬ １およびａｔｔＬ ２の間のｃｃｄＢ遺伝子並びにその複数のクローニング部位（ＭＣＳ）におけるＫｐｎ１およびＮｏｔｌに関する制限部位を含む。
【０１３６】
ｐＥＮＴＲ−１１の組み換え部位間に見いだされるｃｃｄＢ遺伝子は、ネガティブ選択を可能にする。ｃｃｄＢ遺伝子は、ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉ（使用される菌株）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について毒性のある蛋白をエンコードする。ＰＮＣ−２８ＥＧがｐＥＮＴＲ−１１ベクターにクローンされるとき、ｃｃｄＢ遺伝子は除かれる。そのため、ＰＮＣ−２８ＥＧを含まないコロニーは、成長できない。カナマイシン抵抗性遺伝子も、カナマイシン処理培養プレートでのポジティブコロニーの選択を可能にする。
【０１３７】
ｐＥＮＴＲ−１１ベクターをＫｐｎ１およびＮｏｔ１により消化して、突き出した末端を曝しそしてＰＮＣ−２８ＥＧの連結を可能にした。消化は、またｃｃｄＢ遺伝子の除去を生ずる。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧは、同じ方法で消化された。ＰＮＣ−２８ＥＧは、次にアガロースゲルの消化した生成物を分離しそして遺伝子を含むアガロースのスラブを削り取ることによりｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターから精製された。線状化ｐＥＮＴＲ１１ベクターも同様な方法で精製した。アガローススラブは溶融され、そしてＰＮＣ−２８ＥＧを、触媒としてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用してｐＥＮＴＲ１１に連結した。クローンしたエントリーベクターｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧを使用して選択カナマイシンアガロースプレート上に成長した化学的感応ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。
【０１３８】
多数のコロニーが成長し、そしてそれらはすべてＰＮＣ−２８ＥＧを含んだが、いくつかのコロニーをＰＣＲスクリーニングにかけた。ベクターを２つの異なる制限酵素により消化して、ＰＮＣ−２８ＥＧを含まないベクターが機能性プラスミド中に連結しそしてｃｃｄＢ選択の妨害により偽のポジティブを生ずる可能性を最低にした。ＰＮＣ−２８ＥＧそれ自体のＤＮＡ配列は、関連する唯一の反応が制限反応であるので、改変されてはならず、複製メカニズムも含まれなかった。この重要な分析は、事実すべてのコロニーがＰＮＣ−２８ＥＧを含むものではないことを示した。ＰＮＣ−２８ポジティブクローンは、次に多量に成長しそして組み換えエントリーベクターｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧがこのコロニーから単離された。
【０１３９】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ構築における最後の段階は、ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧから単離されたＰＮＣ−２８ＥＧをアデノウイルスデスチネーションベクターであるｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ中にサブクローニングすることであった。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴは、ｐＥＮＴＲ１１に見いだされるａｔｔＬ １およびａｔｔＬ ２部位に相当するａｔｔＢ １およびａｔｔＢ ２組み換え部位を含む。これは、ｐＥＮＴＲ−１１ベクターからｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴへのＰＮＣ−２８ＥＧのインテグラーゼ仲介組み換えクローニングを可能にする。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴは、またＰＮＣ−２８ＥＧの発現を増強するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。アンピシリン抵抗性ｃｃｄｂネガティブ選択およびｍＲＮＡの有効な転写停止およびポリアデニル化のための単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリアデニル化配列もｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴに存在する。図９は、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴの組み換え部位を示す。ｐＮＣ−２８ＥＧは、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴへの組み換えによりクローンされ、所望の発現クローンを生成した。
【０１４０】
複製不能ウイルスをエンコードする必要な配列を含んだｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧは、ＰＮＣ−２８を発現できる。化学的感応ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉを、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターにより形質転換しそして選択アンピシリンプレートで成長させた。多数のコロニーが成長し、そして１０のランダムに選択したコロニーがＰＣＲスクリーニングにかけられた（図１０）。図１０は、２％アガロースゲル上で分離された１０の選択されたポジティブコロニーからのＰＣＲ生成物を示す写真である。エチジウムブロマイド染色ＤＮＡバンドは、１００ｂｐマークを越えて移動し（レーン１１）、ＰＣＲ生成物（１−９）のサイズが正確でありそしてこれらのコロニーがｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧを含むことを示す。レーン１０の弱いバンドは、偽のポジティブコロニーを示す。従って、バンドの移動は、１０のランダムに選択されたコロニーの内の９つが、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧを含むことを示した。これらのポジティブなコロニーは、大量の液体培地で成長しそしてｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧはそれらから精製された。図１１は、アガロースゲル上で分離された精製プラスミドを示す。
【０１４１】
ゲルの結果は、単離されたｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧが非常に純粋であることを示す。レーン１および３で単一のバンドのみが存在するので、精製されたプラスミドには他の不純物がない。バンドの分子サイズは約３５ｋｂである。
【０１４２】
一度ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧが精製されたならば、それは次にＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞をトランスフェクションするのに使用されて、ＰＮＣ−２８蛋白中に転写かつ翻訳されたとき、ＰＮＣ−２８のための遺伝子が膵臓ガン細胞に対し細胞毒性を有しそのため構築されたベクターが抗膵臓ガン剤として有用であることを立証した。
【０１４３】
ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞は、抗生物質のない培地（ｃＲＭＰＩ、１０％ＦＢＳ）を有する６穴のプレートの３つの穴に１ｘ１０５細胞の濃度で接種された。細胞は、３７℃で４時間のインキュベーションにより穴に接着した。２つのトランスフェクションを行った。第一の穴はｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧによりトランスフェクションされ、そして第二の穴は、コントロールプラスミドｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺによりなされた。両方の場合とも、細胞は４μｇのプラスミドおよび１０μＬのリポフェクタミン２０００（比２：５）によりトランスフェクションされた。第三の穴の細胞は、第二のコントロールとして用いられそしてリポフェクタミン２０００（１０μＬ）のみを用いた。
【０１４４】
細胞を３７℃でインキュベータに戻した。２４時間後、それぞれの穴からの上澄を集め、そして懸濁された細胞をカウントした。細胞の生存も注目した。細胞を新しい培地で満たし、そしてインキュベータに戻した。この手順を、トラスフェクション後７２時間まで連続する２４時間毎に繰り返した。
【０１４５】
トランスフェクション後７２時間で、残りの接着細胞を次に離しそしてカウントした。図１２Ａおよび表５は、７２時間目のそれぞれの穴での接着細胞の数を示す。図１２Ａおよび表５に示されるように、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧによりトランスフェクションされた細胞は、細胞の最初の接種から細胞の濃度が８５％増加したことを示す。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺによりトランスフェクションされたＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞は、７２時間後３．５倍に増え、すべてのプラスミドによりトランスフェクションされなかった細胞は、接種された細胞の最初の量から７．５倍増加した。図１２ｂは、トランスフェクション後７２時間の細胞の写真を示す。トランスフェクション後７２時間で、残りの接着細胞は、次に離されそしてカウントされた。図１２ｂに示されるように、トランスフェクション後７２時間で、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧにより処理された細胞の９８％が、コントロールに比べて分解した。ＬａｃＺベクターによりトランスフェクションされた細胞およびリポフェクタミン２０００によるものは、９０−１００％の密集成長を示したに過ぎない。
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧによりトランスフェクションされた膵臓ガンＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞の＞９８％の低下そして開始時の数より３．５倍および７．５倍の両方のコントロール細胞数の増加は、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ細胞の細胞分解作用がＰＮＣ−２８の生合成によることを明らかに示している。Ａｄ／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターによりトランスフェクションされたＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞も、非接着および死んだ細胞において最高の増加（５ｘコントロール）を示す。対照的に、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺトランスフェクションＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞は、細胞の分解を示さず、そしてリポフェクタミン２０００処理細胞と比較したとき、わずかに遅い成長を示すに過ぎなかった。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺトランスフェクションおよびリポフェクタミン処理ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞における細胞分解の不存在は、さらに新しく合成されたＰＮＣ−２８蛋白がｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧトランスフェクション細胞における細胞死の原因であるという主張を強化する。トランスフェクション後４８時間のｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧトランスフェクションＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３群における非接着かつ死んだ細胞の急速な増加は、ＰＮＣ−２８の発現がこの時間枠内で生ずることを示唆する。この観察は、ペネトラチン配列に付着したＰＮＣ−２８が、薬剤への細胞の暴露後４８−７２時間以内でＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞に対して細胞死を誘導する、実施例２および図１に報告された時間枠と有利に比較される。
【０１４８】
上記の明細書およびそこに報告された実験結果は、説明のためであり、そして本発明の範囲の制限ではない。当業者は、種々の改変が本発明から離れることなくなされうることを理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】膵臓ガン細胞により異種移植された同型接合したＮＵ／ＮＵマウスにおけるＰＮＣ−２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４へそのカルボキシ末端で融合したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の生体内腫瘍阻害作用を描いている。星をつけた矢印は、腫瘍成長期間中の１３日（正確には１３．５日）のｓ．ｃ．ポンプ移植の時間を示す。
【図２】Ａ−Ｈは、２９３ＡおよびＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞に対するｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスの作用を示す顕微鏡写真である。
【図３】ＰＮＣ−２８ＥＧの６２ｂｐＤＮＡ配列を示す。開始コドンおよび停止コドンの両者は、強調されている。本発明のペプチドをエンコードする配列は、イタリックで強調されている。ＤＮＡ配列のそれぞれのコドンの下に、対応するアミノ酸がある。
【図４】ＰＮＣ−２８ＥＧ ＰＣＲ生成物を示すゲル写真である。レーン４は１００ｂｐマーカーを含む。
【図５】ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターのヌクレオチド配列および制限マップである。ラベル「ＰＣＲ生成物」は、ＰＮＣ−２８ＥＧがベクターでクローンされる場所を示す。クローンされた遺伝子は、配列決定プライマーとして使用される普遍的Ｍ１３プライマーの配列範囲内にある。ベクターは、アンピシリンおよびカナマイシン抵抗性遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含む。
【図６】１９の選択ポジティブコロニーからのＰＣＲ生成物並びに分子マーカーを示すゲル写真である。
【図７】図６からのコロニー８のＤＮＡ配列を示す。一番上の線は、実際のＤＮＡ配列でありそして図の下方に示されているのは、自動ＤＮＡ配列分析から得られたクロマトグラムである。
【図８】ｐＥＮＴＲ−１１ベクターのマップである。
【図９】Ａｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターのマップである。
【図１０】ＰＮＣ−２８ＥＧのＰＣＲ増幅生成物を示すゲル写真である。
【図１１】精製されたｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ（レーン１および２）および５００ｂｐＤＮＡマーカー（レーン７）のゲル写真である。
【図１２】Ａは、トランスフェクション後７２時間の接着ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞の数を示すグラフである。Ｂは、トランスフェクション後７２時間目のＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞を示す顕微鏡写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潰瘍性疾患の治療用の薬剤に関する。さらに特に、本発明は、悪性かつ形質転換した細胞を選択的に破壊する合成ペプチド、並びにそれに基づく潰瘍性疾患の治療方法を含む。本発明は、またガンに対するウイルス治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３蛋白は、細胞サイクルの重要な調節物である。それは、一部分、有糸分裂を誘導する蛋白の転写をブロックすることによりそして有糸分裂をブロックする蛋白の転写を誘導することにより有糸分裂を誘導しそしてアポトーシスを促進する多数のガン遺伝子蛋白のガン遺伝子作用をブロックする。ｐ５３細胞がないことは、細胞の形質転換および悪性疾患と関係がある。（非特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ＆Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０
【０００４】
ｐ５３蛋白分子は、３９３のアミノ酸からなる。それは、残基９３〜３１３からなるＤＮＡ結合ドメイン中のＤＮＡの特定配列に結合するドメインを含む。この領域の結晶構造は、Ｘ線結晶分析により決定されている。残基３１２〜３９３は、ｐ５３蛋白のホモテトラマーの形成に含まれる。残基１〜９３は、ｐ５３蛋白の活性および半減期の調節に含まれる。
【０００５】
ｐ５３蛋白は、他の重要な調節蛋白であるＭＤＭ−２蛋白に結合する。ＭＤＭ−２蛋白をエンコードするＭＤＭ遺伝子は、周知のガン遺伝子である。ＭＤＭ−２蛋白は、ｐ５３蛋白と複合体を形成し、それは、ユビキネーション経路によりｐ５３蛋白の分解を生ずる。ｐ５３蛋白は、ｐ５３蛋白の残基１４〜２２（インバリアント）を含むアミノ酸配列を使用してＭＤＭ−２蛋白に結合する。ｐ５３蛋白の全ＭＤＭ−２蛋白結合ドメインは、残基１２〜２６に及ぶ。（非特許文献２）。
【０００６】
【非特許文献２】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ＆Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０
【０００７】
ＭＤＭ−２蛋白が周知のガン遺伝子の発現生成物であることを考えて、ＭＤＭ−２蛋白が非常に重要な調節蛋白であることは驚くにあたらない。その上、ＭＤＭ−２蛋白の過剰発現または増幅は、ヒト乳房腫瘍の５０％を含むヒトの悪性の４０〜６０％に見いだされている。ｐ５３蛋白とＭＤＭ−２蛋白との間の複合体の形成が、ｐ５３蛋白の転写活性の阻害を生じ、そのためｐ５３蛋白の活性化ドメインまたはそのなかのＤＮＡ結合部位のブロックによる分子の抗腫瘍作用を生ずることが示唆されている。さらに一般的に、これらおよび他の実験の観察は、ｐ５３蛋白の抗腫瘍作用が、ｐ５３蛋白へのＭＤＭ−２蛋白の結合を干渉できるペプチドによって増強されるかもしれないことを示唆していると解釈されてきている。事実、多数の研究が、ＭＤＭ−２／ｐ５３複合体が合理的なドラッグデザインの標的であるかもしれないことを示唆している。（非特許文献３）および（特許文献１）参照。
【０００８】
