抗凝固処理全血から産生される自己又は同種の凝固剤
全血からの安定な自己又は同種の凝固剤調製方法を開示する。抗凝固処理された全血を直接沈殿させることによって、血漿分離の工程の必要性が除かれ、予想外の結果をもたらす。本発明の方法によって産生された自己又は同種の凝固剤は、市販のウシトロンビン及びヒトトロンビン調製物と同等の凝固時間を有し、ウシトロンビン調製物と比べて、活性化された血小板からの改良された成長因子の放出動態を示した。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は２００３年１月２７日に出願された、米国仮出願第６０／４４２，９７４号を優先権主張した非仮出願であり、その全内容は参照として本願に含まれる。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、抗凝固処理した全血からの、効果の早い自己又は同種の凝固剤の生産方法に関するものである。
【発明の背景】
【０００３】
ヒト又は動物血漿由来のトロンビンは、血液や血液誘導体〔精製フィブリノーゲン、多血小板血漿（ＰＲＰ）、濃縮血小板（ＰＣ）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）〕の効果的な凝固剤である。トロンビンはフィブリノーゲンに働き、フィブリノーゲンをフィブリンに変え、フィブリンマトリックスの形成をもたらす。止血剤としては、ウシのトロンビン（ＢＴ）の臨床的な使用が一般的である。一方、ヒトの血漿由来トロンビンは、局所の止血剤として、例えばティセル（商標）・フィブリン・シーラント（バクスターコーポレーション）のような、ヒト血漿由来フィブリンシーラント、及び様々な外科的処置のヒト血漿由来創傷シーラントと組み合わせて使用することが認可されているのみである。
【０００４】
ウシ由来トロンビンは、外科的領域において、臨床的に止血を行うための処置の標準として、数十年間利用されてきた。ウシ由来トロンビンは、溶媒洗浄剤で処理されたヒトのプール血漿由来のフィブリンシーラントを調製する手段として利用されてきた。また、ウシトロンビンを使用して、試験室（例えば血液銀行）で調製された寒冷沈降物、及びポイントオブケアで調製された多血小板血漿、濃縮血小板、乏血小板血漿（それぞれ、ＰＲＰ、ＰＣ及びＰＰＰと称する）を凝固させる。
【０００５】
ウシのトロンビンの使用に関連するリスクとして、疾患（ウシ海綿状脳症、ＢＳＥ）の伝搬の可能性、及びヒト第Ｖ因子に対する抗体の産生が挙げられる。ウシトロンビンの臨床用途によるＢＳＥの感染の報告は、文字どおり無いが、異常な出血時間をもたらした抗体産生の報告がある（１−５）。クロマトグラフィーで精製したウシトロンビンの局所的な暴露の後に、ヒト第Ｖ因子の阻害物質が、報告されてきた（６）。局所のウシトロンビンへの暴露は、複数のタンパク質や糖鎖抗原に対する抗体の産生を引き起こしてきた。これらの抗体は暴露された患者の３０％から５５％で報告され、抗核抗体ばかりでなく、カルジオリピンの性質を持っている（７，８）。
【０００６】
ウシトロンビンの使用に関連した問題の結果として、患者自身の血液（自己）又は供血者の血液（同種）から調製する代替の凝固剤が研究されてきている。
【０００７】
今まで、本発明者は、１分から５分の凝固時間をもつ凝固促進剤を生産してきた。そして、凝固促進剤は、ＰＲＰ又はＰＰＰと混合されたとき、及び硬質の移植組織片材料（例えば自己移植、異種移植、外来移植、及び合成）に塗布されると、効果的であることが証明されてきている。これらの材料に塗布された前記組成物は、移植材料の硬化をもたらし、それによって取扱適正を改良し、及び外科的欠陥部位への輸送を簡易化する。結果として得られたこの形態の移植材料は、欠陥部位にぴったり適合し、そして安定化されることができる。また、ＰＲＰ及びＰＣ中に存在する特定のタンパク質も、より迅速な傷の回復に寄与している。
【０００８】
１分から５分の凝固時間の凝固促進剤は、前記の適応においては効果的でもあるけれども、特定の軟組織への適用は効果的でないかもしれず、その結果、早い凝固時間を持つ、ウシ由来でない凝固剤が必要となる。日常的に止血を行うためには、およそ１０秒（ウシのトロンビンで標準的）の凝固時間が、必要とされる。それより長い凝固時間はより好ましくなく、毛細血管出血の制御のためには、より効果的でないことがある。
【０００９】
今まで、ウシ由来でない効果の早い凝固剤の開発研究は、血液の細胞成分の分離、そして血液の血漿画分からタンパク質を分離するための様々な方法の適用に焦点が当てられてきた。寒冷沈降、物理化学的沈殿、マイクロフィルター技術の使用、密度勾配法などの方法が使用されている。血漿分画が分離され、そして解析されてきている。
【００１０】
さらに、様々な一般に知られている沈殿剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、硫酸アンモニウム、及びエタノールも、また研究されてきている。それぞれの薬剤は特定のタンパク質の分離において、一定の利点を有しているが、一方で他のタンパク質の部分的沈殿をもたらす。それにもかかわらず、これらの沈殿剤が、分離工程の最大の効果を達成するために、無細胞の血漿に利用され、適用されてきている。
【００１１】
最近まで、前記第１の焦点は、いくつかのエタノールの使用濃度に当てられており、例えば無細胞の血漿に１０％−２５％のエタノールが適用されていた（ＵＳパテントＮｏ．６，２７４，０９０は、例えば１人の供血者からのプラズマから安定なトロンビンの成分の調製の方法を開示している）。この方法に使用しているトロンビンの調製は時間を要し、そして血漿をエタノールと混合させる前に、最初に全血からの血漿画分を調製する必要があるので、多数の工程を必要とする。
【００１２】
血漿に適用される特定のエタノールの濃度は、ＰＲＰ又はＰＰＰを凝固させるための、例えば５秒から１５秒（ＵＳパテントＮｏ．６，２７４，０９０）の改良された凝固時間を提供してきた。しかし組成物の調製後１時間で、凝固時間は２５秒より長くなり、調製から２時間後には、凝固時間は４０秒より長くなった。
【００１３】
そのため、求められていることは、自己又は同種の凝固剤の調製のための方法であって、前記方法は、少容量の全血から２０秒より少ない時間で凝固する凝固剤を産生すること、４時間より長く活性を維持する凝固剤を産生すること、及び総調製時間が６０分より短い凝固剤を産生することである。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者は、血漿分離工程を省略すること、及び抗凝固処理済みの全血に直接沈殿剤を添加することによって、早い凝固時間を有しており、その組成物によって長時間、その凝固時間が維持される、ヒト凝固剤が得られることを見出した。それにより、凝固剤の調製に必要な総時間は、血漿分画の分離の所要時間の分、減少した。
【００１５】
注目すべきことに、本発明の方法によって生産される凝固剤の性能の有効性は、血漿の分離工程を省略する結果として起こる、若干の溶血によって減少することはない。更に、特定の論理に固執することはないが、赤血球の存在が細胞集塊や阻害タンパク質の沈殿に、実質的に寄与しているのではないかと考えられる。
【００１６】
従って、１つの観点としては、本発明は、抗凝固処理した全血からの効果の早い凝固剤を調製するための迅速法に関するものである。この方法は、供血者からのある容量の抗凝血処理した全血を得ること、前記抗凝固処理した全血と沈殿剤を混合すること、細胞及び血漿成分の沈殿が起きるように充分な時間混合物をインキュベートすること、そして、その後に、即効性の凝固剤を含んでいる上清を得るために沈殿を分離することとを含む。
【００１７】
関連した観点としては、前記発明は、抗凝固処理した全血からの自己凝固剤を調製するための迅速法に関するものである。この方法は、凝固剤が調製される患者からある容量の抗凝固処理した全血を得ること、前記抗凝固処理した全血と沈殿剤を混合すること、細胞及び血漿成分の沈殿が起きるように充分な時間、混合物をインキュベートすること、そして、その後に、その前記上清中に自己又は同種の凝固剤を含んでいる上清を取得するために得られた沈殿を分離することとを含む。
【００１８】
本発明の方法は、患者又は同種の供血者から得られた約８〜１０ｍＬの比較的少量の全血と同じように、必要に応じ様々な量の凝固剤を生産するように比率を変えることが可能である。全血は抗凝固剤、例えば、ＡＣＤで抗凝固処理するが、場合により、ＡＣＤは５−１０ｍｇ／ｍＬの濃度のマンニトールを含む。
【００１９】
別の観点としては、（本）発明は血清分離を必要としない自己の凝固剤の調製方法に関すものである。本発明の方法は、事前に全血から分離した血漿とは対照的に、抗凝固処理された全血を、例えばエタノールのような沈殿剤で、直接沈殿することを含んでいる。
【００２０】
関連した観点としては、（本）発明は、前記方法によって生産されるヒト血液画分に関するものである。その画分はプロトロンビン−トロンビンタンパク質８０−９０％を含み、検出可能なフィブリノーゲンは含まず、ＡＴＩＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳの基準値レベル２０−３０％を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図１は、５人の供血者の、トロンビンで活性化された血小板濃縮血液検体から放出されたＰＤＧＦ−ＡＢの濃度と血小板数の関係を示したグラフである。
【００２２】
図２は、５人の供血者の、トロンビンで活性化された血小板濃縮血液検体から放出されたＴＧＦ−β１の濃度と血小板数の関係を示したグラフである。
【００２３】
図３−７は、５人の供血者のウシトロンビン又は自己のトロンビンで活性化された濃縮血小板のＰＤＧＦ−ＡＢ及びＴＧＦ−β１の成長因子放出動態を示したグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本願でリスト化された、すべての特許、出願、出版物、又は他の参考文献は、参照によって本願に盛込まれている。下記の記載のように、専門用語の使用に関しては慣用されているものに従う。
ＡＣＤ ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ
（酸性キトレートデキストロース）
ＣａＣｌ２ 塩化カルシウム
ＣＰＤ ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ
（キトレートリン酸デキストロース）
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＴＯＨ エタノール、エチルアルコール
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＰＰ ｐａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ（乏血小板血漿）
ＰＲＰ ｐａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ（多血小板血漿）
ＰＣ ｐａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（濃縮血小板）
「抗凝固剤」という用語は、全血の凝固を防止することのできる物質を意味している。
「自己血」という用語は、患者自身の血液を意味している。
「同種血」という用語は、凝固剤を調製する個人以外の血液提供者から得られる血液を意味している。
「凝固剤」という用語は、全血又は血液成分（血漿、血小板）が凝血塊を形成させることができる物質を意味している。
【００２５】
本発明に関連する自己凝固剤の分離の方法論はエタノール分画法を改変したものを基礎としている。しかしながら標準で、又は一般に使用されている開始材料である、血漿や寒冷沈殿の乏血漿と比較すると、前記工程は全血を利用している。従って、本発明の方法は、
ａ）供血者から１容量の抗凝固処理された全血を得ること
ｂ）沈殿剤と抗凝固処理された全血とを混合すること
ｃ）前記ｂ）の混合物を細胞及び特定の血漿成分の沈殿を起こすために充分な時間、インキュベートすること
ｄ）前記ｃ）で得られた沈殿を上清から分離すること（通常、遠心分離及び／又は濾過）、及び
ｅ）凝固剤として使用する上清を回収すること
を含む。
【００２６】
１つの実施態様としては、少量の抗凝固処理された全血を、例えば酸性キトレートデキストロースのような抗凝固剤を含む採血管や注射筒に、供血者から採血することによって得る。完全だが、しかし穏やかな混合の後、抗凝固処理された全血は清潔なガラス又はプラスチックのチューブに移され、そして、沈殿剤、例えばエタノールを抗凝固処理された全血と混合する。この得られた混合物は、血液中の細胞及び特異的な血漿成分の沈殿を起こすために充分な時間、約２０分から６０分間、室温でインキュベートする。充分な沈殿は、固まりとなった細胞及び不溶性のタンパク質からなる粘性のある沈殿が形成されることによってわかるであろう。
