抗原提示細胞上に発現されたＤＣＩＲへの抗原のターゲティングに基づくワクチン
本発明は、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を用いた、抗原提示の有効性を増大させるための組成物及び方法であって、上記抗原が、上記抗体−抗原複合体と接触していた樹状細胞によってプロセシング及び提示される組成物及び方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ワクチン接種の分野に関し、より詳細には、抗原提示細胞上に発現されたＤＣＩＲへの抗原のターゲティングに基づくワクチンに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれている、２００７年２月２日出願の米国仮出願第６０／８８８０３２号に基づく優先権を主張する。
【０００３】
米国連邦政府によって資金助成された研究に関する記載
本発明は、ＮＩＨによって授与された契約番号１Ｕ１９ＡＩ０５７２３４−０１００００３下の米国政府助成を用いて行われた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
本発明の範囲を限定せずに、その背景を抗原提示との関連において説明する。
【０００５】
樹状細胞（ＤＣ，dendritic cell）ターゲッティングに基づくヒトワクチンは、マウスモデルでの説得力のある研究を基にする新概念である。この場合、特定のＤＣ受容体に対する抗体によってＤＣにもたらされる少量の比較的弱い抗原が、強力かつ広範な免疫応答を誘発しうる。ヒト用のそのようなワクチンを開発するには、この抗原ターゲティングの適用に正確にどのＤＣ受容体を用いるべきかに関する、より詳細な理解を必要とする。これは、マウスの免疫系とヒトの免疫系との間で、常に正確な対応があるわけではないからであり、また、このワクチン適用に関して、すべての潜在的ＤＣ受容体が慎重に検査されているわけではないからでもある。
【０００６】
したがって、様々な抗ヒトＤＣ受容体標的をインビトロで試験する研究が開始されており、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子及びクラスII分子との関連で、マンノース受容体で活性化されたＴ細胞に対するヒトｍＡｂに融合している黒色腫抗原ｐｍｅｌ１７を用いて、ＤＣターゲッティングが行われた（Ramakrishna, V., J. F. Treml, et al. (2004). "Mannose receptor targeting of tumor antigen pmel17 to human dendritic cells directs anti-melanoma T cell responses via multiple HLA molecules." J Immunol 172(5): 2845-52.）。また、ヒト化抗ＤＣ−ＳＩＧＮ ｍＡｂを介して、モデル抗原であるＫＬＨをＤＣにターゲティングすることによって、抗原特異的なナイーブＴ細胞応答に加えて、用量抑制的なリコールＴ細胞応答も効果的に誘導された（Tacken, P. J., I. J. de Vries, et al. (2005). "Effective induction of naive and recall T-cell responses by targeting antigen to human dendritic cells via a humanized anti-DC-SIGN antibody." Blood 106(4): 1278-85.）。マンノース受容体及びＤＣ−ＳＩＧＮに加えて、ヒトＤＣは、抗原捕捉に関与していることが知られている他の受容体も発現する。これらの多くは、ＬＯＸ−１、ＤＥＣ２０５、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ、ランゲリン、ＤＣＩＲ、ＢＤＣＡ−２、ＤＥＣＴＩＮ−１及びＣＬＥＣ−６を含めたＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ，C-type lectin receptor）である。これらのＣＬＲは、ＤＣの異なったサブセットにより異なって発現され、それらの発現は、ＤＣ成熟の状態に従って相違しうる（Figdor, C. G., Y. van Kooyk, et al. (2002). "C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells." Nat Rev Immunol 2(2): 77-84.、Geijtenbeek, T. B., S. J. van Vliet, et al. (2004). "Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells." Annu Rev Immunol 22: 33-54.）。
【０００７】
ＤＣのサブセットは、異なった免疫応答を刺激する。したがって、異なって発現される受容体を介して、抗原をこれらのサブセットにターゲティングすることによって、異なった免疫応答が誘発されるはずである（Shortman, K. and Y. J. Liu (2002). "Mouse and human dendritic cell subtypes." Nat Rev Immunol 2(3): 151-61.）。さらに、同じＤＣサブセット上の異なった受容体が、抗原を別々のプロセシング経路に方向付ける可能性もある（Trombetta, E. S. and I. Mellman (2005). "Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo." Annu Rev Immunol 23: 975-1028.）。最後に、これらの受容体の一部は内因的に活性化しないものであり（例えば、ＤＥＣ２０５（Bonifaz, L. C., D. P. Bonnyay, et al. (2004). "In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination." J Exp Med 199(6): 815-24.））、一方、他のものは、活性化するものであるか（例えば、ＬＯＸ−１（Delneste, Y., G. Magistrelli, et al. (2002). "Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation." Immunity 17(3): 353-62.））、まだ完全には研究されていないものである。抗原の取り込みと同時に起こるＤＣ活性化の重要性は知られていない。しかし、これが有益であるならば、ターゲッティングｍＡｂを介したＤＣの活性化によって、ターゲッティングワクチンの製剤が単純化される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ramakrishna, V., J. F. Treml, et al. (2004). "Mannose receptor targeting of tumor antigen pmel17 to human dendritic cells directs anti-melanoma T cell responses via multiple HLA molecules." J Immunol 172(5): 2845-52.
【非特許文献２】Tacken, P. J., I. J. de Vries, et al. (2005). "Effective induction of naive and recall T-cell responses by targeting antigen to human dendritic cells via a humanized anti-DC-SIGN antibody." Blood 106(4): 1278-85.
【非特許文献３】Figdor, C. G., Y. van Kooyk, et al. (2002). "C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells." Nat Rev Immunol 2(2): 77-84.
【非特許文献４】Geijtenbeek, T. B., S. J. van Vliet, et al. (2004). "Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells." Annu Rev Immunol 22: 33-54.
【非特許文献５】Shortman, K. and Y. J. Liu (2002). "Mouse and human dendritic cell subtypes." Nat Rev Immunol 2(3): 151-61.
【非特許文献６】Trombetta, E. S. and I. Mellman (2005). "Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo." Annu Rev Immunol 23: 975-1028.
【非特許文献７】Bonifaz, L. C., D. P. Bonnyay, et al. (2004). "In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination." J Exp Med 199(6): 815-24.
【非特許文献８】Delneste, Y., G. Magistrelli, et al. (2002). "Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation." Immunity 17(3): 353-62.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらの考慮を背景として、本発明者らは、望ましい免疫結果を得るために最も適したヒトＤＣターゲッティング受容体を特定するための、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞ナイーブ応答及びリコール応答をインビトロで詳細に探索することによる系統的な比較の緊急な必要性を認識している。本出願は、特定のＤＣ受容体、すなわち、樹状細胞抑制型受容体（ＤＣＩＲ，Dendritic Cell Inhibitory Receptor）が、予防用及び治療用ワクチン接種のために抗原をヒトＤＣにターゲティングする目的に理想的な受容体であることを示す、その特殊かつ予想外な特徴を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、抗原に対する強力かつ広範な免疫応答を誘発する目的で、抗原を抗原提示細胞に特異的にターゲティングする（送達する）ワクチンを作製及び使用するための組成物及び方法を含む。目的は、主として、抗原が由来する作用物質（病原体又は癌）に対する防御的又は治療的免疫応答を誘起することである。
【００１１】
より詳細には、本発明は、制御されたモジュール構造で１又は複数の抗原を保持する、標的特異的な単一の組換え抗体（ｍＡｂ）、活性化タンパク質又は他の抗体を設計及び作製するための組成物、方法及び方法を提供する。本発明のモジュールｒＡｂ担体は、例えば、複数の抗原、並びに／又は抗原及び活性化サイトカインを（内部移行するヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体を介して）樹状細胞（ＤＣ）にターゲティングするのに用いることができる。また、本発明は、制御され、かつ特定されたやり方で、２つの異なった組換えｍＡｂを端と端とで連結する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、抗体−抗原複合体を形成する標的作用物質が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を単離及び精製することによって、ＤＣＩＲ発現抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させる組成物及び方法であって、その作用物質が、抗体−作用物質複合体と接触した、例えば樹状細胞によってプロセシング及び提示される方法を含む。一実施形態では、抗原提示細胞が樹状細胞であり、ＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の一方の半分に結合する。ＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の一方の半分に結合し、かつ抗原がコヘリン／ドックリン対の他方の半分に結合して複合体を形成してもよい。作用物質の非限定的な例には、ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、核酸及びこれらの組合せのうちの１又は複数が含まれる。
【００１３】
作用物質は、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ，transforming growth factor）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ，fibroblast growth factor）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ，platelet derived growth factor）、上皮成長因子（ＥＧＦ，epidermal growth factor）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ，connective tissue activated peptide）、骨形成因子、並びにそのような成長因子の生理活性類似体、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、分裂促進サイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、並びにβトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合性成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来性成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ，insulin-like growth factor））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えばＧＤＦ−１）及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めたトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）遺伝子スーパーファミリーから選択される１又は複数のサイトカインでありうる。別の実施形態では、作用物質は、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性及び癌性のタンパク質である抗原を含む。
【００１４】
本発明は、樹状細胞による抗原提示の有効性を増大させる組成物及び方法であって、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合するＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を結合させるステップを含み、その抗原が、抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によってプロセシング及び提示される組成物及び方法も含む。別の実施形態は、防御的又は治療的免疫応答を誘発する目的で、抗原を抗原提示細胞に送達するための、ＤＣＩＲに対する抗体又は他の特異的結合分子の使用である。皮膚を介したワクチン接種のための、ＤＣＩＲに特異的な抗原標的試薬の使用；同時投与又は連結されたワクチン接種用のアジュバントと併用した、ＤＣＩＲに特異的な抗原標的試薬の使用、又は組換えの抗原−抗体融合タンパク質として発現することができる特異的抗原の、抗原ターゲッティング（ワクチン接種）目的での使用。
【００１５】
別の実施形態は、患者の樹状細胞を単離するステップ；上記樹状細胞を活性化量の抗ＤＣＩＲ抗体又はその断片及び抗原に曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップ；並びに抗原が負荷されて活性化された上記樹状細胞を上記患者に再導入するステップによって、樹状細胞の有効性を増大させる方法を含む。抗原は、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性又は癌性のタンパク質を含みうる。本発明は、哺乳動物細胞から分泌された抗ＤＣＩＲ免疫グロブリン又はその部分、及び免疫グロブリンに結合した抗原も含む。免疫グロブリンは、コヒーシン／ドックリンドメインの半分に結合しており、又はそれは、モジュールｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヒーシン−ドックリン結合対の他方の半分、若しくは抗原との融合タンパク質である、コヒーシン−ドックリン結合対の他方の半分を含んでもよい。抗原特異的なドメインは、完全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片、及び／又はＦｃドメインの部分を伴ったＦａｂ断片でありうる。抗ＤＣＩＲ免疫グロブリンは、放射性同位元素、金属、酵素、ボツリヌス毒素、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、ウェルシュ菌毒素、マイコトキシン、志賀毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン（seguitoxin）、サキシトキシン、アブリン、シアノジノシン、α毒素、テトロドトキシン、アコノトキシン（aconotoxin）、ヘビ毒及びクモ毒から選択される毒素に結合していてもよい。抗原は、免疫グロブリンとの融合タンパク質であるか、又は免疫グロブリンに共有結合若しくは非共有結合によって化学的に結合したものでありうる。
【００１６】
別の実施形態は、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を含むワクチンであって、その抗原が、抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によってプロセシング及び提示されるワクチンである。
【００１７】
本発明の新規抗体は、新規な組織分布情報を示すこともできた。それらの特異的親和性により、本発明の抗ＤＣＩＲ抗体は、サルＤＣＩＲに結合することが見出された。本発明の抗ＤＣＩＲ抗体は、インビボ［ｈｕ−マウス］における、抗ＤＣＩＲ−Ｆｌｕ ｍ１を用いた、増殖中のＦｌｕ ｍ１特異的ＣＤ８細胞へのターゲッティング、及びエキソビボヒト皮膚細胞のインビトロターゲッティングに有効である。さらに、ＤＣＩＲの炭水化物リガンドの複合体は、抗原送達のための抗ＤＣＩＲ薬の代用薬として使用できることが見出された。したがって、本発明の別の実施形態は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｓｐ１２を含有する、グリカンの少なくとも一部に結合した、ＤＣＩＲに特異的に結合する抗原性Ｔ細胞エピトープペプチドである。上記グリカン（及びその誘導体）は、単独又は併用で、ＤＣＩＲ結合を阻止するのに使用できる。
【００１８】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、これより、添付された図と共に、本発明の詳細な説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、対照と比較した場合、すべてではないが、多くのハイブリドーマ上清が、ＭＣＰ−１の特異的な産生を誘発し、すなわち、ｍＡｂ ４Ｃ７、９Ｅ８、１９Ｅ３、１Ｇ３、１０Ａ５、２９Ｇ１０、３Ｃ２、３Ｇ２、２４Ａ５、３０Ｆ３、１２Ｅ２、５Ｆ９、２Ｆ１１、２４Ｅ７、３１Ａ６、６Ａ１１、２ ９Ｅ９、２Ｈ８、３０Ｄ９、６Ｃ８、３５Ｆ１、３Ｆ１２が以降の特徴付けに選択されたことを示す図である。
【図２】プレートに結合したＤＣＩＲとの、ｍＡｂの高親和性相互作用をＥＬＩＳＡによって示す図である。
【図３】ＦＡＣＳで使用するための高親和性抗体の結合を示す図である。
【図４】ヒト皮膚から直接単離された３種のヒトＤＣサブタイプでもＤＣＩＲが発現されていることを示す図である。
【図５】ヒト扁桃腺内の胚中心を囲む細胞集団のＤＣＩＲ特異的染色を示す図である。
【図６】架橋Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質及びＤＣＩＲに対するｍＡｂの例を示す図である。
【図７】抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９ ｍＡｂへのＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１の架橋結合を示す図である。
【図８】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１が、ｍＡｂに架橋結合されていないＦｌｕ Ｍ１タンパク質より効率的に、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す図である。
【図９】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１が、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を、Ｉｎｔ−ＤＣより、ＬＣを介して、より効率的に誘導することを示す図である。
【図１０】２９３細胞内に同時形質移入され、培養上清中へのｒＡｂの分泌に関して抗ヒトＦＣ ＥＬＩＳＡによってアッセイされた多数の異なった抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに対応するマウス−ヒトキメラｒＡｂをコードするＨ＋Ｌ鎖ベクターを示す図である。
【図１１】抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂに連結されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１がＧＭ／ＩＬ−１５ヒトＤＣに特異的に結合することを示す図である。
【図１２】抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ又は抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂに連結されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ヒトＤＣに結合し、その中に内部移行されることを示す図である。
【図１３】抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ複合体が、他の［抗ＤＣ受容体ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体より、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に効率的であることを示す図である。
【図１４】１日間投与された抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ複合体が、他の［抗ＤＣ受容体ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体より、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に効率的であることを示す図である。
【図１５】ｒＡｂ Ｈ鎖のＣ末端との融合体として発現された様々な抗原が、ｒＡｂ．抗原の分泌に内因的な影響を有することを示す図である。
【図１６】抗ＤＣＩＲ．Ｆｌｕ ＨＡ５ ｒＡｂが可変領域の性質に応じて様々な効率で分泌されることを示す図である。
【図１７】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングを増強することを示す図である。
【図１８】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングを増強することを示す図である。
【図１９】ヒト上皮シート内におけるＤＣＩＲ分布の免疫組織化学分析を示す図である。
【図２０Ａ−２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｄは、ＤＣＩＲ抗原に対するモノクローナル抗体、とりわけＤＣＩＲへの親和性を示す図である。
【図２０Ｃ−２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｄは、ＤＣＩＲ抗原に対するモノクローナル抗体、とりわけＤＣＩＲへの親和性を示す図である。
【図２１】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂの、アカゲザルＤＣＩＲに対する交差反応性を示す図である。
【図２２】特定のグリカン構造への、ＤＣＩＲ外部ドメインの結合を示すグラフである。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ＤＣＩＲが、すべての血液ＤＣサブセットのための包括的な標的であることを示す図である。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ＤＣＩＲが、すべての血液ＤＣサブセットのための包括的な標的であることを示す図である。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ＤＣＩＲが、すべての血液ＤＣサブセットのための包括的な標的であることを示す図である。
【図２４】ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１でのワクチン接種によって、ＦｌｕＭ１特異的なリコールＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の産生が可能となることを実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用について以下に詳細に論じるが、本発明は、様々な特定の概念に具体化できる多数の適用可能な発明概念を提供することを理解されたい。本明細書で論じる特定の実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するに過ぎず、本発明の範囲の境界を定めるものではない。
【００２１】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関連する領域の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」や「その（the）」などの用語は、単数の存在物のみを指すのではなく、それには、その特定の例を例示目的に用いることのできる一般クラスが含まれる。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を記載するのに使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲で大要を記載しているのを除いて、本発明の境界を定めるものではない。
【００２２】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的免疫を調節するのに重要な役割を果たしている抗原提示細胞である（Mellman, I. and R. M. Steinman (2001). "Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines." Cell 106(3): 255-8.、Banchereau, J., F. Briere, et al. (2000). “Immunobiology of dendritic cells.” Annu Rev Immunol 18: 767-811.、Cella, M., F. Sallusto, et al. (1997). "Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells." Curr Opin Immunol 9(1): 10-6.）。ＤＣは、抗原を捕捉して、それらをペプチドにプロセシングして、これらをＴ細胞に提示する。したがって、抗原をＤＣに直接送達することは、ワクチンを改善するための重点領域である。そのような例の１つは、後で患者に再投与される自己ＤＣへのエキソビボ抗原負荷を用いたＤＣベースのワクチンの開発である（Banchereau, J., B. Schuler-Thurner, et al. (2001). "Dendritic cells as vectors for therapy." Cell 106(3): 271-4.、Steinman, R. M. and M. Dhodapkar (2001). "Active immunization against cancer with dendritic cells: the near future." Int J Cancer 94(4): 459-73.）。ワクチンの効力を改善するための別の戦略は、内部移行するＤＣ特異的な受容体に対する抗体に結合した抗原をＤＣに特異的にターゲッティングすることである。ワクチン接種のためにＤＣをターゲッティングすることの可能性は、主要なマウス研究によって注目を浴びた。オボアルブミン（ＯＶＡ）に結合した抗ＬＯＸ−１ ｍＡｂを用いたインビボでのターゲッティングは、ＭＨＣクラスＩ経路に向けた外因性抗原のクロスプレゼンテーションを介して、防御的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘発した（Delneste, Y., G. Magistrelli, et al. (2002). "Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation." Immunity 17(3): 353-62.）。また、ＣＤ４０Ｌ成熟刺激と併用すると、抗ＤＥＣ２０５ ｍＡｂに結合したＯＶＡも、インビボで、ＤＣによるＭＨＣクラスＩ拘束性の提示を増強し、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の持続的な形成をもたらす（Bonifaz, L. C., D. P. Bonnyay, et al. (2004). "In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination." J Exp Med 199(6): 815-24.）。これらの研究は両方とも劇的な用量の節約（すなわち非常に少ない抗原量で強い免疫応答）を示し、他のタイプのＯＶＡ免疫処置で通常見られるより広範な応答を示唆した。ＤＥＣ２０５を介したＤＣへのＨＩＶ ｇａｇ抗原のターゲッティングを用いた最近の研究は、これらの概念を臨床的に重要な抗原にまで拡張し、ＤＣへの抗原のターゲティングの基本特性、すなわち、劇的な用量の節約、単一ワクチン接種に由来する防御応答、並びにＣＤ８及びＣＤ４コンパートメントの両方における抗原特異的なＴ細胞の増殖を確認した（Trumpfheller, C., J. S. Finke, et al. (2006). "Intensified and protective CD4+ T cell immunity in mice with anti-dendritic cell HIV gag fusion antibody vaccine." J Exp Med 203(3): 607-17.）。
【００２３】
本発明は、制御された多変量様式における、単一の組換え一次ｍＡｂへの、（一次ｍＡｂから独立して工学的に作製、発現及び精製された）複数の抗原又はタンパク質の複合体形成を提供する。現在、１つの一次ｍＡｂに（それぞれストレプトアビジンに別々に連結するように工学的に作製された）様々なタンパク質の付加を可能にする部位特異的ビオチン化部位を工学的に作製する方法が存在する。しかし、本発明は、所定のモル比及び位置における、複数の組合せの一次ｍＡｂへの、別々に工学的に作製されたタンパク質の付加を提供する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「モジュールｒＡｂ担体」という用語は、単一の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）への、様々な抗原、活性化タンパク質又は他の抗体の、制御されたモジュール付加をもたらすように工学的に作製された組換え抗体系を示すのに使用される。このｒＡｂは、標準的なハイブリドーマ技法、組換え抗体ディスプレイ及びヒト化モノクローナル抗体などを用いて作製されたモノクローナル抗体でありうる。モジュールｒＡｂ担体は、例えば、複数の抗原、並びに／又は抗原及び活性化サイトカインを（内部移行する受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの組換え一次抗体を介して）、樹状細胞（ＤＣ）にターゲティングするのに使用できる。モジュールｒＡｂ担体は、制御された特定の方法で、２つの異なった組換えｍＡｂを端と端とで連結するのに使用できる。
【００２５】
「モジュールｒＡｂ担体」の抗原結合部分は、認識されるモジュール結合部分が、そのアミノ酸配列に付加及び／又は結合される、１又は複数の可変ドメイン、１又は複数の可変ドメイン及び最初の定常ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びに、Ｆａｂｃ断片、及び／又はＦｃドメインの部分を伴ったＦａｂ断片でありうる。モジュールｒＡｂ担体で使用するための抗体は、いずれのアイソタイプ又はクラスのものでも、サブクラスでも、又はどんな供給源（動物性及び／又は組換え）由来の抗体でもよい。
【００２６】
非限定的な一例において、モジュールｒＡｂ担体は、工学的に作製された組換えｍＡｂとの関連で、特異的かつ特定のタンパク質複合体を作製するための１又は複数のモジュールコヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインを有するように工学的に作製される。ｍＡｂは、ｍＡｂの抗原結合ドメインのカルボキシ側に、１又は複数のモジュールコヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインを含有する融合タンパク質の一部分である。コヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインは、例えば化学架橋結合物質及び／又はジスルフィド結合形成を用いることによって、翻訳後に付加されたものでも可能である。
【００２７】
「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、その抗原の受容者体内で液性及び／又は細胞性免疫応答を開始できる分子を指す。抗原は、本発明では、２つの異なった場面で、すなわち抗体又はｒＡｂの他の抗原認識ドメインの標的として、又はモジュールｒＡｂ担体に相補的なドックリン／コヒーシン分子の一部として細胞若しくは細胞内にもたらされるか、ｒＡｂによってターゲッティングされる分子として使用されうる。抗原は、通常、ワクチン接種が有利な治療法となる疾患を引き起こす病原体である。抗原がＭＨＣに提示される場合、そのペプチドは、しばしば約８アミノ酸から約２５アミノ酸である。抗原には、例えば、単純な中間代謝物質、糖、脂質及びホルモン、並びに複合糖質、リン脂質、核酸及びタンパク質などの高分子を含めたどんなタイプの生物学的分子も含まれる。抗原の一般的な範疇には、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌抗原、原子動物及び他の寄生虫の抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー及び移植拒絶に関与している抗原並びに他の種々雑多な抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
モジュールｒＡｂ担体は、任意の数の活性物質、例えば、抗生物質、抗感染症薬、抗ウイルス剤、抗腫瘍薬、解熱薬、鎮痛剤、抗炎症薬、骨粗鬆症の治療薬、酵素、サイトカイン、抗凝血物質、多糖、コラーゲン、細胞及び上記の活性物質の２種以上の組合せを保持できる。本発明を用いて送達する抗生物質の例には、テトラサイクリン、アミノグルコシド、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬物、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、アマンタジン、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アンティノマイシンＤ、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン及びイミダゾールカルボキシアミドなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明を用いて送達する抗腫瘍薬の例には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール及びメトトレキセートが含まれるが、これらに限定されない。解熱薬及び鎮痛剤の例には、アスピリン、Motrin（登録商標）、Ibuprofen（登録商標）、ナプロキセン及びアセトアミノフェンなどが含まれる。
