抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う抗体グリコシル化改変体
【課題】Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴うポリペプチドを提供する。
【解決手段】本発明は、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸の発現によりＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴うポリペプチドを産生するよう操作された宿主細胞であって、上記宿主細胞により産生される上記ポリペプチドは、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質から成る群から選択され、上記ＧｎＴＩＩＩは、Ｆｃ領域中にバイセクト複合オリゴ糖を保有するポリペプチドと比較して、Ｆｃ領域中にバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合オリゴ糖あるいはそれらの混合物を保有する上記ポリペプチドの割合を増大するのに十分な量で発現される宿主細胞に関する。
【解決手段】本発明は、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸の発現によりＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴うポリペプチドを産生するよう操作された宿主細胞であって、上記宿主細胞により産生される上記ポリペプチドは、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質から成る群から選択され、上記ＧｎＴＩＩＩは、Ｆｃ領域中にバイセクト複合オリゴ糖を保有するポリペプチドと比較して、Ｆｃ領域中にバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合オリゴ糖あるいはそれらの混合物を保有する上記ポリペプチドの割合を増大するのに十分な量で発現される宿主細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、タンパク質のグリコシル化操作の分野に関する。より詳細には、本発明は、改良された処置的特性を有するタンパク質（抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う抗体）を生成するためのグリコシル化操作に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
糖タンパク質は、ヒト、その他の真核生物およびいくつかの原核生物における多数の不可欠な機能（触媒作用、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション、ならびに分子認識および会合）を媒介する。それらは、真核生物において非細胞質ゾルタンパク質の大部分を構成する（Ｌｉｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７（１９９３））。多数の糖タンパク質が処置目的のために開発されてきており、過去２０年の間、天然に存在する分泌糖タンパク質の組換えバージョンが生物工学産業の主要な産物であった。例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、処置用モノクローナル抗体（処置用ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が挙げられる（Ｃｕｍｍｉｎｇら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−１３０（１９９１））。
【０００３】
オリゴ糖成分は、処置用糖タンパク質の有効性に関係のある特性（物理学的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態および特異的生物学的活性）に有意に影響を及ぼし得る。このような特性は、オリゴ糖の存在または非存在だけでなく、その特異的構造に依存し得る。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間のいくつかの一般化がなされ得る。例えば、特定のオリゴ糖構造は、特定の糖質結合タンパク質との相互作用による血流からの糖タンパク質の迅速クリアランスを媒介するが、他のオリゴ糖構造は、抗体により結合され、望ましくない免疫反応を誘発し得る（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。
【０００４】
哺乳動物細胞は、ヒト適用のために最も適合した形態でタンパク質をグリコシル化するこれらの能力に起因して、処置用糖タンパク質の産生のために好ましい宿主である（Ｃｕｍｍｉｎｇら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−３０（１９９１）；Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。細菌がタンパク質をグリコシル化することは非常に稀であり、同様に他の型の一般的な宿主（例えば酵母、糸状菌、昆虫および植物細胞）は、血流からの迅速なクリアランス、望ましくない免疫相互作用、およびいくつかの特定の場合には減少した生物学的活性に関連した、グリコシル化パターンを生じる。哺乳動物細胞の中でも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、過去２０年間、最も一般的に用いられてきた。適切なグリコシル化パターンを示すことに加えて、これらの細胞は、遺伝的に安定な、高度に生産的なクローン細胞株の一貫した生成を可能にする。それらは、無血清培地を用いた単純なバイオリアクター中で高密度に培養されることができ、安全且つ再現可能な生物プロセスの開発を可能にする。その他の一般的に用いられる動物細胞としては、新生仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０−マウスミエローマ細胞およびＳＰ２／０−マウスミエローマ細胞が挙げられる。さらに最近、トランスジェニック動物からの産生も試験されている（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。
【０００５】
抗体はすべて、重鎖定常領域の保存位置に糖質構造を含有し、各アイソタイプはＮ結合型糖質構造の異なるアレイを保有し、これがタンパク質のアセンブリー、分泌または機能的活性に様々な影響を及ぼす（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７））。付着Ｎ結合型糖質の構造は、プロセシングの程度に依存してかなり変化し、高マンノース、多分枝、ならびにビアンテナリ（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）複合オリゴ糖を包含し得る（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７））。典型的には、モノクローナル抗体でさえ多様なグリコフォーム（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）として存在するよう、特定のグリコシル化部位に結合されるコアオリゴ糖構造の不均質プロセシングが存在する。同様に、抗体グリコシル化における大きな差異は細胞株間で起こり、異なる培養条件下で増殖された所定の細胞株に関しては、小さな差異さえも観察される、ということが示された（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（８）：８１３−２２（１９９５））。
【０００６】
非結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞、下級または濾胞性非ホジキンリンパ腫の処置のためのＲｉｔｕｘｉｍａｂ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）および進行性乳癌の処置のためのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ，）についての米国食品医薬品局の認可により実証されたような、癌の処置に有用な薬であり得る（Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ａ．−Ｊ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６６−７３（１９９９）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−１８（１９９９））。これらの製品が成功したのは、その効力のためだけでなく、その顕著な安全プロフィールのためでもある（Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ａ．−Ｊ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６６−７３（１９９９）Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−１８（１９９９））。これら２つの薬剤の業績にもかかわらず、非結合ｍＡｂ療法により通常得られるものより高い特異的抗体活性を得ることに現在大きな関心がある。
【０００７】
簡単な製造方法を維持し、有意の望ましくない副作用を潜在的に回避しながら、効力を大きく高めるための一方法は、ｍＡｂの天然の細胞媒介性エフェクター機能を、それらのオリゴ糖成分を操作することにより強化することである（Ｕｍａｎ〜ａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。癌免疫療法において最も一般的に用いられる抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各々のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存Ｎ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合される２つの複合ビアンテナリオリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋められて、ポリペプチドバックボーンとの広範な接触を形成するため、それらの存在は、抗体がエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するために不可欠である（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２（１９９５）；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８）；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３２（１９９７））。
【０００８】
バイセクト（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）オリゴ糖の生成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中での過剰発現が、操作されたＣＨＯ細胞により産生される抗神経芽細胞腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増強する、ということを以前に本発明者等は示した（非特許文献１、特許文献１参照）（これら各々の記載内容全体が、この全体を参考として本明細書中に援用される）。抗体ｃｈＣＥ７は、高腫瘍親和性および特異性を有するが、効力が弱すぎるためにＧｎＴＩＩＩ酵素を欠く、標準的な工業用の細胞株中で産生される場合に臨床的に有用ではない非結合ｍＡｂの大きいクラスに属する（非特許文献１）。その試験は、天然に存在する抗体に見出されるレベルを上回るように定常領域（Ｆｃ）関連バイセクトオリゴ糖の割合を増大することにより、最大インビトロＡＤＣＣ活性を大きく高めることができることを示した最初のものであった。この発見が、バイセクトオリゴ糖の非存在下で有意のＡＤＣＣ活性をすでに有する非結合ｍＡｂに外挿され得るか否かを確定するために、本発明者等は、この技術を、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、抗ＣＤ２０、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８キメラ抗体に適用した。本発明者等は、同様に本技術を非結合抗癌ｍＡｂ ｃｈＧ２５０に適用した。
【特許文献１】国際公開第９９／５４３４２号パンフレット
【非特許文献１】Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な概要）
テトラサイクリン調節様式で、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ；ＥＣ２．１．４．１４４）を過剰発現する遺伝子操作されたｍＡｂ産生細胞株を用いて、抗−ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）および抗癌ｍＡｂ ｃｈＧ２５０の新規のグリコシル化改変体を、本発明者等はここに生成した。ＧｎＴＩＩＩは、天然に存在するヒト抗体中に低から中レベルで見出されるが、標準工業細胞株中に産生されるｍＡｂを欠いているバイセクトオリゴ糖の合成に必要とされる。新規のグリコシル化バージョンは、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（欧州で販売されているＲｉｘｔｕｘｉｍａｂのバージョン）およびマウスミエローマ由来ｃｈＧ２５０より生物学的（ＡＤＣＣ）活性が優れていた。例えば、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭのような最大ＡＤＣＣ活性に達するために必要とされる量は、最高レベルのバイセクトオリゴ糖を保有する改変体では１０分の１であった。ｃｈＧ２５０に関しては、最高レベルのバイセクトオリゴ糖を保有する改変体は、非修飾コントロールｃｈＧ２５０にさらに低いＡＤＣＣ活性を検出するために必要とされるものの１２５分の１の濃度で有意のＡＤＣＣ活性を媒介した。ＧｎＴＩＩＩ発現およびＡＤＣＣ活性のレベル間に明らかな相関が見出された。
【００１０】
したがって、一局面において、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする少なくとも１つの核酸の発現によりＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴うポリペプチドを産生するよう操作された宿主細胞であって、上記宿主細胞により産生される上記ポリペプチドは、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質から成る群から選択され、上記ＧｎＴＩＩＩは、Ｆｃ領域中にバイセクト複合オリゴ糖を保有するポリペプチドと比較して、Ｆｃ領域中にバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合オリゴ糖あるいはそれらの混合物を保有する上記ポリペプチドの割合を増大するのに十分な量で発現される宿主細胞に関する。
【００１１】
好ましい実施形態では、上記ポリペプチドはＩｇＧまたはそのフラグメントであり、最も好ましくはＩｇＧ１またはそのフラグメントである。さらに好ましい実施形態では、上記ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質である。
【００１２】
本特許請求される発明の別の局面では、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が、上記宿主中に導入された。好ましい実施形態では、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子が上記宿主細胞染色体中に導入された。
【００１３】
あるいは、宿主細胞は、例えば遺伝子発現を増強するＤＮＡ要素の宿主染色体中への挿入により内因性ＧｎＴＩＩＩ遺伝子が活性化されるよう、操作された。好ましい実施形態では、内因性ＧｎＴＩＩＩは、宿主細胞染色体中への、プロモーター、エンハンサー、転写因子結合部位、トランスポゾンまたはレトロウイルス要素、あるいはそれらの組合せの挿入により活性化された。別の局面では、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩの発現を誘発する突然変異を保有するよう選択された。好ましくは宿主細胞は、ＣＨＯ細胞変異体ｌｅｃ１０である。
【００１４】
本特許請求される発明のさらに好ましい実施形態では、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸が構成的プロモーター要素に作動可能に連結される。
【００１５】
さらに好ましい実施形態では、上記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、またはハイブリドーマ細胞、Ｙ０ミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞であり、上記ポリペプチドは、抗ＣＤ２０抗体である。別の好ましい実施形態では、宿主細胞はＳＰ２／０細胞であり、上記ポリペプチドはモノクローナル抗体ｃｈＧ２５０である。
【００１６】
別の局面では、本特許請求される発明は、抗体分子、抗体フラグメントまたは免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸をさらに含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、上記宿主細胞は、抗ＣＤ２０抗体、キメラ抗ヒト神経芽細胞腫モノクローナル抗体ｃｈＣＥ７、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０、キメラ抗ヒト結腸、肺および乳癌モノクローナル抗体ＩＮＧ−１、ヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体３６２２Ｗ９４、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体Ａ３３、ＧＤ３ガングリオシドＲ２４に対して向けられる抗ヒト黒色腫抗体、またはキメラ抗ヒト扁平上皮細胞癌モノクローナル抗体ＳＦ−２５、抗ヒトＥＧＦＲ抗体、抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗ヒトＰＳＭＡ抗体、および抗ヒトＰＳＣＡ抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗ヒトＣＤ３０抗体、抗ヒトＣＤ３３抗体、抗ヒトＣＤ３８抗体、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ４５抗体、抗ヒトＣＤ５２抗体、抗ヒトＣＤ１３８抗体、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ改変体抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体、抗ヒトＣＥＡ抗体、抗ヒトＭＵＣ１抗体、抗ヒトＭＵＣ１コアタンパク質抗体、抗ヒト異常グリコシル化ＭＵＣ１抗体、ＥＤ−Ｂドメインを含有するヒトフィブロネクチン改変体に対する抗体、および抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を含む。
【００１７】
別の局面において、本特許請求される発明は、宿主細胞中でのポリペプチドの産生方法であって、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う上記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で上記宿主細胞のいずれかを培養することを包含する方法に関する。好ましい実施形態では、上記方法は、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う上記ポリペプチドを単離することをさらに包含する。
【００１８】
さらに好ましい実施形態では、上記宿主細胞は、免疫グロブリンのグリコシル化Ｆｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む。
【００１９】
好ましい実施形態では、上記ポリペプチドのＦｃ領域中のバイセクトオリゴ糖の割合は、５０％より大きく、より好ましくは７０％より大きい。別の実施形態では、Ｆｃ領域中のバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合体オリゴ糖あるいはそれらの混合物の割合は、上記ポリペプチドのＦｃ領域中のバイセクト複合オリゴ糖の割合より大きい。
【００２０】
本特許請求される方法の好ましい局面では、上記ポリペプチドは、抗ＣＤ２０抗体であり、上記宿主細胞により産生される抗ＣＤ２０抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した場合に、図２Ｅに示されたものと実質的に等価であるグリコシル化プロフィールを有する。
【００２１】
本特許請求される方法の別の好ましい局面では、上記ポリペプチドは、ｃｈＧ２５０モノクローナル抗体であり、上記宿主細胞により産生されるｃｈＧ２５０抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した場合に、図７Ｄに示されたものと実質的に等価であるグリコシル化プロフィールを有する。
【００２２】
さらなる局面では、本特許請求される発明は、上記の方法のいずれかにより産生される抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を伴う抗体に関する。好ましい実施形態では、抗体は、抗ＣＤ２０抗体、ｃｈＣＥ７、ｃｈ−Ｇ２５０、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＩＮＧ−１、３６２２Ｗ９４、ＳＦ−２５、Ａ３３およびＲ２４から成る群から選択される。あるいは、ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含み、上記の方法のいずれかにより産生されるＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う抗体フラグメントであり得る。
【００２３】
さらなる局面では、本特許請求される発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含み、上記の方法のいずれかにより産生されるＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う融合タンパク質に関する。
【００２４】
さらなる局面において、本特許請求される発明は、本発明の抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物に関する。
【００２５】
さらなる局面では、本特許請求される発明は、処置上有効な量の前記の薬学的組成物を、該薬学的組成物を必要とする患者に投与することを包含する癌の処置方法に関する。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、処置上有効な量の免疫学的活性抗体を、該免疫学的活性抗体を必要とするヒト被験者に投与することを包含する、Ｂ細胞欠乏を基礎にした病原性自己抗体により全体的または部分的に引き起こされる自己免疫疾患を処置するための改良型方法であって、改良が上記のように調製されるＡＤＣＣの増強を伴う処置上有効な量の抗体を投与することを包含する改良型方法に関する。好ましい実施形態では、抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。自己免疫疾患または障害の例としては、免疫媒介性血小板減少症、例えば急性特発性血小板減少性紫斑および慢性特発性血小板減少性紫斑、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎（ｐｏｓｔ−ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多形紅斑、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および繊維性肺胞炎、炎症性応答（例えば乾癬および皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患）；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性結腸炎）に関連する応答；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；結腸炎；糸球体腎炎；アレルギー症状（例えば湿疹および喘息）、ならびにＴ細胞の浸潤および慢性炎症性応答を含むその他の症状；アテローム硬化症；白血球粘着不全症；慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病（例えば１型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；ならびに典型的には結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および血管炎に見出されるサイトカインおよびＴリンパ球により媒介される急性および遅延性過敏症に関連する免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球漏出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（寒冷グロブリン血症（ｃｒｙｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）またはクームス陽性貧血が挙げられるが、これらに限定されない）；重症筋無力症；抗原−抗体複合体媒介性疾患；抗腎糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート−イートン筋無力症症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多発性内分泌症；ライター病；スティッフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞動脈炎；免疫複合体性腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）または自己免疫血小板減少症等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のこの局面において、本発明の抗体は、正常Ｂ細胞の血液を長期間枯渇させるために用いられる。
上記に加えて、本発明は、さらに以下の項目を提供する。
（項目１）
β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする少なくとも１つの核酸の発現によりＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴うポリペプチドを産生するよう操作された宿主細胞であって、該宿主細胞により産生される該ポリペプチドは、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質から成る群から選択され、ここで、該ＧｎＴＩＩＩは、Ｆｃ領域中にバイセクト複合オリゴ糖を保有するポリペプチドと比較して、Ｆｃ領域中にバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合オリゴ糖、あるいはそれらの混合物を保有する該ポリペプチドの割合を増大するのに十分な量で発現される、宿主細胞。
（項目２）
前記ポリペプチドがＩｇＧまたはそのフラグメントである、項目１に記載の宿主細胞。
（項目３）
前記ポリペプチドがＩｇＧ１またはそのフラグメントである、項目１に記載の宿主細胞。
（項目４）
前記ポリペプチドがヒトＩｇＧのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質である、項目１に記載の宿主細胞。
（項目５）
ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が前記宿主細胞中に導入されている、項目１に記載の宿主細胞。
（項目６）
内因性ＧｎＴＩＩＩ遺伝子が活性化されるよう操作されている、項目１に記載の宿主細胞。
（項目７）
前記内因性ＧｎＴＩＩＩが宿主染色体中への遺伝子発現を増強するＤＮＡ要素の挿入により活性化されている、項目６に記載の宿主細胞。
（項目８）
内因性ＧｎＴＩＩＩの発現を誘発する突然変異を保有するよう選択されている、項目６に記載の宿主細胞。
（項目９）
ＣＨＯ細胞変異体ｌｅｃ１０である、項目８に記載の宿主細胞。
（項目１０）
ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｙ０ミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞である、項目１に記載の宿主細胞。
（項目１１）
前記ポリペプチドが抗ＣＤ２０抗体である、項目１０に記載の宿主細胞。
（項目１２）
前記抗ＣＤ２０抗体がＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８である、項目１１に記載の宿主細胞。
（項目１３）
ＳＰ２／０細胞である、項目１０に記載の宿主細胞。
（項目１４）
前記抗体がキメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０である、項目１３に記載の宿主細胞。
（項目１５）
ＧｎＴＩＩＩをコードする前記少なくとも１つの遺伝子が前記宿主細胞染色体中に導入されている、項目５に記載の宿主細胞。
（項目１６）
前記内因性ＧｎＴＩＩＩは、前記宿主細胞染色体中へのプロモーター要素、トランスポゾンまたはレトロウイルス要素の挿入により活性化されている、項目６に記載の宿主細胞。
（項目１７）
抗体分子、抗体フラグメントまたは免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸をさらに含む、項目１に記載の宿主細胞。
（項目１８）
ＧｎＴＩＩＩをコードする前記少なくとも１つの核酸が、構成プロモーター要素に作動可能に連結される、項目１に記載の宿主細胞。
（項目１９）
項目１７に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、以下：抗ＣＤ２０抗体、キメラ抗ヒト神経芽細胞腫モノクローナル抗体ｃｈＣＥ７、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０、キメラ抗ヒト結腸、肺および乳癌モノクローナル抗体ＩＮＧ−１、ヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体３６２２Ｗ９４、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体Ａ３３、ＧＤ３ガングリオシドＲ２４に対して向けられる抗ヒト黒色腫抗体、キメラ抗ヒト扁平上皮細胞癌モノクローナル抗体ＳＦ−２５、抗ヒトＥＧＦＲ抗体、抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗ヒトＰＳＭＡ抗体、抗ヒトＰＳＣＡ抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗ヒトＣＤ３０抗体、抗ヒトＣＤ３３抗体、抗ヒトＣＤ３８抗体、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ４５抗体、抗ヒトＣＤ５２抗体、抗ヒトＣＤ１３８抗体、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ改変体抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体、抗ヒトＣＥＡ抗体、抗ヒトＭＵＣ１抗体、抗ヒトＭＵＣ１コアタンパク質抗体、抗ヒト異常グリコシル化ＭＵＣ１抗体、ＥＤ−Ｂドメインを含有するヒトフィブロネクチン改変体に対する抗体または抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を含む、宿主細胞。
（項目２０）
宿主細胞中でのポリペプチドの産生方法であって、該方法は、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、項目１〜１９のいずれか一項記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
（項目２１）
Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記宿主細胞が、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記ポリペプチドのＦｃ領域中の５０％より多いオリゴ糖がバイセクトされる、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記ポリペプチドのＦｃ領域中の７０％より多いオリゴ糖がバイセクトされる、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
