抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカー及び薬疹発症の診断方法
【課題】抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカー及びそれを用いた診断方法を提供する。
【解決手段】抗てんかん薬による薬疹を発症した症例と抗てんかん薬を投与しても何ら薬疹を発症しない陰性対照とのＨＬＡクラスＩアレル頻度を比較検討し、抗てんかん薬による薬疹発症と有意な相関のあるＨＬＡアレルとしてＨＬＡ−Ｂ＊５５０２及びＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を見出した。これらＨＬＡアレル及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む診断マーカーを検出することにより、抗てんかん薬による薬疹発症の可能性を早期に診断することができる。
【解決手段】抗てんかん薬による薬疹を発症した症例と抗てんかん薬を投与しても何ら薬疹を発症しない陰性対照とのＨＬＡクラスＩアレル頻度を比較検討し、抗てんかん薬による薬疹発症と有意な相関のあるＨＬＡアレルとしてＨＬＡ−Ｂ＊５５０２及びＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を見出した。これらＨＬＡアレル及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む診断マーカーを検出することにより、抗てんかん薬による薬疹発症の可能性を早期に診断することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗てんかん薬による薬疹発症を予測、診断するための診断マーカー及びこの診断マーカーを用いた薬疹発症の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは、種種の病因によってもたらされる慢性の脳疾患であり、大脳ニューロンの過剰な放電に由来する反復性の発作（てんかん発作）を主徴とし、それに変異に富んだ臨床ならびに検査所見の表出が伴う。
【０００３】
抗てんかん薬によるてんかん治療は、主に対症療法であるため、通常、抗てんかん薬は長期にわたって服用される。そのため、医療者及び患者等ともにその副作用について関心が高く、患者個人に合った、より安全で副作用の少ないオーダーメード医療の実現が望まれている。
【０００４】
薬物の副作用は、直接的薬理作用に基づくもの、既知の薬理作用では説明できない特異体質によるもの、長期間使用効果によるもの、及び遅発性効果によるものに分類される。
【０００５】
抗てんかん薬における特異体質による副作用の一つである薬疹には、口唇、表皮剥離などの表皮の壊死性障害に加え発熱を伴うスティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）などの重症薬疹がある。
【０００６】
重症薬疹は、その発症率は低いが、８０％以上の医薬品で発症することが指摘されている。ＳＪＳ及びＴＥＮについては、年間３００例以上の副作用に関する報告がある。ＳＪＳ及びＴＥＮでは、重篤な場合には死に至り、また治療後に眼及び肺に重い後遺症が残ることがあり、その後のＱＯＬが著しく低下する。
【０００７】
そのために、重症薬疹を発症しやすい体質を検出する方法を確立して、当該医薬品の投与を回避することにより発症を未然に防ぐことができれば、医薬品の安全な使用に繋がり、臨床上有益である。
【０００８】
代表的な抗てんかん薬であるカルバマゼピン（ＣＢＺ）によるＳＪＳの発症において、ＨＬＡクラスＩの遺伝子多型の一つであるＨＬＡ−Ｂ＊５９０１が、日本人に特異的な診断マーカーの候補として報告されている（非特許文献１）。
【０００９】
しかしながら、このＨＬＡアレルのみでは、ＣＢＺによるＳＪＳの発症を予測、診断するには充分でなく、ＣＢＺを含む抗てんかん薬による薬疹発症をより確実に予測、診断することが望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hiroko Ikeda, et. al., "HLA-class I markers in Japanese patients with carbamazepine-induced cutaneous adverse reactions", Epilepsia, Digital Object Identifier 10.1111/j.1528-1167.2009.02269.x
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、抗てんかん薬による薬疹の発症可能性を早期に予測、診断可能とする、薬疹発症の診断マーカー及びこの診断マーカーを用いた薬疹発症の診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカーは、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を含む、ことを特徴とする。
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明の第２の観点に係る、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカーは、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち何れか二つを含む、ことを特徴とする。
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明の第３の観点に係る、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカーは、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む、ことを特徴とする。
【００１５】
前記薬疹は、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）又は中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）であってもよい。
【００１６】
前記抗てんかん薬は、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド、クロナゼパム、ジアゼパム、フェノバルビタール、クロバザム、プリミドン、スルチアム、アセタゾラミド、ニトラゼパム、エトスクシミド、ガバペンチン、トピラマート及びラモトリギンであってもよい。
【００１７】
上記目的を達成するため、本発明の第４の観点に係る薬疹発症の診断方法は、抗てんかん薬による薬疹発症を予測する診断方法であって、患者から試料を採取する工程と、該採取された試料中の、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち少なくとも何れか一つを検出する工程と、前記検出する工程により求められた結果に基づいて、抗てんかん薬による薬疹の発症リスクを判定する工程と、を有する、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、抗てんかん薬による薬疹発症を予測、診断可能な診断マーカー及びこの診断マーカーを検出することを手段とする薬疹発症の診断方法が提供される。これにより、抗てんかん薬による薬疹の発症可能性（リスク）を早期に予測、診断し、抗てんかん薬の投与による薬疹発症を未然に防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＨＬＡ遺伝子領域の構造を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、抗てんかん薬による薬疹発症と統計学上有意に相関のあるＨＬＡクラスＩアレルを同定し、これらＨＬＡクラスＩアレルを含む薬疹発症の診断マーカーを提供する。本発明はさらに、これらのＨＬＡクラスＩアレルと、抗てんかん薬による薬疹発症と関連のあることが日本人においてすでに報告されているＨＬＡクラスＩアレルと、を二つ以上組み合わせることにより、薬疹発症の予測精度が向上した診断マーカーを提供する。
【００２１】
（抗てんかん薬による薬疹発症と相関のあるＨＬＡクラスＩアレルの同定）
まず、抗てんかん薬による薬疹発症と有意に相関を有するＨＬＡクラスＩアレルを同定する。具体的には、抗てんかん薬の投与により薬疹を発症した患者を対象に、ＨＬＡクラスＩを遺伝子タイピングにより検索し、抗てんかん薬による薬疹の発病がない陰性対照患者のＨＬＡクラスＩアレルと比較検討を行う。
