慢性疲労症候群の判定方法
【課題】慢性疲労症候群に罹患しているか否かを正確に安定して行うことができる方法を提供する。
【解決手段】生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する工程と、前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する工程と、前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する工程。
【解決手段】生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する工程と、前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する工程と、前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者が慢性疲労症候群に罹患しているかを判定するための方法に関する。より具体的には、本発明は、被験者から採取された生体試料中のある特定の遺伝子の遺伝子転写産物の発現量の測定に基づいて、該被験者が慢性疲労症候群に罹患しているかを判定できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会において、多くの人が慢性的な疲労を感じている。1999年の厚生労働省の調査では、国民の約３分の１が慢性的な疲労を感じており、その疲労により引き起こされる経済的損失は、約１．２兆円と試算され、大きな社会的問題となりうることが示唆されている。
【０００３】
慢性疲労症候群は、原因不明の回復しない強度の疲労が半年以上続く疾患であり、罹患者は日本に約30万人、全世界では約300万人、また、その予備軍は約3000万人とも言われている。
現時点では、慢性疲労症候群の診断は、患者の申告による生活の障害の程度の認定と、他の疲労を伴う疾患を精密な検査により除外していくことによってしか行うことができず、客観的な判定方法が確立されていない。
【０００４】
特表２０００−５１６８１８号公報(特許文献１)は、血液中のタンパク質であるＲＮａｓｅ Ｌを検出することにより、慢性疲労症候群を診断する方法を開示している。
特開２００５−１３１４７号公報(特許文献２)は、被験者のゲノム中のセロトニントランスポーター遺伝子の多型に基づいて、慢性疲労症候群の発症リスクを判定する方法を開示している。
【０００５】
特開２００７−２２８８７８号公報(特許文献３)は、慢性疲労症候群の患者において発現が変化している遺伝子の発現量に基づいて、慢性疲労症候群の診断を行う方法を開示している。
さらに、米国特許出願公開第２００９／００１０９０８号明細書(特許文献４)は、慢性疲労症候群の診断に用い得るバイオマーカー(遺伝子)を多数列挙している。
また、Gowら(非特許文献１)も、慢性疲労症候群の患者において発現量が特異的な遺伝子を同定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０００−５１６８１８号公報
【特許文献２】特開２００５−１３１４７号公報
【特許文献３】特開２００７−２２８８７８号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／００１０９０８号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】John W Gowら, "A gene signature for post-infectious chronic fatigue syndrome", BMC Medical Genomics 2009, 2:38
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来技術の方法では、精度の高い慢性疲労症候群の診断を安定して行うことが困難であった。
そこで、本発明は、慢性疲労症候群に罹患しているか否かの判定を正確に安定して行うことができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、被験者からの生体試料中のある特定のカテゴリー(遺伝子群)に属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定し、健常者から得られる生体試料中の対応する遺伝子転写産物の発現量からの偏差を表す値を算出し、この偏差を表す値をカテゴリー内で平均化し、少なくとも２つのカテゴリーについて求めた平均化された値を用いることにより、慢性疲労症候群に罹患している患者を、健常者から明確に安定して区別できることを見出して、本発明を完成した。
【００１０】
よって、本発明は、
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する工程と、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出する工程と、
選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する工程と、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する工程と
を含む、慢性疲労症候群の判定方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、コンピュータを、
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定することにより得られる発現量を受け付ける受付手段、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出し、選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する平均値取得手段、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する判定手段、
前記判定手段の判定結果を出力する出力手段
として機能させるための慢性疲労症候群の判定用プログラムも提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によると、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを、被験者からの生体試料を用いて簡便に判定できるとともに、客観的な判定手段を提供できる。また、本発明の方法は、従来の方法に比較して、慢性疲労症候群の診断の助けとなるより精度の高い指標を提供することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のプログラムが用いられる慢性疲労症候群の判定用装置の一例を示す図である。
【図２】本発明のプログラムによる具体的な動作のフローチャートである。
【図３】エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群に属する遺伝子の遺伝子転写産物の発現量から求めた健常者及び慢性疲労症候群の患者の平均値の分布を示す。
【図４】（Ａ）エネルギー産生関連遺伝子群及びウイルス感染関連遺伝子群、（Ｂ）エネルギー産生関連遺伝子群及び抗酸化関連遺伝子群、（Ｃ）ウイルス感染関連遺伝子群及び免疫機能関連遺伝子群、（Ｄ）エネルギー産生関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群、（Ｅ）エネルギー産生関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、及び免疫機能関連遺伝子群、（Ｆ）抗酸化関連遺伝子群、鉄調節関連遺伝子群、及び免疫機能関連遺伝子群、（Ｇ）エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群のそれぞれにおける健常者と慢性疲労症候群患者との遺伝子転写産物の発現量から求めた平均値を用いて、判定を行った結果を示す。
【図５】エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群のそれぞれにおける健常者と慢性疲労症候群患者との遺伝子転写産物の発現量から求めた平均値を用いて、判定を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の慢性疲労症候群の判定方法では、まず、被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する。
生体試料は、そこから遺伝子転写産物を抽出可能な生体から採取される試料であれば特に限定されず、被験者の血液(全血、血漿、血清を含む)、唾液、尿、体毛などを用いることができる。
【００１５】
本明細書において、「遺伝子転写産物」とは、遺伝子が転写されることにより得られる産物のことであり、リボ核酸(RNA)、具体的にはメッセンジャーRNA (mRNA)である。
また、本明細書において、「遺伝子転写産物の発現量」とは、上記の生体試料中の遺伝子転写産物の存在量又は該存在量を反映する物質の量のことである。よって、本発明の方法では、遺伝子転写産物（mRNA）の量、又はmRNAから得られる相補デオキシリボ核酸(cDNA)若しくは相補RNA (cRNA)の量を測定できる。通常、生体試料中のmRNAの量は微量であるので、そこから逆転写及びインビトロ転写(IVT)などにより得られるcDNA又はcRNAの量を測定することが好ましい。
【００１６】
生体試料から遺伝子転写産物を抽出する方法は、当該技術において知られるRNA抽出法を用いて行うことができる。例えば、生体試料を遠心分離して、RNAを含む細胞を沈殿させ、物理的又は酵素的に細胞を破壊し、細胞破片を除去することによりRNA抽出物を得ることができる。RNAの抽出は、市販のRNA抽出キットなどを用いて行うこともできる。
【００１７】
上記のようにして得られた遺伝子転写産物の抽出物から、遺伝子転写産物の発現量の測定時に混入していないことが好ましい生体試料由来の混入成分、例えば生体試料が血液である場合はグロビンのmRNAなどを除去するための処理を行うこともできる。
【００１８】
上記のようにして得られた遺伝子転写産物の抽出物について、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する。
【００１９】
遺伝子転写産物の発現量の測定は、それ自体公知の方法に従って行うことができるが、多数の遺伝子転写産物の発現解析を行うことができる点で、定量PCRや核酸チップを用いる測定方法が好ましい。
核酸チップを用いて遺伝子転写産物の発現量を測定する場合、例えば、基板上に固定された20〜25 mer程度の核酸プローブに、遺伝子転写産物の抽出物又は遺伝子転写産物から作製したcDNA若しくはcRNAを接触させ、ハイブリッドの形成の有無を蛍光、発色、電流などの指標の変化を測定することにより、目的の遺伝子転写産物の発現量を測定できる。
上記の核酸プローブは、１つの遺伝子転写産物に対して少なくとも１つ用いればよく、遺伝子転写産物の長さなどに応じて、複数のプローブを用いることもできる。プローブの配列は、測定しようとする遺伝子転写産物の配列に応じて当業者が適宜決定できる。
核酸チップを用いる遺伝子転写産物の発現量の測定方法としては、例えば、Affymetrix社により提供されるGeneChipシステムを用いることができる。
【００２０】
核酸チップを用いる場合、遺伝子転写産物又はそのcDNA若しくはcRNAは、核酸プローブとのハイブリッド形成を容易にするために、断片化することが望ましい。断片化は、当該技術において公知の方法により行うことができ、例えば、金属イオン存在下で加熱する方法やリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼなどの核酸分解酵素を用いて行うことができる。
【００２１】
核酸チップにおいて核酸プローブと接触させる遺伝子転写産物又はそのcDNA若しくはcRNAは、通常、5〜20μg程度であればよい。接触条件は、通常、４５℃で１６時間程度である。
【００２２】
核酸プローブと接触させてハイブリッドを形成した遺伝子転写産物又はそのcDNA若しくはcRNAは、そのハイブリッド形成の有無及びハイブリッド形成した量について、蛍光物質、色素又はハイブリッド形成したことによる核酸チップ上を流れる電流量の変化などに基づいて検出することができる。
ハイブリッドの形成を、蛍光物質又は色素の検出により測定する場合、遺伝子転写産物又はそのcDNA若しくはcRNAが、蛍光物質又は色素の検出のための標識物質で標識されていることが好ましい。このような標識物質は、当該技術において通常用いられるものを用いることができる。通常、ビオチン化ヌクレオチド又はビオチン化リボヌクレオチドを、cDNA又はcRNAを合成するときのヌクレオチド又はリボヌクレオチド基質として混合しておくことにより、得られるcDNA又はcRNAがビオチンで標識されることができる。cDNA又はcRNAがビオチン標識されていると、核酸チップ上で、ビオチンに対する結合パートナーであるアビジン又はストレプトアビジンが結合できる。アビジン又はストレプトアビジンが、適切な蛍光物質と結合していることにより、ハイブリッドの形成が検出できる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリン、フィコエリスリンなどが挙げられる。通常、フィコエリスリン−ストレプトアビジンのコンジュゲートが市販されているので、これを用いることが簡便である。