Ｆｃ領域中のバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合オリゴ糖あるいはそれらの混合物の割合が、前記ポリペプチドのＦｃ領域中のバイセクト複合オリゴ糖の割合より大きい、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記ポリペプチドは、抗ＣＤ２０抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８であり、前記宿主細胞により産生されるＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した場合に、図２Ｅに示されるものと実質的に等価であるグリコシル化プロフィールを有する、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリペプチドは、ｃｈＧ２５０モノクローナル抗体であり、前記宿主細胞により産生される前記ｃｈＧ２５０抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した場合に、図７Ｄに示されるものと実質的に等価であるグリコシル化プロフィールを有する、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
項目２１に記載の方法により産生される抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を伴う、抗体。
（項目２９）
ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８、ｃｈＣＥ７、ｃｈ−Ｇ２５０、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＩＮＧ−１、３６２２Ｗ９４、ＳＦ−２５、Ａ３３およびＲ２４から成る群から選択される、項目２８に記載の抗体。
（項目３０）
免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含み、項目２１に記載の方法により産生されるＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う、抗体フラグメント。
（項目３１）
免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含み、かつ項目２１に記載の方法により産生されるＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う、融合タンパク質。
（項目３２）
項目２８に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３３）
項目３０に記載の抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３４）
項目３１に記載の融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３５）
項目３２〜３４のいずれか一項に記載の処置上有効な量の薬学的組成物を、該薬学的組成物を必要とする患者に投与する工程を包含する、癌の処置方法。
（項目３６）
処置上有効な量の抗体を、該抗体を必要とするヒト被験者に投与するこ工程を包含する、Ｂ細胞欠乏を基礎にした疾患処置の改良型方法であって、該改良が、項目２８に記載の方法により産生される処置上有効な量の抗体を投与する工程を包含する、改良型方法。
（項目３７）
前記抗体が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、項目３６に記載の改良型方法。
（項目３８）
前記抗ＣＤ２０抗体がＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８である、項目３７に記載の改良型方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
用語は、別に定義しない限り、以下のように当該技術分野で一般的に用いられるように本明細書中で用いられる。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、「抗体」という用語は、全抗体分子、抗体フラグメント、あるいは免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質を包含するよう意図される。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子改変体、ならびに置換、付加または欠失を生じるが抗体依存性細胞傷害性を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低減しない変更を有する改変体を包含するよう意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的損失を伴わずに、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。このような改変体は、活性に及ぼす最小限の影響を有するよう、当該技術分野で公知の一般原則に従って選択され得る（例えばＢｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１０（１９９０）参照）。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ」という用語は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をいう。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「操作する」、「操作された」、「操作」および「グリコシル化操作」という用語は、天然に存在するポリペプチドまたはそのフラグメントのグリコシル化パターンの任意の操作を包含するとみなされる。グリコシル化操作としては、細胞のグリコシル化機構の代謝的操作（細胞中で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変更を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む）が挙げられる。さらに、グリコシル化操作は、グリコシル化に対する、変異および細胞環境の影響を包含する。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、「宿主細胞」という用語は、目的のタンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチド（抗体および抗体フラグメントを含む）の修飾グリコフォームを生じるよう操作され得る任意の種類の細胞系を網羅する。典型的には、宿主細胞は、最適化されたレベルのＧｎＴＩＩＩを発現するよう操作されている。宿主細胞としては、少数名前を挙げるとすれば、培養細胞（例えば哺乳動物培養細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞）、酵母細胞および昆虫細胞）が挙げられるが、トランスジェニック動物または培養組織内に含まれる細胞も挙げられる。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「Ｆｃ媒介性細胞傷害性」という用語は、抗体依存性細胞傷害性、ならびにヒトＦｃ領域を含有する可溶性Ｆｃ融合タンパク質により媒介される細胞傷害性を包含する。Ｆｃ媒介性細胞傷害性は、「ヒト免疫エフェクター細胞」による「抗体標的化細胞」の溶解をもたらす免疫メカニズムであって、ここで、
「ヒト免疫エフェクター細胞」は、抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域と結合し、エフェクター機能を実施する、それらの表面上にＦｃ受容体を提示する白血球の集団である。このような集団としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３４】
「抗体標的化細胞」は、抗体またはＦｃ融合タンパク質により結合される細胞である。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域に対してＮ末端側のタンパク質部分を介して標的細胞と結合する。
【００３５】
本明細書中で用いる場合、「Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強」という用語は、上記のＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムにより、標的細胞周囲の媒質中で、所定時間で、抗体またはＦｃ融合タンパク質の所定濃度で溶解される「抗体標的細胞」の数の増大、および／またはＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムにより、所定時間で、「抗体標的細胞」の所定数の溶解を達成するのに必要とされる、標的細胞周囲の媒質中での、抗体またはＦｃ融合タンパク質の濃度の低減と定義される。Ｆｃ媒介性細胞傷害性は、当業者に既知である同一の標準的な産生方法、精製方法、配合方法および貯蔵方法を用いて、同一型の宿主細胞により産生されるが、本明細書中に記載される方法によりグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩを発現するよう操作された宿主細胞によっては産生されたことがない、同一の抗体またはＦｃ融合タンパク質により媒介される細胞傷害性に関連する。
【００３６】
「抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を伴う抗体」とは、当業者に既知の任意の適切な方法により確定されるようなＡＤＣＣの増強を伴う抗体を意味する。許容可能なインビトロＡＤＣＣアッセイの１つを以下に示す：
１）本アッセイは、抗体の抗原結合領域により認識される標的抗原を発現することが既知である標的細胞を用いる。
【００３７】
２）本アッセイは、エフェクター細胞として無作為に選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いる。
【００３８】
３）本アッセイは、以下のプロトコールに従って実行される：
ｉ）ＰＢＭＣを、標準密度遠心分離法を用いて単離し、５×１０６細胞／ｍｌでＲＰＭＩ細胞培地中に懸濁する。
【００３９】
ｉｉ）標的細胞を標準組織培養法により増殖させ、９０％より高い成育可能度で指数増殖期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培地中で洗浄し、１００μキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培地で２回洗浄し、１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培地中に再懸濁する。
【００４０】
ｉｉｉ）上記の最終標的細胞懸濁液１００μｌを、９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに移す。
【００４１】
ｉｖ）抗体を、細胞培地中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌに連続希釈し、得られた抗体溶液５０μｌを９６ウエルマイクロタイタープレート中の標的細胞に添加し、上記の全濃度範囲を網羅する種々の抗体濃度を三重反復試験する。
【００４２】
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールに関しては、標識した標的細胞を含有するプレート中の３つの付加的ウエルに、抗体溶液（上記ｉｖ時点）の代わりに、非イオン性洗剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の２％（容量／容量）水溶液５０μｌを添加する。
【００４３】
ｖｉ）自発性放出（ＳＲ）コントロールに関しては、標識した標的細胞を含有するプレート中の３つの付加的ウエルに、抗体溶液（上記ｉｖ時点）の代わりに、ＲＰＭＩ細胞培地５０μｌを添加する。
【００４４】
ｖｉｉ）次に、９６ウエルマイクロタイタープレートを５０×ｇで１分間遠心分離し、４℃で１時間インキュベートする。
【００４５】
ｖｉｉｉ）ＰＢＭＣ懸濁液（上記ｉ時点）５０μｌを各ウエルに添加して、２５：１のエフェクター：標的細胞比を生じ、５％ＣＯ２大気下で３７℃で４時間、インキュベーター中にプレートを入れる。
【００４６】
ｉｘ）各ウエルから無細胞上清を回収し、ガンマ計数器を用いて実験的放出放射能（ＥＲ）を定量する。
【００４７】
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００（式中、ＥＲはその抗体濃度に関して定量された平均放射能（上記ｉｘ時点参照）であり、ＭＲは、ＭＲコントロール（上記ｖ時点参照）に関して定量された平均放射能（上記ｉｘ時点参照）であり、ＳＲは、ＳＲコントロール（上記ｖｉ時点参照）に関して定量された平均放射能（上記ｉｘ時点参照）である）に従って各抗体濃度に関して算定する。
【００４８】
４）「ＡＤＣＣの増強」とは、上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増大、および／または上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の低減と定義される。ＡＤＣＣの増強は、当業者に既知である同一の標準的な産生方法、精製方法、配合方法および貯蔵方法を用いて、同一型の宿主細胞により産生されるが、しかしグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩを過剰発現するよう操作された宿主細胞によっては産生されたことがない同一の抗体により媒介される、上記のアッセイを用いて測定されるＡＤＣＣに関連する。
【００４９】
本明細書中で用いる場合、「抗ＣＤ２０抗体」という用語は、典型的には、一般的にＣＤ２０と呼ばれるヒトＢリンパ球限定分化抗原Ｂｐ３５として示される３５，０００ダルトンの細胞表面非グリコシル化リンタンパク質を特異的に認識する抗体を意味するよう意図される。
【００５０】
（グリコシル化パターンの変更が望ましいタンパク質Ａをコードする核酸の同定および生成）
本発明は、グリコフォームの抗体または抗体フラグメント、あるいは抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う抗体フラグメントを含む融合タンパク質の産生のための宿主細胞系の生成および使用の方法を提供する。標的エピトープの同定、ならびにグリコシル化パターンの変更が望ましい潜在的処置値を有する抗体の生成、ならびにそれらのそれぞれのコード核酸配列の単離は、本発明の範囲内である。
【００５１】
当業界で既知の種々の手法は、当該エピトープを標的化するための抗体の産生に用いられ得る。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリにより産生されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば診断薬または処置薬として有用であり得る。処置薬としては、中和抗体、すなわち、リガンド、基質またはアダプター分子と結合に関して競合するものが、特に好ましいものである。
【００５２】
抗体の産生のために、当該標的タンパク質を注射することにより種々の宿主動物、例えばウサギ、マウス、ラット等（これらに限定されない）が免疫される。宿主種に応じて種々のアジュバントを、免疫学的応答を増強するために用いることができ、その例としては、フロイント（完全および不完全）アジュバント、無機質ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えばリゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、サポニン、油乳剤、カギアナカサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント（例えばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
当該標的に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製され得る。これらの例としては、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２（１９８３）； Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−３０
（１９８３））、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７−９６ （Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−５４（１９８５））が用いられ得る。あるいは、一本鎖抗体の産生に関して記載された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）が、所望の特異性を有する一本鎖抗体を産生するために適合され得る。
【００５４】
当該標的タンパク質の特異的結合部位を含有する抗体フラグメントは、既知の技法で生成され得る。例えばこのようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリが、当該標的タンパク質に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速且つ容易な同定を可能にするよう構築され得る（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５−８１（１９８９））。
【００５５】
グリコシル化パターンの変更が望ましい抗体または抗体フラグメントが一旦同定されれば、当該技術分野で周知の技法を用いて、コード核酸配列が同定され、単離される。
【００５６】
ａ．変更されたグリコシル化パターンを有するタンパク質の産生のための細胞株の生成
本発明は、変更されたグリコシル化パターンを有するタンパク質の生成のための宿主細胞発現系を提供する。特に本発明は、改良された処置値を有するグリコフォームのタンパク質の生成のための宿主細胞系を提供する。したがって、本発明は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の発現を増強するよう選択または操作された宿主細胞発現系を提供する。特に、このような宿主細胞発現系は、任意に構成的プロモーター
系または調節プロモーター系に作動可能に連結されるＧｎＴＩＩＩをコードする組換え核酸分子を含むように操作され得る。あるいは、ＧｎＴＩＩＩを天然に産生し、産生するよう誘導され、かつ／または産生するよう選択される宿主細胞発現系が用いられ得る。
【００５７】
特定の一実施形態において、本発明は、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸を発現するよう操作された宿主細胞を提供する。一局面では、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子を用いて形質転換されるかまたはトランスフェクトされる。代替的局面では、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩが活性化されるような方法で操作および／または選択された。例えば、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩの発現を誘発する突然変異を保有するよう選択され得る。特定の一実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ ｌｅｃ１０変異体である。あるいは、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩが活性化されるよう操作され得る。さらに別の代替的実施形態では、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩが構成的プロモーター要素、トランスポゾンまたはレトロウイルス要素の宿主細胞染色体中への挿入により活性化されるように操作される。
【００５８】
一般に、任意の種類の培養細胞株が、本発明の宿主細胞株を操作するための背景として用いられ得る。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、あるいは昆虫細胞が、本発明の操作された宿主細胞を生成するための背景細胞株として用いられる。
【００５９】
本発明は、本明細書中に記載されたようなＧｎＴＩＩＩを発現する任意の操作された宿主細胞を包含するよう意図される。
【００６０】
ＧｎＴＩＩＩをコードする１つまたは複数の核酸は、構成的プロモーターの、あるいは調節された発現系の制御下で発現され得る。適切な調節化発現系としては、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃ−スイッチ発現系、糖質コルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系およびメタロチオネイン金属誘導性発現系が挙げられるが、これらに限定されない。ＧｎＴＩＩＩをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系内に含まれる場合、構成プロモーターの制御下で発現され得るものがある一方、調節プロモーターの制御下で発現されるものもある。最大発現レベルは、細胞増殖速度に有意の悪影響を及ぼさない安定ＧｎＴＩＩＩ発現の最大限可能なレベルであると考えられ、ルーチン実験を用いて確定される。発現レベルは、当該技術分野で一般に既知である方法により、例えばＧｎＴＩＩＩ特異的抗体を用いるウエスタンブロット分析、ＧｎＴＩＩＩ特異的核酸プローブを用いるノーザンブロット分析、あるいは酵素活性の測定により確定される。あるいは、ＧｎＴＩＩＩの生合成産物と結合するレクチン、例えばＥ４−ＰＨＡレクチンが用いられ得る。さらなる代替例では、核酸はレポーター遺伝子に作動可能に連結されることができ、ＧｎＴＩＩＩの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを測定することにより確定される。レポーター遺伝子は、単一ｍＲＮＡ分子として上記ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸（単数または複数）と一緒に転写されてもよく、それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかにより連結され得る。レポーター遺伝子は、単一ポリペプチド鎖が形成されるよう、上記ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸と一緒に翻訳され得る。ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸は、ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸およびレポーター遺伝子が、２つの別個のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に代替的にスプライシングされるＲＮＡ分子に転写されるよう、単一プロモーターの制御下でレポーター遺伝子と作動可能に連結され得る。その結果生じるｍＲＮＡのうちの１つは上記レポータータンパク質に翻訳され、他のものは上記ＧｎＴＩＩＩに翻訳される。
【００６１】
ＧｎＴＩＩＩをコードするいくつかの異なる核酸が発現される場合、それらは、１つのまたは複数のｍＲＮＡ分子として転写されるように配置され得る。それらが単一ｍＲＮＡ分子として転写される場合、それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかにより連結され得る。それらは、いくつかの別個のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に代替的にスプライシングされるＲＮＡ分子に単一プロモーターから転写され得、これは次に、それらのそれぞれのコードＧｎＴＩＩＩに翻訳される。
【００６２】
その他の実施形態では、本発明は、抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う処置用抗体の生成のための宿主細胞発現系、およびＦｃ媒介性細胞傷害性を促すために表面にＩｇＧ Ｆｃ領域を提示する細胞を提供する。一般に、宿主細胞発現系は、変更グリコフォームの産生が望ましい抗体をコードする核酸を、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸と一緒に発現するよう操作および／または選択されている。一実施形態では、宿主細胞系は、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子をトランスフェクトされる。典型的には、トランスフェクト細胞は、ＧｎＴＩＩＩを安定に発現するクローンを同定し、単離するよう選択される。別の実施形態では、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩの発現のために選択されている。例えば、そうでなければサイレントＧｎＴＩＩＩの発現を誘発する突然変異を保有する細胞が選択され得る。例えば、ＣＨＯ細胞は、ある種の変異体において、例えば変異体Ｌｅｃ１０において活性であるサイレントＧｎＴＩＩＩ遺伝子を保有することが既知である。さらに、調節プロモーターまたは構成性プロモーターの挿入、トランスポゾン、レトロウイルス要素等の使用を含む当該技術分野で既知の方法を、サイレントＧｎＴＩＩＩを活性化し得る。遺伝子ノックアウト技術の使用、あるいはリボサイム法の使用はまた、宿主細胞のＧｎＴＩＩＩ発現レベルを調整するために用いることができるため、本発明の範囲内である。
【００６３】
任意の種類の培養細胞株を、本発明の宿主細胞株を操作するためのバックグラウンドとして用いることができる。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞または昆虫細胞が用いられ得る。典型的には、このような細胞株は、全抗体分子、抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトランスフェクト核酸をさらに含むよう操作される。代替的実施形態では、当該特定の抗体を発現するハイブリドーマ細胞株が、本発明の操作された宿主細胞を生成するためのバックグラウンド細胞株として用いられる。
【００６４】
典型的には、宿主細胞系における少なくとも１つの核酸は、ＧｎＴＩＩＩをコードする。
【００６５】
ＧｎＴＩＩＩをコードする１つまたは複数の核酸は、構成プロモーターの、あるいは調節発現系の制御下で発現され得る。適切な調節発現系としては、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃ−スイッチ発現系、糖質コルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系およびメタロチオネイン金属誘導性発現系が挙げられるが、これらに限定されない。ＧｎＴＩＩＩをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系内に含まれる場合、構成プロモーターの制御下で発現され得るものがある一方、調節プロモーターの制御下で発現されるものもある。最大発現レベルは、細胞増殖速度に重大な悪影響を及ぼさない安定ＧｎＴＩＩＩ発現の最大限レベルであると考えられ、日常的な実験を用いて確定される。発現レベルは、当該技術分野で一般に既知である方法（ＧｎＴＩＩＩ特異的抗体を用いるウエスタンブロット分析、ＧｎＴＩＩＩ特異的核酸プローブを用いるノーザンブロット分析、あるいはＧｎＴＩＩＩの酵素活性の測定を含む）により確定される。あるいは、ＧｎＴＩＩＩの生合成産物に結合するレクチン、例えばＥ４−ＰＨＡレクチンが用いられ得る。さらなる代替例では、核酸はレポーター遺伝子に作動可能に連結されることができ、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを測定することにより確定される。レポーター遺伝子は、単一ｍＲＮＡ分子として上記糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸と一緒に転写されてもよく、それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）により連結され得る。レポーター遺伝子は、単一ポリペプチド鎖が形成されるよう、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸と一緒に翻訳され得る。ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸は、ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸およびレポーター遺伝子が、２つの別個のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に代替的にスプライシングされるＲＮＡ分子に転写されるよう、単一プロモーターの制御下でレポーター遺伝子と作動可能に連結され得る。その結果生じるｍＲＮＡのうちの１つは上記レポータータンパク質に翻訳され、他のものは上記ＧｎＴＩＩＩに翻訳される。
【００６６】
ＧｎＴＩＩＩをコードするいくつかの異なる核酸が発現される場合、それらは、１つまたは複数のｍＲＮＡ分子として転写されるように配置され得る。それらが単一ｍＲＮＡ分子として転写される場合、それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）により連結され得る。それらは、いくつかの別個のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に代替的にスプライシングされるＲＮＡ分子に単一プロモーターから転写され、これは次に、それらのそれぞれのコードＧｎＴＩＩＩに翻訳される。
【００６７】
（ｉ．発現系）
当業者に既知である方法を用いて、目的のタンパク質のコード配列、ならびにＧｎＴＩＩＩおよび適切な転写／翻訳制御シグナルのコード配列を含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、組換えＤＮＡ法、合成法およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｕｌｉｓｈｉｎｇ ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載された技法を参照）。
【００６８】
種々の宿主発現ベクター系が、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を発現するために利用され得る。好ましくは哺乳動物細胞は、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有する組換えプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞系として用いられる。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、あるいは昆虫細胞が宿主細胞系として用いられる。代替的な実施形態では、その他の真核生物宿主細胞系、（目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞；目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは二重微小染色体（例えばマウス細胞株）中で安定に増幅される（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）かまたは不安定に増幅される、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの多重コピーおよびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有するよう操作された細胞株を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染した動物細胞系を含む）が意図され得る。
【００６９】
本発明の方法については、安定発現は、一般的に、典型的にはより再現可能な結果が得られ、かつ大規模生成もより容易であるので、一過性発現のために好ましい。ウイルスの複製起源を含有する発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、および選択可能マーカーにより制御されるそれぞれのコード核酸で形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は栄養強化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地中で１〜２時間増殖させられ、次に選択培地に切り替えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、それらの染色体中にプラスミドを安定的に組み込み、増殖して増殖巣を形成し、これが次にクローニングされて細胞株に増大され得る細胞の選択を可能にする。
【００７０】
以下の多くの選択系、が用いられ得るが、これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２６（１９６２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））（これらはｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞またはａｐｒｔ―細胞のそれぞれにおいて用いられ得る）。代謝拮抗物質耐性も、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７（１９８９）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）に対する耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｇｎｅ ３０：１４７（１９８４））に対する選択の基礎として用いられ得る。近年、さらに別の選択可能遺伝子、すなわちトリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるｔｒｐＢ；ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８０４７（１９８８））；グルタミンシンターゼ系；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編（１９８７））が記載されている。
