抗原または抗体の検出方法
【課題】抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法において、非特異的な核酸増幅によって検出される偽陽性シグナルを簡便に軽減できる抗原または抗体の検出法を提供する。
【解決手段】抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法であって、核酸結合タンパク質存在下で核酸を増幅することを特徴とする抗原または抗体の検出方法。さらに、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する抗原または抗体検出キットであって、核酸結合タンパク質を含有する抗原または抗体検出キット。
【解決手段】抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法であって、核酸結合タンパク質存在下で核酸を増幅することを特徴とする抗原または抗体の検出方法。さらに、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する抗原または抗体検出キットであって、核酸結合タンパク質を含有する抗原または抗体検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は検体中の抗原または抗体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の抗原を検出する方法として、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法が用いられている。ＥＬＩＳＡ法は特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色・発光をシグナルに用いることで抗原を検出することができる。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法においては、抗体は酵素により標識されるが、抗体を核酸で標識し、核酸増幅反応により検出する技術が開発されている。ＰＣＲ法による核酸増幅を行うことにより抗原を検出するイムノ−ＰＣＲ法は、抗原抗体反応の持つ特異性とＰＣＲ法の持つ優れた感度を併せ持つ極めて有用な方法である（非特許文献１）。
【０００４】
抗プリオン蛋白質抗体と、異常プリオン蛋白質もしくはその部分分解断片との特異的結合を利用したイムノ−ＰＣＲにより、試料中に含まれる異常プリオン蛋白質を高感度に検出する方法が開発されている（特許文献１）。
【０００５】
また、イムノ−ＰＣＲ測定キットがＣａｒｅＴＩＳ社から販売されており、Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いたＥＬＩＳＡ法であるＥＬＩＳＡ（ＨＲＰ）法と比べて約１０００倍感度が良いと言われている。
【０００６】
さらに、抗体に付加されたＤＮＡタグを制限酵素反応により切り出し、定量Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により検出する方法が知られている。この方法は、抗体ごとに異なる塩基配列・鎖長のＤＮＡを標識することで、同時に複数の抗体を用いた検出も可能となっている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−２６７９２８号公報
【特許文献２】日本特許第４１１１９８４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，p１２０−１２２，１９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
抗体を標識する核酸の増幅反応により抗原を検出する既存の方法は、抗原の検出感度を向上することはできたが、非特異的核酸増幅を軽減するには洗浄操作を徹底的に行うことが必要となり、そのため操作が煩雑であった。また洗浄が不完全であると、偽陽性シグナルが検出されることにより、微量に存在する抗原の有無を判定しにくいという問題があった。
【００１０】
本発明は、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法において、非特異的な核酸増幅によって検出される偽陽性シグナルを簡便に軽減できる抗原または抗体の検出法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法において、抗体または抗原を標識する核酸を増幅する際に、核酸結合タンパク質を添加することにより、抗原または抗体と未反応の抗体または抗原を標識する核酸に由来する非特異的な核酸の増幅を抑制し、偽陽性のシグナルの出現を軽減できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法であって、核酸結合タンパク質存在下で核酸を増幅することを特徴とする抗原または抗体の検出方法に係るものである。
【００１３】
また、本発明は、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する抗原または抗体検出キットであって、核酸結合タンパク質を含有する抗原または抗体検出キットに係るものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法において、抗原や抗体の種類に関係なく非特異的な核酸増幅による偽陽性シグナルの出現を簡便な操作で低減することができる。そして、この方法は、非特異的な核酸増幅物の生成を効率的に抑えることができることから、抗原抗体反応に基づいた検出法を必要とする検査や診断をより高感度に行うだけでなく、種々の核酸増幅法による核酸増幅産物を確認するのみで簡便に抗原または抗体の有無を判定でき、抗原抗体反応に基づき、核酸増幅の有無で検査・診断を行うキットを作製する際には非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の比較例１に係る、ＭＵＳＴａｇキットによるＩＬ-１α抗原の検出結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例１に係る、ＭｕｔＳによる非特異的核酸増幅の抑制効果を示す図である。
【図３】本発明の実施例２に係る、イムノ−ＰＣＲ法において核酸結合タンパク質により非特異的な核酸増幅を抑制し、高感度に抗原を検出できることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗原または抗体の検出方法は、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法であって、核酸を増幅する工程において、核酸結合タンパク質を核酸増幅反応液中に添加することを特徴とするものである。核酸増幅方法としては、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)が最も一般的に使用されており、イムノ−ＰＣＲ法は、抗体に標識された核酸の増幅反応により抗体を検出する方法として知られている。しかし、抗体を標識する核酸を増幅する方法としてはＰＣＲ法に限定されるものではない。Polymerase Chain Reaction（PCR)法、Ligase Chain Reaction（LCR)法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids（ICAN）法、Strand Displacement Amplification（SDA）法、Transcription Mediated Amplification（MTD）法、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification（NASBA）法から選ばれる１以上の方法を好適に利用し得る。
【００１７】
イムノ−ＰＣＲ法とは、抗原抗体反応を利用して特定の抗原を検出する方法であり、抗体を任意の核酸断片で標識して当該核酸断片をＰＣＲ法により検出する。イムノ−ＰＣＲ法が、通常のＥＬＩＳＡ法と異なるのは、抗体に付加した核酸断片をＰＣＲ法により検出する点のみであるため、本発明は如何なる抗原に対する検出に応用することが可能である。
【００１８】
また、本発明の方法は、抗原の検出のみならず、抗原を核酸断片で標識することで抗体の検出に用いることもできる。
【００１９】