また、アビジン又はストレプトアビジンに対する標識抗体を、アビジン又はストレプトアビジンと接触させ、標識抗体の蛍光物質又は色素を検出することもできる。
【００２３】
上記の６つの遺伝子群は、遺伝子オントロジー(Gene Ontology; GO)プロジェクトにより定義されたカテゴリー(GO Term)に従う分類である。GO Termは、http://www.geneontology.org/index.shtmlから閲覧可能である。
本発明の方法においては、上記の６つの遺伝子群のうち、少なくとも２つの群に属するそれぞれ少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する。
【００２４】
(A)エネルギー産生関連遺伝子群
エネルギー産生関連遺伝子群は、生体内のエネルギー源であるアデノシン３リン酸(ATP)に関連する遺伝子からなるカテゴリーである。本発明の方法において遺伝子転写産物の発現量が測定されるエネルギー産生関連遺伝子群は、(A-1)ＡＴＰ合成酵素関連遺伝子、(A-2)ミトコンドリアリボソームタンパク質関連遺伝子、(A-3)ＮＡＤＨ脱水素酵素関連遺伝子及び(A-4)ミトコンドリアＤＮＡ合成関連遺伝子を含むことが好ましい。
【００２５】
(A-1)ＡＴＰ合成酵素関連遺伝子は、GO Termにおいて「ミトコンドリアプロトン輸送ＡＴＰ合成酵素複合体(Mitochondrial proton-transporting ATP synthase complex)」(GO: 0005753)に分類される遺伝子である。
(A-2)ミトコンドリアリボソームタンパク質関連遺伝子は、ミトコンドリアのリボソームを構成するか又はミトコンドリアに存在するタンパク質の遺伝子である。
(A-3)ＮＡＤＨ脱水素酵素関連遺伝子は、GO Termにおいて「ＮＡＤＨ脱水素酵素(ユビキノン)活性(NADH dehydrogenase (ubiquinone) actitity)」(GO Term: 0008753)に分類される遺伝子である。
(A-4)ミトコンドリアＤＮＡ合成関連遺伝子は、GO Termにおいて「ミトコンドリアＤＮＡ合成(Mitochondrial DNA replication)」(GO: 0006264)に分類される遺伝子である。
【００２６】
(B)ウイルス感染関連遺伝子群
ウイルス感染関連遺伝子群は、インターフェロン誘導タンパク質の遺伝子を含むことが好ましい。これらの遺伝子は、ウイルスに感染するとインターフェロンが産生されることから、ウイルス感染関連遺伝子群として分類される。
【００２７】
(C)細胞死関連遺伝子群
細胞死関連遺伝子群は、細胞死に関連することが知られているカスパーゼ及びスフィンゴミエリンに関連する遺伝子を含むことが好ましい。具体的には、細胞死関連遺伝子群は、カスパーゼ関連遺伝子及びスフィンゴミエリン合成酵素関連遺伝子を含むことが好ましい。
カスパーゼ関連遺伝子は、カスパーゼの遺伝子である。
スフィンゴミエリン合成酵素関連遺伝子は、スフィンゴミエリンの合成に関連する酵素の遺伝子である。
【００２８】
(D)抗酸化関連遺伝子群
抗酸化関連遺伝子群は、抗酸化物質であることが知られているグルタチオンＳ転移酵素関連遺伝子を含むことが好ましい。
グルタチオンＳ転移酵素関連遺伝子は、GO Termにおいて「グルタチオン転移酵素活性(Glutathione transferase activity)」(GO: 0004364)に分類される遺伝子である。
【００２９】
(E)免疫機能関連遺伝子群
免疫機能関連遺伝子群は、免疫系に関連する遺伝子群であり、Ｔ細胞受容体関連遺伝子及びＮＫ細胞受容体関連遺伝子を含むことが好ましい。
Ｔ細胞受容体関連遺伝子は、Ｔ細胞受容体α、β、γなどの遺伝子である。
ＮＫ細胞受容体関連遺伝子は、ＮＫ細胞受容体の遺伝子である。
【００３０】
(F)鉄調節関連遺伝子
鉄調節関連遺伝子は、鉄応答性エレメント結合タンパク質関連遺伝子を含むことが好ましい。
鉄応答性エレメント結合タンパク質関連遺伝子は、GO Termにおいて「鉄応答性エレメント結合(Iron-responsive element binding)」(GO: 0030350)に分類される遺伝子である。
上記の各遺伝子群に属する遺伝子の例を、以下の表１に示す。
【００３１】
【表１−１】
【００３２】
【表１−２】
【００３３】
【表１−３】
【００３４】
【表１−４】
【００３５】
【表１−５】
【００３６】
本発明の方法では、上記の表１の遺伝子のうち、以下の表２に示す遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を、少なくとも２つの遺伝子群について測定することがより好ましい。
なお、表２において、「プローブセットＩＤ」は、Affymetrix社のGeneChip (登録商標)で用いられる遺伝子認識のためのプローブの組を特定するためのＩＤ番号であり、各プローブの配列については、http://www.affymetrix.com/analysis/index.affxなどから得ることができる。
また、これらの遺伝子の配列はすでに公知であり、表２に示すEntrez、Ensemble及びUnigeneのＩＤ番号を用いて、これらのデータベースから容易に入手できる。
【００３７】
【表２−１】
【００３８】
【表２−２】
【００３９】
【表２−３】
【００４０】
【表２−４】
【００４１】
【表２−５】
【００４２】
【表２−６】
【００４３】
この工程で得られる遺伝子転写産物の発現量は、生体試料中の各遺伝子転写産物の存在量を相対的に表す値であれば、特に限定されない。上記の核酸チップにより測定を行う場合、発現量は、蛍光強度、発色強度、電流量などに基づく核酸チップから得られるシグナルであり得る。
これらのシグナルは、核酸チップ用の測定装置を用いて測定できる。
【００４４】
次いで、測定された発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出する。
本明細書において、「対応する遺伝子転写産物」とは、被験者について発現量を測定したのと同じ遺伝子転写産物を意味する。
健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量は、上記の被験者からの生体試料について行ったのと同様の方法に従って、健常者から採取された生体試料を用い、測定対象の遺伝子転写産物の発現量を測定することにより、得ることができる。
本明細書において、「健常者」とは、医師の問診および一般血液検査により健常であることが確認できる人のことである。また、本明細書において、「慢性疲労症候群の患者」とは、専門医による診断により慢性疲労症候群に罹患していることが確認できる人のことである。
「健常者の集団」とは、統計学的に充分に大きいサイズの集団であればよく、３０名以上、好ましくは４０名以上の集団であればよい。
【００４５】
上記の偏差を表す値は、次の式により求めることができる。
偏差を表す値＝（被験者での遺伝子転写産物の発現量−健常者の集団での対応する遺伝子転写産物の発現量の平均値）／健常者の集団での対応する遺伝子転写産物の発現量の標準偏差
上記の偏差を表す値は、Ｚスコアとしても知られる値であり、健常者の集団における遺伝子転写産物の発現量から、被験者の遺伝子転写産物の発現量がどの程度かけ離れているかを示す値である。
【００４６】
次いで、選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、該１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得するか、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、該２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する。
すなわち、本明細書において、「平均値」とは、平均値を取得しようとする遺伝子群の中で１つの遺伝子についての偏差を表す値しか得られていない場合は、その１つの遺伝子についての偏差を表す値を意味し、２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、それらの偏差を表す値を平均した値を意味する。
【００４７】
上記の平均値は、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群について取得する。好ましくは、少なくとも３つの遺伝子群についての平均値を取得し、より好ましくは少なくとも４つの遺伝子群について、さらに好ましくは少なくとも５つの遺伝子群について、最も好ましくは６つの遺伝子群の全てについての平均値を取得する。
【００４８】
上記のようにして得られた平均値を用いて、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する。
この判定は、上記のようにして被験者から取得された平均値を、健常者から採取された生体試料を用いて上記の各工程と同様にして予め得られた平均値と、慢性疲労症候群の患者から採取された生体試料を用いて上記の各工程と同様にして予め得られた平均値とに基づいて得られる判定式に入力することにより行うことができる。この判定式は、それ自体公知のソフトウェアであるサポートベクターマシン(SVM)を用いて作成できる。
上記のような健常者からの平均値と、慢性疲労症候群の患者からの平均値とが予め入力され、判定式が作成されたSVMに、被験者から採取された生体試料から求めた平均値を入力することにより、この被験者が慢性疲労症候群に罹患しているか否かを判定することができる。
【００４９】
本発明の方法は、慢性疲労症候群の患者を「陽性」であると判定する感度が、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上である。また、本発明の方法は、健常者を「陰性」であると判定する特異度が、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上である。
本発明の方法は、このように高い感度及び特異度を有するので、正確な診断を安定して行うことができる。
【００５０】
上記の本発明の方法をコンピュータにより行うための慢性疲労症候群の判定用プログラムも、本発明の１つである。すなわち、本発明のプログラムは、コンピュータを、
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定することにより得られる発現量を受け付ける受付手段、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出し、選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する平均値取得手段、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する判定手段、
前記判定手段の判定結果を出力する出力手段
として機能させるための慢性疲労症候群の判定用プログラムである。
【００５１】
図１に、本発明のプログラムが用いられる慢性疲労症候群の判定用装置の一例を示す。慢性疲労症候群の判定用装置は、遺伝子転写産物発現量測定装置１と、コンピュータ２と、これらを接続するケーブル３とから構成される。遺伝子転写産物発現量測定装置１で測定される蛍光強度、電流量などに基づくシグナルなどの発現量のデータは、ケーブル３を介してコンピュータ２に送ることができる。また、遺伝子転写産物発現量測定装置１は、コンピュータ２と接続されていなくてもよく、この場合、発現量のデータをコンピュータに入力して上記のプログラムを作動させることができる。
コンピュータ２では、得られた発現量から、上記の偏差を表す値を算出し、得られた偏差を表す値を、少なくとも２つの遺伝子群のそれぞれにおける平均値として取得し、該平均値に基づいて、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する。
【００５２】
本発明のプログラムは、中央処理装置、記憶部、コンパクトディスクやフロッピー（登録商標）ディスクなどの読取装置やキーボードなどの入力部、及びディスプレイなどの出力部を備えるコンピュータ２と協働して、上記の本発明の方法を実現することができる。
【００５３】
本発明のプログラムによる手段としてのより具体的なコンピュータ２の動作のフローチャートを、図２に示す。
まず、遺伝子転写産物発現量測定装置で測定された遺伝子転写産物の発現量が、コンピュータ２のＣＰＵに入力される（ステップＳ１１）。