【００３０】
本発明を用いて送達する抗炎症薬の例には、ＮＳＡＩＤＳ、アスピリン、ステロイド、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニソロン及びジクロフェナクナトリウムなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明を用いて送達する骨粗鬆症治療薬並びに骨及び骨格に作用する他の因子の例には、カルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、副甲状腺ホルモン及びその活性断片、ヒストンＨ４関連骨形成増殖ペプチド（histone H4-related bone formation and proliferation peptide ）、並びにこれらの変異体、誘導体及び類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明を用いて送達する酵素及び酵素補因子の例には、Pancrease（登録商標）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、パンクレアチン、コラゲナーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノゲン、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、アデニルシクラーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明を用いて送達するサイトカインの例には、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、骨形成因子、並びにそのような成長因子の生理活性類似体、断片及び誘導体が含まれるが、これらに限定されない。サイトカインは、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、マイトジェニックサイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など；レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、又はこれらの任意の断片若しくは組合せでありうる。他のサイトカインには、βトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合性成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めたトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）スーパーファミリーのメンバーが含まれる。
【００３４】
本発明を用いて送達する成長因子の例には、哺乳動物細胞からなど、天然又は自然の供給源から単離することのできる成長因子も、組換えＤＮＡ技法によって、又は様々な化学的方法によって、合成によって調製することのできる成長因子も含まれるが、これらに限定されない。加えて、これらの因子の類似体、断片又は誘導体も、それらが天然分子の生物活性の少なくとも一部を示すという条件で、用いることができる。例えば、類似体は、部位特異的変異導入又は他の遺伝子工学的手法によって改変された遺伝子を発現することによって調製することができる。
【００３５】
本発明を用いて送達する抗凝血物質の例には、ワルファリン、ヘパリン及びヒルジンなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明を用いて送達する、免疫系に作用する因子の例には、走化性ペプチド及びブラジキニンなど、炎症及び悪性新生物を制御する因子、並びに伝染性微生物を攻撃する因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
ウイルス抗原の例には、例えば、レトロウイルス（retroviral）抗原、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素及び他のＨＩＶ成分などのヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ，human immunodeficiency virus）抗原に由来するレトロウイルス抗原など；肝炎ウイルス（hepatitis viral）抗原、すなわち、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus）のＳ、Ｍ及びＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス並びに他の肝炎、例えば、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎のプレＳ抗原、Ｃ型肝炎のウイルスＲＮＡなどのウイルス成分など；インフルエンザウイルス（influenza viral）抗原、すなわち、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ及び他のインフルエンザウイルス成分など；麻疹ウイルス（measles viral）抗原、すなわち、麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルス成分など；風疹（rubella）ウイルス抗原、すなわち、タンパク質Ｅ１及びＥ２並びに他の風疹ウイルス成分など；ロタウイルス（rotaviral）抗原、すなわち、ＶＰ７ｓｃ及び他のロタウイルス成分など；サイトメガロウイルス（cytomegaloviral）抗原、すなわち、エンベロープ糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原成分など；呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial viral）抗原、すなわち、ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分など；単純ヘルペスウイルス（herpes simplex viral）抗原、すなわち、前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ及び他の単純ヘルペスウイルス抗原成分など；水痘帯状疱疹ウイルス（varicella zoster viral）抗原、すなわち、ｇｐＩ、ｇｐII及び他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原成分など；日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis viral）抗原、タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分など；並びに狂犬病ウイルス抗原（rabies viral）、すなわち、狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質及び他の狂犬病ウイルス抗原成分などが含まれるが、これらに限定されない。ウイルス抗原の追加の例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。
【００３７】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ抗原ワクチンを用いて送達できる抗原性の標的には、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウイルスには、ピコルナウイルス（picornavirus）、コロナウイルス（coronavirus）、トガウイルス（togavirus）、フラビウイルス（flavirvirus）、ラブドウイルス（rhabdovirus）、パラミクソウイルス（paramyxovirus）、オルソミクソウイルス（orthomyxovirus）、ブニアウイルス（bunyavirus）、アレナウイルス（arenavirus）、レオウイルス（reovirus）、レトロウイルス（retrovirus）、パピローマウイルス（papilomavirus）、パルボウイルス（parvovirus）、ヘルペスウイルス（herpesvirus）、ポックスウイルス（poxvirus）、ヘパドナウイルス（hepadnavirus）及び海綿状ウイルス（spongiform virus）が含まれる。他のウイルス性の標的には、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス１及び２、麻疹、デング熱（dengue）、痘瘡（smallpox）、小児マヒ（polio）又はＨＩＶが含まれる。病原体には、トリパノソーマ（trypanosome）、条虫（tapeworm）、回虫（roundworm）、蠕虫（helminthes）及びマラリア原虫（malaria）が含まれる。この方法で、胎児性抗原又は前立腺特異抗原などの癌マーカーをターゲティングできる。他の例には、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種を目的とした、本発明によるベクターの投与は、強い免疫応答が望まれる導入遺伝子の長期的発現を可能にするために、ベクター随伴抗原が十分に非免疫原性であることが必要となる。場合によっては、個体のワクチン接種を、年に１回又は２年に１回など、まれに行うのみでよく、かつ感染性病原体に対して長期の免疫学的防御を提供しうる。本発明と共に、ベクターで、そして最終的には抗原として使用するための生物、アレルゲン、核酸配列及びアミノ酸配列の特定の例は、参照により関連部分が本明細書に組み込まれている、米国特許第６５４１０１１号明細書、とりわけ、本発明と共に用いることができる生物と特定の配列とを照らし合わせる表に見出すことができる。
【００３８】
本明細書で開示するｒＡｂワクチンと共に使用するための細菌抗原には、例えば、百日咳（pertussis）細菌抗原、すなわち、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、ペルタクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ及び他の百日咳細菌抗原成分など；ジフテリア（diptheria）細菌抗原、すなわち、ジフテリア毒素又はトキソイド、及び他のジフテリア細菌抗原成分など；破傷風（tetanus）細菌抗原、破傷風毒素又はトキソイド、及び他の破傷風細菌抗原成分など；レンサ球菌（streptococcal）細菌抗原、すなわち、Ｍタンパク質及び他のレンサ球菌細菌性抗原成分など；グラム陰性桿菌（gram-negative bacilli）細菌抗原、すなわち、リポ多糖及び他のグラム陰性細菌抗原成分など；結核菌（Mycobacterium tuberculosis）細菌抗原、すなわち、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ及び他のミコバクテリア（mycobacterial）抗原成分など；ピロリ菌（Helicobacter pylori）細菌抗原成分；肺炎球菌（pneumococcal）細菌抗原、すなわち、ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖及び他の肺炎球菌細菌抗原成分など；インフルエンザ菌（haemophilus influenza）細菌抗原、すなわち、莢膜多糖及び他のインフルエンザ菌細菌抗原成分など；炭疸（anthrax）細菌抗原、すなわち、炭疸菌防御抗原及び他の炭疸細菌抗原成分など；並びにリケッチア（rickettsiae）細菌抗原、すなわち、ｒｏｍｐＡ及び他のリケッチア細菌抗原成分などが含まれるが、これらに限定されない。他のどんな細菌抗原、ミコバクテリア抗原、マイコプラズマ抗原、リッケチア抗原又はクラミジア抗原も、本明細書に記載の細菌抗原に含まれる。インフルエンザ菌、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、髄膜炎菌（neisseria meningitidis）、肺炎レンサ球菌（streptococcus pneumoniae）、淋菌（neisseria gonorrhoeae）、サルモネラ血清型チフス菌（salmonella serotype typhi）、赤痢菌（shigella）、コレラ菌（vibrio cholerae）、デング熱、脳炎（Encephalitides）、日本脳炎、ライム病（lyme disease）、ペスト菌（Yersinia pestis）、ウエストナイルウイルス（west nile virus）、黄熱（yellow fever）、野兎病（tularemia）、肝炎（ウイルス性、細菌性）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス、respiratory syncytial virus）、ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３、アデノウイルス（adenovirus）、天然痘（small pox）、アレルギー並びに癌も、部分的又は全体的な病原体となりうる。
【００３９】
本発明の組成物及び方法と共に使用するための真菌抗原には、例えば、カンジダ菌（candida）真菌抗原成分；ヒストプラスマ（histoplasma）真菌抗原、すなわち、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）及び他のヒストプラスマ真菌抗原成分など；クリプトコッカス（cryptococcal）真菌抗原、すなわち、莢膜多糖及び他のクリプトコッカス真菌抗原成分など；コクシジオイデス（coccidiodes）真菌抗原、すなわち、球状体抗原及び他のコクシジオイデス菌抗原成分など；並びに白癬（tinea）真菌抗原、すなわち、白癬菌ワクチン及び他の白癬真菌抗原成分などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
原生動物抗原及び他の寄生虫抗原の例には、例えば、熱帯熱マラリア原虫抗原、すなわち、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液段階抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ及び他のマラリア原虫抗原成分など；トキソプラズマ（toxoplasma）抗原、すなわち、ＳＡＧ−１、ｐ３０及び他のトキソプラズマ抗原成分など；住血吸虫（schistosomae）抗原、すなわち、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシン及び他の住血吸虫抗原成分など；森林型熱帯リーシュマニア（leishmania major）及び他のリーシュマニア抗原、すなわち、ｇｐ６３、リポホスホグリカン及びその関連タンパク質、並びに他のリーシュマニア抗原成分など；並びにクルーズトリパノソーマ（trypanosoma cruzi）抗原、すなわち、７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原及び他のトリパノソーマ抗原成分などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のｒＡｂを用いてターゲティングすることができる抗原は、通常、内部移行の可能性、免疫細胞特異性のレベル、標的免疫細胞、免疫細胞の成熟及び／又は活性化のレベルなどを含めた多くの因子に基づいて選択される。限定されるものではないが、樹状細胞の細胞表面マーカーの例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ及び／又はＡＳＰＧＲなどが含まれ、場合によっては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７の不在も有する。抗原提示細胞の細胞表面マーカーの例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１並びに／又はＦｃγ受容体が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
送達用の、細胞表面にある標的抗原には、典型的には腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核及び細胞小器官などに由来する腫瘍抗原に特徴的なものが含まれる。本発明の抗体部分への腫瘍標的の例には、血液癌、すなわち、白血病及びリンパ腫など、神経腫瘍、すなわち、星状細胞腫又はグリア芽腫など、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頚部癌、消化管腫瘍、すなわち、胃癌又は大腸癌など、肝臓癌、膵臓癌、泌尿生殖器腫瘍、すなわち、頚部癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌又は陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽頭、咽頭部及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分並びに甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫並びに白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明を用いた抗原提示のために、単独で、又は組合せて、免疫細胞に送達できる抗原の例には、腫瘍タンパク質、例えば、変異導入された発癌遺伝子、腫瘍関連のウイルスタンパク質並びに腫瘍ムチン及び糖脂質が含まれる。腫瘍関連のウイルスタンパク質でありうる抗原は、上述のウイルスのクラスに由来するものとなる。特定の抗原は、腫瘍に特徴的なものでありえ（サブセットの１つは、通常は腫瘍前駆細胞によって発現されないタンパク質である）、又は、通常は腫瘍前駆細胞で発現されるが、腫瘍の変異特性を有するタンパク質でありうる。他の抗原には、活性又は細胞内分布が改変されている正常タンパク質の変異変種、例えば、腫瘍抗原を生み出す遺伝子変異が含まれる。
【００４４】
腫瘍抗原の非限定的な特定の例には、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ，prostate specific antigen）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１〜４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン、Mucin）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（黒色腫偏在性変異遺伝子産物、melanoma ubiquitous mutated gene product）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン−バーウイルス核抗原、Epstein-Barr Virus nuclear antigen）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ，human papilloma virus）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ，lung resistance protein）、Ｂｃｌ−２並びにＫｉ−６７が含まれる。加えて、上記免疫原性分子は、自己免疫疾患の開始及び／又は伝搬に関与する自己抗原でありえ、この自己免疫疾患の病態は、例えばＳＬＥ又はＭＧのように、大部分、関連する標的器管、組織又は細胞によって発現された分子に特異的な抗体の活性に起因する。そのような疾患では、関連した自己抗原に対する、進行中の抗体媒介性（すなわち、Ｔｈ２型）免疫応答を、細胞性（すなわち、Ｔｈ１型）の免疫応答へと誘導することが望ましい場合がある。別法では、関連する自己免疫疾患を有してはいないが、罹患しやすいことが疑われている対象体内の自己抗原に対するＴｈ２応答の開始を、適切な自己抗原に対するＴｈ１応答を予防的に誘導することによって、防止するか、又はそのレベルを低減することが望ましい場合がある。所望の自己抗原には、（ａ）ＳＬＥに関しては、Ｓｍｉｔｈ抗原、ＲＮＰ（リボ核タンパク質、ribonucleoprotein）、ＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質が含まれ、（ｂ）ＭＧに関しては、アセチルコリン受容体が含まれるが、これらに限定されない。１又は複数のタイプの自己免疫応答に関与するその他の種々な抗原の例には、例えば、内因性ホルモン、すなわち、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチン及び他のホルモンなどが含まれる。
【００４５】
自己免疫疾患、アレルギー及び移植拒絶に関与する抗原を、本発明の組成物及び方法で用いることができる。例えば、以下の自己免疫疾患又は障害、すなわち、糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎が含まれる）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎が含まれる）、乾癬、シェーグレン症候群によって続発する乾性角結膜炎を含めたシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー反応、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病境界反応、結節性紅斑癩、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎及び間質性肺線維症のうちのいずれか１又は複数に関与する抗原を、本発明で用いることができる。自己免疫疾患に関与する抗原の例には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５，glutamic acid decarboxylase 65）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、チログロブリン及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ，thyroid stimulating hormone）受容体が含まれる。アレルギーに関与する抗原の例には、花粉抗原、すなわち、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原及びライ麦花粉抗原など、動物由来の抗原、すなわち、塵ダニ抗原及びネコ抗原など、組織適合性抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬が含まれる。移植拒絶に関与する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓及び神経移植片成分など、移植受容動物体内に移植される移植片の抗原成分が含まれる。抗原は、自己免疫疾患を治療するのに有用な改変ペプチドリガンドでもよい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、病原体ＤＮＡ又はＲＮＡによってコードされている多くの病原体ポリペプチドのいずれかの中に位置するエピトープに類似した一次構造、二次構造又は三次構造を含有するペプチド又はタンパク質抗原を指す。類似性のレベルは、通常、そのようなポリペプチドに対するモノクローナル又はポリクロナール抗体が、そのペプチド抗原又はタンパク質抗原にも結合若しくは反応するか、又はそれ以外の方法でそれも認識する程度となる。そのような抗体と併用して、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡなど、様々な免疫検定法が利用でき、それらの方法はすべて当業者には公知である。ワクチンでの使用に適した病原体エピトープ及び／又はそれらの機能的等価物の同定は、本発明の一部である。単離及び同定された後、容易に機能的等価物を得ることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４５５４１０１号明細書に教示されているHoppの方法を利用することができる。米国特許第４５５４１０１号明細書は、親水性に基づいた、アミノ酸配列からのエピトープの同定及び調製を教示する。他のいくつかの文書にも記載されている方法、及びそれらに基づいたソフトウェアプログラムも、エピトープコア配列を同定するのに使用できる（例えば、Jameson and Wolf, 1988、Wolf et al., 1988、米国特許第４５５４１０１号明細書を参照）。これらの「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、その後、ペプチド合成又は組換え技法のいずれかの適用を介して、容易にペプチドに組み入れることができる。
【００４７】
活性成分として、本発明の抗原をコードする核酸を含有しているワクチン組成物の調製物は、液体溶液又は懸濁液として、注射剤として調製することができ、また、感染の前に液体に入れて溶液又は懸濁液にするのに適した固体形態も調製することができる。この調製物は、乳化されて、リポソーム内に封入されたものでよい。活性免疫原性成分は、しばしば担体と混合され、この担体は、薬学的に許容され、活性成分との適合性を有するものである。
【００４８】
「薬学的に許容される担体」という用語は、それが投与される対象の体内でアレルギー反応又は他の有害反応を引き起こさない担体を指す。適した、薬学的に許容される担体には、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せのうちの１又は複数が含まれる。加えて、望ましい場合には、ワクチンは、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を増強するアジュバントなど、微量の佐剤を含有しうる。有効でありうるアジュバントの例には、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ，N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ及びＲＩＢＩが含まれるが、これらに限定されない。ＲＩＢＩは、細菌から抽出された３つの成分、すなわち、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Tween 80エマルジョン中に含有している。アジュバントの他の例には、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、dimethyl dioctadecyl ammonium bromide）、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント、並びにQuilAが含まれる。加えて、リンフォカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質も、本明細書に記載のアジュバントと併用できる。
【００４９】
本発明に記載の医薬製品は、血清リポタンパク質表面に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する単コピー又は多コピーの特定ヌクレオチド配列を有する裸のポリヌクレオチドを含有しうる。このポリヌクレオチドは、生理活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードするものでよく、生理的に許容される投与可能な形態で用意されるであろう。本発明から生じうる別の医薬製品は、本明細書に記載の方法によって患者血液又は他の取得源から単離された高度に精製された血漿リポタンパク質画分と、血清リポタンパク質表面に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する単コピー又は多コピーの特定ヌクレオチド配列を含有する、上記精製リポタンパク質画分に予め結合された生理的に許容される投与可能形態のポリヌクレオチドとを含有しうる。
【００５０】
さらに別の医薬製品は、生理的に許容される投与可能形態の、単コピー又は多コピーの特定ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドに予め結合された、単コピー又は多コピーの特異的ＤＮＡ結合モチーフを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する高度に精製された血漿リポタンパク質画分を含有しうる。さらに別の医薬製品は、生理的に許容される投与可能形態の、単コピー又は多コピーの特定ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドに予め結合された、単コピー又は多コピーの特異的ＤＮＡ結合モチーフを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する高度に精製された血漿リポタンパク質画分を含有しうる。
【００５１】
投与するべき用量は、治療される対象の体重及び身体状態、並びに治療の投与経路及び頻度に大きく依存している。高度に精製されたリポタンパク質画分に予め結合された裸のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ及びタンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲にある量で投与できる。
【００５２】
ｒＡｂ及びｒＡｂ複合体の投与では、患者は、もしあればベクターの毒性を考慮に入れて、化学療法剤を投与するための一般的プロトコールに従う。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予測される。記載の遺伝子療法と組合せて、様々な標準的治療及び外科的介入を適用できることも企図されている。
【００５３】
遺伝子療法の臨床適用が企図されている場合、複合体を、意図されている適用に適した医薬組成物として調製することが必要となる。通常これは、発熱因子、及びヒト又は動物に有害でありうるどんな他の不純物も本質的に含まない医薬組成物を調製することが必要となる。通常、複合体に安定性を与え、かつ標的細胞による複合体の摂取を可能にするために、適切な塩及び緩衝剤を用いることも望まれる。
【００５４】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水溶媒中に溶解又は分散された、有効量の化合物を含有しうる。そのような組成物は、接種材料と呼ぶこともできる。医薬活性物質用のそのような媒体及び作用物質の使用は、当技術分野でよく知られている。どんな従来の媒体又は作用物質も、それが活性成分と不適合でない限り、治療組成物中でのその使用が企図されている。栄養補助活性成分も組成物に組み込むことができる。本発明の組成物は、古典的な製剤も含有しうる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中、並びに油中にデイスパージョンを調製することもできる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。
【００５５】
疾患状態。最大（又は場合によっては最小）の免疫応答を得るための部位への抗原の送達を最大にするために、治療するべき特定の疾患に応じて、本発明による治療組成物の投与は、その経路を介して標的組織に到達可能である限り、任意の一般的な経路を介したものとなる。投与は、通常、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射となる。送達するための他の領域には、経口、鼻腔、頬側、直腸、腟又は局所が含まれる。局所投与は、皮膚癌の治療にとりわけ有利となる。そのような組成物は、通常、生理的に許容される担体、緩衝剤又は他の賦形剤を含有する薬学的に許容される組成物として投与される。
【００５６】
本発明のワクチン又は治療組成物は、注射によって、非経口的に、例えば皮下又は筋肉内に投与できる。投与の他の方法に適した別の製剤には、坐剤が含まれ、場合によっては、経口製剤又はエアゾールとして供与するのに適した製剤が含まれる。経口製剤の場合、アジュバントを利用したＴ細胞サブセットの操作、抗原パッケージング、又は様々な製剤への個々のサイトカインの添加によって、最適化された免疫応答を伴った、経口ワクチンの改善がもたらされる。坐剤用には、伝統的な結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含有しうる。そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含有する混合物から生成することができる。経口製剤は、通常使用される賦形剤、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース及び炭酸マグネシウムなどを含有する。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤又は粉末薬の形態を取って、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有しうる。
【００５７】
本発明の抗原をコードする核酸は、中性形態又は塩形態で、ワクチン又は治療組成物中に処方することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（そのペプチドの遊離アミノ基で形成される）が含まれ、それらは、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸など、又は有機酸、すなわち酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマレイン酸などで形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩も、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は鉄（III）など、並びに有機塩基、すなわちイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン及びプロカインなどから得ることができる。
【００５８】
ワクチン又は治療組成物は、投与剤形と適合した方法並びに予防上及び／又は治療上有効となる量で投与する。投与するべき量は、治療される対象に依存し、これには、例えば、対象の免疫系が抗体を合成する能力、及び望ましい防御又は治療の程度が含まれる。適した用量範囲は、約１ｍｇ〜３００ｍｇの範囲及び好ましくは約１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲など、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲のワクチン接種１回あたり、活性成分数百マイクログラムの桁のものである。初期投与及び追加免疫注射に適した投与計画も可変的であるが、典型的には、初期投与の後に後続の接種を行うもの、又は他の投与を行うものである。投与するのに必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断により、対象それぞれに特有でありうる。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の最小投薬単位、核酸分子又は融合ポリペプチドが他の治療薬と併用投与されるかどうか、受容者の免疫状態及び健康、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療活性によって決まることは、当業者には明らかであろう。
【００５９】
組成物は、単回投与スケジュールで投与することも、反復投与スケジュールで投与することもできる。反復投与スケジュールは、ワクチン接種の初期コースが、例えば１〜１０回の別々の投与を含みうる投与スケジュールであって、その後、その免疫応答を維持及び／又は補強するのに必要な後続の時間間隔で、例えば次の投与まで１〜４カ月で、他の投与が行われ、そして、必要ならば、それに続く投与が数カ月後に行われる投与スケジュールである。防御免疫の望ましいレベルを維持するためには、１〜５年、通常３年間隔の周期的な追加免疫が望ましい。免疫処置コースの後に、ＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共培養された末梢血液リンパ球（ＰＢＬ、peripheral blood lymphocyte）のインビトロ増殖アッセイ、及び初プライミングされたリンパ球から放出されたＩＦＮ−γのレベルの測定を行うことができる。これらのアッセイは、放射性ヌクレオチド、酵素及び蛍光標識など、従来の標識を用いて実施できる。これらの技法は当業者に知られており、参照により関連の部分が本明細書に組み込まれている米国特許第３７９１９３２号、第４１７４３８４号及び第３９４９０６４号明細書に見出すことができる。
【００６０】