【００２７】
その後、混合物を１，０００−３，０００ｘｇで、約５−３０分遠心分離し、沈殿物をチューブの底に凝集させる。最後に、沈殿の上部の上清をチューブから分離する。上清は、所望の凝固剤を含む混合物の画分である。
【００２８】
１つの実施態様としては、凝固剤を調製するために用いる全血の容量は、少量であり、例えば僅かに８−１０ｍＬであろう。血液は非ヘパリンの抗凝固剤の入った採血管（例えば、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（商標）チューブ）又は注射筒に採血する。本発明で使用することのある抗凝固剤の例として、カルシウムイオン結合又は金属イオン封鎖性の抗凝固剤、例えばキトレートリン酸デキストラン（ＣＰＤ）、酸性キトレートデキストラン（ＡＣＤ）又はクエン酸ナトリウムなどが挙げられる。典型的には、好適な抗凝固剤は酸性キトレートデキストラン（ＡＣＤ）及びＡＣＤ／マンニトールである。
【００２９】
典型的な沈殿剤としては、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムのような成分と同様に、例えばポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、又はエタノールが含まれる。
【００３０】
１つの実施態様としては、エタノールを沈殿剤として使用する。エタノールの終濃度は好ましくは１０％から２５％の間であろう。そのため、８−１０ｍＬの開始全血容量に対して、１−２ｍＬの１００％又は９５％のエタノールを全血に加える。
【００３１】
さらに、０．０５から０．４ｍＬの間の１０％塩化カルシウム溶液を抗凝固剤処理した全血と沈殿剤の混合物に加える。例えば、１つの実施態様として、抗凝固剤処理した開始容量８ｍＬの全血に１．６ｍＬのエタノールと０．１ｍＬの１０％ＣａＣｌ２を使用した。
【００３２】
細胞及び特異的な血漿成分が沈殿を起こすための充分な時間に関して、沈殿をチューブ中で、約５分から４５分内に形成することが期待できる。
【００３３】
１つの実施態様として、最初の全血の容量は１ｍＬのＡＣＤ当たり５−１０ｍｇ濃度のマンニトールを含んだ、ＡＣＤ及びマンニトールの混合物で最初の全血は抗凝固処理されることができる。
【００３４】
本発明の方法を説明するために、以下の実施例を提供する。
実施例１
【００３５】
自己のトロンビン及び全血検体において、関連する血漿タンパク質濃度の比較を、放射性免疫拡散法を使用して行った。全血はＡＣＤ−マンニトール抗凝固剤を含んだチューブに採血した。そして抗凝固処理した全血を２ｍＬの９５％エタノールと３０分間、反応させた。次に、混合物をＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＡ）で遠心し、同時に濃縮血小板を調製した。トロンビンを含む上清を、血清フィルターシステム、例えばｓｅｒｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｓｅｐａｒｅｔｏｒ（例を挙げると、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｒａｎｄ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使って、又は注射筒で上清を吸引することによって、沈殿した細胞成分及び特異的な血漿成分から分離した。
【００３６】
乏血小板血漿は、以下のように調製した。自己のトロンビンを調製するために使用した同じ供血者の、全血をＡＣＤ抗凝固溶液（Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）に採血する。前記血液検体を遠心分離し、血漿試料を試験のために取得した。血漿試料は、放射性免疫拡散解析の基準検体として使用した。
【００３７】
自己のトロンビン（ＡＴ）は前記のように調製した。基本的には、９ｍＬの全血を１ｍＬのＡＣＤ−マンニトール抗凝固剤（Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）中に採血した。８ｍＬの抗凝固処理した血液を１．７ｍｌのエタノール塩化カルシウム溶液（Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）と３０分間室温でインキュベートした。そして、混合物をＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍで遠心した。自己のトロンビンを含む上清を、ｂｌｏｏｄ ｓｅｒｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍを用い、沈殿したタンパク質及び赤血球から分離した。得られた上清をＲＩＤで解析した。
【００３８】
１４人の供血者について、すべてＲＩＤを行った。以下のタンパク質、プロテインＣ、プロテインＳ、アンチトロンビンＩＩＩ、アルブミン、フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子の濃度を解析した。ＰＰＰの検体は、前記タンパク質基準値を得るために解析した。ＡＴを含むＡＴ上清検体は、エタノール分画の結果として除去された前記のタンパク質の比率を計算するため、（前記）タンパク質濃度を測定した。
［放射性免疫拡散法の手順］
【００３９】
ＲＩＤのプレートは、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＵＫ）から入手し、製造メーカーの説明書に従って使用した。前記ＲＩＤプレートは、アルミホイルの袋から取り出し、傷みがないかチェックし、そして１０−１５分室温で放置した。次に、校正用の溶液を静かに混合し、必要に応じて希釈した。対照及び試験検体は、使用の前に１／１０に希釈した。基準物質、対照検体、及び試験検体は、使用前に素早く穏やかに撹拌した。
【００４０】
必要な数のウェルを、５μＬの検体で満たし、３０分間拡散させた。前記プレートを、水平に室温で保存し、少なくとも４８時間の間アルブミンの解析を、７２時間の間アンチトロンビンＩＩＩの解析を、９６時間の間第ＸＩＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、及びフィブリノーゲンを解析を行った。それぞれの反応円の直径に該当する検体濃度を、直接ＲＩＤ参照表から読み取った。
【００４１】
実験の結果を、表１及び２に示した。自己トロンビン調製物の活性は、濃縮血小板を凝固させることによって確認した。２つの比率における凝固時間の平均は、我々の予測の範囲内であった。３つの検体を外部の施設で解析したところ、８５％のトロンビンが調製物中に残存していた。フィブリノーゲンは、完全に自己トロンビン調製物からは除かれていた。トロンビン活性の潜在的阻害物質であるアンチトロンビンＩＩＩは、平均７９．８６±２．６％減少していた。残存しているアンチトロンビンＩＩＩの濃度２０％は、臨床的欠乏の範囲と考えられる。さらに４時間の反応を行っても、ＡＴＩＩＩ、プロテインＣ及びプロテインＳの除去は増加しなかった（データは示していない）。表１は、自己のトロンビン、及び自己トロンビンを調製した全血検体の血漿中の、プロテインＣ、プロテインＳ、及びアンチトロンビンＩＩＩのタンパク質濃度の比較を示している。表２は、同じ検体の第１３因子、アルブミン、及びフィブリノーゲンのレベルを示している。
【表１】
【表２】
【００４２】
そのため、本発明の方法に従って得られた上清は、プロトロンビンートロンビンタンパク質の８０−９０％を含んでいる。上清中にフィブリノーゲンは検出されず、ＡＴＩＩＩ、プロテインＣ及びプロテインＳは、基準値の２０−３０％のみである。
《上清中のヘモグロビンの測定》
【００４３】
６％を越えるエタノール濃度は、全血検体で溶血を引き起こす。前記のように、マンニトールは抗凝固剤に添加されると、微少小胞（ｍｉｃｒｏ ｖｅｓｉｃｌｅ）形成を減らし、エタノールの導入の結果である溶血を減少させる。
【００４４】
表３に示したように、自己のトロンビンの調製物中のヘモグロビン総量の平均は６９ｍｇである。この値は、平均８％の溶血の割合と一致し、局所の適用には重要ではない。
【表３】
《残存エタノール量の測定》
【００４５】
エタノールの百分率（容量／容量）を、認定試験機関（Ｃｈｅｍｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。検査された生成物は、自己トロンビンを作製した全血検体の血漿、自己トロンビン生成物、及び濃縮血小板の集塊から得られた上清が含まれていた。最後の生成物である、血小板ゲルは、以下の局所での適用で存在するエタノール量を含んでいる。
【００４６】
凝固活性化剤として自己トロンビンを使用し、濃縮血小板に凝血塊を形成させた。全血からのＰＰＰの検体、ＡＴ上清、及び凝血塊放出物検体が前記のように、測定のために得られた。測定は５人の供血者について行った。
【００４７】
０．５ｍＬのＰＣを、１２ｘ７５ｍｍのホウケイ酸ガラスの培養チューブに添加した。ＡＴを校正済みのピペットで１：３又は１：５の割合で加えた。チューブは、固形の凝血塊ができるまで前後に傾けた。次に、凝血塊を遠心し、上清を得た。
【００４８】
エタノールの解析は、Ｃｈｅｍｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，Ｍａａｃｈｕｓｅｔｔｓで行った。結果を表４に示す。全血検体中に見られた痕跡量のアルコールは、明らかに放血部位で使用されたアルコールの結果であった。自己トロンビンや血小板のゲル中の濃度は、予想された数値の範囲内だった。
【表４】
【００４９】
そのため、濃縮血小板に凝固剤を混合し、試験管内でゲル化させたときに、残存するエタノール量は、４％未満である。この残存濃度は、生体の創傷部位に適用されるときには、さらに大幅に減少している。
《自己のトロンビンによる濃縮血小板と乏血小板血漿の凝固時間の比較》
【００５０】
試験管内での、実験室凝固時間の実験は、凝固剤の有効性の標準化試験で行った。凝固時間は、自己トロンビンを用い、濃縮血小板及び乏血小板血漿の、凝固を開始させることによって測定した。凝固時間は２重で測定した。個々の反応と個々の凝固時間の計時／記録は、独立して行った。
【００５１】
凝固試験は、遠心後の４回のポイントで行った。上清を移し、ＡＴを回収した直後の０時間と、自己トロンビンの調製後２時間と、４時間と、及び６時間である。簡潔に述べると、０．５ｍＬのＰＣを、１２ｘ７５ｍｍのホウケイ酸ガラスの培養チューブに添加した。校正されたピペットを用い、ＰＣの含まれているチューブに、ＡＴを１：３又は１：５の割合で添加した。ＡＴを添加するとすぐにタイマーをスタートさせた。固形の凝血塊が形成されるまで、チューブを前後に傾けた。タイマーを止めて、凝固時間を記録した。この操作を前記の時間ごとに繰り返した。
【００５２】
自己のトロンビンによる濃縮血小板の凝固時間を表５に示した。
【表５】
【００５３】
０時間と６時間では、２つの混合比で凝固時間に、有意差はなかった。２つの混合比での凝固時間の間には、２時間（ｐ＝０．００４）及び４時間（ｐ＝０．０１３）で有意な差があった。
【００５４】
より特筆すべき事実は、３：１の混合比で、２時間、４時間及び６時間の凝固時間は、０時間より有意に短かった。表６に示したように、３：１の混合比で、０時間では２８．７５％が凝固時間が２０秒かそれより長く、５０％が、１０秒未満だった。その他の時間では、いずれの混合比でも２０秒未満の凝固時間であり、３：１の混合比を用いると、６４−８５％の凝固時間が１０秒又はそれ未満だった。この凝固時間は、これらの実験と同時に行ったウシで見られた４〜６秒の凝固時間と比較しても、勝るとも劣らないものであった。
【表６】
【００５５】
自己トロンビンによる乏血小板血漿の凝固時間の結果は、若干長かったが、濃縮血小板で得られた結果とほぼ同等であった（表７）。０時間において、２つの混合比の間では、有意差（ｐ＝０．６５９）は無かった。３：１の混合比での、２時間と４時間の凝固時間は、０時間と比較して、有意に短かった（ｐ＝０．００１３）。乏血小板血漿の凝固時間は、わずかに再分配（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）があったが、凝固時間は、濃縮血小板のそれと同等であった（表８）。
【表７】
【表８】
《トロンビン当量（ｅｑｕｉｂｑｌｅｎｃｅ）の測定》
［濃縮血小板の凝固時間の比較］
【００５６】
