抗原ペプチド製剤の調製方法
【課題】本発明は、抗原ペプチドを含む製剤に関し、効率的かつ安定的に免疫誘導が得られる抗原ペプチド製剤を提供することを課題とする。すなわち、抗原ペプチド製剤の投与の際、鉱物油エマルションなどを利用しなくても免疫可能な抗原ペプチド製剤の調製方法を提供することを課題とする。
【解決手段】ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸または前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加し、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させて、抗原ペプチド製剤を調製することによる。
【解決手段】ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸または前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加し、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させて、抗原ペプチド製剤を調製することによる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原としての機能を有するペプチドを用いて免疫を行う際、効率的かつ安定的に免疫反応を惹起させることを可能とする投与製剤の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己の腫瘍細胞を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、腫瘍抗原ペプチドとよばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子）との複合体を認識することにより、自己の腫瘍細胞を攻撃する。腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンホカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。
【０００３】
また、外部から抗原が侵入すると、その抗原を捕食したマクロファージなどの喰食細胞は抗原を小さなペプチドに分解し、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して細胞表面に抗原を提示する。このペプチド抗原を認識可能なレセプターを細胞表面に有するヘルパーＴ細胞は、そのレセプターとＣＤ４分子によって、抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を同時に認識する。認識したと同時にヘルパーＴ細胞へ刺激が伝わり、ヘルパーＴ細胞は活性化し、増殖し、サイトカインを産生し始める。産生されたサイトカインは血流を通じてＢ細胞に到達し、Ｂ細胞を刺激し、Ｂ細胞能増殖を促進して形質細胞（プラズマ細胞、抗体産生細胞）や記憶細胞へと分化させ、免疫応答を増強させる。
【０００４】
上記のような免疫応答に関連するペプチドを、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドといい、単に抗原ペプチドともいう。
【０００５】
最近の研究から癌細胞由来のタンパク質分解産物が抗原となり、このタンパク質を産生している癌細胞を自ら攻撃して死滅させる機構が生体内に備わっていることが科学的に実証された。このことを受け、該癌細胞由来のタンパク質分解産物からなる抗原部分を、抗原ペプチド製剤として癌患者に投与し、腫瘍を消滅させようとする新しい治療法の開発が進められている（特許文献１、２）。
【０００６】
ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の抗原ペプチドを用いて免疫を行う際、抗原ペプチドを生理食塩水単体で免疫を行うと、免疫誘導能が低く効率的ではない。そこで、免疫能を増強させるために、従来ではフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製して、皮内や皮下に投与を行っていた。これらのエマルションや不溶性複合体が、皮内や皮下での抗原拡散を抑制して免疫誘導能を発揮させる。ただし、エマルションや不溶性複合体は長期間保存できないため、上記のように免疫時など要時調製が必要である。また、エマルションは調製に手間がかかるため、要時エマルションや不溶性複合体を調製するのは効率的ではなく、医療現場では不便であるといった問題がある。
【０００７】
また、抗原ペプチドはそのアミノ酸配列により水への溶解性が異なるため、抗原ペプチドの凍結乾燥物を注射投与するために水系溶媒に溶解するのに、各抗原ペプチドごとに溶媒量の検討が必要である。