【００７１】
（ｉｉ．変更されたグリコシル化パターンを有するタンパク質を発現するトランスフェクト体または形質転換体の同定）
コード配列を含有し、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的アプローチにより同定され得る；（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在；（ｃ）宿主細胞中のそれぞれのｍＲＮＡ転写体の発現により測定した場合の転写のレベルの評価；および（ｄ）イムノアッセイにより、またはその生物学的活性により測定した場合の遺伝子産物の検出。
【００７２】
第一のアプローチでは、発現ベクター中に挿入された目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列の存在は、それぞれのコード配列とそれぞれが相同であるヌクレオチド配列、あるいはその一部分または誘導体を含むプローブを用いる、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにより検出され得る。
【００７３】
第二のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系は、ある種の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成等）の存在または非存在に基づいて、同定および、選択され得る。例えば、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、それぞれのコード配列を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、コード配列の発現を制御するために用いられる同一のまたは異なるプロモーターの制御下でコード配列と縦列に配置され得る。誘導または選択に応答するマーカーの発現は、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列の発現を示す。
【００７４】
第三のアプローチでは、目的のタンパク質のコード領域およびＧｎＴＩＩＩのコード配列についての転写活性は、ハイブリダイゼーションアッセイにより評価され得る。例えば、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列と相同なプローブまたはその特定部分を用いたノーザンブロットにより、ＲＮＡが単離され、分析され得る。あるいは、宿主細胞の全核酸が抽出され、このようなプローブとのハイブリダイゼーションについてアッセイされ得る。
【００７５】
第四のアプローチでは、目的のタンパク質およびＧｎＴＩＩＩのコード配列のタンパク質産物の発現は、例えばウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、放射免疫沈降法、酵素結合イムノアッセイ等）により、免疫学的に評価され得る。しかしながら、発現系の成功の最終試験は、生物学的に活性な遺伝子産物の検出を包含する。
【００７６】
（ｂ．変更されたグリコシル化パターンを有するタンパク質およびタンパク質フラグメントの生成および使用）
（ｉ．抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う抗体の生成および使用）
好ましい実施形態において、本発明は、抗体依存性細胞傷害性の増強を伴うグリコフォームの抗体および抗体フラグメントを提供する。
【００７７】
いくつかの種類の癌の処置のための非結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験は、近年、励みになる結果をもたらした（Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：２２３−２５（１９９７）；Ｄｅｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７））。キメラ非結合ＩｇＧ１は、低級または濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫に関して認可された（Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：２２３−２５（１９９７））が、別の非結合ｍＡｂ、ヒト化ＩｇＧ１ターゲッティング固形乳房腫瘍もまた、ＩＩＩ期臨床試験において有望な結果を示している（Ｄｅｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７））。これら２つのｍＡｂの抗原は、それぞれの腫瘍細胞中で高く発現され、抗体はインビトロおよびインビボエフェクター細胞による強力な腫瘍破壊を媒介する。これに対比して、良好な腫瘍特異性を有する多くの他の非結合ｍＡｂは、臨床的に有用であるほど十分な効力を有するエフェクター機能を誘発し得ない（Ｆｒｏｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ ８０：３１７−３３（１９９７）；Ｓｕｒｆｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９：１８４−９１（１９９６））。これらの弱いｍＡｂのいくつかについて、サイトカインによる補助処置（ａｄｊｕｎｃｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）が現在試験されている。サイトカインの添加により、循環リンパ球の活性および数を高めることにより、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激することができる（Ｆｒｏｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ ８０：３１７−３３（１９９７）Ｓｕｒｆｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９：１８４−９１（１９９６））ＡＤＣＣ（抗体標的細胞上での溶解性攻撃）は、白血球受容体と抗体の定常領域（Ｆｃ）との結合の際に誘発される（Ｄｅｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７））。
【００７８】
非結合ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増強するための異なるが相補的な手法は、リンパ球受容体（ＦｃγＲ）に対するその親和性を増強するよう抗体のＦｃ領域を操作することである。タンパク質操作試験は、ＦｃγＲがＩｇＧ ＣＨ２ドメインのより低いヒンジ領域と相互作用することを示した（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６））。しかし、ＦｃγＲ結合は、ＣＨ２領域中の保存Ａｓｎ２９７に共有結合されたオリゴ糖の存在も要する（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６）；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３１（１９９７））が、このことは、オリゴ糖およびポリペプチドがともに相互作用部位に直接関与することを、あるいは活性ＣＨ２ポリペプチド立体配座を保持するためにオリゴ糖が必要であることを示唆する。したがって、オリゴ糖構造の改変は、相互作用の親和性を増強するための一手段として検討され得る。
【００７９】
ＩｇＧ分子は、各重鎖上に１つずつ、そのＦｃ領域中に２つのＮ結合型オリゴ糖を保有する。任意の糖タンパク質として、抗体は、同一ポリペプチド骨格を共有するが、グリコシル化部位に結合された異なるオリゴ糖を有する、グリコフォームの一集団として産生される。血清ＩｇＧのＦｃ領域中に通常見出されるオリゴ糖は、複合ビアンテナリ型のものであって（Ｗｏｒｍａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１３０−３８（１９９７））、低レベルの末端シアル酸およびバイセクトＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ならびに種々の程度の末端ガラクトシル化およびコアフコシル化を伴う。ＦｃγＲ結合に必要とされる最小糖質構造は、オリゴ糖コア内に存在することをいくつかの試験が示唆している（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６））。末端ガラクトースの除去は、ＡＤＣＣ活性を約２分の１に低減するが、これは、ＦｃγＲ受容体結合におけるこれらの残基に関する役割を示す（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６））。
【００８０】
非結合体化型処置用ｍＡｂの産生のために工業的および学究的に用いられるマウス由来細胞株またはハムスター由来細胞株は、通常は、必要なオリゴ糖決定基をＦｃ部位に結合する。しかしこれらの細胞株中で発現されるＩｇＧは、血清ＩｇＧ中に少量で見出されるバイセクトＧｌｃＮＡｃを欠く（Ｌｉｆｅｌｙら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５））。対照的に、ラットミエローマ産生ヒト化ＩｇＧ１（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）は、そのグリコフォームのいくつかでバイセクトＧｌｃＮＡｃを保有することが近年観察された（Ｌｉｆｅｌｙら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５））。ラット細胞由来抗体は、標準細胞株中に産生されるＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体と同様のインビトロでのＡＤＣＣ活性に達するが、抗体濃度は有意に低い。
【００８１】
ＣＡＭＰＡＴＨ抗原は、通常はリンパ腫細胞上に高レベルで存在し、このキメラｍＡｂはバイセクトＧｌｃＮＡｃの非存在下で高ＡＤＣＣ活性を有する（Ｌｉｆｅｌｙら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５））。Ｎ結合型グリコシル化経路では、バイセクトＧｌｃＮＡｃは、酵素β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）に付加される（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６４：１６３−８１（１９８６））。
【００８２】
本発明者らは、異なるレベルのクローン化ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を、外部調節様式で発現するよう予め操作された単一抗体産生ＣＨＯ細胞株を用いた。この手法は、ＧｎＴＩＩＩの発現と改変された抗体のＡＤＣＣ活性との間の強い相関を最初に確定した。
【００８３】
本発明者らは、以前に、開示された方法により改変されたＣ２Ｂ８抗体が、同一の細胞培養および精製条件下で産生された標準非改変Ｃ２Ｂ８抗体の約１６倍のＡＤＣＣ活性を有する、ということを示した。要するに、ＧｎＴＩＩＩ発現を示さないＣＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８細胞中で発現されたＣ２Ｂ８抗体サンプルは、ヒトリンパ球によるＳＢ細胞（ＣＤ２０＋）のインビトロでの溶解物として測定される、約３１％（１μｇ／ｍｌの抗体濃度で）の細胞傷害活性を示した。対照的に、基本的高抑制レベルでＧｎＴＩＩＩを発現するＣＨＯ細胞培養由来のＣ２Ｂ８抗体は、１μｇ／ｍｌの抗体濃度で、同一抗体濃度のコントロールに対してＡＤＣＣ活性の３３％増を示した。さらに、ＧｎＴＩＩＩの発現増強は、同一抗体濃度でのコントロールと比較して、最大ＡＤＣＣ活性のほぼ８０％という大きい増加（１μｇ／ｍｌの抗体濃度で）を生じた（国際公開番号ＷＯ９９／５４３４２参照）（この記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）。
【００８４】
抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う本発明のさらに他の抗体としては、本発明の方法により産生される抗ヒト神経芽細胞腫モノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）、本発明の方法により産生されるキメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体（ｃｈ−Ｇ２５０）、本発明の方法により産生されるヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（例えばトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ））、本発明の方法により産生されるキメラ抗ヒト結腸、肺および乳癌モノクローナル抗体（ＩＮＧ−１）、本発明の方法により産生されるヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体（３６２２Ｗ９４）、本発明の方法により産生されるヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）、本発明の方法により産生されるＧＤ３ガングリオシドに対して向けられる抗ヒト黒色腫抗体（Ｒ２４）、ならびに本発明の方法により産生されるキメラ抗ヒト扁平上皮細胞癌モノクローナル抗体（ＳＦ−２５）、本発明の方法により産生される抗ヒト小細胞肺癌モノクローナル抗体（ＢＥＣ２、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ）、本発明の方法により産生される抗ヒト非ホジキンリンパ腫モノクローナル抗体（Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ））、本発明の方法により調製される抗ヒト扁平上皮細胞頭頚部癌モノクローナル抗体（Ｃ２２５、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、本発明の方法により調製される抗ヒト直腸および結腸癌モノクローナル抗体（Ｐａｎｏｒｅｘ（エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、本発明の方法により産生される抗ヒト卵巣癌モノクローナル抗体（テラギン（Ｔｈｅｒａｇｙｎ）、Ａｎｔｉｓｏｍａ）、本発明の方法により産生される抗ヒト急性骨髄性白血病モノクローナル抗体（Ｓｍａｒｔ Ｍ１９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、Ｋａｎｅｂｏ）、本発明の方法により産生される抗ヒト悪性神経膠腫モノクローナル抗体（Ｃｏｔａｒａ、Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、本発明の方法により産生される抗ヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫モノクローナル抗体（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、本発明の方法により産生される抗ヒト固形腫瘍モノクローナル抗体（ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、本発明の方法により産生される抗ヒト結腸直腸癌モノクローナル抗体（ヨウ素１３１−ＭＮ−１４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、本発明の方法により産生される抗ヒト卵巣、腎臓、乳房および前立腺癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−２１０、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、本発明の方法により産生される抗ヒト結腸直腸および膵臓癌モノクローナル抗体（ＴＴＭＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉｅ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）、本発明の方法により産生される抗ヒトＴＡＧ−７２発現癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−２２０、Ｍｅｄａｒｅｘ）、本発明の方法により産生される抗ヒトＥＧＦｒ発現癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−４４７）、本発明の方法により産生される抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、本発明の方法により産生される抗ヒト乳房、肺、前立腺および膵臓の癌および悪性黒色腫モノクローナル抗体（ＢｒｅｖａＲｅｘ、ＡｌｔａＲｅｘ）、ならびに本発明の方法により産生される抗ヒト急性骨髄性白血病モノクローナル抗体（モノクローナル抗体結合体、Ｉｍｍｕｎｅｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価である領域を含む抗体フラグメントおよび融合タンパク質に関する。
【００８５】
（ｉｉ．Ｆｃ媒介性細胞傷害性を促す免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質の生成および使用）
上記のように、本発明は、処置用抗体のＡＤＣＣ活性を増強するための方法に関する。これは、このような抗体のＦｃ領域のグリコシル化パターンを操作することにより、特にそれらのＦｃ領域の保存グリコシル化部位にＮ結合されるバイセクト複合オリゴ糖およびバイセクトハイブリッドオリゴ糖を保有する抗体分子の割合を最大にすることにより、達成される。この戦略は、処置用抗体によってだけでなく、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価である領域を保有する任意の分子により媒介される望ましくない細胞に対するＦｃ媒介性細胞傷害性を増強するために適用され得るが、これは、グリコシル化の操作により導入される変化が、Ｆｃ領域のみに、したがってＡＤＣＣメカニズムに関与するエフェクター細胞の表面のＦｃ受容体とのその相互作用に、影響を及ぼすためである。本明細書に開示された方法が適用され得るＦｃ含有分子としては、（ａ）Ｆｃ領域のＮ末端に融合されたターゲッティングタンパク質ドメインから作製される可溶性融合タンパク質（ＣｈａｍｏｖおよびＡｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：５２（１９９６））、および（ｂ）Ｆｃ領域のＮ末端に融合された原形質膜に局在化されるＩＩ型膜貫通ドメインから作製される原形質膜固定融合タンパク質（Ｓｔａｂｉｌａ，Ｐ．Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１３５７（１９９８））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
可溶性融合タンパク質（ａ）の場合、ターゲッティングドメインは、望ましくない細胞、例えば癌細胞との融合タンパク質の結合を指向する（すなわち処置用抗体と同様の様式である）。したがって、これらの分子により媒介されるＦｃ媒介性細胞性細胞毒活性を増強するためのここに開示された方法の適用は、処置用抗体に適用される方法と同一である。
【００８７】
膜固定融合タンパク質（ｂ）の場合、身体中の望ましくない細胞は、融合タンパク質をコードする遺伝子を発現しなければならない。これは、遺伝子療法の手法により、すなわち望ましくない細胞に対して融合タンパク質コード遺伝子の発現を指向するプラスミドまたはウイルスベクターを用いて、インビボで細胞をトランスフェクトすることによってか、あるいはそれらの表面に融合タンパク質を発現するよう遺伝的に操作された細胞の身体中への移植により、達成され得る。後者の細胞は、普通は、ポリマーカプセル内で身体に移殖される（カプセル化細胞療法）が、この場合、それらはＦｃ媒介性細胞傷害性メカニズムにより破壊され得ない。しかし、カプセル装置が故障すると、漏出細胞は望ましくないものになり、次いでそれらはＦｃ媒介性細胞傷害性により排除され得る（Ｓｔａｂｉｌａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１３５７（１９９８））。この場合、ＧｎＴＩＩＩの適切または最大発現レベルを指向する付加的遺伝子発現カセットを遺伝子療法ベクター中に組み入れることによってか、あるいは適切または最大レベルのＧｎＴＩＩＩを発現するために移殖されるよう細胞を操作することにより、本明細書中に開示された方法が適用される。両方の場合、開示された方法の目的は、バイセクト複合オリゴ糖および／またはバイセクトハイブリッドオリゴ糖を保有する表面提示Ｆｃ領域の割合を増大するかまたは最大にすることである。
【００８８】
以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明する。以下の調製物および実施例は、当業者に本発明をより明確に理解させ、本発明を実施させるために示している。しかし、本発明は、本発明の単一の態様の説明として意図されているに過ぎない例示的実施形態の範囲内に限定されず、機能的に等価である方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書中に記載されたものの他の本発明の種々の修正は、上記の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内であるよう意図される。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
（ＩＤＥＣ−ＣＥＢ８産生細胞株のグリコシル化操作により得られる、増強された抗体依存性細胞傷害性を有する、キメラ抗ＣＤ２０抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の新規バージョン）
ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８のＶＨおよびＶＬのコード領域の合成ならびに哺乳動物発現ベクターの構築。ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて、一段階法で、一組の重複一本鎖オリゴヌクレオチドから構築した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：５００−５０３（１９９７））。国際公開特許出願（国際公開番号ＷＯ９４／１１０２６）から、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８
ＶＬおよびＶＨをコードするオリジナル配列データを得た。構築されたＶＬおよびＶＨｃＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）にサブクローニングし、配列決定して、オリジナルアミノ酸残基配列を変更せずに、可変領域および定常領域接合部に導入された独特の制限部位を用いて、それぞれヒト定常軽鎖（Ｉｇκ）および重鎖（ＩｇＧ１）ｃＤＮＡへの連結により直接結合した（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）；Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５−４４５（１９９４））。各完全長ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に個別にサブクローニングし、キメラＣ２Ｂ８軽鎖（ｐＣ２Ｂ８Ｌ）および重鎖（ｐＣ２Ｂ８Ｈ）に関する哺乳動物発現ベクターを得た。
【００９０】
異なるレベルのＧｎＴＩＩＩを発現するＣＨＯ細胞中でのＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の産生。２つのＣＨＯ細胞株、すなわち培地中のテトラサイクリン濃度に依存して異なるレベルのＧｎＴＩＩＩを発現するＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ；およびＧｎＴＩＩＩを発現しない親細胞株であるＣＨＯ−ｔＴＡの確立は、以前に記載されている（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）；Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５：５４２−５４９（１９９９））。リン酸カルシウム法を用いて、各細胞株に、ベクターｐＣ２Ｂ８Ｌ、ｐＣ２Ｂ８ＨおよびｐＺｅｏＳＶ２（＋）（ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性に関して；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を同時トランスフェクトした。ゼオシン耐性クローンを９６ウエルプレートに移して、ヒト定常領域に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８産生に関してアッセイした（４）。選定クローン（ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ−Ｃ２Ｈ８）の並行培養から３つのＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８サンプルを得て、テトラサイクリン濃度のみを変えて、培地に添加した（それぞれ２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬおよび２０００ｎｇ／ｍＬ）。培養上清を後期対数期に回収した。同一条件下で、しかし培地にテトラサイクリンを添加せずに培養したＣＨＯ−ｔＴＡ由来クローンであるＣＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８から、さらに別の抗体サンプルを得た。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより抗体サンプルを培地から精製し、上記のように陽イオン交換カラムで緩衝液をＰＢＳに交換した（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。標準として用いられるリツキシマブを有するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製の蛍光ベースのキット（Ｌｅｉｄｅｎ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、抗体濃度を測定した。
【００９１】
間接的免疫蛍光法。ＣＤ２０陽性細胞（ＳＢ細胞；ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２０）およびＣＤ２０陰性細胞（ＨＳＢ細胞；ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２０．１）を各々、ハンクス平衡塩溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の２．５μｇ／ｍｌのＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ由来ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８抗体、および２％ウシ血清アルブミン分画Ｖ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（ＨＢＳＳＢ）とともに１時間インキュベートした。陰性コントロールとして、ＨＢＳＳＢをＣ２Ｂ８抗体の代わりに用いた。ＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＦｃポリクローナル抗体を、全サンプルに関して、二次抗体（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）として用いた。ライカ蛍光顕微鏡（Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、細胞を検査した。
【００９２】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによるオリゴ糖プロファイリング 上記（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））のように、Ｃ２Ｂ８抗体サンプル、ＭａｂＴｈｅｒａＴＭ（リツキシマブの欧州等価物；Ｒ．Ｓｔａｈｅｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｐｉｔａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの御厚意により得た）、Ｃ２Ｂ８−２５ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔおよびＣ２Ｂ８−ｎｔ（各々１００μｇ）から、中性Ｎ結合型オリゴ糖を得た。要するに、抗体サンプルをまず、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｉｎｇｓｏｎ，ＵＫ）で処理して、いかなるシアル酸単糖残基をも除去した。次に、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、中性Ｎ結合型オリゴ糖を脱シアリル化抗体サンプルから放出し、微小カラムを用いて精製して、Ｅｌｉｔｅ Ｖｏｙａｇｅｒ ４００分光計（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）でＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。
【００９３】
ＡＤＣＣ活性アッセイ。フィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｅｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）勾配上での遠心分離により、ヘパリン処理新鮮ヒト血液（全実験において、同一健常ドナーから得た）から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。プラスチック接着により、ＰＢＭＣ（エフェクター）から単球を枯渇させた。ＣＤ２０陽性ＳＢ（標的）細胞を、３７℃で、１００μＣｉ５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｄｅｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて９０分間標識し、ＲＰＭＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で２回洗浄して、１０５細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。ＲＰＭＩ培地中に希釈したＣ２Ｂ８ｍＡｂ ５０μｌを、９６ウエル丸底マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｌａｎｇｅｎｔｈａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の１００μｌのＳＢ細胞（１０，０００細胞／ウエル）に添加し、５０×ｇで１分間遠心分離し、４℃で１時間インキュベートした。その後、エフェクター細胞（ＲＰＭＩ培地中に２×１０７細胞／ｍｌで懸濁）５０μｌを各９６ウエルに添加して、最終Ｅ：Ｔ比１００を得た。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートし、Ｓｋａｔｒｏｎ回収システム（Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて回収し、コブラ（Ｃｏｂｒａ）０５００５γ計数器（Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）で計数した（ＥＲ、実験的放出）。Ｃ２Ｂ８ｍＡｂの代わりに、それぞれ１００μｌの１％Ｎｏｎｉｄｅｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）または１００μｌのＲＰＭＩ培地を１００μｌの標識標的細胞に添加することにより、最大（ＭＲ）および自発性放出（ＳＲ）を得た。データポイントはすべて、三連で実施した。以下の式：（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００を用いて、特異的溶解（％）を算定した。
【００９４】
（結果および考察）
ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の産生および特異的抗原結合の立証。ＧｎＴＩＩＩの安定テトラサイクリン調節発現およびＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の安定構成性発現を示すＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ細胞を確立し、一組の抗体サンプルの産生のためにスケールアップした。スケールアップ中、同一クローンからの並行培養を、３つの異なるテトラサイクリン濃度、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌおよび２０００ｎｇ／ｍｌ下で増殖させた。これらのレベルのテトラサイクリンは、異なるレベルのＧｎＴＩＩＩおよびバイセクトオリゴ糖を生じることが以前に示されている（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）；Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５：５４２−５４９（１９９９））。ＧｎＴＩＩＩを発現しないＣ２Ｂ８産生コントロール細胞株も確立し、ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩの３つの並行培養に関するのと同一条件下で培養した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により、ｍＡｂ純度を９５％より高いと概算した。それらの産生のために培養培地に添加されたテトラサイクリン濃度に従い、サンプルを以下のように命名した：Ｃ２Ｂ８−２５ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔおよびＣ２Ｂ８−ｎｔ（すなわち非バイセクトコントロールに関しては無テトラサイクリン）。サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、ＣＤ２０陽性細胞およびＣＤ２０陰性細胞を用いた間接的免疫蛍光法により、特異的抗原結合を示したが（図１）、これは、合成ＶＬおよびＶＨの遺伝子フラグメントが機能的に誤りがなかったことを示す。
【００９５】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳを用いたオリゴ糖プロファイリング 放出中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより、各抗体サンプルのグリコシル化プロフィールを分析した。この技法では、異なる質量のオリゴ糖は、スペクトルにおいて別個のピークとして現れ、それらの割合は、相対的ピーク高により定量的に反映される（Ｈａｒｖｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：６１４−６１９（１９９３）；Ｈａｒｖｅｙ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．１５：３３３−３３８（１９９８））。オリゴ糖構造は、それらの予測分子量、同一宿主中で産生されるＩｇＧＩ ｍＡｂ由来のオリゴ糖に関する過去の構造データ、ならびにＮ結合型オリゴ糖生合成経路に関する情報に基づいて異なるピークに割り当てられた。
【００９６】
ＧｎＴＩＩＩ発現レベル（すなわちテトラサイクリン濃度）と異なる抗体サンプルから得られるバイセクト（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）オリゴ糖の量との間に、明らかな相関が見出された。予測どおり、ＧｎＴＩＩＩを発現しない宿主から得られるＭａｂＴｈｅｒａＴＭおよびＣ２Ｂ８−ｎｔは、バイセクトオリゴ糖を保有しなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。これに対比して、バイセクト構造は、サンプルＣ２Ｂ８−２０００ｔ中で、すなわちＧｎＴＩＩＩ発現の基底レベルで、オリゴ糖プールの約３５％までに達した。この場合、主なバイセクトオリゴ糖ピークは複合型であり、ｍ／ｚ１６８９およびｍ／ｚ１８５１のピークに明確に割り当てられた（図２Ｃ）。次のより高いＧｎＴＩＩＩ発現レベル、サンプルＣ２Ｂ８−５０ｔは、約２０％のこれらのピーク（ｍ／ｚ１７０５およびｍ／ｚ１８６１でのそれらの会合カリウム付加物を含む）の増大をもたらした。この増大は、それぞれｍ／ｚ１４８６およびｍ／ｚ１６４８でのそれらの非バイセクト等価物の同時低減を伴った（図２Ｄ）。最高ＧｎＴＩＩＩ発現レベルでは、ＧｎＴＩＩＩ、ｍ／ｚ１４８６に関する主基質であるサンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、ほぼベースラインレベルに低減したが、複合バイセクト構造（ｍ／ｚ１６８９および１８５１）は、ｍ／ｚ１６６４、１８１０および１８２６でのピークの増大を有利に低減した（図２Ｅ）。これらのピークは、バイセクトハイブリッド化合物、ガラクトシル化複合オリゴ糖、または両方の混合物に割り当てられ得る。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩ過剰発現は経路の初期段階での生合成の流れを方向転換し得るので、それらの相対的増加は、バイセクトハイブリッド化合物の蓄積と一致する（図３Ａおよび３Ｂ参照）。バイセクトオリゴ糖構造（複合型およびハイブリッド型）の量は、このサンプルに関しては約８０％に達した。
【００９７】
（ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８グリコシル化改変体のＡＤＣＣ活性）
異なるＣ２Ｂ８ｍＡｂグリコシル化改変体を、ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞のインビトロ溶解として測定したＡＤＣＣ活性について比較した。ＧｎＴＩＩＩを欠いている親細胞株由来の、さらに別のｍＡｂサンプルであるＣ２Ｂ８−ｎｔも試験した。基底ＧｎＴＩＩＩ発現レベルで産生され、低レベルのバイセクトオリゴ糖を保有するサンプルＣ２Ｂ８−２０００ｔは、Ｃ２Ｂ８−ｔよりわずかに活性であった（図４Ａ）。ＧｎＴＩＩＩ発現の次に高いレベルでは、サンプルＣ２Ｂ８−５０ｔはほぼ等レベルのバイセクトオリゴ糖および非バイセクトオリゴ糖を保有したが、有意により高い標的細胞溶解を媒介しなかった。しかしながら、最低テトラサイクリン濃度では、８０％までのバイセクトオリゴ糖構造を含有するサンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、全抗体濃度範囲で、残りのサンプルより有意に活性であった。Ｃ２Ｂ８−２５ｔは１０分の１の抗体濃度で、サンプルＣ２Ｂ８−ｎｔの最大レベルのＡＤＣＣ活性に達した（図４Ａ）。サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、コントロールに関しての最大ＡＤＣＣ活性の有意の増強も示した（５０％対３０％溶解）。
【００９８】
最高比率のバイセクトオリゴ糖を保有するサンプルＣ２Ｂ８−５０ｔおよびＣ２Ｂ８−２５ｔを、欧州で一般に販売されているＲｉｔｕｘａｎＴＭのバージョンであるＭａｂｔｈｅｒａＴＭのＡＤＣＣ活性とさらに比較した（図４Ｂ）。サンプルＣ２Ｂ８−５０ｔは活性のわずかな増強を示したが、サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、全抗体濃度でＭａｂｔｈｅｒａＴＭより明らかに性能がよかった。マブテラ（商標）の最大ＡＤＣＣ活性に達するにはＣ２Ｂ８−２５ｔの約５〜１０分の１の濃度が必要であり、Ｃ２Ｂ８−２５ｔの最大活性は、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭより約２５％高かった。
【００９９】
これらの結果は、一般に、Ｃ２Ｂ８抗体のインビトロＡＤＣＣ活性がＦｃ領域中にバイセクトオリゴ糖を保有する分子の割合と相関することを示す。低ベースラインレベルのＡＤＣＣ活性を有する抗体であるｃｈＣＥ７の場合、活性の有意な増強は天然に存在する抗体で見出されるレベルを上回るバイセクトオリゴ糖の画分を増大することにより得られる、ということをわれわれは以前に報告した（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。同じことは、バイセクトオリゴ糖の非存在下で高ＡＤＣＣ活性をすでに有するＣ２Ｂ８ｍＡｂに当てはまる。しかしながらｃｈＣＥ７の場合、ＡＤＣＣ活性の非常に大きい増強が、バイセクトオリゴ糖が主として複合型のものであるＧｎＴＩＩＩ発現のレベルで観察された（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。強力なＣ２Ｂ８ｍＡｂに関しては、活性のこのような大きい増加は、研究したＧｎＴＩＩＩ発現の最高レベルで観察されただけあったが、この場合、バイセクトオリゴ糖は主にハイブリッド型に転じていた（図２）。両ｍＡｂに関して、最高活性を有するサンプルは、非バイセクトオリゴ糖よりかなり高レベルのバイセクトオリゴ糖を有した。これらの観察はともに、おそらくは複合およびハイブリッドのバイセクトオリゴ糖がともにＡＤＣＣ活性に重要であることを示す。
【０１００】
複合オリゴ糖およびハイブリッドオリゴ糖の両方において、バイセクトＧｌｃＮＡｃはオリゴ糖立体配座の大きい変化をもたらす（Ｂａｌａｊｉ，Ｐ．Ｖ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１８：１０１−１１４（１９９６））。変化は、ＣＨ２ドメインにおいてポリペプチドと広範に相互作用するオリゴ糖の一部で起こる（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８））。ポリペプチドはこの位置では比較的柔軟性であるため（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８））、バイセクトＮ−アセチルグルコサミンがＦｃ領域における配座変化によりその生物学的作用を媒介する可能性がある。すべての血清ＩｇＧはバイセクトオリゴ糖を保有するので、潜在的に変更された立体配座は天然ですでに存在する。操作された抗体と天然抗体との間の主な差は、より活性な立体配座を表示する分子の割合である。
【０１０１】
非結合体化ｍＡｂの活性を増強するための種々の手法は、現在、臨床評価（放射免疫療法、抗体依存性酵素／プロドラッグ療法、サイトカインを用いた免疫毒素およびアジュバント療法を含む）の下にある（Ｈｊｅｌｍ Ｓｋｏｇ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：４６３−４７０（１９９０）；Ｂｌａｋｅｙ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５：１７５−１８３（１９９４）；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｇ．Ａ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：３２８１ｓ−３２９６ｓ（１９９９）；Ｈａｎｋ，Ｊ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：５２３４−５２３９（１９９０））。これらの技法により活性が大きく増加し得るが、これらの技法は、非結合体化ｍＡｂと比較した場合、有意に高い副作用、生産コスト上昇、ならびに生産から患者への投与までの複雑なロジスティクスももたらし得る。ここに示した技法は、簡単な生産方法を維持しながら、効力の増強を得るための代替的方法を提供するものであって、多数の非結合体化ｍＡｂに適用可能であるべきである。
【０１０２】
（実施例２）
（ｃｈＧ２５０産生細胞株のグリコシル化操作により得られる抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う、抗腎細胞癌抗体ｃｈＧ２５０の新規バージョン）
（１．細胞培養）
ｃｈＧ２５０キメラｍＡｂを産生するＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（ｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞）を、１：１００（容量／容量）のペニシリン／ストレプトマイシン／抗真菌性溶液（ＳＩＧＭＡ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充した標準細胞培地中で増殖させた。細胞を、組織培養フラスコ中で５％ＣＯ２湿潤大気中、３７℃で培養した。培地を、３〜４日ごとに取り替えた。細胞を、１０％ＤＭＳＯを含有する培地中で凍結させた。
【０１０３】
（２．ｐＧｎＴＩＩＩ−ｐｕｒｏ発現を有するＳＰ２／０細胞の生成）
ＩＲＥＳを介してプロマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されるＧｎＴＩＩＩの構成性発現のためのベクターを用いて、電気穿孔により、ｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０ミエローマ細胞をトランスフェクトした。電気穿孔の２４時間前に、培地を取り替えて、細胞を５×１０５細胞／ｍｌで接種した。７００万個の細胞を、４℃にて１３００ｒｍｐで４分間、遠心分離した。細胞を３ｍＬの新しい培地で洗浄し、再び遠心分離した。培地中の１．２５％（容量／容量）ＤＭＳＯおよび２０〜３０μｇのＤＮＡを含有する反応混合物０．３〜０．５ｍｌの容量中に細胞を再懸濁した。次に電気穿孔混合物を０．４ｃｍキュベットに移して、遺伝子パルサー（Ｂｉｏ Ｒａｄ製）を用いて、低電圧（２５０〜３００Ｖ）および高キャパシタンス（９６０μＦ）でパルスをかけた。電気穿孔後、細胞を迅速にＴ２５培養フラスコ中の６ｍＬの１．２５％（容量／容量）ＤＭＳＯ培地に移して、３７℃でインキュベートした。電気穿孔後２日目に培地に２μｇ／ｍＬのプロマイシンを適用することにより、安定構成部分を選択した。２〜３週間後、安定したプロマイシン耐性混合集団を得た。単一細胞由来クローンをＦＡＣＳにより得て、その後、展開し、プロマイシン選択下で保持した。
【０１０４】
（３．ウエスタンブロット）
ウエスタンブロッティングにより、ＧｎＴＩＩＩ発現に関してプロマイシン耐性クローンをスクリーニングした。ウエスタンブロットは、クローン５Ｈ１２、４Ｅ６および４Ｅ８が最高レベルのＧｎＴＩＩＩを発現していることを明らかに示した。５Ｇ２も中強度のＧｎＴＩＩＩ帯域を示したが、２Ｆ１、３Ｄ３および４Ｇ３は最低帯域強度を有し、したがって低量のＧｎＴＩＩＩを発現した（図５）。
【０１０５】
（４．野生型を含めた７つのＧｎＴＩＩＩ発現クローンからのｃｈＧ２５０モノクローナル抗体の産生および精製）
クローン２Ｆ１、３Ｄ３、４Ｅ６、４Ｅ８、４Ｇ３、５Ｇ２、５Ｈ１２および野生型（ｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞）を、１３０ｍｌ培地の総容量中に３×１０５細胞／ｍＬで接種し、単一三重フラスコ中で培養した。接種のために用いた細胞は、すべて完
全対数増殖期であり、したがって細胞は、生産バッチ開始時に同一の増殖状態であったと考えられた。細胞を４日間培養した。抗体を含有する上清を後期対数増殖期に収集して、再現性を保証した。ｃｈＧ２５０モノクローナル抗体を、２クロマトグラフィー工程で精製した。各バッチから得られたｃｈＧ２５０モノクローナル抗体を含有する培養上清をまず、ＨｉＴｒａｐプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。プロテインＡは、ヒトＩｇＧＦｃ領域に高度に特異的である。プロテイン溶離物からのプールサンプルを、ＲｅｓｏｕｒｃｅＳ １ｍｌカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上での陽イオン交換クロマトグラフィーによりＰＢＳに緩衝液交換した。ＳＤＳ染色およびクーマシーブルー染色から、最終純度を９５％より高いと判定した（図６）。既知の濃度を有する野生型抗体を用いた標準較正曲線で、各サンプルの濃度を確定した。
【０１０６】
（５．異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現する７つのクローン由来のｍＡｂ調製物のオリゴ糖プロファイリング）
異なるオリゴ糖構造の分子量を正確に提供するマトリクス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）によって、オリゴ糖プロフィールを得た。この技法は、混合物内の異なるオリゴ糖構造間の割合の定量的分析を可能にする。中性オリゴ糖は、主に［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンとして出現したが、時としてそれらはより小さい［Ｍ＋Ｋ＋］イオンを伴い、ｍ／ｚ１６の質量増大をもたらした。カリウムイオン付加物として出現する構造のパーセンテージはマトリクスの含量に依存し、したがってサンプル間で変化し得る。各抗体調製物由来の中性Ｎ結合型オリゴ糖の混合物を、マトリクスとして２，５−デヒドロ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）を用いて分析した。既知の単糖組成および独特の質量のために、スペクトル中のピークのいくつかは、特定のオリゴ糖構造に明確に割り当てられた。しかしながら、多重構造はしばしば、特定の質量に割り当てられ得る。ＭＡＬＤＩによって質量を確定することはできるが、異性体間の区別はできない。生合成経路についての知識および過去の構造データは、ほとんどの場合に、スペクトル中のピークへのオリゴ糖構造の割り当てを可能にする。
【０１０７】
ＧｎＴＩＩＩを発現しないｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞株中で産生されたｍＡｂサンプル由来のオリゴ糖は、非バイセクトビアンテナリ（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）複合体（ｍ／ｚ１４８６）およびモノガラクトシル化非バイセクトビアンテナリ複合体構造またはジガラクトシル化非バイセクトビアンテナリ複合体構造（図７Ａ）（ともにコア領域でα（１，６）−フコシル化される）を含有した（それぞれピークｍ／ｚ１６４８および１８１０）。
【０１０８】
ＧｎＴＩＩＩの発現は、２つの型、すなわち複合型またはハイブリッド型のバイセクトＦｃ会合オリゴ糖構造を生じた。複合バイセクトオリゴ糖は明確に、ｍ／ｚ１５４３、１６８９、１７０５、１８５１および１８６７でのピークに割り当てられた（［Ｍ＋Ｋ＋］付加物）。予測どおり、バイセクトオリゴ糖の増大は、非バイセクト複合オリゴ糖に対応するピークｍ／ｚ１４８６および１６４８の同時低減を伴った。ＧｎＴＩＩＩ発現クローン由来の全サンプルに関して、ＧｎＴＩＩＩの主基質（ｍ／ｚ１４８６）は劇的に低減した。予測どおり、ｍ／ｚ１６４８のピークに割り当てられた非バイセクト複合オリゴ糖型のパーセンテージは、最高ＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン（クローン４Ｅ６、４Ｅ８、５Ｇ２および５Ｈ１２）に関して最低値を有した。これら２つのピークは、バイセクト複合型オリゴ糖およびバイセクトハイブリッド型オリゴ糖の蓄積を有利に低減した（図７Ａ〜図７Ｄおよび図８Ａ〜図８Ｄ）。バイセクト複合オリゴ糖のパーセンテージは、低量のＧｎＴＩＩＩを発現するクローン由来のサンプルではより低かった。これは、より高いＧｎＴＩＩＩ発現レベルがおそらくは生合成の流れをバイセクトハイブリッド構造に転向し、それにより複合体および複合バイセクト化合物の相対的割合を低減する、という事実と一致する。バイセクトハイブリッド構造に関しては、２つの考え得る構造がしばしば、単一ピークに割り当てられ得る。したがって、全オリゴ糖プール全体のこれらの構造のパーセンテージを概算するために、いくつかの仮定を行った。ピークｍ／ｚ１６６４、１６８０、１８１０および１８２６は、バイセクトハイブリッド型、ガラクトシル化複合オリゴ糖、またはそれらの混合物に割り当てられ得る。ｗｔ−抗体調製物がピーク１６６４の比較的低いパーセンテージを有したという事実により、異なるクローン由来の抗体サンプル中に有意量で出現するこのピークは完全に、バイセクトハイブリッド構造に対応すると仮定された（図７Ａ〜図７Ｄおよび図８Ａ〜図８Ｄ）。しかしながら、特定構造をピークｍ／ｚ１８１０および１８２６に割り当てるためには、さらなる特性化を実施しなければならない。要するに、ＧｎＴＩＩＩの過剰発現により、バイセクトオリゴ糖構造が生成され、それらの相対的割合はＧｎＴＩＩＩ発現レベルと相関した。
【０１０９】
（６．カルセイン−ＡＭ保持による抗体媒介性細胞毒活性の測定）
細胞傷害性を測定するカルセイン−ＡＭ保持法は、抗体を用いたインキュベーション後に細胞中に残留する染料蛍光を測定する。４００万個のＧ２５０抗原陽性細胞（標的）を、１０％ウシ胎仔血清を補充した１．８ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０細胞培地（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の１０μＭのカルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、５％ＣＯ２湿潤大気中で３７℃にて３０分間標識した。細胞を培地中で２回洗浄し、１２ｍＬのＡＩＭＶ無血清培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に再懸濁した。次に、標識細胞をＵ底９６ウェルに移し（３０，０００細胞／ウェル）、異なる濃度の抗体を用いて、４℃で１時間、三連でインキュベートした。フィコール−パック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）勾配上での遠心分離により、ヘパリン処理新鮮ヒト血液（全実験において、同一健常ドナーから得た）から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣを５０μＬ容量で三連ウェルに添加し、２５：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）および２００μＬの最終容量を生じた。次に９６ウエルプレートを、５％ＣＯ２大気中で３７℃にて４時間インキュベートした。その後、９６ウエルプレートを７００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、２００μＬの０．０５Ｍ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９、０．１％トリトンＸ−１００中で溶解した。標的細胞中の蛍光染料の保持を、ＦＬＵＯｓｔａｒ微小プレート読取器（ＢＭＧ ＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。抗体に曝露する代わりに、サポニン（ＡＩＭＶ中２００μｇ／ｍＬ；ＳＩＧＭＡ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に標的細胞を曝露することにより、特異的溶解を総溶解コントロールに関して算定した。以下の式を用いて、特異的溶解（％）を算定した：
細胞傷害性％＝（Ｆｍｅｄ−Ｆｅｘｐ）／（Ｆｍｅｄ−Ｆｄｅｔ）
（式中、Ｆｍｅｄは培地単独で処理した標的細胞の蛍光を表し、ＰＭＢＣによる非特異的溶解を考察し、Ｆｅｘｐは抗体で処理した細胞の蛍光を表し、Ｆｄｅｔは抗体の代わりにサポニンで処理した細胞の蛍光を表す）。
【０１１０】
インビトロＡＤＣＣ活性に対するｃｈＧ２５０の修飾グリコシル化改変体の効果を確定するために、Ｇ２５０抗原陽性標的細胞を、異なる濃度のｃｈＧ２５０抗体サンプルを用いて、および用いずに、ＰＢＭＣを用いて培養した。野生型細胞株由来の非修飾ｃｈＧ２５０抗体の細胞傷害性を、それぞれ中度および高度のＧｎＴＩＩＩレベルを発現する２つの細胞株（３Ｄ３、５Ｈ１２）由来の２つの抗体調製物と比較した（図５参照）。
【０１１１】
非修飾ｃｈＧ２５０抗体は、アッセイで用いられる濃度範囲全体で有意のＡＤＣＣ活性を媒介しなかった（活性はバックグラウンドと有意に異ならなかった）。２μｇ／ｍＬでのＡＤＣＣ活性の増強（ほぼ２０％、図９参照）は、中度のＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン３Ｄ３由来の抗体サンプルを用いて観察された。この抗体サンプルの細胞毒活性は、より高い抗体濃度では増殖しなかった。予測どおり、クローン５Ｈ１２由来の抗体調製物は、標的細胞に対してＡＤＣＣを媒介するその能力において、サンプル３Ｄ３および非修飾抗体全体で顕著な増強を示した。この抗体調製物の最大ＡＤＣＣ活性は約５０％であり、非修飾コントロールサンプルと比較した場合、１２５分の１の濃度で、有意のＡＤＣＣ活性を顕著に媒介した。
【０１１２】
（実施例３）
（慢性対宿主性移植片病を有する患者における免疫媒介性血小板減少症の処置）
慢性対宿主性移植片病における自己免疫血小板減少症は、臨床疾患を引き起こすＢ細胞調節不全の一例を示す。慢性対宿主性移植片病を有する被験者における免疫媒介性血小板減少症を処置するために、本発明の方法により調製され、ＡＤＣＣの増強を伴う抗ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体を、Ｒａｔａｎａｔｈａｒａｔｈｏｒｎ，Ｖ．ら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３３（４）：２７５−７９（２０００）（この記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されたように被験者に投与する。特に、抗体３７５ｍｇ／ｍ２の毎週注入を被験者に４週間施した。抗体療法は、末梢血中のＢ細胞の顕著な枯渇ならびに血小板関連抗体レベルの低減を生じた。
【０１１３】
（実施例４）
（重症免疫媒介性赤芽球ろうおよび溶血性貧血の処置）
免疫媒介性後天性赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）は、しばしばその他の自己免疫現象に関連するまれな障害である。被験者における免疫媒介性後天性赤芽球ろうを処置するために、本発明の方法により調製され、ＡＤＣＣの増殖を伴う抗ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体を、Ｚｅｃｃａ，Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ １２：３９９５−９７（１９９７）（この記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されたように、被験者に投与する。特に、ＰＲＣＡおよび自己免疫性溶血性貧血を有する被験者には、抗体３７５ｍｇ／ｍ２／週を２用量投与する。抗体療法後、静脈内免疫グロブリンを用いた変換処置を開始する。この処置は、Ｂ細胞の顕著な枯渇およびヘモグロビンレベル増大を伴う網状赤血球数の有意の増大を生じる。
【０１１４】
本発明は、上記の説明および実施例に特に記載されたものと別の方法で実行され得ることは明らかである。本発明の多数の変更および改変は上記の教示にかんがみて可能であり、したがって添付の特許請求の範囲内である。
【０１１５】
本明細書中に引用された全出版物（特許、特許出願、季刊誌、実験マニュアル、書籍またはその他の文を含む献）の開示内容はすべて、参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞に対する抗体調製物Ｃ２Ｂ８−２５ｔの反応性を示す間接的免疫蛍光アッセイ。陰性コントロール（ＨＳＢ ＣＤ２０陰性細胞株を含む）および二次ＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＦｃポリクローナル抗体だけで処理された細胞は示されていない。
【図２Ａ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図２Ｂ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図２Ｃ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図２Ｄ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図２Ｅ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図３】典型的なヒトＩｇＧ Ｆｃ会合オリゴ糖構造（Ａ）および部分的Ｎ結合型グリコシル化経路（Ｂ）の説明。（図３Ａ）オリゴ糖のコアは、Ａｓｎ２９７に結合される３個のマンノース（Ｍ）および２個のＮ−アセチルグルコサミン（Ｇｎ）の単糖残基で構成される。ガラクトース（Ｇ）、フコース（Ｆ）およびバイセクトＮ−アセチルグルコサミン（Ｇｎ、矩形）は、存在する場合もしない場合もある。末端Ｎ−アセチルノイラミン酸も存在し得るが、図中に含まれていない。（図３Ｂ）部分的Ｎ結合型グリコシル化経路は、主要なオリゴ糖クラス（点線枠）の生成をもたらす。バイセクトＮ−アセチルグルコサミンは、Ｇｎｂとして示される。下付数字は、各オリゴ糖中に存在する単糖残基の数を示す。各構造は、そのナトリウム関連［Ｍ＋Ｎａ＋］質量と一緒に出現する。フコース（ｆ）を含有する構造の質量も含まれる。
【図４Ａ】Ｒｉｔｕｘｉｍａｂグリコシル化改変体のＡＤＣＣ活性。異なるｍＡｂ濃度により媒介されるヒトリンパ球（Ｅ：Ｔ比１００：１）による５１Ｃｒ標識ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞の溶解により、細胞傷害性のパーセンテージを測定した。（図４Ａ）しかし、単一細胞株由来のＣ２Ｂ８サンプルの活性は、漸増ＧｎＴＩＩＩ発現レベル（すなわち漸減テトラサイクリン濃度）を生じた。サンプルは、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、Ｃ２Ｂ８−２５ｔおよびＣ２Ｂ８−ｎｔ（ＧｎＴＩＩＩを発現しないクローン由来のコントロールｍＡｂ）である。（図４Ｂ）Ｃ２Ｂ８−５０ｔおよびＣ２Ｂ８−２５ｔのＡＤＣＣ活性を、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭと比較した。
【図４Ｂ】Ｒｉｔｕｘｉｍａｂグリコシル化改変体のＡＤＣＣ活性。異なるｍＡｂ濃度により媒介されるヒトリンパ球（Ｅ：Ｔ比１００：１）による５１Ｃｒ標識ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞の溶解により、細胞傷害性のパーセンテージを測定した。（図４Ａ）しかし、単一細胞株由来のＣ２Ｂ８サンプルの活性は、漸増ＧｎＴＩＩＩ発現レベル（すなわち漸減テトラサイクリン濃度）を生じた。サンプルは、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、Ｃ２Ｂ８−２５ｔおよびＣ２Ｂ８−ｎｔ（ＧｎＴＩＩＩを発現しないクローン由来のコントロールｍＡｂ）である。（図４Ｂ）Ｃ２Ｂ８−５０ｔおよびＣ２Ｂ８−２５ｔのＡＤＣＣ活性を、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭと比較した。
【図５】７つのＧｎＴＩＩＩ発現クローンおよび野生型のウエスタンブロット分析。各サンプル３０μｇを８．７５％ＳＤＳゲル上にロードし、ＰＶＤＦ膜に移して、抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０）でプローブした。ＷＴはｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞をいう。
【図６】分解精製抗体サンプルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。
【図７Ａ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン、ならびにｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞：ＷＴ（図７Ａ）、２Ｆ１（図７Ｂ）、３Ｄ３（図７Ｃ）、４Ｅ６（図７Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図７Ｂ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン、ならびにｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞：ＷＴ（図７Ａ）、２Ｆ１（図７Ｂ）、３Ｄ３（図７Ｃ）、４Ｅ６（図７Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図７Ｃ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン、ならびにｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞：ＷＴ（図７Ａ）、２Ｆ１（図７Ｂ）、３Ｄ３（図７Ｃ）、４Ｅ６（図７Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図７Ｄ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン、ならびにｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞：ＷＴ（図７Ａ）、２Ｆ１（図７Ｂ）、３Ｄ３（図７Ｃ）、４Ｅ６（図７Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図８Ａ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン：４Ｅ８（図８Ａ）；５Ｇ２（図８Ｂ）；４Ｇ３（図８Ｃ）；５Ｈ１２（図８Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図８Ｂ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン：４Ｅ８（図８Ａ）；５Ｇ２（図８Ｂ）；４Ｇ３（図８Ｃ）；５Ｈ１２（図８Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図８Ｃ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン：４Ｅ８（図８Ａ）；５Ｇ２（図８Ｂ）；４Ｇ３（図８Ｃ）；５Ｈ１２（図８Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図８Ｄ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン：４Ｅ８（図８Ａ）；５Ｇ２（図８Ｂ）；４Ｇ３（図８Ｃ）；５Ｈ１２（図８Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図９】コントロールｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／−細胞およびＧｎＴＩＩＩトランスフェクト（ｔｒａｎｓｅｃｔ）クローン３Ｄ３および５Ｈ１２由来の抗体サンプルのインビトロＡＤＣＣアッセイ。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、タンパク質のグリコシル化操作の分野に関する。より詳細には、本発明は、改良された処置的特性を有するタンパク質（抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う抗体）を生成するためのグリコシル化操作に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