牛トロンビンと比較した自己トロンビンの効力は、１つの濃縮血小板および３つの濃度のヒトフィブリノーゲンを評価材料として使用して測定した。牛トロンビン（ＢＴ）は以下のように調製した。５ｍＬの１０％ＣａＣｌ２溶液を、凍結乾燥の５，０００ｕｎｉｔのバイアルに注入した。そしてＢＴを、１，０００、５００、２５０、１２５、６２．５ｕｎｉｔ／ｍＬの濃度に段階希釈した。次に、ＢＴを１：１０の比率で濃縮血小板に加えた。
【００５７】
凝固時間は、前記のように測定した。表９は、４６６ｘ１０３μＬから１４２８ｘ１０３μＬの範囲の値の濃縮血小板の凝固時間を比較している。自己トロンビンに対する濃縮血小板の混合比が３：１において、自己トロンビンで得られた前記凝固時間の平均は、９．１７±１．７秒だった。２５０ｕ／ｍＬのウシトロンビン濃度で、対応する平均凝固時間（９．００ｘ１．７秒）が得られた。ウシトロンビンの実験が、１０：１（濃縮血漿：トロンビン）の混合比で行われていることを考慮すると、自己トロンビンは、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのウシトロンビンと同等であることを示している。表１０に示すように、５：１の比率の自己トロンビンの凝固時間（１０．８３秒）は、同様な範囲にある。
【表９】
［精製ヒトフィブリノーゲンの異なる濃度での凝固時間］
【００５８】
濃縮血小板（ＰＣ）及び乏血小板血漿（ＰＰＰ）は、以下のようにＳｍａｒｔＰＲｅｐ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍを用いて、その使用説明書に従って、調製した。ＰＰＰを、スペーサーセット（ｓｐａｃｅｒ ｓｅｔ）を有する３０ｍＬの注射筒で取り出し、プラスチックディスポーザブル［Ｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ（ＰＤ）］に７ｍＬの量を残し、そして５０ｍＬのチューブに移し、総量を測った。
【００５９】
血小板は７ｍＬの量に、再懸濁し、目盛りのある５０ｍＬのチューブに移し、総量を測った。０．５ｍＬのＰＣの検体及びＰＰＰをＣＢＣ解析のため、凍結バイアルに移した。
【００６０】
ウシトロンビン（Ｊｏｎｅｓ ＰｈａｒｍａＩｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ＷＩより入手したＢＴ）は、使用のために５０００ｕｎｉｔの乾燥トロンビンのバイアルに５ｍＬの１０％ＣａＣｌ２を注入し調製した。５段階、１０００、５００、２５０、１２５、及び６２．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬにＢＴを希釈し調製した。ＢＴを、フィブリノーゲンと同じ容量の０．５ｍＬで、フィブリノーゲンに対して１：１０の混合比で加えた。
【００６１】
自己トロンビン（ＡＴ）は以下のように調製した。９ｍＬの全血を、１ｍＬのＡＣＤ−マンニトールの凝固剤に、採血した。８ｍＬの抗凝固処理した血液を１．７ｍＬのエタノール−塩化カルシウム溶液と４５分間インキュベートした。次に、混合物を、ＳｍａｒｔＰＲｅｐ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍで遠心し、同時に濃縮血小板を調製した。トロンビンを含む上清を分離チューブで、沈殿したタンパク質及び赤血球から分離した。ＡＴをフィブリノーゲンに１：３及び１：５の混合比で加えた。
【００６２】
ヒトフィブリノーゲンは、Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｓ，ＭＯ）から、乾燥形態で入手し、９１％凝固可能と解析されている。フィブリノーゲンは、蒸留水で６００、３００及び１５０ｍｇ／ｄＬの３つの濃度に希釈し、試験した。
【００６３】
凝固時間は、自己トロンビン及びウシトロンビンを凝固開始物質として、フィブリノーゲンで調べた。自己トロンビンは、９検体の全血から調製した。前記の他の凝固試験と同じように、個々の反応と個々の凝固時間の計時／記録は、独立して行った。
［フィブリノーゲン検査］
【００６４】
０．５ｍＬのフィブリノーゲンを、１２ｘ７５ｍｍのホウケイ酸ガラスの培養チュ−ブに検査済みのピペットを使用して分注した。ＡＴを、検査済みのピペットを用いて１：３又は１：５の混合比で加えた。ＡＴの総量を加えた時に、計時を始めた。固形の凝血塊が形成されるまで、ガラスチューブを前後に傾けた。それからタイマーを止めて、凝固時間を記録した。前記の試験を、自己トロンビンの代わりに、ウシトロンビン／ＣａＣｌ２活性化剤を用いて、繰り返した。
【００６５】
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ‘ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ及びＢｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍａｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の一連の外科手術患者１００人の平均フィブリノーゲン濃度は、２６８±２７ｍｇ／ｄＬであることがわかった。フィブリノーゲンは急性期の反応物質であり、６００−８００ｍｇ／ｄＬの濃度は慢性病態（例えば、慢性静脈又は糖尿病性潰瘍、関節炎、椎間板ヘルニア）の患者では、珍しくない。それは、この研究で選択されたフィブリノーゲン濃度を根拠とした。
【００６６】
表１０に示したように、フィブリノーゲンの３段階の濃度の凝固時間は、自己トロンビンを３：１及び５：１の両方の混合比で使用した、濃縮血小板でみられたものより明らかに長かった。これは、予想外ではなかった、というのは、血小板は試験管内及び生体内両方の凝固塊の形成において、不可欠な役割を果たしているからである（７）。
【表１０】
【００６７】
何段階かに希釈したウシトロンビンによって、いくつかのフィブリノーゲン濃度の凝固時間を測定した時に、これと同じ傾向が見られた。ウシトロンビンが１２５ｕ／ｍＬで、フィブリノーゲンが６００ｍｇ／ｄＬのときの凝固時間は、１３．７５±０．９秒であり、３００ｍｇ／ｄＬのときは１６．２５±３．８秒だった。これらの値は、６００及び３００ｍｇ／ｄＬの濃度のフィブリノーゲンを凝固させるために、自己トロンビンを３：１の混合比で使用した場合にみられた結果と同様である（表１１）。
【表１１】
【００６８】
本発明の方法に従って製造した、自己トロンビン（ＡＴ）を用いた凝固時間（８−１２秒）は、１００ｕ／ｍＬのウシトロンビン及び５００ｕ／ｍＬのヒトトロンビンを用いた、以前の我々の研究の結果と同等である。
《組織培養実験》
【００６９】
Ｓｌａｔｅｒによって、濃縮血小板がヒト胎児骨芽細胞様細胞に促進作用を示し、それらの分化機能を維持することが、報告されている（１０）。また、高濃度の濃縮血小板分泌物（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｒｅｌｅａｓａｔｅ）が、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）の増殖を促進することが証明されている（１１）。この実験の目的は、濃縮血小板と混合した自己トロンビンの残存アルコールが、培養ヒト繊維芽細胞及びｈＭＳＣｓの増殖を阻害するか否かを検証することであった。
【００７０】
濃縮血小板を、自己トロンビン又はウシトロンビンで凝固させ、混合培養システムで、ヒト繊維芽細胞が平板培養されているウェルの上に、挿入した。細胞は３日及び５日培養した。
【００７１】
平板培養されているｈＭＳＣｓを、濃縮血小板分泌物と培養した。分泌物は、ＡＴ又はＢＴで活性化した凝血塊から作製し、３日及び５日培養した。分泌物は直接培養液に加え、細胞と共に培養した。
【００７２】
濃縮血小板は、ＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍを用い、使用説明書に従って調製した。血小板は７ｍＬの容量に再懸濁し、目盛り付きの５０ｍＬチューブに移し総量を測った。
【００７３】
凍結ヒト繊維芽細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ．，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）を溶解し、〜３．３ｘ１０４ｃｅｌｌ／ウェルの密度で、平板培養した。ヒト間葉幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ．，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）、ｈＭＳＣは、ＭＳＣＧＭ ｂｕｌｌｅｔ ｋｉｔ、グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加した基礎培地で、６ウェルプレートに〜３．３ｘ１０４ｃｅｌｌ／ウェルで平板培養した。
【００７４】
ウシトロンビン（ＢＴ）／ＣａＣｌ２及び自己トロンビン（ＡＴ）は、前記のように調製した。ＢＴ及びＡＴを、ＰＣにそれぞれ１：１０及び１：３の混合比で加えた。
【００７５】
繊維芽細胞とｈＭＳＣの増殖実験において、凝血塊は凝固活性化剤として自己トロンビンやウシトロンビンを用いて、濃縮血小板で形成させた。培養繊維芽細胞に供給された混合物は、３日、５日、及び７日間培養され、一方、ｈＭＳＣｓに供給された混合物は、２時間、及び３日及び５日間インキュベートした。対照としては、培養液の上部に、空の挿入物をおいた。
【００７６】
繊維芽細胞には、血小板ゲルの挿入物を介して、凝血塊分泌物が供給された。ｈＭＳＣｓは、凝血塊を含む試験チューブを遠心し、そして分泌物をｈＭＳＣに直接添加することにより、凝血塊分泌物が供給された。
【００７７】
６本の滅菌チューブがそれぞれの混合物のために準備された。
１．濃縮血小板及びウシトロンビン；
２．濃縮血小板及び自己トロンビン；及び
３．濃縮血小板及び自己凝固促進剤
【００７８】
２ｍＬの新鮮な培地を、プレートの各ウェルに添加した。自己トロンビン、ウシトロンビン、又は自己凝固促進剤を含んだ膜挿入物を調製し、凝固させ、そして繊維芽細胞を含むウェルの上部においた。対照としては、空の挿入物及び培地を上部に調製した。次に、１．５ｍＬの予め暖めておいた培地を、それぞれの挿入物の上部に加えた。培養は、３７度、５％ＣＯ２で４８時間行った。
【００７９】
培養の開始時に、それぞれの挿入物の１つを外して、細胞を撮影した。５日目に、すべての挿入物を外し、細胞を撮影した。すべての挿入物は３日、５日、又は７日の間インキュベートし、それぞれの時間に挿入物を外し、細胞の状態を検査、撮影し実験を繰り返した。
［ヒト間葉幹細胞の培養］
【００８０】
プレートでの培養後、細胞はおよそ２．５時間で付着した。前記ＰＣ−活性化剤混合物は、２時間インキュベートした。古い培地を培養から吸引し、予め暖めておいた１０％ＡＴ−ＰＣの分泌物又は１０％ＢＴ−ＰＣ分泌物を含む、新鮮な培地を細胞に直接加えた。４８時間後、プレートは検査され、撮影された。実験は３日及び５日の分泌物について繰り返した。
【００８１】
ＡＴ及びＢＴで調製した凝血塊と培養したヒト繊維芽細胞は、対照の細胞と比較して、すべて正常に見え、充分に増殖していた（データは示さず）。ＡＴ及びＢＴからの分泌物と培養したｈＭＳＣｓは、外見は正常で、対照の細胞と比較しても充分に増殖していた。
【００８２】
また組織培養実験を、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を使用し、ＡＴ及びＢＴ凝固剤を濃縮血小板と混合した凝血塊上清と、培養することによって行なった。
対照群と試験混合物に１時間暴露処理した群では、細胞の形態又は密度に変化はなかった。ＢＴの上清との接触後２４時間培養した群では、核の高密度化（ｄｅｎｓｅ）を伴った細胞の球形化が見られた。ＡＴで処理した群の細胞の形態は、対照群と同様であった。
《成長因子分泌の動態》
【００８３】
創傷治療において、血小板は２つの役割を持っている。血小板は、凝固の工程に関与し止血を達成し、そして創傷治癒のカスケードの開始時に血小板が放出した成長因子の貯蔵庫となる。成長因子は、様々な作用があるけれども、注射時や摂取時には、速やかに分解される。そのため、血小板ゲルからの成長因子の制御された持続的な放出は、創傷治癒に於ける本発明の重要な観点である。
【００８４】
