所望の表現型を有する細胞に進化させる方法及び進化した細胞
【課題】所望の特性又は機能性を有する細胞又は細胞の組成物の提供。
【解決手段】所望の機能性を有する細胞に進化させる方法であって、a)特定の組成物につき、該組成物を含む細胞に、該組成物生成に関連する発現可能なヌクレオチド配列が組み込まれている、b)少なくとも１つのスクリーニングの機能性を決定する、c)決定したスクリーニングの機能性に関連した１つのスクリーニング基準に関して細胞の当該組成物をスクリーニングする、d)決定したスクリーニングの機能性に関連したスクリーニング基準に合致する細胞を選択し、e)選択した細胞の発現カセットの発現可能な配列と、別の細胞の組成物に由来する発現可能な配列とを組み合わせ、細胞が、完全長の遺伝子を含んで成るヌクレオチド配列の変化となる、f)少なくとも１つの細胞が所望の機能性を獲得するまで、必要に応じて段階b)〜e)を任意に繰り返す、段階を含んで成る、方法。
【解決手段】所望の機能性を有する細胞に進化させる方法であって、a)特定の組成物につき、該組成物を含む細胞に、該組成物生成に関連する発現可能なヌクレオチド配列が組み込まれている、b)少なくとも１つのスクリーニングの機能性を決定する、c)決定したスクリーニングの機能性に関連した１つのスクリーニング基準に関して細胞の当該組成物をスクリーニングする、d)決定したスクリーニングの機能性に関連したスクリーニング基準に合致する細胞を選択し、e)選択した細胞の発現カセットの発現可能な配列と、別の細胞の組成物に由来する発現可能な配列とを組み合わせ、細胞が、完全長の遺伝子を含んで成るヌクレオチド配列の変化となる、f)少なくとも１つの細胞が所望の機能性を獲得するまで、必要に応じて段階b)〜e)を任意に繰り返す、段階を含んで成る、方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の機能性を有する細胞に進化させる方法であって、
a)細胞の組成物を入手し、ここで、前記組成物の少なくとも１つの各細胞が
a1)少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列、ここで、前記配列の少なくとも１つが細胞内の人工染色体に組み込まれている、及び／又は
a2)以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]
（ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表す）
の少なくとも２つの発現カセット、及び／又は
a3)少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列、ここで、前記配列は当該細胞にとって異種である、
を含んで成る、
b)少なくとも１つのスクリーニングの機能性を決定し、
c)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に関して細胞の当該組成物をスクリーニングし、
d)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に合致する細胞を選択し、
e)選択した細胞の発現カセットの発現可能な配列と、別の細胞の組成物に由来する発現可能な配列とを組み合わせ、但し、発現可能な配列の組み合わせは、細胞がa3)だけに記載のようなものである場合、完全長の遺伝子を含んで成るヌクレオチド配列の変化となる、
f)少なくとも１つの細胞が所望の機能性を獲得するまで、必要に応じて段階b)〜e)を任意に繰り返す、
段階を含んで成る、方法。
【請求項２】
段階c)が、既定のスクリーニング機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に合致する細胞を選択する前に、少なくとも２つの異なるスクリーニング基準に関してスクリーニングすること、を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階a)が、更に修飾された組成物を入手する前に、一段階の組み合わせを含んで成る、請求項１又は2に記載の方法。
【請求項４】
段階a)が、更に修飾された組成物を入手する前に、少なくとも二段階の組み合わせを含んで成る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
スクリーニング基準が、培地を基にした基準、例えば異常な培地の基質の使用、毒素を含んで成る培地上での細胞の増殖、阻害剤を含んで成る培地上での細胞の増殖、生存の基準で選択される細胞への到達、より優れた増殖、形態の逸脱、粘着性、スペクトル特性、酵素活性（の調節）、である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
スクリーニング基準が、少なくとも１つの物理的基準、例えば温度、モル浸透圧濃度、光、及び電気、生存の基準で選択される細胞への到達、より優れた増殖、形態の逸脱、粘着性、スペクトル特性、酵素活性（の調節）、である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が、少なくとも２つの異なる種から派生する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が、遺伝子又は完全長のcDNAから個々に選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
スクリーニング基準の強度が各繰り返しにつき増大する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
スクリーニング基準の型が各繰り返しにつき変化する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１又は複数のスクリーニング基準の強度が各繰り返しにつき増大し、そして/あるいは、１又は複数のスクリーニング基準の型が各繰り返しにつき変化する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１又は複数のスクリーニング基準が、基質の濃度が増大した培地中で増殖した場合の細胞の生存能力である、請求項1〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
１又は複数のスクリーニング基準が、前記組成物内の細胞の酵素作用又は前記組成物内のそれらの滲出物のスクリーニングである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
発現可能なヌクレオチド配列の組み合わせが、細胞内の染色体の組み合わせである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
発現可能なヌクレオチド配列内の組み合わせが、発現可能なヌクレオチド配列の組み合わせの間に実質的に起こらない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
発現可能なヌクレオチド配列が、少なくとも２つの異なる細胞から発現可能なヌクレオチド配列を除去し、個々の発現可能なヌクレオチド配列をin vitroで組み合わせ、そして少なくとも２つの組み合わされた発現可能なヌクレオチド配列を少なくとも２つの細胞内に導入すること、によって実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