本発明の抗原または抗体の検出法において、非特異的な核酸増幅の抑制に用いられる核酸結合タンパク質としては、特に制限はないが、種々のＤＮＡ結合性転写因子や、核内受容体及びそのリガンド、ＭｕｔＳタンパク質に代表される塩基配列のミスマッチ検出機能を持ったタンパク質、ヒストン等に代表されるクロマチン構造タンパク質などを挙げることができる。サンプルに由来しない核酸結合タンパクを添加することで本発明の効果が得られる。使用される核酸結合タンパク質は、以下のものが使用できるが、特に限定されるものではない。例えば、アデノウイルスE2タンパク質（Adenovirus E2 Protein） 、AraC転写因子（AraC Transcription Factor）、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子（Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor +）、塩基性ロイシンジッパー転写因子（Basic-Leucine Zipper Transcription Factor +）、 酪酸反応因子1（Butyrate Response Factor 1）、セントロメアタンパク質B（Centromere Protein B）、COUP転写因子（COUP Transcription Factor +）、初期増殖応答転写因子（Early Growth Response Transcription Factor +）、赤血球特異的DNA結合因子（Erythroid-Specific DNA-Binding Factor +）、逆転刺激因子（Factor For Inversion Stimulation Protein）、Gボックス結合タンパク質（G-Box Binding Factor）、転写因子GATA（GATA Transcription Factor +）、肝細胞核因子（Hepatocyte Nuclear Factor +）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質K（Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein K）、HMGAタンパク質（HMGA Protein +）、HMGBタンパク質（HMGB Protein +）、ホメオドメインタンパク質（Homeodomain Protein +）、IκBタンパク質（I-kappa B Protein）、免疫グロブリンJ組換えシグナル配列結合タンパク質（Immunoglobulin J Recombination Signal Sequence-Binding Protein）、組込み宿主因子（Integration Host Factor）、インターフェロン調節因子（Interferon Regulatory Factor +）、インターフェロン活性化遺伝子ファクター3（Interferon-Stimulated Gene Factor 3 +）、クルッペル様転写因子（Kruppel-Like Transcription Factor +）、ロイシン応答調節タンパク質（Leucine-Responsive Regulatory Protein）、マトリックス付着領域結合タンパク質（Matrix Attachment Region Binding Protein）、メチル化CpG結合タンパク質2（Methyl-CpG-Binding Protein 2）、MutSミスマッチ結合タンパク質（MutS DNA Mismatch-Binding Protein）、MutS相同2タンパク質（MutS Homolog 2 Protein）、骨髄性リンパ性白血病タンパク質（Myeloid-Lymphoid Leukemia Protein）、NF-κB（NF-kappaB +）、NFI転写因子（NFI Transcription Factor）、核呼吸因子（Nuclear Respiratory Factor +）、癌遺伝子産物p55（Oncogene Protein p55）、複製開始点認識複合体（Origin Recognition Complex）、ペアードボックス転写因子（Paired Box Transcription Factor +）、POUドメイン因子（POU Domain Factor +）、癌原遺伝子産物c-Bcl-6（Proto-Oncogene Protein c-Bcl-6）、癌原遺伝子産物c-Ets（Proto-Oncogene Protein c-Ets）、癌原遺伝子産物c-Myb（Proto-Oncogene Protein c-Myb）、c-Mycタンパク質（c-Myc Protein）、癌原遺伝子産物c-Rel（Proto-Oncogene Protein c-Rel）、癌原遺伝子産物c-Sis（Proto-Oncogene Protein c-Sis）、Rad51リコンビナーゼ（Rad51 Recombinase）、Rad52-DNA組換え修復タンパク質（Rad52 DNA Repair and Recombination Protein）、複製タンパク質A（Replication Protein A）、複製タンパク質C（Replication Protein C）、網膜芽細胞腫タンパク質（Retinoblastoma Protein）、Smadタンパク質（Smad Protein +）、SOX転写因子（SOX Transcription Factor +）、Tボックスドメインタンパク質（T-Box Domain Protein）、TCF転写因子（TCF Transcription Factor +）、テロメア結合タンパク質（Telomere-Binding Protein +）、Toll様受容体9（Toll-Like Receptor 9）、トランス活性化因子（Trans-Activator +）、転写因子AP-2（Transcription Factor AP-2）、基本転写因子（General Transcription Factor +）、トリステトラプロリン（Tristetraprolin）、腫瘍抑制因子p53（Tumor Suppressor Protein p53）、ウィングドヘリックス転写因子（Winged-Helix Transcription Factor +）、色素性乾皮症A群タンパク質（Xeroderma Pigmentosum Group A Protein）が挙げられる。これらの核酸結合タンパク質は、これらのタンパクをコードする公知の遺伝子を用いて公知の方法で遺伝子工学的に製造することが可能である。これらを単独で用いても良いし、複数組み合わせて用いても良い。これらのタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、核酸結合能を有するタンパク質であれば、本発明に使用しうる。配列同一性は、好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらにより好ましくは９８％以上である。また、核酸結合に機能するドメインのみを用いてもよい。
【００２０】
塩基配列のミスマッチ部位を認識するＭｕｔＳタンパク質を利用する場合は、核酸を増幅する際に用いるＤＮＡプライマーに、ＭｕｔＳが認識する１から３塩基の欠失やミスマッチ、好ましくは、ＭｕｔＳにより特異的に認識される１から３塩基欠失又はＡＧ、ＣＴ、ＧＴのミスマッチ（Ａに対してＴでなくＧにしてミスマッチを形成させる。）を導入しておく必要がある。
【００２１】
また、ＰＣＲ法により核酸増幅を行う場合は、耐熱性の核酸結合タンパク質を用いることが好ましい。ここで耐熱性とは、７０℃で３０分処理した時に５０％以上の活性を保持していることを指し、９０℃で３０分処理した時に５０％以上の活性を保持していることがより好ましい。耐熱性の核酸結合タンパク質としては、例えば、耐熱性のＭｕｔＳタンパク質を挙げることができる。
【００２２】
たとえば、利用可能なＭｕｔＳタンパク質として、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＭｕｔＳ（Ｔａｑ ＭｕｔＳ）が挙げられる。
【００２３】
Ｔａｑ ＭｕｔＳは、５０μｌのＰＣＲ反応液に０．０１μｇ以上好ましくは０．１μｇ以上を添加して使用することができる。すなわち、０．２ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２ｍｇ／Ｌ以上を添加して使用することができる。
【００２４】
また、核酸を増幅させる方法としては、等温もしくは可変温度条件で行う２つの方法があり、本発明ではいずれの手法でも実施することが可能である。等温条件で行う方法としては例えばＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法がある。可変温度条件で行う方法としては例えばＰＣＲ法がある。ＤＮＡからＤＮＡを複製したり、ＤＮＡからＲＮＡを合成したり、あるいは、ＲＮＡからＤＮＡを合成することもできる。通常、ＤＮＡからＤＮＡを複製するにはＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法により行われるが、種々のＤＮＡポリメラーゼを利用することができる。
【００２５】
たとえば、利用可能なＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｑポリメラーゼや、ＥＸ−Ｔａｑ、ＬＡ−Ｔａｑ、Ｅｘｐａｎｄシリーズ、Ｐｌａｔｉｎｕｍシリーズ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔ１ｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、及び、Ｔｆｉ等に代表されるＰｏｌＩ型酵素、Ｐｆｕ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ、及び、ＤＥＥＰＶＥＮＴに代表されるα型酵素、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等が好適に用いられるが、これに限定されるものではない。これらを単独で用いても良いし、複数組み合わせて用いても良い。これらのＤＮＡポリメラーゼは市販のものを用いることができる。
【００２６】
また、ＲＮＡを鋳型として伸長反応を行う場合、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを利用することができる。例えば、好熱菌として知られるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