次いで、ＣＰＵは、入力された発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出し、得られた偏差を表す値について、少なくとも２つの遺伝子群のそれぞれにおける平均値を取得する処理を行う（ステップＳ１２）。
そして、ＣＰＵは、得られた平均値を用いて、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する（ステップＳ１３）。この判定は、好ましくは、平均値を、健常者から採取された生体試料を用いて求められる予め得られた平均値と、慢性疲労症候群の患者から採取された生体試料を用いて求められる予め得られた平均値とに基づいて得られる判定式に入力して、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定することにより行うことができる。
すなわち、コンピュータ２のハードディスクには、予め取得された健常者における平均値と、慢性疲労症候群の患者における平均値とが記憶されていることが好ましい。より好ましくは、コンピュータ２のハードディスクには、サポートベクターマシンがインストールされ、このSVMに上記の平均値が記憶されていることである。
ＣＰＵは、これらの予め記憶された平均値に基づいて得られる判定式に、被験者から得られる平均値を入力して、該被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定した結果を、コンピュータのディスプレイなどの表示装置に表示する（ステップＳ１４）。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例において、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、以下の態様に限定されることを意図しない。
実施例１ 本発明の方法の確立
（１）用いた血液試料
以下の対象者から採取された血液試料を生体試料として用いて、本実施例を行った。
健常者１の血液（平均年齢38.3歳） ６３検体
慢性疲労症候群(CFS)患者の血液（平均年齢36.7歳） １００検体
なお、健常者であるか慢性疲労症候群であるかの判定は、SVMにより行った。
【００５５】
（２）血液からのＲＮＡの抽出
シリンジ採血した血液5 mlから、以下の手順に従ってPAXgene Blood RNAシステム(PreanalytiX社製)を用いてトータルRNAを抽出した。以下に用いた試薬及びカラムは、全てPAXgene Blood RNAシステムに含まれている。
シリンジ採血した2.5 mLの血液を、RNA抽出用採血管であるPAXgene Blood RNA Tube (PreanalytiX社製)に移し、10回程度転倒混和し、室温に２時間以上放置した。すぐに用いない場合は、その後、-80℃にて保存する。次いで、血液を含有するRNA抽出用採血管を4000×gで10分間遠心し、上清を除去した。4 mLのリボヌクレアーゼ フリー水を加えて懸濁し、4000×gで10分間遠心し、上清を除去した。ここに、350μlのBRIバッファーを加えて、懸濁した。
内容物を1.5 mLのチューブに移し、300μlのBR2バッファー及び40μlのProtein Kinase溶液を加えた。５秒間ボルテックスした後に、55℃のサーモシェーカー上で、1000 rpmにて10分間インキュベートした。内容物をPSCカラムにアプライし、14000 rpmで３分間遠心し、得られたろ液を1.5 mLのチューブに移した。ここに、350μＬのエタノールを加え、ボルテックスした後にスピンダウンし、上清700μlをPRCカラムにアプライし、12000 rpmで１分間遠心して、ろ液を廃棄した。さらに、残りの上清も同様にPRCカラムを通過させた。PRCカラムに350μlのBR3バッファーをアプライし、12000 rpmで１分間遠心して、ろ液を廃棄した。70μlのRDD＋10μlのDNaseをPRCカラムにアプライし、室温に15分間放置した後に、ろ液を廃棄した。PRCカラムに350μlのBR3バッファーをアプライし、12000 rpmで１分間遠心して、ろ液を廃棄した。次いで、PRCカラムに500μlのBR4バッファーをアプライし、12000 rpmで１分間遠心して、ろ液を廃棄し、この手順をもう一度繰り返した（３分間の遠心）。PRCカラムを、空のまま、12000 rpmで１分間遠心した。新しい1.5 mLチューブをセットして、40μlのBR5バッファーをカラムに添加して、12000 rpmで１分間遠心し、この手順をもう一度繰り返し、得られたろ液を65℃にて５分間インキュベートした後に、氷上に置いた。
【００５６】
（３）全血由来トータルRNAからのグロビンRNAの除去
上記のようにして得られたトータルRNAから、以下の手順により、GLOBINclear-Humanキット(Ambion社製)を用いてグロビンRNAを除去した。
トータルRNAの溶液に、0.1容量の5M NH4OAc、５μgのグリコーゲン及び2.5容量のエタノールを加え、-80℃にて30〜60分間放置した。14000 rpm、４℃にて30分間遠心し、上清を除去した。ペレットに1 mLの冷80%エタノールを加えて軽く混和し、14000 rpm、４℃にて10分間遠心し、上清を除去した。この手順をもう一度繰り返し、ペレットを15分間乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水20μlを加えて溶解させた。
【００５７】
このようにして濃縮されたRNA溶液(１〜10μg、最大14μl)を、GLOBINclear-Humanキットに付属のチューブに入れ、キットに付属のCapture Oligo Mix 1μlを加え、合計容量が15μlとなるようにヌクレアーゼフリー水を加えた。キットに付属の2x Hybridization Buffer 15μlを加え、ボルテックスした後にスピンダウンし、50℃にて15分間インキュベートした。
キットに付属のStreptavidin Magnetic Beads、Streptavidin Bead Buffer及び2x Hybridization Bufferから、キットの使用説明に従って準備したStreptavidin Magnetic Beads 30μlを加え、ボルテックスした後にスピンダウンし、指ではじいて軽く混合した後に、50℃にて30分間インキュベートした。その後、ボルテックス、スピンダウンした後にマグネットスタンド上で３〜５分間放置し、上清を回収した。
【００５８】
ここに、RNA Binding Buffer 100μlを加え、ボルテックスしたBeads Suspension Mix 20μlを加え、10秒間ボルテックスした。スピンダウンし、マグネットスタンド上に３〜５分間放置し、上清を除去した後に、RNA Wash Solution 200μlを加え、10秒間ボルテックスし、スピンダウンした。マグネットスタンド上に３〜５分間放置し、上清を除去した後に、ペレットを乾燥させ、58℃に温めたElution Buffer 20μlを加え、10秒間ボルテックスし、58℃にて５分間インキュベートした。10秒間ボルテックスし、マグネットスタンド上に３〜５分間放置して、上清を回収することにより、グロビンRNAが除去されたRNAが得られた。
【００５９】
（４）GeneChip (登録商標)に用いるためのターゲットの作製
得られたトータルRNAから、以下の手順に従って、GeneChip One-Cycle Target Labeling and Control Reagents (Affymetrix社製)を用いて、遺伝子転写産物の発現量の測定のためにGeneChipに用いるためのビオチン標識ターゲットcRNAを作製した。
（4-1）1st鎖cDNAの合成
PCR用のチューブに、以下の試薬を入れ、70℃にて10分、次いで４℃にて２分以上インキュベートした。
トータルRNA（１μg） ３μl
RNアーゼフリー水 ５μl
20倍希釈されたPoly-A RNA Control ２μl
T7-Oligo (dT) Primer 50μM ２μl
合計 12μl
ここに、以下の試薬をさらに添加してタッピングした。
5×First Strand Reaction Mix ４μl
DTT 0.1M ２μl
dNTP 10 mM １μl
合計 ７μl
42℃にて２分間インキュベートし、Super Script II １μlを加えて42℃にて１時間、次いで４℃にて２分以上インキュベートして、1st鎖のcDNAを合成した。
【００６０】
（4-2）2nd鎖cDNAの合成
合成された1st鎖のcDNAに、以下の試薬を追加し、タッピングした。
RNaseフリー水 91μl
5×2nd Strand Reaction Mix 30μl
dNTP 10mM ３μl
E. coli DNAリガーゼ １μl
E. coli DNAポリメラーゼＩ ４μl
RNaseH １μl
合計 130μl
混合物を16℃にて２時間インキュベートし、T4 DNAポリメラーゼＩ ２μlを加え、16℃にて５分間インキュベートした後に、0.5M EDTAを10μl加えて、2nd鎖のcDNAを合成した。
【００６１】
（4-3）cDNAの洗浄
合成された2nd鎖のcDNAを、1.5 mLのチューブに移し、600μlのcDNA Binding Bufferを加え、ボルテックスにて混和した。500μlを、cDNA Cleanup Spin Columnにいれ、10000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる。残りのcDNAもカラムに載せ、同様にして遠心した。カラムを新しい2 mLチューブに移し、750μlのcDNA Wash Bufferを絡むに載せ、遠心し、ろ液を捨て、カラムを14000 rpmで５分間遠心した。カラムを新しい1.5 mLチューブに移し、14μlのcDNA Elution Bufferをカラムに載せ、１分間放置した後に、14000 rpmで１分間遠心して、cDNAを洗浄した。
【００６２】
（4-4）IVTラベリング
得られたcDNAを、以下の手順により、インビトロ転写(IVT)にてビオチン標識cRNAに変換した。
PCR用チューブに、以下の各試薬を入れ、軽く混合して、37℃にて16時間インキュベートして、cRNAを得た。以下の各試薬は、One-Cycle Target Labeling and Control Reagentsキットに含まれる。
工程(4-3)からのcDNA 12μl
RNaseフリー水 ８μl
10×IVT Labeling Buffer ４μl
IVT Labeling NTP Mix 12μl
IVT Labeling Enzyme Mix ４μl
合計 40μl
【００６３】
（4-5）cRNAの洗浄
得られたcRNAを、1.5 mLのチューブに移し、60μlのRNaseフリー水を加え、ボルテックスで混合した。350μlのIVT CRNA Binding Bufferを加え、ボルテックスで混合し、250μlの100% EtOHを加えてピペットで混合した。cRNA Cleanup Spin Columnに載せ、1000 rpmで15秒間遠心し、カラムを新しいチューブに移した。500μlのIVT cRNA Wash Bufferをカラムに入れ、10000 rpmで15秒間遠心し、ろ液を廃棄した。80% EtOHを500μl入れ、10000 rpmで15秒間遠心し、ろ液を廃棄した。14000 rpmで５分間遠心してカラムを乾燥させた後に、新しいチューブにカラムを移し、RNaseフリー水11μlをカラムに載せて１分間放置し、14000 rpmで１分間遠心した。さらに、RNaseフリー水10μlをカラムに載せて１分間放置し、14000 rpmで１分間遠心した。得られたろ液を200倍希釈して吸光度を測定し、cRNAの量を測定した。
【００６４】
（4-6）cRNAのフラグメント化
以下の試薬をチューブに入れ、混合して94℃にて35分間インキュベートしてcRNAをフラグメント化した後に、４℃にて保存した。なお、以下の試薬は、One-Cycle Target Labeling and Control Reagentsキットに含まれるものである。
(4-5)からのcRNA 10μl
５×Fragmentation Buffer ８μl
RNaseフリー水 22μl
合計 40μl
【００６５】
（５）GeneChip (登録商標)による遺伝子の発現量の測定
（４）で得られた断片化されたビオチン標識cRNAを用いて、GeneChip (登録商標)でのハイブリダイゼーションにより、遺伝子の発現量の測定を行った。用いた核酸チップは、Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayであった。また、ハイブリダイゼーションの条件は、以下のとおりであった。
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
断片化されたcRNA 15又は12.6又は12.1μg