モジュールｒＡｂ担体及び／又は結合ｒＡｂ担体−（コヒーシン／ドックリン及び／又はドックリン−コヒーシン）−抗原複合体（ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチン）は、核酸ベクターが使用されるかどうか、又は最終精製タンパク質若しくは最終ワクチン形態が使用されるかどうかに応じて、１又は複数の「最小投薬単位」で与えることができる。最小投薬単位は、その投与、すなわち適切な経路及び治療実施計画に伴って望ましい応答を産生すると計算された所定の量の治療組成物を含有するものとして定義されている。投与するべき量、並びに特定の経路及び剤形は、臨床分野の当業者の技術に包含される。治療するべき対象、とりわけ対象の免疫系の状態及び望ましい防御についても評価することができる。最小投薬単位は、単回の注射で投与する必要はなく、それには、一定の時間にわたる持続注入も含まれうる。本発明の最小投薬単位は、ＤＮＡ／ｋｇ（又はタンパク質／ｋｇ）体重によって、好都合に表記されうるものであり、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１０００ｍｇ又は１０００ｍｇ超ＤＮＡ又はタンパク質／ｋｇ体重の間の範囲が投与される。同様に、送達されるｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの量は約０．２〜約８．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で変動しうる。したがって、特定の実施形態では、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ及び７．５ｍｇのワクチンをインビボで個体に送達できる。投与するべきｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの用量は、治療される対象の体重及び身体状態、並びに投与経路及び治療の頻度に大きく依存している。リポソーム送達ベクター又はウイルス性送達ベクターに予め結合された裸のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、１μｇ〜１ｍｇポリヌクレオチド又は１μｇ〜１００ｍｇタンパク質の範囲の量で投与できる。したがって、特定の組成物は、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ又は１００ｍｇのベクターに独立に結合した、約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１０００μｇの間のポリヌクレオチド又はタンパク質を含みうる。
【００６１】
Ｆｌｕ抗原をターゲティングされた樹状細胞による、ヒトＦｌｕ特異的Ｔ細胞の免疫刺激を測定するインビトロ細胞系で本発明を試験した。ここに示す結果は、単独ではこの系で効力がない抗原用量における、そのような抗原特異的細胞の特異的な増殖を実証する。
【００６２】
本発明は、モジュールｒＡｂ担体、すなわち、例えば、ヒマ毒、炭疽菌（Anthrax）毒素、及びスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ由来の防御抗原と複合体形成した組換えヒト化ｍＡｂ（特異的なヒト樹状細胞受容体に対するもの）を作製するのにも使用できる。この存在の潜在的市場は、すべての軍関係者のワクチン接種、及びこれらの物質に関連したどんな生体脅威（biothreat）にも反応して大規模人口密集地に投与するための予備に保存されるワクチンである。本発明は、ヒト使用及び動物使用の両方のためのワクチン一般の設計に広範な適用を有する。所望の産業には、製薬産業及びバイオテクノロジー産業が含まれる。
【００６３】
一般的方法−制限酵素及びＤＮＡ修飾酵素はＮＥＢ社から入手した。プラスミド及びＤＮＡ断片の精製には、Qiagen社製の製品を用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Simply Blue（Invitrogen社製）で染色された４〜１２％のBis-Trisゲルで行った。クロマトグラフィー用のカラム及び樹脂は、GE Healthcare社から入手した。プラスミドコンストラクトは、ＤＮＡ配列決定（MCLAB社）によって確認した。ＤＮＡプライマーは、Operon社又はMidland Certified Reagent Company社から入手した。配列分析は、Sequencher（Gene Codes社製）で行った。ProtParamツール（２００５年）によって予測された計算上の吸光係数に基づいたタンパク質濃度は、ＵＶ吸収（NanoDrop社製ND-1000）によって測定した。配列は、参照により本明細書に組み込まれている配列表の配列番号１〜３９に示す。それらは、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂ重鎖（配列番号１〜１７）及び軽鎖のシグナルペプチド及び可変領域配列（配列番号１８〜３９）のアラインメントである。予測されるＮ末端シグナルペプチド領域、変種間又は近縁配列間における配列の相違は、Sequencherを用いて決定した。
【００６４】
コヒーシン−屈曲部−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−６×Ｈｉｓタンパク質のコヒーシンドメインへのＣ末端伸長部の配列。免疫優性ペプチド配列ペプチドには下線が引かれており、このペプチドの境界にある太字の残基は、抗原の天然配列である。Ｃ末端のHisタグは、Ni＋＋アフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にする。Ｃ１８６ コヒーシン−屈曲部−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−６×Ｈｉｓ：
ASDTTEARHPPVTTPTTDRRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRPLEHHHHHH（配列番号４０）。
【００６５】
抗原発現コンストラクト−ＰＣＲを用いて、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)のＭ１タンパク質のＯＲＦを増幅し、その間に、開始コドンの遠位に位置するNhe I部位と、終止コドンの遠位に位置するNot I部位とを組み込んだ。消化断片をpET-28b(+)（Novagen社製）にクローニングし、Ｍ１ ＯＲＦをＨｉｓ６タグとインフレームになるように挿入して、それによって、Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質をコードするようにした。Ｎ末端のプロテインＧ前駆体Ｂ２ドメイン残基２９８〜３５２（ｇｉ｜１２４２６７｜）をNco I部位の遠位にコードし、その後に、GGSGGSGGSLD（配列番号４１）をコードするリンカー残基を有する類似のベクターにＦｌｕ Ｍ１ ＯＲＦを挿入した。このベクターは、Ｑ２４６Ｅ変化を有するＰｒｏＧ．Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質を発現した。Nco I部位とNhe I部位との間に挿入された、クロストリジウム・サーモセラム（C. thermocellum）由来のＮ末端１６９残基コヒーシンドメインをコードするpET28b(+)誘導体は、Ｃｏｈ．Ｈｉｓを発現した。Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１．Ｈｉｓの発現には、上記誘導体のNhe I部位とXho I部位との間にＦｌｕ Ｍ１ ＯＲＦを挿入した。Ｃｏｈ．ＰＥＰ．Ｈｉｓ発現コンストラクトも、必要な配列をコードする合成ＤＮＡをそれらが利用していることを除いて、同様に作製した。タンパク質は、カナマイシン耐性（４０μｇ／ｍｌ）の選択を用い、２００回転／分で振盪しながら３７℃で対数増殖期中期まで培養した大腸菌（E.coli）株BL21(DE3)（Novagen社製）又はT7 Express（ＮＥＢ社製）で、１２０ｍｇ／ＬのＩＰＴＧを添加して発現させた。３時間後に、遠心法によって細胞を採取し、−８０℃で保存した。開始コドンの代わりにSal I部位を組み込み、ベクターのXho I部位に挿入するために、遠位のXho I部位を付加することによって、上述のＡＰ融合体分泌ベクター内の外部ドメインセグメントを、ＰｒｏＧセグメント及びコヒーシンセグメントで置換した。「空」のＡＰベクターは、外部ドメインセグメントを除去することによって作製した。これらのコンストラクトは、それぞれ、ＰｒｏＧ．ＡＰ、Ｃｏｈ．ＡＰ及びＡＰの分泌を指示した。
【００６６】
組換えタンパク質の発現及び精製−プロテアーゼ阻害剤カクテルII（Calbiochem社製）０．１ｍｌを含有する、氷冷の０．１Ｍ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．４（緩衝液Ａ、ＰｒｏＧ．Ｆｌｕ Ｍ１用）又は５０ｍＭ Tris、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ、他のすべてのタンパク質用）３０ｍｌに、各１Ｌの発酵物から得られた大腸菌細胞を再懸濁した。これらの細胞を、５分間の休止時間を挟んだ２×５分間、設定１８で（Fisher社製Sonic Dismembrator 60）、氷上で超音波処理し、その後、１７０００ｒ．ｐ．ｍ．（Sorvall社製SA-600）、４℃で２０分間、遠心処理を行った。ＰｒｏＧ．Ｆｌｕ Ｍ１を得るために、緩衝液Ａで平衡化したＱセファロース５ｍｌ中に上清を通し、その後、ＱのフロースルーにｈＩｇＧビーズ５ｍｌを添加し、混合しながら４℃で１時間インキュベートした。ビーズに結合したタンパク質を、冷ＰＢＳ ５０ｍｌで洗浄し、０．１ＭグリシンｐＨ２．７ ２×１０ｍｌで溶出した。プールした溶出液を、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ５．０緩衝液を用いてｐＨ５にし、５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０（緩衝液Ｃ）で平衡化した１ｍｌ HiTrap Sカラム内を流した。カラムに結合したタンパク質を緩衝液Ｃで繰り返し洗浄し、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を有する緩衝液Ｃで溶出した。ピーク画分をプールした。Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１を精製するために、Ｑセファロースビーズ５ｍｌの中に、細胞溶解液上清画分５０ｍｌを通し、１６０ｍＭ Tris、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９ ６．２５ｍｌをＱセファロースのフロースルーに添加した。これを、Ｎｉ＋＋充填した５ｍｌ HiTrapキレート化ＨＰカラムに４ｍｌ／分で添加した。カラムに結合したタンパク質を２０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６（緩衝液Ｄ）で洗浄し、その後、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０でもう１回洗浄した。結合したタンパク質を１００ｍＭ〜１ＭのＨ３ＣＯＯＮａ勾配ｐＨ４．０で溶出した。ピーク画分をプールし、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０で平衡化した５ｍｌ HiTrap Sカラムに４ｍｌ／分で添加し、平衡化緩衝液で洗浄し、その後、５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．５でもう１回洗浄した。結合したタンパク質を、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を有する５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．５で溶出した。約５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出したピーク画分をプールした。Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１の調製物は、変動的な量の非完全長産物、おそらくＣ末端部分を欠失した産物を含有していた。Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１．Ｈｉｓを精製するために、２Ｌの培養物から得られた細胞を、上述の通り、但し緩衝液Ｂ中で超音波処理した。遠心処理の後、上清にTriton X114 ２．５ｍｌを添加し、氷上で５分間インキュベートした。２５℃でさらに５分間インキュベートした後、２５℃で遠心処理して、上清をTriton X114から分離した。この抽出を繰り返し、Ｑセファロースビーズ５ｍｌの中に上清を通し、１６０ｍＭ Tris、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９ ６．２５ｍｌをＱセファロースのフロースルーに添加した。その後、Ｎｉ＋＋キレート化クロマトグラフィーによって上述の通りタンパク質を精製し、０〜５００ｍＭイミダゾールを有する緩衝液Ｄで溶出した。
【００６７】
マウス／ヒトキメラｍＡｂのｃＤＮＡクローニング及び発現−全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から調製し（RNeasyキット、Qiagen社製）、供給された５’プライマー及び遺伝子特異的な３’プライマー、すなわち、
ｍＩｇＧκ、５’ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc３’；（配列番号４２）
ｍＩｇＧλ、５’ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc３’；（配列番号４３）
ｍＩｇＧ１、５’gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc３’；（配列番号４４）
ｍＩｇＧ２ａ、５’ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt３’；（配列番号４５）
及びｍＩｇＧ２ｂ、５’ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt３’（配列番号４６）
を用いたｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ（SMART RACEキット、BD Biosciences社製）に用いた。ＰＣＲ産物をクローニングし（pCR2.1 TAキット、Invitrogen社製）、ＤＮＡ配列決定によって特徴付けした。得られた、マウスＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域ｃＤＮＡの配列を用い、特異的プライマーを使用して、シグナルペプチド及びＶ領域をＰＣＲ増幅し、その間、下流のヒトＩｇＧκ領域又はＩｇＧ４Ｈ領域をコードする発現ベクター内にクローニング用の隣接制限部位を組み込んだ。Xho I部位及びNot I部位によって挟まれた残基４０１〜７３１（ｇｉ｜６３１０１９３７｜）を増幅し、これをpIRES2-DsRed2（BD Biosciences社製）のXho I〜Not Iの間に挿入することによって、キメラｍｖκ−ｈＩｇκを発現するためのベクターを構築した。ＰＣＲを用いて、Nhe I部位又はSpe I部位、その後CACCを追加した開始コドンから、Xho I部位を追加したコード領域（例えばｇｉ｜７６７７９２９４｜の残基１２６）までｍＡｂ Ｖｋ領域を増幅した。その後、このＰＣＲ断片を上記ベクターのNhe I〜Not Iの間にクローニングした。κｍＳＬＡＭリーダーを用いたキメラｍｖκ−ｈＩｇ用のベクターは、５’ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag３’（配列番号４７）という配列を、上記ベクターのNhe I〜Xho I間に挿入することによって構築した。ＰＣＲを用いて、予測されていた成熟型のＮ末端コドン（SignalP 3.0 Serverサーバを用いて定義された）（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, et al. (2004). "Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0." J Mol Biol 340(4): 783-95.）と、ｍＶκ領域の終端（上記の定義の通り）との間を、５’tcgtacgga３’を追加しながら増幅した。Bsi WI及びXho Iで消化した断片を、上記ベクターの対応する部位に挿入した。対照ｈＩｇκ配列は、ｇｉ｜４９２５７８８７｜の残基２６〜８５及びｇｉ｜２１６６９４０２｜の残基６７〜７０９に対応している。対照ｈＩｇＧ４Ｈベクターは、Ｓ２２９Ｐ及びＬ２３６Ｅ置換を有する、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の残基１２〜１４７３がpIRES2-DsRed2ベクターのBgl II部位〜Not I部位間に挿入され、終止コドンの代わりに配列５’gctagctgattaattaa３’が追加されたものに対応する。これらの置換は、ジスルフィド結合を安定させ、残留ＦｃＲ結合を消失させる（Reddy, M. P., C. A. Kinney, et al. (2000). "Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4." J Immunol 164(4): 1925-33.）。ＰＣＲを用いて、CACCと、その後Bgl II部位とを追加した開始コドンから、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の残基４７３をコードする領域まで、ｍＡｂ ＶＨ領域を増幅した。その後、このＰＣＲ断片を上記ベクターのBgl II〜Apa I間にクローニングした。ｍＳＬＡＭリーダーを用いたキメラｍＶＨ−ｈＩｇＧ４配列用のベクターは、５’ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc３’（配列番号４８）という配列を、上記ベクターのBgl II〜Apa I間に挿入することによって構築した。ＰＣＲを用いて、予測されていた成熟型Ｎ末端コドンとｍＶκ領域の終端との間を、５’tcgtacgga３’を追加して増幅した。Bsi WI及びApa Iで消化された断片を上記ベクターの対応する部位に挿入した。
【００６８】
近位のNhe I部位と、終止コドンに続く遠位のNot I部位とによって挟まれた様々な抗原コード配列を、Ｈ鎖ベクターのNhe I〜Pac I〜Not Ｉ間に挿入した。Ｆｌｕ ＨＡ１−１は、近位の５’gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa３’（配列番号４９）配列（Nhe I部位と、それに続くｃｉｐＡコヒーシン−コヒーシンリンカー残基とコードする配列）と、遠位の５’caccatcaccatcaccattgagcggccgc３’（配列番号５０）配列（Ｈｉｓ６、終止コドン及びNot I部位をコードしている）とを伴った、インフルエンザＡ型ウイルス（A/Puerto Rico/8/34(H1N1)）の赤血球凝集素ｇｉ｜２１６９３１６８｜残基８２〜１０２５（Ｃ９８２Ｔ変化を有する）によってコードされていた。Ｆｌｕ ＨＡ５−１は、Ｆｌｕ ＨＡ１−１と同じ配列が結合した、ｇｉ｜５０２９６０５２｜インフルエンザＡウイルス（A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)）赤血球凝集素残基４９〜９９０によってコードされていた。Ｄｏｃは、近位のNhe I及び遠位のNot I部位を伴ったｇｉ｜４０６７１｜ｃｅｌＤ残基１９２３〜２１５０によってコードされていた。ＰＳＡは、５’gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaacaccgacaacaacacttctagcgc３’（配列番号５１）（Nhe I部位及びｃｉｐＡスペーサー）という近位配列と、遠位のNot I部位とを伴った、ｇｉ｜３４７８４８１２｜前立腺特異抗原残基１０１〜８３２によってコードされていた。Ｆｌｕ Ｍ１−ＰＥＰは、５’gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcgaacgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccgc３’（配列番号５２）によってコードされていた。これも、他のすべてのペプチドをコードする配列も、Nhe I及びNot I制限Ｈ鎖ベクター又はNhe I - Xho I制限Ｃｏｈ．Ｈｉｓベクターへのクローニングに適合した末端を有する相補的な合成ＤＮＡ断片の混合物を介して生成された。制限部位を組み込む必要がある場合、又はＣｉｐＡスペーサー配列中を除いて、好ましいヒトコドンを常に使用した。
【００６９】
ｒＡｂ発現コンストラクトの産生レベルは、それぞれ約２．５μｇのＬ鎖コンストラクト及びＨ鎖コンストラクトと、上述のプロトコールとを用いた５ｍｌ一時的形質移入で試験した。上清は、抗ｈＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（AffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Jackson ImmunoResearch社製）によって分析した。このプロトコールの試験では、分泌されたｒＡｂの産生は、各ＤＮＡ濃度の約２倍の範囲にわたって、Ｈ鎖ベクター及びＬ鎖ベクター濃度に非依存的であった（すなわち、この系はＤＮＡ飽和していた）。
【００７０】
ＣＤ３４−ＤＣの生成−ＣＤ３４＋ＨＰＣを動員し、１０Ｕ／ｋｇ／日の組換えＧ−ＣＳＦ（Neupogen（登録商標））を５日間皮下投与された正常な健常ドナーの末梢血を採取した。ＣＤ３４＋−ＨＰＣは、CEPRATE SC幹細胞濃縮システム（ISOLEX）を用いて取得した。ＣＤ３４−ＤＣは、５％自己血清、５０μＭ ２−βメルカプトエタノール、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、並びにサイトカイン、すなわちＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；Immunex Corp.社製）、ＦＬＴ３−Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ；R&D社製）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ；R&D社製）を補充したYssel培地（米国カリフォルニア州所在Irvine Scientific社製）中で０．５×１０６／ｍｌの密度で培養することによって生成した。培養５日目に、サイトカインを補充した新鮮な培地に細胞を移し、９日目に採取した。
【００７１】
ＣＤ３４−ＤＣの選別−培養９日目に、ＣＤ３４由来のＤＣを採取し、抗ＣＤ１ａ ＦＩＴＣ（Biosource International社製）及び抗ＣＤ１４ＰＥ（BD Biosciences社製）で染色した。ＦＡＣＳ Vantage（商標）（BD Biosciences社製）で、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−−ＬＣ及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋−ｉｎｔＤＣを選別した。純度は、常に９５〜９９％であった。
【００７２】
自己ＣＤ８＋Ｔ細胞の精製−自己ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ５６及びＣＤ４ビーズを用いて枯渇させた後に、ＣＤ８磁性ビーズ（Miltenyi社製）を用いて同一ドナーから得られたＰＢＭＣからの正の選択によって得た。一部の実験では、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ８＋ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−として選別した。
【００７３】
ＣＤ３４−ＤＣサブセットによる、ＣＤ８＋Ｔ細胞への、Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質のクロスプレゼンテーション−ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得た未選別又は選別済のＣＤ３４＋ＤＣサブセット、ＣＤ１ａ＋ＬＣ又はＣＤ１４＋ＩｎｔＤＣ（５×１０４細胞／ｍｌ）を、１０％の熱不活性化ヒトＡＢ型プール血清と、１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−７（R&D社製）と、漸減用量の、抗ＤＣ抗体に架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１とを補充したYssel培地中で、精製された自己ＣＤ８＋Ｔ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）と共に培養した。ＣＤ４０Ｌは２４時間後に培養物に添加し、ＩＬ−２は３日後に添加した。クロスプレゼンテーション効率は、特異的なＦｌｕ Ｍ１、ＨＬＡ−Ａ２０１／ｐＭＩ、フィコエリトリン結合ｉＴＡｇ ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter社製）を用いて、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖のレベルを分析することによって、８日後又は１０日後に評価した。
【００７４】
抗ヒトＤＣＩＲモノクローナル抗体の開発−それぞれマウスの免疫化及びｍＡｂのスクリーニングのために、受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）融合タンパク質及びＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、horse radish peroxidase）融合タンパク質を産生した。ｈＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧ用の発現コンストラクトは、以前に記載されており（Bates, E. E., N. Fournier, et al. (1999). "APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif." J Immunol 163(4): 1973-83.）、分泌を指示するために、マウスＳＬＡＭ（ｍＳＬＡＭ）シグナルペプチドを使用する（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, et al. (2004). "Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0." J Mol Biol 340(4): 783-95.）。近位のインフレームXho I部位と、遠位のTGA終止コドン及びNot I部位とを付加しながら、ＡＰ残基１３３〜１５８１（ｇｂ｜ＢＣ００９６４７｜）を増幅するＰＣＲを用いて、ｈＤＣＩＲ外部ドメイン．ＡＰ用の発現ベクターを作製した。上記ｈＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧベクター内のＩｇＧコード配列をこのXho I〜Not I断片で置換した。上記に定義したＤＣＩＲ外部ドメインコード領域の遠位に、ｇｉ｜２０８４９３｜残基１４〜９４０をクローニングすることによって、ＤＣＩＲ．ＨＲＰ融合タンパク質ベクターを作製した。
【００７５】
哺乳動物細胞から分泌された組換えタンパク質の発現及び精製−融合タンパク質は、製造業者によるプロトコール（形質移入１Ｌあたり総プラスミドＤＮＡ１ｍｇ及び293 Fectin試薬１．３ｍｌ）に従って、FreeStyle（商標）293発現システム（Invitrogen社製）を用いて産生した。組換え抗体（ｒＡｂ）を産生するには、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする等量のベクターを同時形質移入した。形質移入細胞を３日間培養し、培養上清を採取し、新たな培地を添加して、２日間インキュベーションを続けた。プールした上清を濾過によって清澄化した。受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧを、０．１ＭグリシンｐＨ２．７による溶離を用いたHiTrapプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その後、ＰＢＳに対して透析した。ｒＡｂは、HiTrap MabSelect（商標）カラムを用いて、同様に精製した。
【００７６】
モノクローナル抗体の産生−マウスｍＡｂは従来の細胞融合技術によって産生した。簡潔には、Ribiアジュバントと共に受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質２０μｇを、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与して免疫処置を行い、その後、１０日後及び１５日後に、２０μｇの抗原で追加免疫を行った。３カ月後、マウスを再度追加免疫し、その３日後に脾臓を摘出した。別法として、３〜４日ごとに３０〜４０日間の期間にわたって、１〜１０μｇの抗原を含有するRibiアジュバントを足蹠でマウスに注射した。最終追加免疫の３〜４日後に、流入領域リンパ節を採取した。従来の技法（Shulman, M., C. D. Wilde, et al. (1978). "A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies." Nature 276(5685): 269-70.）を用いて、脾臓から得たＢ細胞又はリンパ節細胞をSP2/O-Ag14細胞に融合させた。ＥＬＩＳＡを用いて、融合パートナー単独と比較して、又はＡＰに融合した受容体外部ドメイン（Bates, E. E., N. Fournier, et al. (1999). "APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif." J Immunol 163(4): 1973-83.）に対して、受容体外部ドメイン融合タンパク質に対するハイブリドーマ上清をスクリーニングした。その後、完全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドで一時的に形質移入された２９３ Ｆ細胞を用いて、陽性ウェルをＦＡＣＳでスクリーニングした。
【００７７】
抗ＤＣＩＲ ｍＡｂを開発するために、１０００のハイブリドーマクローンから得た上清をスクリーニングした。そのうち、
９０クローンは、ＤＣＩＲ．Ｉｇ対Ｉｇ ＥＬＩＳＡに関して＋であった。
６４クローンは、ＦＡＣＳによるＤＣＩＲ−２９３細胞に関して＋であった。
６２のＦＡＣＳ＋クローンは、ＥＬＩＳＡ＋であった。
２クローンは２９３＋であった（したがって、ＤＣＩＲに特異的でなかった）。
【００７８】
ヒトＤＣによるサイトカイン産生を刺激する抗ＤＣＩＲ ｍＡｂを得るための生物学的スクリーニング−ＤＣターゲッティングの目的には、抗原をＤＣに送達し、同時にＤＣを活性化して、送達された抗原に対する生産的な免疫応答を刺激する抗体を有することが潜在的に望ましい。したがって、本発明者らは、６２クローンのＦＡＣＳ陽性抗ＤＣＩＲハイブリドーマ上清のパネルを、ＤＣ刺激活性に関して直接的にスクリーニングした。ＣＤ３４＋由来のヒトＤＣをハイブリドーマ上清と共に２４時間培養し、２４時間後に、ＤＣ培養上清をケモカインＭＣＰ−１の存在に関してアッセイした。下の図は、すべてではないが、多くのハイブリドーマ上清が、対照と比較して、ＭＣＰ−１の特異的産生を誘発したことを示す。
【００７９】
上の図において星印で標識されている、選択されたハイブリドーマ（すべてではないが、大部分ＭＣＰ−１産生を刺激する）は、クローン化され、CELLineフラスコ（Intergra社製）内で増殖された単一細胞であった。ハイブリドーマ上清を等容積の１．５Ｍグリシン、３Ｍ ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８と混合し、MabSelect樹脂と共に回転させた。樹脂を結合緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２Ｍ Trisで中和させた後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００８０】
純粋な抗ＤＣＩＲ ｍＡｂの特徴付け−純粋なｍＡｂは、最初に、ＥＬＩＳＡ（ＤＣＩＲ．Ｉｇがプレートに結合しており、ＨＲＰ結合抗ヒトＦｃ試薬で発色させた）によって、そしてＤＣＩＲ．ＨＲＰ捕捉アッセイ（ｍＡｂがプレートに結合しており、ＤＣＩＲ．ＨＲＰ融合タンパク質で発色させた）によって試験した。図２は、プレートに結合したＤＣＩＲとｍＡｂの高親和性の相互作用を示す代表的なアッセイ結果を示す（結合の特異性を示す対照は示されていない）。ＤＣＩＲ．ＨＲＰ捕捉アッセイでは、（すべてでないが）いくつかのｍＡｂが、可溶性のＤＣＩＲ．ＨＲＰをプレートの表面に捕捉することができた。これらのデータは、このパネルにおける、選択された抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが様々なＤＣＩＲ結合親和性及び特性を有していたことを示す。
【００８１】
ＦＡＣＳ反応性に関しても、これらの純粋なｍＡｂを試験した。最初に、完全長ＤＣＩＲをコードする発現プラスミドで一時的に形質移入された２９３細胞に対して試験し、その後、様々なタイプの培養ヒトＤＣ及びエキソビボヒトＤＣに対して試験した。下の図は、ＤＣＩＲ２９３細胞に対するＦＡＣＳ分析で力価決定されたｍＡｂの代表的なセットを示す（対照細胞は陰性であった）。
【００８２】
図３は、ＣＤ１４＋サブタイプ及びＣＤ１ａ＋サブタイプ両方のＣＤ３４由来ヒトＤＣが細胞表面ＤＣＩＲを発現することを示している。これらの２つのＤＣサブタイプは、液性免疫応答対、細胞溶解性免疫応答の方向付けにおいて顕著に異なった役割を有し、したがって、両方のサブタイプのＤＣＩＲが存在することは、ＤＣＩＲを介してヒトＤＣにターゲティングされた抗原が両方のタイプの免疫を誘発することを示唆しており、これは、例えばウイルス感染に対するワクチンにおける重要な特徴となる。
【００８３】
図４は、ヒト皮膚から直接単離された３種のヒトＤＣサブタイプでもＤＣＩＲが発現されていることを示している。これらのサブタイプのＤＣはすべてこの受容体を発現するので、この観察は、ＤＣＩＲ抗原をターゲッティングするワクチンには、皮膚内への投与が有利であるはずであることを示している。これらのサブタイプのＤＣは、免疫を方向付けるそれらの特性に関して、上記培養ヒトＤＣに類似していることが知られており、したがって、望ましい複合免疫応答を誘発するには、ＤＣＩＲを有する皮膚ＤＣを介した抗原のターゲティングが有利であるはずである。
【００８４】
真皮のＤＣ及びＬＣは正常ヒト皮膚標本から精製した。細菌性プロテアーゼであるジスパーゼ２型の存在下で標本を４℃で１８時間インキュベートし、その後、３７℃で２時間インキュベートした。その後、表皮シート及び真皮シートを分離し、切断して小片（約１〜１０ｍｍ）にし、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中に入れた。２日後に、培地中に移動した細胞を収集し、１．０７７ｇ／ｄｌのフィコール−ジアトリゾ酸勾配を用いてさらに濃縮した。ＤＣは、抗ＣＤ１ａ ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ１４ ＡＰＣ ｍＡｂで染色した後に、細胞選別によって精製した。
【００８５】
他のヒト組織におけるＤＣＩＲの存在。図５は、ヒト扁桃腺内の胚中心を囲む細胞集団のＤＣＩＲ特異的染色を示す。これらの細胞は、常在ＤＣであるか、又は最近、例えば外来抗原で負荷されて、活性化された後に、この部位に移動してきたＤＣのいずれかである。この染色は、免疫が引き起こされる臓器への接近を可能にする、皮膚以外の経路による、ＤＣＩＲにターゲッティングされたワクチンの投与も、免疫応答を誘発するのに有利であるはずであることを示している。
【００８６】
抗原をヒトＤＣにターゲッティングする抗ＤＣＩＲ ｍＡｂを使用し、製造業者によるプロトコールに従って、６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサン酸スルホスクシンイミジル（ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、sulfosuccinimidyl 6-[3' (2-pyridyldithio)-propionamido] hexanoate；Pierce社製）を用いて、Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質をｍＡｂに化学的に架橋結合した。この多ステッププロトコールは、ＳＰＤＰのＮＨＳエステル基を介して、室温で３０分間、ｍＡｂのアミンを修飾することによってｍＡｂの活性化を行い、その後、ＰＢＳに対して透析を行うものである。その後、Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質を添加して、室温で終夜インキュベートする。Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質は、２つの遊離スルフヒドリル基を含有している。架橋結合反応の効率は、ｍＡｂと反応させる前のＦｌｕ Ｍ１タンパク質の量を、架橋結合後のｍＡｂ／Ｆｌｕ Ｍ１比と比較することによって見積もられた。本発明者らは、平均して５０％のｍＡｂが１分子のＦｌｕ Ｍ１と反応したと計算した。図６及び７は、架橋Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質及びＤＣＩＲに対するｍＡｂの例を示す。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、Ｆｌｕ Ｍ１／Ｈ鎖の染色の比率に基づいて、ｍＡｂ １に対して、１〜２のＦｌｕ Ｍ１を有する産物を同定した。これらの調製をインビトロ研究に用いた。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（下の２番目の図は、非常に大きな複合体の比率が低いことによって証明されるように、複合体が主としてＦｌｕ Ｍ１と単一のｍＡｂとの間のものであったことを示している。