また、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡの合成を行う場合、転写酵素活性を有するポリメラーゼを利用することができる。例えば、Ｔ７ファージ由来のＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
抗体−核酸複合体の形成は、非特許文献１に記載されているように、抗体、プロテインＡ−ストレプトアビジン・キメラ蛋白質、ビオチン化ＤＮＡを用いる方法や、非特許文献２に記載されているように、抗原特異抗体を特定の動物例えばマウスで作製し、これにビオチン化抗マウスＩｇ抗体、ストレプトアビジン、ビオチン化ＤＮＡを連結させる方法などにより行うことができる。或いは、抗体とアビジンのコンジュゲートを作製してビオチン化ＤＮＡと連結させることも可能である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，p６９８−６９９，１９９３）。抗体を標識する方法は、抗原の標識にも適宜用いることができる。
【００２９】
抗原抗体反応後に特異的に結合した抗体−ＤＮＡまたは抗原−ＤＮＡのＤＮＡタグを鋳型として核酸増幅反応を行う際、抗体または抗原に付加したＤＮＡタグを抗体または抗原に結合したまま鋳型とすることができる。或いは、制限酵素認識配列やジスフィルド結合をＤＮＡタグの抗体または抗原側に導入しておくことにより、制限酵素や還元反応によりＤＮＡタグを切り出して鋳型とすることも可能である。
【００３０】
また、核酸増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマイドで染色したり、或いは、蛍光インターカレーター存在下で核酸増幅を行った後ＵＶを照射することより行うことができる。また、定量Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により定量的に分析することも可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、実験例および実施例を示して本発明を説明するが、本発明はかかる実施例などによって制限されるものではない。
【００３２】
（比較例１）
シンセラテクノロジーズ社のＭＵＳＴａｇキットを用いて、同キットに付属のＩＬ-１α抗原サンプルの検出を行った。各種濃度の抗原サンプル（０、０．０１３、０．０６４、０．３２、１．６、８、４０、２００ｐｇ／ｍｌ）を調製し、抗ＩＬ−１α抗体固定化プレートの各ウェルに５０ μｌずつ添加し、プレートの側面を叩きながら攪拌した後、２５℃にて１時間インキュベートした。その後、反応液を除去し、１００μｌの洗浄液（キットに付属）で３回洗浄した。洗浄液を除去した後、各ウェルに３０μｌのＭＵＳＴａｇ溶液を添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。その後、反応液を除去し、１００μｌの洗浄液（キットに付属）で３回洗浄した。洗浄液を除去した後、各ウェルに、３μｌの１０×ＥｃｏＲＩ処理バッファ（キットに付属）、２７μｌの滅菌水、０．０２μｌの制限酵素ＥｃｏＲＩを添加し、３７℃にて１５分間静置した。その後、ＥｃｏＲＩ反応後の溶液を別の容器に移し、ＰＣＲ反応により核酸の増幅を行った。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。ＰＣＲ反応液の組成：２．５μｌ ＥｃｏＲＩ反応溶液、５μｌ １０×ＥｘＴａｑバッファ、５μｌ ｄＮＴＰ溶液、０．５μｌ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、０．３μｌ プライマーｍｉｘ（１０ｎｇ／ｍｌ）、３６．７μｌ 滅菌水。ＰＣＲ反応：９４℃、２分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒）×２０、又は４０サイクル→７２℃、１分。
【００３３】
ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドにより染色した結果を図１に示した。サイクル数が２０回では、いずれの濃度の抗原においても核酸増幅物は検出されなかった。また、サイクル数が４０回では、ある程度抗原濃度依存的に核酸増幅物が検出されたが、抗原がない場合においてもバンドが検出された（レーン８´）。
【００３４】
（実施例１）
ＧＴミスマッチ導入プライマー（５´−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡ、および、５´−ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡ：下線はミスマッチ部位を示す。）と、ＭｕｔＳタンパク質を用いて、ごく微量の鋳型存在下での、ＰＣＲ反応による核酸増幅の抑制を行った。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。ＰＣＲ反応液の組成：５μｌ １０×ＥｘＴａｑバッファ、１μｌ ｐＵＣ１９溶液（１又は１０ｆｇ／μｌ）、４μｌ ｄＮＴＰ溶液、０．５μｌ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌ ＭｕｔＳタンパク質溶液（０、又は１μｇ／μｌ）、各々１．５μｌ ＧＴミスマッチ導入プライマー（１０μＭ）、３４．５μｌ 滅菌水。ＰＣＲ反応：９４℃、２分→（９４℃、１０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒）×２０、又は４０サイクル→７２℃、１分。
【００３５】
ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドにより染色した結果を図２に示す通り、１ｆｇのｐＵＣ１９が存在する場合において、ＭｕｔＳによる核酸増幅の抑制効果を確認することができた。
【００３６】
（実施例２）
ｉｍＴａｇ ＰＣＲキット（ケアティス社）を用いて、同キットに付属の抗ＨＩＶ−１ ｐ２４抗体を、同キットに付属の固定化溶液で２００倍希釈し、５０μｌずつトップイールドに添加し、３７℃にて２時間放置した。その後、各ウェルの抗体溶液を廃棄し、１００μｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、１００μｌのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、３７℃にて２時間放置した。その後、ブロッキング溶液を除去し、１００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００３７】
各種濃度のキットに付属のＨＩＶ−１ ｐ２４抗原サンプル（０、０．２５、１、４、８、１５、３０、６０ｐｇ／ｍｌ）を調製し、各々の抗原液を、１００μｌずつウェルに添加し、３７℃にて２時間放置した。その後、ブロッキング溶液を除去し、１２０μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００３８】
各ウェルに、ＨＩＶ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（バイオアカデミア社）に付属のビオチン化抗ＨＩＶ−１ ｐ２４抗体液を１０１倍に希釈した溶液を５０μｌずつ加え、３７℃にて１時間静置した。その後、ビオチン化抗体液を除去し、１２０μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。このようなサンプルを４セット作製した。
【００３９】
３セットのサンプルを用いて、イムノＰＣＲによる検出を行った。５０μｌの１ ｎｇ／μｌ ストレプトアビジン溶液を加え、３０分間反応させた後、ストレプトアビジン溶液を除去し、１５０μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、５０μｌのｉｍＴａｇ溶液（ｉｍＴａｇ ＰＣＲキットに付属）を添加し、３０分間反応させ、反応後のｉｍＴａｇ溶液を除去した後、１５０μｌのＰＢＳＴで６回洗浄した。その後、シーリングテープを貼ったトップイールド内でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成：５μｌ １０×ＥｘＴａｑバッファ、４μｌ ｄＮＴＰ溶液、０．５μｌ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌ ＭｕｔＳタンパク質溶液（３種類の濃度：０、０．２、１μｇ／μｌ）、各々１．５μｌ ＧＴミスマッチ導入プライマー（１０μＭ）、３５．５μｌ 滅菌水。ＰＣＲ反応：９４℃、２分→（９４℃、１０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒）×２５サイクル→７２℃、１分。ＧＴミスマッチ導入プライマー：５´−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡ、および、５´−ＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＧＣＧＣＣＣ（下線はミスマッチ部位を示す）。
【００４０】
ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドにより染色した結果を図３（Ａ）に示した。ＭｕｔＳを２μｇ添加することにより、抗原非存在下での偽陽性の核酸増幅を抑制し、０．２５ｐｇ／ｍｌのＨＩＶ ｐ２４を検出することができた。