【特許文献１】ＷＯ２０００／００２９０７号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−３４０４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗原ペプチドを含む製剤に関し、効率的・安定的に免疫誘導が得られる抗原ペプチド製剤を提供することを課題とする。すなわち、抗原ペプチド製剤の投与の際、鉱物油エマルションなどを利用しなくても免疫可能な抗原ペプチド製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸または前記塩基性アミノ酸を含むオリゴペプチドを付加し、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させて、抗原ペプチド製剤を調製することにより、鉱物油エマルションなどを利用しなくても免疫可能な抗原ペプチド製剤を提供可能なことを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加し、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させることを特徴とする抗原ペプチド製剤の調製方法。
２．抗原ペプチドに付加するオリゴペプチドが、抗原ペプチドに付加するオリゴペプチドを付加したのちのアミノ酸残基全体に対して、塩基性アミノ酸残基の割合が少なくとも４０％以上となる前項１に記載の抗原ペプチド製剤の調製方法。
３．オリゴヌクレオチドが、塩基数５〜２５のヌクレオチドであり、ＣｐＧ配列を含む構造である、前項１または２に記載の抗原ペプチド製剤の調製方法。
４．前項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法により得られる抗原ペプチド製剤。
５．ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含むオリゴペプチドを付加したオリゴペプチドとオリゴヌクレオチドの水不溶性の複合体を含む、抗原ペプチド製剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の製造方法から得られた抗原ペプチド製剤の投与により、投与の際に抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製する必要なく、ＣＴＬ活性の上昇が得られた。アルギニン付加ＯＶＡペプチドのカチオン性とオリゴＤＮＡのアニオン性が相互に反応し、その結果生じた不溶性複合体により皮内での拡散が抑制され、免疫効果が現れたと考えられる。従って、本発明の製造方法によると、免疫投与の際に抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体等を調製する必要なく、十分に免疫誘導が可能な抗原ペプチド製剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドとは、上記背景技術の欄で説明したように、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して細胞表面に抗原を提示し、ＣＴＬやヘルパーＴ細胞等の作用によって、細胞傷害作用やＢ細胞能増強により免疫応答を増強可能なペプチドをいう。上記のような免疫応答に関連するペプチドを、単に抗原ペプチドともいう。
【００１３】
抗原ペプチドを皮内または皮下投与する場合、水溶性の状態では拡散が早く免疫担当細胞に認識される前に抗原が拡散して、高い免疫誘導が得られない。つまり、抗原ペプチドが拡散しないで免疫担当細胞に認識されるように、抗原ペプチドの複合体を形成して不溶化する事で、投与時の免疫誘導能を得る事ができる。免疫投与時に抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製しなくとも、十分に免疫誘導が可能な抗原ペプチド製剤は、以下の方法により調製することができる。
【００１４】
抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加する。この塩基性アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンから選択される天然型塩基性アミノ酸でもよいが、塩基性の非天然型アミノ酸を付加させてもよい。オリゴペプチドの配列は、一種のアミノ酸のみでも、三種のアミノ酸をランダムに含むものでもよい。付加するオリゴペプチドには、抗原ペプチドにオリゴペプチドを付加した後のペプチドにおいて、アミノ酸残基全体に対する塩基性アミノ酸残基の割合が少なくとも４０％以上となるのが好ましい。
【００１５】
抗原ペプチドに、前記オリゴペプチドを付加する位置は、抗原ペプチドの抗原決定基を阻害しない部位であればよいが、特にＮ末端若しくはＣ末端、またはＮ末Ｃ末の両端に、塩基性アミノ酸を付加させる事ができる。
【００１６】
上記オリゴペプチドを付加した抗原ペプチドに、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させることで、抗原ペプチド製剤を得ることができる。上記において、付加するオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡが好適であり、また直鎖状・環状のいずれも利用可能である。オリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であればよいが、混合した際に、塩基性アミノ酸の有するカチオンが、オリゴヌクレオチドの有するアニオンより過剰となる条件が望ましい。そのようなオリゴヌクレオチドの塩基数は、具体的には５〜２５である。