血小板のアルファ顆粒から、成長因子を放出させるために、活性化剤を使用することが必要である。以下の実験で使用されている方法は、血小板ゲルを産生するために、臨床的に使用されている方法と同一のものであり、そして生体で起こっている工程と非常に似ている。現在、成長因子の放出は、ウシトロンビン／塩化カルシウム混合物と濃縮血小板の混合によって、開始される。この実験はウシトロンビン及び自己トロンビンによる、放出動態を比較している。放出動態は、活性化剤であるウシトロンビン及び自己トロンビンに晒された、濃縮血小板が形成した凝血塊（血小板ゲル）から発現する上清を集め、測定した。血小板ゲルの調製後、１、２、及び４時間、そしてその後は６日まで毎日、遠心を行い上清を収集した。上清は検査まで−８０度で保存した。成長因子（ヒト血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ））の濃度は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、測定した。
【００８５】
濃縮血小板及び乏血小板血漿は、下記のように調製した。全血は６０ｍＬの注射筒で採血した。濃縮血小板（ＰＣ）及び乏血小板血漿（ＰＰＰ）はＳｍａｒｔＰＲｅｐ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍを用いて、その使用説明書に従って、調製した。血小板は１０ｍＬの血漿に再懸濁し、その濃縮物は、目盛りのある５０ｍＬのバイアルに移した。０．５ｍＬのＰＣ及びＰＰＰの検体は、ＣＢＣ解析のため、凍結（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ）バイアルに入れた。
【００８６】
ウシトロンビンは、前記のように調製し、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬの希釈で使用した。ＢＴは１：１０の割合でＰＣに添加する。自己トロンビン（ＡＴ）は、前記のように調製し、１：３の混合比でＰＣに添加した。
【００８７】
凝血塊活性剤として自己トロンビン及びウシトロンビンを用いて、ＰＣで凝血塊を形成した。１、２、及び４時間、そしてその後は、毎日６日の間培養されてきた凝血塊から分離された上清について、測定を行なった。すべての検体のＰＤＧＦ−ＡＢ成長因子の濃度が測定された。すべての測定は、以下のように２重に測定した。
【００８８】
１．０ｍＬのＰＣは、ホウケイ酸ガラスの培養チューブに検査済みのピペットを用いて、分注した。次に検体は、ＢＴを１：１０の割合で添加すること、又はＡＴを１：３の割合で添加すること、のいずれかにより凝固させた。活性化剤がＰＣに加えられるとすぐに、凝血塊は一定時間、室温で培養された。培養終了後、凝血塊はＳｏｒｖａｌ ＲＣ３Ｃ遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ）で、Ｈ４０００ローターを用い、２５００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を分離し、その容量を測定し、凍結チューブに移し、−８０度で、測定まで保存した。
【００８９】
前記の手順を、１、２、及び４時間、そしてその後は６日まで毎日行なった。すべてのポイントで、使用説明書に従ってＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定し、得られた測定値を利用して成長因子の濃度を計算した。
【００９０】
濃縮血小板、血小板収量と成長因子の放出は、すべての生物学的モデルと同様に、それぞれの個体のバラツキに影響される。以下のデータが示すように、活性化剤による血小板からの成長因子の放出は、或る程度のバラツキがある。このバラツキは、活性化剤がウシトロンビン、ＡＤＰ又は自己トロンビンであろうと無かろうと存在する。図３ないし７は、ウシトロンビン及び自己トロンビンで活性化された５人の供血者濃縮血小板血液検体の、試験管内での成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＴＧＦ−β１）の放出動態を示している。
【００９１】
この試験内測定モデルでは、凝血塊の形成後４時間内で、ウシトロンビンによる完全な成長因子の放出が起こり、７日までの期間に段階的に減少する。自己トロンビンでは、成長因子は次第に増加し、４８から７２時間後に最大濃度に達する。この成長因子の最大濃度は、ウシトロンビンを使用したときに見られた成長因子濃度に対し最小でも８０％に達し、又はウシトロンビンを使用したときの最大成長因子濃度を越えるほどに達することもある。
【００９２】
我々は以前、血小板数と成長因子濃度に直接的な関連があることを証明した（８）。本研究において、濃縮血小板は１０ｍＬに再懸濁した。臨床的には自己トロンビンは、７ｍＬに懸濁された濃縮血小板に対して使用する。これは濃縮血小板から放出される成長因子濃度を３０％まで増加させるだろう。
【００９３】
注射で投与された成長因子の生体内での半減期は分単位であり、そしてそのため持続性の緩やかな増加が、より有益で好ましい（９）。自己トロンビンによる成長因子の放出動態は、緩やかな持続性の増加を支える。ウシトロンビンは、成長因子をすぐに放出し、さらに長期間にわたり増加することはない。
【００９４】
従って、本発明の方法は、臨床的に適用できる成長因子の持続的な放出を可能にするシステムを提供する。放出動態を測定するため、同じ濃縮血小板をＢＴ又はＡＴによって形成させた凝血塊の上清を凝血後決められた時間に回収し、成長因子を測定した。ＢＴの濃縮血小板に対する適用は、成長因子の中程度の放出をもたらし、５日間の観察期間中にさらなる増加は見られない。ＡＴでの成長因子の放出動態は、適用の４時間で２０−３０％の分泌があり、日ごとに放出が増加し、適用後５日目までに最大に達する。
【００９５】
効果が早くウシ由来でない凝固剤の調製のための、開示された方法の利用を容易にするため、いくつかの試薬及び医療器具をまとめて、自給式のキットとして提供できる。
【００９６】
本発明の方法の実施のための実際上の使用のためのキットの１つの実施態様は、
・ ストッパー付のガラス又はプラスチックチューブ
・ 血清フィルターシステム、例えば、血清分離器具、沈殿から上清を吸引する ために最適な平滑なカニューレ、又はピペットシステム。
・ 平滑な針のついた３ｍＬの注射筒
・ 平滑な針のついた１０ｍＬの注射筒
・ ＡＣＤ又はＡＣＤ／マンニトールを含んだバイアル
・ ＥＴＯＨ／ＣａＣｌ２を含んだバイアル
・ ＴｒａｙＰａｋ（商標）と説明書
【００９７】
また、本発明は、下記の特徴を持った自己又は同種の凝固剤の調製方法を提供する。
１．それは、全血検体から調製することができる。
２．調製の工程の反応は室温で行うことができる
３．工程は、ＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）ｓｙｓｔｅｍを使用して、血小板濃縮と 同時に又は独立して調製することができる。
４．全血と沈殿剤の反応時間は４５分か、又はそれ未満である
５．得られた自己凝固剤の調製物は、濃縮血小板又は乏血小板血漿を臨床的に許容 可能な時間内に凝固させる十分な濃度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）がある。
６．自己凝固剤は、濃縮血小板又は乏血小板血漿と伴に、様々な方法や器具で提供 されることができる。
７．本発明の自己凝固剤は、直接創傷部位（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）に適用すること ができる。
【参照文献】
【００９８】
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【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は２００３年１月２７日に出願された、米国仮出願第６０／４４２，９７４号を優先権主張した非仮出願であり、その全内容は参照として本願に含まれる。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、抗凝固処理した全血からの、効果の早い自己又は同種の凝固剤の生産方法に関するものである。
【発明の背景】
【０００３】
ヒト又は動物血漿由来のトロンビンは、血液や血液誘導体〔精製フィブリノーゲン、多血小板血漿（ＰＲＰ）、濃縮血小板（ＰＣ）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）〕の効果的な凝固剤である。トロンビンはフィブリノーゲンに働き、フィブリノーゲンをフィブリンに変え、フィブリンマトリックスの形成をもたらす。止血剤としては、ウシのトロンビン（ＢＴ）の臨床的な使用が一般的である。一方、ヒトの血漿由来トロンビンは、局所の止血剤として、例えばティセル（商標）・フィブリン・シーラント（バクスターコーポレーション）のような、ヒト血漿由来フィブリンシーラント、及び様々な外科的処置のヒト血漿由来創傷シーラントと組み合わせて使用することが認可されているのみである。
【０００４】
ウシ由来トロンビンは、外科的領域において、臨床的に止血を行うための処置の標準として、数十年間利用されてきた。ウシ由来トロンビンは、溶媒洗浄剤で処理されたヒトのプール血漿由来のフィブリンシーラントを調製する手段として利用されてきた。また、ウシトロンビンを使用して、試験室（例えば血液銀行）で調製された寒冷沈降物、及びポイントオブケアで調製された多血小板血漿、濃縮血小板、乏血小板血漿（それぞれ、ＰＲＰ、ＰＣ及びＰＰＰと称する）を凝固させる。
【０００５】
ウシのトロンビンの使用に関連するリスクとして、疾患（ウシ海綿状脳症、ＢＳＥ）の伝搬の可能性、及びヒト第Ｖ因子に対する抗体の産生が挙げられる。ウシトロンビンの臨床用途によるＢＳＥの感染の報告は、文字どおり無いが、異常な出血時間をもたらした抗体産生の報告がある（１−５）。クロマトグラフィーで精製したウシトロンビンの局所的な暴露の後に、ヒト第Ｖ因子の阻害物質が、報告されてきた（６）。局所のウシトロンビンへの暴露は、複数のタンパク質や糖鎖抗原に対する抗体の産生を引き起こしてきた。これらの抗体は暴露された患者の３０％から５５％で報告され、抗核抗体ばかりでなく、カルジオリピンの性質を持っている（７，８）。
【０００６】
ウシトロンビンの使用に関連した問題の結果として、患者自身の血液（自己）又は供血者の血液（同種）から調製する代替の凝固剤が研究されてきている。
【０００７】
今まで、本発明者は、１分から５分の凝固時間をもつ凝固促進剤を生産してきた。そして、凝固促進剤は、ＰＲＰ又はＰＰＰと混合されたとき、及び硬質の移植組織片材料（例えば自己移植、異種移植、外来移植、及び合成）に塗布されると、効果的であることが証明されてきている。これらの材料に塗布された前記組成物は、移植材料の硬化をもたらし、それによって取扱適正を改良し、及び外科的欠陥部位への輸送を簡易化する。結果として得られたこの形態の移植材料は、欠陥部位にぴったり適合し、そして安定化されることができる。また、ＰＲＰ及びＰＣ中に存在する特定のタンパク質も、より迅速な傷の回復に寄与している。
【０００８】
１分から５分の凝固時間の凝固促進剤は、前記の適応においては効果的でもあるけれども、特定の軟組織への適用は効果的でないかもしれず、その結果、早い凝固時間を持つ、ウシ由来でない凝固剤が必要となる。日常的に止血を行うためには、およそ１０秒（ウシのトロンビンで標準的）の凝固時間が、必要とされる。それより長い凝固時間はより好ましくなく、毛細血管出血の制御のためには、より効果的でないことがある。
【０００９】
今まで、ウシ由来でない効果の早い凝固剤の開発研究は、血液の細胞成分の分離、そして血液の血漿画分からタンパク質を分離するための様々な方法の適用に焦点が当てられてきた。寒冷沈降、物理化学的沈殿、マイクロフィルター技術の使用、密度勾配法などの方法が使用されている。血漿分画が分離され、そして解析されてきている。
【００１０】
さらに、様々な一般に知られている沈殿剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、硫酸アンモニウム、及びエタノールも、また研究されてきている。それぞれの薬剤は特定のタンパク質の分離において、一定の利点を有しているが、一方で他のタンパク質の部分的沈殿をもたらす。それにもかかわらず、これらの沈殿剤が、分離工程の最大の効果を達成するために、無細胞の血漿に利用され、適用されてきている。
【００１１】
最近まで、前記第１の焦点は、いくつかのエタノールの使用濃度に当てられており、例えば無細胞の血漿に１０％−２５％のエタノールが適用されていた（ＵＳパテントＮｏ．６，２７４，０９０は、例えば１人の供血者からのプラズマから安定なトロンビンの成分の調製の方法を開示している）。この方法に使用しているトロンビンの調製は時間を要し、そして血漿をエタノールと混合させる前に、最初に全血からの血漿画分を調製する必要があるので、多数の工程を必要とする。
【００１２】