【００４１】
残りの１セットを用いて、通常のＥＬＩＳＡ法での検出を行った。１００μｌの酵素標識体液（ＨＩＶ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットに付属）を加え、３７℃にて３０分間反応させた。その後、酵素標識体液を除去した後、１５０μｌのＰＢＳＴで６回洗浄した。洗浄したウェルに１００μｌの酵素基質液を添加し、２５℃にて３０分間静置した後、１００μｌの反応停止液を加え、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図３（Ｂ）に示した。ＥＬＩＳＡ法では、１５ｐｇ／ｍｌ以下の濃度のＨＩＶ ｐ２４を検出することができなかった。
【００４２】
（実施例３）
ｉｍＴａｇ ＰＣＲキットを用いて、非特異的な増幅反応を抑制したＰＣＲ反応を実施するキットの１例として以下のキットを作製した。１６回反応分のキットとして、以下の構成からなるキットを梱包した。
・Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）１０μｌ
・１０倍濃縮緩衝液 ０．１ｍｌ
・ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ （各２．５ｍＭ）８０μｌ
・プライマー１（５´−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡ）（１０μＭ）３０μｌ
・プライマー２（５´−ＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＧＣＧＣＣＣ）（１０μＭ）３０μｌ
・ＭｕｔＳ（１ｍｇ／ｍｌ) ４０μｌ
【技術分野】
【０００１】
本発明は検体中の抗原または抗体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の抗原を検出する方法として、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法が用いられている。ＥＬＩＳＡ法は特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色・発光をシグナルに用いることで抗原を検出することができる。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法においては、抗体は酵素により標識されるが、抗体を核酸で標識し、核酸増幅反応により検出する技術が開発されている。ＰＣＲ法による核酸増幅を行うことにより抗原を検出するイムノ−ＰＣＲ法は、抗原抗体反応の持つ特異性とＰＣＲ法の持つ優れた感度を併せ持つ極めて有用な方法である（非特許文献１）。
【０００４】
抗プリオン蛋白質抗体と、異常プリオン蛋白質もしくはその部分分解断片との特異的結合を利用したイムノ−ＰＣＲにより、試料中に含まれる異常プリオン蛋白質を高感度に検出する方法が開発されている（特許文献１）。
【０００５】
また、イムノ−ＰＣＲ測定キットがＣａｒｅＴＩＳ社から販売されており、Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いたＥＬＩＳＡ法であるＥＬＩＳＡ（ＨＲＰ）法と比べて約１０００倍感度が良いと言われている。
【０００６】
さらに、抗体に付加されたＤＮＡタグを制限酵素反応により切り出し、定量Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により検出する方法が知られている。この方法は、抗体ごとに異なる塩基配列・鎖長のＤＮＡを標識することで、同時に複数の抗体を用いた検出も可能となっている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−２６７９２８号公報
【特許文献２】日本特許第４１１１９８４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，p１２０−１２２，１９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
抗体を標識する核酸の増幅反応により抗原を検出する既存の方法は、抗原の検出感度を向上することはできたが、非特異的核酸増幅を軽減するには洗浄操作を徹底的に行うことが必要となり、そのため操作が煩雑であった。また洗浄が不完全であると、偽陽性シグナルが検出されることにより、微量に存在する抗原の有無を判定しにくいという問題があった。
【００１０】
本発明は、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法において、非特異的な核酸増幅によって検出される偽陽性シグナルを簡便に軽減できる抗原または抗体の検出法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法において、抗体または抗原を標識する核酸を増幅する際に、核酸結合タンパク質を添加することにより、抗原または抗体と未反応の抗体または抗原を標識する核酸に由来する非特異的な核酸の増幅を抑制し、偽陽性のシグナルの出現を軽減できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法であって、核酸結合タンパク質存在下で核酸を増幅することを特徴とする抗原または抗体の検出方法に係るものである。
【００１３】
また、本発明は、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する抗原または抗体検出キットであって、核酸結合タンパク質を含有する抗原または抗体検出キットに係るものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法において、抗原や抗体の種類に関係なく非特異的な核酸増幅による偽陽性シグナルの出現を簡便な操作で低減することができる。そして、この方法は、非特異的な核酸増幅物の生成を効率的に抑えることができることから、抗原抗体反応に基づいた検出法を必要とする検査や診断をより高感度に行うだけでなく、種々の核酸増幅法による核酸増幅産物を確認するのみで簡便に抗原または抗体の有無を判定でき、抗原抗体反応に基づき、核酸増幅の有無で検査・診断を行うキットを作製する際には非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の比較例１に係る、ＭＵＳＴａｇキットによるＩＬ-１α抗原の検出結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例１に係る、ＭｕｔＳによる非特異的核酸増幅の抑制効果を示す図である。
【図３】本発明の実施例２に係る、イムノ−ＰＣＲ法において核酸結合タンパク質により非特異的な核酸増幅を抑制し、高感度に抗原を検出できることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗原または抗体の検出方法は、抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法であって、核酸を増幅する工程において、核酸結合タンパク質を核酸増幅反応液中に添加することを特徴とするものである。核酸増幅方法としては、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)が最も一般的に使用されており、イムノ−ＰＣＲ法は、抗体に標識された核酸の増幅反応により抗体を検出する方法として知られている。しかし、抗体を標識する核酸を増幅する方法としてはＰＣＲ法に限定されるものではない。Polymerase Chain Reaction（PCR)法、Ligase Chain Reaction（LCR)法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids（ICAN）法、Strand Displacement Amplification（SDA）法、Transcription Mediated Amplification（MTD）法、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification（NASBA）法から選ばれる１以上の方法を好適に利用し得る。
【００１７】
イムノ−ＰＣＲ法とは、抗原抗体反応を利用して特定の抗原を検出する方法であり、抗体を任意の核酸断片で標識して当該核酸断片をＰＣＲ法により検出する。イムノ−ＰＣＲ法が、通常のＥＬＩＳＡ法と異なるのは、抗体に付加した核酸断片をＰＣＲ法により検出する点のみであるため、本発明は如何なる抗原に対する検出に応用することが可能である。
【００１８】
また、本発明の方法は、抗原の検出のみならず、抗原を核酸断片で標識することで抗体の検出に用いることもできる。
【００１９】