Control Oligo B2 ５μl
20×Eukaryotic Hyb control 15μl
２×Hybridization Mix 150μl
DMSO 30μl
ヌクレアーゼフリー水 合計300μlまで
＜ハイブリダイゼーション温度条件＞
99℃、５分→45℃、５分→14000 rpm、５分
【００６６】
チップの染色及び洗浄は、Fluidic Station 450 (Affymetrix)装置を用い、ハイブリッド形成したターゲットcRNAをストレプトアビジン-フィコエリスリンコンジュゲートにより染色するGeneChip Hybridization Wash and Stain kit (Affymetrix)のキットを使用説明書に従って用いて行った。
スキャニングは、GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix)を用いて行った。
【００６７】
（６）発現データの抽出
DNAマイクロアレイ解析ソフトであるGeneChip Operating Software (GCOS; Affymetrix)を用いて、スキャニングした画像データをCELファイルに変換し、ArrayAssist (Stratagene)ソフトウェアで正規化し、各対象者からの試料における測定結果間の相関係数を算出した。正規化のアルゴリズムは、MAS5.0を用いた。
【００６８】
（７）データ解析
（7-1）プローブセットの絞込み
上記のようにして解析された約56000個のプローブセットに対応する遺伝子について、同一の遺伝子に対する複数のプローブセットが含まれるものについては、最大のシグナル値を示したもののみを抽出した。さらに、シグナル値が100以下の遺伝子は、除外した。この結果、約17000個のプローブセットに対応する遺伝子について、以下の解析を行った。
【００６９】
（7-2）発現量のＺスコア化
上記のようにして選択された約17000個のプローブセットに対応する遺伝子転写産物について、健常者１（63検体）から得られたシグナル値全てを用いて平均値及び標準偏差を算出した。この値を用いて、約17000個の遺伝子それぞれについて、以下の式を用いて、該遺伝子それぞれの偏差を表す値（Ｚスコア）を求めた。
Ｚスコア＝（各遺伝子転写産物のシグナル値−健常者(63検体)の対応する遺伝子転写産物のシグナル値の平均値）／健常者(63検体)の対応する遺伝子転写産物のシグナル値の標準偏差
【００７０】
（7-3）遺伝子のグループ分け及び各グループでの平均値の算出
Gene Ontology(http://www.geneontology.org/index.shtml)での分類に基づいて、上記の約17000個の遺伝子をGO Termに分け、各GO Term内の遺伝子について(7-2)で求めたＺスコアを平均して、平均値を求めた。
また、CFS患者の100検体についても、上記と同様にして、各GO Termでの平均値を求めた。
【００７１】
（7-4）健常者と慢性疲労症候群患者との間で変化する遺伝子群の選択
上記のようにして得られた健常者とCFS患者の各GO Termについての平均値を用いてＴ検定を行い、Ｐ値を算出した。
用いたGO Termを、機能や細胞内局在に基づいていくつかの群にまとめ、Ｐ値＜1.0E-05であるGO Termを多く含む群を抽出した。
次に、抽出した群に含まれる全ての遺伝子についてのＺスコアを用いて階層型クラスタリングを行い、同調して変動する遺伝子のクラスタを選択した。
各クラスタに含まれる遺伝子のＺスコアの平均値をクラスタのスコアとし、健常者(63検体)と、CFS患者(100検体)とについてＴ検定を行った。Ｐ値＜1.0E-05であるクラスタとして、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群を選択した。これらの遺伝子群は、健常者とCFS患者とを区別できるパラメータであると考えられた。これらの遺伝子群及びそれに属する遺伝子は、表２に示したものである。
【００７２】
上記のようにして選択された各遺伝子群における健常者とCFS患者とについて、(7-3)で求めたＺスコアの平均値を、図３に示す。これらの結果から、上記の遺伝子群についての平均値を用いることにより、健常者とCFS患者との区別が可能になることがわかる。
【００７３】
実施例２
実施例１で特定された６つの遺伝子群のうち、
（Ａ）エネルギー産生関連遺伝子群及びウイルス感染関連遺伝子群、
（Ｂ）エネルギー産生関連遺伝子群及び抗酸化関連遺伝子群、
（Ｃ）ウイルス感染関連遺伝子群及び免疫機能関連遺伝子群、
（Ｄ）エネルギー産生関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群、
（Ｅ）エネルギー産生関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、及び免疫機能関連遺伝子群、
（Ｆ）抗酸化関連遺伝子群、鉄調節関連遺伝子群、及び免疫機能関連遺伝子群、
（Ｇ）エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群
のそれぞれにおける健常者１(63検体)及びCFS患者(100検体)についての平均値を、それぞれ、サポートベクターマシン(SVM；解析ソフトArrayAssistの機能に含まれる)に入力し判別式を作成した。そして、これらの163検体の平均値が入力されたSVMを用いて、各検体が陽性（CFSである）と判定されるか、又は陰性(健常である)と判定されるかについて、判別性能の評価を行った。
【００７４】
結果を、それぞれ図４Ａ〜図４Ｇに示す。図４Ａ〜図４Ｇは、それぞれ、上記の遺伝子群(２つ、３つ又は６つ)についての平均値を入力したSVMを用いた場合の結果を示す。
図４において、「感度」とは、CFS患者を「陽性」であると判定する割合であり、「特異度」とは、健常者を健常者であると判定する割合である。「一致率」とは、CFS患者を「陽性」であると判定し、健常者を健常者であると判定する割合である。
これらの結果から、本発明の方法によると、80％以上の感度、及び60％以上の特異度で、CFS患者を同定することが可能になることがわかる。
また、測定する遺伝子群の数を増加させることにより、判定の精度がより向上することもわかる。
【００７５】
実施例３
健常者２の血液（平均年齢20.4歳）２００検体に対して、実施例２で作成した判別式を適用して判定性能を評価した。結果を、図５に示す。
図５の結果から、本発明の方法によると、安定して健常者と慢性疲労症候群患者とを区別できることがわかる。
【符号の説明】
【００７６】
１ 遺伝子転写産物発現量測定装置
２ コンピュータ
３ ケーブル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者が慢性疲労症候群に罹患しているかを判定するための方法に関する。より具体的には、本発明は、被験者から採取された生体試料中のある特定の遺伝子の遺伝子転写産物の発現量の測定に基づいて、該被験者が慢性疲労症候群に罹患しているかを判定できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会において、多くの人が慢性的な疲労を感じている。1999年の厚生労働省の調査では、国民の約３分の１が慢性的な疲労を感じており、その疲労により引き起こされる経済的損失は、約１．２兆円と試算され、大きな社会的問題となりうることが示唆されている。
【０００３】
慢性疲労症候群は、原因不明の回復しない強度の疲労が半年以上続く疾患であり、罹患者は日本に約30万人、全世界では約300万人、また、その予備軍は約3000万人とも言われている。
現時点では、慢性疲労症候群の診断は、患者の申告による生活の障害の程度の認定と、他の疲労を伴う疾患を精密な検査により除外していくことによってしか行うことができず、客観的な判定方法が確立されていない。
【０００４】
特表２０００−５１６８１８号公報(特許文献１)は、血液中のタンパク質であるＲＮａｓｅ Ｌを検出することにより、慢性疲労症候群を診断する方法を開示している。
特開２００５−１３１４７号公報(特許文献２)は、被験者のゲノム中のセロトニントランスポーター遺伝子の多型に基づいて、慢性疲労症候群の発症リスクを判定する方法を開示している。
【０００５】
特開２００７−２２８８７８号公報(特許文献３)は、慢性疲労症候群の患者において発現が変化している遺伝子の発現量に基づいて、慢性疲労症候群の診断を行う方法を開示している。
さらに、米国特許出願公開第２００９／００１０９０８号明細書(特許文献４)は、慢性疲労症候群の診断に用い得るバイオマーカー(遺伝子)を多数列挙している。
また、Gowら(非特許文献１)も、慢性疲労症候群の患者において発現量が特異的な遺伝子を同定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０００−５１６８１８号公報
【特許文献２】特開２００５−１３１４７号公報
【特許文献３】特開２００７−２２８８７８号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／００１０９０８号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】John W Gowら, "A gene signature for post-infectious chronic fatigue syndrome", BMC Medical Genomics 2009, 2:38
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来技術の方法では、精度の高い慢性疲労症候群の診断を安定して行うことが困難であった。
そこで、本発明は、慢性疲労症候群に罹患しているか否かの判定を正確に安定して行うことができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、被験者からの生体試料中のある特定のカテゴリー(遺伝子群)に属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定し、健常者から得られる生体試料中の対応する遺伝子転写産物の発現量からの偏差を表す値を算出し、この偏差を表す値をカテゴリー内で平均化し、少なくとも２つのカテゴリーについて求めた平均化された値を用いることにより、慢性疲労症候群に罹患している患者を、健常者から明確に安定して区別できることを見出して、本発明を完成した。
【００１０】
よって、本発明は、
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する工程と、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出する工程と、
選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する工程と、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する工程と
を含む、慢性疲労症候群の判定方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、コンピュータを、
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定することにより得られる発現量を受け付ける受付手段、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出し、選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する平均値取得手段、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する判定手段、
前記判定手段の判定結果を出力する出力手段
として機能させるための慢性疲労症候群の判定用プログラムも提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によると、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを、被験者からの生体試料を用いて簡便に判定できるとともに、客観的な判定手段を提供できる。また、本発明の方法は、従来の方法に比較して、慢性疲労症候群の診断の助けとなるより精度の高い指標を提供することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のプログラムが用いられる慢性疲労症候群の判定用装置の一例を示す図である。
【図２】本発明のプログラムによる具体的な動作のフローチャートである。
【図３】エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群に属する遺伝子の遺伝子転写産物の発現量から求めた健常者及び慢性疲労症候群の患者の平均値の分布を示す。