血漿に適用される特定のエタノールの濃度は、ＰＲＰ又はＰＰＰを凝固させるための、例えば５秒から１５秒（ＵＳパテントＮｏ．６，２７４，０９０）の改良された凝固時間を提供してきた。しかし組成物の調製後１時間で、凝固時間は２５秒より長くなり、調製から２時間後には、凝固時間は４０秒より長くなった。
【００１３】
そのため、求められていることは、自己又は同種の凝固剤の調製のための方法であって、前記方法は、少容量の全血から２０秒より少ない時間で凝固する凝固剤を産生すること、４時間より長く活性を維持する凝固剤を産生すること、及び総調製時間が６０分より短い凝固剤を産生することである。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者は、血漿分離工程を省略すること、及び抗凝固処理済みの全血に直接沈殿剤を添加することによって、早い凝固時間を有しており、その組成物によって長時間、その凝固時間が維持される、ヒト凝固剤が得られることを見出した。それにより、凝固剤の調製に必要な総時間は、血漿分画の分離の所要時間の分、減少した。
【００１５】
注目すべきことに、本発明の方法によって生産される凝固剤の性能の有効性は、血漿の分離工程を省略する結果として起こる、若干の溶血によって減少することはない。更に、特定の論理に固執することはないが、赤血球の存在が細胞集塊や阻害タンパク質の沈殿に、実質的に寄与しているのではないかと考えられる。
【００１６】
従って、１つの観点としては、本発明は、抗凝固処理した全血からの効果の早い凝固剤を調製するための迅速法に関するものである。この方法は、供血者からのある容量の抗凝血処理した全血を得ること、前記抗凝固処理した全血と沈殿剤を混合すること、細胞及び血漿成分の沈殿が起きるように充分な時間混合物をインキュベートすること、そして、その後に、即効性の凝固剤を含んでいる上清を得るために沈殿を分離することとを含む。
【００１７】
関連した観点としては、前記発明は、抗凝固処理した全血からの自己凝固剤を調製するための迅速法に関するものである。この方法は、凝固剤が調製される患者からある容量の抗凝固処理した全血を得ること、前記抗凝固処理した全血と沈殿剤を混合すること、細胞及び血漿成分の沈殿が起きるように充分な時間、混合物をインキュベートすること、そして、その後に、その前記上清中に自己又は同種の凝固剤を含んでいる上清を取得するために得られた沈殿を分離することとを含む。
【００１８】
本発明の方法は、患者又は同種の供血者から得られた約８〜１０ｍＬの比較的少量の全血と同じように、必要に応じ様々な量の凝固剤を生産するように比率を変えることが可能である。全血は抗凝固剤、例えば、ＡＣＤで抗凝固処理するが、場合により、ＡＣＤは５−１０ｍｇ／ｍＬの濃度のマンニトールを含む。
【００１９】
別の観点としては、（本）発明は血清分離を必要としない自己の凝固剤の調製方法に関すものである。本発明の方法は、事前に全血から分離した血漿とは対照的に、抗凝固処理された全血を、例えばエタノールのような沈殿剤で、直接沈殿することを含んでいる。
【００２０】
関連した観点としては、（本）発明は、前記方法によって生産されるヒト血液画分に関するものである。その画分はプロトロンビン−トロンビンタンパク質８０−９０％を含み、検出可能なフィブリノーゲンは含まず、ＡＴＩＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳの基準値レベル２０−３０％を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図１は、５人の供血者の、トロンビンで活性化された血小板濃縮血液検体から放出されたＰＤＧＦ−ＡＢの濃度と血小板数の関係を示したグラフである。
【００２２】
図２は、５人の供血者の、トロンビンで活性化された血小板濃縮血液検体から放出されたＴＧＦ−β１の濃度と血小板数の関係を示したグラフである。
【００２３】
図３−７は、５人の供血者のウシトロンビン又は自己のトロンビンで活性化された濃縮血小板のＰＤＧＦ−ＡＢ及びＴＧＦ−β１の成長因子放出動態を示したグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本願でリスト化された、すべての特許、出願、出版物、又は他の参考文献は、参照によって本願に盛込まれている。下記の記載のように、専門用語の使用に関しては慣用されているものに従う。
ＡＣＤ ａｃｉｄ−ｃｉｔｒａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ
（酸性キトレートデキストロース）
ＣａＣｌ２ 塩化カルシウム
ＣＰＤ ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ
（キトレートリン酸デキストロース）
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＴＯＨ エタノール、エチルアルコール
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＰＰ ｐａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ（乏血小板血漿）
ＰＲＰ ｐａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ（多血小板血漿）
ＰＣ ｐａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（濃縮血小板）
「抗凝固剤」という用語は、全血の凝固を防止することのできる物質を意味している。
「自己血」という用語は、患者自身の血液を意味している。
「同種血」という用語は、凝固剤を調製する個人以外の血液提供者から得られる血液を意味している。
「凝固剤」という用語は、全血又は血液成分（血漿、血小板）が凝血塊を形成させることができる物質を意味している。
【００２５】
本発明に関連する自己凝固剤の分離の方法論はエタノール分画法を改変したものを基礎としている。しかしながら標準で、又は一般に使用されている開始材料である、血漿や寒冷沈殿の乏血漿と比較すると、前記工程は全血を利用している。従って、本発明の方法は、
ａ）供血者から１容量の抗凝固処理された全血を得ること
ｂ）沈殿剤と抗凝固処理された全血とを混合すること
ｃ）前記ｂ）の混合物を細胞及び特定の血漿成分の沈殿を起こすために充分な時間、インキュベートすること
ｄ）前記ｃ）で得られた沈殿を上清から分離すること（通常、遠心分離及び／又は濾過）、及び
ｅ）凝固剤として使用する上清を回収すること
を含む。
【００２６】
１つの実施態様としては、少量の抗凝固処理された全血を、例えば酸性キトレートデキストロースのような抗凝固剤を含む採血管や注射筒に、供血者から採血することによって得る。完全だが、しかし穏やかな混合の後、抗凝固処理された全血は清潔なガラス又はプラスチックのチューブに移され、そして、沈殿剤、例えばエタノールを抗凝固処理された全血と混合する。この得られた混合物は、血液中の細胞及び特異的な血漿成分の沈殿を起こすために充分な時間、約２０分から６０分間、室温でインキュベートする。充分な沈殿は、固まりとなった細胞及び不溶性のタンパク質からなる粘性のある沈殿が形成されることによってわかるであろう。
【００２７】
その後、混合物を１，０００−３，０００ｘｇで、約５−３０分遠心分離し、沈殿物をチューブの底に凝集させる。最後に、沈殿の上部の上清をチューブから分離する。上清は、所望の凝固剤を含む混合物の画分である。
【００２８】
１つの実施態様としては、凝固剤を調製するために用いる全血の容量は、少量であり、例えば僅かに８−１０ｍＬであろう。血液は非ヘパリンの抗凝固剤の入った採血管（例えば、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（商標）チューブ）又は注射筒に採血する。本発明で使用することのある抗凝固剤の例として、カルシウムイオン結合又は金属イオン封鎖性の抗凝固剤、例えばキトレートリン酸デキストラン（ＣＰＤ）、酸性キトレートデキストラン（ＡＣＤ）又はクエン酸ナトリウムなどが挙げられる。典型的には、好適な抗凝固剤は酸性キトレートデキストラン（ＡＣＤ）及びＡＣＤ／マンニトールである。
【００２９】
典型的な沈殿剤としては、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムのような成分と同様に、例えばポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、又はエタノールが含まれる。
【００３０】
１つの実施態様としては、エタノールを沈殿剤として使用する。エタノールの終濃度は好ましくは１０％から２５％の間であろう。そのため、８−１０ｍＬの開始全血容量に対して、１−２ｍＬの１００％又は９５％のエタノールを全血に加える。
【００３１】
さらに、０．０５から０．４ｍＬの間の１０％塩化カルシウム溶液を抗凝固剤処理した全血と沈殿剤の混合物に加える。例えば、１つの実施態様として、抗凝固剤処理した開始容量８ｍＬの全血に１．６ｍＬのエタノールと０．１ｍＬの１０％ＣａＣｌ２を使用した。
【００３２】
細胞及び特異的な血漿成分が沈殿を起こすための充分な時間に関して、沈殿をチューブ中で、約５分から４５分内に形成することが期待できる。
【００３３】
１つの実施態様として、最初の全血の容量は１ｍＬのＡＣＤ当たり５−１０ｍｇ濃度のマンニトールを含んだ、ＡＣＤ及びマンニトールの混合物で最初の全血は抗凝固処理されることができる。
【００３４】
本発明の方法を説明するために、以下の実施例を提供する。
実施例１
【００３５】
自己のトロンビン及び全血検体において、関連する血漿タンパク質濃度の比較を、放射性免疫拡散法を使用して行った。全血はＡＣＤ−マンニトール抗凝固剤を含んだチューブに採血した。そして抗凝固処理した全血を２ｍＬの９５％エタノールと３０分間、反応させた。次に、混合物をＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＡ）で遠心し、同時に濃縮血小板を調製した。トロンビンを含む上清を、血清フィルターシステム、例えばｓｅｒｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｓｅｐａｒｅｔｏｒ（例を挙げると、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｒａｎｄ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使って、又は注射筒で上清を吸引することによって、沈殿した細胞成分及び特異的な血漿成分から分離した。
【００３６】
乏血小板血漿は、以下のように調製した。自己のトロンビンを調製するために使用した同じ供血者の、全血をＡＣＤ抗凝固溶液（Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）に採血する。前記血液検体を遠心分離し、血漿試料を試験のために取得した。血漿試料は、放射性免疫拡散解析の基準検体として使用した。
【００３７】
自己のトロンビン（ＡＴ）は前記のように調製した。基本的には、９ｍＬの全血を１ｍＬのＡＣＤ−マンニトール抗凝固剤（Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）中に採血した。８ｍＬの抗凝固処理した血液を１．７ｍｌのエタノール塩化カルシウム溶液（Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）と３０分間室温でインキュベートした。そして、混合物をＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍで遠心した。自己のトロンビンを含む上清を、ｂｌｏｏｄ ｓｅｒｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍを用い、沈殿したタンパク質及び赤血球から分離した。得られた上清をＲＩＤで解析した。
【００３８】
１４人の供血者について、すべてＲＩＤを行った。以下のタンパク質、プロテインＣ、プロテインＳ、アンチトロンビンＩＩＩ、アルブミン、フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子の濃度を解析した。ＰＰＰの検体は、前記タンパク質基準値を得るために解析した。ＡＴを含むＡＴ上清検体は、エタノール分画の結果として除去された前記のタンパク質の比率を計算するため、（前記）タンパク質濃度を測定した。
［放射性免疫拡散法の手順］
【００３９】
ＲＩＤのプレートは、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＵＫ）から入手し、製造メーカーの説明書に従って使用した。前記ＲＩＤプレートは、アルミホイルの袋から取り出し、傷みがないかチェックし、そして１０−１５分室温で放置した。次に、校正用の溶液を静かに混合し、必要に応じて希釈した。対照及び試験検体は、使用の前に１／１０に希釈した。基準物質、対照検体、及び試験検体は、使用前に素早く穏やかに撹拌した。