本発明の抗原または抗体の検出法において、非特異的な核酸増幅の抑制に用いられる核酸結合タンパク質としては、特に制限はないが、種々のＤＮＡ結合性転写因子や、核内受容体及びそのリガンド、ＭｕｔＳタンパク質に代表される塩基配列のミスマッチ検出機能を持ったタンパク質、ヒストン等に代表されるクロマチン構造タンパク質などを挙げることができる。サンプルに由来しない核酸結合タンパクを添加することで本発明の効果が得られる。使用される核酸結合タンパク質は、以下のものが使用できるが、特に限定されるものではない。例えば、アデノウイルスE2タンパク質（Adenovirus E2 Protein） 、AraC転写因子（AraC Transcription Factor）、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子（Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor +）、塩基性ロイシンジッパー転写因子（Basic-Leucine Zipper Transcription Factor +）、 酪酸反応因子1（Butyrate Response Factor 1）、セントロメアタンパク質B（Centromere Protein B）、COUP転写因子（COUP Transcription Factor +）、初期増殖応答転写因子（Early Growth Response Transcription Factor +）、赤血球特異的DNA結合因子（Erythroid-Specific DNA-Binding Factor +）、逆転刺激因子（Factor For Inversion Stimulation Protein）、Gボックス結合タンパク質（G-Box Binding Factor）、転写因子GATA（GATA Transcription Factor +）、肝細胞核因子（Hepatocyte Nuclear Factor +）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質K（Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein K）、HMGAタンパク質（HMGA Protein +）、HMGBタンパク質（HMGB Protein +）、ホメオドメインタンパク質（Homeodomain Protein +）、IκBタンパク質（I-kappa B Protein）、免疫グロブリンJ組換えシグナル配列結合タンパク質（Immunoglobulin J Recombination Signal Sequence-Binding Protein）、組込み宿主因子（Integration Host Factor）、インターフェロン調節因子（Interferon Regulatory Factor +）、インターフェロン活性化遺伝子ファクター3（Interferon-Stimulated Gene Factor 3 +）、クルッペル様転写因子（Kruppel-Like Transcription Factor +）、ロイシン応答調節タンパク質（Leucine-Responsive Regulatory Protein）、マトリックス付着領域結合タンパク質（Matrix Attachment Region Binding Protein）、メチル化CpG結合タンパク質2（Methyl-CpG-Binding Protein 2）、MutSミスマッチ結合タンパク質（MutS DNA Mismatch-Binding Protein）、MutS相同2タンパク質（MutS Homolog 2 Protein）、骨髄性リンパ性白血病タンパク質（Myeloid-Lymphoid Leukemia Protein）、NF-κB（NF-kappaB +）、NFI転写因子（NFI Transcription Factor）、核呼吸因子（Nuclear Respiratory Factor +）、癌遺伝子産物p55（Oncogene Protein p55）、複製開始点認識複合体（Origin Recognition Complex）、ペアードボックス転写因子（Paired Box Transcription Factor +）、POUドメイン因子（POU Domain Factor +）、癌原遺伝子産物c-Bcl-6（Proto-Oncogene Protein c-Bcl-6）、癌原遺伝子産物c-Ets（Proto-Oncogene Protein c-Ets）、癌原遺伝子産物c-Myb（Proto-Oncogene Protein c-Myb）、c-Mycタンパク質（c-Myc Protein）、癌原遺伝子産物c-Rel（Proto-Oncogene Protein c-Rel）、癌原遺伝子産物c-Sis（Proto-Oncogene Protein c-Sis）、Rad51リコンビナーゼ（Rad51 Recombinase）、Rad52-DNA組換え修復タンパク質（Rad52 DNA Repair and Recombination Protein）、複製タンパク質A（Replication Protein A）、複製タンパク質C（Replication Protein C）、網膜芽細胞腫タンパク質（Retinoblastoma Protein）、Smadタンパク質（Smad Protein +）、SOX転写因子（SOX Transcription Factor +）、Tボックスドメインタンパク質（T-Box Domain Protein）、TCF転写因子（TCF Transcription Factor +）、テロメア結合タンパク質（Telomere-Binding Protein +）、Toll様受容体9（Toll-Like Receptor 9）、トランス活性化因子（Trans-Activator +）、転写因子AP-2（Transcription Factor AP-2）、基本転写因子（General Transcription Factor +）、トリステトラプロリン（Tristetraprolin）、腫瘍抑制因子p53（Tumor Suppressor Protein p53）、ウィングドヘリックス転写因子（Winged-Helix Transcription Factor +）、色素性乾皮症A群タンパク質（Xeroderma Pigmentosum Group A Protein）が挙げられる。これらの核酸結合タンパク質は、これらのタンパクをコードする公知の遺伝子を用いて公知の方法で遺伝子工学的に製造することが可能である。これらを単独で用いても良いし、複数組み合わせて用いても良い。これらのタンパク質のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、核酸結合能を有するタンパク質であれば、本発明に使用しうる。配列同一性は、好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらにより好ましくは９８％以上である。また、核酸結合に機能するドメインのみを用いてもよい。
【００２０】
塩基配列のミスマッチ部位を認識するＭｕｔＳタンパク質を利用する場合は、核酸を増幅する際に用いるＤＮＡプライマーに、ＭｕｔＳが認識する１から３塩基の欠失やミスマッチ、好ましくは、ＭｕｔＳにより特異的に認識される１から３塩基欠失又はＡＧ、ＣＴ、ＧＴのミスマッチ（Ａに対してＴでなくＧにしてミスマッチを形成させる。）を導入しておく必要がある。
【００２１】
また、ＰＣＲ法により核酸増幅を行う場合は、耐熱性の核酸結合タンパク質を用いることが好ましい。ここで耐熱性とは、７０℃で３０分処理した時に５０％以上の活性を保持していることを指し、９０℃で３０分処理した時に５０％以上の活性を保持していることがより好ましい。耐熱性の核酸結合タンパク質としては、例えば、耐熱性のＭｕｔＳタンパク質を挙げることができる。
【００２２】
たとえば、利用可能なＭｕｔＳタンパク質として、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＭｕｔＳ（Ｔａｑ ＭｕｔＳ）が挙げられる。
【００２３】
Ｔａｑ ＭｕｔＳは、５０μｌのＰＣＲ反応液に０．０１μｇ以上好ましくは０．１μｇ以上を添加して使用することができる。すなわち、０．２ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２ｍｇ／Ｌ以上を添加して使用することができる。
【００２４】
また、核酸を増幅させる方法としては、等温もしくは可変温度条件で行う２つの方法があり、本発明ではいずれの手法でも実施することが可能である。等温条件で行う方法としては例えばＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法がある。可変温度条件で行う方法としては例えばＰＣＲ法がある。ＤＮＡからＤＮＡを複製したり、ＤＮＡからＲＮＡを合成したり、あるいは、ＲＮＡからＤＮＡを合成することもできる。通常、ＤＮＡからＤＮＡを複製するにはＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法により行われるが、種々のＤＮＡポリメラーゼを利用することができる。
【００２５】
たとえば、利用可能なＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｑポリメラーゼや、ＥＸ−Ｔａｑ、ＬＡ−Ｔａｑ、Ｅｘｐａｎｄシリーズ、Ｐｌａｔｉｎｕｍシリーズ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔ１ｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、及び、Ｔｆｉ等に代表されるＰｏｌＩ型酵素、Ｐｆｕ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ、及び、ＤＥＥＰＶＥＮＴに代表されるα型酵素、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等が好適に用いられるが、これに限定されるものではない。これらを単独で用いても良いし、複数組み合わせて用いても良い。これらのＤＮＡポリメラーゼは市販のものを用いることができる。