【００１７】
本発明において、上記オリゴヌクレオチドを免疫に用いる場合、免疫誘導能を活性化するＣｐＧ配列を含む構造からなるオリゴヌクレオチドであればなお好ましい。ここにおいて、ＣｐＧ配列とは、真核生物の遺伝子のプロモーター領域に多く見られ、Ｇ＋Ｃ含量が相対的に高い領域をいう。哺乳動物では、ＣｐＧ配列が島状に散在し、これをＣｐＧアイランドともいう。
【００１８】
本発明は、上記の調製方法の他、上記調製方法により得られた抗原ペプチド製剤も含む。具体的には、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加したオリゴペプチドとオリゴヌクレオチドの水不溶性の複合体を含む、抗原ペプチド製剤も含まれる。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２０】
（実施例１）各試料の調製
１）各ペプチドの調製
卵白アルブミンの抗原ペプチド（ＯＶＡペプチド（Sigma Genosys社））（配列番号１）を得、さらにＯＶＡペプチドにアルギニン１，３，５または７残基を付加したものを合成した（配列番号２〜５）。
【００２１】
ＯＶＡペプチド ：SIINFEKL （配列番号１）
Ｒ１-ＯＶＡペプチド ：RSIINFEKL（配列番号２）
Ｒ３-ＯＶＡペプチド ：RRRSIINFEKL（配列番号３）
Ｒ５-ＯＶＡペプチド ：RRRRRSIINFEKL（配列番号４）
Ｒ７-ＯＶＡペプチド ：RRRRRRRSIINFEKL（配列番号５）
【００２２】
２）オリゴヌクレオチドの合成
免疫誘導能を活性化するＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）を合成した（配列番号６）。
ＧｐＧ含有オリゴＤＮＡ：TCCATGACGTTCCTGATGCT（配列番号６）
【００２３】
３）試料の調製
上記１）および２）で調製した各ペプチドおよびオリゴＤＮＡをそれぞれ生理食塩水に溶解し、表１に示す試料を調製した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（実験例１）不溶性複合体の形成
２００ｎｍｏｌの各抗原ペプチドを含有する生理食塩水溶液２００μｌに、５ｎｍｏｌまたは１０ｎｍｏｌのＣｐＧを添加した試料について、目視にて複合体形成を確認した。その結果を表１に示した。
塩基性アミノ酸であるアルギニンを付加させないＯＶＡペプチドでは、複合体形成は認められなかったが、アルギニン１，３，５，７残基を付加したＲ１，Ｒ３，Ｒ５およびＲ７−ＯＶＡペプチドでは、複合体形成を認めた。
【００２６】
（実験例２）不溶性複合体中のペプチド抗原含有量の確認
２００ｎｍｏｌの各抗原ペプチドを含有する生理食塩水溶液２００μｌに、５ｎｍｏｌまたは１０ｎｍｏｌのＣｐＧを添加して複合体を形成させた。８０００ｒｐｍ×５分間にて遠心分離を行い、沈殿した複合体のみを回収して、上清についてＨＰＬＣ分析を行った。その結果を表２に示した。
【００２７】
分析条件
カラム ：Xbridge C18（Waters製）
溶離液 ：Ａ液 ０．１％ ＴＦＡ／水、Ｂ液 ０．１％ ＴＦＡ／ＡｃＮ
溶出条件 ：Ａ液 ９５％／Ｂ液５％→（２０分間）→Ａ液 ４５％／Ｂ液５５％
流量 ：１ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
【００２８】
【表２】
【００２９】
各試料より得た複合体から、表２に示す量の抗原ペプチドを回収することができた。
【００３０】
（実験例３）再懸濁後の複合体中抗原ペプチド残存量
２００ｎｍｏｌの抗原ペプチドを含有する生理食塩水溶液２００μｌに、５ｎｍｏｌ，１０ｎｍｏｌまたは２０ｎｍｏｌのオリゴＤＮＡを添加して複合体を形成させた。８０００ｒｐｍ×５分間にて遠心分離を行い、沈殿した複合体のみを回収して、−４０℃にて凍結保存した。保存した不溶性複合体を、生理食塩液２００μｌにて再懸濁した後、再度８０００ｒｐｍ×５分間にて遠心分離を行い、複合体を回収した。上清について、上記実験例２と同条件にてＨＰＬＣ分析を行った。その結果を表３に示した。
【００３１】
【表３】
【００３２】
各試料より得た再懸濁した複合体から、表３に示す割合の抗原ペプチドを回収することができた。Ｒ１およびＲ３−ＯＶＡペプチドを含む複合体では、再懸濁時に抗原ペプチドが複合体から解離する場合もあったが、Ｒ５およびＲ７−ＯＶＡペプチドでは、再懸濁時にも抗原ペプチドは複合体から全く解離せず、安定に維持された。
【００３３】
（実験例４）免疫誘導試験
実験例２と同様に、２００ｎｍｏｌの抗原ペプチドを含有する生理食塩水溶液２００μｌに、５ｎｍｏｌまたは１０ｎｍｏｌのオリゴＤＮＡを添加して複合体を形成させた。８０００ｒｐｍ×５分間にて遠心分離を行い、沈殿した複合体のみを回収して、−４０℃にて凍結保存した。保存した不溶性複合体を、生理食塩液２００μｌにて再懸濁して投与サンプルとした。
【００３４】