【００４０】
必要な数のウェルを、５μＬの検体で満たし、３０分間拡散させた。前記プレートを、水平に室温で保存し、少なくとも４８時間の間アルブミンの解析を、７２時間の間アンチトロンビンＩＩＩの解析を、９６時間の間第ＸＩＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、及びフィブリノーゲンを解析を行った。それぞれの反応円の直径に該当する検体濃度を、直接ＲＩＤ参照表から読み取った。
【００４１】
実験の結果を、表１及び２に示した。自己トロンビン調製物の活性は、濃縮血小板を凝固させることによって確認した。２つの比率における凝固時間の平均は、我々の予測の範囲内であった。３つの検体を外部の施設で解析したところ、８５％のトロンビンが調製物中に残存していた。フィブリノーゲンは、完全に自己トロンビン調製物からは除かれていた。トロンビン活性の潜在的阻害物質であるアンチトロンビンＩＩＩは、平均７９．８６±２．６％減少していた。残存しているアンチトロンビンＩＩＩの濃度２０％は、臨床的欠乏の範囲と考えられる。さらに４時間の反応を行っても、ＡＴＩＩＩ、プロテインＣ及びプロテインＳの除去は増加しなかった（データは示していない）。表１は、自己のトロンビン、及び自己トロンビンを調製した全血検体の血漿中の、プロテインＣ、プロテインＳ、及びアンチトロンビンＩＩＩのタンパク質濃度の比較を示している。表２は、同じ検体の第１３因子、アルブミン、及びフィブリノーゲンのレベルを示している。
【表１】
【表２】
【００４２】
そのため、本発明の方法に従って得られた上清は、プロトロンビンートロンビンタンパク質の８０−９０％を含んでいる。上清中にフィブリノーゲンは検出されず、ＡＴＩＩＩ、プロテインＣ及びプロテインＳは、基準値の２０−３０％のみである。
《上清中のヘモグロビンの測定》
【００４３】
６％を越えるエタノール濃度は、全血検体で溶血を引き起こす。前記のように、マンニトールは抗凝固剤に添加されると、微少小胞（ｍｉｃｒｏ ｖｅｓｉｃｌｅ）形成を減らし、エタノールの導入の結果である溶血を減少させる。
【００４４】
表３に示したように、自己のトロンビンの調製物中のヘモグロビン総量の平均は６９ｍｇである。この値は、平均８％の溶血の割合と一致し、局所の適用には重要ではない。
【表３】
《残存エタノール量の測定》
【００４５】
エタノールの百分率（容量／容量）を、認定試験機関（Ｃｈｅｍｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。検査された生成物は、自己トロンビンを作製した全血検体の血漿、自己トロンビン生成物、及び濃縮血小板の集塊から得られた上清が含まれていた。最後の生成物である、血小板ゲルは、以下の局所での適用で存在するエタノール量を含んでいる。
【００４６】
凝固活性化剤として自己トロンビンを使用し、濃縮血小板に凝血塊を形成させた。全血からのＰＰＰの検体、ＡＴ上清、及び凝血塊放出物検体が前記のように、測定のために得られた。測定は５人の供血者について行った。
【００４７】
０．５ｍＬのＰＣを、１２ｘ７５ｍｍのホウケイ酸ガラスの培養チューブに添加した。ＡＴを校正済みのピペットで１：３又は１：５の割合で加えた。チューブは、固形の凝血塊ができるまで前後に傾けた。次に、凝血塊を遠心し、上清を得た。
【００４８】
エタノールの解析は、Ｃｈｅｍｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，Ｍａａｃｈｕｓｅｔｔｓで行った。結果を表４に示す。全血検体中に見られた痕跡量のアルコールは、明らかに放血部位で使用されたアルコールの結果であった。自己トロンビンや血小板のゲル中の濃度は、予想された数値の範囲内だった。
【表４】
【００４９】
そのため、濃縮血小板に凝固剤を混合し、試験管内でゲル化させたときに、残存するエタノール量は、４％未満である。この残存濃度は、生体の創傷部位に適用されるときには、さらに大幅に減少している。
《自己のトロンビンによる濃縮血小板と乏血小板血漿の凝固時間の比較》
【００５０】
試験管内での、実験室凝固時間の実験は、凝固剤の有効性の標準化試験で行った。凝固時間は、自己トロンビンを用い、濃縮血小板及び乏血小板血漿の、凝固を開始させることによって測定した。凝固時間は２重で測定した。個々の反応と個々の凝固時間の計時／記録は、独立して行った。
【００５１】
凝固試験は、遠心後の４回のポイントで行った。上清を移し、ＡＴを回収した直後の０時間と、自己トロンビンの調製後２時間と、４時間と、及び６時間である。簡潔に述べると、０．５ｍＬのＰＣを、１２ｘ７５ｍｍのホウケイ酸ガラスの培養チューブに添加した。校正されたピペットを用い、ＰＣの含まれているチューブに、ＡＴを１：３又は１：５の割合で添加した。ＡＴを添加するとすぐにタイマーをスタートさせた。固形の凝血塊が形成されるまで、チューブを前後に傾けた。タイマーを止めて、凝固時間を記録した。この操作を前記の時間ごとに繰り返した。
【００５２】
自己のトロンビンによる濃縮血小板の凝固時間を表５に示した。
【表５】
【００５３】
０時間と６時間では、２つの混合比で凝固時間に、有意差はなかった。２つの混合比での凝固時間の間には、２時間（ｐ＝０．００４）及び４時間（ｐ＝０．０１３）で有意な差があった。
【００５４】
より特筆すべき事実は、３：１の混合比で、２時間、４時間及び６時間の凝固時間は、０時間より有意に短かった。表６に示したように、３：１の混合比で、０時間では２８．７５％が凝固時間が２０秒かそれより長く、５０％が、１０秒未満だった。その他の時間では、いずれの混合比でも２０秒未満の凝固時間であり、３：１の混合比を用いると、６４−８５％の凝固時間が１０秒又はそれ未満だった。この凝固時間は、これらの実験と同時に行ったウシで見られた４〜６秒の凝固時間と比較しても、勝るとも劣らないものであった。
【表６】
【００５５】
自己トロンビンによる乏血小板血漿の凝固時間の結果は、若干長かったが、濃縮血小板で得られた結果とほぼ同等であった（表７）。０時間において、２つの混合比の間では、有意差（ｐ＝０．６５９）は無かった。３：１の混合比での、２時間と４時間の凝固時間は、０時間と比較して、有意に短かった（ｐ＝０．００１３）。乏血小板血漿の凝固時間は、わずかに再分配（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）があったが、凝固時間は、濃縮血小板のそれと同等であった（表８）。
【表７】
【表８】
《トロンビン当量（ｅｑｕｉｂｑｌｅｎｃｅ）の測定》
［濃縮血小板の凝固時間の比較］
【００５６】
牛トロンビンと比較した自己トロンビンの効力は、１つの濃縮血小板および３つの濃度のヒトフィブリノーゲンを評価材料として使用して測定した。牛トロンビン（ＢＴ）は以下のように調製した。５ｍＬの１０％ＣａＣｌ２溶液を、凍結乾燥の５，０００ｕｎｉｔのバイアルに注入した。そしてＢＴを、１，０００、５００、２５０、１２５、６２．５ｕｎｉｔ／ｍＬの濃度に段階希釈した。次に、ＢＴを１：１０の比率で濃縮血小板に加えた。
【００５７】
凝固時間は、前記のように測定した。表９は、４６６ｘ１０３μＬから１４２８ｘ１０３μＬの範囲の値の濃縮血小板の凝固時間を比較している。自己トロンビンに対する濃縮血小板の混合比が３：１において、自己トロンビンで得られた前記凝固時間の平均は、９．１７±１．７秒だった。２５０ｕ／ｍＬのウシトロンビン濃度で、対応する平均凝固時間（９．００ｘ１．７秒）が得られた。ウシトロンビンの実験が、１０：１（濃縮血漿：トロンビン）の混合比で行われていることを考慮すると、自己トロンビンは、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのウシトロンビンと同等であることを示している。表１０に示すように、５：１の比率の自己トロンビンの凝固時間（１０．８３秒）は、同様な範囲にある。
【表９】
［精製ヒトフィブリノーゲンの異なる濃度での凝固時間］
【００５８】
濃縮血小板（ＰＣ）及び乏血小板血漿（ＰＰＰ）は、以下のようにＳｍａｒｔＰＲｅｐ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍを用いて、その使用説明書に従って、調製した。ＰＰＰを、スペーサーセット（ｓｐａｃｅｒ ｓｅｔ）を有する３０ｍＬの注射筒で取り出し、プラスチックディスポーザブル［Ｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ（ＰＤ）］に７ｍＬの量を残し、そして５０ｍＬのチューブに移し、総量を測った。
【００５９】
血小板は７ｍＬの量に、再懸濁し、目盛りのある５０ｍＬのチューブに移し、総量を測った。０．５ｍＬのＰＣの検体及びＰＰＰをＣＢＣ解析のため、凍結バイアルに移した。
【００６０】
ウシトロンビン（Ｊｏｎｅｓ ＰｈａｒｍａＩｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ＷＩより入手したＢＴ）は、使用のために５０００ｕｎｉｔの乾燥トロンビンのバイアルに５ｍＬの１０％ＣａＣｌ２を注入し調製した。５段階、１０００、５００、２５０、１２５、及び６２．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬにＢＴを希釈し調製した。ＢＴを、フィブリノーゲンと同じ容量の０．５ｍＬで、フィブリノーゲンに対して１：１０の混合比で加えた。
【００６１】
自己トロンビン（ＡＴ）は以下のように調製した。９ｍＬの全血を、１ｍＬのＡＣＤ−マンニトールの凝固剤に、採血した。８ｍＬの抗凝固処理した血液を１．７ｍＬのエタノール−塩化カルシウム溶液と４５分間インキュベートした。次に、混合物を、ＳｍａｒｔＰＲｅｐ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍで遠心し、同時に濃縮血小板を調製した。トロンビンを含む上清を分離チューブで、沈殿したタンパク質及び赤血球から分離した。ＡＴをフィブリノーゲンに１：３及び１：５の混合比で加えた。
【００６２】
ヒトフィブリノーゲンは、Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｓ，ＭＯ）から、乾燥形態で入手し、９１％凝固可能と解析されている。フィブリノーゲンは、蒸留水で６００、３００及び１５０ｍｇ／ｄＬの３つの濃度に希釈し、試験した。
【００６３】
凝固時間は、自己トロンビン及びウシトロンビンを凝固開始物質として、フィブリノーゲンで調べた。自己トロンビンは、９検体の全血から調製した。前記の他の凝固試験と同じように、個々の反応と個々の凝固時間の計時／記録は、独立して行った。
［フィブリノーゲン検査］
【００６４】
０．５ｍＬのフィブリノーゲンを、１２ｘ７５ｍｍのホウケイ酸ガラスの培養チュ−ブに検査済みのピペットを使用して分注した。ＡＴを、検査済みのピペットを用いて１：３又は１：５の混合比で加えた。ＡＴの総量を加えた時に、計時を始めた。固形の凝血塊が形成されるまで、ガラスチューブを前後に傾けた。それからタイマーを止めて、凝固時間を記録した。前記の試験を、自己トロンビンの代わりに、ウシトロンビン／ＣａＣｌ２活性化剤を用いて、繰り返した。
【００６５】
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ‘ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ及びＢｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍａｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の一連の外科手術患者１００人の平均フィブリノーゲン濃度は、２６８±２７ｍｇ／ｄＬであることがわかった。フィブリノーゲンは急性期の反応物質であり、６００−８００ｍｇ／ｄＬの濃度は慢性病態（例えば、慢性静脈又は糖尿病性潰瘍、関節炎、椎間板ヘルニア）の患者では、珍しくない。それは、この研究で選択されたフィブリノーゲン濃度を根拠とした。
【００６６】
表１０に示したように、フィブリノーゲンの３段階の濃度の凝固時間は、自己トロンビンを３：１及び５：１の両方の混合比で使用した、濃縮血小板でみられたものより明らかに長かった。これは、予想外ではなかった、というのは、血小板は試験管内及び生体内両方の凝固塊の形成において、不可欠な役割を果たしているからである（７）。
【表１０】
【００６７】