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｗａｓｙｌｙｋ ｅｔａｌ．，「ｐ５３ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅａｔｈ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＤＭ２ ｂｙ ａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＤＭ２ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ５３」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，１９２１−３４（１９９９）
【特許文献１】米国特許５７７０３７７
【０００９】
広範囲のスペクトルの細胞に感染するアデノウイルスの能力およびその高い感染能力は、それをガン治療の顕著な候補者にしている（非特許文献４）。アデノウイルスは、二十面体のキャプシドからなる。ウイルスのゲノムを包んでいるキャプシドは、３つの主な蛋白すなわちヘキソン、ペントン塩基そしてこぶ状になった繊維からなる。さらに、いくつかの小さい蛋白、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２並びにウイルスをエンコードしたプロテアーゼも存在する。ウイルスのゲノムは、長い末端の繰り返し（ＬＴＲ）を有する５’末端に共有結合で結合した末端蛋白を有する線状の二本鎖ＤＮＡである。ＤＮＡは、また蛋白ＶＩＩおよびｍｕとして周知のペプチドと伴生している（非特許文献５）。アデノウイルスのゲノムは、３つの機能的なカテゴリーにさらに分類でき、初期の遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４蛋白についてエンコードする）、遅滞遺伝子および単一の主な後期のユニットである。ＤＮＡ複製、ウイルス遺伝子の転写、宿主細胞の免疫抑制および宿主細胞のアポトーシスの阻害は、初期遺伝子生成物に起因する。後期遺伝子の生成は、ウイルスアセンブリを必要とする（非特許文献６）。
【００１０】
【非特許文献４】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【非特許文献５】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【非特許文献６】Ｗａｎｇ Ｉ．Ｉ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｉ．Ｉ．（２０００）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｉｙ Ｔｏｄａｙ ５，１０−１６
【００１１】
アデノウイルスの感染性サイクルは、初期の相および後期の相で規定できる。初期の相は、宿主細胞中へのウイルスの侵入次に核中へのウイルスゲノムの移動および初期遺伝子の選択的転写および翻訳をカバーする（非特許文献７）。これらの初期の事象では、ウイルスは、後期の遺伝子の翻訳を導くウイルスＤＮＡの複製を助けるために、宿主細胞の機能を引き継ぐ。細胞の屈性における主要なファクターは、受容体の認識である。蛋白のこぶ状になった繊維は、高い親和性で、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）として周知の細胞表面の受容体に結合する。細胞の感染は、先ずこぶ状になった繊維のＣＡＲへの結合により開始される。ウイルスのインターナリゼーションは、表面のインテグリン−蛋白（細胞接着、細胞−細胞結合および他の細胞−細胞関連現象における細胞外マトリックスに含まれる）へのペントン塩基の追加の結合を含む（非特許文献８）、（非特許文献９）。多数のシグナル経路が、次に誘導され、ウイルス粒子のクラスリン仲介エンドサイトーシスを助ける。エンドサイトーシスは、ウイルス粒子の陥入、次にエンドサイトーシス小胞の発生を生ずるプラズマ膜の切り取りを含む。ウイルスをエンコードするプロテアーゼは、次に構造蛋白ＶＩの分解によりウイルスキャプシドを分裂させる。ウイルスは、次に核膜に移動し、そこでゲノムは核中に入り、最初の転写を導く。ウイルスゲノムは、細胞蛋白ｐ３２の助けにより宿主の核に近づくことができると思われる。ｐ３２は、主としてミトコンドリアに見いだされるが、また核にも存在する。蛋白は、ミトコンドリアと核との間の細胞内シャトルとして働く。ウイルスは、核へ近づくためにこの細胞内シャトルシステムを支配できるように見える（非特許文献１０）。
【００１２】
【非特許文献７】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【非特許文献８】Ｍａｔｈｉａｓ，Ｐ．，Ｇａｌｌｅｎｏ，Ｍ．＆Ｎｅｒｎｅｒｏｗ，Ｇ．Ｒ．（１９９８）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｌｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖ β５ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，３３６５−３３７４．
【非特許文献９】Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ，Ｗｉｎｉｔｚ，Ｓ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅｓｓ，Ｓ．，Ｒｅｎ，Ｘ．Ｄ．，Ｒｅｎｓｈａｗ，Ｍ．Ｗ．＆Ｓｃｈｗａｒｔｚ；Ｍ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １７，２０７−２２０．
【非特許文献１０】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【００１３】
低い病的状態および高いレベルのトランス遺伝子発現は、アデノウイルスを機能的な研究において非常に魅力的なベクターにする。しかし、生体内の免疫反応の優越性は、ベクターの実際的な展開において制限ファクターである。トランス遺伝子発現の持続時間は、生体内では、感染した細胞に向かう宿主の抗アデノウイルス免疫反応により大幅に制限される（非特許文献１１）。上皮細胞は、例えば、アデノウイルス感染を阻害する抗細菌性ペプチドを放出できる（非特許文献１２）。他の防御機構は、感染初期におけるインターフェロンとして周知の細胞性蛋白の放出を含む。インターフェロンは、細胞のＪａｋ／ＳＴＡＴ経路を活性化し、それは感染された細胞を排除しそして感染から健康な細胞を保護できる一連の遺伝子生成物の転写を制御するインターフェロン反応要素の活性化を生ずる（非特許文献１３）。ＭＨＣクラスＩ抗原の範囲における感染された細胞の表面に存在するウイルス抗原のＴ細胞の認識は、細胞毒性Ｔ細胞からのパーフォリンの移動および感染された細胞の溶解を生ずる。ウイルスの活性は、またプログラムされた細胞死を導くアポトーシス経路を生ずる。特にガン治療では、その目的がすべての形質転換された細胞を排除することであるが、免疫反応の活性化が望ましい作用である。
【００１４】
【非特許文献１１】Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｎｕｎｅｓ，Ｆ．Ａ．，Ｂｅｒｅｎｃｓｉ，Ｋ．，Ｆｕｒｔｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｇｏｎｃｚｏｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４，９１：４４０７−４４１１：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｌｉｍｉｔｓ Ｅｌ−ｄｅｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ
【非特許文献１２】Ｇｒｏｐｐ，Ｒ．，Ｆｒｙｅ，Ｍ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｏ．＆Ｂａｒｇｏｎ，Ｊ．（１９９９）．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ ｉｍｐａｉｒ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｄｅｉｏｖｉｒｕｓ−ｒｎｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｘ，９５７−９６４
【非特許文献１３】Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ，Ｓ．，Ｄｉｄｃｏｃｋ，Ｌ．＆Ｒａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｅ．（２０００）．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１，２３４１−２３６５
【００１５】
腫瘍サプレッサーｐ５３は、アポトーシスおよび細胞サイクル阻止において主要な役割をはたす（非特許文献１４）。この蛋白は、Ｂａｘのような抗増殖蛋白の転写を制御する。Ｂａｘは、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を刺激し、それはアダプター蛋白Ａｐａｆ−１および全複合体に結合し、次にプロカスパスを活性化して細胞死を導く（非特許文献１５）。ｐ５３は、腫瘍蛋白マウスダブルマイニュート２、ｍｄｍ２により制御される。ｍｄｍ２は、ｐ５３蛋白と複合体を形成でき、そのユビキチン化およびプロテアソームによるその分解を導く（非特許文献１６）。ｐ５３は、細胞に生ずるかもしれないコントロールされない細胞の増殖および突然変異のような危険な事象からの保護をもたらす。防御性ｐ５３遺伝子は、細胞について多数の有害な結果を有する。ｐ５３を欠く細胞または突然変異したｐ５３を含む細胞は、アポトーシスを回避できそしてそれらの増殖を続ける。これらの細胞内のＤＮＡ損傷は、それぞれの新しい部分に蓄積し、一方細胞はそれらを修復できない。従って、ｐ５３の機能の損失は、ガンの発生に密接に関連している。ｐ５３の機能の損失により、突然変異細胞は、細胞サイクルを通してアポトーシスそしてそれらが分裂するときガン促進突然変異の蓄積を回避し続けることができる（非特許文献１７）。
【００１６】
【非特許文献１４】Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．，Ｌｅｗｉｓ Ｊ．，ＲａｆｆＭ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．（２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ
【非特許文献１５】Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．，Ｌｅｗｉｓ Ｊ．，ＲａｆｆＭ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．（２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ
【非特許文献１６】Ｕｃｈｉｄａ Ｔ．，Ｍｉｎｅｉ Ｓ．，Ｇａｏ，Ｊ．，Ｗａｎｇ Ｃ．，Ｓａｔｏｈ Ｔ．，Ｂａｂａ Ｓ．（２００２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆｐ５３，ＭＤＭ２ ａｎｄ ｂｃｌ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｄｄｅｒ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：２５３−２５９
【非特許文献１７】Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．，Ｌｅｗｉｓ Ｊ．，ＲａｆｆＭ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．（２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ
【００１７】
ｐ５３遺伝子の突然変異並びに広範囲のヒトの腫瘍の発生へのその関連は、野生型ｐ５３を配合したベクターの開発を促している。これらのベクターは、未分化甲状腺ガン、ヒト悪性グリオームおよび乳ガンについて生体外および生体内でテストして成功している（非特許文献１８）。
【００１８】
【非特許文献１８】Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．（２０００）Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８１ ２５７３−２６０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
悪性または形質転換された細胞を選択的に殺すペプチドを提供することに加えて、本発明は、これらのペプチドをコードするトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を配合するアデノウイルスベクター（ＡｄＶ）を提供する。これらのベクターを悪性および形質転換された細胞への投与は、これら細胞の死を生ずる。目的のＡｄＶ発現伝達体は、膵臓ガンを含む異なる潰瘍性疾患を治療するのにそれらの抗増殖性について特に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体を提供し、該ペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、膜浸透リーダー配列に融合しそして悪性または形質転換した細胞を選択的に死に至らしめる。
【００２１】
これらペプチドの例は、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはそのアナログまたは誘導体、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはそのアナログまたは誘導体、ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログまたは誘導体である。細胞膜を通って輸送されそして悪性または形質転換された細胞を選択的に殺すために、リーダー配列は、好ましくは、ペプチド、そのアナログまたは誘導体のカルボキシル末端に位置する。好ましくは、リーダー配列は、主として正の電荷を有するアミノ酸残基からなる。本発明に従って使用できるリーダー配列の例は、ペネトラチン、Ａｒｇｓ、ＨＩＶ１のＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｒ−ＴＡＴ、ＳＶ４０−ＮＬＳ、ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ、ＨＩＶ ＲＥＶ（３４−５０）、ＦＨＶコート（３５−４９）、ＢＭＶ ＧＡＧ（７−２５）、ＨＴＬＶ−ＩＩＲＥＸ（４−１６）、ＣＣＭＶ ＧＡＧ（７−２５）、Ｐ２２Ｎ（１４−３０）、ラムダＮ（１−２２）、デルタＮ（１２−２９）、酵母ＧＣＮ４、およびｐ−ｖｅｃを含むが、これらに限定されない。好ましくは、リーダー配列は、アミノ酸配列ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）を有するアンテナペディア蛋白からのペネトラチン配列である。
【００２２】
製薬上許容できる担体と混合された本発明のペプチドの少なくとも１つを含む製薬組成物も提供される。さらに、患者の潰瘍性疾患を治療するすなわち患者の悪性または潰瘍性細胞を選択的に殺す方法が提供される。１つの態様では、方法は、患者に、治療上有効な量のアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体を投与し、該ペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、そのカルボキシル末端で膜浸透リーダー配列に融合しそして悪性または形質転換した細胞を選択的に死に至らしめる。他の態様では、方法は、患者に、治療上有効な量の配列番号１、配列番号２または配列番号３に示される配列を有する少なくとも１つのペプチドまたはそのアナログまたは誘導体を投与することであり、膜浸透リーダー配列は、ペプチド、そのアナログまたは誘導体のカルボキシル末端に融合する。
【００２３】
本発明は、また本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーターからなる複製不能アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターを提供する。複製不能ＡｄＶの例は、例えば、欠失したＥ１およびＥ３遺伝子を有するＡｄＶを含む。１つの態様では、ペプチドがアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体からなる、本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーターからなる複製不能ＡｄＶベクターが提供される。例えば、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーター配列からなる複製不能ＡｄＶベクターが提供される。本発明の他の態様では、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーター配列からなる複製不能ＡｄＶベクターが提供される。本発明のなお他の態様では、アミノ酸配列ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーター配列からなる複製不能ＡｄＶベクターが提供される。
【００２４】
本発明の他の構成では、患者の悪性または潰瘍性細胞を選択的に殺す方法を提供する。方法は、患者に、前記のペプチドの任意のものまたはそのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーターからなる本発明の複製不能ＡｄＶベクターの治療上有効な量を投与することからなる。好ましくは、悪性または潰瘍性細胞は、膵臓ガン細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明によれば、悪性および形質転換した細胞が、単一の連続するポリペプチド鎖としてｐ５３蛋白内のアミノ酸の配列およびリーダー配列からなる合成ペプチドの投与により選択的に破壊されることが見いだされた。作用の機構は、ｐ５３ペプチドがｐ５３蛋白を全く生成しない形質転換した細胞を選択的に殺すので、ＭＤＭ−２蛋白に結合しているｐ５３蛋白に無関係なように思われる。ｐ５３ペプチドは、また正常の細胞を殺すことなく正常または高レベルのｐ５３蛋白を発現する悪性および形質転換した細胞を選択的に殺す。
【００２６】
本発明によれば、ヒトｐ５３のアミノ酸残基１２−２６のすべてまたは一部に相当するペプチドからなる組成物が提供される。この領域は、ｈｄｍ−２およびｍｄｍ−２蛋白と接触しそしていずれかの蛋白に結合したときα−らせん構造をとることが知られている。膜浸透リーダー配列によりカルボキシ末端に融合するとき、本発明のペプチドは、悪性および形質転換したヒト細胞を選択的に殺す。
【００２７】