剃毛したマウス（C57BL/6、♀、８週齢）に投与サンプルを注射投与（５０μｌ×４箇所／匹）した。１週毎に１回、２週間投与を行い、最終投与から１週間後に脾臓を摘出して、ＣＴＬ活性を測定した。ＣＴＬ活性は、ELISpot（Enzyme-Linked Immunospot）法により測定した。その結果を表４に示した。
【００３５】
【表４】
【００３６】
表４に示すように、各試料より得た不溶性複合体と生理食塩水の懸濁液の投与により、ＣＴＬ活性の上昇が得られた。アルギニン付加ＯＶＡペプチドのカチオン性とオリゴＤＮＡのアニオン性が相互に反応し、その結果生じた不溶性複合体により皮内での拡散が抑制され、免疫効果が現れたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上詳述したように、本発明の製造方法から得られた抗原ペプチド製剤の投与により、投与の際に抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製する必要なく、ＣＴＬ活性の上昇が得られた。アルギニン付加ＯＶＡペプチドのカチオン性とオリゴＤＮＡのアニオン性が相互に反応し、その結果生じた不溶性複合体により皮内での拡散が抑制され、免疫効果が現れたと考えられる。従って、本発明の製造方法によると、免疫投与時に、抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製する必要なく、十分に免疫誘導が可能な抗原ペプチド製剤を提供することができる。本製剤は、保存安定性に優れ、製剤投与の際に簡便に使用することができる優れた抗原ペプチド製剤ということができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原としての機能を有するペプチドを用いて免疫を行う際、効率的かつ安定的に免疫反応を惹起させることを可能とする投与製剤の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己の腫瘍細胞を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、腫瘍抗原ペプチドとよばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子）との複合体を認識することにより、自己の腫瘍細胞を攻撃する。腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンホカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。
【０００３】
また、外部から抗原が侵入すると、その抗原を捕食したマクロファージなどの喰食細胞は抗原を小さなペプチドに分解し、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して細胞表面に抗原を提示する。このペプチド抗原を認識可能なレセプターを細胞表面に有するヘルパーＴ細胞は、そのレセプターとＣＤ４分子によって、抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を同時に認識する。認識したと同時にヘルパーＴ細胞へ刺激が伝わり、ヘルパーＴ細胞は活性化し、増殖し、サイトカインを産生し始める。産生されたサイトカインは血流を通じてＢ細胞に到達し、Ｂ細胞を刺激し、Ｂ細胞能増殖を促進して形質細胞（プラズマ細胞、抗体産生細胞）や記憶細胞へと分化させ、免疫応答を増強させる。
【０００４】
上記のような免疫応答に関連するペプチドを、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドといい、単に抗原ペプチドともいう。
【０００５】
最近の研究から癌細胞由来のタンパク質分解産物が抗原となり、このタンパク質を産生している癌細胞を自ら攻撃して死滅させる機構が生体内に備わっていることが科学的に実証された。このことを受け、該癌細胞由来のタンパク質分解産物からなる抗原部分を、抗原ペプチド製剤として癌患者に投与し、腫瘍を消滅させようとする新しい治療法の開発が進められている（特許文献１、２）。
【０００６】
ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の抗原ペプチドを用いて免疫を行う際、抗原ペプチドを生理食塩水単体で免疫を行うと、免疫誘導能が低く効率的ではない。そこで、免疫能を増強させるために、従来ではフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製して、皮内や皮下に投与を行っていた。これらのエマルションや不溶性複合体が、皮内や皮下での抗原拡散を抑制して免疫誘導能を発揮させる。ただし、エマルションや不溶性複合体は長期間保存できないため、上記のように免疫時など要時調製が必要である。また、エマルションは調製に手間がかかるため、要時エマルションや不溶性複合体を調製するのは効率的ではなく、医療現場では不便であるといった問題がある。
【０００７】
また、抗原ペプチドはそのアミノ酸配列により水への溶解性が異なるため、抗原ペプチドの凍結乾燥物を注射投与するために水系溶媒に溶解するのに、各抗原ペプチドごとに溶媒量の検討が必要である。