所望の機能性が、非天然の二次代謝物を産生する細胞の能力である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
二次代謝物が新規である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
段階c)〜e)が少なくとも２回、例えば少なくとも３回、例えば少なくとも４回、例えば少なくとも５回、例えば少なくとも１０回繰り返される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記別の細胞の組成物が、少なくとも既定のタンパク質又は基質を発現することができる細胞を含んで成る、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記別の細胞の組成物がランダムに選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物がサブ組成物のコレクションである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
サブ組成物が、共通の少なくとも１つの表現型を有する個々の細胞のコレクションである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
サブ組成物が個々の細胞のコレクションであり、前記細胞が、同一の発現可能なヌクレオチド配列のために、同一のプロモーターを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
サブ組成物が個々の細胞のコレクションであり、各細胞が、コンカテマーの少なくとも１つのカセット内に、同一の発現可能なヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
組成物が少なくとも２０個の個々の細胞を含んで成る、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
組成物が、少なくとも５０個の個々の細胞を含んで成る、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
組成物が、少なくとも１００個の個々の細胞を含んで成る、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
段階d)の選択が、蛍光励起セルソーターによって実施される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
段階d)の選択が、フローサイトメトリーによって実施される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１０００個の細胞が、セルソーターによって１秒で選別される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
各サブ組成物が少なくとも１０個の個々の細胞を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
各サブ組成物が少なくとも５０個の個々の細胞を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
各サブ組成物が少なくとも１００個の個々の細胞、例えば少なくとも１０００個の個々の細胞、例えば少なくとも１０，０００個の個々の細胞、を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
組成物が１つの種由来の細胞のコレクションを含んで成る、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
組成物の少なくとも１つの細胞が、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも１つのコンカテマーを含んで成り、各コンカテマーが５’→３’方向に以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、rs1とrs2は共に機能的制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が異なる発現状態に由来する）のオリゴヌクレオチドを含んで成る、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２つの異なる発現状態が、少なくとも２つの異なる組織、例えば少なくとも２つの器官、例えば少なくとも２つの種、例えば少なくとも２つの属、を表す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
２つの異なる種が、少なくとも２つの異なる綱、例えば少なくとも２つの異なる門(division)、更に好ましくは少なくとも２つの異なる亜界、例えば少なくとも２つの異なる界に由来する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１つの種が真核生物であり、そして別の種が原核生物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
実質的に全てのrs1-rs2配列が同一の制限酵素によって認識され、更に好ましくは実質的に全てのrs1-rs2配列が実質的に同一である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
nが少なくとも１０、例えば少なくとも１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、例えば少なくとも３０、例えば少なくとも３０〜６０又は６０以上、例えば少なくとも７５、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも５００、例えば少なくとも７５０、例えば少なくとも１０００、例えば少なくとも１５００、例えば少なくとも２０００である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
異なる発現可能なヌクレオチド配列が同一の、又は異なる発現状態に由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
異なる発現状態が、少なくとも２つの異なる組織、例えば少なくとも２つの器官、例えば少なくとも２つの種、例えば少なくとも２つの属を表す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
異なる種が、少なくとも２つの門(phylum)、例えば少なくとも２つの異なる綱、例えば少なくとも２つの異なる門(division)、更に好ましくは少なくとも２つの異なる亜界、例えば少なくとも２つの異なる界に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
細菌、例えばエスケリッチャ・コリ(Escherichia coli)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・コエリコロー(Streptomyces coelicolor)、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、ミクソコックス・キサンサス(Myxococcus xanthus)を含んで成る群から選択される原核細胞を含んで成る、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