本発明の第一の構成では、以下のアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドが提供され、少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドは、リーダー配列に融合する。好ましくは、ペプチドは、少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸残基からなる。好ましい態様では、配列番号１に示される配列の少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸からなるペプチドは、以下のアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）を有する。他の好ましい態様では、配列番号１に示される配列の少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸からなるペプチドは、以下のアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）を有する。なお他の態様では、配列番号１に示される配列の少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸からなるペプチドは、以下のアミノ酸配列ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を有する。
【００２８】
本発明のペプチドを細胞に運ぶ機能のリーダー配列は、種々の源から由来する。好ましくは、リーダー配列は、正の電荷を有するリーダー配列が本発明のペプチドのアルファらせんを安定化するために、圧倒的に正の電荷を有するアミノ酸残基からなる。本発明のペプチドに結合するリーダー配列の例は、（非特許文献１９）に記載されており、以下の膜浸透リーダー配列を含むが、これらに限定されない（蛋白のリーダー配列を構成しているアミノ酸残基の数は、多くの場合、蛋白の名の直後にかっこで示されている）。ペネトラチン（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ）（配列番号４）；（Ａｒｇ）８または（Ｒ）４−（Ｒ）１６からの任意のポリ−Ｒ；ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（４７−６０）（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５）；Ｄ−ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号６）；Ｒ−ＴＡＴ Ｇ（Ｒ）９ＰＰＱ（配列番号７）；ＳＶ４０−ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号８）；ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＩＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）（配列番号９）；ＨＩＶ ＲＥＶ（３４−５０）−（ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ）（配列番号１０）；ＦＨＶ（３５−４９）コート−（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ）（配列番号１１）；ＢＭＶ ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）（配列番号１２）；ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲＥＸ４−１６−（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ）（配列番号１３）；ＣＣＭＶ ＧＡＧ（７−２５）−（ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ）（配列番号１４）；Ｐ２２Ｎ（１４−３０）（ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ）（配列番号１５）；ＬＡＭＢＤＡ Ｎ（１−２２）（ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ）（配列番号１６）；ＰｈｉＮ（１２−２９）（ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ）（配列番号１７）；ＹＥＡＳＴ ＰＲＰ６（１２９−１２４）（ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ）（配列番号１８）；ＨＵＭＡＮ Ｕ２ＡＦ（ＳＱＭＴＲＱＡＲＲＬＹＶ）（配列番号１９）；ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＦＯＳ（１３９−１６４）ＫＲＲＩＲＲＥＲＮＫＭＡＡＡＫＳＲＮＲＲＲＥＬＴＤＴ（配列番号２０）；ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＪＵＮ（２５２−２７９）（ＲＩＫＡＥＲＫＲＭＲＮＲＩＡＡＳＫＳＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ）（配列番号２１）；ＹＥＡＳＴ ＧＣＮ４（ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ）（配列番号２２）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２３）；ｐ−ｖｅｃ ＬＬＩＩＲＲＲＩＲＫＱＡＫＡＨＳＫ（配列番号２４）。他の膜浸透リーダー配列も使用できる。これらの配列は、非常に容易に入手でき、そして例えば（非特許文献２０）および（非特許文献２１）に記載されている。
【００２９】
【非特許文献１９】Ｓｃｈｅｌｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６０４３−６０４９
【非特許文献２０】Ｅｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６９：２３７−２４４
【非特許文献２１】Ｅｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６９：２３７−２４４
【００３０】
好ましくは、アンテナペディア蛋白のペネトラチンリーダー配列の正の電荷を有するリーダー配列が使用される。このリーダー配列は、以下のアミノ酸配列を有する。ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）。好ましくは、リーダー配列は、ｐ５３ペプチドのカルボキシル末端に付着して、合成ペプチドが形質転換した悪性の細胞を殺すことができる。
【００３１】
構造的に関連のあるアミノ酸配列は、本発明を実施するに当たって、配列番号１、２、３または４に示される開示された配列の代わりをすることができる。それらのアナログまたは誘導体を含む配列番号１、２または３に記載される任意の配列は、配列番号４に記載される配列を含むがこれに限定されないリーダー配列と結合するとき、本明細書では、「合成ペプチド」または「複数の合成ペプチド」と呼称される。これらの合成ペプチドの三次元構造を真似る固定した分子は、ペプチド類似物とよばれ、そしてまた本発明の範囲内に含まれる。ｐ５３ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端の何れかまたはそれらの両者でのアルファらせん安定化アミノ酸残基を、それがＭＤＭ−２蛋白に結合するとき、ｐ５３蛋白のこの領域の立体配座であることが知られているアルファらせん立体配座を安定化するために添加できる。アルファらせん安定化アミノ酸の例は、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ（特にらせんのアミノ末端において）、ＭｅｔおよびＰｈｅを含む。
【００３２】
本発明のペプチドのアミノ酸挿入誘導体は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列の変異型は、ランダムな挿入も得られる生成物の好適なスクリーニングにより可能であるが、本発明のペプチドにおける予定された部位中に１つ以上のアミノ酸残基が誘導されるものである。欠失変異型は、本発明のペプチドの配列から１つ以上のアミノ酸を除くことにより生成できる。置換アミノ酸変異型は、配列中の少なくとも１つの残基が除かれそして異なる残基がその位置に挿入されているものである。代表的な置換は、以下の表１に従って生成されるものである。
【００３３】
【表１】
【００３４】
合成ペプチドがアミノ酸置換により誘導されるとき、アミノ酸は、一般に、同様な性質例えば疎水性、親水性、電気陰性、かさ高な側鎖などを有する他のアミノ酸によって置換される。本明細書で使用されるとき、用語「誘導体」、「アナログ」、「フラグメント」、「部分」および「同様な分子」は、該誘導体、アナログ、フラグメント、部分または同様な分子が形質転換したまたは新生物の細胞に入りそして選択的に殺す能力を維持する限り、アミノ酸置換、挿入、付加または欠失を有する配列番号１、２、３または４に示されるようなアミノ酸配列を有する本発明のペプチドをいう。
【００３５】
本発明の合成ペプチドは、多数の周知の技術により合成できる。例えば、ペプチドは、（非特許文献２２）により最初に記述された固相技術を使用して製造できる。他のペプチド合成技術は、（非特許文献２３）および当業者が容易に入手できる他の参考文献に見いだすことができる。ポリペプチドの合成技術の要約は、（非特許文献２４）に見いだすことができる。ペプチドは、また（非特許文献２５）に記述されたように溶液法により合成できる。異なるペプチド合成に使用される適切な保護基は、上記のテキスト並びに（非特許文献２６）に記述されている。本発明のペプチドは、またｐ５３蛋白の大部分からまたはｐ５３蛋白全体から化学または酵素による切断によって製造できる。同様に、本発明の合成ペプチドで使用されるリーダー配列は、これらのリーダー配列が由来する蛋白の大部分または蛋白全体からの化学または酵素による切断により製造できる。
【００３６】
【非特許文献２２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）
【非特許文献２３】Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ．ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第二版（１９７６）
【非特許文献２４】Ｊ．Ｓｔｒｕｒａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．，（１９８４）
【非特許文献２５】Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＩＩ巻、第三版、Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）
【非特許文献２６】Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）
【００３７】
さらに、本発明のペプチドは、また組み換えＤＮＡ技術により製造できる。蛋白をつくるのに使用されるほとんどのアミノ酸では、１つより多いコーディングヌクレオチドトリプレット（コドン）は、特別のアミノ酸残基についてコードする。遺伝コードのこの性質は、重複性として周知である。そのため、多数のヌクレオチド配列は、悪性および形質転換した哺乳動物の細胞を選択的に殺す特別の本発明のペプチドについてコードできる。本発明は、またそれから本発明のペプチドが酵素的または化学的に切断されるキメラペプチドまたは本発明のペプチドをコードするすなわち発現できる遺伝子を規定するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包含する。
【００３８】
培地で成長する細胞に適用されるとき、合成ペプチドは、悪性または形質転換した細胞を選択的に殺し、細胞の数を投与量に依存して低下させる。効果は、２時間内または３時間内そしてせいぜい４８時間内で一般に観察できる。培地で成長したラットの膵臓腺房細胞の系（ＢＭＲＰＡ．４３０）は、Ｋ−ｒａｓにより形質転換された。正常の細胞系は、膵臓腺房細胞に典型的な構造を示し、形質転換した細胞（ＴＵＣ−３）は、腺房細胞の文化した形態を欠き、典型的な膵臓ガン細胞と思われる。ＢＭＲＰＡ．４３０細胞が、リーダー配列番号４にカップリングした配列番号１の一次構造を有する合成ペプチドにより５０μｇ／ｍＬの投与量で処理されたとき、細胞は影響されなかった。しかし、ＴＵＣ−３細胞が、リーダー配列番号４にカップリングした配列番号１の一次構造を有するペプチドにより１００μｇ／ｍＬの投与量で処理されたとき、それらは３−４日以内に死んだ。同様な結果は、同じ実験が行われたが配列番号１が配列番号２または配列番号３の何れかにより置換されたとき、得られた。さらに、形質転換したおよび悪性の細胞の死は、リーダー配列番号にカップリングした配列番号１の一次構造を有する合成ペプチドにより１００μｇ／ｍＬの投与量で処理されたヒト乳ガン細胞系および黒色腫およびＨｅｌａ細胞について観察された。対照的に、同じ投与量で同じ合成ペプチドは、非悪性および非形質転換したヒト胸部または繊維芽細胞系に対してなんら作用しなかった。
【００３９】
配列番号４に示されるリーダー配列がＰＮＣ２９すなわち以下のアミノ酸配列ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有するコントロール蛋白のカルボキシ末端に位置したとき、悪性または正常の細胞になんら作用しなかった。
【００４０】
さらに、配列番号４に示されるリーダー配列へカルボキシ末端で融合した配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、成長因子の存在下造血細胞系に分化するヒト幹細胞の能力になんら作用しない。これは、このペプチドが、化学治療薬として投与されるとき、骨髄細胞に有害ではないことを示している。（非特許文献２７）参照。この記述は、十分に示されるならば、本明細書に参考として引用される。
【００４１】
【非特許文献２７】Ｋａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ．ａｌ．，（２００１年１０月２３日）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（２２）：１２４３８−１２４４３
【００４２】
培養されたガン細胞が、１００μｇ／ｍＬの投与量で、結合したリーダー配列なしの配列番号１の一次構造を有するペプチドにより処理されたとき、細胞は影響されなかった。同様に、培養されたガン細胞が、同じ投与量で、リーダー配列番号４すなわち現在好ましいリーダー配列により処理されたとき、細胞は、また影響されなかった。これらの結果は、合成ペプチドのリーダー配列が合成ペプチドを処理された細胞の細胞膜を通ることを可能にすることを示し、そして合成ペプチドの作用が必ず細胞内であることを示している。
【００４３】
合成ペプチドが、ｐ５３蛋白およびＭＤＭ−２蛋白の結合と干渉することにより働いたかどうかを決定するために、合成ペプチドは、ホモ接合の欠失によりｐ５３蛋白を作ることができなくされた形質転換した結腸直腸腺ガン細胞についてテストされた。驚くべきことに、合成ペプチドは、形質転換した細胞を選択的に殺すが、正常な細胞に対して作用しなかった。これらの結果は、作用のメカニズムが、ＭＤＭ−２蛋白に結合したｐ５３蛋白に関係がないように見える。それは、ｐ５３ペプチドが、ｐ５３蛋白を全く生成しない形質転換した細胞を選択的に殺すからである。これらの結果は、ＭＤＭ−２蛋白へのｐ５３蛋白の結合との干渉が、それにより合成ペプチドが悪性および形質転換した細胞の選択的死を生じさせるメカニズムではないことを示している。本明細書で開示された合成ペプチド、それらの誘導体、アナログおよびペプチド類似分子は、ガンのような新生物疾患の治療に有用であるが、形質転換および悪性の細胞に対する作用メカニズムは、見いだされていない。
【００４４】
本発明のペプチドは、生体内で新生物細胞に対して有効である。例えば、膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３を異種移植されしかも約３−６ｍｍの発育した腫瘍サイズを有するマウスは、本発明の合成ペプチド、例えばカルボキシ末端でリーダー配列に融合した配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するペプチドの投与後、これらの腫瘍のサイズを劇的に低下させる。
【００４５】
本発明のペプチドの観察された性質と一致して、本発明のペプチドは、新生物または悪性の細胞すなわち動物殊にヒトのガン細胞を選択的に殺すのに使用できる。本発明の合成ペプチドは、従って有効量で投与されて、患者のヒトまたは動物の新生物細胞を殺す。
【００４６】
本発明の合成ペプチドは、好ましくは、製薬上許容できる担体とともに本発明による少なくとも１つの合成ペプチドを治療上有効な量で含む製薬組成物としてヒトの患者に投与できる。用語「治療上有効量」または「製薬上有効量」は、新生物または悪性の細胞すなわちガン細胞を選択的に殺すことを含む抑制された成長を個体に生成するのに必要な投与量を意味する。
【００４７】
好ましくは、本発明の１つ以上の合成ペプチドを含む組成物は、新生物細胞を選択的に殺す従って新生物または悪性の疾患例えばガンを治療する目的で静脈内に投与される。本発明の１つ以上のペプチドを使用して有効に治療できる異なるガンの例は、乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、子宮頸ガン、結腸ガン、黒色腫、膵臓ガンおよびすべての固形組織腫瘍（上皮細胞腫瘍）を含むがこれらに限定されず、そしてリンパ腫および白血病を含むがこれらに限定されない血液のガンを含む。
【００４８】
本発明の合成ペプチドの投与は、経口、静脈内、鼻孔内、直腸内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下の投与によりまたは注入または埋め込みによる。これらの方法で投与されるとき、本発明の合成ペプチドは、他の成分例えば担体および／または助剤と組み合わせることができる。他の成分の性質には制限がないが、ただしそれらは製薬上許容でき、それらの目的とする投与に有効でなければならず、組成物の活性成分の活性を低下させてはならずそして本発明のペプチドの細胞中への移入を妨げてはならない。ペプチド組成物は、また好ましくは、それからパッチまたは挿入物が、本発明の合成ペプチドの１つ以上を治療上有効な量で時間依存で放出する液状または半液状の皮膚伝達パッチに含浸でき、または皮下挿入物に含まれることができる。
【００４９】
注射に好適な製薬の形は、滅菌の注射可能な溶液または分散物の即時の調製のための滅菌粉末、および滅菌溶液または分散物を含む。最終の溶液の形は、すべての場合で、滅菌かつ流体でなければならない。典型的な担体は、例えば水緩衝した水溶液すなわち生体適合性緩衝液、エタノール、ポリオール例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、これらの好適な混合物、界面活性剤または植物油を含む溶媒または分散媒体を含む。滅菌は、濾過または抗菌剤または抗かび剤の添加を含むがこれらに限定されない任意の当該技術に認められている方法を利用して達成できる。これらの剤の例は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールを含む。等張剤例えば砂糖または塩化ナトリウムも本発明の組成物中に配合できる。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「製薬上許容できる担体」は、任意かつすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗かび剤、等張剤などを含む。これらの媒体および剤の使用は、当業者に周知である。
【００５１】