【００８７】
図６は、抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９ ｍＡｂへのＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１の架橋結合を示す。プロテインＧセファロースアフィニティーによって精製された架橋結合産物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。左から右へ、２．５μｇ、１μｇ Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１、１：１、２：１、４：１の比率でＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１をｍＡｂと反応させて得られた産物１０μｇである。
【００８８】
図７は、ｍＡｂへのＨｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１の架橋結合を示す。プロテインＧセファロースアフィニティーによって精製された架橋結合産物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。左から右へと、５μｇ Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１、それに続いて、５μｇ ｍＡｂ（抗ＣＤ１ａ＿ＯＫＴ６、抗ＬＡＮＧ＿２Ｇ３、抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９）と、５μｇ Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１と反応させた５μｇ ｍＡｂとの対である。
【００８９】
Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質に架橋結合された抗ＤＣ受容体ｍＡｂは抗原を効果的にヒトＤＣにターゲッティングする−抗ＤＣ受容体ｍＡｂをＦｌｕ Ｍ１タンパク質に化学的に架橋結合させ、様々な用量を、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞とのヒトＣＤ３４由来ＣＤ１ａ＋ＤＣの共培養物に添加した。２４時間後に、ＤＣ活性化のために、ＣＤ４０Ｌを培養物に添加し、続いて、３日目に、Ｔ細胞増殖のために、ＩＬ−２を添加した。８〜１０日後に、Ｆｌｕ Ｍ１ペプチドであるGILGFVFTL（配列番号５３）に特異的なＴ細胞をＭＨＣ四量体分析によって評価した。図８は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１がＦｌｕ Ｍ１特異的な細胞の増殖を誘発したが、同様な用量の非架橋Ｆｌｕ Ｍ１及びｍＡｂでは、有意に少ないＦｌｕ Ｍ１特異的細胞増殖が観察されたことを示す。用量範囲は、架橋結合されたｍＡｂが、遊離Ｆｌｕ Ｍ１より少なくとも５０倍効果的に反応を誘発したことを示す。このデータは抗原ターゲッティング、すなわち、免疫応答の増強、この場合は特異的なＦｌｕ Ｍ１エピトープの記憶によるＴ細胞の復活を実証している。ＣＤ３４−ＤＣは、ＣＤ１ａ＋ＬＣサブセット又はＣＤ１４＋ＩｎｔＤＣサブセットに選別した。図９は、両方の細胞型でＤＣＩＲ発現が同様なレベルであったのにもかかわらず、抗ＤＣＩＲターゲッティングされたＣＤ１ａ＋ＬＣが、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋細胞の増殖を方向付けるのにはるかに有効であったことを示す。
【００９０】
図８は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１が、ｍＡｂに連結されていないＦｌｕ Ｍ１タンパク質より効率的に、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す。ＣＤ３４由来のＣＤ１ａ＋ＤＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び示されている濃度の、Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１に架橋結合された抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９ ｍＡｂ又は非連結のｍＡｂと共にインキュベートした。その後、Ｆｌｕ Ｍ１特異的な増殖に関してＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。内側の四角は、四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。
【００９１】
図９は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１が、Ｉｎｔ−ＤＣよりＬＣを介して、より効率的にＦｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す。示されている濃度の、Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１に架橋結合した抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９ ｍＡｂと共に、ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得たＬＣ又はＩｎｔ−ＤＣと自己ＣＤ８＋Ｔ細胞とを共培養した。クロスプレゼンテーション効率をＦｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度によって評価し、ＨＬＡ−Ａ２０１／ｐＭＩ四量体を用いて分析した。内側の四角は、四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。
【００９２】
プロトタイプ抗原ターゲッティングワクチンとしての組換え抗ＤＣＩＲ ｍＡｂ（ｒＡｂ）の開発。マウスハイブリドーマでコードされているＨ鎖及びＬ鎖可変（Ｖ）領域と、ヒト免疫グロブリンκ又はヒトＩｇＧ４Ｈ定常（Ｃ）領域とのキメラである分泌性抗ＤＣ受容体ｒＡｂを、一時的に形質移入された哺乳動物細胞で発現するためのベクターを開発した。異なった特異性を有する（すなわち異なった抗ＤＣＩＲハイブリドーマから得た）抗ＤＣ受容体ｍＡｂのＬ鎖及びＨ鎖からのＶ領域を、ｃＤＮＡクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特徴付け、これらのベクター中に工学的に作製した。図１０は、２９３細胞に同時形質移入され、培養上清中へのｒＡｂの分泌に関して抗ヒトＦＣ ＥＬＩＳＡでアッセイされた多くの異なった抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに対応するマウス−ヒトキメラｒＡｂをコードするそのようなＨ＋Ｌ鎖ベクターを示す。
【００９３】
これらの抗ＤＣＩＲ ｒＡｂは、ｒＡｂ Ｈ鎖とインフレームになっている約９．５ｋＤＡのドックリンドメインをコードしていた。これらのドックリンドメイン（ｒＡｂ．Ｄｏｃと呼ばれる）の目的は、特異的な［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．抗原］複合体の構築を可能にすることである。この場合、Ｃｏｈ．抗原は、約１７．５ｋＤａのコヒーシンドメインと抗原との間の融合タンパク質を指す。コヒーシンとドックリンとの間の高親和性相互作用は、受容体特異性を有するＤＣの表面に抗原を送達することが本発明者らによって示されている特定の複合体を組み立てるのに使用される。例えば、下の図は、ヒトＤＣの表面に結合した［抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体を示す（ここでは、Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１がビオチン化されており、洗浄ステップの後に細胞表面で検出される）。対照ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１複合体（下の図では赤で示されている）は、検出用ストレプトアビジンＰＥ試薬単独より多くは結合しなかった。
【００９４】
ＤＣＩＲは、抗原の内部移行の動態が遅く、これによって他のＤＣ受容体から区別される。ＤＣ−ＳＩＧＮなどのＤＣ受容体は、内部移行の動態が迅速であることを特徴としている。例えば、図１１は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃが、アレクシア標識されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１を、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮ培養されたヒトＤＣの中に迅速に内部移行させることを示しており、標識の大部分は、１５分以内に細胞の内部に入っている。対照的に、抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃは、Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１を極めて緩徐に内部移行させ、３時間目には、内部抗原及び細胞表面抗原の両方がかなりの量存在している。この結果は、ＤＣＩＲを、内部移行の遅いＤＣ受容体として識別するものであり、Bates et. alの結論と対照的となっている。Bates et. alは、「架橋結合の後、ＤＣＩＲは、ＭＭＲで観察された迅速な動態（データは示されていない）とは対照的に、単球由来ＤＣ及びＣＤ３４由来ＤＣの中に緩徐かつ微弱に移行したのみであった。この知見は、受容体介在性エンドサイトーシスによる銀捕捉がＤＣＩＲの主要な機能ではないことを示唆している」ことを示唆している。
【００９５】
図１１は、抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂに連結されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１がＧＭ／ＩＬ−１５ヒトＤＣに特異的に結合することを示す。４倍のモル過剰であるビオチン化Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１と予め１時間混合されていた、示されている濃度の抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂと共に、単球由来の、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−１５培養されたヒトＤＣをインキュベートした。１時間後に、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥと共にインキュベートした。もう１回洗浄した後に、細胞をＦＡＣＳによって分析して、細胞に結合したＰＥを検出した。緑色のプロットが抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂであり、赤色の曲線が対照ＩｇＧ４．Ｄｏｃ複合体である。
【００９６】
図１２は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ又は抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡに連結されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１が、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ヒトＤＣに結合し、その中に内部移行することを示す。単球由来の、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４培養されたヒトＤＣを、抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ、又は４倍のモル過剰であるアレクシア標識Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１と予め１時間混合されていた抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ ｒＡｂと共にインキュベートした。氷上に１時間おいた後、細胞を洗浄し、３７℃に移した。共焦点顕微鏡法を用いて、細胞結合抗原（赤色で示されている）の細胞内局在を分析した。緑色は、細胞膜結合アクチンを標識している。
【００９７】
ＤＣＩＲ．Ｄｏｃを介した、ヒトＤＣへのＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１のターゲッティングは、ＤＣＩＲを、ワクチン開発目的のための優れた受容体として同定する。内部移行の遅いＤＣＩＲ受容体を介した、ヒトＤＣへのＦｌｕ Ｍ１抗原のターゲッティングを、内部移行が迅速なＡＳＧＰＲ及びＬＯＸ−１受容体を介したターゲッティングと比較した。モニターされた免疫応答は、Ｆｌｕ Ｍ１特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖であった。結果は、ＤＣＩＲを介したターゲッティングが、ＬＯＸ−１又はＡＳＧＰＲを介したものより有意に効果的であったことを示している。同様な実験では、ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に培養する前に、残留の［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．抗原］がないように洗浄した場合、ＤＣＩＲを介したターゲッティングの優越性が、なお一層明らかであった。この状況は、インビボの状況に、より近いものである可能性が高い。インビボでは、ターゲッティングされたＤＣが、流入領域リンパ節内のＴ細胞に遭遇するために、投与された抗原の残留物から遠ざかるように移動する。
【００９８】
図１３は、抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ複合体は、他の［抗ＤＣ受容体ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体より、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるのが効率的であることを示す。ＣＤ３４由来のＣＤ１ａ＋ＤＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び８ｎＭ（上のパネル）又は０．８ｎＭ（下のパネル）の、それぞれＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１と複合体形成した［抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］、抗ＬＯＸ１＿１５Ｃ４．Ｄｏｃ、抗ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１．Ｄｏｃ又はＩｇＧ４．Ｄｏｃ対照ｒＡｂと共に共培養した。その後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＦｌｕ Ｍ１特異的な増殖に関して分析した。内側の四角は、四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。
【００９９】
図１４は、１日間にわたって投与された抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ複合体が、他の［抗ＤＣ受容体ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体より、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるのに効率的であることを示す。試験条件は、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を添加する１日前にＤＣを洗浄したことを除いて、上の図と同様であった。一部の抗ＤＣＩＲ Ｖ領域は、ｒＡｂ Ｈ鎖のＣ末端に融合された重要な抗原を分泌させるのにとりわけ好ましい。
【０１００】
図１５は、ｒＡｂ Ｈ鎖のＣ末端への融合体として発現される様々な抗原がｒＡｂ．抗原の分泌に内因的な影響を有することを示す。ここでは、複数の同じ抗原コード領域を、２通りの異なったマウスＶ領域特異性を有するキメラｈＩｇＧ４ ｒＡｂ上に工学的に作製した。これらの発現コンストラクトを、適切なＬ鎖マウスＶ領域−ｈＩｇｋコンストラクトと共に、２９３Ｆ細胞に同時形質移入し、３日後に、ｒＡｂの分泌を評価した。一部のｒＡｂ抗原は良好に発現されたが、他のもの（Ｆｌｕ ＨＡ５−１を含める）は極めて貧弱であった。各抗原は、ｒＡｂとの関連で分泌に影響を与える内因的な生化学的特性を有すると予測するべきである。実際、試験された２通りのＶ領域特異性との関連で、発現への著しく類似した影響がある。
【０１０１】
Ｆｌｕ ＨＡ５は、トリインフルエンザに対するワクチンを開発する際に考慮することが重要な抗原である。図１６は、様々な抗ＤＣＩＲ Ｖ領域（様々な抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに由来する）が、望ましい抗ＤＣＩＲ．Ｆｌｕ ＨＡ５ワクチンの分泌に大きな影響を与えるという思いがけない発見を示す。下記の例では、他のＤＣＩＲ Ｖ領域と比較した場合、ＤＣＩＲ＿２５Ａ４が、このタイプのワクチンの分泌にとりわけ好ましい。
【０１０２】
図１６は、抗ＤＣＩＲ．Ｆｌｕ ＨＡ５ ｒＡｂが、可変領域の性質に応じて様々な効率で分泌されることを示す。Ｈ鎖Ｃ末端を介してＤｏｃ（青色円）又はＨＡ５−１（赤色三角）のいずれかに融合した、マウスＶ領域及びヒトＣ領域のキメラをコードするＨ鎖発現プラスミド及びＬ鎖発現プラスミドを、２９３細胞に同時形質移入し、３日後に、ＥＬＩＳＡによって、上清の希釈液にＩｇＧＦｃが存在するかどうかアッセイした。ＤＣＩＲ＿２Ｃ９を除いて、ｒＡｂ．Ｄｏｃは概ね良好に発現された。しかし、ｒＡｂ．ＨＡ５−１の発現にはばらつきが大きかった。
【０１０３】
ｒＡｂ．ＨＡ５−１の分泌を促進するという抗ＤＣＩＲ ２５Ａ４ Ｖ領域の独特な特性が、請求項５の適用を説明する。前者は、特定のＶ領域がｒＡｂ．抗原の分泌に影響を与えうるという本発明者らの発明に基づいている。これは、望ましい結合特異性を有する様々なＶ領域をスクリーニングして、分泌に好ましいものを得ることによって、ｒＡｂ融合タンパク質と関連における、特定の抗原の内因的に貧弱な分泌を克服できることを意味する。どんな分泌性ｒＡｂ．融合タンパク質にもあてはまる新規な一般原理として、これを主張する。
【０１０４】
抗ＤＣＩＲは、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを増強する。図１７は、プライミングを増強するという、樹状細胞への特定の作用を抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが有することを示す。プライミングは、ペプチドを取り込み、それを、表面ＭＨＣ上で、そのペプチド抗原に特異的なＴ細胞に提示することである。この例は、同族のＴ細胞によって通常送達される既知のＤＣ活性化シグナルであるＣＤ４０Ｌと共に、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂでＤＣを刺激することによって、そのＤＣ培養物に添加された免疫優性なＨＩＶ ｇａｇペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の大幅な増加がもたらされることを示している。この特性は、抗ＤＣ受容体ｒＡｂワクチンを介した成功した抗原ターゲッティングでは、高い確度で予測されることであり、抗ＤＣＩＲ．抗原ワクチンが優れていることを示している。
【０１０５】
図１７は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングを増強することを示している。精製された全ＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０６細胞／ウェル）を、自己ＩＦＮ−ＤＣ（１×１０５細胞／ウェル）、並びにＨＬＡ−Ａ２０１拘束性ＨＩＶペプチドであるｐｏｌ（ｐｏｌ４７６〜４８４ ILKEPVHGV（配列番号５４）、ｐｏｌ２９３〜３０２ KYTAFTIPSI（配列番号５５））及びｇａｇ（ｇａｇ７７〜８５、SLYNTVATL（配列番号５６）、ｇａｇ１５１〜１５９、TLNAWVKVV（配列番号５７））（５μＭ）で刺激した。４℃で終夜、ＰＢＳ（ｐＨ９．６）中に希釈された５μｇ／ウェルの抗ＤＣＩＲ ｍＡｂ又は対照モノクローナル抗体でプレコーティングされた２４ウェルプレート内で細胞を９日間培養し、繰り返し洗浄した。細胞は、１０％ヒトＡＢ型血清、１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−７（R&D社製）及び１００ｎｇ／ｍｌ ＣＤ４０Ｌ（R&D社製）を補充したYssel培地中で培養した。３日目にＩＬ−２を１０Ｕ／ｍｌで添加した。ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、インキュベーション期間の終わりに、ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２０１四量体（Beckman Coulter社製）に結合している細胞の数を数えることによって測定した。
【０１０６】
抗ＤＣＩＲ ｍＡｂはクロスプライミングを増強する。図１８は、クロスプライミングを増強するという、樹状細胞への特定の作用を抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが有することを示す。クロスプライミングは、タンパク質を取り込み、それを正しくプロセッシングして、表面ＭＨＣで提示することであり、抗原由来のペプチドに特異的なＴ細胞の増殖によって測定にされる。この例は、同族のＴ細胞によって通常送達される既知なＤＣ活性化シグナルであるＣＤ４０Ｌと共に、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂでＤＣを刺激することによって、ＤＣ培養物に添加されたコヒーシン−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質に由来する免疫優性なＭＡＲＴ−１エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の大幅な増加がもたらされることを示している。この特性は、抗ＤＣ受容体ｒＡｂワクチンを介した抗原ターゲッティングに極めて望ましく、抗ＤＣＩＲ．抗原ワクチンが優れていることを示している。
【０１０７】
図１８は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングを増強することを示す。上図の方法は、ペプチドがｃｏｈ．ＭＡＲＴ−１ペプチド融合タンパク質で置換されていることを除いて、前の図の方法と同じである。
【０１０８】
本明細書で論じたどんな実施形態も、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実施することができ、かつその逆も同様であることが企図されている。さらに、本発明の方法を実現するのに、本発明の組成物を用いることができる。
【０１０９】
図１９は、ヒト上皮シートにおけるＤＣＩＲ分布の免疫組織化学分析を示す。ＤＲ−ＦＩＴＣ染色は緑色で示されており、ＰＡＢ２６９（ＤＣＩＲ）−５６８は赤色で示されている。右上のパネルは、それらの画像を重ね合わせたものを示す。青色の染色は、細胞核のＤＡＰＩ染色である。倍率４０倍のデジタル画像。細胞の形態及びＤＲ染色は、表皮ランゲルハンス細胞に特徴的なものであり、したがって、この分析は、ランゲルハンス細胞におけるＤＣＩＲ発現を明らかにし、例えば、乱切りされた皮膚に適用された抗ＤＣＩＲ．抗原結合体を取り込む効用をＤＣＩＲが有することを指摘するものである。したがって、これらのデータは、アジュバントを介したＤＣ活性化に伴った、ランゲルハンス細胞による抗原の取り込みが、ターゲッティングされた抗原に対する強力な細胞応答をもたらすことを示している。
【０１１０】
図２０Ａ〜２０Ｄは、ＤＣＩＲ抗原に対するモノクローナル抗体を示し、詳細にはＤＣＩＲへの親和性を示す。
【０１１１】
ＤＣＩＲ抗原の固定：一級アミン（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中に５０μｇ・ｍＬ−１）を介して、AKT_ivコバレントセンサー（covalent sensor）の表面にＤＣＩＲ抗原を固定した。ＥＤＣとＮＨＳとの混合物を用いて、カルボン酸表面を活性化し、４チャネルすべてにＤＣＩＲを結合させた。最後に、専用のブロッキング剤を用いて、どんな残留カルボン酸基も不活性化した。
【０１１２】
ＨＢＳ中における４種の抗ＤＣＩＲ抗体の親和性の測定：４種の抗ＤＣＩＲ抗体の親和性を測定するために、１０〜０．３１２５μｇ ｍＬ−１の各抗体の希釈系列を調製し、平行して、固定されたＤＣＩＲ抗原の上に１８０秒間注入した。試料注入の間に、６０秒間２回の１００ｍＭ塩酸の注入を用いて、表面を再生させた。バイオセンサー測定は、Akubio社製アコースティックバイオセンサーで行った。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
表１は、２種の好ましい抗ＤＣＩＲモノクローナル抗体２４Ａ５及び９Ｅ８の高親和性ＤＣＩＲ外部ドメイン結合特性を示し、それらに由来するマウス可変領域は、ヒトＩｇＧ４本体に移植した場合、高親和性の結合特性を大部分保持していることを実証する。このデータは、ヒトＤＣＩＲに結合するという効用に関する、これらの可変領域の配列［及びそれらの「ヒト化」誘導体］に対する明確な主張を支持する。
【０１１５】
アカゲザルＤＣＩＲに対する抗ＤＣＩＲ ｍＡｂの交差反応性。アカゲザル（Rhesus macaque）ＤＣＩＲへの、抗ヒトＤＣＩＲ ｍＡｂの交差反応性を試験するために、哺乳動物発現ベクター内に構成したアカゲザルＤＣＩＲ ｃＤＮＡで２３３Ｆ細胞に形質移入した。形質移入されていない２９３Ｆ細胞及びヒトＤＣＩＲの発現を指示する同一のベクターで形質移入された２９３Ｆ細胞と比較して、そのパネルの抗ヒトＤＣＩＲ抗体がサルＤＣＩＲに結合するかどうか、ＦＡＣＳによって検査した。ヒトＤＣＩＲ配列とサルＤＣＩＲ配列との間の比較を下記に示す。ヒトＤＣＩＲとサルＤＣＩＲとの間の交差反応性を示す抗体は、例えば、組換えヒト化抗ＤＣＩＲ．抗原ワクチンとして構成した場合、治療薬としてのＮＨＰ毒性研究によって、作用機序ベースの問題にも取り組むことができる［すなわち、これらの試験は、毒性と比較した効力に関しても取り組むことができる］ので、とりわけ好ましい。
【０１１６】
ヒトＤＣＩＲ対、サルＤＣＩＲ。最初の配列はヒト配列であり、サルＤＣＩＲで見られた変化はヒト配列の下に示されている。推定上の膜通過領域は下線で強調されている。非保存性の変化は太字で強調されている。
MTSEITYAEVRFKNEFKSSGINTASSAASKERTAPHKSNTGFPKLLCASLLIFFLLLAISFFIAFVIFFQKYSQLLEKKT（配列番号５８）
MTSEITYAEVRQNESKSSGIDSASSAASKKRTAPHKSNTGFSKLLCASLMIFFLLLAISFFFAFFIFFQKYSQLLEKMT（配列番号５９）
TKELVHTTLECVKKNMPVEETAWSCCPKNWKSFSSNCYFISTESASWQDSEKDCARMEAHLLVINTQEEQDFIFQNLQEE（配列番号６０）
TKDLVHTTLECVKKNMTTEETAWSCCPKNWKPFSSNCYFISTESASWQKSEKDCARMEAHLLVINTREEQDFIFQNLQEE（配列番号６１）
SAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPREPSDPNERCVVLNFRKSPKRWGWNDVNCLGPQRSVCEMMKIHL（配列番号６２）
SAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPHEPSDPDERCVVLNFRKTPKRWGWNDVHCIVPQRSVCEMMKIHL（配列番号６３）
【０１１７】
図２１は、アカゲザルＤＣＩＲへの、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂの交差反応性を示す。試料のＦＡＣＳ分析が下に提示されている。緑色のプロットは、対照でＩｇＧ４．ｇａｇ組換えタンパク質によるバックグランド結合を示す。赤色のプロットは、抗ＤＣＩＲ．ｇａｇタンパク質を介した結合である［２次抗体はＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧＦｃであった］。結果は、ヒトＤＣＩＲ発現プラスミドで形質移入された２９３Ｆ細胞には、９Ｅ８ ｍＡｂと２４Ａ５ ｍＡｂとで匹敵した結合を示しており、サルＤＣＩＲ発現プラスミドによって形質移入された２９３のＦ細胞には、９Ｅ８は結合したが、２４Ａ５は結合しなかった。同様な分析で、９Ｅ８、２９Ｇ１０、３１Ａ６、及び３Ｃ２ ｍＡｂはサルＤＣＩＲによく結合したが、２４Ａ５、６Ｃ８、２４Ｅ７、５Ｆ９及び２９Ｅ９ ｍＡｂは結合しなかった。
【０１１８】
図２２は、特定のグリカン構造への、ＤＣＩＲ外部ドメインの結合を示すグラフである。ＤＣＩＲ外部ドメインは、２９３Ｆ細胞から分泌されるｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質として発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。米国糖鎖コンソーシアム（the Consortium for Functional Glycomics）から得たプリントアレイのバージョン３．０を用いて、このタンパク質を特定のグリカンの結合に関して試験した。このアレイは、６通りに複製された３２０種のグリカン（又はグリコフォーム）からなる。
【０１１９】
下記に示すExcelスプレッドシートは、それぞれ、グリカン番号、構造又は名称、６通りの複製の平均ＲＦＵ値、標準偏差、平均値の標準誤差（全データセットを提示している上記グラフのエラーバーに使用した）及び％ＣＶを列Ａ〜Ｆに示している。列Ｃ〜Ｙは、グリカン数対、平均ＲＦＵのグラフを含有し、列Ｚ〜ＡＥは、最高の強度で結合したグリカンのリストを提供するために、ＲＦＵによって並べ替えられた（高い値から低い値）Ａ〜Ｆのデータである。６通りの複製からなる各セットから、最高値及び最低値が除外されているので、これらの平均は、６つの値ではなく、４つの値の平均である。これは、単一の非常に高いポイントを含有した誤ヒットの一部を排除する。したがって、高い％ＣＶを有するポイントは、疑わしいものと考えるべきである。これらの分析は、フィコエリトリンで標識された抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃを使用した検出を用いて行った。２ｍＭ Ｃａ及びＭｇ、１％ＢＳＡ並びに０．０５％Tween 20を含有するTris−食塩水結合緩衝液を用いて、ＤＣＩＲ．ＩｇＦｃをＰＢＳ中に２００μｇ／ｍｌに希釈した。
【０１２０】
このデータは、米国糖鎖コンソーシアムと協力して作成した。ＤＣＩＲ外部ドメインに最も強固に結合したグリカンは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｓｐ１２であった。このグリカンは、いくつかのヒト血漿タンパク質で見出される極めて複雑な糖質であるが、試験した他のｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質は、このグリカンへの選好を示さなかった。
【０１２１】
したがって、グリカン１４３又は関連構造のパネルからスクリーニングされた親和性がより高い誘導体で装飾された抗原は、ＤＣＩＲに対する抗原に磨きをかけるはずであり、ＤＣターゲッティングワクチン又は他のＤＣＩＲターゲッティング作用物質の抗ＤＣＩＲ成分の代用物として働く。これはワクチン製造及び貯蔵における費用便益を有しうるであろう。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
図２３Ａ〜２３Ｃは、ＤＣＩＲがすべての血液ＤＣサブセットの包括的な標的であることを示す。血液中では、ＣＤ１１ｃ＋ｍＤＣ及びＢＤＣＡ２＋ｐＤＣという、ＤＣの２つのサブセットが同定される。ＤＣＩＲは、両方のＤＣサブセットで見出される稀少なレクチン型受容体の１つである。ｍＤＣ及びｐＤＣを血球アフェレーシスから精製し、各ＤＣサブセットを、精製された自己ＣＤ８＋Ｔ細胞並びに漸減濃度のＦｌｕ−ＭＰの４種の組換え型、すなわちＦｌｕ−ＭＰ、ＩｇＧ４に融合したＦｌｕ−ＭＰ及び２種の異なった組換え抗ＤＣＩＲ抗体２４Ａ５及び９Ｅ８に融合したＦｌｕ−ＭＰと共に培養した。
【０１２４】
下記図２３Ａに示す結果は、両方の組換えＤＣＩＲ−Ｆｌｕ−ＭＰ融合タンパク質が、８０ｐＭという低い濃度で、１．７８％〜２．１８％の四量体陽性細胞を誘導できるので、これら２種のタンパク質は、Ｆｌｕ−ＭＰをｍＤＣに強力にターゲッティングできることを示している。この濃度は、Ｆｌｕ−ＭＰ自体及びＩｇＧ４−Ｆｌｕ−ＭＰが抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導できない濃度である。ｐＤＣは、８ｎＭで、４種の形態の組換えＦｌｕ−ＭＰのクロスプレゼンテーションを行うこともできた。０．８ｎＭ及び８０ｐＭでは、２種のＤＣＩＲ−Ｆｌｕ−ＭＰコンストラクトがクロスプレゼンテーションされたが、他の２種のＦｌｕ−ＭＰコンストラクトはクロスプレゼンテーションされなかった（下側の図Ｂ）。
【０１２５】
まとめると、これらのデータは、ＤＣＩＲは、血液ｍＤＣ及びｐＤＣの両方によって、タンパク質をクロスプレゼンテーション用に強力にターゲッティングすることを示す。ヒトでは、ＬＣ及びＩｎｔＤＣが、それぞれ細胞性免疫及び液性免疫を選択的にプライミングする能力を有する。抗原を、ＤＣＩＲのような、汎ＤＣ分子にターゲッティングすることによって、様々なＤＣサブセットをターゲッティングすることによる広範な液性免疫応答及び細胞性免疫応答が潜在的に誘導される。これは、抗ランゲリンなどの、サブセット特異的抗原送達媒体とは対照的である。
【０１２６】
図２３Ａは、ＣＤ４０Ｌで成熟し、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養された、ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得た血液由来のｍＤＣが、各８ｎＭ、０．８ｎＭ又は８０ｐＭのａＤＣＩＲ−Ｆｌｕ−ＭＰ（ａ＃２４Ａ５及びｂ＃９Ｅ８）、ＩｇＧ４−Ｆｌｕ−ＭＰ又はＦｌｕ−ＭＰでターゲッティングされることを示す。１０日後に、特異的なＨＬＡ−Ａ２−Ｍ１四量体染色によってＴ細胞増殖を評価した［垂直軸］。
【０１２７】
図２３Ｂは、ＣＤ４０Ｌで成熟し、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養された、ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得た血液由来のｐＤＣが、各８ｎＭ、０．８ｎＭ又は８０ｐＭのａＤＣＩＲ−Ｆｌｕ−ＭＰ（ａ＃２４Ａ５及びｂ＃９Ｅ８）、ＩｇＧ４−Ｆｌｕ−ＭＰ又はＦｌｕ−ＭＰでターゲッティングされることを示す。１０日後に、特異的なＨＬＡ−Ａ２−Ｍ１四量体染色によってＴ細胞増殖を評価した［垂直軸］。
【０１２８】
図２３Ｃは、ＬＣ及び真皮ＣＤ１４＋ＤＣによるタンパク質のクロスプレゼンテーションを、ＤＣＩＲが可能にすることを示す。ＣＤ４０Ｌで成熟し、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養された、ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得た皮膚由来のＤＣが、各８ｎＭの抗ＤＣＩＲ：Ｆｌｕ−ＭＰ、抗ランゲリン：Ｆｌｕ−ＭＰ又はＩｇＧ４：Ｆｌｕ−ＭＰでターゲッティングされる。１０日後に、特異的なＨＬＡ−Ａ２−Ｍ１四量体染色によってＴ細胞増殖を評価した［垂直軸］。
【０１２９】