酵母；フィラメンタス・アスコマイセテス(Filamentous ascomycetes)、例えばニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)及びアスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)；植物細胞、例えばタバコ及びシロイヌナズナ由来のもの；哺乳類宿主細胞；ヒト、サル及び齧歯類由来のもの、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NIH/3T3, COS, 293, VERO, HeLa、を含んで成る群から選択される真核細胞を含んで成る、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
パン酵母, クルイベロマイセス・マリキシャヌス(Kluyveromyces marxianus), K.ラクチス(K. lactis), カンジダ・ウチリス(Candida utilis), ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma), サッカロマイセス・ボウラジイ(Saccharomyces boulardii), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha), ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・パラフィニカ(Candida paraffinica), シュワニオマイセス・カステリイ(Schwanniomyces castellii), ピキア・スチピチス(Pichia stipitis), カンジダ・シェハタエ(Candida shehatae), ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis), リポマイセス・リポフェル(Lipomyces lipofer), クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcos curvatus), カンジダ種(Candida spp)(例えば、C.パルミオレオフィリア(C. palmioleophila)), ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii), カンジダ属(Candida), ロドトルラ種(Rhodotorula spp), サッカロマイセス種(Saccharomycopsis spp)., アウレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans), カンジダ・ブルンプチイ(Candida brumptii), カンジダ・ハイドロカーボフマリカ(Candida hydrocarbofumarica), トルロプシス属(Torulopsis), カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis), サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae), ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra), カンジダ・フラベリ(Candida flaveri), エレモテシウム・アシュビイ(Eremothecium ashbyii), ピキア種(Pichia spp.), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), クルイベロマイセス属(Kluyveromyces), ハンセヌラ属(Hansenula), クロエケラ属(Kloeckera), ピキア属(Pichia), パチソレン種(Pachysolen spp.), 又はトルロプシス・ボンビコラ(Torulopsis bombicola)を含んで成る群から選択される酵母細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
細胞が、突然変異を補完する、挿入された選択的遺伝子マーカーを含んで成る、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つのコンカテマーのヌクレオチド配列、好ましくは、実質的に全てのコンカテマー由来のヌクレオチド配列が、任意な１つのコンカテマーの反復配列のレベルを最小化するために設計されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
発現可能なヌクレオチド配列が最小化されている、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５１】
各コンカテマーが５’→３’方向に以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、rs1とrs2は共に機能的制限部位を表し、
SPは少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも２つのカセットのrs1-rs2が同一の制限酵素によって認識される）のオリゴヌクレオチドを含んで成る、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも１つのコンカテマーを含んで成る細胞であって、当該細胞にとって異種の少なくとも１つの代謝物を産生することができる細胞。
【請求項５２】
制御可能なプロモーターの支配化にある少なくとも第一及び第二の発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る少なくとも１つの人工染色体を含んで成る進化した細胞であって、第一の発現可能なヌクレオチド配列のプロモーターが他の発現可能なヌクレオチド配列のプロモーターから独立して制御可能であり、当該細胞にとって異種の少なくとも１つの物質を産生することができる細胞。
【請求項５３】
個々のオリゴヌクレオチドの少なくとも１個のコンカテマーを含んで成る細胞であって、各コンカテマーが個々に、５’→３’方向に、以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも２つのカセットのrs1-rs2は同一の制限酵素によって認識される）のオリゴヌクレオチド配列を含んで成り、
天然細胞によって代謝されえない、少なくとも１つの化合物を代謝することができる細胞。
【請求項５４】
制御可能なプロモーターの支配化にある少なくとも第一及び第二の発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る少なくとも１つの人工染色体を含んで成る細胞であって、第一の発現可能なヌクレオチド配列のプロモーターが他の発現可能なヌクレオチド配列のプロモーターから独立して制御可能であり、天然細胞によって代謝されえない、少なくとも１つの化合物を代謝することができる細胞。
【請求項５５】