糖タンパク質は、ヒト、その他の真核生物およびいくつかの原核生物における多数の不可欠な機能（触媒作用、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション、ならびに分子認識および会合）を媒介する。それらは、真核生物において非細胞質ゾルタンパク質の大部分を構成する（Ｌｉｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７（１９９３））。多数の糖タンパク質が処置目的のために開発されてきており、過去２０年の間、天然に存在する分泌糖タンパク質の組換えバージョンが生物工学産業の主要な産物であった。例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、処置用モノクローナル抗体（処置用ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が挙げられる（Ｃｕｍｍｉｎｇら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−１３０（１９９１））。
【０００３】
オリゴ糖成分は、処置用糖タンパク質の有効性に関係のある特性（物理学的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態および特異的生物学的活性）に有意に影響を及ぼし得る。このような特性は、オリゴ糖の存在または非存在だけでなく、その特異的構造に依存し得る。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能との間のいくつかの一般化がなされ得る。例えば、特定のオリゴ糖構造は、特定の糖質結合タンパク質との相互作用による血流からの糖タンパク質の迅速クリアランスを媒介するが、他のオリゴ糖構造は、抗体により結合され、望ましくない免疫反応を誘発し得る（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。
【０００４】
哺乳動物細胞は、ヒト適用のために最も適合した形態でタンパク質をグリコシル化するこれらの能力に起因して、処置用糖タンパク質の産生のために好ましい宿主である（Ｃｕｍｍｉｎｇら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−３０（１９９１）；Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。細菌がタンパク質をグリコシル化することは非常に稀であり、同様に他の型の一般的な宿主（例えば酵母、糸状菌、昆虫および植物細胞）は、血流からの迅速なクリアランス、望ましくない免疫相互作用、およびいくつかの特定の場合には減少した生物学的活性に関連した、グリコシル化パターンを生じる。哺乳動物細胞の中でも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、過去２０年間、最も一般的に用いられてきた。適切なグリコシル化パターンを示すことに加えて、これらの細胞は、遺伝的に安定な、高度に生産的なクローン細胞株の一貫した生成を可能にする。それらは、無血清培地を用いた単純なバイオリアクター中で高密度に培養されることができ、安全且つ再現可能な生物プロセスの開発を可能にする。その他の一般的に用いられる動物細胞としては、新生仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０−マウスミエローマ細胞およびＳＰ２／０−マウスミエローマ細胞が挙げられる。さらに最近、トランスジェニック動物からの産生も試験されている（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５−８１（１９９６））。
【０００５】
抗体はすべて、重鎖定常領域の保存位置に糖質構造を含有し、各アイソタイプはＮ結合型糖質構造の異なるアレイを保有し、これがタンパク質のアセンブリー、分泌または機能的活性に様々な影響を及ぼす（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７））。付着Ｎ結合型糖質の構造は、プロセシングの程度に依存してかなり変化し、高マンノース、多分枝、ならびにビアンテナリ（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）複合オリゴ糖を包含し得る（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７））。典型的には、モノクローナル抗体でさえ多様なグリコフォーム（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）として存在するよう、特定のグリコシル化部位に結合されるコアオリゴ糖構造の不均質プロセシングが存在する。同様に、抗体グリコシル化における大きな差異は細胞株間で起こり、異なる培養条件下で増殖された所定の細胞株に関しては、小さな差異さえも観察される、ということが示された（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（８）：８１３−２２（１９９５））。
【０００６】
非結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞、下級または濾胞性非ホジキンリンパ腫の処置のためのＲｉｔｕｘｉｍａｂ（ＲｉｔｕｘａｎＴＭ；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）および進行性乳癌の処置のためのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ，）についての米国食品医薬品局の認可により実証されたような、癌の処置に有用な薬であり得る（Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ａ．−Ｊ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６６−７３（１９９９）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−１８（１９９９））。これらの製品が成功したのは、その効力のためだけでなく、その顕著な安全プロフィールのためでもある（Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ａ．−Ｊ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６６−７３（１９９９）Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−１８（１９９９））。これら２つの薬剤の業績にもかかわらず、非結合ｍＡｂ療法により通常得られるものより高い特異的抗体活性を得ることに現在大きな関心がある。
【０００７】
簡単な製造方法を維持し、有意の望ましくない副作用を潜在的に回避しながら、効力を大きく高めるための一方法は、ｍＡｂの天然の細胞媒介性エフェクター機能を、それらのオリゴ糖成分を操作することにより強化することである（Ｕｍａｎ〜ａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。癌免疫療法において最も一般的に用いられる抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各々のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存Ｎ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合される２つの複合ビアンテナリオリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋められて、ポリペプチドバックボーンとの広範な接触を形成するため、それらの存在は、抗体がエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するために不可欠である（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２（１９９５）；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８）；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３２（１９９７））。
【０００８】
バイセクト（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）オリゴ糖の生成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中での過剰発現が、操作されたＣＨＯ細胞により産生される抗神経芽細胞腫キメラモノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増強する、ということを以前に本発明者等は示した（非特許文献１、特許文献１参照）（これら各々の記載内容全体が、この全体を参考として本明細書中に援用される）。抗体ｃｈＣＥ７は、高腫瘍親和性および特異性を有するが、効力が弱すぎるためにＧｎＴＩＩＩ酵素を欠く、標準的な工業用の細胞株中で産生される場合に臨床的に有用ではない非結合ｍＡｂの大きいクラスに属する（非特許文献１）。その試験は、天然に存在する抗体に見出されるレベルを上回るように定常領域（Ｆｃ）関連バイセクトオリゴ糖の割合を増大することにより、最大インビトロＡＤＣＣ活性を大きく高めることができることを示した最初のものであった。この発見が、バイセクトオリゴ糖の非存在下で有意のＡＤＣＣ活性をすでに有する非結合ｍＡｂに外挿され得るか否かを確定するために、本発明者等は、この技術を、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、抗ＣＤ２０、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８キメラ抗体に適用した。本発明者等は、同様に本技術を非結合抗癌ｍＡｂ ｃｈＧ２５０に適用した。
【特許文献１】国際公開第９９／５４３４２号パンフレット
【非特許文献１】Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な概要）
テトラサイクリン調節様式で、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ；ＥＣ２．１．４．１４４）を過剰発現する遺伝子操作されたｍＡｂ産生細胞株を用いて、抗−ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）および抗癌ｍＡｂ ｃｈＧ２５０の新規のグリコシル化改変体を、本発明者等はここに生成した。ＧｎＴＩＩＩは、天然に存在するヒト抗体中に低から中レベルで見出されるが、標準工業細胞株中に産生されるｍＡｂを欠いているバイセクトオリゴ糖の合成に必要とされる。新規のグリコシル化バージョンは、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（欧州で販売されているＲｉｘｔｕｘｉｍａｂのバージョン）およびマウスミエローマ由来ｃｈＧ２５０より生物学的（ＡＤＣＣ）活性が優れていた。例えば、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭのような最大ＡＤＣＣ活性に達するために必要とされる量は、最高レベルのバイセクトオリゴ糖を保有する改変体では１０分の１であった。ｃｈＧ２５０に関しては、最高レベルのバイセクトオリゴ糖を保有する改変体は、非修飾コントロールｃｈＧ２５０にさらに低いＡＤＣＣ活性を検出するために必要とされるものの１２５分の１の濃度で有意のＡＤＣＣ活性を媒介した。ＧｎＴＩＩＩ発現およびＡＤＣＣ活性のレベル間に明らかな相関が見出された。
【００１０】
したがって、一局面において、本発明は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする少なくとも１つの核酸の発現によりＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴うポリペプチドを産生するよう操作された宿主細胞であって、上記宿主細胞により産生される上記ポリペプチドは、全抗体分子、抗体フラグメントおよび免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質から成る群から選択され、上記ＧｎＴＩＩＩは、Ｆｃ領域中にバイセクト複合オリゴ糖を保有するポリペプチドと比較して、Ｆｃ領域中にバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合オリゴ糖あるいはそれらの混合物を保有する上記ポリペプチドの割合を増大するのに十分な量で発現される宿主細胞に関する。
【００１１】
好ましい実施形態では、上記ポリペプチドはＩｇＧまたはそのフラグメントであり、最も好ましくはＩｇＧ１またはそのフラグメントである。さらに好ましい実施形態では、上記ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質である。
【００１２】
本特許請求される発明の別の局面では、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が、上記宿主中に導入された。好ましい実施形態では、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子が上記宿主細胞染色体中に導入された。
【００１３】
あるいは、宿主細胞は、例えば遺伝子発現を増強するＤＮＡ要素の宿主染色体中への挿入により内因性ＧｎＴＩＩＩ遺伝子が活性化されるよう、操作された。好ましい実施形態では、内因性ＧｎＴＩＩＩは、宿主細胞染色体中への、プロモーター、エンハンサー、転写因子結合部位、トランスポゾンまたはレトロウイルス要素、あるいはそれらの組合せの挿入により活性化された。別の局面では、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩの発現を誘発する突然変異を保有するよう選択された。好ましくは宿主細胞は、ＣＨＯ細胞変異体ｌｅｃ１０である。
【００１４】
本特許請求される発明のさらに好ましい実施形態では、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸が構成的プロモーター要素に作動可能に連結される。
【００１５】
さらに好ましい実施形態では、上記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、またはハイブリドーマ細胞、Ｙ０ミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞であり、上記ポリペプチドは、抗ＣＤ２０抗体である。別の好ましい実施形態では、宿主細胞はＳＰ２／０細胞であり、上記ポリペプチドはモノクローナル抗体ｃｈＧ２５０である。
【００１６】
別の局面では、本特許請求される発明は、抗体分子、抗体フラグメントまたは免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸をさらに含む宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、上記宿主細胞は、抗ＣＤ２０抗体、キメラ抗ヒト神経芽細胞腫モノクローナル抗体ｃｈＣＥ７、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０、キメラ抗ヒト結腸、肺および乳癌モノクローナル抗体ＩＮＧ−１、ヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体３６２２Ｗ９４、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体Ａ３３、ＧＤ３ガングリオシドＲ２４に対して向けられる抗ヒト黒色腫抗体、またはキメラ抗ヒト扁平上皮細胞癌モノクローナル抗体ＳＦ−２５、抗ヒトＥＧＦＲ抗体、抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗ヒトＰＳＭＡ抗体、および抗ヒトＰＳＣＡ抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗ヒトＣＤ３０抗体、抗ヒトＣＤ３３抗体、抗ヒトＣＤ３８抗体、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ４５抗体、抗ヒトＣＤ５２抗体、抗ヒトＣＤ１３８抗体、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ改変体抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体、抗ヒトＣＥＡ抗体、抗ヒトＭＵＣ１抗体、抗ヒトＭＵＣ１コアタンパク質抗体、抗ヒト異常グリコシル化ＭＵＣ１抗体、ＥＤ−Ｂドメインを含有するヒトフィブロネクチン改変体に対する抗体、および抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を含む。
【００１７】
別の局面において、本特許請求される発明は、宿主細胞中でのポリペプチドの産生方法であって、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う上記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で上記宿主細胞のいずれかを培養することを包含する方法に関する。好ましい実施形態では、上記方法は、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う上記ポリペプチドを単離することをさらに包含する。
【００１８】
さらに好ましい実施形態では、上記宿主細胞は、免疫グロブリンのグリコシル化Ｆｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む。
【００１９】
好ましい実施形態では、上記ポリペプチドのＦｃ領域中のバイセクトオリゴ糖の割合は、５０％より大きく、より好ましくは７０％より大きい。別の実施形態では、Ｆｃ領域中のバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合体オリゴ糖あるいはそれらの混合物の割合は、上記ポリペプチドのＦｃ領域中のバイセクト複合オリゴ糖の割合より大きい。
【００２０】
本特許請求される方法の好ましい局面では、上記ポリペプチドは、抗ＣＤ２０抗体であり、上記宿主細胞により産生される抗ＣＤ２０抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した場合に、図２Ｅに示されたものと実質的に等価であるグリコシル化プロフィールを有する。
【００２１】
本特許請求される方法の別の好ましい局面では、上記ポリペプチドは、ｃｈＧ２５０モノクローナル抗体であり、上記宿主細胞により産生されるｃｈＧ２５０抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した場合に、図７Ｄに示されたものと実質的に等価であるグリコシル化プロフィールを有する。
【００２２】
さらなる局面では、本特許請求される発明は、上記の方法のいずれかにより産生される抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を伴う抗体に関する。好ましい実施形態では、抗体は、抗ＣＤ２０抗体、ｃｈＣＥ７、ｃｈ−Ｇ２５０、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＩＮＧ−１、３６２２Ｗ９４、ＳＦ−２５、Ａ３３およびＲ２４から成る群から選択される。あるいは、ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含み、上記の方法のいずれかにより産生されるＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う抗体フラグメントであり得る。
【００２３】
さらなる局面では、本特許請求される発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含み、上記の方法のいずれかにより産生されるＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う融合タンパク質に関する。
【００２４】
さらなる局面において、本特許請求される発明は、本発明の抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物に関する。
【００２５】
さらなる局面では、本特許請求される発明は、処置上有効な量の前記の薬学的組成物を、該薬学的組成物を必要とする患者に投与することを包含する癌の処置方法に関する。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、処置上有効な量の免疫学的活性抗体を、該免疫学的活性抗体を必要とするヒト被験者に投与することを包含する、Ｂ細胞欠乏を基礎にした病原性自己抗体により全体的または部分的に引き起こされる自己免疫疾患を処置するための改良型方法であって、改良が上記のように調製されるＡＤＣＣの増強を伴う処置上有効な量の抗体を投与することを包含する改良型方法に関する。好ましい実施形態では、抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。自己免疫疾患または障害の例としては、免疫媒介性血小板減少症、例えば急性特発性血小板減少性紫斑および慢性特発性血小板減少性紫斑、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎（ｐｏｓｔ−ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多形紅斑、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および繊維性肺胞炎、炎症性応答（例えば乾癬および皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患）；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性結腸炎）に関連する応答；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；結腸炎；糸球体腎炎；アレルギー症状（例えば湿疹および喘息）、ならびにＴ細胞の浸潤および慢性炎症性応答を含むその他の症状；アテローム硬化症；白血球粘着不全症；慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病（例えば１型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；ならびに典型的には結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および血管炎に見出されるサイトカインおよびＴリンパ球により媒介される急性および遅延性過敏症に関連する免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球漏出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（寒冷グロブリン血症（ｃｒｙｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）またはクームス陽性貧血が挙げられるが、これらに限定されない）；重症筋無力症；抗原−抗体複合体媒介性疾患；抗腎糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート−イートン筋無力症症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多発性内分泌症；ライター病；スティッフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞動脈炎；免疫複合体性腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）または自己免疫血小板減少症等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のこの局面において、本発明の抗体は、正常Ｂ細胞の血液を長期間枯渇させるために用いられる。
上記に加えて、本発明は、さらに以下の項目を提供する。
（項目１）
β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする少なくとも１つの核酸の発現によりＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴うポリペプチドを産生するよう操作された宿主細胞であって、該宿主細胞により産生される該ポリペプチドは、全抗体分子、抗体フラグメント、および免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質から成る群から選択され、ここで、該ＧｎＴＩＩＩは、Ｆｃ領域中にバイセクト複合オリゴ糖を保有するポリペプチドと比較して、Ｆｃ領域中にバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合オリゴ糖、あるいはそれらの混合物を保有する該ポリペプチドの割合を増大するのに十分な量で発現される、宿主細胞。
（項目２）
前記ポリペプチドがＩｇＧまたはそのフラグメントである、項目１に記載の宿主細胞。
（項目３）
前記ポリペプチドがＩｇＧ１またはそのフラグメントである、項目１に記載の宿主細胞。
（項目４）
前記ポリペプチドがヒトＩｇＧのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質である、項目１に記載の宿主細胞。
（項目５）
ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子が前記宿主細胞中に導入されている、項目１に記載の宿主細胞。
（項目６）
内因性ＧｎＴＩＩＩ遺伝子が活性化されるよう操作されている、項目１に記載の宿主細胞。
（項目７）
前記内因性ＧｎＴＩＩＩが宿主染色体中への遺伝子発現を増強するＤＮＡ要素の挿入により活性化されている、項目６に記載の宿主細胞。
（項目８）
内因性ＧｎＴＩＩＩの発現を誘発する突然変異を保有するよう選択されている、項目６に記載の宿主細胞。
（項目９）
ＣＨＯ細胞変異体ｌｅｃ１０である、項目８に記載の宿主細胞。
（項目１０）
ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｙ０ミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞である、項目１に記載の宿主細胞。
（項目１１）
前記ポリペプチドが抗ＣＤ２０抗体である、項目１０に記載の宿主細胞。
（項目１２）
前記抗ＣＤ２０抗体がＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８である、項目１１に記載の宿主細胞。
（項目１３）
ＳＰ２／０細胞である、項目１０に記載の宿主細胞。
（項目１４）
前記抗体がキメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０である、項目１３に記載の宿主細胞。
（項目１５）
ＧｎＴＩＩＩをコードする前記少なくとも１つの遺伝子が前記宿主細胞染色体中に導入されている、項目５に記載の宿主細胞。
（項目１６）
前記内因性ＧｎＴＩＩＩは、前記宿主細胞染色体中へのプロモーター要素、トランスポゾンまたはレトロウイルス要素の挿入により活性化されている、項目６に記載の宿主細胞。
（項目１７）
抗体分子、抗体フラグメントまたは免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸をさらに含む、項目１に記載の宿主細胞。
（項目１８）
ＧｎＴＩＩＩをコードする前記少なくとも１つの核酸が、構成プロモーター要素に作動可能に連結される、項目１に記載の宿主細胞。
（項目１９）
項目１７に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、以下：抗ＣＤ２０抗体、キメラ抗ヒト神経芽細胞腫モノクローナル抗体ｃｈＣＥ７、キメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体ｃｈＧ２５０、キメラ抗ヒト結腸、肺および乳癌モノクローナル抗体ＩＮＧ−１、ヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体３６２２Ｗ９４、ヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体Ａ３３、ＧＤ３ガングリオシドＲ２４に対して向けられる抗ヒト黒色腫抗体、キメラ抗ヒト扁平上皮細胞癌モノクローナル抗体ＳＦ−２５、抗ヒトＥＧＦＲ抗体、抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、抗ヒトＰＳＭＡ抗体、抗ヒトＰＳＣＡ抗体、抗ヒトＣＤ２２抗体、抗ヒトＣＤ３０抗体、抗ヒトＣＤ３３抗体、抗ヒトＣＤ３８抗体、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ４５抗体、抗ヒトＣＤ５２抗体、抗ヒトＣＤ１３８抗体、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ改変体抗体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体、抗ヒトＣＥＡ抗体、抗ヒトＭＵＣ１抗体、抗ヒトＭＵＣ１コアタンパク質抗体、抗ヒト異常グリコシル化ＭＵＣ１抗体、ＥＤ−Ｂドメインを含有するヒトフィブロネクチン改変体に対する抗体または抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、をコードする少なくとも１つのトランスフェクトされた核酸を含む、宿主細胞。
（項目２０）
宿主細胞中でのポリペプチドの産生方法であって、該方法は、Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、項目１〜１９のいずれか一項記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
（項目２１）
Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記宿主細胞が、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記ポリペプチドのＦｃ領域中の５０％より多いオリゴ糖がバイセクトされる、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記ポリペプチドのＦｃ領域中の７０％より多いオリゴ糖がバイセクトされる、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
Ｆｃ領域中のバイセクトハイブリッドオリゴ糖またはガラクトシル化複合オリゴ糖あるいはそれらの混合物の割合が、前記ポリペプチドのＦｃ領域中のバイセクト複合オリゴ糖の割合より大きい、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記ポリペプチドは、抗ＣＤ２０抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８であり、前記宿主細胞により産生されるＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した場合に、図２Ｅに示されるものと実質的に等価であるグリコシル化プロフィールを有する、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリペプチドは、ｃｈＧ２５０モノクローナル抗体であり、前記宿主細胞により産生される前記ｃｈＧ２５０抗体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した場合に、図７Ｄに示されるものと実質的に等価であるグリコシル化プロフィールを有する、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
項目２１に記載の方法により産生される抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を伴う、抗体。
（項目２９）
ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８、ｃｈＣＥ７、ｃｈ−Ｇ２５０、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＩＮＧ−１、３６２２Ｗ９４、ＳＦ−２５、Ａ３３およびＲ２４から成る群から選択される、項目２８に記載の抗体。
（項目３０）
免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含み、項目２１に記載の方法により産生されるＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う、抗体フラグメント。
（項目３１）
免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含み、かつ項目２１に記載の方法により産生されるＦｃ媒介性細胞傷害性の増強を伴う、融合タンパク質。
（項目３２）
項目２８に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３３）
項目３０に記載の抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３４）
項目３１に記載の融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目３５）
項目３２〜３４のいずれか一項に記載の処置上有効な量の薬学的組成物を、該薬学的組成物を必要とする患者に投与する工程を包含する、癌の処置方法。
（項目３６）
処置上有効な量の抗体を、該抗体を必要とするヒト被験者に投与するこ工程を包含する、Ｂ細胞欠乏を基礎にした疾患処置の改良型方法であって、該改良が、項目２８に記載の方法により産生される処置上有効な量の抗体を投与する工程を包含する、改良型方法。
（項目３７）
前記抗体が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、項目３６に記載の改良型方法。
（項目３８）
前記抗ＣＤ２０抗体がＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８である、項目３７に記載の改良型方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
用語は、別に定義しない限り、以下のように当該技術分野で一般的に用いられるように本明細書中で用いられる。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、「抗体」という用語は、全抗体分子、抗体フラグメント、あるいは免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質を包含するよう意図される。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子改変体、ならびに置換、付加または欠失を生じるが抗体依存性細胞傷害性を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低減しない変更を有する改変体を包含するよう意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的損失を伴わずに、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。このような改変体は、活性に及ぼす最小限の影響を有するよう、当該技術分野で公知の一般原則に従って選択され得る（例えばＢｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１０（１９９０）参照）。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ」という用語は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をいう。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「操作する」、「操作された」、「操作」および「グリコシル化操作」という用語は、天然に存在するポリペプチドまたはそのフラグメントのグリコシル化パターンの任意の操作を包含するとみなされる。グリコシル化操作としては、細胞のグリコシル化機構の代謝的操作（細胞中で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変更を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む）が挙げられる。さらに、グリコシル化操作は、グリコシル化に対する、変異および細胞環境の影響を包含する。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、「宿主細胞」という用語は、目的のタンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチド（抗体および抗体フラグメントを含む）の修飾グリコフォームを生じるよう操作され得る任意の種類の細胞系を網羅する。典型的には、宿主細胞は、最適化されたレベルのＧｎＴＩＩＩを発現するよう操作されている。宿主細胞としては、少数名前を挙げるとすれば、培養細胞（例えば哺乳動物培養細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞）、酵母細胞および昆虫細胞）が挙げられるが、トランスジェニック動物または培養組織内に含まれる細胞も挙げられる。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「Ｆｃ媒介性細胞傷害性」という用語は、抗体依存性細胞傷害性、ならびにヒトＦｃ領域を含有する可溶性Ｆｃ融合タンパク質により媒介される細胞傷害性を包含する。Ｆｃ媒介性細胞傷害性は、「ヒト免疫エフェクター細胞」による「抗体標的化細胞」の溶解をもたらす免疫メカニズムであって、ここで、
「ヒト免疫エフェクター細胞」は、抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域と結合し、エフェクター機能を実施する、それらの表面上にＦｃ受容体を提示する白血球の集団である。このような集団としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３４】
「抗体標的化細胞」は、抗体またはＦｃ融合タンパク質により結合される細胞である。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域に対してＮ末端側のタンパク質部分を介して標的細胞と結合する。
【００３５】
本明細書中で用いる場合、「Ｆｃ媒介性細胞傷害性の増強」という用語は、上記のＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムにより、標的細胞周囲の媒質中で、所定時間で、抗体またはＦｃ融合タンパク質の所定濃度で溶解される「抗体標的細胞」の数の増大、および／またはＦｃ媒介性細胞傷害性のメカニズムにより、所定時間で、「抗体標的細胞」の所定数の溶解を達成するのに必要とされる、標的細胞周囲の媒質中での、抗体またはＦｃ融合タンパク質の濃度の低減と定義される。Ｆｃ媒介性細胞傷害性は、当業者に既知である同一の標準的な産生方法、精製方法、配合方法および貯蔵方法を用いて、同一型の宿主細胞により産生されるが、本明細書中に記載される方法によりグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩを発現するよう操作された宿主細胞によっては産生されたことがない、同一の抗体またはＦｃ融合タンパク質により媒介される細胞傷害性に関連する。
【００３６】
「抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強を伴う抗体」とは、当業者に既知の任意の適切な方法により確定されるようなＡＤＣＣの増強を伴う抗体を意味する。許容可能なインビトロＡＤＣＣアッセイの１つを以下に示す：
１）本アッセイは、抗体の抗原結合領域により認識される標的抗原を発現することが既知である標的細胞を用いる。
【００３７】
２）本アッセイは、エフェクター細胞として無作為に選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いる。
【００３８】
３）本アッセイは、以下のプロトコールに従って実行される：
ｉ）ＰＢＭＣを、標準密度遠心分離法を用いて単離し、５×１０６細胞／ｍｌでＲＰＭＩ細胞培地中に懸濁する。
【００３９】
ｉｉ）標的細胞を標準組織培養法により増殖させ、９０％より高い成育可能度で指数増殖期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培地中で洗浄し、１００μキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培地で２回洗浄し、１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培地中に再懸濁する。
【００４０】
ｉｉｉ）上記の最終標的細胞懸濁液１００μｌを、９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに移す。
【００４１】
ｉｖ）抗体を、細胞培地中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌに連続希釈し、得られた抗体溶液５０μｌを９６ウエルマイクロタイタープレート中の標的細胞に添加し、上記の全濃度範囲を網羅する種々の抗体濃度を三重反復試験する。
【００４２】
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールに関しては、標識した標的細胞を含有するプレート中の３つの付加的ウエルに、抗体溶液（上記ｉｖ時点）の代わりに、非イオン性洗剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の２％（容量／容量）水溶液５０μｌを添加する。
【００４３】
ｖｉ）自発性放出（ＳＲ）コントロールに関しては、標識した標的細胞を含有するプレート中の３つの付加的ウエルに、抗体溶液（上記ｉｖ時点）の代わりに、ＲＰＭＩ細胞培地５０μｌを添加する。
【００４４】
ｖｉｉ）次に、９６ウエルマイクロタイタープレートを５０×ｇで１分間遠心分離し、４℃で１時間インキュベートする。
【００４５】
ｖｉｉｉ）ＰＢＭＣ懸濁液（上記ｉ時点）５０μｌを各ウエルに添加して、２５：１のエフェクター：標的細胞比を生じ、５％ＣＯ２大気下で３７℃で４時間、インキュベーター中にプレートを入れる。
【００４６】
ｉｘ）各ウエルから無細胞上清を回収し、ガンマ計数器を用いて実験的放出放射能（ＥＲ）を定量する。
【００４７】
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００（式中、ＥＲはその抗体濃度に関して定量された平均放射能（上記ｉｘ時点参照）であり、ＭＲは、ＭＲコントロール（上記ｖ時点参照）に関して定量された平均放射能（上記ｉｘ時点参照）であり、ＳＲは、ＳＲコントロール（上記ｖｉ時点参照）に関して定量された平均放射能（上記ｉｘ時点参照）である）に従って各抗体濃度に関して算定する。
【００４８】
４）「ＡＤＣＣの増強」とは、上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増大、および／または上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の低減と定義される。ＡＤＣＣの増強は、当業者に既知である同一の標準的な産生方法、精製方法、配合方法および貯蔵方法を用いて、同一型の宿主細胞により産生されるが、しかしグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩＩＩを過剰発現するよう操作された宿主細胞によっては産生されたことがない同一の抗体により媒介される、上記のアッセイを用いて測定されるＡＤＣＣに関連する。
【００４９】
本明細書中で用いる場合、「抗ＣＤ２０抗体」という用語は、典型的には、一般的にＣＤ２０と呼ばれるヒトＢリンパ球限定分化抗原Ｂｐ３５として示される３５，０００ダルトンの細胞表面非グリコシル化リンタンパク質を特異的に認識する抗体を意味するよう意図される。
【００５０】
（グリコシル化パターンの変更が望ましいタンパク質Ａをコードする核酸の同定および生成）
本発明は、グリコフォームの抗体または抗体フラグメント、あるいは抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う抗体フラグメントを含む融合タンパク質の産生のための宿主細胞系の生成および使用の方法を提供する。標的エピトープの同定、ならびにグリコシル化パターンの変更が望ましい潜在的処置値を有する抗体の生成、ならびにそれらのそれぞれのコード核酸配列の単離は、本発明の範囲内である。
【００５１】
当業界で既知の種々の手法は、当該エピトープを標的化するための抗体の産生に用いられ得る。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリにより産生されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば診断薬または処置薬として有用であり得る。処置薬としては、中和抗体、すなわち、リガンド、基質またはアダプター分子と結合に関して競合するものが、特に好ましいものである。
【００５２】
抗体の産生のために、当該標的タンパク質を注射することにより種々の宿主動物、例えばウサギ、マウス、ラット等（これらに限定されない）が免疫される。宿主種に応じて種々のアジュバントを、免疫学的応答を増強するために用いることができ、その例としては、フロイント（完全および不完全）アジュバント、無機質ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えばリゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、サポニン、油乳剤、カギアナカサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント（例えばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
当該標的に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製され得る。これらの例としては、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２（１９８３）； Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−３０
（１９８３））、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７−９６ （Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−５４（１９８５））が用いられ得る。あるいは、一本鎖抗体の産生に関して記載された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）が、所望の特異性を有する一本鎖抗体を産生するために適合され得る。
【００５４】
当該標的タンパク質の特異的結合部位を含有する抗体フラグメントは、既知の技法で生成され得る。例えばこのようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリが、当該標的タンパク質に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速且つ容易な同定を可能にするよう構築され得る（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５−８１（１９８９））。
【００５５】
グリコシル化パターンの変更が望ましい抗体または抗体フラグメントが一旦同定されれば、当該技術分野で周知の技法を用いて、コード核酸配列が同定され、単離される。
【００５６】
ａ．変更されたグリコシル化パターンを有するタンパク質の産生のための細胞株の生成
本発明は、変更されたグリコシル化パターンを有するタンパク質の生成のための宿主細胞発現系を提供する。特に本発明は、改良された処置値を有するグリコフォームのタンパク質の生成のための宿主細胞系を提供する。したがって、本発明は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の発現を増強するよう選択または操作された宿主細胞発現系を提供する。特に、このような宿主細胞発現系は、任意に構成的プロモーター
系または調節プロモーター系に作動可能に連結されるＧｎＴＩＩＩをコードする組換え核酸分子を含むように操作され得る。あるいは、ＧｎＴＩＩＩを天然に産生し、産生するよう誘導され、かつ／または産生するよう選択される宿主細胞発現系が用いられ得る。
【００５７】
特定の一実施形態において、本発明は、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸を発現するよう操作された宿主細胞を提供する。一局面では、宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む核酸分子を用いて形質転換されるかまたはトランスフェクトされる。代替的局面では、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩが活性化されるような方法で操作および／または選択された。例えば、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩの発現を誘発する突然変異を保有するよう選択され得る。特定の一実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ ｌｅｃ１０変異体である。あるいは、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩが活性化されるよう操作され得る。さらに別の代替的実施形態では、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩが構成的プロモーター要素、トランスポゾンまたはレトロウイルス要素の宿主細胞染色体中への挿入により活性化されるように操作される。
【００５８】
一般に、任意の種類の培養細胞株が、本発明の宿主細胞株を操作するための背景として用いられ得る。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、あるいは昆虫細胞が、本発明の操作された宿主細胞を生成するための背景細胞株として用いられる。
【００５９】
本発明は、本明細書中に記載されたようなＧｎＴＩＩＩを発現する任意の操作された宿主細胞を包含するよう意図される。
【００６０】
ＧｎＴＩＩＩをコードする１つまたは複数の核酸は、構成的プロモーターの、あるいは調節された発現系の制御下で発現され得る。適切な調節化発現系としては、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃ−スイッチ発現系、糖質コルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系およびメタロチオネイン金属誘導性発現系が挙げられるが、これらに限定されない。ＧｎＴＩＩＩをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系内に含まれる場合、構成プロモーターの制御下で発現され得るものがある一方、調節プロモーターの制御下で発現されるものもある。最大発現レベルは、細胞増殖速度に有意の悪影響を及ぼさない安定ＧｎＴＩＩＩ発現の最大限可能なレベルであると考えられ、ルーチン実験を用いて確定される。発現レベルは、当該技術分野で一般に既知である方法により、例えばＧｎＴＩＩＩ特異的抗体を用いるウエスタンブロット分析、ＧｎＴＩＩＩ特異的核酸プローブを用いるノーザンブロット分析、あるいは酵素活性の測定により確定される。あるいは、ＧｎＴＩＩＩの生合成産物と結合するレクチン、例えばＥ４−ＰＨＡレクチンが用いられ得る。さらなる代替例では、核酸はレポーター遺伝子に作動可能に連結されることができ、ＧｎＴＩＩＩの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを測定することにより確定される。レポーター遺伝子は、単一ｍＲＮＡ分子として上記ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸（単数または複数）と一緒に転写されてもよく、それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかにより連結され得る。レポーター遺伝子は、単一ポリペプチド鎖が形成されるよう、上記ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸と一緒に翻訳され得る。ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸は、ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸およびレポーター遺伝子が、２つの別個のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に代替的にスプライシングされるＲＮＡ分子に転写されるよう、単一プロモーターの制御下でレポーター遺伝子と作動可能に連結され得る。その結果生じるｍＲＮＡのうちの１つは上記レポータータンパク質に翻訳され、他のものは上記ＧｎＴＩＩＩに翻訳される。
【００６１】
ＧｎＴＩＩＩをコードするいくつかの異なる核酸が発現される場合、それらは、１つのまたは複数のｍＲＮＡ分子として転写されるように配置され得る。それらが単一ｍＲＮＡ分子として転写される場合、それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）のいずれかにより連結され得る。それらは、いくつかの別個のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に代替的にスプライシングされるＲＮＡ分子に単一プロモーターから転写され得、これは次に、それらのそれぞれのコードＧｎＴＩＩＩに翻訳される。
【００６２】
その他の実施形態では、本発明は、抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う処置用抗体の生成のための宿主細胞発現系、およびＦｃ媒介性細胞傷害性を促すために表面にＩｇＧ Ｆｃ領域を提示する細胞を提供する。一般に、宿主細胞発現系は、変更グリコフォームの産生が望ましい抗体をコードする核酸を、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸と一緒に発現するよう操作および／または選択されている。一実施形態では、宿主細胞系は、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの遺伝子をトランスフェクトされる。典型的には、トランスフェクト細胞は、ＧｎＴＩＩＩを安定に発現するクローンを同定し、単離するよう選択される。別の実施形態では、宿主細胞は、内因性ＧｎＴＩＩＩの発現のために選択されている。例えば、そうでなければサイレントＧｎＴＩＩＩの発現を誘発する突然変異を保有する細胞が選択され得る。例えば、ＣＨＯ細胞は、ある種の変異体において、例えば変異体Ｌｅｃ１０において活性であるサイレントＧｎＴＩＩＩ遺伝子を保有することが既知である。さらに、調節プロモーターまたは構成性プロモーターの挿入、トランスポゾン、レトロウイルス要素等の使用を含む当該技術分野で既知の方法を、サイレントＧｎＴＩＩＩを活性化し得る。遺伝子ノックアウト技術の使用、あるいはリボサイム法の使用はまた、宿主細胞のＧｎＴＩＩＩ発現レベルを調整するために用いることができるため、本発明の範囲内である。
【００６３】
任意の種類の培養細胞株を、本発明の宿主細胞株を操作するためのバックグラウンドとして用いることができる。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞または昆虫細胞が用いられ得る。典型的には、このような細胞株は、全抗体分子、抗体フラグメント、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つのトランスフェクト核酸をさらに含むよう操作される。代替的実施形態では、当該特定の抗体を発現するハイブリドーマ細胞株が、本発明の操作された宿主細胞を生成するためのバックグラウンド細胞株として用いられる。
【００６４】
典型的には、宿主細胞系における少なくとも１つの核酸は、ＧｎＴＩＩＩをコードする。
【００６５】
ＧｎＴＩＩＩをコードする１つまたは複数の核酸は、構成プロモーターの、あるいは調節発現系の制御下で発現され得る。適切な調節発現系としては、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃ−スイッチ発現系、糖質コルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系およびメタロチオネイン金属誘導性発現系が挙げられるが、これらに限定されない。ＧｎＴＩＩＩをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系内に含まれる場合、構成プロモーターの制御下で発現され得るものがある一方、調節プロモーターの制御下で発現されるものもある。最大発現レベルは、細胞増殖速度に重大な悪影響を及ぼさない安定ＧｎＴＩＩＩ発現の最大限レベルであると考えられ、日常的な実験を用いて確定される。発現レベルは、当該技術分野で一般に既知である方法（ＧｎＴＩＩＩ特異的抗体を用いるウエスタンブロット分析、ＧｎＴＩＩＩ特異的核酸プローブを用いるノーザンブロット分析、あるいはＧｎＴＩＩＩの酵素活性の測定を含む）により確定される。あるいは、ＧｎＴＩＩＩの生合成産物に結合するレクチン、例えばＥ４−ＰＨＡレクチンが用いられ得る。さらなる代替例では、核酸はレポーター遺伝子に作動可能に連結されることができ、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを測定することにより確定される。レポーター遺伝子は、単一ｍＲＮＡ分子として上記糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸と一緒に転写されてもよく、それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）により連結され得る。レポーター遺伝子は、単一ポリペプチド鎖が形成されるよう、ＧｎＴＩＩＩをコードする少なくとも１つの核酸と一緒に翻訳され得る。ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸は、ＧｎＴＩＩＩをコードする核酸およびレポーター遺伝子が、２つの別個のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に代替的にスプライシングされるＲＮＡ分子に転写されるよう、単一プロモーターの制御下でレポーター遺伝子と作動可能に連結され得る。その結果生じるｍＲＮＡのうちの１つは上記レポータータンパク質に翻訳され、他のものは上記ＧｎＴＩＩＩに翻訳される。
【００６６】
ＧｎＴＩＩＩをコードするいくつかの異なる核酸が発現される場合、それらは、１つまたは複数のｍＲＮＡ分子として転写されるように配置され得る。それらが単一ｍＲＮＡ分子として転写される場合、それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により、またはキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）により連結され得る。それらは、いくつかの別個のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に代替的にスプライシングされるＲＮＡ分子に単一プロモーターから転写され、これは次に、それらのそれぞれのコードＧｎＴＩＩＩに翻訳される。
【００６７】
（ｉ．発現系）
当業者に既知である方法を用いて、目的のタンパク質のコード配列、ならびにＧｎＴＩＩＩおよび適切な転写／翻訳制御シグナルのコード配列を含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、組換えＤＮＡ法、合成法およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｕｌｉｓｈｉｎｇ ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載された技法を参照）。
【００６８】
種々の宿主発現ベクター系が、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を発現するために利用され得る。好ましくは哺乳動物細胞は、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有する組換えプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞系として用いられる。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、あるいは昆虫細胞が宿主細胞系として用いられる。代替的な実施形態では、その他の真核生物宿主細胞系、（目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞；目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは二重微小染色体（例えばマウス細胞株）中で安定に増幅される（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）かまたは不安定に増幅される、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの多重コピーおよびＧｎＴＩＩＩのコード配列を含有するよう操作された細胞株を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染した動物細胞系を含む）が意図され得る。
【００６９】
本発明の方法については、安定発現は、一般的に、典型的にはより再現可能な結果が得られ、かつ大規模生成もより容易であるので、一過性発現のために好ましい。ウイルスの複製起源を含有する発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、および選択可能マーカーにより制御されるそれぞれのコード核酸で形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は栄養強化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地中で１〜２時間増殖させられ、次に選択培地に切り替えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、それらの染色体中にプラスミドを安定的に組み込み、増殖して増殖巣を形成し、これが次にクローニングされて細胞株に増大され得る細胞の選択を可能にする。
【００７０】
以下の多くの選択系、が用いられ得るが、これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２６（１９６２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））（これらはｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞またはａｐｒｔ―細胞のそれぞれにおいて用いられ得る）。代謝拮抗物質耐性も、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７（１９８９）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）に対する耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｇｎｅ ３０：１４７（１９８４））に対する選択の基礎として用いられ得る。近年、さらに別の選択可能遺伝子、すなわちトリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるｔｒｐＢ；ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８０４７（１９８８））；グルタミンシンターゼ系；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編（１９８７））が記載されている。
【００７１】
（ｉｉ．変更されたグリコシル化パターンを有するタンパク質を発現するトランスフェクト体または形質転換体の同定）
コード配列を含有し、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的アプローチにより同定され得る；（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在；（ｃ）宿主細胞中のそれぞれのｍＲＮＡ転写体の発現により測定した場合の転写のレベルの評価；および（ｄ）イムノアッセイにより、またはその生物学的活性により測定した場合の遺伝子産物の検出。
【００７２】
第一のアプローチでは、発現ベクター中に挿入された目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列の存在は、それぞれのコード配列とそれぞれが相同であるヌクレオチド配列、あるいはその一部分または誘導体を含むプローブを用いる、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにより検出され得る。