【図４】（Ａ）エネルギー産生関連遺伝子群及びウイルス感染関連遺伝子群、（Ｂ）エネルギー産生関連遺伝子群及び抗酸化関連遺伝子群、（Ｃ）ウイルス感染関連遺伝子群及び免疫機能関連遺伝子群、（Ｄ）エネルギー産生関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群、（Ｅ）エネルギー産生関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、及び免疫機能関連遺伝子群、（Ｆ）抗酸化関連遺伝子群、鉄調節関連遺伝子群、及び免疫機能関連遺伝子群、（Ｇ）エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群のそれぞれにおける健常者と慢性疲労症候群患者との遺伝子転写産物の発現量から求めた平均値を用いて、判定を行った結果を示す。
【図５】エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群のそれぞれにおける健常者と慢性疲労症候群患者との遺伝子転写産物の発現量から求めた平均値を用いて、判定を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の慢性疲労症候群の判定方法では、まず、被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する。
生体試料は、そこから遺伝子転写産物を抽出可能な生体から採取される試料であれば特に限定されず、被験者の血液(全血、血漿、血清を含む)、唾液、尿、体毛などを用いることができる。
【００１５】
本明細書において、「遺伝子転写産物」とは、遺伝子が転写されることにより得られる産物のことであり、リボ核酸(RNA)、具体的にはメッセンジャーRNA (mRNA)である。
また、本明細書において、「遺伝子転写産物の発現量」とは、上記の生体試料中の遺伝子転写産物の存在量又は該存在量を反映する物質の量のことである。よって、本発明の方法では、遺伝子転写産物（mRNA）の量、又はmRNAから得られる相補デオキシリボ核酸(cDNA)若しくは相補RNA (cRNA)の量を測定できる。通常、生体試料中のmRNAの量は微量であるので、そこから逆転写及びインビトロ転写(IVT)などにより得られるcDNA又はcRNAの量を測定することが好ましい。
【００１６】
生体試料から遺伝子転写産物を抽出する方法は、当該技術において知られるRNA抽出法を用いて行うことができる。例えば、生体試料を遠心分離して、RNAを含む細胞を沈殿させ、物理的又は酵素的に細胞を破壊し、細胞破片を除去することによりRNA抽出物を得ることができる。RNAの抽出は、市販のRNA抽出キットなどを用いて行うこともできる。
【００１７】
上記のようにして得られた遺伝子転写産物の抽出物から、遺伝子転写産物の発現量の測定時に混入していないことが好ましい生体試料由来の混入成分、例えば生体試料が血液である場合はグロビンのmRNAなどを除去するための処理を行うこともできる。
【００１８】
上記のようにして得られた遺伝子転写産物の抽出物について、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する。
【００１９】
遺伝子転写産物の発現量の測定は、それ自体公知の方法に従って行うことができるが、多数の遺伝子転写産物の発現解析を行うことができる点で、定量PCRや核酸チップを用いる測定方法が好ましい。
核酸チップを用いて遺伝子転写産物の発現量を測定する場合、例えば、基板上に固定された20〜25 mer程度の核酸プローブに、遺伝子転写産物の抽出物又は遺伝子転写産物から作製したcDNA若しくはcRNAを接触させ、ハイブリッドの形成の有無を蛍光、発色、電流などの指標の変化を測定することにより、目的の遺伝子転写産物の発現量を測定できる。
上記の核酸プローブは、１つの遺伝子転写産物に対して少なくとも１つ用いればよく、遺伝子転写産物の長さなどに応じて、複数のプローブを用いることもできる。プローブの配列は、測定しようとする遺伝子転写産物の配列に応じて当業者が適宜決定できる。
核酸チップを用いる遺伝子転写産物の発現量の測定方法としては、例えば、Affymetrix社により提供されるGeneChipシステムを用いることができる。
【００２０】
核酸チップを用いる場合、遺伝子転写産物又はそのcDNA若しくはcRNAは、核酸プローブとのハイブリッド形成を容易にするために、断片化することが望ましい。断片化は、当該技術において公知の方法により行うことができ、例えば、金属イオン存在下で加熱する方法やリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼなどの核酸分解酵素を用いて行うことができる。
【００２１】
核酸チップにおいて核酸プローブと接触させる遺伝子転写産物又はそのcDNA若しくはcRNAは、通常、5〜20μg程度であればよい。接触条件は、通常、４５℃で１６時間程度である。
【００２２】
核酸プローブと接触させてハイブリッドを形成した遺伝子転写産物又はそのcDNA若しくはcRNAは、そのハイブリッド形成の有無及びハイブリッド形成した量について、蛍光物質、色素又はハイブリッド形成したことによる核酸チップ上を流れる電流量の変化などに基づいて検出することができる。
ハイブリッドの形成を、蛍光物質又は色素の検出により測定する場合、遺伝子転写産物又はそのcDNA若しくはcRNAが、蛍光物質又は色素の検出のための標識物質で標識されていることが好ましい。このような標識物質は、当該技術において通常用いられるものを用いることができる。通常、ビオチン化ヌクレオチド又はビオチン化リボヌクレオチドを、cDNA又はcRNAを合成するときのヌクレオチド又はリボヌクレオチド基質として混合しておくことにより、得られるcDNA又はcRNAがビオチンで標識されることができる。cDNA又はcRNAがビオチン標識されていると、核酸チップ上で、ビオチンに対する結合パートナーであるアビジン又はストレプトアビジンが結合できる。アビジン又はストレプトアビジンが、適切な蛍光物質と結合していることにより、ハイブリッドの形成が検出できる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリン、フィコエリスリンなどが挙げられる。通常、フィコエリスリン−ストレプトアビジンのコンジュゲートが市販されているので、これを用いることが簡便である。
また、アビジン又はストレプトアビジンに対する標識抗体を、アビジン又はストレプトアビジンと接触させ、標識抗体の蛍光物質又は色素を検出することもできる。
【００２３】
上記の６つの遺伝子群は、遺伝子オントロジー(Gene Ontology; GO)プロジェクトにより定義されたカテゴリー(GO Term)に従う分類である。GO Termは、http://www.geneontology.org/index.shtmlから閲覧可能である。
本発明の方法においては、上記の６つの遺伝子群のうち、少なくとも２つの群に属するそれぞれ少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する。
【００２４】
(A)エネルギー産生関連遺伝子群
エネルギー産生関連遺伝子群は、生体内のエネルギー源であるアデノシン３リン酸(ATP)に関連する遺伝子からなるカテゴリーである。本発明の方法において遺伝子転写産物の発現量が測定されるエネルギー産生関連遺伝子群は、(A-1)ＡＴＰ合成酵素関連遺伝子、(A-2)ミトコンドリアリボソームタンパク質関連遺伝子、(A-3)ＮＡＤＨ脱水素酵素関連遺伝子及び(A-4)ミトコンドリアＤＮＡ合成関連遺伝子を含むことが好ましい。
【００２５】
(A-1)ＡＴＰ合成酵素関連遺伝子は、GO Termにおいて「ミトコンドリアプロトン輸送ＡＴＰ合成酵素複合体(Mitochondrial proton-transporting ATP synthase complex)」(GO: 0005753)に分類される遺伝子である。
(A-2)ミトコンドリアリボソームタンパク質関連遺伝子は、ミトコンドリアのリボソームを構成するか又はミトコンドリアに存在するタンパク質の遺伝子である。
(A-3)ＮＡＤＨ脱水素酵素関連遺伝子は、GO Termにおいて「ＮＡＤＨ脱水素酵素(ユビキノン)活性(NADH dehydrogenase (ubiquinone) actitity)」(GO Term: 0008753)に分類される遺伝子である。
(A-4)ミトコンドリアＤＮＡ合成関連遺伝子は、GO Termにおいて「ミトコンドリアＤＮＡ合成(Mitochondrial DNA replication)」(GO: 0006264)に分類される遺伝子である。
【００２６】
(B)ウイルス感染関連遺伝子群
ウイルス感染関連遺伝子群は、インターフェロン誘導タンパク質の遺伝子を含むことが好ましい。これらの遺伝子は、ウイルスに感染するとインターフェロンが産生されることから、ウイルス感染関連遺伝子群として分類される。
【００２７】
(C)細胞死関連遺伝子群
細胞死関連遺伝子群は、細胞死に関連することが知られているカスパーゼ及びスフィンゴミエリンに関連する遺伝子を含むことが好ましい。具体的には、細胞死関連遺伝子群は、カスパーゼ関連遺伝子及びスフィンゴミエリン合成酵素関連遺伝子を含むことが好ましい。
カスパーゼ関連遺伝子は、カスパーゼの遺伝子である。
スフィンゴミエリン合成酵素関連遺伝子は、スフィンゴミエリンの合成に関連する酵素の遺伝子である。
【００２８】
(D)抗酸化関連遺伝子群
抗酸化関連遺伝子群は、抗酸化物質であることが知られているグルタチオンＳ転移酵素関連遺伝子を含むことが好ましい。
グルタチオンＳ転移酵素関連遺伝子は、GO Termにおいて「グルタチオン転移酵素活性(Glutathione transferase activity)」(GO: 0004364)に分類される遺伝子である。
【００２９】
(E)免疫機能関連遺伝子群
免疫機能関連遺伝子群は、免疫系に関連する遺伝子群であり、Ｔ細胞受容体関連遺伝子及びＮＫ細胞受容体関連遺伝子を含むことが好ましい。
Ｔ細胞受容体関連遺伝子は、Ｔ細胞受容体α、β、γなどの遺伝子である。
ＮＫ細胞受容体関連遺伝子は、ＮＫ細胞受容体の遺伝子である。
【００３０】
(F)鉄調節関連遺伝子
鉄調節関連遺伝子は、鉄応答性エレメント結合タンパク質関連遺伝子を含むことが好ましい。
鉄応答性エレメント結合タンパク質関連遺伝子は、GO Termにおいて「鉄応答性エレメント結合(Iron-responsive element binding)」(GO: 0030350)に分類される遺伝子である。
上記の各遺伝子群に属する遺伝子の例を、以下の表１に示す。
【００３１】
【表１−１】
【００３２】
【表１−２】
【００３３】
【表１−３】
【００３４】
【表１−４】
【００３５】
【表１−５】
【００３６】
本発明の方法では、上記の表１の遺伝子のうち、以下の表２に示す遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を、少なくとも２つの遺伝子群について測定することがより好ましい。
なお、表２において、「プローブセットＩＤ」は、Affymetrix社のGeneChip (登録商標)で用いられる遺伝子認識のためのプローブの組を特定するためのＩＤ番号であり、各プローブの配列については、http://www.affymetrix.com/analysis/index.affxなどから得ることができる。
また、これらの遺伝子の配列はすでに公知であり、表２に示すEntrez、Ensemble及びUnigeneのＩＤ番号を用いて、これらのデータベースから容易に入手できる。
【００３７】
【表２−１】
【００３８】
【表２−２】
【００３９】
【表２−３】
【００４０】
【表２−４】
【００４１】
【表２−５】
【００４２】
【表２−６】
【００４３】
この工程で得られる遺伝子転写産物の発現量は、生体試料中の各遺伝子転写産物の存在量を相対的に表す値であれば、特に限定されない。上記の核酸チップにより測定を行う場合、発現量は、蛍光強度、発色強度、電流量などに基づく核酸チップから得られるシグナルであり得る。
これらのシグナルは、核酸チップ用の測定装置を用いて測定できる。
【００４４】
次いで、測定された発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出する。
本明細書において、「対応する遺伝子転写産物」とは、被験者について発現量を測定したのと同じ遺伝子転写産物を意味する。
健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量は、上記の被験者からの生体試料について行ったのと同様の方法に従って、健常者から採取された生体試料を用い、測定対象の遺伝子転写産物の発現量を測定することにより、得ることができる。
本明細書において、「健常者」とは、医師の問診および一般血液検査により健常であることが確認できる人のことである。また、本明細書において、「慢性疲労症候群の患者」とは、専門医による診断により慢性疲労症候群に罹患していることが確認できる人のことである。