【００２２】
抗てんかん薬には、カルバマゼピン（ＣＢＺ）、フェニトイン（ＰＨＴ）、バルプロ酸ナトリウム（ＶＰＡ）、ゾニサミド（ＺＮＳ）、クロナゼパム、ジアゼパム、フェノバルビタール（ＰＢ）、クロバザム（ＣＬＢ）、プリミドン、スルチアム、アセタゾラミド、ニトラゼパム、エトスクシミド、ガバペンチン、トピラマート及びラモトリギン（ＬＴＧ）などが含まれる。これら抗てんかん薬の投与量、方法などは、患者の年齢、体重、性別などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
【００２３】
上記の抗てんかん薬は、それぞれ作用機序が異なる。例えば、ナトリウムチャネルを抑制する抗てんかん薬としては、ＣＢＺ及びＰＨＴが知られている。Ｔ型カルシウムチャネルを抑制する抗てんかん薬としては、ＶＰＡ及びエトスクシミドが知られている。またＧＡＢＡの抑制作用を増強させる抗てんかん薬としては、ジアゼパム及びＰＢが知られている。これら抗てんかん薬は、てんかん患者の発作型によって適宜選択されて、投与される。
【００２４】
薬疹は、軽症薬疹から重症薬疹まで、様々なものを含む。重症薬疹には、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）及び中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）が含まれる。ＳＪＳは、口唇、表皮剥離などの表皮の壊死性障害に加え、高熱や悪心を伴う。ＴＥＮもまた、口唇、表皮剥離などの表皮の壊死性障害に加え、高熱や悪心を伴うが、その表皮変化がＳＪＳよりも広範に及ぶ。一方、軽症薬疹では、皮膚の紅斑が認められる程度である。
【００２５】
ＨＬＡは、ヒトＭＨＣ（主要組織適合性複合体又は主要組織適合抗原）であり、第６染色体短腕部の６ｐ２１．３に位置するＭＨＣ領域によりコードされた遺伝子群に支配される遺伝子産物である。図１に示すように、このＭＨＣ領域は、クラスＩ〜ＩＩＩ遺伝子領域により構成される。このうちＨＬＡクラスＩは、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ座によってコードされ、遺伝的多型性に富んでいる。その複数のアレル及び／又はハプロタイプの殆どが公知である（R. Holdsworth et. al., Tissue Antigens(2009)73, 95-170、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースhttp://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）。
【００２６】
ここで、「遺伝的多型（遺伝子多型）」とは、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１又は複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が、該１又は複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、又は１％以上の頻度でその集団内に存在する場合に、その変異をいう。
【００２７】
「アレル」は対立遺伝子それぞれを指す。「アレル頻度」とは、一つの集団において複数の対立遺伝子が存在する場合に、ある対立遺伝子が含まれる割合をいう。また、「ハプロタイプ」とは、同一染色体上において統計学上関連している、つまり遺伝的に連鎖している遺伝子多型の組み合わせをいう。
【００２８】
ＨＬＡクラスＩの遺伝子タイピングに用いる試料は、患者由来の試料であり、ＨＬＡクラスＩの遺伝子多型を同定できるものであれば特に限定されない。例えば、患者より採血された末梢血などの血液、髄液、唾液等の体液、又は口腔粘膜などの組織などを挙げることができる。下記ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、ダイレクトシークエンス法等に供するため、フェノール法或いは市販の核酸抽出用のキット（ＱＩＡＧＥＮ社、タカラバイオ社など）により、この患者由来の試料から核酸を抽出することができる。好ましい核酸は、ゲノムＤＮＡである。さらに抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法などにより目的の領域を増幅したＤＮＡ断片を用いてもよい。この場合、信頼性の高いＤＮＡポリメラーゼを使用することが望ましい。
【００２９】
ＨＬＡクラスＩの遺伝子タイピングの方法としては、通常公知の方法、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence Specific Primers）法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法、及びダイレクトシーケンス法を用いることができる。
【００３０】
ＰＣＲ−ＳＳＰ法では、あるＨＬＡクラスＩアレルに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより、該ＨＬＡ−クラスＩアレルの増幅の有無を確認することで多型を判定することができる。この場合、例えば、ＰＣＲ増幅産物をゲル電気泳動することにより増幅ＤＮＡ断片の有無を確認することができる。
【００３１】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、特定のＨＬＡクラスＩアレルの遺伝子多型部位が制限酵素認識サイトに含まれる場合に有効である。多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅後、所定の制限酵素で切断し、ゲル電気泳動により切断されたＤＮＡ断片の大きさを解析し、その長さの違いにより、該遺伝子多型の判定が可能である。
【００３２】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、遺伝子多型の有無により、熱変性させた１本鎖ＤＮＡの高次構造が変化し、その電気泳動による移動度の違いを解析することにより、目的の遺伝子多型の有無を検出することができる。
【００３３】
また、ダイレクトシークエンス法は、試料中に含まれるＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した後、目的の領域の塩基配列を直接決定する方法である。一般的にはジデオキシ法を用いて塩基配列を決定する。塩基配列決定に用いるシークエンサーには、市販のＡＢＩシリーズ（アマシャムバイオサイエンス）等を用いることができる。
【００３４】
その他の遺伝子タイピングとしては、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、ＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）−ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of Flight/Mass Spectrometry）法、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法などをあげることができる。本実施形態においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
上記方法により同定された、抗てんかん薬により薬疹を発症した患者のＨＬＡクラスＩアレルと、陰性対照患者のＨＬＡクラスＩアレルとの比較検討は、χ２乗検定により行う。あるＨＬＡクラスＩアレルにおけるχ２乗検定の結果、ｐ値が０．１未満、好ましくはｐ値が０．０５未満の場合、そのＨＬＡクラスＩアレルは、抗てんかん薬による薬疹発症と統計学上有意な相関があると判断する。
【００３６】
また、抗てんかん薬による薬疹発症患者のＨＬＡクラスＩアレル頻度について、日本人のアレル頻度と比較し、人口に対する相対危険度（ＲＲ）として評価することもできる。具体的には、人口に対する相対危険度は、ＲＲ＝（ａ＊ｄ）／（ｂ＊ｃ）で表される。この式において、ａは抗てんかん薬による薬疹発症患者のうち対象となるＨＬＡアレルを有する群、ｂは抗てんかん薬による薬疹発症患者のうち対象となるＨＬＡアレルを有さない群、ｃは日本人において対象となるＨＬＡアレルを有する群、及びｄは日本人において対象となるＨＬＡアレルを有さない群である。また、これら検定以外にも、抗てんかん薬による薬疹発症と遺伝子多型の関連を検定することが可能であれば、他の周知の統計学的処理によって行なうことができる。