図２４は、ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１でのワクチン接種が、ＦｌｕＭ１特異的なリコールＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の産生を可能にすることを示す。亜致死条件で照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ β２ｍ−／−免疫不全マウスにＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋健常ドナーから得た３×１０６ ＣＤ３４＋ＨＰＣを移植した結果を、移植の４〜８週後に、２０×１０６の自己Ｔ細胞を養子移入することによって再構成した。ＤＣを動員するために、５回用量のヒト組換えＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）でマウスを１０日間前処置した。アジュバントとして、５０ｍｃｇ／マウスのポリＩＣと共に、全量３０ｍｃｇのＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１ワクチンを、２通りの時点、すなわち１日目及び７日目に、２つの部位、すなわちｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．に送達した。インフルエンザ特異的免疫応答の誘導は、マトリックスタンパク質１：ＦｌｕＭ１ ５８〜６６（GILGFVFTL）（配列番号６４）ペプチドを負荷した四量体で、血液及び組織を染色することによって評価した。図１に示す通り、ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１でワクチン接種されたマウスの５匹中４匹は、ワクチン接種後の１１日目に、ＦｌｕＭ１四量体に結合する循環ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞が、０．６３％、０．３４％、０．２１％及び０．６２％であることを示した。ＨＩＶｇａｇペプチドが負荷された対照四量体による染色はほぼ陰性であった。これらの予備的な結果は、独立したマウスコホートで確認され、ＦｌｕＭ１四量体に高親和性で結合するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、合計で１２匹中９匹のワクチン接種マウスで観察された。これらの結果は、ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１でのワクチン接種が、ＦｌｕＭ１特異的なリコールＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の産生を可能にすることを実証する。
【０１３０】
本明細書に記載した特定の実施形態は、本発明の制限としてではなく、例として示したものであることが理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに、様々な実施形態で利用することができる。当業者ならば、本明細書に記載した本発明の特定の方法に対する多数の均等物を認識するか、常例的実験を用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲に包含されている。
【０１３１】
本明細書で参照したすべての出版物及び特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルを示すものである。すべての刊行物及び特許出願を、あたかも個々の刊行物又は特許出願を具体的かつ個別的に参照により組み込むと示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込む。
【０１３２】
「１つの（a）」又は「１つの（an）」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は本明細書中で「含む（comprising）」という用語と共に使用される場合、「１つ」であることを意味しうるが、それは、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１又は１超」という意味とも一貫性を有する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、一選択肢のみの選択を指すことが明示的に示されているか、選択肢が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するのに用いられる。但し、本開示は、一選択肢のみの選択並びに「及び／又は」を指すという定義を支持する。本出願全体にわたって、「約」という用語は、ある値に、その値を決定するのに用いられた装置若しくは方法に固有な誤差の変異又は研究対象間に存在する変異が含まれていることを示すのに使用される。
【０１３３】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」など、含む（comprising）のどんな形態も）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」など、有する（having）のどんな形態も）、「含む（including）」（並びに「含む（include）」及び「含む（includes）」など、含む（including）のどんな形態も）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contain）」及び「含有する（contains）」など、含有する（containing）のどんな形態も）という語は、包括的又は非制限的であって、追加の、記載されていない要素又は方法ステップを除外しない。
【０１３４】
「又はこれらの組合せ」という用語は、本明細書で使用される場合、その用語に先行して列挙されている項目のすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はこれらの組合せ」には、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣのうちの少なくとも１つが含まれ、特定の文脈で順序が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含まれると意図されている。この例示を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど、１又は複数の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せも、明示的に含まれる。当業者ならば、通常は、どんな組合せも、文脈から別段のことが明らかでない限り、それに含まれる項目又は用語の数に制限がないことを理解するであろう。
【０１３５】
本明細書で開示及び特許請求されている組成物及び／又は方法はすべて、本明細書の開示に照らして、過度の実験をすることなく作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して記述したが、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱せずに、上記の組成物及び／又は方法、並びに本明細書に記載の方法のステップ又はステップの順序に変異を適用しうることは、当業者には明らかであろう。当業者に明らかなそのようなすべての類似した置換及び改変は、添付されている特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念に包含されるものとする。
【０１３６】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ワクチン接種の分野に関し、より詳細には、抗原提示細胞上に発現されたＤＣＩＲへの抗原のターゲティングに基づくワクチンに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれている、２００７年２月２日出願の米国仮出願第６０／８８８０３２号に基づく優先権を主張する。
【０００３】
米国連邦政府によって資金助成された研究に関する記載
本発明は、ＮＩＨによって授与された契約番号１Ｕ１９ＡＩ０５７２３４−０１００００３下の米国政府助成を用いて行われた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
本発明の範囲を限定せずに、その背景を抗原提示との関連において説明する。
【０００５】
樹状細胞（ＤＣ，dendritic cell）ターゲッティングに基づくヒトワクチンは、マウスモデルでの説得力のある研究を基にする新概念である。この場合、特定のＤＣ受容体に対する抗体によってＤＣにもたらされる少量の比較的弱い抗原が、強力かつ広範な免疫応答を誘発しうる。ヒト用のそのようなワクチンを開発するには、この抗原ターゲティングの適用に正確にどのＤＣ受容体を用いるべきかに関する、より詳細な理解を必要とする。これは、マウスの免疫系とヒトの免疫系との間で、常に正確な対応があるわけではないからであり、また、このワクチン適用に関して、すべての潜在的ＤＣ受容体が慎重に検査されているわけではないからでもある。
【０００６】
したがって、様々な抗ヒトＤＣ受容体標的をインビトロで試験する研究が開始されており、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子及びクラスII分子との関連で、マンノース受容体で活性化されたＴ細胞に対するヒトｍＡｂに融合している黒色腫抗原ｐｍｅｌ１７を用いて、ＤＣターゲッティングが行われた（Ramakrishna, V., J. F. Treml, et al. (2004). "Mannose receptor targeting of tumor antigen pmel17 to human dendritic cells directs anti-melanoma T cell responses via multiple HLA molecules." J Immunol 172(5): 2845-52.）。また、ヒト化抗ＤＣ−ＳＩＧＮ ｍＡｂを介して、モデル抗原であるＫＬＨをＤＣにターゲティングすることによって、抗原特異的なナイーブＴ細胞応答に加えて、用量抑制的なリコールＴ細胞応答も効果的に誘導された（Tacken, P. J., I. J. de Vries, et al. (2005). "Effective induction of naive and recall T-cell responses by targeting antigen to human dendritic cells via a humanized anti-DC-SIGN antibody." Blood 106(4): 1278-85.）。マンノース受容体及びＤＣ−ＳＩＧＮに加えて、ヒトＤＣは、抗原捕捉に関与していることが知られている他の受容体も発現する。これらの多くは、ＬＯＸ−１、ＤＥＣ２０５、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ、ランゲリン、ＤＣＩＲ、ＢＤＣＡ−２、ＤＥＣＴＩＮ−１及びＣＬＥＣ−６を含めたＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ，C-type lectin receptor）である。これらのＣＬＲは、ＤＣの異なったサブセットにより異なって発現され、それらの発現は、ＤＣ成熟の状態に従って相違しうる（Figdor, C. G., Y. van Kooyk, et al. (2002). "C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells." Nat Rev Immunol 2(2): 77-84.、Geijtenbeek, T. B., S. J. van Vliet, et al. (2004). "Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells." Annu Rev Immunol 22: 33-54.）。
【０００７】
ＤＣのサブセットは、異なった免疫応答を刺激する。したがって、異なって発現される受容体を介して、抗原をこれらのサブセットにターゲティングすることによって、異なった免疫応答が誘発されるはずである（Shortman, K. and Y. J. Liu (2002). "Mouse and human dendritic cell subtypes." Nat Rev Immunol 2(3): 151-61.）。さらに、同じＤＣサブセット上の異なった受容体が、抗原を別々のプロセシング経路に方向付ける可能性もある（Trombetta, E. S. and I. Mellman (2005). "Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo." Annu Rev Immunol 23: 975-1028.）。最後に、これらの受容体の一部は内因的に活性化しないものであり（例えば、ＤＥＣ２０５（Bonifaz, L. C., D. P. Bonnyay, et al. (2004). "In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination." J Exp Med 199(6): 815-24.））、一方、他のものは、活性化するものであるか（例えば、ＬＯＸ−１（Delneste, Y., G. Magistrelli, et al. (2002). "Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation." Immunity 17(3): 353-62.））、まだ完全には研究されていないものである。抗原の取り込みと同時に起こるＤＣ活性化の重要性は知られていない。しかし、これが有益であるならば、ターゲッティングｍＡｂを介したＤＣの活性化によって、ターゲッティングワクチンの製剤が単純化される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ramakrishna, V., J. F. Treml, et al. (2004). "Mannose receptor targeting of tumor antigen pmel17 to human dendritic cells directs anti-melanoma T cell responses via multiple HLA molecules." J Immunol 172(5): 2845-52.
【非特許文献２】Tacken, P. J., I. J. de Vries, et al. (2005). "Effective induction of naive and recall T-cell responses by targeting antigen to human dendritic cells via a humanized anti-DC-SIGN antibody." Blood 106(4): 1278-85.
【非特許文献３】Figdor, C. G., Y. van Kooyk, et al. (2002). "C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells." Nat Rev Immunol 2(2): 77-84.
【非特許文献４】Geijtenbeek, T. B., S. J. van Vliet, et al. (2004). "Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells." Annu Rev Immunol 22: 33-54.
【非特許文献５】Shortman, K. and Y. J. Liu (2002). "Mouse and human dendritic cell subtypes." Nat Rev Immunol 2(3): 151-61.
【非特許文献６】Trombetta, E. S. and I. Mellman (2005). "Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo." Annu Rev Immunol 23: 975-1028.
【非特許文献７】Bonifaz, L. C., D. P. Bonnyay, et al. (2004). "In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination." J Exp Med 199(6): 815-24.
【非特許文献８】Delneste, Y., G. Magistrelli, et al. (2002). "Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation." Immunity 17(3): 353-62.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらの考慮を背景として、本発明者らは、望ましい免疫結果を得るために最も適したヒトＤＣターゲッティング受容体を特定するための、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞ナイーブ応答及びリコール応答をインビトロで詳細に探索することによる系統的な比較の緊急な必要性を認識している。本出願は、特定のＤＣ受容体、すなわち、樹状細胞抑制型受容体（ＤＣＩＲ，Dendritic Cell Inhibitory Receptor）が、予防用及び治療用ワクチン接種のために抗原をヒトＤＣにターゲティングする目的に理想的な受容体であることを示す、その特殊かつ予想外な特徴を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、抗原に対する強力かつ広範な免疫応答を誘発する目的で、抗原を抗原提示細胞に特異的にターゲティングする（送達する）ワクチンを作製及び使用するための組成物及び方法を含む。目的は、主として、抗原が由来する作用物質（病原体又は癌）に対する防御的又は治療的免疫応答を誘起することである。
【００１１】
より詳細には、本発明は、制御されたモジュール構造で１又は複数の抗原を保持する、標的特異的な単一の組換え抗体（ｍＡｂ）、活性化タンパク質又は他の抗体を設計及び作製するための組成物、方法及び方法を提供する。本発明のモジュールｒＡｂ担体は、例えば、複数の抗原、並びに／又は抗原及び活性化サイトカインを（内部移行するヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体を介して）樹状細胞（ＤＣ）にターゲティングするのに用いることができる。また、本発明は、制御され、かつ特定されたやり方で、２つの異なった組換えｍＡｂを端と端とで連結する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、抗体−抗原複合体を形成する標的作用物質が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を単離及び精製することによって、ＤＣＩＲ発現抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させる組成物及び方法であって、その作用物質が、抗体−作用物質複合体と接触した、例えば樹状細胞によってプロセシング及び提示される方法を含む。一実施形態では、抗原提示細胞が樹状細胞であり、ＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の一方の半分に結合する。ＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の一方の半分に結合し、かつ抗原がコヘリン／ドックリン対の他方の半分に結合して複合体を形成してもよい。作用物質の非限定的な例には、ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、核酸及びこれらの組合せのうちの１又は複数が含まれる。
【００１３】
作用物質は、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ，transforming growth factor）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ，fibroblast growth factor）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ，platelet derived growth factor）、上皮成長因子（ＥＧＦ，epidermal growth factor）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ，connective tissue activated peptide）、骨形成因子、並びにそのような成長因子の生理活性類似体、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、分裂促進サイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、並びにβトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合性成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来性成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ，insulin-like growth factor））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えばＧＤＦ−１）及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めたトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）遺伝子スーパーファミリーから選択される１又は複数のサイトカインでありうる。別の実施形態では、作用物質は、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性及び癌性のタンパク質である抗原を含む。
【００１４】
本発明は、樹状細胞による抗原提示の有効性を増大させる組成物及び方法であって、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合するＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を結合させるステップを含み、その抗原が、抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によってプロセシング及び提示される組成物及び方法も含む。別の実施形態は、防御的又は治療的免疫応答を誘発する目的で、抗原を抗原提示細胞に送達するための、ＤＣＩＲに対する抗体又は他の特異的結合分子の使用である。皮膚を介したワクチン接種のための、ＤＣＩＲに特異的な抗原標的試薬の使用；同時投与又は連結されたワクチン接種用のアジュバントと併用した、ＤＣＩＲに特異的な抗原標的試薬の使用、又は組換えの抗原−抗体融合タンパク質として発現することができる特異的抗原の、抗原ターゲッティング（ワクチン接種）目的での使用。
【００１５】
別の実施形態は、患者の樹状細胞を単離するステップ；上記樹状細胞を活性化量の抗ＤＣＩＲ抗体又はその断片及び抗原に曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップ；並びに抗原が負荷されて活性化された上記樹状細胞を上記患者に再導入するステップによって、樹状細胞の有効性を増大させる方法を含む。抗原は、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性又は癌性のタンパク質を含みうる。本発明は、哺乳動物細胞から分泌された抗ＤＣＩＲ免疫グロブリン又はその部分、及び免疫グロブリンに結合した抗原も含む。免疫グロブリンは、コヒーシン／ドックリンドメインの半分に結合しており、又はそれは、モジュールｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヒーシン−ドックリン結合対の他方の半分、若しくは抗原との融合タンパク質である、コヒーシン−ドックリン結合対の他方の半分を含んでもよい。抗原特異的なドメインは、完全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片、及び／又はＦｃドメインの部分を伴ったＦａｂ断片でありうる。抗ＤＣＩＲ免疫グロブリンは、放射性同位元素、金属、酵素、ボツリヌス毒素、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、ウェルシュ菌毒素、マイコトキシン、志賀毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン（seguitoxin）、サキシトキシン、アブリン、シアノジノシン、α毒素、テトロドトキシン、アコノトキシン（aconotoxin）、ヘビ毒及びクモ毒から選択される毒素に結合していてもよい。抗原は、免疫グロブリンとの融合タンパク質であるか、又は免疫グロブリンに共有結合若しくは非共有結合によって化学的に結合したものでありうる。
【００１６】
別の実施形態は、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を含むワクチンであって、その抗原が、抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によってプロセシング及び提示されるワクチンである。
【００１７】
本発明の新規抗体は、新規な組織分布情報を示すこともできた。それらの特異的親和性により、本発明の抗ＤＣＩＲ抗体は、サルＤＣＩＲに結合することが見出された。本発明の抗ＤＣＩＲ抗体は、インビボ［ｈｕ−マウス］における、抗ＤＣＩＲ−Ｆｌｕ ｍ１を用いた、増殖中のＦｌｕ ｍ１特異的ＣＤ８細胞へのターゲッティング、及びエキソビボヒト皮膚細胞のインビトロターゲッティングに有効である。さらに、ＤＣＩＲの炭水化物リガンドの複合体は、抗原送達のための抗ＤＣＩＲ薬の代用薬として使用できることが見出された。したがって、本発明の別の実施形態は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｓｐ１２を含有する、グリカンの少なくとも一部に結合した、ＤＣＩＲに特異的に結合する抗原性Ｔ細胞エピトープペプチドである。上記グリカン（及びその誘導体）は、単独又は併用で、ＤＣＩＲ結合を阻止するのに使用できる。
【００１８】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、これより、添付された図と共に、本発明の詳細な説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、対照と比較した場合、すべてではないが、多くのハイブリドーマ上清が、ＭＣＰ−１の特異的な産生を誘発し、すなわち、ｍＡｂ ４Ｃ７、９Ｅ８、１９Ｅ３、１Ｇ３、１０Ａ５、２９Ｇ１０、３Ｃ２、３Ｇ２、２４Ａ５、３０Ｆ３、１２Ｅ２、５Ｆ９、２Ｆ１１、２４Ｅ７、３１Ａ６、６Ａ１１、２ ９Ｅ９、２Ｈ８、３０Ｄ９、６Ｃ８、３５Ｆ１、３Ｆ１２が以降の特徴付けに選択されたことを示す図である。
【図２】プレートに結合したＤＣＩＲとの、ｍＡｂの高親和性相互作用をＥＬＩＳＡによって示す図である。
【図３】ＦＡＣＳで使用するための高親和性抗体の結合を示す図である。
【図４】ヒト皮膚から直接単離された３種のヒトＤＣサブタイプでもＤＣＩＲが発現されていることを示す図である。
【図５】ヒト扁桃腺内の胚中心を囲む細胞集団のＤＣＩＲ特異的染色を示す図である。
【図６】架橋Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質及びＤＣＩＲに対するｍＡｂの例を示す図である。
【図７】抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９ ｍＡｂへのＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１の架橋結合を示す図である。
【図８】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１が、ｍＡｂに架橋結合されていないＦｌｕ Ｍ１タンパク質より効率的に、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す図である。
【図９】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１が、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を、Ｉｎｔ−ＤＣより、ＬＣを介して、より効率的に誘導することを示す図である。
【図１０】２９３細胞内に同時形質移入され、培養上清中へのｒＡｂの分泌に関して抗ヒトＦＣ ＥＬＩＳＡによってアッセイされた多数の異なった抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに対応するマウス−ヒトキメラｒＡｂをコードするＨ＋Ｌ鎖ベクターを示す図である。
【図１１】抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂに連結されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１がＧＭ／ＩＬ−１５ヒトＤＣに特異的に結合することを示す図である。
【図１２】抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ又は抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂに連結されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１がＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ヒトＤＣに結合し、その中に内部移行されることを示す図である。
【図１３】抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ複合体が、他の［抗ＤＣ受容体ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体より、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に効率的であることを示す図である。
【図１４】１日間投与された抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ複合体が、他の［抗ＤＣ受容体ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体より、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に効率的であることを示す図である。
【図１５】ｒＡｂ Ｈ鎖のＣ末端との融合体として発現された様々な抗原が、ｒＡｂ．抗原の分泌に内因的な影響を有することを示す図である。
【図１６】抗ＤＣＩＲ．Ｆｌｕ ＨＡ５ ｒＡｂが可変領域の性質に応じて様々な効率で分泌されることを示す図である。
【図１７】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングを増強することを示す図である。
【図１８】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングを増強することを示す図である。
【図１９】ヒト上皮シート内におけるＤＣＩＲ分布の免疫組織化学分析を示す図である。
【図２０Ａ−２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｄは、ＤＣＩＲ抗原に対するモノクローナル抗体、とりわけＤＣＩＲへの親和性を示す図である。
【図２０Ｃ−２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｄは、ＤＣＩＲ抗原に対するモノクローナル抗体、とりわけＤＣＩＲへの親和性を示す図である。
【図２１】抗ＤＣＩＲ ｍＡｂの、アカゲザルＤＣＩＲに対する交差反応性を示す図である。
【図２２】特定のグリカン構造への、ＤＣＩＲ外部ドメインの結合を示すグラフである。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ＤＣＩＲが、すべての血液ＤＣサブセットのための包括的な標的であることを示す図である。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ＤＣＩＲが、すべての血液ＤＣサブセットのための包括的な標的であることを示す図である。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｃは、ＤＣＩＲが、すべての血液ＤＣサブセットのための包括的な標的であることを示す図である。
【図２４】ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１でのワクチン接種によって、ＦｌｕＭ１特異的なリコールＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の産生が可能となることを実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用について以下に詳細に論じるが、本発明は、様々な特定の概念に具体化できる多数の適用可能な発明概念を提供することを理解されたい。本明細書で論じる特定の実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するに過ぎず、本発明の範囲の境界を定めるものではない。
【００２１】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関連する領域の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」や「その（the）」などの用語は、単数の存在物のみを指すのではなく、それには、その特定の例を例示目的に用いることのできる一般クラスが含まれる。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を記載するのに使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲で大要を記載しているのを除いて、本発明の境界を定めるものではない。
【００２２】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的免疫を調節するのに重要な役割を果たしている抗原提示細胞である（Mellman, I. and R. M. Steinman (2001). "Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines." Cell 106(3): 255-8.、Banchereau, J., F. Briere, et al. (2000). “Immunobiology of dendritic cells.” Annu Rev Immunol 18: 767-811.、Cella, M., F. Sallusto, et al. (1997). "Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells." Curr Opin Immunol 9(1): 10-6.）。ＤＣは、抗原を捕捉して、それらをペプチドにプロセシングして、これらをＴ細胞に提示する。したがって、抗原をＤＣに直接送達することは、ワクチンを改善するための重点領域である。そのような例の１つは、後で患者に再投与される自己ＤＣへのエキソビボ抗原負荷を用いたＤＣベースのワクチンの開発である（Banchereau, J., B. Schuler-Thurner, et al. (2001). "Dendritic cells as vectors for therapy." Cell 106(3): 271-4.、Steinman, R. M. and M. Dhodapkar (2001). "Active immunization against cancer with dendritic cells: the near future." Int J Cancer 94(4): 459-73.）。ワクチンの効力を改善するための別の戦略は、内部移行するＤＣ特異的な受容体に対する抗体に結合した抗原をＤＣに特異的にターゲッティングすることである。ワクチン接種のためにＤＣをターゲッティングすることの可能性は、主要なマウス研究によって注目を浴びた。オボアルブミン（ＯＶＡ）に結合した抗ＬＯＸ−１ ｍＡｂを用いたインビボでのターゲッティングは、ＭＨＣクラスＩ経路に向けた外因性抗原のクロスプレゼンテーションを介して、防御的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘発した（Delneste, Y., G. Magistrelli, et al. (2002). "Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation." Immunity 17(3): 353-62.）。また、ＣＤ４０Ｌ成熟刺激と併用すると、抗ＤＥＣ２０５ ｍＡｂに結合したＯＶＡも、インビボで、ＤＣによるＭＨＣクラスＩ拘束性の提示を増強し、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の持続的な形成をもたらす（Bonifaz, L. C., D. P. Bonnyay, et al. (2004). "In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination." J Exp Med 199(6): 815-24.）。これらの研究は両方とも劇的な用量の節約（すなわち非常に少ない抗原量で強い免疫応答）を示し、他のタイプのＯＶＡ免疫処置で通常見られるより広範な応答を示唆した。ＤＥＣ２０５を介したＤＣへのＨＩＶ ｇａｇ抗原のターゲッティングを用いた最近の研究は、これらの概念を臨床的に重要な抗原にまで拡張し、ＤＣへの抗原のターゲティングの基本特性、すなわち、劇的な用量の節約、単一ワクチン接種に由来する防御応答、並びにＣＤ８及びＣＤ４コンパートメントの両方における抗原特異的なＴ細胞の増殖を確認した（Trumpfheller, C., J. S. Finke, et al. (2006). "Intensified and protective CD4+ T cell immunity in mice with anti-dendritic cell HIV gag fusion antibody vaccine." J Exp Med 203(3): 607-17.）。