本発明の合成ペプチドを含む滅菌の注射可能な溶液の製造は、必要に応じ上記の種々の成分の１つ以上を含む適切な溶媒中に、必要な量で上記の本発明の合成ペプチドの１つ以上を配合し、次に滅菌好ましくは濾過滅菌により達成される。滅菌粉末を得るために、上記の溶液は、必要に応じ真空乾燥または凍結乾燥される。
【００５２】
不活性希釈剤および／または同化可能な可食性の担体などは、ペプチドが経口的に投与されるとき、製薬組成物の一部にできる。製薬組成物は、ハードまたはソフトのゼラチンカプセル中に存在するか、または錠剤に打錠されるかまたはエリキシル、懸濁物、シロップなどに製造される。
【００５３】
本発明の合成ペプチドは、従って治療上有効な投与量で好適な製薬上許容できる担体ともに製薬上有効な量で好都合かつ有効な投与に製造される。製薬上有効な量の例は、少なくとも約２５μｇ／ｍＬから少なくとも約３００μｇ／ｍＬの範囲のペプチド濃度を含む。
【００５４】
ヒトに適用される本発明の方法で使用されるべき合成ペプチドの精密な治療上有効な量は、新生物疾患の段階、腫瘍のサイズおよび強さ、転移の存在または程度などの変動により述べることができない。さらに、個体の体重、性別および全体の健康は、考慮されねばならずそして投与量に影響するだろう。しかし、本発明の合成ペプチドが１投与あたり少なくとも約１０ｍｇの量、さらに好ましくは１投与あたり約１０００ｍｇまでの量で投与されることが、一般に述べることができる。本発明のペプチド組成物は最終的に血流から排除されるので、製薬組成物の再投与が指示され好まれる。
【００５５】
本発明の合成ペプチドは、投与処方と適合するやり方でそして治療上有効である量で投与できる。合成ペプチドは、年齢、体重および患者の症状および投与の経路に依存する。ヒト成人への投与の好適な投与量の例は、体重１ｋｇあたり約０．１〜約２０ｍｇに及ぶ。好ましくは、投与量は、体重１ｋｇあたり約０．１〜約１０ｍｇである。
【００５６】
本発明によって、また新生物疾患を治療する方法が提供される。方法は、この治療を要する患者に、そのアナログおよび誘導体を含む上記の合成ペプチドを治療上有効な量で投与することからなる。従って、例えば、１つの態様では、リーダー配列へそのカルボキシ末端で融合した配列番号１に示される少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与される。他の態様では、リーダー配列へそのカルボキシ末端で融合した配列番号１に示される少なくとも約８から少なくとも約１０の連続するアミノ酸からなるペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与される。例えば、リーダー配列へそのカルボキシ末端で融合した配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与される。リーダー配列へそのカルボキシ末端で融合した配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与できる。なお他の態様では、リーダー配列にそのカルボキシ末端で融合した配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのアナログまたは誘導体は、有効な量で患者に投与できる。治療法によれば、合成ペプチドの混合物が投与できる。従って、例えば、有効な量で上記のペプチドまたはそのアナログまたは誘導体の１つを投与することに加えて、２つ以上の上記のペプチドまたはアナログまたは誘導体の混合物が患者に投与できる。
【００５７】
本発明の他の構成では、上記で十分に記述された、複製不能アデノウイルス（ＡｄＶ）を含みそして本発明のペプチドのためのコーディング配列に実施可能に結合したプロモーター配列例えば上記のペプチドすなわち配列番号１、配列番号２，配列番号３またはそれらのアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列を有する発現媒体が提供される。上記のように、１つより多いトリプレット（コドン）は、特定のアミノ酸残基についてコードできる。表２は、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されたアミノ酸配列をエンコードするのに使用できるコドンの異なる組み合わせを示す。配列番号１のアミノ酸配列は、太字で表の一番上のラインに示される。配列番号２および配列番号３の両者のアミノ酸配列は、この太字の部分内に見いだすことができる。表２の太字のヌクレオチド配列は、ＰＮＣ−２８ＥＧのヌクレオチド配列に相当する。
【００５８】
【表２】
【００５９】
配列番号１、２または３に示されるアミノ酸配列のアナログまたは誘導体をエンコードするヌクレオチド配列を使用するには、当業者は、遺伝コードの表を参照して適切なコドンを選ぶことができる。
【００６０】
Ａｄの多数の異なるクラスが存在し、そして本発明の方法で使用できる。これらのＡｄベクターは、文献に記載されておりそして容易に入手できる。例えば、（非特許文献２８）、（非特許文献２９）参照。例えば、本発明によれば、Ｅ１および／またはＥ３遺伝子が除かれたＡｄベクターが使用でき、異種プロモーターのコントロールの下約６．５ｋｂまでのトランス遺伝子の導入を可能にする。（非特許文献３０）。欠陥Ｅ１ウイルスは、Ｅ１相補細胞系例えば２９３Ａ細胞（Ｅ１遺伝子をトランスでもたらす）で増殖できる。
【００６１】
【非特許文献２８】Ｂｒａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｇａｕｌｄｉｅ，Ｊ．；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ １９９５，６：５９０−５９５：Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ
【非特許文献２９】Ｈｉｔｔ，Ｍ．Ｍ．，Ａｄｄｉｓｏｎ，ＣＬ．ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．；Ａｄｖ．ＰｈａｒｍａｃｏＬ １９９６，４０：１３７−２０６：Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．
【非特許文献３０】Ｇｒａｈａｍ ＦＬ．Ｓｍｉｌｅｙ．Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．，ａｎｄ Ｎａｒｉｎ，Ｒ．（１９７７）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｔｒａｓｎｆｏｒｍ３ｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５．Ｊ．Ｇｅｎ．ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７４．
【００６２】
別に、Ｅ１およびＥ３遺伝子を欠くことに加えてまたＥ２遺伝子を欠くＡｄベクターが使用できる。例えば、（非特許文献３１）および（非特許文献３２）参照。
【００６３】
【非特許文献３１】Ｌｕｓｋｙ，Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｅｌ，Ｅ１／Ｅ２Ａ，ｏｒ Ｅ１／Ｅ４ ｄｅｌｅｔｅｄ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（３）：２０２２−３
【非特許文献３２】Ｏ’Ｎｅａｌ，Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８“Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｅ２ａ−ｄｅｌｅｔｅｄ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｌｐｈａｌ−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．９（１１）：１５９７−９８
【００６４】
さらに、ほとんどまたはすべてのＡｄコーディング配列を欠くヘルパー依存（ＨＤ）または実質を失った（ｇｕｔｔｅｄ）ベクターは、本発明に従って使用できる。これらのベクターは、治療遺伝子の長期にわたる発現が、マウスおよびモンキーで観察されているので、遺伝子治療用の遺伝子伝達ベクターとして大きな可能性を有する。組織培養におけるこれらの実質を失ったベクターの生成は、トランスの実質を失ったベクターの成長および組み立てに必要な蛋白を提供するために、相補的ヘルパーウイルスを要する。（非特許文献３３）、（非特許文献３４）、（非特許文献３５）参照。これらの文献およびそれらに引用されているすべての文献を、もし十分に示されているならば、参考として引用する。
【００６５】
【非特許文献３３】Ｃｈｅｎ，Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７“Ｐｅｒｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｌａｃｋｓ ａｌｌ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（４）：１４１４−１４１９
【非特許文献３４】Ｍｏｒｒａｌ，Ｎ．，ＲＪ Ｐａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）“Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｙｉｅｌｄ ｓｕｐｒａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｌｐｈａ １−ａｎｔｒｉｔｒｙｐｓｉｎ ｗｉｔｈ ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（１８）：２７０９−２７１６
【非特許文献３５】Ｍｏｒｒａｌ，Ｏ’Ｎｅａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９“Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｆｏｒ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ．“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（２２）：ｌ２８１６−１２８２１
【００６６】
上述のように、新生物疾患例えばガンのウイルス治療に関する本発明では、治療の目的が目標組織の取り除きである場合、ベクター感染細胞を目標とする宿主抗Ａｄ免疫反応が望ましいと考えられている。従って、実質を失ったＡｄベクターは、宿主のより強い免疫反応を誘発する初期の世代のいくつかと同様に、好ましくない。
【００６７】
Ａｄベクターは、２つのプラスミド系、すなわちエントリープラスミド、並びに上記のペプチド（配列番号１−３）およびそのアナログまたは誘導体の１つをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合したプロモーターを含むＥ１およびＥ３遺伝子欠失アデノウイルスゲノムから作られたデスチネーションベクターに基づく。２つのプラスミド系は、（非特許文献３６）、（非特許文献３７）、および（非特許文献３８）に十分に記載されている。Ｅ１およびＥ３の遺伝子欠失により、ウイルスは、Ｅ１およびＥ３蛋白を発現しない細胞を複製することを妨げられる。
【００６８】
【非特許文献３６】Ｇｒａｈａｍ ＦＬ．Ｓｍｉｌｅｙ．Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．，ａｎｄ Ｎａｒｉｎ，Ｒ．（１９７７）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｔｒａｓｎｆｏｒｍ３ｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５．Ｊ．Ｇｅｎ．ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７４
【非特許文献３７】Ｋｏｚａｒｓｋｙ，ＫＦ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ （１９９３） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｒｏｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３，４９９−５０３
【非特許文献３８】Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ Ｖ，ａｎｄ ＧｒａｈａｍＰＬ （１９９５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ Ｅｌ，Ｅ４，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＸ Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５ Ｍｕｔａｎｔｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６，１５７５−１５８６
【００６９】
例えば、エントリープラスミドは、そのプラスミドがラムダ組み換え反応によりＡｄＶ中にクローンされる本発明のペプチドをエンコードする遺伝子を含む。複製不能ベクターは、２９３Ａ細胞で増殖し、それはＡｄＶゲノムＤＮＡにより形質転換されたバイオエンジニアリングにより作られたヒト胚腎細胞である（非特許文献３９）。この細胞系は、ウイルス複製に必要な欠失遺伝子を補給する。
【００７０】
【非特許文献３９】Ｗａｎｇ Ｉ．Ｉ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｉ．Ｉ．（２０００）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖｅｉｙ Ｔｏｄａｙ ５，１０−１６
【００７１】
本発明の複製不能ＡｄＶベクターは、標準の組み換えＤＮＡ法を使用して構築できる。ベクターの構築のための標準の技術は、当業者に周知であり、そして文献例えば（非特許文献４０）、または非常に入手可能な組み換えＤＮＡ技術に関する多数の実験マニュアルの任意のものに見いだされる。種々の戦略は、ＤＮＡの連結フラグメントについて利用可能であり、その選択は、ＤＮＡフラグメントの末端の性質に依存しそして当業者によって容易に決定できる。本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合できる多数の異なるプロモーターが存在する。プロモーターは、本発明のＡｄＶベクターによる本発明の実施されるウイルス治療の細胞において機能しなければならない。本発明のＡｄＶベクターで使用できる多数の広く利用できるプロモーターが存在する。これらプロモーターの例は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＬＴＲ、ベータ−アクチン、ＥＦ−アルファ、Ｇａｌ−Ｅｌｂ、ＵｂＣ、ベータ−カゼイン、ＥＭ−７、ＥＦ、ＴＥＦ１、ＣＭＶ−２およびＢｓｄを含むが、これらに限定されない。好ましい態様では、プロモーターはＣＭＶである。
【００７２】
【非特許文献４０】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
【００７３】
組み換えベクターは、次に（非特許文献４１）Ｓｔｏｗ，Ｎ．Ｄ．１９８１（もし十分に示されるならば、参考として引用される）に記載されたような標準の方法を使用して未処理のウイルス中に再建される。未処理のウイルス中へ組み換えベクターを再建することを記述している他の文献は、（非特許文献４２）Ｃｒｏｕｚｅｔ Ｊ．Ｌ．Ｎａｕｄｉｎら、１９９７（また十分に示されるならば、参考として引用される）を含む。
【００７４】
【非特許文献４１】Ｓｔｏｗ，Ｎ．Ｄ．，１９８１，“Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅｆｔ−ｈａｎｄ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：１７１−１８０
【非特許文献４２】Ｃｒｏｕｚｅｔ Ｊ，Ｌ．Ｎａｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，“Ｒｅｃｏｎｉｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（４）：１４１４−１４１９
【００７５】
一度本発明のＡｄＶベクターが構築されるならば、それは異なるタイプのガンにかかった患者を治療するのに使用できる。新生物疾患（ガン）の治療は、これらの疾患にかかった患者に、本発明のアデノウイルスベクターからなる組成物を投与することにより達成される。ガンにかかったヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物は、有効な抗新生物投与量の本発明のベクターを投与することにより治療できる。本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチドに実施可能に結合したプロモーターからなる本発明のＡｄＶベクターは、乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、子宮頸ガン、結腸ガン、黒色腫、膵臓ガンおよびすべての固形組織腫瘍（上皮細胞腫瘍）を含むがこれらに限定されず、そしてリンパ腫および白血病を含むがこれらに限定されない血液のガンを含む。好ましい態様では、治療されるガンは、膵臓ガンである。
【００７６】
感染性アデノウイルス粒子の懸濁物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下および局所を含む種々の経路により新生物組織に適用できる。他の経路は、霧としての吸入（例えば、肺ガンの治療）、または例えばもし必要ならば手術中または子宮頸ガンのような腫瘍部位を綿棒で塗るような直接の適用を含む。アデノウイルス懸濁物は、また例えば卵巣ガンを治療するための腹腔中への点滴により投与できる。他の好適な経路は、浣腸（結腸ガン）またはカテーテル（膀胱ガンの場合）により、腫瘍の塊例えば乳ガン中への直接の注射を含む。
【００７７】
実際の投与は、年齢、体重、ガンのタイプおよび進行度、１つ以上の腫瘍の位置、転移の存在および患者の全体の状態に基づいて患者ごとに異なる。しかし、１ｍＬあたり約１０３〜約１０１５またはそれ以上のビリオン粒子を含むアデノウイルス懸濁物が投与されると、一般にいわれる。ＡｄＶベクター懸濁物の再投与は、必要に応じ行われる。
【００７８】
本発明のＡｄＶベクターは、薬理学的に有効な量の１つ以上の本発明のＡｄＶベクターを含む滅菌組成物で混合される。一般に、組成物は、水性懸濁物中で約１０３〜約１０１５またはそれ以上のＡｄＶ粒子を含む。滅菌組成物は、通常、例えば水、緩衝された水、０．４％塩水、０．３％グリシンなどのような水溶液である。これら組成物は、例えば生理学的な条件を模倣するための製薬上許容できる補助物質、例えばｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含むことができる。組成物は、また本発明のＡｄＶベクターによる細胞の感染を増加する助剤を含むことができる。
【００７９】
以下の実施例は、本発明をさらに説明しそしてその範囲を制限することを意味するものではない。
【実施例１】
【００８０】