【００３７】
本実施形態において具体的には、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２及びＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２が、抗てんかん薬の投与による薬疹発症と統計学上有意に相関のあるＨＬＡアレルとして同定された。また、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及び既知の薬疹発症診断マーカー候補であるＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を二つ以上組み合わせて用いることにより、抗てんかん薬による薬疹の発症を精度よく予測可能であることが明らかとなった。これらＨＬＡクラスＩアレルの塩基配列及び各コードするアミノ酸配列は公知である（ＮＣＢＩ（http://www.Ncbi.nlm.nih.gov））。
【００３８】
ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５９０１由来のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。このＨＬＡアレルの日本人の保有率は１．７％である。ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２由来のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。このＨＬＡアレルの日本人の保有率は２．８％である。また、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２由来のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。このＨＬＡアレルの日本人の保有率は１６．６％である。
【００３９】
（抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカー）
本発明に係る抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーは、特定のＨＬＡクラスＩアレルを検出することによって、抗てんかん薬による薬疹発症を予測、診断する指標として使用されるマーカーである。具体的には、本発明に係る薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を含む。好ましくは、本発明に係る薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち何れか二つを含む。さらに好ましくは、本発明に係る薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む。
【００４０】
ここで、「複数のＨＬＡクラスＩアレルを含む診断マーカー」とは、該複数のＨＬＡクラスＩアレルのうち少なくとも何れか一つのアレルを保有することを指標として抗てんかん薬による薬疹の発症を予測、診断する診断マーカーのことをいう。複数のＨＬＡクラスＩアレルを含む診断マーカーは、単一のＨＬＡクラスＩアレルを含む診断マーカーよりも、抗てんかん薬による薬疹発症の予測、診断の精度が向上する点で有利である。
【００４１】
本発明に係る薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｂ＊５９０１と、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２と、を同一染色体上に有する、ＨＬＡクラスＩのハプロタイプであってもよい。本実施形態において、好ましいＨＬＡクラスＩハプロタイプは、Ａ＊２４０２−Ｃｗ＊０１０２−Ｂ＊５９０１ハプロタイプである。なお、このハプロタイプは、日本人において高い頻度（１．５％）で認められる。
【００４２】
これらＨＬＡクラスＩアレルを含む薬疹発症の診断マーカーは、目的のＨＬＡクラスＩアレルを検出できるものであればよく、該アレルに由来するゲノム配列（塩基配列）又は発現される核酸（例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）配列（塩基配列）を有するポリヌクレオチド及びコードされるポリペプチドを含む。
【００４３】
上記ポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）にコードされるアミノ酸配列（配列番号１〜３）又はそのアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４４】
また、上記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）に由来する塩基配列、その相補配列又はその断片と少なくとも７０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００４５】
これら配列は、全配列であってもよいし、各ＨＬＡクラスＩの遺伝子多型（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）を特徴付ける多型部位を含む部分配列であってもよい。
【００４６】
また、上記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）に由来する塩基配列、又はその相補配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。配列は、各ＨＬＡクラスＩの遺伝子多型を特徴付ける多型部位を含めば、部分配列であってよい。
【００４７】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として、具体的には、５ × Ｓ Ｓ Ｃ 、０ ． ５ ％ Ｓ Ｄ Ｓ 及び５０ ％ ホルムアミドの溶液中で４ ２ ℃ にて加温した後、０ ． １ × Ｓ Ｓ Ｃ 、０ ． ５ ％ Ｓ Ｄ Ｓ の溶液中で６ ８ ℃ にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察される条件を例示できる。
【００４８】
（抗てんかん薬による薬疹発症の診断方法）
本発明に係る抗てんかん薬による薬疹発症の診断方法は、患者から試料を採取する工程と、採取された試料中の、本発明において同定された抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーを検出する工程と、この検出結果に基づいて、抗てんかん薬による薬疹の発症リスクを判定する工程と、を有する。具体的には、患者由来の試料から、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１の少なくとも何れか一つが検出された場合に、該患者は、抗てんかん薬の投与により薬疹を発症する可能性（リスク）が高いと判定する。これにより、抗てんかん薬による薬疹の発症可能性を早期に診断し、抗てんかん薬の投与による薬疹発症を未然に防ぐことができる。
【００４９】
本発明において同定された抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を含む。好ましい薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち何れか二つを含む。より好ましい薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む。
【００５０】
患者からの試料の採取及びこれら薬疹発症の診断マーカーの検出は、上記のＨＬＡアレルの同定に記載の方法と同様に行うことができる。なお、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及び／又はＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を検出できる方法であれば、これに限定されない。
【００５１】
（その他）
本実施形態において、上記ＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）は、前述の作用機序の異なる抗てんかん薬の投与により薬疹が発症した症例で検出される。従って、これらのＨＬＡアレルを含む薬疹発症の診断マーカーは、特定の抗てんかん薬に限定されず、上記作用機序の異なる複数の抗てんかん薬による薬疹発症を予測するのに有用であり得る。