【００７３】
第二のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系は、ある種の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成等）の存在または非存在に基づいて、同定および、選択され得る。例えば、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、それぞれのコード配列を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、コード配列の発現を制御するために用いられる同一のまたは異なるプロモーターの制御下でコード配列と縦列に配置され得る。誘導または選択に応答するマーカーの発現は、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列の発現を示す。
【００７４】
第三のアプローチでは、目的のタンパク質のコード領域およびＧｎＴＩＩＩのコード配列についての転写活性は、ハイブリダイゼーションアッセイにより評価され得る。例えば、目的のタンパク質のコード配列およびＧｎＴＩＩＩのコード配列と相同なプローブまたはその特定部分を用いたノーザンブロットにより、ＲＮＡが単離され、分析され得る。あるいは、宿主細胞の全核酸が抽出され、このようなプローブとのハイブリダイゼーションについてアッセイされ得る。
【００７５】
第四のアプローチでは、目的のタンパク質およびＧｎＴＩＩＩのコード配列のタンパク質産物の発現は、例えばウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、放射免疫沈降法、酵素結合イムノアッセイ等）により、免疫学的に評価され得る。しかしながら、発現系の成功の最終試験は、生物学的に活性な遺伝子産物の検出を包含する。
【００７６】
（ｂ．変更されたグリコシル化パターンを有するタンパク質およびタンパク質フラグメントの生成および使用）
（ｉ．抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う抗体の生成および使用）
好ましい実施形態において、本発明は、抗体依存性細胞傷害性の増強を伴うグリコフォームの抗体および抗体フラグメントを提供する。
【００７７】
いくつかの種類の癌の処置のための非結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験は、近年、励みになる結果をもたらした（Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：２２３−２５（１９９７）；Ｄｅｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７））。キメラ非結合ＩｇＧ１は、低級または濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫に関して認可された（Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：２２３−２５（１９９７））が、別の非結合ｍＡｂ、ヒト化ＩｇＧ１ターゲッティング固形乳房腫瘍もまた、ＩＩＩ期臨床試験において有望な結果を示している（Ｄｅｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７））。これら２つのｍＡｂの抗原は、それぞれの腫瘍細胞中で高く発現され、抗体はインビトロおよびインビボエフェクター細胞による強力な腫瘍破壊を媒介する。これに対比して、良好な腫瘍特異性を有する多くの他の非結合ｍＡｂは、臨床的に有用であるほど十分な効力を有するエフェクター機能を誘発し得ない（Ｆｒｏｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ ８０：３１７−３３（１９９７）；Ｓｕｒｆｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９：１８４−９１（１９９６））。これらの弱いｍＡｂのいくつかについて、サイトカインによる補助処置（ａｄｊｕｎｃｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）が現在試験されている。サイトカインの添加により、循環リンパ球の活性および数を高めることにより、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激することができる（Ｆｒｏｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ ８０：３１７−３３（１９９７）Ｓｕｒｆｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９：１８４−９１（１９９６））ＡＤＣＣ（抗体標的細胞上での溶解性攻撃）は、白血球受容体と抗体の定常領域（Ｆｃ）との結合の際に誘発される（Ｄｅｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７））。
【００７８】
非結合ＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性を増強するための異なるが相補的な手法は、リンパ球受容体（ＦｃγＲ）に対するその親和性を増強するよう抗体のＦｃ領域を操作することである。タンパク質操作試験は、ＦｃγＲがＩｇＧ ＣＨ２ドメインのより低いヒンジ領域と相互作用することを示した（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６））。しかし、ＦｃγＲ結合は、ＣＨ２領域中の保存Ａｓｎ２９７に共有結合されたオリゴ糖の存在も要する（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６）；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３１（１９９７））が、このことは、オリゴ糖およびポリペプチドがともに相互作用部位に直接関与することを、あるいは活性ＣＨ２ポリペプチド立体配座を保持するためにオリゴ糖が必要であることを示唆する。したがって、オリゴ糖構造の改変は、相互作用の親和性を増強するための一手段として検討され得る。
【００７９】
ＩｇＧ分子は、各重鎖上に１つずつ、そのＦｃ領域中に２つのＮ結合型オリゴ糖を保有する。任意の糖タンパク質として、抗体は、同一ポリペプチド骨格を共有するが、グリコシル化部位に結合された異なるオリゴ糖を有する、グリコフォームの一集団として産生される。血清ＩｇＧのＦｃ領域中に通常見出されるオリゴ糖は、複合ビアンテナリ型のものであって（Ｗｏｒｍａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１３０−３８（１９９７））、低レベルの末端シアル酸およびバイセクトＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ならびに種々の程度の末端ガラクトシル化およびコアフコシル化を伴う。ＦｃγＲ結合に必要とされる最小糖質構造は、オリゴ糖コア内に存在することをいくつかの試験が示唆している（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６））。末端ガラクトースの除去は、ＡＤＣＣ活性を約２分の１に低減するが、これは、ＦｃγＲ受容体結合におけるこれらの残基に関する役割を示す（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９６３−６９（１９９６））。
【００８０】
非結合体化型処置用ｍＡｂの産生のために工業的および学究的に用いられるマウス由来細胞株またはハムスター由来細胞株は、通常は、必要なオリゴ糖決定基をＦｃ部位に結合する。しかしこれらの細胞株中で発現されるＩｇＧは、血清ＩｇＧ中に少量で見出されるバイセクトＧｌｃＮＡｃを欠く（Ｌｉｆｅｌｙら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５））。対照的に、ラットミエローマ産生ヒト化ＩｇＧ１（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）は、そのグリコフォームのいくつかでバイセクトＧｌｃＮＡｃを保有することが近年観察された（Ｌｉｆｅｌｙら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５））。ラット細胞由来抗体は、標準細胞株中に産生されるＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体と同様のインビトロでのＡＤＣＣ活性に達するが、抗体濃度は有意に低い。
【００８１】
ＣＡＭＰＡＴＨ抗原は、通常はリンパ腫細胞上に高レベルで存在し、このキメラｍＡｂはバイセクトＧｌｃＮＡｃの非存在下で高ＡＤＣＣ活性を有する（Ｌｉｆｅｌｙら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１８：８１３−２２（１９９５））。Ｎ結合型グリコシル化経路では、バイセクトＧｌｃＮＡｃは、酵素β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）に付加される（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６４：１６３−８１（１９８６））。
【００８２】
本発明者らは、異なるレベルのクローン化ＧｎＴＩＩＩ遺伝子を、外部調節様式で発現するよう予め操作された単一抗体産生ＣＨＯ細胞株を用いた。この手法は、ＧｎＴＩＩＩの発現と改変された抗体のＡＤＣＣ活性との間の強い相関を最初に確定した。
【００８３】
本発明者らは、以前に、開示された方法により改変されたＣ２Ｂ８抗体が、同一の細胞培養および精製条件下で産生された標準非改変Ｃ２Ｂ８抗体の約１６倍のＡＤＣＣ活性を有する、ということを示した。要するに、ＧｎＴＩＩＩ発現を示さないＣＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８細胞中で発現されたＣ２Ｂ８抗体サンプルは、ヒトリンパ球によるＳＢ細胞（ＣＤ２０＋）のインビトロでの溶解物として測定される、約３１％（１μｇ／ｍｌの抗体濃度で）の細胞傷害活性を示した。対照的に、基本的高抑制レベルでＧｎＴＩＩＩを発現するＣＨＯ細胞培養由来のＣ２Ｂ８抗体は、１μｇ／ｍｌの抗体濃度で、同一抗体濃度のコントロールに対してＡＤＣＣ活性の３３％増を示した。さらに、ＧｎＴＩＩＩの発現増強は、同一抗体濃度でのコントロールと比較して、最大ＡＤＣＣ活性のほぼ８０％という大きい増加（１μｇ／ｍｌの抗体濃度で）を生じた（国際公開番号ＷＯ９９／５４３４２参照）（この記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）。
【００８４】
抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う本発明のさらに他の抗体としては、本発明の方法により産生される抗ヒト神経芽細胞腫モノクローナル抗体（ｃｈＣＥ７）、本発明の方法により産生されるキメラ抗ヒト腎細胞癌モノクローナル抗体（ｃｈ−Ｇ２５０）、本発明の方法により産生されるヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（例えばトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ））、本発明の方法により産生されるキメラ抗ヒト結腸、肺および乳癌モノクローナル抗体（ＩＮＧ−１）、本発明の方法により産生されるヒト化抗ヒト１７−１Ａ抗原モノクローナル抗体（３６２２Ｗ９４）、本発明の方法により産生されるヒト化抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）、本発明の方法により産生されるＧＤ３ガングリオシドに対して向けられる抗ヒト黒色腫抗体（Ｒ２４）、ならびに本発明の方法により産生されるキメラ抗ヒト扁平上皮細胞癌モノクローナル抗体（ＳＦ−２５）、本発明の方法により産生される抗ヒト小細胞肺癌モノクローナル抗体（ＢＥＣ２、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ）、本発明の方法により産生される抗ヒト非ホジキンリンパ腫モノクローナル抗体（Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ））、本発明の方法により調製される抗ヒト扁平上皮細胞頭頚部癌モノクローナル抗体（Ｃ２２５、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、本発明の方法により調製される抗ヒト直腸および結腸癌モノクローナル抗体（Ｐａｎｏｒｅｘ（エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、本発明の方法により産生される抗ヒト卵巣癌モノクローナル抗体（テラギン（Ｔｈｅｒａｇｙｎ）、Ａｎｔｉｓｏｍａ）、本発明の方法により産生される抗ヒト急性骨髄性白血病モノクローナル抗体（Ｓｍａｒｔ Ｍ１９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、Ｋａｎｅｂｏ）、本発明の方法により産生される抗ヒト悪性神経膠腫モノクローナル抗体（Ｃｏｔａｒａ、Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、本発明の方法により産生される抗ヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫モノクローナル抗体（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、本発明の方法により産生される抗ヒト固形腫瘍モノクローナル抗体（ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、本発明の方法により産生される抗ヒト結腸直腸癌モノクローナル抗体（ヨウ素１３１−ＭＮ−１４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、本発明の方法により産生される抗ヒト卵巣、腎臓、乳房および前立腺癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−２１０、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、本発明の方法により産生される抗ヒト結腸直腸および膵臓癌モノクローナル抗体（ＴＴＭＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉｅ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）、本発明の方法により産生される抗ヒトＴＡＧ−７２発現癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−２２０、Ｍｅｄａｒｅｘ）、本発明の方法により産生される抗ヒトＥＧＦｒ発現癌モノクローナル抗体（ＭＤＸ−４４７）、本発明の方法により産生される抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、本発明の方法により産生される抗ヒト乳房、肺、前立腺および膵臓の癌および悪性黒色腫モノクローナル抗体（ＢｒｅｖａＲｅｘ、ＡｌｔａＲｅｘ）、ならびに本発明の方法により産生される抗ヒト急性骨髄性白血病モノクローナル抗体（モノクローナル抗体結合体、Ｉｍｍｕｎｅｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価である領域を含む抗体フラグメントおよび融合タンパク質に関する。
【００８５】
（ｉｉ．Ｆｃ媒介性細胞傷害性を促す免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質の生成および使用）
上記のように、本発明は、処置用抗体のＡＤＣＣ活性を増強するための方法に関する。これは、このような抗体のＦｃ領域のグリコシル化パターンを操作することにより、特にそれらのＦｃ領域の保存グリコシル化部位にＮ結合されるバイセクト複合オリゴ糖およびバイセクトハイブリッドオリゴ糖を保有する抗体分子の割合を最大にすることにより、達成される。この戦略は、処置用抗体によってだけでなく、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価である領域を保有する任意の分子により媒介される望ましくない細胞に対するＦｃ媒介性細胞傷害性を増強するために適用され得るが、これは、グリコシル化の操作により導入される変化が、Ｆｃ領域のみに、したがってＡＤＣＣメカニズムに関与するエフェクター細胞の表面のＦｃ受容体とのその相互作用に、影響を及ぼすためである。本明細書に開示された方法が適用され得るＦｃ含有分子としては、（ａ）Ｆｃ領域のＮ末端に融合されたターゲッティングタンパク質ドメインから作製される可溶性融合タンパク質（ＣｈａｍｏｖおよびＡｓｈｋｅｎａｚｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：５２（１９９６））、および（ｂ）Ｆｃ領域のＮ末端に融合された原形質膜に局在化されるＩＩ型膜貫通ドメインから作製される原形質膜固定融合タンパク質（Ｓｔａｂｉｌａ，Ｐ．Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１３５７（１９９８））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
可溶性融合タンパク質（ａ）の場合、ターゲッティングドメインは、望ましくない細胞、例えば癌細胞との融合タンパク質の結合を指向する（すなわち処置用抗体と同様の様式である）。したがって、これらの分子により媒介されるＦｃ媒介性細胞性細胞毒活性を増強するためのここに開示された方法の適用は、処置用抗体に適用される方法と同一である。
【００８７】
膜固定融合タンパク質（ｂ）の場合、身体中の望ましくない細胞は、融合タンパク質をコードする遺伝子を発現しなければならない。これは、遺伝子療法の手法により、すなわち望ましくない細胞に対して融合タンパク質コード遺伝子の発現を指向するプラスミドまたはウイルスベクターを用いて、インビボで細胞をトランスフェクトすることによってか、あるいはそれらの表面に融合タンパク質を発現するよう遺伝的に操作された細胞の身体中への移植により、達成され得る。後者の細胞は、普通は、ポリマーカプセル内で身体に移殖される（カプセル化細胞療法）が、この場合、それらはＦｃ媒介性細胞傷害性メカニズムにより破壊され得ない。しかし、カプセル装置が故障すると、漏出細胞は望ましくないものになり、次いでそれらはＦｃ媒介性細胞傷害性により排除され得る（Ｓｔａｂｉｌａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１３５７（１９９８））。この場合、ＧｎＴＩＩＩの適切または最大発現レベルを指向する付加的遺伝子発現カセットを遺伝子療法ベクター中に組み入れることによってか、あるいは適切または最大レベルのＧｎＴＩＩＩを発現するために移殖されるよう細胞を操作することにより、本明細書中に開示された方法が適用される。両方の場合、開示された方法の目的は、バイセクト複合オリゴ糖および／またはバイセクトハイブリッドオリゴ糖を保有する表面提示Ｆｃ領域の割合を増大するかまたは最大にすることである。
【００８８】
以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明する。以下の調製物および実施例は、当業者に本発明をより明確に理解させ、本発明を実施させるために示している。しかし、本発明は、本発明の単一の態様の説明として意図されているに過ぎない例示的実施形態の範囲内に限定されず、機能的に等価である方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書中に記載されたものの他の本発明の種々の修正は、上記の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内であるよう意図される。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
（ＩＤＥＣ−ＣＥＢ８産生細胞株のグリコシル化操作により得られる、増強された抗体依存性細胞傷害性を有する、キメラ抗ＣＤ２０抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の新規バージョン）
ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８のＶＨおよびＶＬのコード領域の合成ならびに哺乳動物発現ベクターの構築。ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて、一段階法で、一組の重複一本鎖オリゴヌクレオチドから構築した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：５００−５０３（１９９７））。国際公開特許出願（国際公開番号ＷＯ９４／１１０２６）から、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８
ＶＬおよびＶＨをコードするオリジナル配列データを得た。構築されたＶＬおよびＶＨｃＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）にサブクローニングし、配列決定して、オリジナルアミノ酸残基配列を変更せずに、可変領域および定常領域接合部に導入された独特の制限部位を用いて、それぞれヒト定常軽鎖（Ｉｇκ）および重鎖（ＩｇＧ１）ｃＤＮＡへの連結により直接結合した（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）；Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８３：４３５−４４５（１９９４））。各完全長ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に個別にサブクローニングし、キメラＣ２Ｂ８軽鎖（ｐＣ２Ｂ８Ｌ）および重鎖（ｐＣ２Ｂ８Ｈ）に関する哺乳動物発現ベクターを得た。
【００９０】
異なるレベルのＧｎＴＩＩＩを発現するＣＨＯ細胞中でのＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の産生。２つのＣＨＯ細胞株、すなわち培地中のテトラサイクリン濃度に依存して異なるレベルのＧｎＴＩＩＩを発現するＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ；およびＧｎＴＩＩＩを発現しない親細胞株であるＣＨＯ−ｔＴＡの確立は、以前に記載されている（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）；Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５：５４２−５４９（１９９９））。リン酸カルシウム法を用いて、各細胞株に、ベクターｐＣ２Ｂ８Ｌ、ｐＣ２Ｂ８ＨおよびｐＺｅｏＳＶ２（＋）（ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性に関して；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を同時トランスフェクトした。ゼオシン耐性クローンを９６ウエルプレートに移して、ヒト定常領域に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８産生に関してアッセイした（４）。選定クローン（ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ−Ｃ２Ｈ８）の並行培養から３つのＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８サンプルを得て、テトラサイクリン濃度のみを変えて、培地に添加した（それぞれ２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬおよび２０００ｎｇ／ｍＬ）。培養上清を後期対数期に回収した。同一条件下で、しかし培地にテトラサイクリンを添加せずに培養したＣＨＯ−ｔＴＡ由来クローンであるＣＨＯ−ｔＴＡ−Ｃ２Ｂ８から、さらに別の抗体サンプルを得た。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより抗体サンプルを培地から精製し、上記のように陽イオン交換カラムで緩衝液をＰＢＳに交換した（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。標準として用いられるリツキシマブを有するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製の蛍光ベースのキット（Ｌｅｉｄｅｎ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、抗体濃度を測定した。
【００９１】
間接的免疫蛍光法。ＣＤ２０陽性細胞（ＳＢ細胞；ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２０）およびＣＤ２０陰性細胞（ＨＳＢ細胞；ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２０．１）を各々、ハンクス平衡塩溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の２．５μｇ／ｍｌのＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ由来ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８抗体、および２％ウシ血清アルブミン分画Ｖ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（ＨＢＳＳＢ）とともに１時間インキュベートした。陰性コントロールとして、ＨＢＳＳＢをＣ２Ｂ８抗体の代わりに用いた。ＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＦｃポリクローナル抗体を、全サンプルに関して、二次抗体（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）として用いた。ライカ蛍光顕微鏡（Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、細胞を検査した。
【００９２】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによるオリゴ糖プロファイリング 上記（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））のように、Ｃ２Ｂ８抗体サンプル、ＭａｂＴｈｅｒａＴＭ（リツキシマブの欧州等価物；Ｒ．Ｓｔａｈｅｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｐｉｔａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの御厚意により得た）、Ｃ２Ｂ８−２５ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔおよびＣ２Ｂ８−ｎｔ（各々１００μｇ）から、中性Ｎ結合型オリゴ糖を得た。要するに、抗体サンプルをまず、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｂｉｎｇｓｏｎ，ＵＫ）で処理して、いかなるシアル酸単糖残基をも除去した。次に、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、中性Ｎ結合型オリゴ糖を脱シアリル化抗体サンプルから放出し、微小カラムを用いて精製して、Ｅｌｉｔｅ Ｖｏｙａｇｅｒ ４００分光計（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）でＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。
【００９３】
ＡＤＣＣ活性アッセイ。フィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｅｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）勾配上での遠心分離により、ヘパリン処理新鮮ヒト血液（全実験において、同一健常ドナーから得た）から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。プラスチック接着により、ＰＢＭＣ（エフェクター）から単球を枯渇させた。ＣＤ２０陽性ＳＢ（標的）細胞を、３７℃で、１００μＣｉ５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｄｅｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて９０分間標識し、ＲＰＭＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で２回洗浄して、１０５細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。ＲＰＭＩ培地中に希釈したＣ２Ｂ８ｍＡｂ ５０μｌを、９６ウエル丸底マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｌａｎｇｅｎｔｈａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の１００μｌのＳＢ細胞（１０，０００細胞／ウエル）に添加し、５０×ｇで１分間遠心分離し、４℃で１時間インキュベートした。その後、エフェクター細胞（ＲＰＭＩ培地中に２×１０７細胞／ｍｌで懸濁）５０μｌを各９６ウエルに添加して、最終Ｅ：Ｔ比１００を得た。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートし、Ｓｋａｔｒｏｎ回収システム（Ｓｋａｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いて回収し、コブラ（Ｃｏｂｒａ）０５００５γ計数器（Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）で計数した（ＥＲ、実験的放出）。Ｃ２Ｂ８ｍＡｂの代わりに、それぞれ１００μｌの１％Ｎｏｎｉｄｅｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）または１００μｌのＲＰＭＩ培地を１００μｌの標識標的細胞に添加することにより、最大（ＭＲ）および自発性放出（ＳＲ）を得た。データポイントはすべて、三連で実施した。以下の式：（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００を用いて、特異的溶解（％）を算定した。
【００９４】
（結果および考察）
ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の産生および特異的抗原結合の立証。ＧｎＴＩＩＩの安定テトラサイクリン調節発現およびＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８の安定構成性発現を示すＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩ細胞を確立し、一組の抗体サンプルの産生のためにスケールアップした。スケールアップ中、同一クローンからの並行培養を、３つの異なるテトラサイクリン濃度、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌおよび２０００ｎｇ／ｍｌ下で増殖させた。これらのレベルのテトラサイクリンは、異なるレベルのＧｎＴＩＩＩおよびバイセクトオリゴ糖を生じることが以前に示されている（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９）；Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５：５４２−５４９（１９９９））。ＧｎＴＩＩＩを発現しないＣ２Ｂ８産生コントロール細胞株も確立し、ＣＨＯ−ｔｅｔ−ＧｎＴＩＩＩの３つの並行培養に関するのと同一条件下で培養した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により、ｍＡｂ純度を９５％より高いと概算した。それらの産生のために培養培地に添加されたテトラサイクリン濃度に従い、サンプルを以下のように命名した：Ｃ２Ｂ８−２５ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔおよびＣ２Ｂ８−ｎｔ（すなわち非バイセクトコントロールに関しては無テトラサイクリン）。サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、ＣＤ２０陽性細胞およびＣＤ２０陰性細胞を用いた間接的免疫蛍光法により、特異的抗原結合を示したが（図１）、これは、合成ＶＬおよびＶＨの遺伝子フラグメントが機能的に誤りがなかったことを示す。
【００９５】