「健常者の集団」とは、統計学的に充分に大きいサイズの集団であればよく、３０名以上、好ましくは４０名以上の集団であればよい。
【００４５】
上記の偏差を表す値は、次の式により求めることができる。
偏差を表す値＝（被験者での遺伝子転写産物の発現量−健常者の集団での対応する遺伝子転写産物の発現量の平均値）／健常者の集団での対応する遺伝子転写産物の発現量の標準偏差
上記の偏差を表す値は、Ｚスコアとしても知られる値であり、健常者の集団における遺伝子転写産物の発現量から、被験者の遺伝子転写産物の発現量がどの程度かけ離れているかを示す値である。
【００４６】
次いで、選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、該１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得するか、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、該２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する。
すなわち、本明細書において、「平均値」とは、平均値を取得しようとする遺伝子群の中で１つの遺伝子についての偏差を表す値しか得られていない場合は、その１つの遺伝子についての偏差を表す値を意味し、２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、それらの偏差を表す値を平均した値を意味する。
【００４７】
上記の平均値は、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群について取得する。好ましくは、少なくとも３つの遺伝子群についての平均値を取得し、より好ましくは少なくとも４つの遺伝子群について、さらに好ましくは少なくとも５つの遺伝子群について、最も好ましくは６つの遺伝子群の全てについての平均値を取得する。
【００４８】
上記のようにして得られた平均値を用いて、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する。
この判定は、上記のようにして被験者から取得された平均値を、健常者から採取された生体試料を用いて上記の各工程と同様にして予め得られた平均値と、慢性疲労症候群の患者から採取された生体試料を用いて上記の各工程と同様にして予め得られた平均値とに基づいて得られる判定式に入力することにより行うことができる。この判定式は、それ自体公知のソフトウェアであるサポートベクターマシン(SVM)を用いて作成できる。
上記のような健常者からの平均値と、慢性疲労症候群の患者からの平均値とが予め入力され、判定式が作成されたSVMに、被験者から採取された生体試料から求めた平均値を入力することにより、この被験者が慢性疲労症候群に罹患しているか否かを判定することができる。
【００４９】
本発明の方法は、慢性疲労症候群の患者を「陽性」であると判定する感度が、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上である。また、本発明の方法は、健常者を「陰性」であると判定する特異度が、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上である。
本発明の方法は、このように高い感度及び特異度を有するので、正確な診断を安定して行うことができる。
【００５０】
上記の本発明の方法をコンピュータにより行うための慢性疲労症候群の判定用プログラムも、本発明の１つである。すなわち、本発明のプログラムは、コンピュータを、
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定することにより得られる発現量を受け付ける受付手段、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出し、選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する平均値取得手段、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する判定手段、
前記判定手段の判定結果を出力する出力手段
として機能させるための慢性疲労症候群の判定用プログラムである。
【００５１】
図１に、本発明のプログラムが用いられる慢性疲労症候群の判定用装置の一例を示す。慢性疲労症候群の判定用装置は、遺伝子転写産物発現量測定装置１と、コンピュータ２と、これらを接続するケーブル３とから構成される。遺伝子転写産物発現量測定装置１で測定される蛍光強度、電流量などに基づくシグナルなどの発現量のデータは、ケーブル３を介してコンピュータ２に送ることができる。また、遺伝子転写産物発現量測定装置１は、コンピュータ２と接続されていなくてもよく、この場合、発現量のデータをコンピュータに入力して上記のプログラムを作動させることができる。
コンピュータ２では、得られた発現量から、上記の偏差を表す値を算出し、得られた偏差を表す値を、少なくとも２つの遺伝子群のそれぞれにおける平均値として取得し、該平均値に基づいて、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する。
【００５２】
本発明のプログラムは、中央処理装置、記憶部、コンパクトディスクやフロッピー（登録商標）ディスクなどの読取装置やキーボードなどの入力部、及びディスプレイなどの出力部を備えるコンピュータ２と協働して、上記の本発明の方法を実現することができる。
【００５３】
本発明のプログラムによる手段としてのより具体的なコンピュータ２の動作のフローチャートを、図２に示す。
まず、遺伝子転写産物発現量測定装置で測定された遺伝子転写産物の発現量が、コンピュータ２のＣＰＵに入力される（ステップＳ１１）。
次いで、ＣＰＵは、入力された発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出し、得られた偏差を表す値について、少なくとも２つの遺伝子群のそれぞれにおける平均値を取得する処理を行う（ステップＳ１２）。
そして、ＣＰＵは、得られた平均値を用いて、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する（ステップＳ１３）。この判定は、好ましくは、平均値を、健常者から採取された生体試料を用いて求められる予め得られた平均値と、慢性疲労症候群の患者から採取された生体試料を用いて求められる予め得られた平均値とに基づいて得られる判定式に入力して、被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定することにより行うことができる。
すなわち、コンピュータ２のハードディスクには、予め取得された健常者における平均値と、慢性疲労症候群の患者における平均値とが記憶されていることが好ましい。より好ましくは、コンピュータ２のハードディスクには、サポートベクターマシンがインストールされ、このSVMに上記の平均値が記憶されていることである。
ＣＰＵは、これらの予め記憶された平均値に基づいて得られる判定式に、被験者から得られる平均値を入力して、該被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定した結果を、コンピュータのディスプレイなどの表示装置に表示する（ステップＳ１４）。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例において、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、以下の態様に限定されることを意図しない。
実施例１ 本発明の方法の確立
（１）用いた血液試料
以下の対象者から採取された血液試料を生体試料として用いて、本実施例を行った。
健常者１の血液（平均年齢38.3歳） ６３検体
慢性疲労症候群(CFS)患者の血液（平均年齢36.7歳） １００検体
なお、健常者であるか慢性疲労症候群であるかの判定は、SVMにより行った。
【００５５】
（２）血液からのＲＮＡの抽出
シリンジ採血した血液5 mlから、以下の手順に従ってPAXgene Blood RNAシステム(PreanalytiX社製)を用いてトータルRNAを抽出した。以下に用いた試薬及びカラムは、全てPAXgene Blood RNAシステムに含まれている。
シリンジ採血した2.5 mLの血液を、RNA抽出用採血管であるPAXgene Blood RNA Tube (PreanalytiX社製)に移し、10回程度転倒混和し、室温に２時間以上放置した。すぐに用いない場合は、その後、-80℃にて保存する。次いで、血液を含有するRNA抽出用採血管を4000×gで10分間遠心し、上清を除去した。4 mLのリボヌクレアーゼ フリー水を加えて懸濁し、4000×gで10分間遠心し、上清を除去した。ここに、350μlのBRIバッファーを加えて、懸濁した。
内容物を1.5 mLのチューブに移し、300μlのBR2バッファー及び40μlのProtein Kinase溶液を加えた。５秒間ボルテックスした後に、55℃のサーモシェーカー上で、1000 rpmにて10分間インキュベートした。内容物をPSCカラムにアプライし、14000 rpmで３分間遠心し、得られたろ液を1.5 mLのチューブに移した。ここに、350μＬのエタノールを加え、ボルテックスした後にスピンダウンし、上清700μlをPRCカラムにアプライし、12000 rpmで１分間遠心して、ろ液を廃棄した。さらに、残りの上清も同様にPRCカラムを通過させた。PRCカラムに350μlのBR3バッファーをアプライし、12000 rpmで１分間遠心して、ろ液を廃棄した。70μlのRDD＋10μlのDNaseをPRCカラムにアプライし、室温に15分間放置した後に、ろ液を廃棄した。PRCカラムに350μlのBR3バッファーをアプライし、12000 rpmで１分間遠心して、ろ液を廃棄した。次いで、PRCカラムに500μlのBR4バッファーをアプライし、12000 rpmで１分間遠心して、ろ液を廃棄し、この手順をもう一度繰り返した（３分間の遠心）。PRCカラムを、空のまま、12000 rpmで１分間遠心した。新しい1.5 mLチューブをセットして、40μlのBR5バッファーをカラムに添加して、12000 rpmで１分間遠心し、この手順をもう一度繰り返し、得られたろ液を65℃にて５分間インキュベートした後に、氷上に置いた。
【００５６】
（３）全血由来トータルRNAからのグロビンRNAの除去
上記のようにして得られたトータルRNAから、以下の手順により、GLOBINclear-Humanキット(Ambion社製)を用いてグロビンRNAを除去した。
トータルRNAの溶液に、0.1容量の5M NH4OAc、５μgのグリコーゲン及び2.5容量のエタノールを加え、-80℃にて30〜60分間放置した。14000 rpm、４℃にて30分間遠心し、上清を除去した。ペレットに1 mLの冷80%エタノールを加えて軽く混和し、14000 rpm、４℃にて10分間遠心し、上清を除去した。この手順をもう一度繰り返し、ペレットを15分間乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水20μlを加えて溶解させた。
【００５７】
このようにして濃縮されたRNA溶液(１〜10μg、最大14μl)を、GLOBINclear-Humanキットに付属のチューブに入れ、キットに付属のCapture Oligo Mix 1μlを加え、合計容量が15μlとなるようにヌクレアーゼフリー水を加えた。キットに付属の2x Hybridization Buffer 15μlを加え、ボルテックスした後にスピンダウンし、50℃にて15分間インキュベートした。
キットに付属のStreptavidin Magnetic Beads、Streptavidin Bead Buffer及び2x Hybridization Bufferから、キットの使用説明に従って準備したStreptavidin Magnetic Beads 30μlを加え、ボルテックスした後にスピンダウンし、指ではじいて軽く混合した後に、50℃にて30分間インキュベートした。その後、ボルテックス、スピンダウンした後にマグネットスタンド上で３〜５分間放置し、上清を回収した。
【００５８】
ここに、RNA Binding Buffer 100μlを加え、ボルテックスしたBeads Suspension Mix 20μlを加え、10秒間ボルテックスした。スピンダウンし、マグネットスタンド上に３〜５分間放置し、上清を除去した後に、RNA Wash Solution 200μlを加え、10秒間ボルテックスし、スピンダウンした。マグネットスタンド上に３〜５分間放置し、上清を除去した後に、ペレットを乾燥させ、58℃に温めたElution Buffer 20μlを加え、10秒間ボルテックスし、58℃にて５分間インキュベートした。10秒間ボルテックスし、マグネットスタンド上に３〜５分間放置して、上清を回収することにより、グロビンRNAが除去されたRNAが得られた。