【００５２】
また、ＳＪＳなどの重症薬疹の既往を有する患者だけでなく、軽症薬疹の既往を有する患者も、本発明に係る薬疹発症診断マーカーを有することが見出される。具体的には、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１は、ＰＨＴによる軽症薬疹症例において検出される。また、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２は、ＣＢＺ、ＰＨＴ、ＺＮＳ及びＶＰＡによる軽症薬疹症例において検出される。また、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２は、ＣＢＺ、ＰＢ、ＰＨＴ、ＺＮＳ及びＶＰＡによる軽症薬疹症例において検出される。従って、本発明に係る抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーは、重症薬疹のみならず、軽症薬疹の発症を予測、診断するのに有用であり得る。
【実施例】
【００５３】
てんかん治療のために抗てんかん薬を内服した日本人患者のうち、ＳＪＳを発症した１４例を対象に、ＨＬＡクラスＩを遺伝子タイピングにより検索した。具体的には、ＨＬＡクラスＩアレルの高解像度の遺伝子タイピングは、ＳｅＣｏｒｅシークエンシングキット（Invitrogen Corp., Brown Deer, WI, USA）及びＡＢＩ３７３０ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）により行った。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃｗ用の上記キットを用いて、添付のプロトコールに従い、各遺伝子のエクソン２〜４を増幅し、遺伝子多型を同定するためにシークエンス解析を行った。得られたシークエンス解析データから、Ａｓｓｉｇｎ ＳＢＴソフトウエア（version3.2.7b）（Conexio Genomics, Western Australia, Australia）を用いて、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃｗアレルを検出、同定した。また、抗てんかん薬を内服してもＳＪＳを発症しなかった日本人陰性対照７０例についても同様にＨＬＡクラスＩアレルを検索し、両者のアレル出現率（頻度）を比較した。
【００５４】
ＳＪＳを発症した１４例中、７例が男性、７例が女性であったことから、性差はないと判断される。また、１４例の年齢範囲は３歳〜５０歳であった。
【００５５】
投与された抗てんかん薬は、カルバマゼピン（ＣＢＺ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、フェニトイン（ＰＨＴ）、ゾニサミド（ＺＮＳ）、クロバザム（ＣＬＢ）、バルプロ酸ナトリウム（ＶＰＡ）、ラモトリギン（ＬＴＧ）であった。
【００５６】
（ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）
表１に示すように、抗てんかん薬による薬疹発症と相関を有することがすでに報告されているＨＬＡクラスＩアレルであるＨＬＡ−Ｂ＊５９０１は、ＣＢＺ及びＰＢ投与によりＳＪＳを発症した３症例より検出され、陰性対照との比較でそのアレル頻度に有意差が認められた（χ２乗検定により、p=0.01604）。また、人口との比較では、相対危険度がＲＲ＝７．９１と高い値であった。これらの結果から、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１は、抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーとして有用であることが確認された。
【表１】
【００５７】
（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２）
表２に示すように、ＣＢＺ、ＰＢ及びＣＬＢによりＳＪＳを発症した３症例においてＨＬＡ−Ｂ＊５５０２が検出され、陰性対照との比較でアレル頻度に有意差が認められた（χ２乗検定により、p=0.03545)。また、人口との比較では、相対危険度がＲＲ＝３．５８であった。これらの結果から、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２は、抗てんかん薬による薬疹発症を予測、診断するための診断マーカーとして有用であることが明らかとなった。
【表２】
【００５８】
（ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２）
表３に示すように、ＣＢＺ、ＰＢ、ＰＨＴ、ＣＬＢ及びＬＴＧによりＳＪＳを発症した８症例において、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２が検出され、陰性対照との比較でアレル頻度に有意差が認められた（χ２乗検定により、p=0.03840)。また、人口との比較では、相対危険度がＲＲ＝２．１６であった。これらの結果から、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２は、抗てんかん薬による薬疹発症を予測するための診断マーカーとして有用であることが明らかとなった。
【表３】
【００５９】
（ＨＬＡクラスＩアレルの組み合わせ）
また、表４に示すように、これらのＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１、Ｂ＊５５０２及びＣｗ＊０１０２）の何れか一つでも検出されたＳＪＳ症例数は、１４例中９例であり、ＨＬＡクラスＩアレルそれぞれ単独の場合に検出された症例数よりも増加した。また、これらのＨＬＡクラスＩアレルのうち何れか二つを組み合わせた場合においても、それぞれ単独で検出された症例数よりも増加する傾向が認められた。以上の結果から、抗てんかん薬による薬疹発症と統計学上有意な相関を有するＨＬＡクラスＩアレルであるＨＬＡ−Ｂ＊５９０１、Ｂ＊５５０２及びＣｗ＊０１０２を二つ以上含む診断マーカーを用いることにより、抗てんかん薬による薬疹発症の予測精度が向上することが明らかとなった。
【表４】
【００６０】
（ＨＬＡクラスＩハプロタイプ）
ＨＬＡクラスＩハプロタイプの一つであるＡ＊２４０２−Ｃｗ＊０１０２−Ｂ＊５９０１ハプロタイプと、抗てんかん薬による薬疹発症とが、陰性対照と比較して統計学上有意な相関を有することが分かった（p=0.016、人口に対する相対危険度ＲＲ＝７．７）。以上の結果から、抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１又はＢ＊５５０２と、Ｃｗ＊０１０２と、を同一染色体上に有するＨＬＡクラスＩハプロタイプを含み得ることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗てんかん薬による薬疹発症を予測、診断するための診断マーカー及びこの診断マーカーを用いた薬疹発症の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは、種種の病因によってもたらされる慢性の脳疾患であり、大脳ニューロンの過剰な放電に由来する反復性の発作（てんかん発作）を主徴とし、それに変異に富んだ臨床ならびに検査所見の表出が伴う。
【０００３】
抗てんかん薬によるてんかん治療は、主に対症療法であるため、通常、抗てんかん薬は長期にわたって服用される。そのため、医療者及び患者等ともにその副作用について関心が高く、患者個人に合った、より安全で副作用の少ないオーダーメード医療の実現が望まれている。
【０００４】
薬物の副作用は、直接的薬理作用に基づくもの、既知の薬理作用では説明できない特異体質によるもの、長期間使用効果によるもの、及び遅発性効果によるものに分類される。
【０００５】
抗てんかん薬における特異体質による副作用の一つである薬疹には、口唇、表皮剥離などの表皮の壊死性障害に加え発熱を伴うスティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）などの重症薬疹がある。
【０００６】