以下の実験は、アミノ酸の末端に付着したリーダー配列を有する本発明のペプチドの有効性を比較するために行われた。上述したように、カルボキシ末端においてリーダー配列により合成されたペプチドは、ＭＤＭ−２に結合したとき、このペプチドのｐ５３部分の活性なコンホメーションであるペプチドのへリックスらせん形成を促進した。上述のように、配列番号１、２および３に示されたアミノ酸配列を有する本発明のペプチドは、同型的にｐ５３遺伝子を欠失したものを含む広範囲のヒトガン細胞に対して強い毒性を有する。配列番号１、２および３に示されたアミノ酸配列を有するそれぞれのペプチドに関するα−へリックスの確率のプロフィルは、２つの異なる方法、すなわち１つは蛋白のデータベースからのへリックスの確率を使用するもの（非特許文献４３）そして他は、（非特許文献４４）および（非特許文献４５）に記載されたように、これらのパラメーターに対する電荷の影響を含むことにより改変された、２０の天然Ｌアミノ酸のそれぞれに関するブロックコポリマーから実験的に決定された平衡定数、らせん核形成（σ）および成長（ｓ）に基づくＩｓｉｎｇモデルを使用するものを使用して行われた。確率プロフィルは、もしリーダー配列がアミノ酸末端にあるならば、たとえペプチドが細胞膜を横切っているとしても、α−へリックス定数は、遙かに低いことを示した。
【００８１】
【非特許文献４３】Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：８４６−８５６
【非特許文献４４】Ｖａｓｑｕｅｚ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９８７，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２６：３５１−３７２
【非特許文献４５】Ｖａｓｑｕｅｚ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９８７，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２６：３７３−３９３
【００８２】
配列番号３に示された配列を有するペプチドは、アミノ酸の末端に付着したリーダー配列による固相合成により合成された。このペプチドは、以下の表３においてＰＮＣ２８’とラベルされる。ＰＮＣ２８’ペプチドは、３つの異なる濃度すなわち２５、５０および１００μｇ／ｍＬで、形質転換した膵臓ガン（ＴＵＣ−３）細胞とインキュベートされた。インキュベーション２週後、最高の投与量のペプチドで、細胞の死がなく、そして細胞のほぼ半分が腺房を形成するのが見られ、そして未形質転換の形態の表現型を示した。同じ現象は、５０μｇ／ｍＬで観察され、そして２５μｇ／ｍＬでは、顕著に少ない細胞が復帰したのが見られた。対照的に、リーダー配列がペプチドのカルボキシ末端に付着したとき（表３のＰＮＣ２８）、５０および１００μｇ／ｍＬの投与量で、１００％の細胞の死が約４日で生じた。
【００８３】
これらの結果は、リーダー配列が、ｐ５３ペプチドのＭＤＭ−２部分のカルボキシル末端に選択的に付加して、ペプチドをして細胞膜を横切らせそして特異的に悪性細胞を殺すことを可能にすることを示す。表３では、リーダー配列は、ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）である。
【００８４】
【表３】
【００８５】
これらの結果は、本発明の特異性、すなわち正の電荷を有する残基のリーダーまたはクラスターがガン細胞の毒性に関して任意のエフェクターペプチドのカルボキシ末端に配置されなければならないことを示す。
【実施例２】
【００８６】
体重２０−２２ｇのＮｕ／Ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ｎ＝１０）に、左の後脚の領域に、生きている膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／マウス）を皮下（ｓ．ｃ．）に異種移植した。腫瘍は、発生し成長させ、そして毎日の検査中すべてのマウスが、非常に同様の成長速度で腫瘍を発育させることが観察された。
【００８７】
１２日後、腫瘍は直径３−６ｍｍのサイズに達し、そしてマウスをそれぞれ５匹ずつの２つの群に分けた。それぞれの群には、Ａｌｚｅｔ（商標）浸透圧ポンプをｓ．ｃ．で埋め込み、一定速度かつ１４日間の規定された期間で、２０ｍｇ／マウスの濃度でそれぞれのペプチドを含む全体積０．０９５ｍＬの規定の塩水を注入した。マウスの１つの群は、ペネトラチンリーダー配列（配列番号４）へそのカルボキシ末端で融合したＰＮＣ−２８（配列番号３に示されたアミノ酸を有するペプチド）を用い、そしてマウスの他の群は、ＰＮＣ−２９すなわち以下のアミノ酸配列ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有する同様なサイズのコントロールペプチドを用いた。ポンプは、製造者のガイドラインに従いそして滅菌条件で満たされた。ポンプを、そのなかに小さいポンプが挿入されたマウスの皮膚の下にポケットをつくることにより麻酔されたマウスの左の脇腹にｓ．ｃ．で埋め込んだ。それぞれのポケットは、簡単な縫合により閉じられた。それらの内側の室から、ポンプは、それぞれのマウスに０．２５μＬ／時で連続して注入した。マウスは、かれらが動物施設の分離棟へ戻されるとき、手術から回復するまで観察された。動物がＮｕ／Ｎｕマウスであり従って易感染性であるため、かれらは病原体に曝されたとき、非常に影響を受けやすい。手術並びにすべての手術前および後の処置は、そのため、滅菌フードの環境で行われた。
【００８８】
図１に明らかに示されるように、マウス中への注入４８〜７２時間以内のＰＮＣ−２８は、腫瘍の成長を有効に停止させる。対照的に、コントロールペプチドＰＮＣ−２９は、正常または腫瘍の細胞になんら作用しなかった。ＰＮＣ−２９で処理されたマウスでは、腫瘍は、連続する速度で成長を続け、２週間の処置そしてポンプが全くペプチド溶液を放出することを止めた以後の期間にわたり１０〜１６ｍｍの直径の腫瘍になった。マウスの両方の群における腫瘍のサイズの測定の統計分析は、ｐ＜０．００１のそれらの間の有意をもたらした。
【実施例３】
【００８９】
実施例２の同じ方法を用い、生きた膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／マウス）がマウス（ｎ＝１０）中に異種移植されたときと同時にポンプを開始した。５匹のマウスにはＰＮＣ２８が投与され、そして５匹のマウスは全く処置されなかった（偽処置）。結果は以下の通りである。
【００９０】
【表４】
【００９１】
【実施例４】
【００９２】
実施例２に記載されたのと同じ方法を用い、生きた膵臓ガン細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（１ｘ１０６細胞／マウス）を５匹のマウスの腹腔に移植した。ポンプを、腫瘍細胞の移植と同時に右肩の領域に入れた。５匹のマウス全部では、３週間後肉眼で腫瘍は見られなかった。
【実施例５】
【００９３】
ＡｄＶベクター構築における材料および方法
細胞および細胞培養：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得られた２９３Ａ細胞を、クリオバイアルから解凍し、そしてＤＭＥＭ，２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ，Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｃＤＭＥＭ）からなる培地中で７５ｃｍ２組織培養フラスコ（ＴＣＦ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）で成長させた。細胞は、ＣＯ２−９５％空気の混合物を供給されたインキュベータで３７℃で成長した。培地を２日置きに変えた。細胞が９０〜９５％密集成長したとき、それらを１ｘＰＢＳで洗い、１ｘトリプシンにより外し、そして新しいＴＣＦ中に継代した。
【００９４】
ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞（生きた膵臓ガン細胞）は、コドン１２における発ガン突然変異（Ｇｌｙ１２→Ｖａｌ１２）を有するヒトｋ−ｒａｓ遺伝子およびネオマイシン抵抗性遺伝子を含むプラスミドによる正常のラット膵臓腺房細胞（ＢＭＲＰＡ１）のトランスフェクションにより生成された。生体外のコントロールされない細胞増殖、接触阻害の損失、低栄養素培地における成長および生体内の腫瘍の形成は、この形質転換した膵臓細胞系の特徴である。（非特許文献４６）または（特許文献２）２００３年１月１７日に出願された継続中の予備特許出願番号６０／４４０６９９、この出願はもし十分に示されるならば本明細書で参考として引用される）。ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞は、微量元素、成長因子および１０％ＦＢＳを含む半合成ＲＰＭＩ培地（ｃＲＰＭＩ）で成長させた（Ｂｒａｄｕ，２０００）。培地を２日置きに変えそして細胞を９０−９５％の密集成長で継代した。
【００９５】
【非特許文献４６】Ｂｒａｄｕ Ｓ（２０００）．Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅｔｏｂａｃｃｏ ｓｍｏｋｅ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ ＮＮＫ ｉｎ ｒａｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ＢＭＲＰＡ１ ｃｅｌｌｓ．ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ，ＳＵＮＹ−ＨＳＣ ａｔ Ｂｒｏｏｋｌｙｎ
【特許文献２】２００３年１月１７日に出願された継続中の予備特許出願番号６０／４４０６９９
【００９６】
ＰＮＣ−２８ＥＧの合成：ペプチド配列、開始コドン（ＡＴＧ）、停止コドン（ＴＡＧ）、Ｎｏｔ ＩおよびＫｐｎ Ｉ制限部位（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および追加の４塩基対（適切な制限酵素結合のために必要である）を含む２つの一本鎖ＤＮＡフラグメントを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡによりこの研究のために合成した。２つの一本鎖を９５℃で５分間アニーリングし、そして以下のプライマーＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧ（ＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｒｅｖ）、ＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣ（ＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｆｒｗ）およびＴａｑポリメラーゼを使用して２５μＬの反応体積でＰＣＲによって増幅した。誤った初回免疫の可能性を防ぐために、ＰＮＣ−２８ＥＧ−ＦｒｗおよびＲｅｖを１０ｐモルの濃度で使用した。次に、５μＬのＰＣＲ生成物を１００ｂｐマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに２％アガロースゲルで分析して、６２ｂｐの遺伝子の長さを立証した。
【００９７】
ポリメラーゼ連鎖反応：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、生体外で別個のＤＮＡフラグメントを増幅するのに役立つ方法である。この目的のために、二本鎖ＤＮＡは、まず変性されそして複製されるべきＤＮＡフラグメントに並ぶ２つの相補性オリゴヌクレオチド（プライマー）によりアニーリングされる。２つのプライマーの間のＤＮＡフラグメントは、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて合成された。これらの３つの段階の繰り返しにより、最初のセグメントは理想的に２ｘ倍に増幅され、この場合ｘはサイクルの数である（非特許文献４７）。最後に、すべての不完全な鎖合成は、追加の長い延長時間により完成された。他に述べていない限り、ＰＣＲの条件は、以下の通りであった。５分９５℃（変性）、次に１分９５℃（変性）、１分５０℃（アニーリング）、１分７２℃（延長）の３０サイクル、次に７２℃で１０分の最終の延長時間。
【００９８】
【非特許文献４７】Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｆａｌｏｏｎａ，Ｆ．，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｈｏｒｎ Ｇ．Ｔ．，Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ａｒｎｈｅｉｍ，Ｎ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０
【００９９】
他に述べていない限り、すべてのＰＣＲ生成物は、ＤＮＡバンドを染めるためのエチジウムブロミド（１０ｍｇ／ｍＬ）７．５μＬを含む１ｘＴＢＥ（トリス、硼酸、ＥＤＴＡ）１００ｍＬあたり２ｇのアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により製造された２％アガロースゲルで分析された。ＤＮＡ生成物は、７０ボルトで分離されそして紫外線照明により分析された。
【０１００】
ｐＣＲ２．１におけるＰＮＣ−２８ＥＧのクローニングおよびＴＯＰ１０感応Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換：ＰＮＣ−２８ＥＧを配列するために、ＰＣＲ生成物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯクローニングおよび形質転換のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンした。ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧベクター（２μＬ）をＴＯＰ１０化学的感応Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、そして３０分間氷上でインキュベートし、４２℃で水浴でヒートショックし、２５０μＬのＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でインキュベートし、そして３７℃で１時間２００ｒｐｍでショックをかけた。１００μＬのこの混合物を選択アンピシリン（５０μｇ／μＬ）アガロースプレートにおいた。細菌を１晩増殖させ、そしてコロニーを正確なサイズにされた遺伝子の存在についてＰＣＲにより分析した。
【０１０１】
ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧに関する細菌コロニーの分析：いくつかの反応混合物を、１μＬのＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｒｅｖ（１０ｐモル）、１μＬのＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｆｒｗ（１０ｐモル）、０．５μＬのｄＮＴＰ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ、２．５μＬの１０ｘＢｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）および１９．５μＬの滅菌水をそれぞれ含むことにより調製した。選択されたコロニーは、接種ループにより取り出し、そして反応混合物を含む予めラベルされた０．５ｍＬのポリプロピレン管（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｃａｌａ，ＦＬ）中に移し、そしてＰＣＲを行った。添加する緩衝液（５μＬ）および５ｘＦｉｃｏｌｌを８μＬのＰＣＲ生成物に添加し、そしてＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルで分析した。
【０１０２】
組み換えプラスミドを含むコロニーを、Ｌｕｒｅａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（５０μｇ／μＬのアンピシリンを含むＬＢブロス）で３７℃で１晩成長させた。細菌を採集し、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧを、ＱｉａｇｅｎのＭｉｎｉｐｒｅｐプラスミド単離キットを使用して単離した。単離したプラスミドの濃度を、配列決定前にＯＤ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで測定した。
【０１０３】
エントリーベクター（ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧ）の構築：エントリーベクターは、ＰＮＣ−２８ＥＧをｐＥＮＴＲ１１にクローニングすることにより構築された。ＰＮＣ−２８ＥＧをｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏから精製し、そして製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってｐＥＮＴＲ１１の曝された末端に結合した。連結反応のために、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧおよびｐＥＮＴＲ−１１をＫｐｎ１，Ｎｏｔ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）により消化し、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで分離しそしてゲル抽出により精製した。
【０１０４】
Ｋｐｎ１消化：６０μｇのｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８を、３０μＬのｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８（２μｇ／μＬ）、６μＬのＫｐｎ １（１０単位／μＬ）、５μＬの１０ｘＢｕｆｆｅｒ（酵素を補充する）および９μＬの滅菌水を含む５０μＬの反応物中で６０単位のＫｐｎ １により１時間３７℃で消化した。消化は、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿を次に行い、Ｎｏｔ１によるさらなる消化と干渉する蛋白および酵素を除いた。２５μＬの１：１フェノール クロロホルムを消化したサンプルに添加した。サンプルを１５秒攪拌しそして３分間１３，０００ｒで遠心分離した。３層は、遠心分離後サンプル中で確認でき、プラスミドを含む重ねるものを、中間層または界面を乱すことなく新しい管に注意して移した。プラスミドを次に１００μＬの１００％エタノールおよび５μＬの３Ｍ Ｎａ−アセテートを添加することにより沈殿させ、次に−８０℃においた。１時間後、管を−８０℃から取り出し、２０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離してプラスミドをペレットにした。上澄をペレットを乱すことなく取り出した。予冷した７０％エタノール（１５０μＬ）を添加しそして管をさらに５分間の遠心分離にかけた。エタノールのすべての痕跡を管から除き、ペレットを残して１０分間風乾した。
【０１０５】
Ｎｏｔ１消化：ペレットを３８．５μＬの滅菌水により再溶出し、そして上述したＫｐｎ １消化と同じ条件下でＮｏｔ１により消化した。すなわち６０単位のＮｏｔ１（６μＬ）、５μＬの１０ｘＢｕｆｆｅｒ（Ｎｏｔ１酵素を補充する）、０．５μＬの１００ｘＢＳＡおよび３８．５μＬの滅菌水、３７℃、１時間。
【０１０６】
ｐＥＮＴＲ１１（２０μｇ）を、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧエントリーベクターについて記述したのと同じ方法で、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターと平行してＫｐｎ ＩおよびＮｏｔ１制限酵素消化により処理した。