【００５９】
（４）GeneChip (登録商標)に用いるためのターゲットの作製
得られたトータルRNAから、以下の手順に従って、GeneChip One-Cycle Target Labeling and Control Reagents (Affymetrix社製)を用いて、遺伝子転写産物の発現量の測定のためにGeneChipに用いるためのビオチン標識ターゲットcRNAを作製した。
（4-1）1st鎖cDNAの合成
PCR用のチューブに、以下の試薬を入れ、70℃にて10分、次いで４℃にて２分以上インキュベートした。
トータルRNA（１μg） ３μl
RNアーゼフリー水 ５μl
20倍希釈されたPoly-A RNA Control ２μl
T7-Oligo (dT) Primer 50μM ２μl
合計 12μl
ここに、以下の試薬をさらに添加してタッピングした。
5×First Strand Reaction Mix ４μl
DTT 0.1M ２μl
dNTP 10 mM １μl
合計 ７μl
42℃にて２分間インキュベートし、Super Script II １μlを加えて42℃にて１時間、次いで４℃にて２分以上インキュベートして、1st鎖のcDNAを合成した。
【００６０】
（4-2）2nd鎖cDNAの合成
合成された1st鎖のcDNAに、以下の試薬を追加し、タッピングした。
RNaseフリー水 91μl
5×2nd Strand Reaction Mix 30μl
dNTP 10mM ３μl
E. coli DNAリガーゼ １μl
E. coli DNAポリメラーゼＩ ４μl
RNaseH １μl
合計 130μl
混合物を16℃にて２時間インキュベートし、T4 DNAポリメラーゼＩ ２μlを加え、16℃にて５分間インキュベートした後に、0.5M EDTAを10μl加えて、2nd鎖のcDNAを合成した。
【００６１】
（4-3）cDNAの洗浄
合成された2nd鎖のcDNAを、1.5 mLのチューブに移し、600μlのcDNA Binding Bufferを加え、ボルテックスにて混和した。500μlを、cDNA Cleanup Spin Columnにいれ、10000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる。残りのcDNAもカラムに載せ、同様にして遠心した。カラムを新しい2 mLチューブに移し、750μlのcDNA Wash Bufferを絡むに載せ、遠心し、ろ液を捨て、カラムを14000 rpmで５分間遠心した。カラムを新しい1.5 mLチューブに移し、14μlのcDNA Elution Bufferをカラムに載せ、１分間放置した後に、14000 rpmで１分間遠心して、cDNAを洗浄した。
【００６２】
（4-4）IVTラベリング
得られたcDNAを、以下の手順により、インビトロ転写(IVT)にてビオチン標識cRNAに変換した。
PCR用チューブに、以下の各試薬を入れ、軽く混合して、37℃にて16時間インキュベートして、cRNAを得た。以下の各試薬は、One-Cycle Target Labeling and Control Reagentsキットに含まれる。
工程(4-3)からのcDNA 12μl
RNaseフリー水 ８μl
10×IVT Labeling Buffer ４μl
IVT Labeling NTP Mix 12μl
IVT Labeling Enzyme Mix ４μl
合計 40μl
【００６３】
（4-5）cRNAの洗浄
得られたcRNAを、1.5 mLのチューブに移し、60μlのRNaseフリー水を加え、ボルテックスで混合した。350μlのIVT CRNA Binding Bufferを加え、ボルテックスで混合し、250μlの100% EtOHを加えてピペットで混合した。cRNA Cleanup Spin Columnに載せ、1000 rpmで15秒間遠心し、カラムを新しいチューブに移した。500μlのIVT cRNA Wash Bufferをカラムに入れ、10000 rpmで15秒間遠心し、ろ液を廃棄した。80% EtOHを500μl入れ、10000 rpmで15秒間遠心し、ろ液を廃棄した。14000 rpmで５分間遠心してカラムを乾燥させた後に、新しいチューブにカラムを移し、RNaseフリー水11μlをカラムに載せて１分間放置し、14000 rpmで１分間遠心した。さらに、RNaseフリー水10μlをカラムに載せて１分間放置し、14000 rpmで１分間遠心した。得られたろ液を200倍希釈して吸光度を測定し、cRNAの量を測定した。
【００６４】
（4-6）cRNAのフラグメント化
以下の試薬をチューブに入れ、混合して94℃にて35分間インキュベートしてcRNAをフラグメント化した後に、４℃にて保存した。なお、以下の試薬は、One-Cycle Target Labeling and Control Reagentsキットに含まれるものである。
(4-5)からのcRNA 10μl
５×Fragmentation Buffer ８μl
RNaseフリー水 22μl
合計 40μl
【００６５】
（５）GeneChip (登録商標)による遺伝子の発現量の測定
（４）で得られた断片化されたビオチン標識cRNAを用いて、GeneChip (登録商標)でのハイブリダイゼーションにより、遺伝子の発現量の測定を行った。用いた核酸チップは、Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayであった。また、ハイブリダイゼーションの条件は、以下のとおりであった。
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
断片化されたcRNA 15又は12.6又は12.1μg
Control Oligo B2 ５μl
20×Eukaryotic Hyb control 15μl
２×Hybridization Mix 150μl
DMSO 30μl
ヌクレアーゼフリー水 合計300μlまで
＜ハイブリダイゼーション温度条件＞
99℃、５分→45℃、５分→14000 rpm、５分
【００６６】
チップの染色及び洗浄は、Fluidic Station 450 (Affymetrix)装置を用い、ハイブリッド形成したターゲットcRNAをストレプトアビジン-フィコエリスリンコンジュゲートにより染色するGeneChip Hybridization Wash and Stain kit (Affymetrix)のキットを使用説明書に従って用いて行った。
スキャニングは、GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix)を用いて行った。
【００６７】
（６）発現データの抽出
DNAマイクロアレイ解析ソフトであるGeneChip Operating Software (GCOS; Affymetrix)を用いて、スキャニングした画像データをCELファイルに変換し、ArrayAssist (Stratagene)ソフトウェアで正規化し、各対象者からの試料における測定結果間の相関係数を算出した。正規化のアルゴリズムは、MAS5.0を用いた。
【００６８】
（７）データ解析
（7-1）プローブセットの絞込み
上記のようにして解析された約56000個のプローブセットに対応する遺伝子について、同一の遺伝子に対する複数のプローブセットが含まれるものについては、最大のシグナル値を示したもののみを抽出した。さらに、シグナル値が100以下の遺伝子は、除外した。この結果、約17000個のプローブセットに対応する遺伝子について、以下の解析を行った。
【００６９】
（7-2）発現量のＺスコア化
上記のようにして選択された約17000個のプローブセットに対応する遺伝子転写産物について、健常者１（63検体）から得られたシグナル値全てを用いて平均値及び標準偏差を算出した。この値を用いて、約17000個の遺伝子それぞれについて、以下の式を用いて、該遺伝子それぞれの偏差を表す値（Ｚスコア）を求めた。
Ｚスコア＝（各遺伝子転写産物のシグナル値−健常者(63検体)の対応する遺伝子転写産物のシグナル値の平均値）／健常者(63検体)の対応する遺伝子転写産物のシグナル値の標準偏差
【００７０】
（7-3）遺伝子のグループ分け及び各グループでの平均値の算出
Gene Ontology(http://www.geneontology.org/index.shtml)での分類に基づいて、上記の約17000個の遺伝子をGO Termに分け、各GO Term内の遺伝子について(7-2)で求めたＺスコアを平均して、平均値を求めた。
また、CFS患者の100検体についても、上記と同様にして、各GO Termでの平均値を求めた。
【００７１】
（7-4）健常者と慢性疲労症候群患者との間で変化する遺伝子群の選択
上記のようにして得られた健常者とCFS患者の各GO Termについての平均値を用いてＴ検定を行い、Ｐ値を算出した。
用いたGO Termを、機能や細胞内局在に基づいていくつかの群にまとめ、Ｐ値＜1.0E-05であるGO Termを多く含む群を抽出した。
次に、抽出した群に含まれる全ての遺伝子についてのＺスコアを用いて階層型クラスタリングを行い、同調して変動する遺伝子のクラスタを選択した。
各クラスタに含まれる遺伝子のＺスコアの平均値をクラスタのスコアとし、健常者(63検体)と、CFS患者(100検体)とについてＴ検定を行った。Ｐ値＜1.0E-05であるクラスタとして、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群を選択した。これらの遺伝子群は、健常者とCFS患者とを区別できるパラメータであると考えられた。これらの遺伝子群及びそれに属する遺伝子は、表２に示したものである。
【００７２】
上記のようにして選択された各遺伝子群における健常者とCFS患者とについて、(7-3)で求めたＺスコアの平均値を、図３に示す。これらの結果から、上記の遺伝子群についての平均値を用いることにより、健常者とCFS患者との区別が可能になることがわかる。
【００７３】
実施例２
実施例１で特定された６つの遺伝子群のうち、
（Ａ）エネルギー産生関連遺伝子群及びウイルス感染関連遺伝子群、
（Ｂ）エネルギー産生関連遺伝子群及び抗酸化関連遺伝子群、
（Ｃ）ウイルス感染関連遺伝子群及び免疫機能関連遺伝子群、
（Ｄ）エネルギー産生関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群、
（Ｅ）エネルギー産生関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、及び免疫機能関連遺伝子群、
（Ｆ）抗酸化関連遺伝子群、鉄調節関連遺伝子群、及び免疫機能関連遺伝子群、
（Ｇ）エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群
のそれぞれにおける健常者１(63検体)及びCFS患者(100検体)についての平均値を、それぞれ、サポートベクターマシン(SVM；解析ソフトArrayAssistの機能に含まれる)に入力し判別式を作成した。そして、これらの163検体の平均値が入力されたSVMを用いて、各検体が陽性（CFSである）と判定されるか、又は陰性(健常である)と判定されるかについて、判別性能の評価を行った。
【００７４】
結果を、それぞれ図４Ａ〜図４Ｇに示す。図４Ａ〜図４Ｇは、それぞれ、上記の遺伝子群(２つ、３つ又は６つ)についての平均値を入力したSVMを用いた場合の結果を示す。
図４において、「感度」とは、CFS患者を「陽性」であると判定する割合であり、「特異度」とは、健常者を健常者であると判定する割合である。「一致率」とは、CFS患者を「陽性」であると判定し、健常者を健常者であると判定する割合である。
これらの結果から、本発明の方法によると、80％以上の感度、及び60％以上の特異度で、CFS患者を同定することが可能になることがわかる。
また、測定する遺伝子群の数を増加させることにより、判定の精度がより向上することもわかる。
【００７５】
実施例３
健常者２の血液（平均年齢20.4歳）２００検体に対して、実施例２で作成した判別式を適用して判定性能を評価した。結果を、図５に示す。
図５の結果から、本発明の方法によると、安定して健常者と慢性疲労症候群患者とを区別できることがわかる。
【符号の説明】
【００７６】
１ 遺伝子転写産物発現量測定装置
２ コンピュータ
３ ケーブル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する工程と、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出する工程と、
選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する工程と、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する工程と