【００２６】
また、ＲＮＡを鋳型として伸長反応を行う場合、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼを利用することができる。例えば、好熱菌として知られるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
また、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡの合成を行う場合、転写酵素活性を有するポリメラーゼを利用することができる。例えば、Ｔ７ファージ由来のＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
抗体−核酸複合体の形成は、非特許文献１に記載されているように、抗体、プロテインＡ−ストレプトアビジン・キメラ蛋白質、ビオチン化ＤＮＡを用いる方法や、非特許文献２に記載されているように、抗原特異抗体を特定の動物例えばマウスで作製し、これにビオチン化抗マウスＩｇ抗体、ストレプトアビジン、ビオチン化ＤＮＡを連結させる方法などにより行うことができる。或いは、抗体とアビジンのコンジュゲートを作製してビオチン化ＤＮＡと連結させることも可能である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，p６９８−６９９，１９９３）。抗体を標識する方法は、抗原の標識にも適宜用いることができる。
【００２９】
抗原抗体反応後に特異的に結合した抗体−ＤＮＡまたは抗原−ＤＮＡのＤＮＡタグを鋳型として核酸増幅反応を行う際、抗体または抗原に付加したＤＮＡタグを抗体または抗原に結合したまま鋳型とすることができる。或いは、制限酵素認識配列やジスフィルド結合をＤＮＡタグの抗体または抗原側に導入しておくことにより、制限酵素や還元反応によりＤＮＡタグを切り出して鋳型とすることも可能である。
【００３０】
また、核酸増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマイドで染色したり、或いは、蛍光インターカレーター存在下で核酸増幅を行った後ＵＶを照射することより行うことができる。また、定量Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により定量的に分析することも可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、実験例および実施例を示して本発明を説明するが、本発明はかかる実施例などによって制限されるものではない。
【００３２】
（比較例１）
シンセラテクノロジーズ社のＭＵＳＴａｇキットを用いて、同キットに付属のＩＬ-１α抗原サンプルの検出を行った。各種濃度の抗原サンプル（０、０．０１３、０．０６４、０．３２、１．６、８、４０、２００ｐｇ／ｍｌ）を調製し、抗ＩＬ−１α抗体固定化プレートの各ウェルに５０ μｌずつ添加し、プレートの側面を叩きながら攪拌した後、２５℃にて１時間インキュベートした。その後、反応液を除去し、１００μｌの洗浄液（キットに付属）で３回洗浄した。洗浄液を除去した後、各ウェルに３０μｌのＭＵＳＴａｇ溶液を添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。その後、反応液を除去し、１００μｌの洗浄液（キットに付属）で３回洗浄した。洗浄液を除去した後、各ウェルに、３μｌの１０×ＥｃｏＲＩ処理バッファ（キットに付属）、２７μｌの滅菌水、０．０２μｌの制限酵素ＥｃｏＲＩを添加し、３７℃にて１５分間静置した。その後、ＥｃｏＲＩ反応後の溶液を別の容器に移し、ＰＣＲ反応により核酸の増幅を行った。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。ＰＣＲ反応液の組成：２．５μｌ ＥｃｏＲＩ反応溶液、５μｌ １０×ＥｘＴａｑバッファ、５μｌ ｄＮＴＰ溶液、０．５μｌ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、０．３μｌ プライマーｍｉｘ（１０ｎｇ／ｍｌ）、３６．７μｌ 滅菌水。ＰＣＲ反応：９４℃、２分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒）×２０、又は４０サイクル→７２℃、１分。
【００３３】
ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドにより染色した結果を図１に示した。サイクル数が２０回では、いずれの濃度の抗原においても核酸増幅物は検出されなかった。また、サイクル数が４０回では、ある程度抗原濃度依存的に核酸増幅物が検出されたが、抗原がない場合においてもバンドが検出された（レーン８´）。
【００３４】
（実施例１）
ＧＴミスマッチ導入プライマー（５´−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡ、および、５´−ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡ：下線はミスマッチ部位を示す。）と、ＭｕｔＳタンパク質を用いて、ごく微量の鋳型存在下での、ＰＣＲ反応による核酸増幅の抑制を行った。ＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。ＰＣＲ反応液の組成：５μｌ １０×ＥｘＴａｑバッファ、１μｌ ｐＵＣ１９溶液（１又は１０ｆｇ／μｌ）、４μｌ ｄＮＴＰ溶液、０．５μｌ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌ ＭｕｔＳタンパク質溶液（０、又は１μｇ／μｌ）、各々１．５μｌ ＧＴミスマッチ導入プライマー（１０μＭ）、３４．５μｌ 滅菌水。ＰＣＲ反応：９４℃、２分→（９４℃、１０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒）×２０、又は４０サイクル→７２℃、１分。
【００３５】
ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドにより染色した結果を図２に示す通り、１ｆｇのｐＵＣ１９が存在する場合において、ＭｕｔＳによる核酸増幅の抑制効果を確認することができた。
【００３６】
（実施例２）
ｉｍＴａｇ ＰＣＲキット（ケアティス社）を用いて、同キットに付属の抗ＨＩＶ−１ ｐ２４抗体を、同キットに付属の固定化溶液で２００倍希釈し、５０μｌずつトップイールドに添加し、３７℃にて２時間放置した。その後、各ウェルの抗体溶液を廃棄し、１００μｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、１００μｌのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、３７℃にて２時間放置した。その後、ブロッキング溶液を除去し、１００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００３７】
各種濃度のキットに付属のＨＩＶ−１ ｐ２４抗原サンプル（０、０．２５、１、４、８、１５、３０、６０ｐｇ／ｍｌ）を調製し、各々の抗原液を、１００μｌずつウェルに添加し、３７℃にて２時間放置した。その後、ブロッキング溶液を除去し、１２０μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００３８】
各ウェルに、ＨＩＶ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（バイオアカデミア社）に付属のビオチン化抗ＨＩＶ−１ ｐ２４抗体液を１０１倍に希釈した溶液を５０μｌずつ加え、３７℃にて１時間静置した。その後、ビオチン化抗体液を除去し、１２０μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。このようなサンプルを４セット作製した。
【００３９】
３セットのサンプルを用いて、イムノＰＣＲによる検出を行った。５０μｌの１ ｎｇ／μｌ ストレプトアビジン溶液を加え、３０分間反応させた後、ストレプトアビジン溶液を除去し、１５０μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、５０μｌのｉｍＴａｇ溶液（ｉｍＴａｇ ＰＣＲキットに付属）を添加し、３０分間反応させ、反応後のｉｍＴａｇ溶液を除去した後、１５０μｌのＰＢＳＴで６回洗浄した。その後、シーリングテープを貼ったトップイールド内でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成：５μｌ １０×ＥｘＴａｑバッファ、４μｌ ｄＮＴＰ溶液、０．５μｌ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、２μｌ ＭｕｔＳタンパク質溶液（３種類の濃度：０、０．２、１μｇ／μｌ）、各々１．５μｌ ＧＴミスマッチ導入プライマー（１０μＭ）、３５．５μｌ 滅菌水。ＰＣＲ反応：９４℃、２分→（９４℃、１０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒）×２５サイクル→７２℃、１分。ＧＴミスマッチ導入プライマー：５´−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡ、および、５´−ＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＧＣＧＣＣＣ（下線はミスマッチ部位を示す）。