【特許文献１】ＷＯ２０００／００２９０７号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−３４０４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗原ペプチドを含む製剤に関し、効率的・安定的に免疫誘導が得られる抗原ペプチド製剤を提供することを課題とする。すなわち、抗原ペプチド製剤の投与の際、鉱物油エマルションなどを利用しなくても免疫可能な抗原ペプチド製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸または前記塩基性アミノ酸を含むオリゴペプチドを付加し、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させて、抗原ペプチド製剤を調製することにより、鉱物油エマルションなどを利用しなくても免疫可能な抗原ペプチド製剤を提供可能なことを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加し、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させることを特徴とする抗原ペプチド製剤の調製方法。
２．抗原ペプチドに付加するオリゴペプチドが、抗原ペプチドに付加するオリゴペプチドを付加したのちのアミノ酸残基全体に対して、塩基性アミノ酸残基の割合が少なくとも４０％以上となる前項１に記載の抗原ペプチド製剤の調製方法。
３．オリゴヌクレオチドが、塩基数５〜２５のヌクレオチドであり、ＣｐＧ配列を含む構造である、前項１または２に記載の抗原ペプチド製剤の調製方法。
４．前項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法により得られる抗原ペプチド製剤。
５．ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含むオリゴペプチドを付加したオリゴペプチドとオリゴヌクレオチドの水不溶性の複合体を含む、抗原ペプチド製剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の製造方法から得られた抗原ペプチド製剤の投与により、投与の際に抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製する必要なく、ＣＴＬ活性の上昇が得られた。アルギニン付加ＯＶＡペプチドのカチオン性とオリゴＤＮＡのアニオン性が相互に反応し、その結果生じた不溶性複合体により皮内での拡散が抑制され、免疫効果が現れたと考えられる。従って、本発明の製造方法によると、免疫投与の際に抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体等を調製する必要なく、十分に免疫誘導が可能な抗原ペプチド製剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドとは、上記背景技術の欄で説明したように、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して細胞表面に抗原を提示し、ＣＴＬやヘルパーＴ細胞等の作用によって、細胞傷害作用やＢ細胞能増強により免疫応答を増強可能なペプチドをいう。上記のような免疫応答に関連するペプチドを、単に抗原ペプチドともいう。
【００１３】
抗原ペプチドを皮内または皮下投与する場合、水溶性の状態では拡散が早く免疫担当細胞に認識される前に抗原が拡散して、高い免疫誘導が得られない。つまり、抗原ペプチドが拡散しないで免疫担当細胞に認識されるように、抗原ペプチドの複合体を形成して不溶化する事で、投与時の免疫誘導能を得る事ができる。免疫投与時に抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製しなくとも、十分に免疫誘導が可能な抗原ペプチド製剤は、以下の方法により調製することができる。
【００１４】
抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加する。この塩基性アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンから選択される天然型塩基性アミノ酸でもよいが、塩基性の非天然型アミノ酸を付加させてもよい。オリゴペプチドの配列は、一種のアミノ酸のみでも、三種のアミノ酸をランダムに含むものでもよい。付加するオリゴペプチドには、抗原ペプチドにオリゴペプチドを付加した後のペプチドにおいて、アミノ酸残基全体に対する塩基性アミノ酸残基の割合が少なくとも４０％以上となるのが好ましい。
【００１５】
抗原ペプチドに、前記オリゴペプチドを付加する位置は、抗原ペプチドの抗原決定基を阻害しない部位であればよいが、特にＮ末端若しくはＣ末端、またはＮ末Ｃ末の両端に、塩基性アミノ酸を付加させる事ができる。
【００１６】