を含む、慢性疲労症候群の判定方法。
【請求項２】
測定工程において、少なくとも３つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子転写産物の発現量を測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エネルギー産生関連遺伝子群の遺伝子が、ＡＴＰ合成酵素関連遺伝子、ミトコンドリアリボソームタンパク質関連遺伝子、ＮＡＤＨ脱水素酵素関連遺伝子及びミトコンドリアＤＮＡ合成関連遺伝子を含み、
ウイルス感染関連遺伝子群の遺伝子が、インターフェロン関連遺伝子を含み、
細胞死関連遺伝子群の遺伝子が、カスパーゼ関連遺伝子及びスフィンゴミエリン合成酵素関連遺伝子を含み、
抗酸化関連遺伝子群の遺伝子が、グルタチオンＳ転移酵素関連遺伝子を含み、
免疫機能関連遺伝子群の遺伝子が、Ｔ細胞受容体関連遺伝子及びＮＫ細胞受容体関連遺伝子を含み、
鉄調節関連遺伝子群の遺伝子が、鉄応答性エレメント結合タンパク質関連遺伝子を含む
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
エネルギー産生関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して506、518、517、516、513、63931、6182、6183、6150、51081、60488、54948、51021、51373、65003、26589、64981、63875、64951、64978、64928、219927、116540、122704、4706、4717、4695、4718、4710 /// 727762、54539、51079、4715、4716、55967、126328及び5428で表される遺伝子からなる群より選択され、
細胞死関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して114769 /// 834、22900、836、842、838、837、834、839、841、84674、259230、81537及び166929で表される遺伝子からなる群より選択され、
ウイルス感染関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して3428及び64135で表される遺伝子からなる群より選択され、
抗酸化関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して2950、9446、2947、2946、2944、2949、2948、373156、79807及び2941で表される遺伝子からなる群より選択され、
免疫機能関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して28755 /// 6955、28663 /// 28738 /// 28755 /// 6955、6955、28663 /// 28738 /// 28755 /// 6955 /// 6964、445347 /// 6967、6955 /// 6964、28595、3812 /// 727787、3808、3804、3806、3802、3811 /// 3813、57292、100132285 /// 3806 /// 3809、3811、3809及び115653で表される遺伝子からなる群より選択され、
鉄調節関連遺伝子が、Entrez Gene IDで表して3658で表される遺伝子である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
生体試料が、血液である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
判定工程が、前記被験者から取得された平均値を、健常者から採取された生体試料を用いて前記測定工程、算出工程及び取得工程と同様にして予め得られた平均値と、慢性疲労症候群の患者から採取された生体試料を用いて前記測定工程、算出工程及び取得工程と同様にして予め得られた平均値とに基づいて得られる判定式に入力することにより行われる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
判定式が、サポートベクターマシンを用いて作成される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コンピュータを、
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定することにより得られる発現量を受け付ける受付手段、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出し、選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する平均値取得手段、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する判定手段、
前記判定手段の判定結果を出力する出力手段
として機能させるための慢性疲労症候群の判定用プログラム。
【請求項９】
前記判定手段がサポートベクターマシンを含む請求項８に記載のプログラム。
【請求項１】
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定する工程と、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出する工程と、
選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する工程と、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する工程と
を含む、慢性疲労症候群の判定方法。
【請求項２】
測定工程において、少なくとも３つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子転写産物の発現量を測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エネルギー産生関連遺伝子群の遺伝子が、ＡＴＰ合成酵素関連遺伝子、ミトコンドリアリボソームタンパク質関連遺伝子、ＮＡＤＨ脱水素酵素関連遺伝子及びミトコンドリアＤＮＡ合成関連遺伝子を含み、
ウイルス感染関連遺伝子群の遺伝子が、インターフェロン関連遺伝子を含み、
細胞死関連遺伝子群の遺伝子が、カスパーゼ関連遺伝子及びスフィンゴミエリン合成酵素関連遺伝子を含み、
抗酸化関連遺伝子群の遺伝子が、グルタチオンＳ転移酵素関連遺伝子を含み、
免疫機能関連遺伝子群の遺伝子が、Ｔ細胞受容体関連遺伝子及びＮＫ細胞受容体関連遺伝子を含み、
鉄調節関連遺伝子群の遺伝子が、鉄応答性エレメント結合タンパク質関連遺伝子を含む
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
エネルギー産生関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して506、518、517、516、513、63931、6182、6183、6150、51081、60488、54948、51021、51373、65003、26589、64981、63875、64951、64978、64928、219927、116540、122704、4706、4717、4695、4718、4710 /// 727762、54539、51079、4715、4716、55967、126328及び5428で表される遺伝子からなる群より選択され、
細胞死関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して114769 /// 834、22900、836、842、838、837、834、839、841、84674、259230、81537及び166929で表される遺伝子からなる群より選択され、
ウイルス感染関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して3428及び64135で表される遺伝子からなる群より選択され、
抗酸化関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して2950、9446、2947、2946、2944、2949、2948、373156、79807及び2941で表される遺伝子からなる群より選択され、
免疫機能関連遺伝子群の遺伝子が、Entrez Gene IDで表して28755 /// 6955、28663 /// 28738 /// 28755 /// 6955、6955、28663 /// 28738 /// 28755 /// 6955 /// 6964、445347 /// 6967、6955 /// 6964、28595、3812 /// 727787、3808、3804、3806、3802、3811 /// 3813、57292、100132285 /// 3806 /// 3809、3811、3809及び115653で表される遺伝子からなる群より選択され、
鉄調節関連遺伝子が、Entrez Gene IDで表して3658で表される遺伝子である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
生体試料が、血液である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
判定工程が、前記被験者から取得された平均値を、健常者から採取された生体試料を用いて前記測定工程、算出工程及び取得工程と同様にして予め得られた平均値と、慢性疲労症候群の患者から採取された生体試料を用いて前記測定工程、算出工程及び取得工程と同様にして予め得られた平均値とに基づいて得られる判定式に入力することにより行われる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
判定式が、サポートベクターマシンを用いて作成される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コンピュータを、
被験者から採取された生体試料中の、エネルギー産生関連遺伝子群、ウイルス感染関連遺伝子群、細胞死関連遺伝子群、抗酸化関連遺伝子群、免疫機能関連遺伝子群、及び鉄調節関連遺伝子群から選択される少なくとも２つの遺伝子群にそれぞれ属する少なくとも１つの遺伝子の遺伝子転写産物の発現量を測定することにより得られる発現量を受け付ける受付手段、
前記測定された遺伝子転写産物の発現量から、健常者の集団における対応する遺伝子転写産物の発現量に基づいて、偏差を表す値を算出し、選択された遺伝子群に属する１つの遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記１つの遺伝子についての偏差を表す値を平均値として取得し、又は選択された遺伝子群に属する２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値が得られている場合は、前記２つ以上の遺伝子についての偏差を表す値の平均値を取得する平均値取得手段、
前記平均値を用いて、前記被験者が慢性疲労症候群であるか否かを判定する判定手段、
前記判定手段の判定結果を出力する出力手段
として機能させるための慢性疲労症候群の判定用プログラム。
【請求項９】
前記判定手段がサポートベクターマシンを含む請求項８に記載のプログラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２１７７０５（Ｐ２０１１−２１７７０５Ａ）
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９３２２５（Ｐ２０１０−９３２２５）
【出願日】平成２２年４月１４日（２０１０．４．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年１０月１５日 第１６回日本未病システム学会学術総会事務局発行の「第１６回 日本未病システム学会 学術総会 抄録集」および平成２１年１１月１日 日本未病システム学会主催の「第１６回 日本未病システム学会 学術総会」において発表
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１４日（２０１０．４．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年１０月１５日 第１６回日本未病システム学会学術総会事務局発行の「第１６回 日本未病システム学会 学術総会 抄録集」および平成２１年１１月１日 日本未病システム学会主催の「第１６回 日本未病システム学会 学術総会」において発表
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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