【００２３】
本発明は、制御された多変量様式における、単一の組換え一次ｍＡｂへの、（一次ｍＡｂから独立して工学的に作製、発現及び精製された）複数の抗原又はタンパク質の複合体形成を提供する。現在、１つの一次ｍＡｂに（それぞれストレプトアビジンに別々に連結するように工学的に作製された）様々なタンパク質の付加を可能にする部位特異的ビオチン化部位を工学的に作製する方法が存在する。しかし、本発明は、所定のモル比及び位置における、複数の組合せの一次ｍＡｂへの、別々に工学的に作製されたタンパク質の付加を提供する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「モジュールｒＡｂ担体」という用語は、単一の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）への、様々な抗原、活性化タンパク質又は他の抗体の、制御されたモジュール付加をもたらすように工学的に作製された組換え抗体系を示すのに使用される。このｒＡｂは、標準的なハイブリドーマ技法、組換え抗体ディスプレイ及びヒト化モノクローナル抗体などを用いて作製されたモノクローナル抗体でありうる。モジュールｒＡｂ担体は、例えば、複数の抗原、並びに／又は抗原及び活性化サイトカインを（内部移行する受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの組換え一次抗体を介して）、樹状細胞（ＤＣ）にターゲティングするのに使用できる。モジュールｒＡｂ担体は、制御された特定の方法で、２つの異なった組換えｍＡｂを端と端とで連結するのに使用できる。
【００２５】
「モジュールｒＡｂ担体」の抗原結合部分は、認識されるモジュール結合部分が、そのアミノ酸配列に付加及び／又は結合される、１又は複数の可変ドメイン、１又は複数の可変ドメイン及び最初の定常ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びに、Ｆａｂｃ断片、及び／又はＦｃドメインの部分を伴ったＦａｂ断片でありうる。モジュールｒＡｂ担体で使用するための抗体は、いずれのアイソタイプ又はクラスのものでも、サブクラスでも、又はどんな供給源（動物性及び／又は組換え）由来の抗体でもよい。
【００２６】
非限定的な一例において、モジュールｒＡｂ担体は、工学的に作製された組換えｍＡｂとの関連で、特異的かつ特定のタンパク質複合体を作製するための１又は複数のモジュールコヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインを有するように工学的に作製される。ｍＡｂは、ｍＡｂの抗原結合ドメインのカルボキシ側に、１又は複数のモジュールコヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインを含有する融合タンパク質の一部分である。コヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインは、例えば化学架橋結合物質及び／又はジスルフィド結合形成を用いることによって、翻訳後に付加されたものでも可能である。
【００２７】
「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、その抗原の受容者体内で液性及び／又は細胞性免疫応答を開始できる分子を指す。抗原は、本発明では、２つの異なった場面で、すなわち抗体又はｒＡｂの他の抗原認識ドメインの標的として、又はモジュールｒＡｂ担体に相補的なドックリン／コヒーシン分子の一部として細胞若しくは細胞内にもたらされるか、ｒＡｂによってターゲッティングされる分子として使用されうる。抗原は、通常、ワクチン接種が有利な治療法となる疾患を引き起こす病原体である。抗原がＭＨＣに提示される場合、そのペプチドは、しばしば約８アミノ酸から約２５アミノ酸である。抗原には、例えば、単純な中間代謝物質、糖、脂質及びホルモン、並びに複合糖質、リン脂質、核酸及びタンパク質などの高分子を含めたどんなタイプの生物学的分子も含まれる。抗原の一般的な範疇には、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌抗原、原子動物及び他の寄生虫の抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー及び移植拒絶に関与している抗原並びに他の種々雑多な抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
モジュールｒＡｂ担体は、任意の数の活性物質、例えば、抗生物質、抗感染症薬、抗ウイルス剤、抗腫瘍薬、解熱薬、鎮痛剤、抗炎症薬、骨粗鬆症の治療薬、酵素、サイトカイン、抗凝血物質、多糖、コラーゲン、細胞及び上記の活性物質の２種以上の組合せを保持できる。本発明を用いて送達する抗生物質の例には、テトラサイクリン、アミノグルコシド、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬物、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、アマンタジン、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アンティノマイシンＤ、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン及びイミダゾールカルボキシアミドなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明を用いて送達する抗腫瘍薬の例には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール及びメトトレキセートが含まれるが、これらに限定されない。解熱薬及び鎮痛剤の例には、アスピリン、Motrin（登録商標）、Ibuprofen（登録商標）、ナプロキセン及びアセトアミノフェンなどが含まれる。
【００３０】
本発明を用いて送達する抗炎症薬の例には、ＮＳＡＩＤＳ、アスピリン、ステロイド、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニソロン及びジクロフェナクナトリウムなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明を用いて送達する骨粗鬆症治療薬並びに骨及び骨格に作用する他の因子の例には、カルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、副甲状腺ホルモン及びその活性断片、ヒストンＨ４関連骨形成増殖ペプチド（histone H4-related bone formation and proliferation peptide ）、並びにこれらの変異体、誘導体及び類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明を用いて送達する酵素及び酵素補因子の例には、Pancrease（登録商標）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、パンクレアチン、コラゲナーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノゲン、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、アデニルシクラーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明を用いて送達するサイトカインの例には、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、骨形成因子、並びにそのような成長因子の生理活性類似体、断片及び誘導体が含まれるが、これらに限定されない。サイトカインは、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、マイトジェニックサイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など；レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、又はこれらの任意の断片若しくは組合せでありうる。他のサイトカインには、βトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合性成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めたトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）スーパーファミリーのメンバーが含まれる。
【００３４】
本発明を用いて送達する成長因子の例には、哺乳動物細胞からなど、天然又は自然の供給源から単離することのできる成長因子も、組換えＤＮＡ技法によって、又は様々な化学的方法によって、合成によって調製することのできる成長因子も含まれるが、これらに限定されない。加えて、これらの因子の類似体、断片又は誘導体も、それらが天然分子の生物活性の少なくとも一部を示すという条件で、用いることができる。例えば、類似体は、部位特異的変異導入又は他の遺伝子工学的手法によって改変された遺伝子を発現することによって調製することができる。
【００３５】
本発明を用いて送達する抗凝血物質の例には、ワルファリン、ヘパリン及びヒルジンなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明を用いて送達する、免疫系に作用する因子の例には、走化性ペプチド及びブラジキニンなど、炎症及び悪性新生物を制御する因子、並びに伝染性微生物を攻撃する因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
ウイルス抗原の例には、例えば、レトロウイルス（retroviral）抗原、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素及び他のＨＩＶ成分などのヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ，human immunodeficiency virus）抗原に由来するレトロウイルス抗原など；肝炎ウイルス（hepatitis viral）抗原、すなわち、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus）のＳ、Ｍ及びＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス並びに他の肝炎、例えば、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎のプレＳ抗原、Ｃ型肝炎のウイルスＲＮＡなどのウイルス成分など；インフルエンザウイルス（influenza viral）抗原、すなわち、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ及び他のインフルエンザウイルス成分など；麻疹ウイルス（measles viral）抗原、すなわち、麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルス成分など；風疹（rubella）ウイルス抗原、すなわち、タンパク質Ｅ１及びＥ２並びに他の風疹ウイルス成分など；ロタウイルス（rotaviral）抗原、すなわち、ＶＰ７ｓｃ及び他のロタウイルス成分など；サイトメガロウイルス（cytomegaloviral）抗原、すなわち、エンベロープ糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原成分など；呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial viral）抗原、すなわち、ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分など；単純ヘルペスウイルス（herpes simplex viral）抗原、すなわち、前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ及び他の単純ヘルペスウイルス抗原成分など；水痘帯状疱疹ウイルス（varicella zoster viral）抗原、すなわち、ｇｐＩ、ｇｐII及び他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原成分など；日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis viral）抗原、タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分など；並びに狂犬病ウイルス抗原（rabies viral）、すなわち、狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質及び他の狂犬病ウイルス抗原成分などが含まれるが、これらに限定されない。ウイルス抗原の追加の例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。
【００３７】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ抗原ワクチンを用いて送達できる抗原性の標的には、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウイルスには、ピコルナウイルス（picornavirus）、コロナウイルス（coronavirus）、トガウイルス（togavirus）、フラビウイルス（flavirvirus）、ラブドウイルス（rhabdovirus）、パラミクソウイルス（paramyxovirus）、オルソミクソウイルス（orthomyxovirus）、ブニアウイルス（bunyavirus）、アレナウイルス（arenavirus）、レオウイルス（reovirus）、レトロウイルス（retrovirus）、パピローマウイルス（papilomavirus）、パルボウイルス（parvovirus）、ヘルペスウイルス（herpesvirus）、ポックスウイルス（poxvirus）、ヘパドナウイルス（hepadnavirus）及び海綿状ウイルス（spongiform virus）が含まれる。他のウイルス性の標的には、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス１及び２、麻疹、デング熱（dengue）、痘瘡（smallpox）、小児マヒ（polio）又はＨＩＶが含まれる。病原体には、トリパノソーマ（trypanosome）、条虫（tapeworm）、回虫（roundworm）、蠕虫（helminthes）及びマラリア原虫（malaria）が含まれる。この方法で、胎児性抗原又は前立腺特異抗原などの癌マーカーをターゲティングできる。他の例には、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種を目的とした、本発明によるベクターの投与は、強い免疫応答が望まれる導入遺伝子の長期的発現を可能にするために、ベクター随伴抗原が十分に非免疫原性であることが必要となる。場合によっては、個体のワクチン接種を、年に１回又は２年に１回など、まれに行うのみでよく、かつ感染性病原体に対して長期の免疫学的防御を提供しうる。本発明と共に、ベクターで、そして最終的には抗原として使用するための生物、アレルゲン、核酸配列及びアミノ酸配列の特定の例は、参照により関連部分が本明細書に組み込まれている、米国特許第６５４１０１１号明細書、とりわけ、本発明と共に用いることができる生物と特定の配列とを照らし合わせる表に見出すことができる。
【００３８】
本明細書で開示するｒＡｂワクチンと共に使用するための細菌抗原には、例えば、百日咳（pertussis）細菌抗原、すなわち、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、ペルタクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ及び他の百日咳細菌抗原成分など；ジフテリア（diptheria）細菌抗原、すなわち、ジフテリア毒素又はトキソイド、及び他のジフテリア細菌抗原成分など；破傷風（tetanus）細菌抗原、破傷風毒素又はトキソイド、及び他の破傷風細菌抗原成分など；レンサ球菌（streptococcal）細菌抗原、すなわち、Ｍタンパク質及び他のレンサ球菌細菌性抗原成分など；グラム陰性桿菌（gram-negative bacilli）細菌抗原、すなわち、リポ多糖及び他のグラム陰性細菌抗原成分など；結核菌（Mycobacterium tuberculosis）細菌抗原、すなわち、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ及び他のミコバクテリア（mycobacterial）抗原成分など；ピロリ菌（Helicobacter pylori）細菌抗原成分；肺炎球菌（pneumococcal）細菌抗原、すなわち、ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖及び他の肺炎球菌細菌抗原成分など；インフルエンザ菌（haemophilus influenza）細菌抗原、すなわち、莢膜多糖及び他のインフルエンザ菌細菌抗原成分など；炭疸（anthrax）細菌抗原、すなわち、炭疸菌防御抗原及び他の炭疸細菌抗原成分など；並びにリケッチア（rickettsiae）細菌抗原、すなわち、ｒｏｍｐＡ及び他のリケッチア細菌抗原成分などが含まれるが、これらに限定されない。他のどんな細菌抗原、ミコバクテリア抗原、マイコプラズマ抗原、リッケチア抗原又はクラミジア抗原も、本明細書に記載の細菌抗原に含まれる。インフルエンザ菌、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、髄膜炎菌（neisseria meningitidis）、肺炎レンサ球菌（streptococcus pneumoniae）、淋菌（neisseria gonorrhoeae）、サルモネラ血清型チフス菌（salmonella serotype typhi）、赤痢菌（shigella）、コレラ菌（vibrio cholerae）、デング熱、脳炎（Encephalitides）、日本脳炎、ライム病（lyme disease）、ペスト菌（Yersinia pestis）、ウエストナイルウイルス（west nile virus）、黄熱（yellow fever）、野兎病（tularemia）、肝炎（ウイルス性、細菌性）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス、respiratory syncytial virus）、ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３、アデノウイルス（adenovirus）、天然痘（small pox）、アレルギー並びに癌も、部分的又は全体的な病原体となりうる。
【００３９】
本発明の組成物及び方法と共に使用するための真菌抗原には、例えば、カンジダ菌（candida）真菌抗原成分；ヒストプラスマ（histoplasma）真菌抗原、すなわち、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）及び他のヒストプラスマ真菌抗原成分など；クリプトコッカス（cryptococcal）真菌抗原、すなわち、莢膜多糖及び他のクリプトコッカス真菌抗原成分など；コクシジオイデス（coccidiodes）真菌抗原、すなわち、球状体抗原及び他のコクシジオイデス菌抗原成分など；並びに白癬（tinea）真菌抗原、すなわち、白癬菌ワクチン及び他の白癬真菌抗原成分などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
原生動物抗原及び他の寄生虫抗原の例には、例えば、熱帯熱マラリア原虫抗原、すなわち、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液段階抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ及び他のマラリア原虫抗原成分など；トキソプラズマ（toxoplasma）抗原、すなわち、ＳＡＧ−１、ｐ３０及び他のトキソプラズマ抗原成分など；住血吸虫（schistosomae）抗原、すなわち、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシン及び他の住血吸虫抗原成分など；森林型熱帯リーシュマニア（leishmania major）及び他のリーシュマニア抗原、すなわち、ｇｐ６３、リポホスホグリカン及びその関連タンパク質、並びに他のリーシュマニア抗原成分など；並びにクルーズトリパノソーマ（trypanosoma cruzi）抗原、すなわち、７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原及び他のトリパノソーマ抗原成分などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のｒＡｂを用いてターゲティングすることができる抗原は、通常、内部移行の可能性、免疫細胞特異性のレベル、標的免疫細胞、免疫細胞の成熟及び／又は活性化のレベルなどを含めた多くの因子に基づいて選択される。限定されるものではないが、樹状細胞の細胞表面マーカーの例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ及び／又はＡＳＰＧＲなどが含まれ、場合によっては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７の不在も有する。抗原提示細胞の細胞表面マーカーの例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１並びに／又はＦｃγ受容体が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
送達用の、細胞表面にある標的抗原には、典型的には腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核及び細胞小器官などに由来する腫瘍抗原に特徴的なものが含まれる。本発明の抗体部分への腫瘍標的の例には、血液癌、すなわち、白血病及びリンパ腫など、神経腫瘍、すなわち、星状細胞腫又はグリア芽腫など、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頚部癌、消化管腫瘍、すなわち、胃癌又は大腸癌など、肝臓癌、膵臓癌、泌尿生殖器腫瘍、すなわち、頚部癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌又は陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽頭、咽頭部及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆管、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び神経系の他の部分並びに甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫並びに白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明を用いた抗原提示のために、単独で、又は組合せて、免疫細胞に送達できる抗原の例には、腫瘍タンパク質、例えば、変異導入された発癌遺伝子、腫瘍関連のウイルスタンパク質並びに腫瘍ムチン及び糖脂質が含まれる。腫瘍関連のウイルスタンパク質でありうる抗原は、上述のウイルスのクラスに由来するものとなる。特定の抗原は、腫瘍に特徴的なものでありえ（サブセットの１つは、通常は腫瘍前駆細胞によって発現されないタンパク質である）、又は、通常は腫瘍前駆細胞で発現されるが、腫瘍の変異特性を有するタンパク質でありうる。他の抗原には、活性又は細胞内分布が改変されている正常タンパク質の変異変種、例えば、腫瘍抗原を生み出す遺伝子変異が含まれる。
【００４４】
腫瘍抗原の非限定的な特定の例には、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ，prostate specific antigen）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１〜４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン、Mucin）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（黒色腫偏在性変異遺伝子産物、melanoma ubiquitous mutated gene product）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン−バーウイルス核抗原、Epstein-Barr Virus nuclear antigen）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ，human papilloma virus）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ，lung resistance protein）、Ｂｃｌ−２並びにＫｉ−６７が含まれる。加えて、上記免疫原性分子は、自己免疫疾患の開始及び／又は伝搬に関与する自己抗原でありえ、この自己免疫疾患の病態は、例えばＳＬＥ又はＭＧのように、大部分、関連する標的器管、組織又は細胞によって発現された分子に特異的な抗体の活性に起因する。そのような疾患では、関連した自己抗原に対する、進行中の抗体媒介性（すなわち、Ｔｈ２型）免疫応答を、細胞性（すなわち、Ｔｈ１型）の免疫応答へと誘導することが望ましい場合がある。別法では、関連する自己免疫疾患を有してはいないが、罹患しやすいことが疑われている対象体内の自己抗原に対するＴｈ２応答の開始を、適切な自己抗原に対するＴｈ１応答を予防的に誘導することによって、防止するか、又はそのレベルを低減することが望ましい場合がある。所望の自己抗原には、（ａ）ＳＬＥに関しては、Ｓｍｉｔｈ抗原、ＲＮＰ（リボ核タンパク質、ribonucleoprotein）、ＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質が含まれ、（ｂ）ＭＧに関しては、アセチルコリン受容体が含まれるが、これらに限定されない。１又は複数のタイプの自己免疫応答に関与するその他の種々な抗原の例には、例えば、内因性ホルモン、すなわち、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチン及び他のホルモンなどが含まれる。
【００４５】
自己免疫疾患、アレルギー及び移植拒絶に関与する抗原を、本発明の組成物及び方法で用いることができる。例えば、以下の自己免疫疾患又は障害、すなわち、糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎が含まれる）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎が含まれる）、乾癬、シェーグレン症候群によって続発する乾性角結膜炎を含めたシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー反応、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病境界反応、結節性紅斑癩、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎及び間質性肺線維症のうちのいずれか１又は複数に関与する抗原を、本発明で用いることができる。自己免疫疾患に関与する抗原の例には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５，glutamic acid decarboxylase 65）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、チログロブリン及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ，thyroid stimulating hormone）受容体が含まれる。アレルギーに関与する抗原の例には、花粉抗原、すなわち、スギ花粉抗原、ブタ草花粉抗原及びライ麦花粉抗原など、動物由来の抗原、すなわち、塵ダニ抗原及びネコ抗原など、組織適合性抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬が含まれる。移植拒絶に関与する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓及び神経移植片成分など、移植受容動物体内に移植される移植片の抗原成分が含まれる。抗原は、自己免疫疾患を治療するのに有用な改変ペプチドリガンドでもよい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、病原体ＤＮＡ又はＲＮＡによってコードされている多くの病原体ポリペプチドのいずれかの中に位置するエピトープに類似した一次構造、二次構造又は三次構造を含有するペプチド又はタンパク質抗原を指す。類似性のレベルは、通常、そのようなポリペプチドに対するモノクローナル又はポリクロナール抗体が、そのペプチド抗原又はタンパク質抗原にも結合若しくは反応するか、又はそれ以外の方法でそれも認識する程度となる。そのような抗体と併用して、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡなど、様々な免疫検定法が利用でき、それらの方法はすべて当業者には公知である。ワクチンでの使用に適した病原体エピトープ及び／又はそれらの機能的等価物の同定は、本発明の一部である。単離及び同定された後、容易に機能的等価物を得ることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４５５４１０１号明細書に教示されているHoppの方法を利用することができる。米国特許第４５５４１０１号明細書は、親水性に基づいた、アミノ酸配列からのエピトープの同定及び調製を教示する。他のいくつかの文書にも記載されている方法、及びそれらに基づいたソフトウェアプログラムも、エピトープコア配列を同定するのに使用できる（例えば、Jameson and Wolf, 1988、Wolf et al., 1988、米国特許第４５５４１０１号明細書を参照）。これらの「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、その後、ペプチド合成又は組換え技法のいずれかの適用を介して、容易にペプチドに組み入れることができる。
【００４７】
活性成分として、本発明の抗原をコードする核酸を含有しているワクチン組成物の調製物は、液体溶液又は懸濁液として、注射剤として調製することができ、また、感染の前に液体に入れて溶液又は懸濁液にするのに適した固体形態も調製することができる。この調製物は、乳化されて、リポソーム内に封入されたものでよい。活性免疫原性成分は、しばしば担体と混合され、この担体は、薬学的に許容され、活性成分との適合性を有するものである。
【００４８】
「薬学的に許容される担体」という用語は、それが投与される対象の体内でアレルギー反応又は他の有害反応を引き起こさない担体を指す。適した、薬学的に許容される担体には、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せのうちの１又は複数が含まれる。加えて、望ましい場合には、ワクチンは、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を増強するアジュバントなど、微量の佐剤を含有しうる。有効でありうるアジュバントの例には、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ，N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ及びＲＩＢＩが含まれるが、これらに限定されない。ＲＩＢＩは、細菌から抽出された３つの成分、すなわち、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Tween 80エマルジョン中に含有している。アジュバントの他の例には、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、dimethyl dioctadecyl ammonium bromide）、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント、並びにQuilAが含まれる。加えて、リンフォカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質も、本明細書に記載のアジュバントと併用できる。
【００４９】
本発明に記載の医薬製品は、血清リポタンパク質表面に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する単コピー又は多コピーの特定ヌクレオチド配列を有する裸のポリヌクレオチドを含有しうる。このポリヌクレオチドは、生理活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードするものでよく、生理的に許容される投与可能な形態で用意されるであろう。本発明から生じうる別の医薬製品は、本明細書に記載の方法によって患者血液又は他の取得源から単離された高度に精製された血漿リポタンパク質画分と、血清リポタンパク質表面に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する単コピー又は多コピーの特定ヌクレオチド配列を含有する、上記精製リポタンパク質画分に予め結合された生理的に許容される投与可能形態のポリヌクレオチドとを含有しうる。
【００５０】
さらに別の医薬製品は、生理的に許容される投与可能形態の、単コピー又は多コピーの特定ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドに予め結合された、単コピー又は多コピーの特異的ＤＮＡ結合モチーフを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する高度に精製された血漿リポタンパク質画分を含有しうる。さらに別の医薬製品は、生理的に許容される投与可能形態の、単コピー又は多コピーの特定ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドに予め結合された、単コピー又は多コピーの特異的ＤＮＡ結合モチーフを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する高度に精製された血漿リポタンパク質画分を含有しうる。
【００５１】
投与するべき用量は、治療される対象の体重及び身体状態、並びに治療の投与経路及び頻度に大きく依存している。高度に精製されたリポタンパク質画分に予め結合された裸のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ及びタンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲にある量で投与できる。
【００５２】
ｒＡｂ及びｒＡｂ複合体の投与では、患者は、もしあればベクターの毒性を考慮に入れて、化学療法剤を投与するための一般的プロトコールに従う。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予測される。記載の遺伝子療法と組合せて、様々な標準的治療及び外科的介入を適用できることも企図されている。
【００５３】
遺伝子療法の臨床適用が企図されている場合、複合体を、意図されている適用に適した医薬組成物として調製することが必要となる。通常これは、発熱因子、及びヒト又は動物に有害でありうるどんな他の不純物も本質的に含まない医薬組成物を調製することが必要となる。通常、複合体に安定性を与え、かつ標的細胞による複合体の摂取を可能にするために、適切な塩及び緩衝剤を用いることも望まれる。