請求項３〜５０のいずれか１項に記載の特徴のいずれかを含んで成る、請求項５１、５２、５３、又は５４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５６】
請求項５１又は５２に記載の細胞によって産生される代謝物。
【請求項１】
所望の機能性を有する細胞に進化させる方法であって、
a)細胞の組成物を入手し、ここで、前記組成物の少なくとも１つの各細胞が
a1)少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列、ここで、前記配列の少なくとも１つが細胞内の人工染色体に組み込まれている、及び／又は
a2)以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]
（ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表す）
の少なくとも２つの発現カセット、及び／又は
a3)少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列、ここで、前記配列は当該細胞にとって異種である、
を含んで成る、
b)少なくとも１つのスクリーニングの機能性を決定し、
c)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に関して細胞の当該組成物をスクリーニングし、
d)決定したスクリーニングの機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に合致する細胞を選択し、
e)選択した細胞の発現カセットの発現可能な配列と、別の細胞の組成物に由来する発現可能な配列とを組み合わせ、但し、発現可能な配列の組み合わせは、細胞がa3)だけに記載のようなものである場合、完全長の遺伝子を含んで成るヌクレオチド配列の変化となる、
f)少なくとも１つの細胞が所望の機能性を獲得するまで、必要に応じて段階b)〜e)を任意に繰り返す、
段階を含んで成る、方法。
【請求項２】
段階c)が、既定のスクリーニング機能性に関連した少なくとも１つのスクリーニング基準に合致する細胞を選択する前に、少なくとも２つの異なるスクリーニング基準に関してスクリーニングすること、を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階a)が、更に修飾された組成物を入手する前に、一段階の組み合わせを含んで成る、請求項１又は2に記載の方法。
【請求項４】
段階a)が、更に修飾された組成物を入手する前に、少なくとも二段階の組み合わせを含んで成る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
スクリーニング基準が、培地を基にした基準、例えば異常な培地の基質の使用、毒素を含んで成る培地上での細胞の増殖、阻害剤を含んで成る培地上での細胞の増殖、生存の基準で選択される細胞への到達、より優れた増殖、形態の逸脱、粘着性、スペクトル特性、酵素活性（の調節）、である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
スクリーニング基準が、少なくとも１つの物理的基準、例えば温度、モル浸透圧濃度、光、及び電気、生存の基準で選択される細胞への到達、より優れた増殖、形態の逸脱、粘着性、スペクトル特性、酵素活性（の調節）、である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が、少なくとも２つの異なる種から派生する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が、遺伝子又は完全長のcDNAから個々に選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
スクリーニング基準の強度が各繰り返しにつき増大する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
スクリーニング基準の型が各繰り返しにつき変化する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１又は複数のスクリーニング基準の強度が各繰り返しにつき増大し、そして/あるいは、１又は複数のスクリーニング基準の型が各繰り返しにつき変化する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１又は複数のスクリーニング基準が、基質の濃度が増大した培地中で増殖した場合の細胞の生存能力である、請求項1〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
１又は複数のスクリーニング基準が、前記組成物内の細胞の酵素作用又は前記組成物内のそれらの滲出物のスクリーニングである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
発現可能なヌクレオチド配列の組み合わせが、細胞内の染色体の組み合わせである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
発現可能なヌクレオチド配列内の組み合わせが、発現可能なヌクレオチド配列の組み合わせの間に実質的に起こらない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
発現可能なヌクレオチド配列が、少なくとも２つの異なる細胞から発現可能なヌクレオチド配列を除去し、個々の発現可能なヌクレオチド配列をin vitroで組み合わせ、そして少なくとも２つの組み合わされた発現可能なヌクレオチド配列を少なくとも２つの細胞内に導入すること、によって実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
所望の機能性が、非天然の二次代謝物を産生する細胞の能力である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
二次代謝物が新規である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
段階c)〜e)が少なくとも２回、例えば少なくとも３回、例えば少なくとも４回、例えば少なくとも５回、例えば少なくとも１０回繰り返される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記別の細胞の組成物が、少なくとも既定のタンパク質又は基質を発現することができる細胞を含んで成る、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記別の細胞の組成物がランダムに選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物がサブ組成物のコレクションである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
サブ組成物が、共通の少なくとも１つの表現型を有する個々の細胞のコレクションである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
サブ組成物が個々の細胞のコレクションであり、前記細胞が、同一の発現可能なヌクレオチド配列のために、同一のプロモーターを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