何段階かに希釈したウシトロンビンによって、いくつかのフィブリノーゲン濃度の凝固時間を測定した時に、これと同じ傾向が見られた。ウシトロンビンが１２５ｕ／ｍＬで、フィブリノーゲンが６００ｍｇ／ｄＬのときの凝固時間は、１３．７５±０．９秒であり、３００ｍｇ／ｄＬのときは１６．２５±３．８秒だった。これらの値は、６００及び３００ｍｇ／ｄＬの濃度のフィブリノーゲンを凝固させるために、自己トロンビンを３：１の混合比で使用した場合にみられた結果と同様である（表１１）。
【表１１】
【００６８】
本発明の方法に従って製造した、自己トロンビン（ＡＴ）を用いた凝固時間（８−１２秒）は、１００ｕ／ｍＬのウシトロンビン及び５００ｕ／ｍＬのヒトトロンビンを用いた、以前の我々の研究の結果と同等である。
《組織培養実験》
【００６９】
Ｓｌａｔｅｒによって、濃縮血小板がヒト胎児骨芽細胞様細胞に促進作用を示し、それらの分化機能を維持することが、報告されている（１０）。また、高濃度の濃縮血小板分泌物（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｒｅｌｅａｓａｔｅ）が、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）の増殖を促進することが証明されている（１１）。この実験の目的は、濃縮血小板と混合した自己トロンビンの残存アルコールが、培養ヒト繊維芽細胞及びｈＭＳＣｓの増殖を阻害するか否かを検証することであった。
【００７０】
濃縮血小板を、自己トロンビン又はウシトロンビンで凝固させ、混合培養システムで、ヒト繊維芽細胞が平板培養されているウェルの上に、挿入した。細胞は３日及び５日培養した。
【００７１】
平板培養されているｈＭＳＣｓを、濃縮血小板分泌物と培養した。分泌物は、ＡＴ又はＢＴで活性化した凝血塊から作製し、３日及び５日培養した。分泌物は直接培養液に加え、細胞と共に培養した。
【００７２】
濃縮血小板は、ＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍを用い、使用説明書に従って調製した。血小板は７ｍＬの容量に再懸濁し、目盛り付きの５０ｍＬチューブに移し総量を測った。
【００７３】
凍結ヒト繊維芽細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ．，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）を溶解し、〜３．３ｘ１０４ｃｅｌｌ／ウェルの密度で、平板培養した。ヒト間葉幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ．，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）、ｈＭＳＣは、ＭＳＣＧＭ ｂｕｌｌｅｔ ｋｉｔ、グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加した基礎培地で、６ウェルプレートに〜３．３ｘ１０４ｃｅｌｌ／ウェルで平板培養した。
【００７４】
ウシトロンビン（ＢＴ）／ＣａＣｌ２及び自己トロンビン（ＡＴ）は、前記のように調製した。ＢＴ及びＡＴを、ＰＣにそれぞれ１：１０及び１：３の混合比で加えた。
【００７５】
繊維芽細胞とｈＭＳＣの増殖実験において、凝血塊は凝固活性化剤として自己トロンビンやウシトロンビンを用いて、濃縮血小板で形成させた。培養繊維芽細胞に供給された混合物は、３日、５日、及び７日間培養され、一方、ｈＭＳＣｓに供給された混合物は、２時間、及び３日及び５日間インキュベートした。対照としては、培養液の上部に、空の挿入物をおいた。
【００７６】
繊維芽細胞には、血小板ゲルの挿入物を介して、凝血塊分泌物が供給された。ｈＭＳＣｓは、凝血塊を含む試験チューブを遠心し、そして分泌物をｈＭＳＣに直接添加することにより、凝血塊分泌物が供給された。
【００７７】
６本の滅菌チューブがそれぞれの混合物のために準備された。
１．濃縮血小板及びウシトロンビン；
２．濃縮血小板及び自己トロンビン；及び
３．濃縮血小板及び自己凝固促進剤
【００７８】
２ｍＬの新鮮な培地を、プレートの各ウェルに添加した。自己トロンビン、ウシトロンビン、又は自己凝固促進剤を含んだ膜挿入物を調製し、凝固させ、そして繊維芽細胞を含むウェルの上部においた。対照としては、空の挿入物及び培地を上部に調製した。次に、１．５ｍＬの予め暖めておいた培地を、それぞれの挿入物の上部に加えた。培養は、３７度、５％ＣＯ２で４８時間行った。
【００７９】
培養の開始時に、それぞれの挿入物の１つを外して、細胞を撮影した。５日目に、すべての挿入物を外し、細胞を撮影した。すべての挿入物は３日、５日、又は７日の間インキュベートし、それぞれの時間に挿入物を外し、細胞の状態を検査、撮影し実験を繰り返した。
［ヒト間葉幹細胞の培養］
【００８０】
プレートでの培養後、細胞はおよそ２．５時間で付着した。前記ＰＣ−活性化剤混合物は、２時間インキュベートした。古い培地を培養から吸引し、予め暖めておいた１０％ＡＴ−ＰＣの分泌物又は１０％ＢＴ−ＰＣ分泌物を含む、新鮮な培地を細胞に直接加えた。４８時間後、プレートは検査され、撮影された。実験は３日及び５日の分泌物について繰り返した。
【００８１】
ＡＴ及びＢＴで調製した凝血塊と培養したヒト繊維芽細胞は、対照の細胞と比較して、すべて正常に見え、充分に増殖していた（データは示さず）。ＡＴ及びＢＴからの分泌物と培養したｈＭＳＣｓは、外見は正常で、対照の細胞と比較しても充分に増殖していた。
【００８２】
また組織培養実験を、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を使用し、ＡＴ及びＢＴ凝固剤を濃縮血小板と混合した凝血塊上清と、培養することによって行なった。
対照群と試験混合物に１時間暴露処理した群では、細胞の形態又は密度に変化はなかった。ＢＴの上清との接触後２４時間培養した群では、核の高密度化（ｄｅｎｓｅ）を伴った細胞の球形化が見られた。ＡＴで処理した群の細胞の形態は、対照群と同様であった。
《成長因子分泌の動態》
【００８３】
創傷治療において、血小板は２つの役割を持っている。血小板は、凝固の工程に関与し止血を達成し、そして創傷治癒のカスケードの開始時に血小板が放出した成長因子の貯蔵庫となる。成長因子は、様々な作用があるけれども、注射時や摂取時には、速やかに分解される。そのため、血小板ゲルからの成長因子の制御された持続的な放出は、創傷治癒に於ける本発明の重要な観点である。
【００８４】
血小板のアルファ顆粒から、成長因子を放出させるために、活性化剤を使用することが必要である。以下の実験で使用されている方法は、血小板ゲルを産生するために、臨床的に使用されている方法と同一のものであり、そして生体で起こっている工程と非常に似ている。現在、成長因子の放出は、ウシトロンビン／塩化カルシウム混合物と濃縮血小板の混合によって、開始される。この実験はウシトロンビン及び自己トロンビンによる、放出動態を比較している。放出動態は、活性化剤であるウシトロンビン及び自己トロンビンに晒された、濃縮血小板が形成した凝血塊（血小板ゲル）から発現する上清を集め、測定した。血小板ゲルの調製後、１、２、及び４時間、そしてその後は６日まで毎日、遠心を行い上清を収集した。上清は検査まで−８０度で保存した。成長因子（ヒト血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ））の濃度は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、測定した。
【００８５】
濃縮血小板及び乏血小板血漿は、下記のように調製した。全血は６０ｍＬの注射筒で採血した。濃縮血小板（ＰＣ）及び乏血小板血漿（ＰＰＰ）はＳｍａｒｔＰＲｅｐ（商標）２ ｓｙｓｔｅｍを用いて、その使用説明書に従って、調製した。血小板は１０ｍＬの血漿に再懸濁し、その濃縮物は、目盛りのある５０ｍＬのバイアルに移した。０．５ｍＬのＰＣ及びＰＰＰの検体は、ＣＢＣ解析のため、凍結（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ）バイアルに入れた。
【００８６】
ウシトロンビンは、前記のように調製し、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬの希釈で使用した。ＢＴは１：１０の割合でＰＣに添加する。自己トロンビン（ＡＴ）は、前記のように調製し、１：３の混合比でＰＣに添加した。
【００８７】
凝血塊活性剤として自己トロンビン及びウシトロンビンを用いて、ＰＣで凝血塊を形成した。１、２、及び４時間、そしてその後は、毎日６日の間培養されてきた凝血塊から分離された上清について、測定を行なった。すべての検体のＰＤＧＦ−ＡＢ成長因子の濃度が測定された。すべての測定は、以下のように２重に測定した。
【００８８】
１．０ｍＬのＰＣは、ホウケイ酸ガラスの培養チューブに検査済みのピペットを用いて、分注した。次に検体は、ＢＴを１：１０の割合で添加すること、又はＡＴを１：３の割合で添加すること、のいずれかにより凝固させた。活性化剤がＰＣに加えられるとすぐに、凝血塊は一定時間、室温で培養された。培養終了後、凝血塊はＳｏｒｖａｌ ＲＣ３Ｃ遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ）で、Ｈ４０００ローターを用い、２５００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を分離し、その容量を測定し、凍結チューブに移し、−８０度で、測定まで保存した。
【００８９】
前記の手順を、１、２、及び４時間、そしてその後は６日まで毎日行なった。すべてのポイントで、使用説明書に従ってＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定し、得られた測定値を利用して成長因子の濃度を計算した。
【００９０】
濃縮血小板、血小板収量と成長因子の放出は、すべての生物学的モデルと同様に、それぞれの個体のバラツキに影響される。以下のデータが示すように、活性化剤による血小板からの成長因子の放出は、或る程度のバラツキがある。このバラツキは、活性化剤がウシトロンビン、ＡＤＰ又は自己トロンビンであろうと無かろうと存在する。図３ないし７は、ウシトロンビン及び自己トロンビンで活性化された５人の供血者濃縮血小板血液検体の、試験管内での成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＴＧＦ−β１）の放出動態を示している。
【００９１】
この試験内測定モデルでは、凝血塊の形成後４時間内で、ウシトロンビンによる完全な成長因子の放出が起こり、７日までの期間に段階的に減少する。自己トロンビンでは、成長因子は次第に増加し、４８から７２時間後に最大濃度に達する。この成長因子の最大濃度は、ウシトロンビンを使用したときに見られた成長因子濃度に対し最小でも８０％に達し、又はウシトロンビンを使用したときの最大成長因子濃度を越えるほどに達することもある。
【００９２】
我々は以前、血小板数と成長因子濃度に直接的な関連があることを証明した（８）。本研究において、濃縮血小板は１０ｍＬに再懸濁した。臨床的には自己トロンビンは、７ｍＬに懸濁された濃縮血小板に対して使用する。これは濃縮血小板から放出される成長因子濃度を３０％まで増加させるだろう。
【００９３】
注射で投与された成長因子の生体内での半減期は分単位であり、そしてそのため持続性の緩やかな増加が、より有益で好ましい（９）。自己トロンビンによる成長因子の放出動態は、緩やかな持続性の増加を支える。ウシトロンビンは、成長因子をすぐに放出し、さらに長期間にわたり増加することはない。
【００９４】
従って、本発明の方法は、臨床的に適用できる成長因子の持続的な放出を可能にするシステムを提供する。放出動態を測定するため、同じ濃縮血小板をＢＴ又はＡＴによって形成させた凝血塊の上清を凝血後決められた時間に回収し、成長因子を測定した。ＢＴの濃縮血小板に対する適用は、成長因子の中程度の放出をもたらし、５日間の観察期間中にさらなる増加は見られない。ＡＴでの成長因子の放出動態は、適用の４時間で２０−３０％の分泌があり、日ごとに放出が増加し、適用後５日目までに最大に達する。
【００９５】
効果が早くウシ由来でない凝固剤の調製のための、開示された方法の利用を容易にするため、いくつかの試薬及び医療器具をまとめて、自給式のキットとして提供できる。
【００９６】
本発明の方法の実施のための実際上の使用のためのキットの１つの実施態様は、
・ ストッパー付のガラス又はプラスチックチューブ
・ 血清フィルターシステム、例えば、血清分離器具、沈殿から上清を吸引する ために最適な平滑なカニューレ、又はピペットシステム。
・ 平滑な針のついた３ｍＬの注射筒
・ 平滑な針のついた１０ｍＬの注射筒