上記オリゴペプチドを付加した抗原ペプチドに、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させることで、抗原ペプチド製剤を得ることができる。上記において、付加するオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡが好適であり、また直鎖状・環状のいずれも利用可能である。オリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であればよいが、混合した際に、塩基性アミノ酸の有するカチオンが、オリゴヌクレオチドの有するアニオンより過剰となる条件が望ましい。そのようなオリゴヌクレオチドの塩基数は、具体的には５〜２５である。
【００１７】
本発明において、上記オリゴヌクレオチドを免疫に用いる場合、免疫誘導能を活性化するＣｐＧ配列を含む構造からなるオリゴヌクレオチドであればなお好ましい。ここにおいて、ＣｐＧ配列とは、真核生物の遺伝子のプロモーター領域に多く見られ、Ｇ＋Ｃ含量が相対的に高い領域をいう。哺乳動物では、ＣｐＧ配列が島状に散在し、これをＣｐＧアイランドともいう。
【００１８】
本発明は、上記の調製方法の他、上記調製方法により得られた抗原ペプチド製剤も含む。具体的には、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加したオリゴペプチドとオリゴヌクレオチドの水不溶性の複合体を含む、抗原ペプチド製剤も含まれる。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２０】
（実施例１）各試料の調製
１）各ペプチドの調製
卵白アルブミンの抗原ペプチド（ＯＶＡペプチド（Sigma Genosys社））（配列番号１）を得、さらにＯＶＡペプチドにアルギニン１，３，５または７残基を付加したものを合成した（配列番号２〜５）。
【００２１】
ＯＶＡペプチド ：SIINFEKL （配列番号１）
Ｒ１-ＯＶＡペプチド ：RSIINFEKL（配列番号２）
Ｒ３-ＯＶＡペプチド ：RRRSIINFEKL（配列番号３）
Ｒ５-ＯＶＡペプチド ：RRRRRSIINFEKL（配列番号４）
Ｒ７-ＯＶＡペプチド ：RRRRRRRSIINFEKL（配列番号５）
【００２２】
２）オリゴヌクレオチドの合成
免疫誘導能を活性化するＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）を合成した（配列番号６）。
ＧｐＧ含有オリゴＤＮＡ：TCCATGACGTTCCTGATGCT（配列番号６）
【００２３】
３）試料の調製
上記１）および２）で調製した各ペプチドおよびオリゴＤＮＡをそれぞれ生理食塩水に溶解し、表１に示す試料を調製した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（実験例１）不溶性複合体の形成
２００ｎｍｏｌの各抗原ペプチドを含有する生理食塩水溶液２００μｌに、５ｎｍｏｌまたは１０ｎｍｏｌのＣｐＧを添加した試料について、目視にて複合体形成を確認した。その結果を表１に示した。
塩基性アミノ酸であるアルギニンを付加させないＯＶＡペプチドでは、複合体形成は認められなかったが、アルギニン１，３，５，７残基を付加したＲ１，Ｒ３，Ｒ５およびＲ７−ＯＶＡペプチドでは、複合体形成を認めた。
【００２６】
（実験例２）不溶性複合体中のペプチド抗原含有量の確認
２００ｎｍｏｌの各抗原ペプチドを含有する生理食塩水溶液２００μｌに、５ｎｍｏｌまたは１０ｎｍｏｌのＣｐＧを添加して複合体を形成させた。８０００ｒｐｍ×５分間にて遠心分離を行い、沈殿した複合体のみを回収して、上清についてＨＰＬＣ分析を行った。その結果を表２に示した。
【００２７】
分析条件
カラム ：Xbridge C18（Waters製）
溶離液 ：Ａ液 ０．１％ ＴＦＡ／水、Ｂ液 ０．１％ ＴＦＡ／ＡｃＮ
溶出条件 ：Ａ液 ９５％／Ｂ液５％→（２０分間）→Ａ液 ４５％／Ｂ液５５％
流量 ：１ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
【００２８】
【表２】
【００２９】
各試料より得た複合体から、表２に示す量の抗原ペプチドを回収することができた。
【００３０】
（実験例３）再懸濁後の複合体中抗原ペプチド残存量
２００ｎｍｏｌの抗原ペプチドを含有する生理食塩水溶液２００μｌに、５ｎｍｏｌ，１０ｎｍｏｌまたは２０ｎｍｏｌのオリゴＤＮＡを添加して複合体を形成させた。８０００ｒｐｍ×５分間にて遠心分離を行い、沈殿した複合体のみを回収して、−４０℃にて凍結保存した。保存した不溶性複合体を、生理食塩液２００μｌにて再懸濁した後、再度８０００ｒｐｍ×５分間にて遠心分離を行い、複合体を回収した。上清について、上記実験例２と同条件にてＨＰＬＣ分析を行った。その結果を表３に示した。
【００３１】
【表３】
【００３２】
各試料より得た再懸濁した複合体から、表３に示す割合の抗原ペプチドを回収することができた。Ｒ１およびＲ３−ＯＶＡペプチドを含む複合体では、再懸濁時に抗原ペプチドが複合体から解離する場合もあったが、Ｒ５およびＲ７−ＯＶＡペプチドでは、再懸濁時にも抗原ペプチドは複合体から全く解離せず、安定に維持された。
【００３３】
（実験例４）免疫誘導試験
実験例２と同様に、２００ｎｍｏｌの抗原ペプチドを含有する生理食塩水溶液２００μｌに、５ｎｍｏｌまたは１０ｎｍｏｌのオリゴＤＮＡを添加して複合体を形成させた。８０００ｒｐｍ×５分間にて遠心分離を行い、沈殿した複合体のみを回収して、−４０℃にて凍結保存した。保存した不溶性複合体を、生理食塩液２００μｌにて再懸濁して投与サンプルとした。