重症薬疹は、その発症率は低いが、８０％以上の医薬品で発症することが指摘されている。ＳＪＳ及びＴＥＮについては、年間３００例以上の副作用に関する報告がある。ＳＪＳ及びＴＥＮでは、重篤な場合には死に至り、また治療後に眼及び肺に重い後遺症が残ることがあり、その後のＱＯＬが著しく低下する。
【０００７】
そのために、重症薬疹を発症しやすい体質を検出する方法を確立して、当該医薬品の投与を回避することにより発症を未然に防ぐことができれば、医薬品の安全な使用に繋がり、臨床上有益である。
【０００８】
代表的な抗てんかん薬であるカルバマゼピン（ＣＢＺ）によるＳＪＳの発症において、ＨＬＡクラスＩの遺伝子多型の一つであるＨＬＡ−Ｂ＊５９０１が、日本人に特異的な診断マーカーの候補として報告されている（非特許文献１）。
【０００９】
しかしながら、このＨＬＡアレルのみでは、ＣＢＺによるＳＪＳの発症を予測、診断するには充分でなく、ＣＢＺを含む抗てんかん薬による薬疹発症をより確実に予測、診断することが望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hiroko Ikeda, et. al., "HLA-class I markers in Japanese patients with carbamazepine-induced cutaneous adverse reactions", Epilepsia, Digital Object Identifier 10.1111/j.1528-1167.2009.02269.x
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、抗てんかん薬による薬疹の発症可能性を早期に予測、診断可能とする、薬疹発症の診断マーカー及びこの診断マーカーを用いた薬疹発症の診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカーは、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を含む、ことを特徴とする。
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明の第２の観点に係る、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカーは、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち何れか二つを含む、ことを特徴とする。
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明の第３の観点に係る、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカーは、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む、ことを特徴とする。
【００１５】
前記薬疹は、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）又は中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）であってもよい。
【００１６】
前記抗てんかん薬は、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド、クロナゼパム、ジアゼパム、フェノバルビタール、クロバザム、プリミドン、スルチアム、アセタゾラミド、ニトラゼパム、エトスクシミド、ガバペンチン、トピラマート及びラモトリギンであってもよい。
【００１７】
上記目的を達成するため、本発明の第４の観点に係る薬疹発症の診断方法は、抗てんかん薬による薬疹発症を予測する診断方法であって、患者から試料を採取する工程と、該採取された試料中の、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち少なくとも何れか一つを検出する工程と、前記検出する工程により求められた結果に基づいて、抗てんかん薬による薬疹の発症リスクを判定する工程と、を有する、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、抗てんかん薬による薬疹発症を予測、診断可能な診断マーカー及びこの診断マーカーを検出することを手段とする薬疹発症の診断方法が提供される。これにより、抗てんかん薬による薬疹の発症可能性（リスク）を早期に予測、診断し、抗てんかん薬の投与による薬疹発症を未然に防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＨＬＡ遺伝子領域の構造を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、抗てんかん薬による薬疹発症と統計学上有意に相関のあるＨＬＡクラスＩアレルを同定し、これらＨＬＡクラスＩアレルを含む薬疹発症の診断マーカーを提供する。本発明はさらに、これらのＨＬＡクラスＩアレルと、抗てんかん薬による薬疹発症と関連のあることが日本人においてすでに報告されているＨＬＡクラスＩアレルと、を二つ以上組み合わせることにより、薬疹発症の予測精度が向上した診断マーカーを提供する。
【００２１】
（抗てんかん薬による薬疹発症と相関のあるＨＬＡクラスＩアレルの同定）
まず、抗てんかん薬による薬疹発症と有意に相関を有するＨＬＡクラスＩアレルを同定する。具体的には、抗てんかん薬の投与により薬疹を発症した患者を対象に、ＨＬＡクラスＩを遺伝子タイピングにより検索し、抗てんかん薬による薬疹の発病がない陰性対照患者のＨＬＡクラスＩアレルと比較検討を行う。
【００２２】
抗てんかん薬には、カルバマゼピン（ＣＢＺ）、フェニトイン（ＰＨＴ）、バルプロ酸ナトリウム（ＶＰＡ）、ゾニサミド（ＺＮＳ）、クロナゼパム、ジアゼパム、フェノバルビタール（ＰＢ）、クロバザム（ＣＬＢ）、プリミドン、スルチアム、アセタゾラミド、ニトラゼパム、エトスクシミド、ガバペンチン、トピラマート及びラモトリギン（ＬＴＧ）などが含まれる。これら抗てんかん薬の投与量、方法などは、患者の年齢、体重、性別などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
【００２３】
上記の抗てんかん薬は、それぞれ作用機序が異なる。例えば、ナトリウムチャネルを抑制する抗てんかん薬としては、ＣＢＺ及びＰＨＴが知られている。Ｔ型カルシウムチャネルを抑制する抗てんかん薬としては、ＶＰＡ及びエトスクシミドが知られている。またＧＡＢＡの抑制作用を増強させる抗てんかん薬としては、ジアゼパム及びＰＢが知られている。これら抗てんかん薬は、てんかん患者の発作型によって適宜選択されて、投与される。
【００２４】
薬疹は、軽症薬疹から重症薬疹まで、様々なものを含む。重症薬疹には、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）及び中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）が含まれる。ＳＪＳは、口唇、表皮剥離などの表皮の壊死性障害に加え、高熱や悪心を伴う。ＴＥＮもまた、口唇、表皮剥離などの表皮の壊死性障害に加え、高熱や悪心を伴うが、その表皮変化がＳＪＳよりも広範に及ぶ。一方、軽症薬疹では、皮膚の紅斑が認められる程度である。
【００２５】
ＨＬＡは、ヒトＭＨＣ（主要組織適合性複合体又は主要組織適合抗原）であり、第６染色体短腕部の６ｐ２１．３に位置するＭＨＣ領域によりコードされた遺伝子群に支配される遺伝子産物である。図１に示すように、このＭＨＣ領域は、クラスＩ〜ＩＩＩ遺伝子領域により構成される。このうちＨＬＡクラスＩは、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ座によってコードされ、遺伝的多型性に富んでいる。その複数のアレル及び／又はハプロタイプの殆どが公知である（R. Holdsworth et. al., Tissue Antigens(2009)73, 95-170、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースhttp://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）。
【００２６】
ここで、「遺伝的多型（遺伝子多型）」とは、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１又は複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が、該１又は複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、又は１％以上の頻度でその集団内に存在する場合に、その変異をいう。