【００４０】
ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドにより染色した結果を図３（Ａ）に示した。ＭｕｔＳを２μｇ添加することにより、抗原非存在下での偽陽性の核酸増幅を抑制し、０．２５ｐｇ／ｍｌのＨＩＶ ｐ２４を検出することができた。
【００４１】
残りの１セットを用いて、通常のＥＬＩＳＡ法での検出を行った。１００μｌの酵素標識体液（ＨＩＶ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットに付属）を加え、３７℃にて３０分間反応させた。その後、酵素標識体液を除去した後、１５０μｌのＰＢＳＴで６回洗浄した。洗浄したウェルに１００μｌの酵素基質液を添加し、２５℃にて３０分間静置した後、１００μｌの反応停止液を加え、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図３（Ｂ）に示した。ＥＬＩＳＡ法では、１５ｐｇ／ｍｌ以下の濃度のＨＩＶ ｐ２４を検出することができなかった。
【００４２】
（実施例３）
ｉｍＴａｇ ＰＣＲキットを用いて、非特異的な増幅反応を抑制したＰＣＲ反応を実施するキットの１例として以下のキットを作製した。１６回反応分のキットとして、以下の構成からなるキットを梱包した。
・Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）１０μｌ
・１０倍濃縮緩衝液 ０．１ｍｌ
・ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ （各２．５ｍＭ）８０μｌ
・プライマー１（５´−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴＣＧＴＧＴＣＡ）（１０μＭ）３０μｌ
・プライマー２（５´−ＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＧＣＧＣＣＣ）（１０μＭ）３０μｌ
・ＭｕｔＳ（１ｍｇ／ｍｌ) ４０μｌ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法であって、核酸結合タンパク質存在下で核酸を増幅することを特徴とする抗原または抗体の検出方法。
【請求項２】
請求項１の抗原または抗体の検出方法であって、核酸の増幅反応がPolymerase Chain Reaction（PCR)法、Ligase Chain Reaction（LCR)法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids（ICAN）法、Strand Displacement Amplification（SDA）法、Transcription Mediated Amplification（MTD）法、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification（NASBA）法から選ばれる１以上の方法を用いて行う請求項１に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項３】
核酸の増幅反応が、ＰＣＲ法を用いて行う請求項２に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項４】
核酸結合タンパク質が、核酸結合性転写因子や、核内受容体及びそのリガンド、塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質、クロマチン構造タンパク質から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項５】
核酸結合タンパク質が、アデノウイルスE2タンパク質、AraC転写因子、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子、塩基性ロイシンジッパー転写因子、酪酸反応因子1、セントロメアタンパク質B、COUP転写因子、初期増殖応答転写因子、赤血球特異的DNA結合因子、逆転刺激因子、Gボックス結合タンパク質、転写因子GATA、肝細胞核因子、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質K、HMGAタンパク質、HMGBタンパク質、ホメオドメインタンパク質、IκBタンパク質、免疫グロブリンJ組換えシグナル配列結合タンパク質、組込み宿主因子、インターフェロン調節因子、インターフェロン活性化遺伝子ファクター3、クルッペル様転写因子、ロイシン応答調節タンパク質、マトリックス付着領域結合タンパク質、メチル化CpG結合タンパク質2、MutSミスマッチ結合タンパク質、MutS相同2タンパク質、骨髄性リンパ性白血病タンパク質、NF-κB、NFI転写因子、核呼吸因子、癌遺伝子産物p55、複製開始点認識複合体、ペアードボックス転写因子、POUドメイン因子、癌原遺伝子産物c-Bcl-6、癌原遺伝子産物c-Ets、癌原遺伝子産物c-Myb、c-Mycタンパク質、癌原遺伝子産物c-Rel、癌原遺伝子産物c-Sis、Rad51リコンビナーゼ、Rad52-DNA組換え修復タンパク質、複製タンパク質A、複製タンパク質C、網膜芽細胞腫タンパク質、Smadタンパク質、SOX転写因子、Tボックスドメインタンパク質、TCF転写因子、テロメア結合タンパク質、Toll様受容体9、トランス活性化因子、転写因子AP-2、基本転写因子、トリステトラプロリン、腫瘍抑制因子p53、ウィングドヘリックス転写因子、色素性乾皮症A群タンパク質、および、これらのタンパク質が有するアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項６】
核酸結合タンパク質が、塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質を用いることを特徴とする請求項４に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項７】
核酸結合タンパク質が、好熱菌由来のＭｕｔＳタンパク質を用いることを特徴とする請求項４に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項８】
核酸の増幅反応において反応液中に核酸結合タンパク質を０．２ｍｇ／Ｌ以上添加することを特徴とする請求項１に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項９】
核酸の増幅反応に用いるプライマーとして、１から３塩基の欠失、或いはミスマッチを導入したプライマーを用いることを特徴とする請求項１に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項１０】
核酸の増幅反応に用いるプライマーとして、１塩基の欠失、或いはＡＧ、ＣＴ、ＧＴのミスマッチを導入したプライマーを用いることを特徴とする請求項９に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項１１】
抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する抗原または抗体検出キットであって、核酸結合タンパク質を含有する抗原または抗体検出キット。
【請求項１２】
核酸結合タンパク質が、核酸結合性転写因子や、核内受容体及びそのリガンド、塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質、クロマチン構造タンパク質から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする請求項１１に記載の抗原または抗体検出キット。
【請求項１３】
核酸結合タンパク質が、アデノウイルスE2タンパク質、AraC転写因子、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子、塩基性ロイシンジッパー転写因子、酪酸反応因子1、セントロメアタンパク質B、COUP転写因子、初期増殖応答転写因子、赤血球特異的DNA結合因子、逆転刺激因子、Gボックス結合タンパク質、転写因子GATA、肝細胞核因子、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質K、HMGAタンパク質、HMGBタンパク質、ホメオドメインタンパク質、IκBタンパク質、免疫グロブリンJ組換えシグナル配列結合タンパク質、組込み宿主因子、インターフェロン調節因子、インターフェロン活性化遺伝子ファクター3、クルッペル様転写因子、ロイシン応答調節タンパク質、マトリックス付着領域結合タンパク質、メチル化CpG結合タンパク質2、MutSミスマッチ結合タンパク質、MutS相同2タンパク質、骨髄性リンパ性白血病タンパク質、NF-κB、NFI転写因子、核呼吸因子、癌遺伝子産物p55、複製開始点認識複合体、ペアードボックス転写因子、POUドメイン因子、癌原遺伝子産物c-Bcl-6、癌原遺伝子産物c-Ets、癌原遺伝子産物c-Myb、c-Mycタンパク質、癌原遺伝子産物c-Rel、癌原遺伝子産物c-Sis、Rad51リコンビナーゼ、Rad52-DNA組換え修復タンパク質、複製タンパク質A、複製タンパク質C、網膜芽細胞腫タンパク質、Smadタンパク質、SOX転写因子、Tボックスドメインタンパク質、TCF転写因子、テロメア結合タンパク質、Toll様受容体9、トランス活性化因子、転写因子AP-2、基本転写因子、トリステトラプロリン、腫瘍抑制因子p53、ウィングドヘリックス転写因子、色素性乾皮症A群タンパク質、および、これらのタンパク質が有するアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の抗原または抗体検出キット。