【００３４】
剃毛したマウス（C57BL/6、♀、８週齢）に投与サンプルを注射投与（５０μｌ×４箇所／匹）した。１週毎に１回、２週間投与を行い、最終投与から１週間後に脾臓を摘出して、ＣＴＬ活性を測定した。ＣＴＬ活性は、ELISpot（Enzyme-Linked Immunospot）法により測定した。その結果を表４に示した。
【００３５】
【表４】
【００３６】
表４に示すように、各試料より得た不溶性複合体と生理食塩水の懸濁液の投与により、ＣＴＬ活性の上昇が得られた。アルギニン付加ＯＶＡペプチドのカチオン性とオリゴＤＮＡのアニオン性が相互に反応し、その結果生じた不溶性複合体により皮内での拡散が抑制され、免疫効果が現れたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上詳述したように、本発明の製造方法から得られた抗原ペプチド製剤の投与により、投与の際に抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製する必要なく、ＣＴＬ活性の上昇が得られた。アルギニン付加ＯＶＡペプチドのカチオン性とオリゴＤＮＡのアニオン性が相互に反応し、その結果生じた不溶性複合体により皮内での拡散が抑制され、免疫効果が現れたと考えられる。従って、本発明の製造方法によると、免疫投与時に、抗原物質とフロイントの完全または不完全アジュバンドなどの鉱物油とのエマルション化や、水酸化アルミニウムとの不溶性複合体を調製する必要なく、十分に免疫誘導が可能な抗原ペプチド製剤を提供することができる。本製剤は、保存安定性に優れ、製剤投与の際に簡便に使用することができる優れた抗原ペプチド製剤ということができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加し、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させることを特徴とする抗原ペプチド製剤の調製方法。
【請求項２】
抗原ペプチドに付加するオリゴペプチドが、抗原ペプチドに付加するオリゴペプチドを付加したのちのアミノ酸残基全体に対して、塩基性アミノ酸残基の割合が少なくとも４０％以上となる請求項１に記載の抗原ペプチド製剤の調製方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、塩基数５〜２５のヌクレオチドであり、ＣｐＧ配列を含む構造である、請求項１または２に記載の抗原ペプチド製剤の調製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法により得られる抗原ペプチド製剤。
【請求項５】
ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含むオリゴペプチドを付加したオリゴペプチドとオリゴヌクレオチドの水不溶性の複合体を含む、抗原ペプチド製剤。
【請求項１】
ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含み、塩基性アミノ酸のみから構成されたオリゴペプチドを付加し、さらにオリゴヌクレオチドと混合して水不溶性の複合体を形成させることを特徴とする抗原ペプチド製剤の調製方法。
【請求項２】
抗原ペプチドに付加するオリゴペプチドが、抗原ペプチドに付加するオリゴペプチドを付加したのちのアミノ酸残基全体に対して、塩基性アミノ酸残基の割合が少なくとも４０％以上となる請求項１に記載の抗原ペプチド製剤の調製方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、塩基数５〜２５のヌクレオチドであり、ＣｐＧ配列を含む構造である、請求項１または２に記載の抗原ペプチド製剤の調製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法により得られる抗原ペプチド製剤。
【請求項５】
ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ拘束性の配列を有する抗原ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンから選択される塩基性アミノ酸、若しくは前記塩基性アミノ酸を含むオリゴペプチドを付加したオリゴペプチドとオリゴヌクレオチドの水不溶性の複合体を含む、抗原ペプチド製剤。
【公開番号】特開２００８−３０８４７４（Ｐ２００８−３０８４７４Ａ）
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６０７６２（Ｐ２００７−１６０７６２）
【出願日】平成１９年６月１８日（２００７．６．１８）
【出願人】（０００００３９６４）日東電工株式会社 (5,557)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１８日（２００７．６．１８）
【出願人】（０００００３９６４）日東電工株式会社 (5,557)
【Ｆターム（参考）】
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