・ ＡＣＤ又はＡＣＤ／マンニトールを含んだバイアル
・ ＥＴＯＨ／ＣａＣｌ２を含んだバイアル
・ ＴｒａｙＰａｋ（商標）と説明書
【００９７】
また、本発明は、下記の特徴を持った自己又は同種の凝固剤の調製方法を提供する。
１．それは、全血検体から調製することができる。
２．調製の工程の反応は室温で行うことができる
３．工程は、ＳＭＡＲＴＰＲＥＰ（商標）ｓｙｓｔｅｍを使用して、血小板濃縮と 同時に又は独立して調製することができる。
４．全血と沈殿剤の反応時間は４５分か、又はそれ未満である
５．得られた自己凝固剤の調製物は、濃縮血小板又は乏血小板血漿を臨床的に許容 可能な時間内に凝固させる十分な濃度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）がある。
６．自己凝固剤は、濃縮血小板又は乏血小板血漿と伴に、様々な方法や器具で提供 されることができる。
７．本発明の自己凝固剤は、直接創傷部位（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）に適用すること ができる。
【参照文献】
【００９８】
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９． Ｌｅｅ ＳＪ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０００； ４１： ７０４ １０． Ｓｌａｔｅｒ Ｍ， Ｐａｔａｖａ Ｊ， Ｋｉｎｇｈａｍ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｓ． １９９５； １３： ６５５ １１． Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ ＳＥ， Ｋａｄｉｙａｌａ Ｓ， Ｌｉａｎｇ ＬＮ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｂｏｎｅ ｒｅｐａｉｒ． ４８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｄａｌｌａｓ， ＴＸ， ２００２．
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固処理した全血から凝固剤を製造する方法であって、
ａ）対象から１容量の抗凝固処理した全血を得ること
ｂ）前記抗凝固処理した全血と沈殿剤とを混合すること
ｃ）前記ｂ）の混合物を細胞及び特異的血漿成分の沈殿物、並びに上清を産生するのに十分な時間インキュベートすること
ｄ）上清から沈殿物を分離すること、及び
ｅ）凝固剤として使用する前記上清を回収すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記抗凝固処理した全血の容量が、８〜１０ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全血をＡＣＤ、ＡＣＤ／マンニトール、ＣＰＤ、及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤で抗凝固処理する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記全血を酸性キトレートデキストロースで抗凝固処理する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記全血をＡＣＤ／マンニトールで抗凝固処理する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記マンニトールが７．５ｍｇ／ｍＬＡＣＤの濃度で含まれている請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記沈殿剤がエタノールである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
使用する前記エタノールが、約１０％〜１００％の開始濃度である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
使用する前記エタノールが、約２５％〜９５％の開始濃度である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
使用する前記エタノールが、約５０％から９５％の開始濃度である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記沈殿剤がエタノールと塩化カルシウムとの混合物である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記インキュベート工程が４５分未満を要する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベート工程が３０分未満を要する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
調製される前記凝固剤が自己である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
調製される前記凝固剤が同種である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離工程が混合物を遠心することによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離工程が混合物を濾過することによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記分離工程が混合物の遠心及び濾過の組み合わせによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
抗凝固処理した全血からの凝固剤の調製用のキットであって、
ａ）ストッパー付のチューブ；
ｂ）血清濾過分離器；
ｃ）平滑針付き３ｍＬの注射筒；
ｄ）平滑針付き１０ｍＬの注射筒；
ｅ）ＡＣＤ又はＡＣＤ／マンニトールを含むバイアル；
ｆ）ＥｔＯＨ／ＣａＣｌ２を含むバイアル；及び
ｇ）説明書
を含むキット。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法によって製造されるヒト血液画分であって、プロトロンビン−トロンビンタンパク質８０−９０％を含み、検出可能なフィブリノーゲンを含まず、及びＡＴＩＩＩ、プロテインＣ、及びプロテインＳの基準値レベル２０−３０％を含むヒト血液画分。
【請求項１】
抗凝固処理した全血から凝固剤を製造する方法であって、
ａ）対象から１容量の抗凝固処理した全血を得ること
ｂ）前記抗凝固処理した全血と沈殿剤とを混合すること
ｃ）前記ｂ）の混合物を細胞及び特異的血漿成分の沈殿物、並びに上清を産生するのに十分な時間インキュベートすること
ｄ）上清から沈殿物を分離すること、及び
ｅ）凝固剤として使用する前記上清を回収すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記抗凝固処理した全血の容量が、８〜１０ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全血をＡＣＤ、ＡＣＤ／マンニトール、ＣＰＤ、及びＥＤＴＡからなる群から選択される抗凝固剤で抗凝固処理する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記全血を酸性キトレートデキストロースで抗凝固処理する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記全血をＡＣＤ／マンニトールで抗凝固処理する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記マンニトールが７．５ｍｇ／ｍＬＡＣＤの濃度で含まれている請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記沈殿剤がエタノールである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
使用する前記エタノールが、約１０％〜１００％の開始濃度である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
使用する前記エタノールが、約２５％〜９５％の開始濃度である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
使用する前記エタノールが、約５０％から９５％の開始濃度である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記沈殿剤がエタノールと塩化カルシウムとの混合物である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記インキュベート工程が４５分未満を要する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベート工程が３０分未満を要する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
調製される前記凝固剤が自己である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
調製される前記凝固剤が同種である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離工程が混合物を遠心することによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離工程が混合物を濾過することによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記分離工程が混合物の遠心及び濾過の組み合わせによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
抗凝固処理した全血からの凝固剤の調製用のキットであって、
ａ）ストッパー付のチューブ；
ｂ）血清濾過分離器；
ｃ）平滑針付き３ｍＬの注射筒；
ｄ）平滑針付き１０ｍＬの注射筒；
ｅ）ＡＣＤ又はＡＣＤ／マンニトールを含むバイアル；
ｆ）ＥｔＯＨ／ＣａＣｌ２を含むバイアル；及び
ｇ）説明書
を含むキット。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法によって製造されるヒト血液画分であって、プロトロンビン−トロンビンタンパク質８０−９０％を含み、検出可能なフィブリノーゲンを含まず、及びＡＴＩＩＩ、プロテインＣ、及びプロテインＳの基準値レベル２０−３０％を含むヒト血液画分。
【公表番号】特表２００６−５１６６３０（Ｐ２００６−５１６６３０Ａ）
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０３０５４（Ｐ２００６−５０３０５４）
【出願日】平成１６年１月２７日（２００４．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００２１９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６８１０９
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０５２８３１６４）ハーベスト テクノロジーズ インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＲＶＥＳＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＩＮＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月２７日（２００４．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００２１９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６８１０９
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０５２８３１６４）ハーベスト テクノロジーズ インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＲＶＥＳＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＩＮＣ
【Ｆターム（参考）】
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