【００５４】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水溶媒中に溶解又は分散された、有効量の化合物を含有しうる。そのような組成物は、接種材料と呼ぶこともできる。医薬活性物質用のそのような媒体及び作用物質の使用は、当技術分野でよく知られている。どんな従来の媒体又は作用物質も、それが活性成分と不適合でない限り、治療組成物中でのその使用が企図されている。栄養補助活性成分も組成物に組み込むことができる。本発明の組成物は、古典的な製剤も含有しうる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中、並びに油中にデイスパージョンを調製することもできる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。
【００５５】
疾患状態。最大（又は場合によっては最小）の免疫応答を得るための部位への抗原の送達を最大にするために、治療するべき特定の疾患に応じて、本発明による治療組成物の投与は、その経路を介して標的組織に到達可能である限り、任意の一般的な経路を介したものとなる。投与は、通常、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射となる。送達するための他の領域には、経口、鼻腔、頬側、直腸、腟又は局所が含まれる。局所投与は、皮膚癌の治療にとりわけ有利となる。そのような組成物は、通常、生理的に許容される担体、緩衝剤又は他の賦形剤を含有する薬学的に許容される組成物として投与される。
【００５６】
本発明のワクチン又は治療組成物は、注射によって、非経口的に、例えば皮下又は筋肉内に投与できる。投与の他の方法に適した別の製剤には、坐剤が含まれ、場合によっては、経口製剤又はエアゾールとして供与するのに適した製剤が含まれる。経口製剤の場合、アジュバントを利用したＴ細胞サブセットの操作、抗原パッケージング、又は様々な製剤への個々のサイトカインの添加によって、最適化された免疫応答を伴った、経口ワクチンの改善がもたらされる。坐剤用には、伝統的な結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含有しうる。そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含有する混合物から生成することができる。経口製剤は、通常使用される賦形剤、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース及び炭酸マグネシウムなどを含有する。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤又は粉末薬の形態を取って、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有しうる。
【００５７】
本発明の抗原をコードする核酸は、中性形態又は塩形態で、ワクチン又は治療組成物中に処方することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（そのペプチドの遊離アミノ基で形成される）が含まれ、それらは、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸など、又は有機酸、すなわち酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマレイン酸などで形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩も、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は鉄（III）など、並びに有機塩基、すなわちイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン及びプロカインなどから得ることができる。
【００５８】
ワクチン又は治療組成物は、投与剤形と適合した方法並びに予防上及び／又は治療上有効となる量で投与する。投与するべき量は、治療される対象に依存し、これには、例えば、対象の免疫系が抗体を合成する能力、及び望ましい防御又は治療の程度が含まれる。適した用量範囲は、約１ｍｇ〜３００ｍｇの範囲及び好ましくは約１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲など、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲のワクチン接種１回あたり、活性成分数百マイクログラムの桁のものである。初期投与及び追加免疫注射に適した投与計画も可変的であるが、典型的には、初期投与の後に後続の接種を行うもの、又は他の投与を行うものである。投与するのに必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断により、対象それぞれに特有でありうる。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の最小投薬単位、核酸分子又は融合ポリペプチドが他の治療薬と併用投与されるかどうか、受容者の免疫状態及び健康、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療活性によって決まることは、当業者には明らかであろう。
【００５９】
組成物は、単回投与スケジュールで投与することも、反復投与スケジュールで投与することもできる。反復投与スケジュールは、ワクチン接種の初期コースが、例えば１〜１０回の別々の投与を含みうる投与スケジュールであって、その後、その免疫応答を維持及び／又は補強するのに必要な後続の時間間隔で、例えば次の投与まで１〜４カ月で、他の投与が行われ、そして、必要ならば、それに続く投与が数カ月後に行われる投与スケジュールである。防御免疫の望ましいレベルを維持するためには、１〜５年、通常３年間隔の周期的な追加免疫が望ましい。免疫処置コースの後に、ＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共培養された末梢血液リンパ球（ＰＢＬ、peripheral blood lymphocyte）のインビトロ増殖アッセイ、及び初プライミングされたリンパ球から放出されたＩＦＮ−γのレベルの測定を行うことができる。これらのアッセイは、放射性ヌクレオチド、酵素及び蛍光標識など、従来の標識を用いて実施できる。これらの技法は当業者に知られており、参照により関連の部分が本明細書に組み込まれている米国特許第３７９１９３２号、第４１７４３８４号及び第３９４９０６４号明細書に見出すことができる。
【００６０】
モジュールｒＡｂ担体及び／又は結合ｒＡｂ担体−（コヒーシン／ドックリン及び／又はドックリン−コヒーシン）−抗原複合体（ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチン）は、核酸ベクターが使用されるかどうか、又は最終精製タンパク質若しくは最終ワクチン形態が使用されるかどうかに応じて、１又は複数の「最小投薬単位」で与えることができる。最小投薬単位は、その投与、すなわち適切な経路及び治療実施計画に伴って望ましい応答を産生すると計算された所定の量の治療組成物を含有するものとして定義されている。投与するべき量、並びに特定の経路及び剤形は、臨床分野の当業者の技術に包含される。治療するべき対象、とりわけ対象の免疫系の状態及び望ましい防御についても評価することができる。最小投薬単位は、単回の注射で投与する必要はなく、それには、一定の時間にわたる持続注入も含まれうる。本発明の最小投薬単位は、ＤＮＡ／ｋｇ（又はタンパク質／ｋｇ）体重によって、好都合に表記されうるものであり、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１０００ｍｇ又は１０００ｍｇ超ＤＮＡ又はタンパク質／ｋｇ体重の間の範囲が投与される。同様に、送達されるｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの量は約０．２〜約８．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で変動しうる。したがって、特定の実施形態では、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ及び７．５ｍｇのワクチンをインビボで個体に送達できる。投与するべきｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの用量は、治療される対象の体重及び身体状態、並びに投与経路及び治療の頻度に大きく依存している。リポソーム送達ベクター又はウイルス性送達ベクターに予め結合された裸のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、１μｇ〜１ｍｇポリヌクレオチド又は１μｇ〜１００ｍｇタンパク質の範囲の量で投与できる。したがって、特定の組成物は、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ又は１００ｍｇのベクターに独立に結合した、約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１０００μｇの間のポリヌクレオチド又はタンパク質を含みうる。
【００６１】
Ｆｌｕ抗原をターゲティングされた樹状細胞による、ヒトＦｌｕ特異的Ｔ細胞の免疫刺激を測定するインビトロ細胞系で本発明を試験した。ここに示す結果は、単独ではこの系で効力がない抗原用量における、そのような抗原特異的細胞の特異的な増殖を実証する。
【００６２】
本発明は、モジュールｒＡｂ担体、すなわち、例えば、ヒマ毒、炭疽菌（Anthrax）毒素、及びスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ由来の防御抗原と複合体形成した組換えヒト化ｍＡｂ（特異的なヒト樹状細胞受容体に対するもの）を作製するのにも使用できる。この存在の潜在的市場は、すべての軍関係者のワクチン接種、及びこれらの物質に関連したどんな生体脅威（biothreat）にも反応して大規模人口密集地に投与するための予備に保存されるワクチンである。本発明は、ヒト使用及び動物使用の両方のためのワクチン一般の設計に広範な適用を有する。所望の産業には、製薬産業及びバイオテクノロジー産業が含まれる。
【００６３】
一般的方法−制限酵素及びＤＮＡ修飾酵素はＮＥＢ社から入手した。プラスミド及びＤＮＡ断片の精製には、Qiagen社製の製品を用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Simply Blue（Invitrogen社製）で染色された４〜１２％のBis-Trisゲルで行った。クロマトグラフィー用のカラム及び樹脂は、GE Healthcare社から入手した。プラスミドコンストラクトは、ＤＮＡ配列決定（MCLAB社）によって確認した。ＤＮＡプライマーは、Operon社又はMidland Certified Reagent Company社から入手した。配列分析は、Sequencher（Gene Codes社製）で行った。ProtParamツール（２００５年）によって予測された計算上の吸光係数に基づいたタンパク質濃度は、ＵＶ吸収（NanoDrop社製ND-1000）によって測定した。配列は、参照により本明細書に組み込まれている配列表の配列番号１〜３９に示す。それらは、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂ重鎖（配列番号１〜１７）及び軽鎖のシグナルペプチド及び可変領域配列（配列番号１８〜３９）のアラインメントである。予測されるＮ末端シグナルペプチド領域、変種間又は近縁配列間における配列の相違は、Sequencherを用いて決定した。
【００６４】
コヒーシン−屈曲部−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−６×Ｈｉｓタンパク質のコヒーシンドメインへのＣ末端伸長部の配列。免疫優性ペプチド配列ペプチドには下線が引かれており、このペプチドの境界にある太字の残基は、抗原の天然配列である。Ｃ末端のHisタグは、Ni＋＋アフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にする。Ｃ１８６ コヒーシン−屈曲部−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−６×Ｈｉｓ：
ASDTTEARHPPVTTPTTDRRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRPLEHHHHHH（配列番号４０）。
【００６５】
抗原発現コンストラクト−ＰＣＲを用いて、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)のＭ１タンパク質のＯＲＦを増幅し、その間に、開始コドンの遠位に位置するNhe I部位と、終止コドンの遠位に位置するNot I部位とを組み込んだ。消化断片をpET-28b(+)（Novagen社製）にクローニングし、Ｍ１ ＯＲＦをＨｉｓ６タグとインフレームになるように挿入して、それによって、Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質をコードするようにした。Ｎ末端のプロテインＧ前駆体Ｂ２ドメイン残基２９８〜３５２（ｇｉ｜１２４２６７｜）をNco I部位の遠位にコードし、その後に、GGSGGSGGSLD（配列番号４１）をコードするリンカー残基を有する類似のベクターにＦｌｕ Ｍ１ ＯＲＦを挿入した。このベクターは、Ｑ２４６Ｅ変化を有するＰｒｏＧ．Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質を発現した。Nco I部位とNhe I部位との間に挿入された、クロストリジウム・サーモセラム（C. thermocellum）由来のＮ末端１６９残基コヒーシンドメインをコードするpET28b(+)誘導体は、Ｃｏｈ．Ｈｉｓを発現した。Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１．Ｈｉｓの発現には、上記誘導体のNhe I部位とXho I部位との間にＦｌｕ Ｍ１ ＯＲＦを挿入した。Ｃｏｈ．ＰＥＰ．Ｈｉｓ発現コンストラクトも、必要な配列をコードする合成ＤＮＡをそれらが利用していることを除いて、同様に作製した。タンパク質は、カナマイシン耐性（４０μｇ／ｍｌ）の選択を用い、２００回転／分で振盪しながら３７℃で対数増殖期中期まで培養した大腸菌（E.coli）株BL21(DE3)（Novagen社製）又はT7 Express（ＮＥＢ社製）で、１２０ｍｇ／ＬのＩＰＴＧを添加して発現させた。３時間後に、遠心法によって細胞を採取し、−８０℃で保存した。開始コドンの代わりにSal I部位を組み込み、ベクターのXho I部位に挿入するために、遠位のXho I部位を付加することによって、上述のＡＰ融合体分泌ベクター内の外部ドメインセグメントを、ＰｒｏＧセグメント及びコヒーシンセグメントで置換した。「空」のＡＰベクターは、外部ドメインセグメントを除去することによって作製した。これらのコンストラクトは、それぞれ、ＰｒｏＧ．ＡＰ、Ｃｏｈ．ＡＰ及びＡＰの分泌を指示した。
【００６６】
組換えタンパク質の発現及び精製−プロテアーゼ阻害剤カクテルII（Calbiochem社製）０．１ｍｌを含有する、氷冷の０．１Ｍ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．４（緩衝液Ａ、ＰｒｏＧ．Ｆｌｕ Ｍ１用）又は５０ｍＭ Tris、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ、他のすべてのタンパク質用）３０ｍｌに、各１Ｌの発酵物から得られた大腸菌細胞を再懸濁した。これらの細胞を、５分間の休止時間を挟んだ２×５分間、設定１８で（Fisher社製Sonic Dismembrator 60）、氷上で超音波処理し、その後、１７０００ｒ．ｐ．ｍ．（Sorvall社製SA-600）、４℃で２０分間、遠心処理を行った。ＰｒｏＧ．Ｆｌｕ Ｍ１を得るために、緩衝液Ａで平衡化したＱセファロース５ｍｌ中に上清を通し、その後、ＱのフロースルーにｈＩｇＧビーズ５ｍｌを添加し、混合しながら４℃で１時間インキュベートした。ビーズに結合したタンパク質を、冷ＰＢＳ ５０ｍｌで洗浄し、０．１ＭグリシンｐＨ２．７ ２×１０ｍｌで溶出した。プールした溶出液を、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ５．０緩衝液を用いてｐＨ５にし、５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０（緩衝液Ｃ）で平衡化した１ｍｌ HiTrap Sカラム内を流した。カラムに結合したタンパク質を緩衝液Ｃで繰り返し洗浄し、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を有する緩衝液Ｃで溶出した。ピーク画分をプールした。Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１を精製するために、Ｑセファロースビーズ５ｍｌの中に、細胞溶解液上清画分５０ｍｌを通し、１６０ｍＭ Tris、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９ ６．２５ｍｌをＱセファロースのフロースルーに添加した。これを、Ｎｉ＋＋充填した５ｍｌ HiTrapキレート化ＨＰカラムに４ｍｌ／分で添加した。カラムに結合したタンパク質を２０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６（緩衝液Ｄ）で洗浄し、その後、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０でもう１回洗浄した。結合したタンパク質を１００ｍＭ〜１ＭのＨ３ＣＯＯＮａ勾配ｐＨ４．０で溶出した。ピーク画分をプールし、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０で平衡化した５ｍｌ HiTrap Sカラムに４ｍｌ／分で添加し、平衡化緩衝液で洗浄し、その後、５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．５でもう１回洗浄した。結合したタンパク質を、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を有する５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．５で溶出した。約５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出したピーク画分をプールした。Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１の調製物は、変動的な量の非完全長産物、おそらくＣ末端部分を欠失した産物を含有していた。Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１．Ｈｉｓを精製するために、２Ｌの培養物から得られた細胞を、上述の通り、但し緩衝液Ｂ中で超音波処理した。遠心処理の後、上清にTriton X114 ２．５ｍｌを添加し、氷上で５分間インキュベートした。２５℃でさらに５分間インキュベートした後、２５℃で遠心処理して、上清をTriton X114から分離した。この抽出を繰り返し、Ｑセファロースビーズ５ｍｌの中に上清を通し、１６０ｍＭ Tris、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９ ６．２５ｍｌをＱセファロースのフロースルーに添加した。その後、Ｎｉ＋＋キレート化クロマトグラフィーによって上述の通りタンパク質を精製し、０〜５００ｍＭイミダゾールを有する緩衝液Ｄで溶出した。
【００６７】
マウス／ヒトキメラｍＡｂのｃＤＮＡクローニング及び発現−全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から調製し（RNeasyキット、Qiagen社製）、供給された５’プライマー及び遺伝子特異的な３’プライマー、すなわち、
ｍＩｇＧκ、５’ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc３’；（配列番号４２）
ｍＩｇＧλ、５’ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc３’；（配列番号４３）
ｍＩｇＧ１、５’gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc３’；（配列番号４４）
ｍＩｇＧ２ａ、５’ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt３’；（配列番号４５）
及びｍＩｇＧ２ｂ、５’ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt３’（配列番号４６）
を用いたｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ（SMART RACEキット、BD Biosciences社製）に用いた。ＰＣＲ産物をクローニングし（pCR2.1 TAキット、Invitrogen社製）、ＤＮＡ配列決定によって特徴付けした。得られた、マウスＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域ｃＤＮＡの配列を用い、特異的プライマーを使用して、シグナルペプチド及びＶ領域をＰＣＲ増幅し、その間、下流のヒトＩｇＧκ領域又はＩｇＧ４Ｈ領域をコードする発現ベクター内にクローニング用の隣接制限部位を組み込んだ。Xho I部位及びNot I部位によって挟まれた残基４０１〜７３１（ｇｉ｜６３１０１９３７｜）を増幅し、これをpIRES2-DsRed2（BD Biosciences社製）のXho I〜Not Iの間に挿入することによって、キメラｍｖκ−ｈＩｇκを発現するためのベクターを構築した。ＰＣＲを用いて、Nhe I部位又はSpe I部位、その後CACCを追加した開始コドンから、Xho I部位を追加したコード領域（例えばｇｉ｜７６７７９２９４｜の残基１２６）までｍＡｂ Ｖｋ領域を増幅した。その後、このＰＣＲ断片を上記ベクターのNhe I〜Not Iの間にクローニングした。κｍＳＬＡＭリーダーを用いたキメラｍｖκ−ｈＩｇ用のベクターは、５’ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag３’（配列番号４７）という配列を、上記ベクターのNhe I〜Xho I間に挿入することによって構築した。ＰＣＲを用いて、予測されていた成熟型のＮ末端コドン（SignalP 3.0 Serverサーバを用いて定義された）（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, et al. (2004). "Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0." J Mol Biol 340(4): 783-95.）と、ｍＶκ領域の終端（上記の定義の通り）との間を、５’tcgtacgga３’を追加しながら増幅した。Bsi WI及びXho Iで消化した断片を、上記ベクターの対応する部位に挿入した。対照ｈＩｇκ配列は、ｇｉ｜４９２５７８８７｜の残基２６〜８５及びｇｉ｜２１６６９４０２｜の残基６７〜７０９に対応している。対照ｈＩｇＧ４Ｈベクターは、Ｓ２２９Ｐ及びＬ２３６Ｅ置換を有する、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の残基１２〜１４７３がpIRES2-DsRed2ベクターのBgl II部位〜Not I部位間に挿入され、終止コドンの代わりに配列５’gctagctgattaattaa３’が追加されたものに対応する。これらの置換は、ジスルフィド結合を安定させ、残留ＦｃＲ結合を消失させる（Reddy, M. P., C. A. Kinney, et al. (2000). "Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4." J Immunol 164(4): 1925-33.）。ＰＣＲを用いて、CACCと、その後Bgl II部位とを追加した開始コドンから、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の残基４７３をコードする領域まで、ｍＡｂ ＶＨ領域を増幅した。その後、このＰＣＲ断片を上記ベクターのBgl II〜Apa I間にクローニングした。ｍＳＬＡＭリーダーを用いたキメラｍＶＨ−ｈＩｇＧ４配列用のベクターは、５’ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc３’（配列番号４８）という配列を、上記ベクターのBgl II〜Apa I間に挿入することによって構築した。ＰＣＲを用いて、予測されていた成熟型Ｎ末端コドンとｍＶκ領域の終端との間を、５’tcgtacgga３’を追加して増幅した。Bsi WI及びApa Iで消化された断片を上記ベクターの対応する部位に挿入した。
【００６８】
近位のNhe I部位と、終止コドンに続く遠位のNot I部位とによって挟まれた様々な抗原コード配列を、Ｈ鎖ベクターのNhe I〜Pac I〜Not Ｉ間に挿入した。Ｆｌｕ ＨＡ１−１は、近位の５’gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa３’（配列番号４９）配列（Nhe I部位と、それに続くｃｉｐＡコヒーシン−コヒーシンリンカー残基とコードする配列）と、遠位の５’caccatcaccatcaccattgagcggccgc３’（配列番号５０）配列（Ｈｉｓ６、終止コドン及びNot I部位をコードしている）とを伴った、インフルエンザＡ型ウイルス（A/Puerto Rico/8/34(H1N1)）の赤血球凝集素ｇｉ｜２１６９３１６８｜残基８２〜１０２５（Ｃ９８２Ｔ変化を有する）によってコードされていた。Ｆｌｕ ＨＡ５−１は、Ｆｌｕ ＨＡ１−１と同じ配列が結合した、ｇｉ｜５０２９６０５２｜インフルエンザＡウイルス（A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)）赤血球凝集素残基４９〜９９０によってコードされていた。Ｄｏｃは、近位のNhe I及び遠位のNot I部位を伴ったｇｉ｜４０６７１｜ｃｅｌＤ残基１９２３〜２１５０によってコードされていた。ＰＳＡは、５’gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaacaccgacaacaacacttctagcgc３’（配列番号５１）（Nhe I部位及びｃｉｐＡスペーサー）という近位配列と、遠位のNot I部位とを伴った、ｇｉ｜３４７８４８１２｜前立腺特異抗原残基１０１〜８３２によってコードされていた。Ｆｌｕ Ｍ１−ＰＥＰは、５’gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcgaacgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccgc３’（配列番号５２）によってコードされていた。これも、他のすべてのペプチドをコードする配列も、Nhe I及びNot I制限Ｈ鎖ベクター又はNhe I - Xho I制限Ｃｏｈ．Ｈｉｓベクターへのクローニングに適合した末端を有する相補的な合成ＤＮＡ断片の混合物を介して生成された。制限部位を組み込む必要がある場合、又はＣｉｐＡスペーサー配列中を除いて、好ましいヒトコドンを常に使用した。
【００６９】
ｒＡｂ発現コンストラクトの産生レベルは、それぞれ約２．５μｇのＬ鎖コンストラクト及びＨ鎖コンストラクトと、上述のプロトコールとを用いた５ｍｌ一時的形質移入で試験した。上清は、抗ｈＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（AffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Jackson ImmunoResearch社製）によって分析した。このプロトコールの試験では、分泌されたｒＡｂの産生は、各ＤＮＡ濃度の約２倍の範囲にわたって、Ｈ鎖ベクター及びＬ鎖ベクター濃度に非依存的であった（すなわち、この系はＤＮＡ飽和していた）。
【００７０】
ＣＤ３４−ＤＣの生成−ＣＤ３４＋ＨＰＣを動員し、１０Ｕ／ｋｇ／日の組換えＧ−ＣＳＦ（Neupogen（登録商標））を５日間皮下投与された正常な健常ドナーの末梢血を採取した。ＣＤ３４＋−ＨＰＣは、CEPRATE SC幹細胞濃縮システム（ISOLEX）を用いて取得した。ＣＤ３４−ＤＣは、５％自己血清、５０μＭ ２−βメルカプトエタノール、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、並びにサイトカイン、すなわちＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；Immunex Corp.社製）、ＦＬＴ３−Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ；R&D社製）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ；R&D社製）を補充したYssel培地（米国カリフォルニア州所在Irvine Scientific社製）中で０．５×１０６／ｍｌの密度で培養することによって生成した。培養５日目に、サイトカインを補充した新鮮な培地に細胞を移し、９日目に採取した。
【００７１】
ＣＤ３４−ＤＣの選別−培養９日目に、ＣＤ３４由来のＤＣを採取し、抗ＣＤ１ａ ＦＩＴＣ（Biosource International社製）及び抗ＣＤ１４ＰＥ（BD Biosciences社製）で染色した。ＦＡＣＳ Vantage（商標）（BD Biosciences社製）で、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−−ＬＣ及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋−ｉｎｔＤＣを選別した。純度は、常に９５〜９９％であった。
【００７２】
自己ＣＤ８＋Ｔ細胞の精製−自己ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ５６及びＣＤ４ビーズを用いて枯渇させた後に、ＣＤ８磁性ビーズ（Miltenyi社製）を用いて同一ドナーから得られたＰＢＭＣからの正の選択によって得た。一部の実験では、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ８＋ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−として選別した。
【００７３】
ＣＤ３４−ＤＣサブセットによる、ＣＤ８＋Ｔ細胞への、Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質のクロスプレゼンテーション−ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得た未選別又は選別済のＣＤ３４＋ＤＣサブセット、ＣＤ１ａ＋ＬＣ又はＣＤ１４＋ＩｎｔＤＣ（５×１０４細胞／ｍｌ）を、１０％の熱不活性化ヒトＡＢ型プール血清と、１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−７（R&D社製）と、漸減用量の、抗ＤＣ抗体に架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１とを補充したYssel培地中で、精製された自己ＣＤ８＋Ｔ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）と共に培養した。ＣＤ４０Ｌは２４時間後に培養物に添加し、ＩＬ−２は３日後に添加した。クロスプレゼンテーション効率は、特異的なＦｌｕ Ｍ１、ＨＬＡ−Ａ２０１／ｐＭＩ、フィコエリトリン結合ｉＴＡｇ ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter社製）を用いて、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖のレベルを分析することによって、８日後又は１０日後に評価した。
【００７４】
抗ヒトＤＣＩＲモノクローナル抗体の開発−それぞれマウスの免疫化及びｍＡｂのスクリーニングのために、受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）融合タンパク質及びＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、horse radish peroxidase）融合タンパク質を産生した。ｈＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧ用の発現コンストラクトは、以前に記載されており（Bates, E. E., N. Fournier, et al. (1999). "APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif." J Immunol 163(4): 1973-83.）、分泌を指示するために、マウスＳＬＡＭ（ｍＳＬＡＭ）シグナルペプチドを使用する（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, et al. (2004). "Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0." J Mol Biol 340(4): 783-95.）。近位のインフレームXho I部位と、遠位のTGA終止コドン及びNot I部位とを付加しながら、ＡＰ残基１３３〜１５８１（ｇｂ｜ＢＣ００９６４７｜）を増幅するＰＣＲを用いて、ｈＤＣＩＲ外部ドメイン．ＡＰ用の発現ベクターを作製した。上記ｈＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧベクター内のＩｇＧコード配列をこのXho I〜Not I断片で置換した。上記に定義したＤＣＩＲ外部ドメインコード領域の遠位に、ｇｉ｜２０８４９３｜残基１４〜９４０をクローニングすることによって、ＤＣＩＲ．ＨＲＰ融合タンパク質ベクターを作製した。
【００７５】
哺乳動物細胞から分泌された組換えタンパク質の発現及び精製−融合タンパク質は、製造業者によるプロトコール（形質移入１Ｌあたり総プラスミドＤＮＡ１ｍｇ及び293 Fectin試薬１．３ｍｌ）に従って、FreeStyle（商標）293発現システム（Invitrogen社製）を用いて産生した。組換え抗体（ｒＡｂ）を産生するには、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする等量のベクターを同時形質移入した。形質移入細胞を３日間培養し、培養上清を採取し、新たな培地を添加して、２日間インキュベーションを続けた。プールした上清を濾過によって清澄化した。受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧを、０．１ＭグリシンｐＨ２．７による溶離を用いたHiTrapプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その後、ＰＢＳに対して透析した。ｒＡｂは、HiTrap MabSelect（商標）カラムを用いて、同様に精製した。
【００７６】
モノクローナル抗体の産生−マウスｍＡｂは従来の細胞融合技術によって産生した。簡潔には、Ribiアジュバントと共に受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質２０μｇを、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与して免疫処置を行い、その後、１０日後及び１５日後に、２０μｇの抗原で追加免疫を行った。３カ月後、マウスを再度追加免疫し、その３日後に脾臓を摘出した。別法として、３〜４日ごとに３０〜４０日間の期間にわたって、１〜１０μｇの抗原を含有するRibiアジュバントを足蹠でマウスに注射した。最終追加免疫の３〜４日後に、流入領域リンパ節を採取した。従来の技法（Shulman, M., C. D. Wilde, et al. (1978). "A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies." Nature 276(5685): 269-70.）を用いて、脾臓から得たＢ細胞又はリンパ節細胞をSP2/O-Ag14細胞に融合させた。ＥＬＩＳＡを用いて、融合パートナー単独と比較して、又はＡＰに融合した受容体外部ドメイン（Bates, E. E., N. Fournier, et al. (1999). "APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif." J Immunol 163(4): 1973-83.）に対して、受容体外部ドメイン融合タンパク質に対するハイブリドーマ上清をスクリーニングした。その後、完全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドで一時的に形質移入された２９３ Ｆ細胞を用いて、陽性ウェルをＦＡＣＳでスクリーニングした。
【００７７】
抗ＤＣＩＲ ｍＡｂを開発するために、１０００のハイブリドーマクローンから得た上清をスクリーニングした。そのうち、
９０クローンは、ＤＣＩＲ．Ｉｇ対Ｉｇ ＥＬＩＳＡに関して＋であった。
６４クローンは、ＦＡＣＳによるＤＣＩＲ−２９３細胞に関して＋であった。
６２のＦＡＣＳ＋クローンは、ＥＬＩＳＡ＋であった。
２クローンは２９３＋であった（したがって、ＤＣＩＲに特異的でなかった）。
【００７８】