【００２７】
「アレル」は対立遺伝子それぞれを指す。「アレル頻度」とは、一つの集団において複数の対立遺伝子が存在する場合に、ある対立遺伝子が含まれる割合をいう。また、「ハプロタイプ」とは、同一染色体上において統計学上関連している、つまり遺伝的に連鎖している遺伝子多型の組み合わせをいう。
【００２８】
ＨＬＡクラスＩの遺伝子タイピングに用いる試料は、患者由来の試料であり、ＨＬＡクラスＩの遺伝子多型を同定できるものであれば特に限定されない。例えば、患者より採血された末梢血などの血液、髄液、唾液等の体液、又は口腔粘膜などの組織などを挙げることができる。下記ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、ダイレクトシークエンス法等に供するため、フェノール法或いは市販の核酸抽出用のキット（ＱＩＡＧＥＮ社、タカラバイオ社など）により、この患者由来の試料から核酸を抽出することができる。好ましい核酸は、ゲノムＤＮＡである。さらに抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法などにより目的の領域を増幅したＤＮＡ断片を用いてもよい。この場合、信頼性の高いＤＮＡポリメラーゼを使用することが望ましい。
【００２９】
ＨＬＡクラスＩの遺伝子タイピングの方法としては、通常公知の方法、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence Specific Primers）法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法、及びダイレクトシーケンス法を用いることができる。
【００３０】
ＰＣＲ−ＳＳＰ法では、あるＨＬＡクラスＩアレルに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより、該ＨＬＡ−クラスＩアレルの増幅の有無を確認することで多型を判定することができる。この場合、例えば、ＰＣＲ増幅産物をゲル電気泳動することにより増幅ＤＮＡ断片の有無を確認することができる。
【００３１】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、特定のＨＬＡクラスＩアレルの遺伝子多型部位が制限酵素認識サイトに含まれる場合に有効である。多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅後、所定の制限酵素で切断し、ゲル電気泳動により切断されたＤＮＡ断片の大きさを解析し、その長さの違いにより、該遺伝子多型の判定が可能である。
【００３２】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、遺伝子多型の有無により、熱変性させた１本鎖ＤＮＡの高次構造が変化し、その電気泳動による移動度の違いを解析することにより、目的の遺伝子多型の有無を検出することができる。
【００３３】
また、ダイレクトシークエンス法は、試料中に含まれるＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した後、目的の領域の塩基配列を直接決定する方法である。一般的にはジデオキシ法を用いて塩基配列を決定する。塩基配列決定に用いるシークエンサーには、市販のＡＢＩシリーズ（アマシャムバイオサイエンス）等を用いることができる。
【００３４】
その他の遺伝子タイピングとしては、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、ＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）−ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of Flight/Mass Spectrometry）法、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法などをあげることができる。本実施形態においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
上記方法により同定された、抗てんかん薬により薬疹を発症した患者のＨＬＡクラスＩアレルと、陰性対照患者のＨＬＡクラスＩアレルとの比較検討は、χ２乗検定により行う。あるＨＬＡクラスＩアレルにおけるχ２乗検定の結果、ｐ値が０．１未満、好ましくはｐ値が０．０５未満の場合、そのＨＬＡクラスＩアレルは、抗てんかん薬による薬疹発症と統計学上有意な相関があると判断する。
【００３６】
また、抗てんかん薬による薬疹発症患者のＨＬＡクラスＩアレル頻度について、日本人のアレル頻度と比較し、人口に対する相対危険度（ＲＲ）として評価することもできる。具体的には、人口に対する相対危険度は、ＲＲ＝（ａ＊ｄ）／（ｂ＊ｃ）で表される。この式において、ａは抗てんかん薬による薬疹発症患者のうち対象となるＨＬＡアレルを有する群、ｂは抗てんかん薬による薬疹発症患者のうち対象となるＨＬＡアレルを有さない群、ｃは日本人において対象となるＨＬＡアレルを有する群、及びｄは日本人において対象となるＨＬＡアレルを有さない群である。また、これら検定以外にも、抗てんかん薬による薬疹発症と遺伝子多型の関連を検定することが可能であれば、他の周知の統計学的処理によって行なうことができる。
【００３７】
本実施形態において具体的には、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２及びＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２が、抗てんかん薬の投与による薬疹発症と統計学上有意に相関のあるＨＬＡアレルとして同定された。また、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及び既知の薬疹発症診断マーカー候補であるＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を二つ以上組み合わせて用いることにより、抗てんかん薬による薬疹の発症を精度よく予測可能であることが明らかとなった。これらＨＬＡクラスＩアレルの塩基配列及び各コードするアミノ酸配列は公知である（ＮＣＢＩ（http://www.Ncbi.nlm.nih.gov））。
【００３８】
ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５９０１由来のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。このＨＬＡアレルの日本人の保有率は１．７％である。ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２由来のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。このＨＬＡアレルの日本人の保有率は２．８％である。また、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２由来のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。このＨＬＡアレルの日本人の保有率は１６．６％である。
【００３９】
（抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカー）
本発明に係る抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーは、特定のＨＬＡクラスＩアレルを検出することによって、抗てんかん薬による薬疹発症を予測、診断する指標として使用されるマーカーである。具体的には、本発明に係る薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を含む。好ましくは、本発明に係る薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち何れか二つを含む。さらに好ましくは、本発明に係る薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む。
【００４０】