サブ組成物が個々の細胞のコレクションであり、各細胞が、コンカテマーの少なくとも１つのカセット内に、同一の発現可能なヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
組成物が少なくとも２０個の個々の細胞を含んで成る、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
組成物が、少なくとも５０個の個々の細胞を含んで成る、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
組成物が、少なくとも１００個の個々の細胞を含んで成る、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
段階d)の選択が、蛍光励起セルソーターによって実施される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
段階d)の選択が、フローサイトメトリーによって実施される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１０００個の細胞が、セルソーターによって１秒で選別される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
各サブ組成物が少なくとも１０個の個々の細胞を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
各サブ組成物が少なくとも５０個の個々の細胞を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
各サブ組成物が少なくとも１００個の個々の細胞、例えば少なくとも１０００個の個々の細胞、例えば少なくとも１０，０００個の個々の細胞、を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
組成物が１つの種由来の細胞のコレクションを含んで成る、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
組成物の少なくとも１つの細胞が、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも１つのコンカテマーを含んで成り、各コンカテマーが５’→３’方向に以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、rs1とrs2は共に機能的制限部位を表し、
SPは個々に少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも２つの発現可能なヌクレオチド配列が異なる発現状態に由来する）のオリゴヌクレオチドを含んで成る、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２つの異なる発現状態が、少なくとも２つの異なる組織、例えば少なくとも２つの器官、例えば少なくとも２つの種、例えば少なくとも２つの属、を表す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
２つの異なる種が、少なくとも２つの異なる綱、例えば少なくとも２つの異なる門(division)、更に好ましくは少なくとも２つの異なる亜界、例えば少なくとも２つの異なる界に由来する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１つの種が真核生物であり、そして別の種が原核生物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
実質的に全てのrs1-rs2配列が同一の制限酵素によって認識され、更に好ましくは実質的に全てのrs1-rs2配列が実質的に同一である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
nが少なくとも１０、例えば少なくとも１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、例えば少なくとも３０、例えば少なくとも３０〜６０又は６０以上、例えば少なくとも７５、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも５００、例えば少なくとも７５０、例えば少なくとも１０００、例えば少なくとも１５００、例えば少なくとも２０００である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
異なる発現可能なヌクレオチド配列が同一の、又は異なる発現状態に由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
異なる発現状態が、少なくとも２つの異なる組織、例えば少なくとも２つの器官、例えば少なくとも２つの種、例えば少なくとも２つの属を表す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
異なる種が、少なくとも２つの門(phylum)、例えば少なくとも２つの異なる綱、例えば少なくとも２つの異なる門(division)、更に好ましくは少なくとも２つの異なる亜界、例えば少なくとも２つの異なる界に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
細菌、例えばエスケリッチャ・コリ(Escherichia coli)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・コエリコロー(Streptomyces coelicolor)、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、ミクソコックス・キサンサス(Myxococcus xanthus)を含んで成る群から選択される原核細胞を含んで成る、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
酵母；フィラメンタス・アスコマイセテス(Filamentous ascomycetes)、例えばニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)及びアスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)；植物細胞、例えばタバコ及びシロイヌナズナ由来のもの；哺乳類宿主細胞；ヒト、サル及び齧歯類由来のもの、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NIH/3T3, COS, 293, VERO, HeLa、を含んで成る群から選択される真核細胞を含んで成る、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