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳを用いたオリゴ糖プロファイリング 放出中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより、各抗体サンプルのグリコシル化プロフィールを分析した。この技法では、異なる質量のオリゴ糖は、スペクトルにおいて別個のピークとして現れ、それらの割合は、相対的ピーク高により定量的に反映される（Ｈａｒｖｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：６１４−６１９（１９９３）；Ｈａｒｖｅｙ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．１５：３３３−３３８（１９９８））。オリゴ糖構造は、それらの予測分子量、同一宿主中で産生されるＩｇＧＩ ｍＡｂ由来のオリゴ糖に関する過去の構造データ、ならびにＮ結合型オリゴ糖生合成経路に関する情報に基づいて異なるピークに割り当てられた。
【００９６】
ＧｎＴＩＩＩ発現レベル（すなわちテトラサイクリン濃度）と異なる抗体サンプルから得られるバイセクト（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）オリゴ糖の量との間に、明らかな相関が見出された。予測どおり、ＧｎＴＩＩＩを発現しない宿主から得られるＭａｂＴｈｅｒａＴＭおよびＣ２Ｂ８−ｎｔは、バイセクトオリゴ糖を保有しなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。これに対比して、バイセクト構造は、サンプルＣ２Ｂ８−２０００ｔ中で、すなわちＧｎＴＩＩＩ発現の基底レベルで、オリゴ糖プールの約３５％までに達した。この場合、主なバイセクトオリゴ糖ピークは複合型であり、ｍ／ｚ１６８９およびｍ／ｚ１８５１のピークに明確に割り当てられた（図２Ｃ）。次のより高いＧｎＴＩＩＩ発現レベル、サンプルＣ２Ｂ８−５０ｔは、約２０％のこれらのピーク（ｍ／ｚ１７０５およびｍ／ｚ１８６１でのそれらの会合カリウム付加物を含む）の増大をもたらした。この増大は、それぞれｍ／ｚ１４８６およびｍ／ｚ１６４８でのそれらの非バイセクト等価物の同時低減を伴った（図２Ｄ）。最高ＧｎＴＩＩＩ発現レベルでは、ＧｎＴＩＩＩ、ｍ／ｚ１４８６に関する主基質であるサンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、ほぼベースラインレベルに低減したが、複合バイセクト構造（ｍ／ｚ１６８９および１８５１）は、ｍ／ｚ１６６４、１８１０および１８２６でのピークの増大を有利に低減した（図２Ｅ）。これらのピークは、バイセクトハイブリッド化合物、ガラクトシル化複合オリゴ糖、または両方の混合物に割り当てられ得る。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩ過剰発現は経路の初期段階での生合成の流れを方向転換し得るので、それらの相対的増加は、バイセクトハイブリッド化合物の蓄積と一致する（図３Ａおよび３Ｂ参照）。バイセクトオリゴ糖構造（複合型およびハイブリッド型）の量は、このサンプルに関しては約８０％に達した。
【００９７】
（ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８グリコシル化改変体のＡＤＣＣ活性）
異なるＣ２Ｂ８ｍＡｂグリコシル化改変体を、ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞のインビトロ溶解として測定したＡＤＣＣ活性について比較した。ＧｎＴＩＩＩを欠いている親細胞株由来の、さらに別のｍＡｂサンプルであるＣ２Ｂ８−ｎｔも試験した。基底ＧｎＴＩＩＩ発現レベルで産生され、低レベルのバイセクトオリゴ糖を保有するサンプルＣ２Ｂ８−２０００ｔは、Ｃ２Ｂ８−ｔよりわずかに活性であった（図４Ａ）。ＧｎＴＩＩＩ発現の次に高いレベルでは、サンプルＣ２Ｂ８−５０ｔはほぼ等レベルのバイセクトオリゴ糖および非バイセクトオリゴ糖を保有したが、有意により高い標的細胞溶解を媒介しなかった。しかしながら、最低テトラサイクリン濃度では、８０％までのバイセクトオリゴ糖構造を含有するサンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、全抗体濃度範囲で、残りのサンプルより有意に活性であった。Ｃ２Ｂ８−２５ｔは１０分の１の抗体濃度で、サンプルＣ２Ｂ８−ｎｔの最大レベルのＡＤＣＣ活性に達した（図４Ａ）。サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、コントロールに関しての最大ＡＤＣＣ活性の有意の増強も示した（５０％対３０％溶解）。
【００９８】
最高比率のバイセクトオリゴ糖を保有するサンプルＣ２Ｂ８−５０ｔおよびＣ２Ｂ８−２５ｔを、欧州で一般に販売されているＲｉｔｕｘａｎＴＭのバージョンであるＭａｂｔｈｅｒａＴＭのＡＤＣＣ活性とさらに比較した（図４Ｂ）。サンプルＣ２Ｂ８−５０ｔは活性のわずかな増強を示したが、サンプルＣ２Ｂ８−２５ｔは、全抗体濃度でＭａｂｔｈｅｒａＴＭより明らかに性能がよかった。マブテラ（商標）の最大ＡＤＣＣ活性に達するにはＣ２Ｂ８−２５ｔの約５〜１０分の１の濃度が必要であり、Ｃ２Ｂ８−２５ｔの最大活性は、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭより約２５％高かった。
【００９９】
これらの結果は、一般に、Ｃ２Ｂ８抗体のインビトロＡＤＣＣ活性がＦｃ領域中にバイセクトオリゴ糖を保有する分子の割合と相関することを示す。低ベースラインレベルのＡＤＣＣ活性を有する抗体であるｃｈＣＥ７の場合、活性の有意な増強は天然に存在する抗体で見出されるレベルを上回るバイセクトオリゴ糖の画分を増大することにより得られる、ということをわれわれは以前に報告した（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。同じことは、バイセクトオリゴ糖の非存在下で高ＡＤＣＣ活性をすでに有するＣ２Ｂ８ｍＡｂに当てはまる。しかしながらｃｈＣＥ７の場合、ＡＤＣＣ活性の非常に大きい増強が、バイセクトオリゴ糖が主として複合型のものであるＧｎＴＩＩＩ発現のレベルで観察された（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−１８０（１９９９））。強力なＣ２Ｂ８ｍＡｂに関しては、活性のこのような大きい増加は、研究したＧｎＴＩＩＩ発現の最高レベルで観察されただけあったが、この場合、バイセクトオリゴ糖は主にハイブリッド型に転じていた（図２）。両ｍＡｂに関して、最高活性を有するサンプルは、非バイセクトオリゴ糖よりかなり高レベルのバイセクトオリゴ糖を有した。これらの観察はともに、おそらくは複合およびハイブリッドのバイセクトオリゴ糖がともにＡＤＣＣ活性に重要であることを示す。
【０１００】
複合オリゴ糖およびハイブリッドオリゴ糖の両方において、バイセクトＧｌｃＮＡｃはオリゴ糖立体配座の大きい変化をもたらす（Ｂａｌａｊｉ，Ｐ．Ｖ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１８：１０１−１１４（１９９６））。変化は、ＣＨ２ドメインにおいてポリペプチドと広範に相互作用するオリゴ糖の一部で起こる（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８））。ポリペプチドはこの位置では比較的柔軟性であるため（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８））、バイセクトＮ−アセチルグルコサミンがＦｃ領域における配座変化によりその生物学的作用を媒介する可能性がある。すべての血清ＩｇＧはバイセクトオリゴ糖を保有するので、潜在的に変更された立体配座は天然ですでに存在する。操作された抗体と天然抗体との間の主な差は、より活性な立体配座を表示する分子の割合である。
【０１０１】
非結合体化ｍＡｂの活性を増強するための種々の手法は、現在、臨床評価（放射免疫療法、抗体依存性酵素／プロドラッグ療法、サイトカインを用いた免疫毒素およびアジュバント療法を含む）の下にある（Ｈｊｅｌｍ Ｓｋｏｇ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：４６３−４７０（１９９０）；Ｂｌａｋｅｙ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５：１７５−１８３（１９９４）；Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｇ．Ａ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：３２８１ｓ−３２９６ｓ（１９９９）；Ｈａｎｋ，Ｊ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：５２３４−５２３９（１９９０））。これらの技法により活性が大きく増加し得るが、これらの技法は、非結合体化ｍＡｂと比較した場合、有意に高い副作用、生産コスト上昇、ならびに生産から患者への投与までの複雑なロジスティクスももたらし得る。ここに示した技法は、簡単な生産方法を維持しながら、効力の増強を得るための代替的方法を提供するものであって、多数の非結合体化ｍＡｂに適用可能であるべきである。
【０１０２】
（実施例２）
（ｃｈＧ２５０産生細胞株のグリコシル化操作により得られる抗体依存性細胞傷害性の増強を伴う、抗腎細胞癌抗体ｃｈＧ２５０の新規バージョン）
（１．細胞培養）
ｃｈＧ２５０キメラｍＡｂを産生するＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（ｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞）を、１：１００（容量／容量）のペニシリン／ストレプトマイシン／抗真菌性溶液（ＳＩＧＭＡ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充した標準細胞培地中で増殖させた。細胞を、組織培養フラスコ中で５％ＣＯ２湿潤大気中、３７℃で培養した。培地を、３〜４日ごとに取り替えた。細胞を、１０％ＤＭＳＯを含有する培地中で凍結させた。
【０１０３】
（２．ｐＧｎＴＩＩＩ−ｐｕｒｏ発現を有するＳＰ２／０細胞の生成）
ＩＲＥＳを介してプロマイシン耐性遺伝子に作動可能に連結されるＧｎＴＩＩＩの構成性発現のためのベクターを用いて、電気穿孔により、ｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０ミエローマ細胞をトランスフェクトした。電気穿孔の２４時間前に、培地を取り替えて、細胞を５×１０５細胞／ｍｌで接種した。７００万個の細胞を、４℃にて１３００ｒｍｐで４分間、遠心分離した。細胞を３ｍＬの新しい培地で洗浄し、再び遠心分離した。培地中の１．２５％（容量／容量）ＤＭＳＯおよび２０〜３０μｇのＤＮＡを含有する反応混合物０．３〜０．５ｍｌの容量中に細胞を再懸濁した。次に電気穿孔混合物を０．４ｃｍキュベットに移して、遺伝子パルサー（Ｂｉｏ Ｒａｄ製）を用いて、低電圧（２５０〜３００Ｖ）および高キャパシタンス（９６０μＦ）でパルスをかけた。電気穿孔後、細胞を迅速にＴ２５培養フラスコ中の６ｍＬの１．２５％（容量／容量）ＤＭＳＯ培地に移して、３７℃でインキュベートした。電気穿孔後２日目に培地に２μｇ／ｍＬのプロマイシンを適用することにより、安定構成部分を選択した。２〜３週間後、安定したプロマイシン耐性混合集団を得た。単一細胞由来クローンをＦＡＣＳにより得て、その後、展開し、プロマイシン選択下で保持した。
【０１０４】
（３．ウエスタンブロット）
ウエスタンブロッティングにより、ＧｎＴＩＩＩ発現に関してプロマイシン耐性クローンをスクリーニングした。ウエスタンブロットは、クローン５Ｈ１２、４Ｅ６および４Ｅ８が最高レベルのＧｎＴＩＩＩを発現していることを明らかに示した。５Ｇ２も中強度のＧｎＴＩＩＩ帯域を示したが、２Ｆ１、３Ｄ３および４Ｇ３は最低帯域強度を有し、したがって低量のＧｎＴＩＩＩを発現した（図５）。
【０１０５】
（４．野生型を含めた７つのＧｎＴＩＩＩ発現クローンからのｃｈＧ２５０モノクローナル抗体の産生および精製）
クローン２Ｆ１、３Ｄ３、４Ｅ６、４Ｅ８、４Ｇ３、５Ｇ２、５Ｈ１２および野生型（ｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞）を、１３０ｍｌ培地の総容量中に３×１０５細胞／ｍＬで接種し、単一三重フラスコ中で培養した。接種のために用いた細胞は、すべて完
全対数増殖期であり、したがって細胞は、生産バッチ開始時に同一の増殖状態であったと考えられた。細胞を４日間培養した。抗体を含有する上清を後期対数増殖期に収集して、再現性を保証した。ｃｈＧ２５０モノクローナル抗体を、２クロマトグラフィー工程で精製した。各バッチから得られたｃｈＧ２５０モノクローナル抗体を含有する培養上清をまず、ＨｉＴｒａｐプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。プロテインＡは、ヒトＩｇＧＦｃ領域に高度に特異的である。プロテイン溶離物からのプールサンプルを、ＲｅｓｏｕｒｃｅＳ １ｍｌカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上での陽イオン交換クロマトグラフィーによりＰＢＳに緩衝液交換した。ＳＤＳ染色およびクーマシーブルー染色から、最終純度を９５％より高いと判定した（図６）。既知の濃度を有する野生型抗体を用いた標準較正曲線で、各サンプルの濃度を確定した。
【０１０６】
（５．異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現する７つのクローン由来のｍＡｂ調製物のオリゴ糖プロファイリング）
異なるオリゴ糖構造の分子量を正確に提供するマトリクス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）によって、オリゴ糖プロフィールを得た。この技法は、混合物内の異なるオリゴ糖構造間の割合の定量的分析を可能にする。中性オリゴ糖は、主に［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンとして出現したが、時としてそれらはより小さい［Ｍ＋Ｋ＋］イオンを伴い、ｍ／ｚ１６の質量増大をもたらした。カリウムイオン付加物として出現する構造のパーセンテージはマトリクスの含量に依存し、したがってサンプル間で変化し得る。各抗体調製物由来の中性Ｎ結合型オリゴ糖の混合物を、マトリクスとして２，５−デヒドロ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）を用いて分析した。既知の単糖組成および独特の質量のために、スペクトル中のピークのいくつかは、特定のオリゴ糖構造に明確に割り当てられた。しかしながら、多重構造はしばしば、特定の質量に割り当てられ得る。ＭＡＬＤＩによって質量を確定することはできるが、異性体間の区別はできない。生合成経路についての知識および過去の構造データは、ほとんどの場合に、スペクトル中のピークへのオリゴ糖構造の割り当てを可能にする。
【０１０７】
ＧｎＴＩＩＩを発現しないｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞株中で産生されたｍＡｂサンプル由来のオリゴ糖は、非バイセクトビアンテナリ（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）複合体（ｍ／ｚ１４８６）およびモノガラクトシル化非バイセクトビアンテナリ複合体構造またはジガラクトシル化非バイセクトビアンテナリ複合体構造（図７Ａ）（ともにコア領域でα（１，６）−フコシル化される）を含有した（それぞれピークｍ／ｚ１６４８および１８１０）。
【０１０８】
ＧｎＴＩＩＩの発現は、２つの型、すなわち複合型またはハイブリッド型のバイセクトＦｃ会合オリゴ糖構造を生じた。複合バイセクトオリゴ糖は明確に、ｍ／ｚ１５４３、１６８９、１７０５、１８５１および１８６７でのピークに割り当てられた（［Ｍ＋Ｋ＋］付加物）。予測どおり、バイセクトオリゴ糖の増大は、非バイセクト複合オリゴ糖に対応するピークｍ／ｚ１４８６および１６４８の同時低減を伴った。ＧｎＴＩＩＩ発現クローン由来の全サンプルに関して、ＧｎＴＩＩＩの主基質（ｍ／ｚ１４８６）は劇的に低減した。予測どおり、ｍ／ｚ１６４８のピークに割り当てられた非バイセクト複合オリゴ糖型のパーセンテージは、最高ＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン（クローン４Ｅ６、４Ｅ８、５Ｇ２および５Ｈ１２）に関して最低値を有した。これら２つのピークは、バイセクト複合型オリゴ糖およびバイセクトハイブリッド型オリゴ糖の蓄積を有利に低減した（図７Ａ〜図７Ｄおよび図８Ａ〜図８Ｄ）。バイセクト複合オリゴ糖のパーセンテージは、低量のＧｎＴＩＩＩを発現するクローン由来のサンプルではより低かった。これは、より高いＧｎＴＩＩＩ発現レベルがおそらくは生合成の流れをバイセクトハイブリッド構造に転向し、それにより複合体および複合バイセクト化合物の相対的割合を低減する、という事実と一致する。バイセクトハイブリッド構造に関しては、２つの考え得る構造がしばしば、単一ピークに割り当てられ得る。したがって、全オリゴ糖プール全体のこれらの構造のパーセンテージを概算するために、いくつかの仮定を行った。ピークｍ／ｚ１６６４、１６８０、１８１０および１８２６は、バイセクトハイブリッド型、ガラクトシル化複合オリゴ糖、またはそれらの混合物に割り当てられ得る。ｗｔ−抗体調製物がピーク１６６４の比較的低いパーセンテージを有したという事実により、異なるクローン由来の抗体サンプル中に有意量で出現するこのピークは完全に、バイセクトハイブリッド構造に対応すると仮定された（図７Ａ〜図７Ｄおよび図８Ａ〜図８Ｄ）。しかしながら、特定構造をピークｍ／ｚ１８１０および１８２６に割り当てるためには、さらなる特性化を実施しなければならない。要するに、ＧｎＴＩＩＩの過剰発現により、バイセクトオリゴ糖構造が生成され、それらの相対的割合はＧｎＴＩＩＩ発現レベルと相関した。
【０１０９】
（６．カルセイン−ＡＭ保持による抗体媒介性細胞毒活性の測定）
細胞傷害性を測定するカルセイン−ＡＭ保持法は、抗体を用いたインキュベーション後に細胞中に残留する染料蛍光を測定する。４００万個のＧ２５０抗原陽性細胞（標的）を、１０％ウシ胎仔血清を補充した１．８ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０細胞培地（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の１０μＭのカルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、５％ＣＯ２湿潤大気中で３７℃にて３０分間標識した。細胞を培地中で２回洗浄し、１２ｍＬのＡＩＭＶ無血清培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に再懸濁した。次に、標識細胞をＵ底９６ウェルに移し（３０，０００細胞／ウェル）、異なる濃度の抗体を用いて、４℃で１時間、三連でインキュベートした。フィコール−パック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）勾配上での遠心分離により、ヘパリン処理新鮮ヒト血液（全実験において、同一健常ドナーから得た）から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣを５０μＬ容量で三連ウェルに添加し、２５：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）および２００μＬの最終容量を生じた。次に９６ウエルプレートを、５％ＣＯ２大気中で３７℃にて４時間インキュベートした。その後、９６ウエルプレートを７００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、２００μＬの０．０５Ｍ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９、０．１％トリトンＸ−１００中で溶解した。標的細胞中の蛍光染料の保持を、ＦＬＵＯｓｔａｒ微小プレート読取器（ＢＭＧ ＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。抗体に曝露する代わりに、サポニン（ＡＩＭＶ中２００μｇ／ｍＬ；ＳＩＧＭＡ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に標的細胞を曝露することにより、特異的溶解を総溶解コントロールに関して算定した。以下の式を用いて、特異的溶解（％）を算定した：
細胞傷害性％＝（Ｆｍｅｄ−Ｆｅｘｐ）／（Ｆｍｅｄ−Ｆｄｅｔ）
（式中、Ｆｍｅｄは培地単独で処理した標的細胞の蛍光を表し、ＰＭＢＣによる非特異的溶解を考察し、Ｆｅｘｐは抗体で処理した細胞の蛍光を表し、Ｆｄｅｔは抗体の代わりにサポニンで処理した細胞の蛍光を表す）。
【０１１０】
インビトロＡＤＣＣ活性に対するｃｈＧ２５０の修飾グリコシル化改変体の効果を確定するために、Ｇ２５０抗原陽性標的細胞を、異なる濃度のｃｈＧ２５０抗体サンプルを用いて、および用いずに、ＰＢＭＣを用いて培養した。野生型細胞株由来の非修飾ｃｈＧ２５０抗体の細胞傷害性を、それぞれ中度および高度のＧｎＴＩＩＩレベルを発現する２つの細胞株（３Ｄ３、５Ｈ１２）由来の２つの抗体調製物と比較した（図５参照）。
【０１１１】
非修飾ｃｈＧ２５０抗体は、アッセイで用いられる濃度範囲全体で有意のＡＤＣＣ活性を媒介しなかった（活性はバックグラウンドと有意に異ならなかった）。２μｇ／ｍＬでのＡＤＣＣ活性の増強（ほぼ２０％、図９参照）は、中度のＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン３Ｄ３由来の抗体サンプルを用いて観察された。この抗体サンプルの細胞毒活性は、より高い抗体濃度では増殖しなかった。予測どおり、クローン５Ｈ１２由来の抗体調製物は、標的細胞に対してＡＤＣＣを媒介するその能力において、サンプル３Ｄ３および非修飾抗体全体で顕著な増強を示した。この抗体調製物の最大ＡＤＣＣ活性は約５０％であり、非修飾コントロールサンプルと比較した場合、１２５分の１の濃度で、有意のＡＤＣＣ活性を顕著に媒介した。
【０１１２】
（実施例３）
（慢性対宿主性移植片病を有する患者における免疫媒介性血小板減少症の処置）
慢性対宿主性移植片病における自己免疫血小板減少症は、臨床疾患を引き起こすＢ細胞調節不全の一例を示す。慢性対宿主性移植片病を有する被験者における免疫媒介性血小板減少症を処置するために、本発明の方法により調製され、ＡＤＣＣの増強を伴う抗ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体を、Ｒａｔａｎａｔｈａｒａｔｈｏｒｎ，Ｖ．ら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３３（４）：２７５−７９（２０００）（この記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されたように被験者に投与する。特に、抗体３７５ｍｇ／ｍ２の毎週注入を被験者に４週間施した。抗体療法は、末梢血中のＢ細胞の顕著な枯渇ならびに血小板関連抗体レベルの低減を生じた。
【０１１３】
（実施例４）
（重症免疫媒介性赤芽球ろうおよび溶血性貧血の処置）
免疫媒介性後天性赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）は、しばしばその他の自己免疫現象に関連するまれな障害である。被験者における免疫媒介性後天性赤芽球ろうを処置するために、本発明の方法により調製され、ＡＤＣＣの増殖を伴う抗ＣＤ２０キメラモノクローナル抗体を、Ｚｅｃｃａ，Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ １２：３９９５−９７（１９９７）（この記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されたように、被験者に投与する。特に、ＰＲＣＡおよび自己免疫性溶血性貧血を有する被験者には、抗体３７５ｍｇ／ｍ２／週を２用量投与する。抗体療法後、静脈内免疫グロブリンを用いた変換処置を開始する。この処置は、Ｂ細胞の顕著な枯渇およびヘモグロビンレベル増大を伴う網状赤血球数の有意の増大を生じる。
【０１１４】
本発明は、上記の説明および実施例に特に記載されたものと別の方法で実行され得ることは明らかである。本発明の多数の変更および改変は上記の教示にかんがみて可能であり、したがって添付の特許請求の範囲内である。
【０１１５】
本明細書中に引用された全出版物（特許、特許出願、季刊誌、実験マニュアル、書籍またはその他の文を含む献）の開示内容はすべて、参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞に対する抗体調製物Ｃ２Ｂ８−２５ｔの反応性を示す間接的免疫蛍光アッセイ。陰性コントロール（ＨＳＢ ＣＤ２０陰性細胞株を含む）および二次ＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＦｃポリクローナル抗体だけで処理された細胞は示されていない。
【図２Ａ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図２Ｂ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図２Ｃ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図２Ｄ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図２Ｅ】ＭａｂｔｈｅｒａＴＭ（図２Ａ）、Ｃ２Ｂ８−ｎｔ（図２Ｂ）、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ（図２Ｃ）、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ（図２Ｄ）およびＣ２Ｂ８−２５ｔ（図２Ｅ）抗体サンプル由来のオリゴ糖のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。オリゴ糖は、［Ｍ＋Ｎａ＋］イオンおよび［Ｍ＋Ｋ＋］イオンとして現れる。最初の２つのスペクトル中に出現するオリゴ糖は、ＧｎＴＩＩＩを発現しない細胞培養物に由来し、一方で、Ｃ、ＤおよびＥのオリゴ糖は、異なるレベル（すなわちテトラサイクリン濃度）でＧｎＴＩＩＩを発現する単一細胞株に由来した。
【図３】典型的なヒトＩｇＧ Ｆｃ会合オリゴ糖構造（Ａ）および部分的Ｎ結合型グリコシル化経路（Ｂ）の説明。（図３Ａ）オリゴ糖のコアは、Ａｓｎ２９７に結合される３個のマンノース（Ｍ）および２個のＮ−アセチルグルコサミン（Ｇｎ）の単糖残基で構成される。ガラクトース（Ｇ）、フコース（Ｆ）およびバイセクトＮ−アセチルグルコサミン（Ｇｎ、矩形）は、存在する場合もしない場合もある。末端Ｎ−アセチルノイラミン酸も存在し得るが、図中に含まれていない。（図３Ｂ）部分的Ｎ結合型グリコシル化経路は、主要なオリゴ糖クラス（点線枠）の生成をもたらす。バイセクトＮ−アセチルグルコサミンは、Ｇｎｂとして示される。下付数字は、各オリゴ糖中に存在する単糖残基の数を示す。各構造は、そのナトリウム関連［Ｍ＋Ｎａ＋］質量と一緒に出現する。フコース（ｆ）を含有する構造の質量も含まれる。
【図４Ａ】Ｒｉｔｕｘｉｍａｂグリコシル化改変体のＡＤＣＣ活性。異なるｍＡｂ濃度により媒介されるヒトリンパ球（Ｅ：Ｔ比１００：１）による５１Ｃｒ標識ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞の溶解により、細胞傷害性のパーセンテージを測定した。（図４Ａ）しかし、単一細胞株由来のＣ２Ｂ８サンプルの活性は、漸増ＧｎＴＩＩＩ発現レベル（すなわち漸減テトラサイクリン濃度）を生じた。サンプルは、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、Ｃ２Ｂ８−２５ｔおよびＣ２Ｂ８−ｎｔ（ＧｎＴＩＩＩを発現しないクローン由来のコントロールｍＡｂ）である。（図４Ｂ）Ｃ２Ｂ８−５０ｔおよびＣ２Ｂ８−２５ｔのＡＤＣＣ活性を、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭと比較した。
【図４Ｂ】Ｒｉｔｕｘｉｍａｂグリコシル化改変体のＡＤＣＣ活性。異なるｍＡｂ濃度により媒介されるヒトリンパ球（Ｅ：Ｔ比１００：１）による５１Ｃｒ標識ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞の溶解により、細胞傷害性のパーセンテージを測定した。（図４Ａ）しかし、単一細胞株由来のＣ２Ｂ８サンプルの活性は、漸増ＧｎＴＩＩＩ発現レベル（すなわち漸減テトラサイクリン濃度）を生じた。サンプルは、Ｃ２Ｂ８−２０００ｔ、Ｃ２Ｂ８−５０ｔ、Ｃ２Ｂ８−２５ｔおよびＣ２Ｂ８−ｎｔ（ＧｎＴＩＩＩを発現しないクローン由来のコントロールｍＡｂ）である。（図４Ｂ）Ｃ２Ｂ８−５０ｔおよびＣ２Ｂ８−２５ｔのＡＤＣＣ活性を、ＭａｂｔｈｅｒａＴＭと比較した。
【図５】７つのＧｎＴＩＩＩ発現クローンおよび野生型のウエスタンブロット分析。各サンプル３０μｇを８．７５％ＳＤＳゲル上にロードし、ＰＶＤＦ膜に移して、抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０）でプローブした。ＷＴはｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞をいう。
【図６】分解精製抗体サンプルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。
【図７Ａ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン、ならびにｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞：ＷＴ（図７Ａ）、２Ｆ１（図７Ｂ）、３Ｄ３（図７Ｃ）、４Ｅ６（図７Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図７Ｂ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン、ならびにｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞：ＷＴ（図７Ａ）、２Ｆ１（図７Ｂ）、３Ｄ３（図７Ｃ）、４Ｅ６（図７Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図７Ｃ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン、ならびにｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞：ＷＴ（図７Ａ）、２Ｆ１（図７Ｂ）、３Ｄ３（図７Ｃ）、４Ｅ６（図７Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図７Ｄ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン、ならびにｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／０細胞：ＷＴ（図７Ａ）、２Ｆ１（図７Ｂ）、３Ｄ３（図７Ｃ）、４Ｅ６（図７Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図８Ａ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン：４Ｅ８（図８Ａ）；５Ｇ２（図８Ｂ）；４Ｇ３（図８Ｃ）；５Ｈ１２（図８Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図８Ｂ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン：４Ｅ８（図８Ａ）；５Ｇ２（図８Ｂ）；４Ｇ３（図８Ｃ）；５Ｈ１２（図８Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図８Ｃ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン：４Ｅ８（図８Ａ）；５Ｇ２（図８Ｂ）；４Ｇ３（図８Ｃ）；５Ｈ１２（図８Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図８Ｄ】異なるＧｎＴＩＩＩレベルを発現するクローン：４Ｅ８（図８Ａ）；５Ｇ２（図８Ｂ）；４Ｇ３（図８Ｃ）；５Ｈ１２（図８Ｄ）により産生されるｃｈＧ２５０ｍＡｂサンプルからの中性オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図９】コントロールｗｔ−ｃｈＧ２５０−ＳＰ２／−細胞およびＧｎＴＩＩＩトランスフェクト（ｔｒａｎｓｅｃｔ）クローン３Ｄ３および５Ｈ１２由来の抗体サンプルのインビトロＡＤＣＣアッセイ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【公開番号】特開２００９−１１４２０１（Ｐ２００９−１１４２０１Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３１０３８（Ｐ２００８−３３１０３８）
【出願日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【分割の表示】特願２００３−５１７０６９（Ｐ２００３−５１７０６９）の分割
【原出願日】平成１４年８月５日（２００２．８．５）
【出願人】（５０４０４３８５３）グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【分割の表示】特願２００３−５１７０６９（Ｐ２００３−５１７０６９）の分割
【原出願日】平成１４年８月５日（２００２．８．５）
【出願人】（５０４０４３８５３）グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト (1)
【Ｆターム（参考）】
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