ここで、「複数のＨＬＡクラスＩアレルを含む診断マーカー」とは、該複数のＨＬＡクラスＩアレルのうち少なくとも何れか一つのアレルを保有することを指標として抗てんかん薬による薬疹の発症を予測、診断する診断マーカーのことをいう。複数のＨＬＡクラスＩアレルを含む診断マーカーは、単一のＨＬＡクラスＩアレルを含む診断マーカーよりも、抗てんかん薬による薬疹発症の予測、診断の精度が向上する点で有利である。
【００４１】
本発明に係る薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｂ＊５９０１と、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２と、を同一染色体上に有する、ＨＬＡクラスＩのハプロタイプであってもよい。本実施形態において、好ましいＨＬＡクラスＩハプロタイプは、Ａ＊２４０２−Ｃｗ＊０１０２−Ｂ＊５９０１ハプロタイプである。なお、このハプロタイプは、日本人において高い頻度（１．５％）で認められる。
【００４２】
これらＨＬＡクラスＩアレルを含む薬疹発症の診断マーカーは、目的のＨＬＡクラスＩアレルを検出できるものであればよく、該アレルに由来するゲノム配列（塩基配列）又は発現される核酸（例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）配列（塩基配列）を有するポリヌクレオチド及びコードされるポリペプチドを含む。
【００４３】
上記ポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）にコードされるアミノ酸配列（配列番号１〜３）又はそのアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４４】
また、上記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）に由来する塩基配列、その相補配列又はその断片と少なくとも７０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００４５】
これら配列は、全配列であってもよいし、各ＨＬＡクラスＩの遺伝子多型（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）を特徴付ける多型部位を含む部分配列であってもよい。
【００４６】
また、上記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）に由来する塩基配列、又はその相補配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。配列は、各ＨＬＡクラスＩの遺伝子多型を特徴付ける多型部位を含めば、部分配列であってよい。
【００４７】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として、具体的には、５ × Ｓ Ｓ Ｃ 、０ ． ５ ％ Ｓ Ｄ Ｓ 及び５０ ％ ホルムアミドの溶液中で４ ２ ℃ にて加温した後、０ ． １ × Ｓ Ｓ Ｃ 、０ ． ５ ％ Ｓ Ｄ Ｓ の溶液中で６ ８ ℃ にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察される条件を例示できる。
【００４８】
（抗てんかん薬による薬疹発症の診断方法）
本発明に係る抗てんかん薬による薬疹発症の診断方法は、患者から試料を採取する工程と、採取された試料中の、本発明において同定された抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーを検出する工程と、この検出結果に基づいて、抗てんかん薬による薬疹の発症リスクを判定する工程と、を有する。具体的には、患者由来の試料から、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１の少なくとも何れか一つが検出された場合に、該患者は、抗てんかん薬の投与により薬疹を発症する可能性（リスク）が高いと判定する。これにより、抗てんかん薬による薬疹の発症可能性を早期に診断し、抗てんかん薬の投与による薬疹発症を未然に防ぐことができる。
【００４９】
本発明において同定された抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を含む。好ましい薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち何れか二つを含む。より好ましい薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む。
【００５０】
患者からの試料の採取及びこれら薬疹発症の診断マーカーの検出は、上記のＨＬＡアレルの同定に記載の方法と同様に行うことができる。なお、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及び／又はＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を検出できる方法であれば、これに限定されない。
【００５１】
（その他）
本実施形態において、上記ＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）は、前述の作用機序の異なる抗てんかん薬の投与により薬疹が発症した症例で検出される。従って、これらのＨＬＡアレルを含む薬疹発症の診断マーカーは、特定の抗てんかん薬に限定されず、上記作用機序の異なる複数の抗てんかん薬による薬疹発症を予測するのに有用であり得る。
【００５２】
また、ＳＪＳなどの重症薬疹の既往を有する患者だけでなく、軽症薬疹の既往を有する患者も、本発明に係る薬疹発症診断マーカーを有することが見出される。具体的には、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１は、ＰＨＴによる軽症薬疹症例において検出される。また、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２は、ＣＢＺ、ＰＨＴ、ＺＮＳ及びＶＰＡによる軽症薬疹症例において検出される。また、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２は、ＣＢＺ、ＰＢ、ＰＨＴ、ＺＮＳ及びＶＰＡによる軽症薬疹症例において検出される。従って、本発明に係る抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーは、重症薬疹のみならず、軽症薬疹の発症を予測、診断するのに有用であり得る。
【実施例】
【００５３】
てんかん治療のために抗てんかん薬を内服した日本人患者のうち、ＳＪＳを発症した１４例を対象に、ＨＬＡクラスＩを遺伝子タイピングにより検索した。具体的には、ＨＬＡクラスＩアレルの高解像度の遺伝子タイピングは、ＳｅＣｏｒｅシークエンシングキット（Invitrogen Corp., Brown Deer, WI, USA）及びＡＢＩ３７３０ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）により行った。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃｗ用の上記キットを用いて、添付のプロトコールに従い、各遺伝子のエクソン２〜４を増幅し、遺伝子多型を同定するためにシークエンス解析を行った。得られたシークエンス解析データから、Ａｓｓｉｇｎ ＳＢＴソフトウエア（version3.2.7b）（Conexio Genomics, Western Australia, Australia）を用いて、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃｗアレルを検出、同定した。また、抗てんかん薬を内服してもＳＪＳを発症しなかった日本人陰性対照７０例についても同様にＨＬＡクラスＩアレルを検索し、両者のアレル出現率（頻度）を比較した。
【００５４】
ＳＪＳを発症した１４例中、７例が男性、７例が女性であったことから、性差はないと判断される。また、１４例の年齢範囲は３歳〜５０歳であった。
【００５５】
投与された抗てんかん薬は、カルバマゼピン（ＣＢＺ）、フェノバルビタール（ＰＢ）、フェニトイン（ＰＨＴ）、ゾニサミド（ＺＮＳ）、クロバザム（ＣＬＢ）、バルプロ酸ナトリウム（ＶＰＡ）、ラモトリギン（ＬＴＧ）であった。
【００５６】
（ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１）
表１に示すように、抗てんかん薬による薬疹発症と相関を有することがすでに報告されているＨＬＡクラスＩアレルであるＨＬＡ−Ｂ＊５９０１は、ＣＢＺ及びＰＢ投与によりＳＪＳを発症した３症例より検出され、陰性対照との比較でそのアレル頻度に有意差が認められた（χ２乗検定により、p=0.01604）。また、人口との比較では、相対危険度がＲＲ＝７．９１と高い値であった。これらの結果から、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１は、抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーとして有用であることが確認された。
【表１】
【００５７】
（ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２）
表２に示すように、ＣＢＺ、ＰＢ及びＣＬＢによりＳＪＳを発症した３症例においてＨＬＡ−Ｂ＊５５０２が検出され、陰性対照との比較でアレル頻度に有意差が認められた（χ２乗検定により、p=0.03545)。また、人口との比較では、相対危険度がＲＲ＝３．５８であった。これらの結果から、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２は、抗てんかん薬による薬疹発症を予測、診断するための診断マーカーとして有用であることが明らかとなった。
【表２】
【００５８】
（ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２）
表３に示すように、ＣＢＺ、ＰＢ、ＰＨＴ、ＣＬＢ及びＬＴＧによりＳＪＳを発症した８症例において、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２が検出され、陰性対照との比較でアレル頻度に有意差が認められた（χ２乗検定により、p=0.03840)。また、人口との比較では、相対危険度がＲＲ＝２．１６であった。これらの結果から、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２は、抗てんかん薬による薬疹発症を予測するための診断マーカーとして有用であることが明らかとなった。
【表３】
【００５９】
（ＨＬＡクラスＩアレルの組み合わせ）
また、表４に示すように、これらのＨＬＡクラスＩアレル（ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１、Ｂ＊５５０２及びＣｗ＊０１０２）の何れか一つでも検出されたＳＪＳ症例数は、１４例中９例であり、ＨＬＡクラスＩアレルそれぞれ単独の場合に検出された症例数よりも増加した。また、これらのＨＬＡクラスＩアレルのうち何れか二つを組み合わせた場合においても、それぞれ単独で検出された症例数よりも増加する傾向が認められた。以上の結果から、抗てんかん薬による薬疹発症と統計学上有意な相関を有するＨＬＡクラスＩアレルであるＨＬＡ−Ｂ＊５９０１、Ｂ＊５５０２及びＣｗ＊０１０２を二つ以上含む診断マーカーを用いることにより、抗てんかん薬による薬疹発症の予測精度が向上することが明らかとなった。
【表４】
【００６０】
（ＨＬＡクラスＩハプロタイプ）
ＨＬＡクラスＩハプロタイプの一つであるＡ＊２４０２−Ｃｗ＊０１０２−Ｂ＊５９０１ハプロタイプと、抗てんかん薬による薬疹発症とが、陰性対照と比較して統計学上有意な相関を有することが分かった（p=0.016、人口に対する相対危険度ＲＲ＝７．７）。以上の結果から、抗てんかん薬による薬疹発症の診断マーカーは、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１又はＢ＊５５０２と、Ｃｗ＊０１０２と、を同一染色体上に有するＨＬＡクラスＩハプロタイプを含み得ることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を含む、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカー。
【請求項２】
ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち何れか二つを含む、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカー。
【請求項３】
ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカー。
【請求項４】
前記薬疹が、スティーブンス・ジョンソン症候群又は中毒性表皮壊死症である、ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の診断マーカー。
【請求項５】
前記抗てんかん薬が、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド、クロナゼパム、ジアゼパム、フェノバルビタール、クロバザム、プリミドン、スルチアム、アセタゾラミド、ニトラゼパム、エトスクシミド、ガバペンチン、トピラマート及びラモトリギンである、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の診断マーカー。
【請求項６】
抗てんかん薬による薬疹の発症を予測する診断方法であって、
患者から試料を採取する工程と、
前記採取された試料中の、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち少なくとも何れか一つを検出する工程と、
前記検出する工程により求められた結果に基づいて、抗てんかん薬による薬疹の発症リスクを判定する工程と、
を有する、ことを特徴とする薬疹発症の診断方法。
【請求項１】
ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２又はＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を含む、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカー。
【請求項２】
ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち何れか二つを含む、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカー。
【請求項３】
ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１を含む、抗てんかん薬による薬疹の発症を予測するための診断マーカー。
【請求項４】
前記薬疹が、スティーブンス・ジョンソン症候群又は中毒性表皮壊死症である、ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の診断マーカー。
【請求項５】
前記抗てんかん薬が、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド、クロナゼパム、ジアゼパム、フェノバルビタール、クロバザム、プリミドン、スルチアム、アセタゾラミド、ニトラゼパム、エトスクシミド、ガバペンチン、トピラマート及びラモトリギンである、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の診断マーカー。
【請求項６】
抗てんかん薬による薬疹の発症を予測する診断方法であって、
患者から試料を採取する工程と、
前記採取された試料中の、ＨＬＡクラスＩアレルのＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２及びＨＬＡ−Ｂ＊５９０１のうち少なくとも何れか一つを検出する工程と、
前記検出する工程により求められた結果に基づいて、抗てんかん薬による薬疹の発症リスクを判定する工程と、
を有する、ことを特徴とする薬疹発症の診断方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−４５２８５（Ｐ２０１１−４５２８５Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９６０９０（Ｐ２００９−１９６０９０）
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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