パン酵母, クルイベロマイセス・マリキシャヌス(Kluyveromyces marxianus), K.ラクチス(K. lactis), カンジダ・ウチリス(Candida utilis), ファフィア・ロドザイマ(Phaffia rhodozyma), サッカロマイセス・ボウラジイ(Saccharomyces boulardii), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha), ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・パラフィニカ(Candida paraffinica), シュワニオマイセス・カステリイ(Schwanniomyces castellii), ピキア・スチピチス(Pichia stipitis), カンジダ・シェハタエ(Candida shehatae), ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis), リポマイセス・リポフェル(Lipomyces lipofer), クリプトコッカス・クルバツス(Cryptococcos curvatus), カンジダ種(Candida spp)(例えば、C.パルミオレオフィリア(C. palmioleophila)), ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica), カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii), カンジダ属(Candida), ロドトルラ種(Rhodotorula spp), サッカロマイセス種(Saccharomycopsis spp)., アウレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans), カンジダ・ブルンプチイ(Candida brumptii), カンジダ・ハイドロカーボフマリカ(Candida hydrocarbofumarica), トルロプシス属(Torulopsis), カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis), サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae), ロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra), カンジダ・フラベリ(Candida flaveri), エレモテシウム・アシュビイ(Eremothecium ashbyii), ピキア種(Pichia spp.), ピキア・パストリス(Pichia pastoris), クルイベロマイセス属(Kluyveromyces), ハンセヌラ属(Hansenula), クロエケラ属(Kloeckera), ピキア属(Pichia), パチソレン種(Pachysolen spp.), 又はトルロプシス・ボンビコラ(Torulopsis bombicola)を含んで成る群から選択される酵母細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
細胞が、突然変異を補完する、挿入された選択的遺伝子マーカーを含んで成る、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つのコンカテマーのヌクレオチド配列、好ましくは、実質的に全てのコンカテマー由来のヌクレオチド配列が、任意な１つのコンカテマーの反復配列のレベルを最小化するために設計されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
発現可能なヌクレオチド配列が最小化されている、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５１】
各コンカテマーが５’→３’方向に以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、rs1とrs2は共に機能的制限部位を表し、
SPは少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも２つのカセットのrs1-rs2が同一の制限酵素によって認識される）のオリゴヌクレオチドを含んで成る、個々のオリゴヌクレオチドカセットの少なくとも１つのコンカテマーを含んで成る細胞であって、当該細胞にとって異種の少なくとも１つの代謝物を産生することができる細胞。
【請求項５２】
制御可能なプロモーターの支配化にある少なくとも第一及び第二の発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る少なくとも１つの人工染色体を含んで成る進化した細胞であって、第一の発現可能なヌクレオチド配列のプロモーターが他の発現可能なヌクレオチド配列のプロモーターから独立して制御可能であり、当該細胞にとって異種の少なくとも１つの物質を産生することができる細胞。
【請求項５３】
個々のオリゴヌクレオチドの少なくとも１個のコンカテマーを含んで成る細胞であって、各コンカテマーが個々に、５’→３’方向に、以下の式：
[rs2-SP-PR-X-TR-SP-rs1]n
（ここで、
rs1とrs2は共に制限部位を表し、
SPは少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
PRは、細胞内で機能しうるプロモーターを表し、
Xは発現可能なヌクレオチド配列を表し、
TRはターミネーターを表し、そして
n≧2であり、そして
少なくとも２つのカセットのrs1-rs2は同一の制限酵素によって認識される）のオリゴヌクレオチド配列を含んで成り、
天然細胞によって代謝されえない、少なくとも１つの化合物を代謝することができる細胞。
【請求項５４】
制御可能なプロモーターの支配化にある少なくとも第一及び第二の発現可能なヌクレオチド配列を含んで成る少なくとも１つの人工染色体を含んで成る細胞であって、第一の発現可能なヌクレオチド配列のプロモーターが他の発現可能なヌクレオチド配列のプロモーターから独立して制御可能であり、天然細胞によって代謝されえない、少なくとも１つの化合物を代謝することができる細胞。
【請求項５５】
請求項３〜５０のいずれか１項に記載の特徴のいずれかを含んで成る、請求項５１、５２、５３、又は５４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５６】
請求項５１又は５２に記載の細胞によって産生される代謝物。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１０−１８７６９２（Ｐ２０１０−１８７６９２Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９９１８４（Ｐ２０１０−９９１８４）
【出願日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【分割の表示】特願２００２−５５９５７７（Ｐ２００２−５５９５７７）の分割
【原出願日】平成１４年１月２５日（２００２．１．２５）
【出願人】（５０４３１６２６３）エボルバ アクチェンゲゼルシャフト (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【分割の表示】特願２００２−５５９５７７（Ｐ２００２−５５９５７７）の分割
【原出願日】平成１４年１月２５日（２００２．１．２５）
【出願人】（５０４３１６２６３）エボルバ アクチェンゲゼルシャフト (3)
【Ｆターム（参考）】
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