【０１０７】
ゲル抽出：Ｆｉｃｏｌｌ（５ｘ、２０μＬ）を５０μＬの反応物に添加し、全混合物を５分間７０Ｖで１％アガロースゲルで分離した。ゲルを、ＰＮＣ−２８ＥＧを含む適切なサイズのバンドを削り取る場所についてＵＶ光の下分析した。ＰＮＣ−２８ＥＧを、Ｑｉａｇｅｎのゲル抽出キットを使用してアガローススラブから精製した。ＰＮＣ−２８ＥＧを次にＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）により線状化ｐＥＮＴＲ１１に連結して、ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧエントリーベクターを構築した。
【０１０８】
連結反応：両方のサンプルをＯＤ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで定量し、連結反応に必要な両方のサンプルの最後の濃度を決定した。８．５μＬのＰＮＣ−２８ＥＧ、８．５μＬのｐＥＮＴＲ１１、１μＬのＴ４−ＤＮＡリガーゼ、２μＬの１０ｘＢｕｆｆｅｒ（リガーゼを補充する）を含む連結反応を実施した。反応混合物を１６℃で４時間インキュベートした。２μＬの連結反応物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉ混合物（１００μＬ）を選択カナマイシン（５０μＬ／ｍＬ）アガロースプレートに広げた（５０μＬ／μＬ）。プレートで成長したコロニーを、特異的プライマーとしてＰＮＣ−２８ＥＧ初回免疫オリゴヌクレオチド（ＰＮＣ−２８ＥＧ ＦｒｗおよびＲｅｖ）を使用してＰＣＲ増幅にかけた。生成物を２％アガロースゲルで分析してｐＥＮＴＲ１１へのＰＮＣ−２８ＥＧの適切な連結反応を決定した。ＰＮＣ−２８ＥＧポジティブコロニーを選択しそして５０μＬのカナマイシンを含む２５ｍＬの液体培地で１晩成長させた。ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ベクターを、Ｑｉａｇｅｎのミニプレップ単離キットを使って細菌から単離した。
【０１０９】
ＰＮＣ−２８を含むＡｄＶ（ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ）の構築：完全ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧ（２０２．５ｎｇ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのラムダ組み換え（ＬＲ）プロトコールに従って、２時間２５℃のインキュベーション中１５０ｎｇのｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターにクローンした。反応混合物（１μＬ）を使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換して、次に選択アンピシリンアガロースプレートにおいた。１晩の成長後、コロニーをランダムに取り出し、そして特異的プライマーとしてＰＮＣ−２８ＥＧオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅にかけた。ＰＮＣ−２８ＥＧポジティブコロニーを選択アンピシリンＬＢブロスで培養し、そしてそれらのベクターをＤＮＡ配列決定のために単離した。ＰＮＣ−２８ＥＧの正確なＤＮＡ配列を含むベクターから、４μｇをＰａｃ Ｉ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）により消化し、そして２９３Ａ細胞中に形質転換して新しく構築されたウイルス（ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ）を増殖した。
【０１１０】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスを増殖するための２９３Ａ細胞のトランスフェクション：２９３Ａ細胞を、トランスフェクションの前日に２ｍＬのｃＤＭＥＭを含む６穴の皿に１穴あたり５ｘ１０５細胞で接種した。トランスフェクションの日に、ｃＤＭＥＭを、１０％のＦＢＳを含む１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により置換した。１μｇのｐａｃ Ｉ消化ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺベクターを２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈し、そして３μＬのリポフェクタミン２０００を２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈した。溶液を５分間室温でインキュベートし、混合しそしてさらに室温で２０分間インキュベートした。混合した溶液を６穴皿の穴に添加し、細胞を３７℃でインキュベートしそして２−３日毎に養分をあたえた。細胞を、細胞分解が明らかになるまで（１４日以内）成長させた。細胞の８０−９０％が分解した後、ウイルスを含む上澄を採集し、次に細胞懸濁物を凍結（−８０℃）および解凍（３７℃）した。凍結と乾燥との３サイクル後、細胞のフラグメントを１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離することによりペレット化し、上澄を回収し、１ｍＬ容のクリオバイアルに入れ、将来の使用のために−８０℃で貯蔵した。
【０１１１】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスによるＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ−３のトランスフェクション：細胞は、ウイルスが細胞系で複製できないとき、トランスフェクションされるよりもむしろ形質導入されるといわれている。形質導入の前日に、ＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ−３細胞を１穴あたり１ｘ１０５細胞の濃度で６穴のプレートに接種した。形質導入の日に、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスを、ｃＲＰＭＩ中に１０−９から１０−４の１０倍希釈で希釈して最終体積を１ｍＬにした。培地の廃物を除き、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスの１ｍＬ希釈物をそれらのそれぞれの穴に添加した。次の日、ウイルスを含む培地をそれぞれの穴から取り出し、そしてプラーク化培地（３％のＦＢＳを含むｃＲＰＭＩ）および４％のアガロースからなる予め加温（６５℃）されたアガロースの重ねるもの２ｍＬをそれぞれの穴に添加した。プレートを３７℃の加湿ＣＯ２インキュベータに戻した。最初の重ねるものの添加３日後、１ｍＬの追加の重ねるものをそれぞれの穴に加えた。２９３Ａ細胞は、コントロールＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ−３を提供するためにｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスと同じ方法でトランスフェクションされ、そして２９３Ａ細胞は、細胞分解の徴候のために１４日にわたってモニターされた。
【０１１２】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターによるＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞のトランスフェクション：トラスフェクションの日、ＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ３細胞を離し、そして１０％ＦＢＳを含む抗生物質のないｃＲＰＭＩ培地中で１ｘ１０５細胞の濃度で６穴のプレート中に接種し、そして４時間接着させた。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクター（４．０μｇ）を２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに希釈し、そして１０μＬのリポフェクタミン２０００を２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈した。溶液を室温で５分間インキュベートし、混合しそしてさらに室温で２０分間インキュベートした。次に、混合物を細胞に添加した。コントロールのために、ＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ３細胞のセットをｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺベクターによりトランスフェクションし、そして細胞の第三のセットは１０μＬのリポフェクタミン２０００のみを用いた。プレートを３７℃の加湿ＣＯ２インキュベータに戻した。２４時間および４８時間後、穴のそれぞれのセットの上澄を集め（２ｍＬ）、遠心分離し、そしてペレット化非接着細胞をカウントした。それぞれの場合、穴を２ｍＬの新鮮な培地で補充した。トランスフェクション７２時間後、各穴からの上澄を集めそして非接着細胞をカウントし、接着細胞を０．５ｍＬの１ｘトリプシンに離し、血球計およびトリプシンブルー排除（非特許文献４８）によりカウントした。写真は、４００ＡＳＡ富士フィルムをつけた倒立サイズＺｅｉｓｓ顕微鏡で撮った。
【実施例６】
【０１１３】
【非特許文献４８】Ｍｉｃｈｌ Ｊ．ＤＪ Ｏｈｌｂａｕｍ，ＳＣ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，１９７６．２−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｆｃ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．ＪＥｘｐ Ｍｅｄ，１４４：１４６５−１４８３
【０１１４】
結果
アデノウイルスベクターの構築は、保守的部位特異性組み換えに基づく。細菌ウイルスであるバクテリオファージラムダは、保守的部位特異性組み換えを示したと理解される最初のミクロ実体であった。ウイルスがその宿主細胞中に入るとき、ラムダインテグラーゼとよばれる酵素が合成される。この酵素は、細菌染色体中へのウイルスＤＮＡの共有結合を仲介し、ウイルスＤＮＡをして宿主のＤＮＡの必須部分として複製を可能にする（非特許文献４９）。組み換えは、バクテリオファージおよび細菌染色体に見いだされる関連するが異なるＤＮＡ認識部位に基づく。バクテリオファージインテグラーゼは、バクテリオファージに見いだされるＤＮＡ配列に結合し、そしてＤＮＡ−蛋白複合体を形成する。この複合体は、細菌染色体に見いだされる付着ＤＮＡ配列に結合できる。インテグラーゼは、次に部位特異的鎖交換を生ずるＤＮＡを切断かつ再閉する反応を触媒化できる。
【０１１５】
【非特許文献４９】Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ．，Ｌｅｗｉｓ Ｊ．，Ｒａｆｆ Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ
【０１１６】
バクテリオファージ−宿主組み込みを行う同じメカニズムは、アデノウイルスベクターｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧのデザインに存在する。ＰＮＣ−２８（ＰＮＣ−２８ＥＧ）をエンコードする遺伝子は、ＰＮＣ−２８ＥＧの発現に必要なプロモーターを欠くエントリープラスミド中にクローンされ、従って転写的に不活動といわれる。エントリープラスミドは、特異的な組み換え部位を含み、それはトラス遺伝子と並びそしてアデノウイルスデスチネーションベクターｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴの組み換え部位に相当する。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターは、ＰＮＣ−２８ＥＧの転写および翻訳を行う必要なプロモーターを含む。組み換え反応によって、ＰＮＣ−２８ＥＧは、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター中にサブクローンされて、アデノウイルスベクターｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧを生ずる。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧは、適切なウイルスパッケージングおよびアデノウイルス生成に必要な遺伝子および要素をエンコードするヒトアデノウイルスタイプ５配列を含む。しかし、それはＥ１およびＥ３配列を欠いて、これらの遺伝子を補給しない細胞系においてそれを複製不能にする。
【０１１７】
新しく構築されたｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターが膵臓ガン細胞における抗ガン剤としてテストされる前に、ウイルスの複製可能な性質を知ることがｚベクターが膵臓ガン細胞における抗ガン剤としてテストされる前に、ウイルスの複製可能な性質を知ることが重要である。上述のように、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧは、アデノウイルスゲノムに見いだされるＥ１およびＥ３配列を欠き、そしてこれらの不足した遺伝子を発現するようにバイオエンジニアリングによりつくられた２９３Ａのような細胞系でのみ複製可能である（非特許文献５０）。すべての哺乳動物の細胞系の完全なゲノムは、なお未知であり、そのため、膵臓ガン細胞系ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３がこれらの遺伝子を発現するかどうか、そして細胞死をおそらくもたらすＡｄウイルスのこのタイプの複製を支持するかどうかは未知数であった。ＰＮＣ−２８は、膵臓ガンで細胞分解を誘導するが、感応細胞においてウイルス複製を行うメカニズムも細胞死を誘導する。治療手段へのｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧの開発では、膵臓ガン細胞における細胞死が、ＰＮＣ−２８遺伝子の転写および翻訳に基づくものでありそしてウイルス複製によらなかったことを確かめることが重要であった。
【０１１８】
【非特許文献５０】Ｗａｎｇ Ｉ．Ｉ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｉ．Ｉ．（２０００） Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５，１０−１６
【０１１９】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧトランスフェクション細胞の細胞分解の原因を確かめるために、ＰＮＣ−２８ＥＧを欠いたコントロールアデノウイルスベクターすなわちｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺを要した。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺは、構築されたｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターと同じであるが、ただしそれはＰＮＣ−２８ＥＧの代わりにＬａｃＺ遺伝子を含んだ。コントロールベクターは２つの利点をもたらした。すなわち、それはＰＮＣ−２８ＥＧを欠いておりそのためコントロールとして働きそしてガラクトシダーゼ発現が容易に検出される。粗製のウイルス原料は、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺ、脂質に基づくトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００により２９３Ａ細胞をトランスフェクションすることにより得られた。接着細胞の８０〜９０％が分解したとき、ウイルスを採集した。この最初の原料は、１ｘ１０７−１ｘ１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルス力価を含んだ。粗製ウイルス原料は、より高い力価を生成するために再び２９３Ａ細胞をトランスフェクションするのに使用した。１ｘ１０８−１ｘ１０９ｐｆｕの力価が得られそしてこのような高い力価が望ましい。６つの１０倍希釈がｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺに行われ、１ｘ１０−９−１ｘ１０−４に及んだ。これらの希釈物は、それぞれ２９３Ａを含む６穴プレートの穴並びにＢＭＲＡＰ１．ＴＵＣ３細胞を含む第二の６穴のプレートの穴に添加された。ウイルスは２９３Ａ細胞で複製したので、２９３Ａ細胞の分解は、ウイルスが適切に働いていたことを立証するコントロールとして働いた。次の日、アガロースの重ねるものを細胞の上に置き、そしてそれらは２週間の間プラークの形成についてモニターされ、初めの日から４日後、第二のアガロースの重ねるものを加えた。図２に示されるように、明らかな形態上の変化が２９３Ａについて見られるが、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞ではそうではなかった。
【０１２０】
図２Ａ−２Ｈは、２９３ＡおよびＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞に対するｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺの作用を示す。図２Ａ−２Ｆは、２９３Ａ細胞の希釈物（ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスの１０−９−１０−４）の顕微鏡写真である。１４日後、２９３Ａ細胞の形態は変化した。１０−９希釈物では、９０％の細胞はなお密集成長しているが、しかし細胞分解は肉眼では認められない。ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスの濃度を上げると、丸くなり死んだ細胞の大きな面積が肉眼で確認される。密集成長が低い少数の領域のみが、１０−５より高い濃度のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺで検出できる。
【０１２１】
図２Ｇおよび２Ｈは、１０−９〜１０−４のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスが添加されたＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞の希釈物の顕微鏡写真である。細胞分解の肉眼で確認できる徴候は、任意のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺ希釈物（１０−８〜１０−５は示されず）でＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３培養物で検出できず、細胞は、それらが最低の濃度１０−９希釈（図２Ｇ）と同じく、１０−４希釈で密集成長する（図２Ｈ）。
【０１２２】
ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３細胞は、細胞分解または細胞死の徴候を示さなかった。これは、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞が欠失したＥ１およびＥ３遺伝子を補充せず、その結果ウイルスは複製不能であることを示す。もしウイルスがＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３培養物に細胞分解を生じさせるならば、それは目標細胞中への細胞毒性ＰＮＣ−２８遺伝子の導入のための好適な候補者と考えられないだろう。
【０１２３】
Ａｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８の構築：ＰＮＣ−２８ＥＧの合成は、Ａｄベクター構築の最初の段階であった。（非特許文献５１）により公開されたＰＮＣ−２８のアミノ酸配列（ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ）に相当する２つのオリゴヌクレオチドが合成された。ＰＮＣ−２８ペプチドをエンコードするのに加えて、オリゴヌクレオチド配列も開始コドン、停止コドン、Ｋｐｎ １およびＮｏｔＩ解裂部位およびそれぞれの末端の４つの追加の塩基（ＤＮＡフラグメントを安定化しそして制限部位への適切な酵素結合に必要であった）を含んだ。Ｋｐｎ １およびＮｏｔＩ制限部位は、それらがｐＥＮＴＲ−１１ベクターの複数のクローニング部位（ＭＣＳ）に存在したために、選ばれた。ｐＥＮＴＲ−１１のＫｐｎ １およびＮｏｔＩ制限部位の解裂は、突き出した末端を曝し、そしてｐＥＮＴＲ１１ベクター中への６２ｂｐの全配列（図３）とのＰＮＣ−２８ＥＧの連結を可能にした。
【０１２４】
【非特許文献５１】Ｋａｎｏｖｓｋｙ Ｍ，Ｒａｆｆｏ Ａ，Ｄｒｅｗ Ｌ，Ｒｏｓａｌ Ｒ，Ｄｏ Ｔ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＦＫ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｐ，Ｖｉｓｓｅｒ Ｊ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｒ，Ｂｒａｎｄｔ−ＲａｕｆＰＷ，Ｍｉｃｈｌ Ｊ，Ｆｉｎｅ ＲＬ，Ｐｉｎｃｕｓ ＭＲ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ．２００１ Ｏｃｔ ２３；９８（２２）：１２４３８−４３：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ｔｅｒｍｉｎａ１ ｍｄｍ−２− ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐ５３，ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｒｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ
【０１２５】
オリゴヌクレオチドの合成中製造者の情報（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、不正確な合成の確率は、１ヌクレオチドあたり０．９９である。従って、正確に合成されるこのオリゴヌクレオチドの確率は、０．９９６２であり、所望のダイマーを形成するための２つの正確な鎖アニーリングの確率は、（０．９９６２）２である。そのため、アニーリングされたＰＮＣ−２８ＥＧは、所望のアニーリング生成物を指数的に増幅するためのＰＣＲ増幅用のテンプレートとして使用し、そうすることにおいて、それぞれのベクター中にクローンされるこのＤＮＡの超過の確率を上げることになる。欠失または点突然変異は、蛋白合成中ＤＮＡ翻訳に関する読み枠を変化またはシフトし勝ちであり、そして無効なまたは短い蛋白が転写されるかまたは全く蛋白が転写されないことになり勝ちであろう。
【０１２６】
２つの初回免疫オリゴヌクレオチドが合成された。１つは、５’−３’方向のＰＮＣ−２８ＥＧ、ＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧ（ＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｆｒｗ）に相補的であり、他は３’−５’方向のもの、ＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣ（ＰＮＣ−２８ＥＧ−Ｒｅｖ）に相補的であった。ゲル電気泳動を次に使用して、増幅したＰＮＣ−２８ＥＧの分子サイズを同定した。６２ｂｐのサイズは、ＰＮＣ−２８ＥＧの適切なアニーリングおよび増幅を示す。図４は、１００ｂｐマーカー（レーン４）と比較することにより決定された、ＰＣＲ生成物（レーン１、２、３）を示す。ＰＣＲ生成物の３つの異なる希釈物（１：２０、１：５０および１：１００）。それらは、それぞれレーン１、２および３で分離された。
【０１２７】
６２ｂｐのバンドの適切な分子サイズは、どんな欠失も配列ではなかったことを示す。削り取ったバンドのＤＮＡ配列決定（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によるさらなる分析は、どんな改変も存在しなかったことを示した。この段階は、反応に使用されるＤＮＡのＴａｑポリメラーゼが１サイクルあたり２ｘ１０−４ヌクレオチドの率でヌクレオチドを誤って配合するために、重要であった。
【０１２８】
ＰＮＣ−２８ＥＧの配列決定に使用される戦略は、普遍的初回免疫部位を含んだプラスミド中に遺伝子をクローンし、感応Ｅ．ｃｏｌｉ中にこの組み換えプラスミドを形質転換し、プラスミドを含んだ選択的に成長したコロニーから組み換えプラスミドを精製し、そしてプラスミドＤＮＡを配列決定に送ることであった。ＰＮＣ−２８ＥＧは、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクター中にクローンされた。このプラスミドは、それがトポイソメラーゼＩの使用によってベクター中へのＰＣＲ生成物の迅速かつ有効な挿入をもたらすために、選ばれた。トポイソメラーゼＩは、ＰＮＣ−２８ＥＧの３’末端におけるＴａｑポリメラーゼにより生成されたデオキシアデノシン（Ａ）のオーバーハングを、線状化されたベクターに存在するデオキシチミジン（Ｔ）の３’オーバーハングに連結する。ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターは、アンピシリン、カナマイシン選択性マーカーおよびｌａｃＺ遺伝子を含み、それは組み換えプラスミドを含む細菌コロニーの選択を可能にした。ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏに関するクローニング部位は、図５に示される。図５に示されるように、クローンされた遺伝子は、配列決定のプライマーとして使用される普遍的Ｍ１３プライマーの配列範囲内にある。ベクターは、アンピシリンおよびカナマイシン抵抗性遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含む。
【０１２９】
ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧ組み換えプラスミドは、次に解凍したＴＯＰ１０感応細菌細胞へ連結したプラスミド混合物を加えそして細胞を短く加熱することにより、感応Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換された。この温度の短い変化は、細菌細胞がプラスミドを取り上げるのを可能にした。形質転換した細菌細胞を、ｘ−ｇａｌを含んだ選択アンピシリンプレートで成長させた。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧに存在するＬａｃＺ遺伝子は、ポジティブなコロニーすなわちプラスミドを含むコロニーについてスクリーニングするのに使用された。ＬａｃＺは、β−ガラクトシダーゼについてエンコードし、それはβ−ガラクトシドＸ−ｇａｌを代謝しそしてこれは青い色を生成する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ｐＣＲ２．１ＴｏｐｏプラスミドへのＰＮＣ−２８ＥＧのクローニングは、ＬａｃＺの発現を防ぐ。そのため、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧポジティブコロニーは、青い色を発しない。培養プレートに添加されたアンピシリンは、それらがプラスミドに見いだされるアンピシリン抵抗性遺伝子を欠いているために、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧネガティブ細菌の成長を防ぐ。最後に、ＰＣＲは、偽のポジティブの白色のコロニー、またはＰＮＣ−２８ＥＧを含まないコロニーをスクリーニングするのに使用される。細菌コロニーは、上記のように初回免疫オリゴヌクレオチドＰＮＣ−２８ＥＧ−ＦｒｗおよびＰＮＣ−２８−Ｒｅｖのためのテンプレートとして用いられた。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲルで分析されて、組み換えプラスミド中の遺伝子を含むコロニーを同定した。
【０１３０】
形質転換は、数百の白色コロニーおよび数少ない青色のコロニーを生じた。１９のランダムに選択した白色のコロニーおよび１０のランダムに選択した青色のコロニー（図示せず）をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧについてスクリーニングした。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧを含むコロニーは、６２ｂｐの蛍光バンドを示すことが予想された。図６は、白色のコロニーの分析の結果を示す。図６は、ＰＮＣ−２８ＥＧ形質転換した白色コロニーからの増幅したＰＣＲ生成物を示すゲル写真である。１９の選択されたポジティブコロニーからのＰＣＲ生成物は、２％アガロースゲルで分離された。エチジウムブルー染色ＤＮＡバンドは、１００ｂｐマークを越えて移動し（レーン２０）、ＰＣＲ生成物（１−１８）のサイズが正確でありそしてこれらのコロニーがＰＮＣ−２８ＥＧ／ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏを含むことを示す。
【０１３１】
レーン１９（図６）は、予想されたサイズ以下の弱いバンドを示す。この現象は、プライマーがＰＣＲ生成物に配合されなかったときに通常生じ、それは次にテンプレート（ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧ）が存在せずそしてこのＰＣＲ生成物が偽のポジティブの結果であるように思われることを示唆している。
【０１３２】
ＰＣＲ増幅は、ポジティブと思われるコロニーの中の偽のポジティブをスクリーニングする手段を提供する。これは、挿入物の正確なサイズにより、どのコロニーが組み換えプラスミドを含んでいるかを示した。これらのコロニーのいくつかのプラスミドは、次に配列決定されて、ＰＮＣ−２８ＥＧが適切な配向で挿入されそして配列にどんな点突然変異も存在しなかったことを立証した。レーン１、５および８（図６）に相当したコロニーから単離されたプラスミドは、自動ＤＮＡ配列決定装置に送られた。３つのプラスミドのうち、コロニー８（図６）に存在するものは、ＰＮＣ−２８ＥＧに関する正確な配列を含んだ。コロニー８から得られた配列と合成したＰＮＣ−２８ＥＧ配列との間の比較は、図７に示される。
【０１３３】
ＰＮＣ−２８についてエンコードするセグメントにおいて位置９６（星印図７参照）で１つの点突然変異が存在する。ＴからＣへの変化がある。しかし、これはアミノ酸配列の同定に影響しない。それは、コドンＴＴＣもＴＴＴフェニルアミンと同じアミノ酸をエンコードするからである。また、Ｋｐｎ１制限部位において３つの未知のヌクレオチド（Ｎ）が存在する。これは、自動配列決定装置により生じた誤りの結果と思われる。もしこれらの３つのヌクレオチドが問題を生ずるとしたならば、Ｋｐｎ１は、制限部位を解裂することができず、以後のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターの構築は不可能であったろう。しかし、Ｋｐｎ１制限は影響されないままであり、そしてｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターの構築は、以下のように進行した。
【０１３４】
細菌コロニー８は、細菌が採取されそして上記のようにプラスミドが単離されたとき、１６時間３７℃で液体培地で成長した。
【０１３５】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ構築の次の段階は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ−１１へＰＮＣ−２８ＥＧをクローンすることである。図８は、ｐＥＮＴＲ−１１のベクターマップを示す。エントリーベクターは、組み換え部位ａｔｔＬ １およびａｔｔＬ ２を含み、それらは、アデノウイルス発現ベクターｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴへのＰＮＣ−２８ＥＧの組み換えクローニングを可能にする。それは、またカナマイシン抵抗性遺伝子、ａｔｔＬ １およびａｔｔＬ ２の間のｃｃｄＢ遺伝子並びにその複数のクローニング部位（ＭＣＳ）におけるＫｐｎ１およびＮｏｔｌに関する制限部位を含む。
【０１３６】
ｐＥＮＴＲ−１１の組み換え部位間に見いだされるｃｃｄＢ遺伝子は、ネガティブ選択を可能にする。ｃｃｄＢ遺伝子は、ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉ（使用される菌株）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について毒性のある蛋白をエンコードする。ＰＮＣ−２８ＥＧがｐＥＮＴＲ−１１ベクターにクローンされるとき、ｃｃｄＢ遺伝子は除かれる。そのため、ＰＮＣ−２８ＥＧを含まないコロニーは、成長できない。カナマイシン抵抗性遺伝子も、カナマイシン処理培養プレートでのポジティブコロニーの選択を可能にする。
【０１３７】
ｐＥＮＴＲ−１１ベクターをＫｐｎ１およびＮｏｔ１により消化して、突き出した末端を曝しそしてＰＮＣ−２８ＥＧの連結を可能にした。消化は、またｃｃｄＢ遺伝子の除去を生ずる。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／ＰＮＣ−２８ＥＧは、同じ方法で消化された。ＰＮＣ−２８ＥＧは、次にアガロースゲルの消化した生成物を分離しそして遺伝子を含むアガロースのスラブを削り取ることによりｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターから精製された。線状化ｐＥＮＴＲ１１ベクターも同様な方法で精製した。アガローススラブは溶融され、そしてＰＮＣ−２８ＥＧを、触媒としてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用してｐＥＮＴＲ１１に連結した。クローンしたエントリーベクターｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧを使用して選択カナマイシンアガロースプレート上に成長した化学的感応ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。
【０１３８】
多数のコロニーが成長し、そしてそれらはすべてＰＮＣ−２８ＥＧを含んだが、いくつかのコロニーをＰＣＲスクリーニングにかけた。ベクターを２つの異なる制限酵素により消化して、ＰＮＣ−２８ＥＧを含まないベクターが機能性プラスミド中に連結しそしてｃｃｄＢ選択の妨害により偽のポジティブを生ずる可能性を最低にした。ＰＮＣ−２８ＥＧそれ自体のＤＮＡ配列は、関連する唯一の反応が制限反応であるので、改変されてはならず、複製メカニズムも含まれなかった。この重要な分析は、事実すべてのコロニーがＰＮＣ−２８ＥＧを含むものではないことを示した。ＰＮＣ−２８ポジティブクローンは、次に多量に成長しそして組み換えエントリーベクターｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧがこのコロニーから単離された。
【０１３９】
ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ構築における最後の段階は、ｐＥＮＴＲ１１／ＰＮＣ−２８ＥＧから単離されたＰＮＣ−２８ＥＧをアデノウイルスデスチネーションベクターであるｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ中にサブクローニングすることであった。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴは、ｐＥＮＴＲ１１に見いだされるａｔｔＬ １およびａｔｔＬ ２部位に相当するａｔｔＢ １およびａｔｔＢ ２組み換え部位を含む。これは、ｐＥＮＴＲ−１１ベクターからｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴへのＰＮＣ−２８ＥＧのインテグラーゼ仲介組み換えクローニングを可能にする。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴは、またＰＮＣ−２８ＥＧの発現を増強するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。アンピシリン抵抗性ｃｃｄｂネガティブ選択およびｍＲＮＡの有効な転写停止およびポリアデニル化のための単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリアデニル化配列もｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴに存在する。図９は、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴの組み換え部位を示す。ｐＮＣ−２８ＥＧは、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴへの組み換えによりクローンされ、所望の発現クローンを生成した。
【０１４０】
複製不能ウイルスをエンコードする必要な配列を含んだｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧは、ＰＮＣ−２８を発現できる。化学的感応ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉを、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターにより形質転換しそして選択アンピシリンプレートで成長させた。多数のコロニーが成長し、そして１０のランダムに選択したコロニーがＰＣＲスクリーニングにかけられた（図１０）。図１０は、２％アガロースゲル上で分離された１０の選択されたポジティブコロニーからのＰＣＲ生成物を示す写真である。エチジウムブロマイド染色ＤＮＡバンドは、１００ｂｐマークを越えて移動し（レーン１１）、ＰＣＲ生成物（１−９）のサイズが正確でありそしてこれらのコロニーがｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧを含むことを示す。レーン１０の弱いバンドは、偽のポジティブコロニーを示す。従って、バンドの移動は、１０のランダムに選択されたコロニーの内の９つが、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧを含むことを示した。これらのポジティブなコロニーは、大量の液体培地で成長しそしてｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧはそれらから精製された。図１１は、アガロースゲル上で分離された精製プラスミドを示す。