【請求項１４】
核酸結合タンパク質が、塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の抗原または抗体検出キット。
【請求項１５】
塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質が、好熱菌由来のＭｕｔＳタンパク質であることを特徴とする請求項１４に記載の抗原または抗体検出キット。
【請求項１】
抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する方法であって、核酸結合タンパク質存在下で核酸を増幅することを特徴とする抗原または抗体の検出方法。
【請求項２】
請求項１の抗原または抗体の検出方法であって、核酸の増幅反応がPolymerase Chain Reaction（PCR)法、Ligase Chain Reaction（LCR)法、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids（ICAN）法、Strand Displacement Amplification（SDA）法、Transcription Mediated Amplification（MTD）法、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification（NASBA）法から選ばれる１以上の方法を用いて行う請求項１に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項３】
核酸の増幅反応が、ＰＣＲ法を用いて行う請求項２に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項４】
核酸結合タンパク質が、核酸結合性転写因子や、核内受容体及びそのリガンド、塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質、クロマチン構造タンパク質から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項５】
核酸結合タンパク質が、アデノウイルスE2タンパク質、AraC転写因子、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子、塩基性ロイシンジッパー転写因子、酪酸反応因子1、セントロメアタンパク質B、COUP転写因子、初期増殖応答転写因子、赤血球特異的DNA結合因子、逆転刺激因子、Gボックス結合タンパク質、転写因子GATA、肝細胞核因子、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質K、HMGAタンパク質、HMGBタンパク質、ホメオドメインタンパク質、IκBタンパク質、免疫グロブリンJ組換えシグナル配列結合タンパク質、組込み宿主因子、インターフェロン調節因子、インターフェロン活性化遺伝子ファクター3、クルッペル様転写因子、ロイシン応答調節タンパク質、マトリックス付着領域結合タンパク質、メチル化CpG結合タンパク質2、MutSミスマッチ結合タンパク質、MutS相同2タンパク質、骨髄性リンパ性白血病タンパク質、NF-κB、NFI転写因子、核呼吸因子、癌遺伝子産物p55、複製開始点認識複合体、ペアードボックス転写因子、POUドメイン因子、癌原遺伝子産物c-Bcl-6、癌原遺伝子産物c-Ets、癌原遺伝子産物c-Myb、c-Mycタンパク質、癌原遺伝子産物c-Rel、癌原遺伝子産物c-Sis、Rad51リコンビナーゼ、Rad52-DNA組換え修復タンパク質、複製タンパク質A、複製タンパク質C、網膜芽細胞腫タンパク質、Smadタンパク質、SOX転写因子、Tボックスドメインタンパク質、TCF転写因子、テロメア結合タンパク質、Toll様受容体9、トランス活性化因子、転写因子AP-2、基本転写因子、トリステトラプロリン、腫瘍抑制因子p53、ウィングドヘリックス転写因子、色素性乾皮症A群タンパク質、および、これらのタンパク質が有するアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項６】
核酸結合タンパク質が、塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質を用いることを特徴とする請求項４に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項７】
核酸結合タンパク質が、好熱菌由来のＭｕｔＳタンパク質を用いることを特徴とする請求項４に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項８】
核酸の増幅反応において反応液中に核酸結合タンパク質を０．２ｍｇ／Ｌ以上添加することを特徴とする請求項１に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項９】
核酸の増幅反応に用いるプライマーとして、１から３塩基の欠失、或いはミスマッチを導入したプライマーを用いることを特徴とする請求項１に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項１０】
核酸の増幅反応に用いるプライマーとして、１塩基の欠失、或いはＡＧ、ＣＴ、ＧＴのミスマッチを導入したプライマーを用いることを特徴とする請求項９に記載の抗原または抗体の検出方法。
【請求項１１】
抗体または抗原を標識する核酸の増幅反応により抗原または抗体を検出する抗原または抗体検出キットであって、核酸結合タンパク質を含有する抗原または抗体検出キット。
【請求項１２】
核酸結合タンパク質が、核酸結合性転写因子や、核内受容体及びそのリガンド、塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質、クロマチン構造タンパク質から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする請求項１１に記載の抗原または抗体検出キット。
【請求項１３】
核酸結合タンパク質が、アデノウイルスE2タンパク質、AraC転写因子、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子、塩基性ロイシンジッパー転写因子、酪酸反応因子1、セントロメアタンパク質B、COUP転写因子、初期増殖応答転写因子、赤血球特異的DNA結合因子、逆転刺激因子、Gボックス結合タンパク質、転写因子GATA、肝細胞核因子、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質K、HMGAタンパク質、HMGBタンパク質、ホメオドメインタンパク質、IκBタンパク質、免疫グロブリンJ組換えシグナル配列結合タンパク質、組込み宿主因子、インターフェロン調節因子、インターフェロン活性化遺伝子ファクター3、クルッペル様転写因子、ロイシン応答調節タンパク質、マトリックス付着領域結合タンパク質、メチル化CpG結合タンパク質2、MutSミスマッチ結合タンパク質、MutS相同2タンパク質、骨髄性リンパ性白血病タンパク質、NF-κB、NFI転写因子、核呼吸因子、癌遺伝子産物p55、複製開始点認識複合体、ペアードボックス転写因子、POUドメイン因子、癌原遺伝子産物c-Bcl-6、癌原遺伝子産物c-Ets、癌原遺伝子産物c-Myb、c-Mycタンパク質、癌原遺伝子産物c-Rel、癌原遺伝子産物c-Sis、Rad51リコンビナーゼ、Rad52-DNA組換え修復タンパク質、複製タンパク質A、複製タンパク質C、網膜芽細胞腫タンパク質、Smadタンパク質、SOX転写因子、Tボックスドメインタンパク質、TCF転写因子、テロメア結合タンパク質、Toll様受容体9、トランス活性化因子、転写因子AP-2、基本転写因子、トリステトラプロリン、腫瘍抑制因子p53、ウィングドヘリックス転写因子、色素性乾皮症A群タンパク質、および、これらのタンパク質が有するアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の抗原または抗体検出キット。
【請求項１４】
核酸結合タンパク質が、塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の抗原または抗体検出キット。
【請求項１５】
塩基配列のミスマッチ検出機能を持つタンパク質が、好熱菌由来のＭｕｔＳタンパク質であることを特徴とする請求項１４に記載の抗原または抗体検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２２６９８６（Ｐ２０１０−２２６９８６Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７６６２４（Ｐ２００９−７６６２４）
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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