【０１４１】
ゲルの結果は、単離されたｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧが非常に純粋であることを示す。レーン１および３で単一のバンドのみが存在するので、精製されたプラスミドには他の不純物がない。バンドの分子サイズは約３５ｋｂである。
【０１４２】
一度ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧが精製されたならば、それは次にＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞をトランスフェクションするのに使用されて、ＰＮＣ−２８蛋白中に転写かつ翻訳されたとき、ＰＮＣ−２８のための遺伝子が膵臓ガン細胞に対し細胞毒性を有しそのため構築されたベクターが抗膵臓ガン剤として有用であることを立証した。
【０１４３】
ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞は、抗生物質のない培地（ｃＲＭＰＩ、１０％ＦＢＳ）を有する６穴のプレートの３つの穴に１ｘ１０５細胞の濃度で接種された。細胞は、３７℃で４時間のインキュベーションにより穴に接着した。２つのトランスフェクションを行った。第一の穴はｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧによりトランスフェクションされ、そして第二の穴は、コントロールプラスミドｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺによりなされた。両方の場合とも、細胞は４μｇのプラスミドおよび１０μＬのリポフェクタミン２０００（比２：５）によりトランスフェクションされた。第三の穴の細胞は、第二のコントロールとして用いられそしてリポフェクタミン２０００（１０μＬ）のみを用いた。
【０１４４】
細胞を３７℃でインキュベータに戻した。２４時間後、それぞれの穴からの上澄を集め、そして懸濁された細胞をカウントした。細胞の生存も注目した。細胞を新しい培地で満たし、そしてインキュベータに戻した。この手順を、トラスフェクション後７２時間まで連続する２４時間毎に繰り返した。
【０１４５】
トランスフェクション後７２時間で、残りの接着細胞を次に離しそしてカウントした。図１２Ａおよび表５は、７２時間目のそれぞれの穴での接着細胞の数を示す。図１２Ａおよび表５に示されるように、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧによりトランスフェクションされた細胞は、細胞の最初の接種から細胞の濃度が８５％増加したことを示す。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺによりトランスフェクションされたＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞は、７２時間後３．５倍に増え、すべてのプラスミドによりトランスフェクションされなかった細胞は、接種された細胞の最初の量から７．５倍増加した。図１２ｂは、トランスフェクション後７２時間の細胞の写真を示す。トランスフェクション後７２時間で、残りの接着細胞は、次に離されそしてカウントされた。図１２ｂに示されるように、トランスフェクション後７２時間で、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧにより処理された細胞の９８％が、コントロールに比べて分解した。ＬａｃＺベクターによりトランスフェクションされた細胞およびリポフェクタミン２０００によるものは、９０−１００％の密集成長を示したに過ぎない。
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧによりトランスフェクションされた膵臓ガンＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞の＞９８％の低下そして開始時の数より３．５倍および７．５倍の両方のコントロール細胞数の増加は、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ細胞の細胞分解作用がＰＮＣ−２８の生合成によることを明らかに示している。Ａｄ／ＰＮＣ−２８ＥＧベクターによりトランスフェクションされたＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞も、非接着および死んだ細胞において最高の増加（５ｘコントロール）を示す。対照的に、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺトランスフェクションＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞は、細胞の分解を示さず、そしてリポフェクタミン２０００処理細胞と比較したとき、わずかに遅い成長を示すに過ぎなかった。ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺトランスフェクションおよびリポフェクタミン処理ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞における細胞分解の不存在は、さらに新しく合成されたＰＮＣ−２８蛋白がｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧトランスフェクション細胞における細胞死の原因であるという主張を強化する。トランスフェクション後４８時間のｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧトランスフェクションＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３群における非接着かつ死んだ細胞の急速な増加は、ＰＮＣ−２８の発現がこの時間枠内で生ずることを示唆する。この観察は、ペネトラチン配列に付着したＰＮＣ−２８が、薬剤への細胞の暴露後４８−７２時間以内でＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞に対して細胞死を誘導する、実施例２および図１に報告された時間枠と有利に比較される。
【０１４８】
上記の明細書およびそこに報告された実験結果は、説明のためであり、そして本発明の範囲の制限ではない。当業者は、種々の改変が本発明から離れることなくなされうることを理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】膵臓ガン細胞により異種移植された同型接合したＮＵ／ＮＵマウスにおけるＰＮＣ−２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４へそのカルボキシ末端で融合したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の生体内腫瘍阻害作用を描いている。星をつけた矢印は、腫瘍成長期間中の１３日（正確には１３．５日）のｓ．ｃ．ポンプ移植の時間を示す。
【図２】Ａ−Ｈは、２９３ＡおよびＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞に対するｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺウイルスの作用を示す顕微鏡写真である。
【図３】ＰＮＣ−２８ＥＧの６２ｂｐＤＮＡ配列を示す。開始コドンおよび停止コドンの両者は、強調されている。本発明のペプチドをエンコードする配列は、イタリックで強調されている。ＤＮＡ配列のそれぞれのコドンの下に、対応するアミノ酸がある。
【図４】ＰＮＣ−２８ＥＧ ＰＣＲ生成物を示すゲル写真である。レーン４は１００ｂｐマーカーを含む。
【図５】ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターのヌクレオチド配列および制限マップである。ラベル「ＰＣＲ生成物」は、ＰＮＣ−２８ＥＧがベクターでクローンされる場所を示す。クローンされた遺伝子は、配列決定プライマーとして使用される普遍的Ｍ１３プライマーの配列範囲内にある。ベクターは、アンピシリンおよびカナマイシン抵抗性遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含む。
【図６】１９の選択ポジティブコロニーからのＰＣＲ生成物並びに分子マーカーを示すゲル写真である。
【図７】図６からのコロニー８のＤＮＡ配列を示す。一番上の線は、実際のＤＮＡ配列でありそして図の下方に示されているのは、自動ＤＮＡ配列分析から得られたクロマトグラムである。
【図８】ｐＥＮＴＲ−１１ベクターのマップである。
【図９】Ａｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターのマップである。
【図１０】ＰＮＣ−２８ＥＧのＰＣＲ増幅生成物を示すゲル写真である。
【図１１】精製されたｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧ（レーン１および２）および５００ｂｐＤＮＡマーカー（レーン７）のゲル写真である。
【図１２】Ａは、トランスフェクション後７２時間の接着ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞の数を示すグラフである。Ｂは、トランスフェクション後７２時間目のＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞を示す顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合されたプロモーター配列からなり、該ペプチドがアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるかまたはそのアナログまたは誘導体であることを特徴とする複製不能アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードする請求項１記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項３】
ヌクレオチド配列が、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードする請求項１記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が、アミノ酸配列ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログまたは誘導体である請求項１記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が、ＧＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＣＴＣ（配列番号）からなる請求項４記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項６】
Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠失している請求項１〜５の何れか１つの項記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項７】
ＡｄＶベクターが、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧである請求項５記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項８】
プロモーター配列が、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＬＴＲ、ベータ−アクチン、ＥＦ−アルファ、Ｇａｌ−Ｅｌｂ、ＵｂＣ、ベータ−カゼイン、ＥＭ−７、ＥＦ、ＴＥＦ１、ＣＭＶ−２およびＢｓｄからなる群から選ばれる請求項１〜５の何れか１つの項記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項９】
プロモーター配列がＣＭＶである請求項８記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項１０】
患者に治療上有効な量の請求項１記載のＡｄＶベクターを投与することを特徴とする患者のガン細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１１】
患者に治療上有効な量の請求項２記載のＡｄＶベクターを投与することを特徴とする患者のガン細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１２】
患者に治療上有効な量の請求項３記載のＡｄＶベクターを投与することを特徴とする患者のガン細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１３】
患者に治療上有効な量の請求項４記載のＡｄＶベクターを投与することを特徴とする患者のガン細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１４】
ガン細胞が、乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、子宮頚ガン、結腸ガン、黒色腫、膵臓ガン、固体組織腫瘍または血液のガンの少なくとも１つである請求項１０〜１３の何れか１つの項記載の方法。
【請求項１５】
血液のガンが、リンパ腫または白血病である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ガンが膵臓ガンである請求項１４記載の方法。
【請求項１】
ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列に実施可能に結合されたプロモーター配列からなり、該ペプチドがアミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６つの連続するアミノ酸からなるかまたはそのアナログまたは誘導体であることを特徴とする複製不能アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードする請求項１記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項３】
ヌクレオチド配列が、アミノ酸配列ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはそのアナログまたは誘導体をエンコードする請求項１記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が、アミノ酸配列ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはそのアナログまたは誘導体である請求項１記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項５】
ヌクレオチド配列が、ＧＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＣＴＣ（配列番号）からなる請求項４記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項６】
Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠失している請求項１〜５の何れか１つの項記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項７】
ＡｄＶベクターが、ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８ＥＧである請求項５記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項８】
プロモーター配列が、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＬＴＲ、ベータ−アクチン、ＥＦ−アルファ、Ｇａｌ−Ｅｌｂ、ＵｂＣ、ベータ−カゼイン、ＥＭ−７、ＥＦ、ＴＥＦ１、ＣＭＶ−２およびＢｓｄからなる群から選ばれる請求項１〜５の何れか１つの項記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項９】
プロモーター配列がＣＭＶである請求項８記載の複製不能ＡｄＶベクター。
【請求項１０】
患者に治療上有効な量の請求項１記載のＡｄＶベクターを投与することを特徴とする患者のガン細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１１】
患者に治療上有効な量の請求項２記載のＡｄＶベクターを投与することを特徴とする患者のガン細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１２】
患者に治療上有効な量の請求項３記載のＡｄＶベクターを投与することを特徴とする患者のガン細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１３】
患者に治療上有効な量の請求項４記載のＡｄＶベクターを投与することを特徴とする患者のガン細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１４】
ガン細胞が、乳ガン、前立腺ガン、肺ガン、子宮頚ガン、結腸ガン、黒色腫、膵臓ガン、固体組織腫瘍または血液のガンの少なくとも１つである請求項１０〜１３の何れか１つの項記載の方法。
【請求項１５】
血液のガンが、リンパ腫または白血病である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ガンが膵臓ガンである請求項１４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００６−５１９６１４（Ｐ２００６−５１９６１４Ａ）
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８５９６（Ｐ２００６−５０８５９６）
【出願日】平成１６年１月１３日（２００４．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０００６８４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１０３０
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５０４３４４８４２）ザ リサーチ ファンデーション オブ ステイト ユニバーシティ オブ ニューヨーク (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月１３日（２００４．１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０００６８４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１０３０
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５０４３４４８４２）ザ リサーチ ファンデーション オブ ステイト ユニバーシティ オブ ニューヨーク (8)
【Ｆターム（参考）】
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