ヒトＤＣによるサイトカイン産生を刺激する抗ＤＣＩＲ ｍＡｂを得るための生物学的スクリーニング−ＤＣターゲッティングの目的には、抗原をＤＣに送達し、同時にＤＣを活性化して、送達された抗原に対する生産的な免疫応答を刺激する抗体を有することが潜在的に望ましい。したがって、本発明者らは、６２クローンのＦＡＣＳ陽性抗ＤＣＩＲハイブリドーマ上清のパネルを、ＤＣ刺激活性に関して直接的にスクリーニングした。ＣＤ３４＋由来のヒトＤＣをハイブリドーマ上清と共に２４時間培養し、２４時間後に、ＤＣ培養上清をケモカインＭＣＰ−１の存在に関してアッセイした。下の図は、すべてではないが、多くのハイブリドーマ上清が、対照と比較して、ＭＣＰ−１の特異的産生を誘発したことを示す。
【００７９】
上の図において星印で標識されている、選択されたハイブリドーマ（すべてではないが、大部分ＭＣＰ−１産生を刺激する）は、クローン化され、CELLineフラスコ（Intergra社製）内で増殖された単一細胞であった。ハイブリドーマ上清を等容積の１．５Ｍグリシン、３Ｍ ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８と混合し、MabSelect樹脂と共に回転させた。樹脂を結合緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２Ｍ Trisで中和させた後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００８０】
純粋な抗ＤＣＩＲ ｍＡｂの特徴付け−純粋なｍＡｂは、最初に、ＥＬＩＳＡ（ＤＣＩＲ．Ｉｇがプレートに結合しており、ＨＲＰ結合抗ヒトＦｃ試薬で発色させた）によって、そしてＤＣＩＲ．ＨＲＰ捕捉アッセイ（ｍＡｂがプレートに結合しており、ＤＣＩＲ．ＨＲＰ融合タンパク質で発色させた）によって試験した。図２は、プレートに結合したＤＣＩＲとｍＡｂの高親和性の相互作用を示す代表的なアッセイ結果を示す（結合の特異性を示す対照は示されていない）。ＤＣＩＲ．ＨＲＰ捕捉アッセイでは、（すべてでないが）いくつかのｍＡｂが、可溶性のＤＣＩＲ．ＨＲＰをプレートの表面に捕捉することができた。これらのデータは、このパネルにおける、選択された抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが様々なＤＣＩＲ結合親和性及び特性を有していたことを示す。
【００８１】
ＦＡＣＳ反応性に関しても、これらの純粋なｍＡｂを試験した。最初に、完全長ＤＣＩＲをコードする発現プラスミドで一時的に形質移入された２９３細胞に対して試験し、その後、様々なタイプの培養ヒトＤＣ及びエキソビボヒトＤＣに対して試験した。下の図は、ＤＣＩＲ２９３細胞に対するＦＡＣＳ分析で力価決定されたｍＡｂの代表的なセットを示す（対照細胞は陰性であった）。
【００８２】
図３は、ＣＤ１４＋サブタイプ及びＣＤ１ａ＋サブタイプ両方のＣＤ３４由来ヒトＤＣが細胞表面ＤＣＩＲを発現することを示している。これらの２つのＤＣサブタイプは、液性免疫応答対、細胞溶解性免疫応答の方向付けにおいて顕著に異なった役割を有し、したがって、両方のサブタイプのＤＣＩＲが存在することは、ＤＣＩＲを介してヒトＤＣにターゲティングされた抗原が両方のタイプの免疫を誘発することを示唆しており、これは、例えばウイルス感染に対するワクチンにおける重要な特徴となる。
【００８３】
図４は、ヒト皮膚から直接単離された３種のヒトＤＣサブタイプでもＤＣＩＲが発現されていることを示している。これらのサブタイプのＤＣはすべてこの受容体を発現するので、この観察は、ＤＣＩＲ抗原をターゲッティングするワクチンには、皮膚内への投与が有利であるはずであることを示している。これらのサブタイプのＤＣは、免疫を方向付けるそれらの特性に関して、上記培養ヒトＤＣに類似していることが知られており、したがって、望ましい複合免疫応答を誘発するには、ＤＣＩＲを有する皮膚ＤＣを介した抗原のターゲティングが有利であるはずである。
【００８４】
真皮のＤＣ及びＬＣは正常ヒト皮膚標本から精製した。細菌性プロテアーゼであるジスパーゼ２型の存在下で標本を４℃で１８時間インキュベートし、その後、３７℃で２時間インキュベートした。その後、表皮シート及び真皮シートを分離し、切断して小片（約１〜１０ｍｍ）にし、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中に入れた。２日後に、培地中に移動した細胞を収集し、１．０７７ｇ／ｄｌのフィコール−ジアトリゾ酸勾配を用いてさらに濃縮した。ＤＣは、抗ＣＤ１ａ ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ１４ ＡＰＣ ｍＡｂで染色した後に、細胞選別によって精製した。
【００８５】
他のヒト組織におけるＤＣＩＲの存在。図５は、ヒト扁桃腺内の胚中心を囲む細胞集団のＤＣＩＲ特異的染色を示す。これらの細胞は、常在ＤＣであるか、又は最近、例えば外来抗原で負荷されて、活性化された後に、この部位に移動してきたＤＣのいずれかである。この染色は、免疫が引き起こされる臓器への接近を可能にする、皮膚以外の経路による、ＤＣＩＲにターゲッティングされたワクチンの投与も、免疫応答を誘発するのに有利であるはずであることを示している。
【００８６】
抗原をヒトＤＣにターゲッティングする抗ＤＣＩＲ ｍＡｂを使用し、製造業者によるプロトコールに従って、６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサン酸スルホスクシンイミジル（ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、sulfosuccinimidyl 6-[3' (2-pyridyldithio)-propionamido] hexanoate；Pierce社製）を用いて、Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質をｍＡｂに化学的に架橋結合した。この多ステッププロトコールは、ＳＰＤＰのＮＨＳエステル基を介して、室温で３０分間、ｍＡｂのアミンを修飾することによってｍＡｂの活性化を行い、その後、ＰＢＳに対して透析を行うものである。その後、Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質を添加して、室温で終夜インキュベートする。Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質は、２つの遊離スルフヒドリル基を含有している。架橋結合反応の効率は、ｍＡｂと反応させる前のＦｌｕ Ｍ１タンパク質の量を、架橋結合後のｍＡｂ／Ｆｌｕ Ｍ１比と比較することによって見積もられた。本発明者らは、平均して５０％のｍＡｂが１分子のＦｌｕ Ｍ１と反応したと計算した。図６及び７は、架橋Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質及びＤＣＩＲに対するｍＡｂの例を示す。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、Ｆｌｕ Ｍ１／Ｈ鎖の染色の比率に基づいて、ｍＡｂ １に対して、１〜２のＦｌｕ Ｍ１を有する産物を同定した。これらの調製をインビトロ研究に用いた。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（下の２番目の図は、非常に大きな複合体の比率が低いことによって証明されるように、複合体が主としてＦｌｕ Ｍ１と単一のｍＡｂとの間のものであったことを示している。
【００８７】
図６は、抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９ ｍＡｂへのＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１の架橋結合を示す。プロテインＧセファロースアフィニティーによって精製された架橋結合産物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。左から右へ、２．５μｇ、１μｇ Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１、１：１、２：１、４：１の比率でＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１をｍＡｂと反応させて得られた産物１０μｇである。
【００８８】
図７は、ｍＡｂへのＨｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１の架橋結合を示す。プロテインＧセファロースアフィニティーによって精製された架橋結合産物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。左から右へと、５μｇ Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１、それに続いて、５μｇ ｍＡｂ（抗ＣＤ１ａ＿ＯＫＴ６、抗ＬＡＮＧ＿２Ｇ３、抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９）と、５μｇ Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１と反応させた５μｇ ｍＡｂとの対である。
【００８９】
Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質に架橋結合された抗ＤＣ受容体ｍＡｂは抗原を効果的にヒトＤＣにターゲッティングする−抗ＤＣ受容体ｍＡｂをＦｌｕ Ｍ１タンパク質に化学的に架橋結合させ、様々な用量を、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞とのヒトＣＤ３４由来ＣＤ１ａ＋ＤＣの共培養物に添加した。２４時間後に、ＤＣ活性化のために、ＣＤ４０Ｌを培養物に添加し、続いて、３日目に、Ｔ細胞増殖のために、ＩＬ−２を添加した。８〜１０日後に、Ｆｌｕ Ｍ１ペプチドであるGILGFVFTL（配列番号５３）に特異的なＴ細胞をＭＨＣ四量体分析によって評価した。図８は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１がＦｌｕ Ｍ１特異的な細胞の増殖を誘発したが、同様な用量の非架橋Ｆｌｕ Ｍ１及びｍＡｂでは、有意に少ないＦｌｕ Ｍ１特異的細胞増殖が観察されたことを示す。用量範囲は、架橋結合されたｍＡｂが、遊離Ｆｌｕ Ｍ１より少なくとも５０倍効果的に反応を誘発したことを示す。このデータは抗原ターゲッティング、すなわち、免疫応答の増強、この場合は特異的なＦｌｕ Ｍ１エピトープの記憶によるＴ細胞の復活を実証している。ＣＤ３４−ＤＣは、ＣＤ１ａ＋ＬＣサブセット又はＣＤ１４＋ＩｎｔＤＣサブセットに選別した。図９は、両方の細胞型でＤＣＩＲ発現が同様なレベルであったのにもかかわらず、抗ＤＣＩＲターゲッティングされたＣＤ１ａ＋ＬＣが、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋細胞の増殖を方向付けるのにはるかに有効であったことを示す。
【００９０】
図８は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１が、ｍＡｂに連結されていないＦｌｕ Ｍ１タンパク質より効率的に、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す。ＣＤ３４由来のＣＤ１ａ＋ＤＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び示されている濃度の、Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１に架橋結合された抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９ ｍＡｂ又は非連結のｍＡｂと共にインキュベートした。その後、Ｆｌｕ Ｍ１特異的な増殖に関してＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。内側の四角は、四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。
【００９１】
図９は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに架橋結合されたＦｌｕ Ｍ１が、Ｉｎｔ−ＤＣよりＬＣを介して、より効率的にＦｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す。示されている濃度の、Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１に架橋結合した抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９ ｍＡｂと共に、ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得たＬＣ又はＩｎｔ−ＤＣと自己ＣＤ８＋Ｔ細胞とを共培養した。クロスプレゼンテーション効率をＦｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度によって評価し、ＨＬＡ−Ａ２０１／ｐＭＩ四量体を用いて分析した。内側の四角は、四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。
【００９２】
プロトタイプ抗原ターゲッティングワクチンとしての組換え抗ＤＣＩＲ ｍＡｂ（ｒＡｂ）の開発。マウスハイブリドーマでコードされているＨ鎖及びＬ鎖可変（Ｖ）領域と、ヒト免疫グロブリンκ又はヒトＩｇＧ４Ｈ定常（Ｃ）領域とのキメラである分泌性抗ＤＣ受容体ｒＡｂを、一時的に形質移入された哺乳動物細胞で発現するためのベクターを開発した。異なった特異性を有する（すなわち異なった抗ＤＣＩＲハイブリドーマから得た）抗ＤＣ受容体ｍＡｂのＬ鎖及びＨ鎖からのＶ領域を、ｃＤＮＡクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特徴付け、これらのベクター中に工学的に作製した。図１０は、２９３細胞に同時形質移入され、培養上清中へのｒＡｂの分泌に関して抗ヒトＦＣ ＥＬＩＳＡでアッセイされた多くの異なった抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに対応するマウス−ヒトキメラｒＡｂをコードするそのようなＨ＋Ｌ鎖ベクターを示す。
【００９３】
これらの抗ＤＣＩＲ ｒＡｂは、ｒＡｂ Ｈ鎖とインフレームになっている約９．５ｋＤＡのドックリンドメインをコードしていた。これらのドックリンドメイン（ｒＡｂ．Ｄｏｃと呼ばれる）の目的は、特異的な［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．抗原］複合体の構築を可能にすることである。この場合、Ｃｏｈ．抗原は、約１７．５ｋＤａのコヒーシンドメインと抗原との間の融合タンパク質を指す。コヒーシンとドックリンとの間の高親和性相互作用は、受容体特異性を有するＤＣの表面に抗原を送達することが本発明者らによって示されている特定の複合体を組み立てるのに使用される。例えば、下の図は、ヒトＤＣの表面に結合した［抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体を示す（ここでは、Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１がビオチン化されており、洗浄ステップの後に細胞表面で検出される）。対照ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１複合体（下の図では赤で示されている）は、検出用ストレプトアビジンＰＥ試薬単独より多くは結合しなかった。
【００９４】
ＤＣＩＲは、抗原の内部移行の動態が遅く、これによって他のＤＣ受容体から区別される。ＤＣ−ＳＩＧＮなどのＤＣ受容体は、内部移行の動態が迅速であることを特徴としている。例えば、図１１は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃが、アレクシア標識されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１を、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮ培養されたヒトＤＣの中に迅速に内部移行させることを示しており、標識の大部分は、１５分以内に細胞の内部に入っている。対照的に、抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃは、Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１を極めて緩徐に内部移行させ、３時間目には、内部抗原及び細胞表面抗原の両方がかなりの量存在している。この結果は、ＤＣＩＲを、内部移行の遅いＤＣ受容体として識別するものであり、Bates et. alの結論と対照的となっている。Bates et. alは、「架橋結合の後、ＤＣＩＲは、ＭＭＲで観察された迅速な動態（データは示されていない）とは対照的に、単球由来ＤＣ及びＣＤ３４由来ＤＣの中に緩徐かつ微弱に移行したのみであった。この知見は、受容体介在性エンドサイトーシスによる銀捕捉がＤＣＩＲの主要な機能ではないことを示唆している」ことを示唆している。
【００９５】
図１１は、抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂに連結されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１がＧＭ／ＩＬ−１５ヒトＤＣに特異的に結合することを示す。４倍のモル過剰であるビオチン化Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１と予め１時間混合されていた、示されている濃度の抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂと共に、単球由来の、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−１５培養されたヒトＤＣをインキュベートした。１時間後に、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥと共にインキュベートした。もう１回洗浄した後に、細胞をＦＡＣＳによって分析して、細胞に結合したＰＥを検出した。緑色のプロットが抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂであり、赤色の曲線が対照ＩｇＧ４．Ｄｏｃ複合体である。
【００９６】
図１２は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ又は抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ ｒＡに連結されたＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１が、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４ヒトＤＣに結合し、その中に内部移行することを示す。単球由来の、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４培養されたヒトＤＣを、抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ、又は４倍のモル過剰であるアレクシア標識Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１と予め１時間混合されていた抗ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ．Ｄｏｃ ｒＡｂと共にインキュベートした。氷上に１時間おいた後、細胞を洗浄し、３７℃に移した。共焦点顕微鏡法を用いて、細胞結合抗原（赤色で示されている）の細胞内局在を分析した。緑色は、細胞膜結合アクチンを標識している。
【００９７】
ＤＣＩＲ．Ｄｏｃを介した、ヒトＤＣへのＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１のターゲッティングは、ＤＣＩＲを、ワクチン開発目的のための優れた受容体として同定する。内部移行の遅いＤＣＩＲ受容体を介した、ヒトＤＣへのＦｌｕ Ｍ１抗原のターゲッティングを、内部移行が迅速なＡＳＧＰＲ及びＬＯＸ−１受容体を介したターゲッティングと比較した。モニターされた免疫応答は、Ｆｌｕ Ｍ１特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖であった。結果は、ＤＣＩＲを介したターゲッティングが、ＬＯＸ−１又はＡＳＧＰＲを介したものより有意に効果的であったことを示している。同様な実験では、ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に培養する前に、残留の［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．抗原］がないように洗浄した場合、ＤＣＩＲを介したターゲッティングの優越性が、なお一層明らかであった。この状況は、インビボの状況に、より近いものである可能性が高い。インビボでは、ターゲッティングされたＤＣが、流入領域リンパ節内のＴ細胞に遭遇するために、投与された抗原の残留物から遠ざかるように移動する。
【００９８】
図１３は、抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ複合体は、他の［抗ＤＣ受容体ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体より、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるのが効率的であることを示す。ＣＤ３４由来のＣＤ１ａ＋ＤＣを、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び８ｎＭ（上のパネル）又は０．８ｎＭ（下のパネル）の、それぞれＣｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１と複合体形成した［抗ＤＣＩＲ＿２Ｃ９．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］、抗ＬＯＸ１＿１５Ｃ４．Ｄｏｃ、抗ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１．Ｄｏｃ又はＩｇＧ４．Ｄｏｃ対照ｒＡｂと共に共培養した。その後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＦｌｕ Ｍ１特異的な増殖に関して分析した。内側の四角は、四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。
【００９９】
図１４は、１日間にわたって投与された抗ＤＣＩＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ複合体が、他の［抗ＤＣ受容体ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１］複合体より、Ｆｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるのに効率的であることを示す。試験条件は、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞を添加する１日前にＤＣを洗浄したことを除いて、上の図と同様であった。一部の抗ＤＣＩＲ Ｖ領域は、ｒＡｂ Ｈ鎖のＣ末端に融合された重要な抗原を分泌させるのにとりわけ好ましい。
【０１００】
図１５は、ｒＡｂ Ｈ鎖のＣ末端への融合体として発現される様々な抗原がｒＡｂ．抗原の分泌に内因的な影響を有することを示す。ここでは、複数の同じ抗原コード領域を、２通りの異なったマウスＶ領域特異性を有するキメラｈＩｇＧ４ ｒＡｂ上に工学的に作製した。これらの発現コンストラクトを、適切なＬ鎖マウスＶ領域−ｈＩｇｋコンストラクトと共に、２９３Ｆ細胞に同時形質移入し、３日後に、ｒＡｂの分泌を評価した。一部のｒＡｂ抗原は良好に発現されたが、他のもの（Ｆｌｕ ＨＡ５−１を含める）は極めて貧弱であった。各抗原は、ｒＡｂとの関連で分泌に影響を与える内因的な生化学的特性を有すると予測するべきである。実際、試験された２通りのＶ領域特異性との関連で、発現への著しく類似した影響がある。
【０１０１】
Ｆｌｕ ＨＡ５は、トリインフルエンザに対するワクチンを開発する際に考慮することが重要な抗原である。図１６は、様々な抗ＤＣＩＲ Ｖ領域（様々な抗ＤＣＩＲ ｍＡｂに由来する）が、望ましい抗ＤＣＩＲ．Ｆｌｕ ＨＡ５ワクチンの分泌に大きな影響を与えるという思いがけない発見を示す。下記の例では、他のＤＣＩＲ Ｖ領域と比較した場合、ＤＣＩＲ＿２５Ａ４が、このタイプのワクチンの分泌にとりわけ好ましい。
【０１０２】
図１６は、抗ＤＣＩＲ．Ｆｌｕ ＨＡ５ ｒＡｂが、可変領域の性質に応じて様々な効率で分泌されることを示す。Ｈ鎖Ｃ末端を介してＤｏｃ（青色円）又はＨＡ５−１（赤色三角）のいずれかに融合した、マウスＶ領域及びヒトＣ領域のキメラをコードするＨ鎖発現プラスミド及びＬ鎖発現プラスミドを、２９３細胞に同時形質移入し、３日後に、ＥＬＩＳＡによって、上清の希釈液にＩｇＧＦｃが存在するかどうかアッセイした。ＤＣＩＲ＿２Ｃ９を除いて、ｒＡｂ．Ｄｏｃは概ね良好に発現された。しかし、ｒＡｂ．ＨＡ５−１の発現にはばらつきが大きかった。
【０１０３】
ｒＡｂ．ＨＡ５−１の分泌を促進するという抗ＤＣＩＲ ２５Ａ４ Ｖ領域の独特な特性が、請求項５の適用を説明する。前者は、特定のＶ領域がｒＡｂ．抗原の分泌に影響を与えうるという本発明者らの発明に基づいている。これは、望ましい結合特異性を有する様々なＶ領域をスクリーニングして、分泌に好ましいものを得ることによって、ｒＡｂ融合タンパク質と関連における、特定の抗原の内因的に貧弱な分泌を克服できることを意味する。どんな分泌性ｒＡｂ．融合タンパク質にもあてはまる新規な一般原理として、これを主張する。
【０１０４】
抗ＤＣＩＲは、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを増強する。図１７は、プライミングを増強するという、樹状細胞への特定の作用を抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが有することを示す。プライミングは、ペプチドを取り込み、それを、表面ＭＨＣ上で、そのペプチド抗原に特異的なＴ細胞に提示することである。この例は、同族のＴ細胞によって通常送達される既知のＤＣ活性化シグナルであるＣＤ４０Ｌと共に、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂでＤＣを刺激することによって、そのＤＣ培養物に添加された免疫優性なＨＩＶ ｇａｇペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の大幅な増加がもたらされることを示している。この特性は、抗ＤＣ受容体ｒＡｂワクチンを介した成功した抗原ターゲッティングでは、高い確度で予測されることであり、抗ＤＣＩＲ．抗原ワクチンが優れていることを示している。
【０１０５】
図１７は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングを増強することを示している。精製された全ＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０６細胞／ウェル）を、自己ＩＦＮ−ＤＣ（１×１０５細胞／ウェル）、並びにＨＬＡ−Ａ２０１拘束性ＨＩＶペプチドであるｐｏｌ（ｐｏｌ４７６〜４８４ ILKEPVHGV（配列番号５４）、ｐｏｌ２９３〜３０２ KYTAFTIPSI（配列番号５５））及びｇａｇ（ｇａｇ７７〜８５、SLYNTVATL（配列番号５６）、ｇａｇ１５１〜１５９、TLNAWVKVV（配列番号５７））（５μＭ）で刺激した。４℃で終夜、ＰＢＳ（ｐＨ９．６）中に希釈された５μｇ／ウェルの抗ＤＣＩＲ ｍＡｂ又は対照モノクローナル抗体でプレコーティングされた２４ウェルプレート内で細胞を９日間培養し、繰り返し洗浄した。細胞は、１０％ヒトＡＢ型血清、１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−７（R&D社製）及び１００ｎｇ／ｍｌ ＣＤ４０Ｌ（R&D社製）を補充したYssel培地中で培養した。３日目にＩＬ−２を１０Ｕ／ｍｌで添加した。ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、インキュベーション期間の終わりに、ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２０１四量体（Beckman Coulter社製）に結合している細胞の数を数えることによって測定した。
【０１０６】
抗ＤＣＩＲ ｍＡｂはクロスプライミングを増強する。図１８は、クロスプライミングを増強するという、樹状細胞への特定の作用を抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが有することを示す。クロスプライミングは、タンパク質を取り込み、それを正しくプロセッシングして、表面ＭＨＣで提示することであり、抗原由来のペプチドに特異的なＴ細胞の増殖によって測定にされる。この例は、同族のＴ細胞によって通常送達される既知なＤＣ活性化シグナルであるＣＤ４０Ｌと共に、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂでＤＣを刺激することによって、ＤＣ培養物に添加されたコヒーシン−ＭＡＲＴ−１融合タンパク質に由来する免疫優性なＭＡＲＴ−１エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数の大幅な増加がもたらされることを示している。この特性は、抗ＤＣ受容体ｒＡｂワクチンを介した抗原ターゲッティングに極めて望ましく、抗ＤＣＩＲ．抗原ワクチンが優れていることを示している。
【０１０７】
図１８は、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂが、ＨＩＶ抗原特異的ＣＤ８＋細胞のプライミングを増強することを示す。上図の方法は、ペプチドがｃｏｈ．ＭＡＲＴ−１ペプチド融合タンパク質で置換されていることを除いて、前の図の方法と同じである。
【０１０８】
本明細書で論じたどんな実施形態も、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実施することができ、かつその逆も同様であることが企図されている。さらに、本発明の方法を実現するのに、本発明の組成物を用いることができる。
【０１０９】
図１９は、ヒト上皮シートにおけるＤＣＩＲ分布の免疫組織化学分析を示す。ＤＲ−ＦＩＴＣ染色は緑色で示されており、ＰＡＢ２６９（ＤＣＩＲ）−５６８は赤色で示されている。右上のパネルは、それらの画像を重ね合わせたものを示す。青色の染色は、細胞核のＤＡＰＩ染色である。倍率４０倍のデジタル画像。細胞の形態及びＤＲ染色は、表皮ランゲルハンス細胞に特徴的なものであり、したがって、この分析は、ランゲルハンス細胞におけるＤＣＩＲ発現を明らかにし、例えば、乱切りされた皮膚に適用された抗ＤＣＩＲ．抗原結合体を取り込む効用をＤＣＩＲが有することを指摘するものである。したがって、これらのデータは、アジュバントを介したＤＣ活性化に伴った、ランゲルハンス細胞による抗原の取り込みが、ターゲッティングされた抗原に対する強力な細胞応答をもたらすことを示している。
【０１１０】
図２０Ａ〜２０Ｄは、ＤＣＩＲ抗原に対するモノクローナル抗体を示し、詳細にはＤＣＩＲへの親和性を示す。
【０１１１】
ＤＣＩＲ抗原の固定：一級アミン（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中に５０μｇ・ｍＬ−１）を介して、AKT_ivコバレントセンサー（covalent sensor）の表面にＤＣＩＲ抗原を固定した。ＥＤＣとＮＨＳとの混合物を用いて、カルボン酸表面を活性化し、４チャネルすべてにＤＣＩＲを結合させた。最後に、専用のブロッキング剤を用いて、どんな残留カルボン酸基も不活性化した。
【０１１２】
ＨＢＳ中における４種の抗ＤＣＩＲ抗体の親和性の測定：４種の抗ＤＣＩＲ抗体の親和性を測定するために、１０〜０．３１２５μｇ ｍＬ−１の各抗体の希釈系列を調製し、平行して、固定されたＤＣＩＲ抗原の上に１８０秒間注入した。試料注入の間に、６０秒間２回の１００ｍＭ塩酸の注入を用いて、表面を再生させた。バイオセンサー測定は、Akubio社製アコースティックバイオセンサーで行った。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
表１は、２種の好ましい抗ＤＣＩＲモノクローナル抗体２４Ａ５及び９Ｅ８の高親和性ＤＣＩＲ外部ドメイン結合特性を示し、それらに由来するマウス可変領域は、ヒトＩｇＧ４本体に移植した場合、高親和性の結合特性を大部分保持していることを実証する。このデータは、ヒトＤＣＩＲに結合するという効用に関する、これらの可変領域の配列［及びそれらの「ヒト化」誘導体］に対する明確な主張を支持する。
【０１１５】
アカゲザルＤＣＩＲに対する抗ＤＣＩＲ ｍＡｂの交差反応性。アカゲザル（Rhesus macaque）ＤＣＩＲへの、抗ヒトＤＣＩＲ ｍＡｂの交差反応性を試験するために、哺乳動物発現ベクター内に構成したアカゲザルＤＣＩＲ ｃＤＮＡで２３３Ｆ細胞に形質移入した。形質移入されていない２９３Ｆ細胞及びヒトＤＣＩＲの発現を指示する同一のベクターで形質移入された２９３Ｆ細胞と比較して、そのパネルの抗ヒトＤＣＩＲ抗体がサルＤＣＩＲに結合するかどうか、ＦＡＣＳによって検査した。ヒトＤＣＩＲ配列とサルＤＣＩＲ配列との間の比較を下記に示す。ヒトＤＣＩＲとサルＤＣＩＲとの間の交差反応性を示す抗体は、例えば、組換えヒト化抗ＤＣＩＲ．抗原ワクチンとして構成した場合、治療薬としてのＮＨＰ毒性研究によって、作用機序ベースの問題にも取り組むことができる［すなわち、これらの試験は、毒性と比較した効力に関しても取り組むことができる］ので、とりわけ好ましい。
【０１１６】
ヒトＤＣＩＲ対、サルＤＣＩＲ。最初の配列はヒト配列であり、サルＤＣＩＲで見られた変化はヒト配列の下に示されている。推定上の膜通過領域は下線で強調されている。非保存性の変化は太字で強調されている。
MTSEITYAEVRFKNEFKSSGINTASSAASKERTAPHKSNTGFPKLLCASLLIFFLLLAISFFIAFVIFFQKYSQLLEKKT（配列番号５８）
MTSEITYAEVRQNESKSSGIDSASSAASKKRTAPHKSNTGFSKLLCASLMIFFLLLAISFFFAFFIFFQKYSQLLEKMT（配列番号５９）
TKELVHTTLECVKKNMPVEETAWSCCPKNWKSFSSNCYFISTESASWQDSEKDCARMEAHLLVINTQEEQDFIFQNLQEE（配列番号６０）
TKDLVHTTLECVKKNMTTEETAWSCCPKNWKPFSSNCYFISTESASWQKSEKDCARMEAHLLVINTREEQDFIFQNLQEE（配列番号６１）
SAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPREPSDPNERCVVLNFRKSPKRWGWNDVNCLGPQRSVCEMMKIHL（配列番号６２）
SAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPHEPSDPDERCVVLNFRKTPKRWGWNDVHCIVPQRSVCEMMKIHL（配列番号６３）
【０１１７】
図２１は、アカゲザルＤＣＩＲへの、抗ＤＣＩＲ ｍＡｂの交差反応性を示す。試料のＦＡＣＳ分析が下に提示されている。緑色のプロットは、対照でＩｇＧ４．ｇａｇ組換えタンパク質によるバックグランド結合を示す。赤色のプロットは、抗ＤＣＩＲ．ｇａｇタンパク質を介した結合である［２次抗体はＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧＦｃであった］。結果は、ヒトＤＣＩＲ発現プラスミドで形質移入された２９３Ｆ細胞には、９Ｅ８ ｍＡｂと２４Ａ５ ｍＡｂとで匹敵した結合を示しており、サルＤＣＩＲ発現プラスミドによって形質移入された２９３のＦ細胞には、９Ｅ８は結合したが、２４Ａ５は結合しなかった。同様な分析で、９Ｅ８、２９Ｇ１０、３１Ａ６、及び３Ｃ２ ｍＡｂはサルＤＣＩＲによく結合したが、２４Ａ５、６Ｃ８、２４Ｅ７、５Ｆ９及び２９Ｅ９ ｍＡｂは結合しなかった。
【０１１８】
図２２は、特定のグリカン構造への、ＤＣＩＲ外部ドメインの結合を示すグラフである。ＤＣＩＲ外部ドメインは、２９３Ｆ細胞から分泌されるｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質として発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。米国糖鎖コンソーシアム（the Consortium for Functional Glycomics）から得たプリントアレイのバージョン３．０を用いて、このタンパク質を特定のグリカンの結合に関して試験した。このアレイは、６通りに複製された３２０種のグリカン（又はグリコフォーム）からなる。
【０１１９】
下記に示すExcelスプレッドシートは、それぞれ、グリカン番号、構造又は名称、６通りの複製の平均ＲＦＵ値、標準偏差、平均値の標準誤差（全データセットを提示している上記グラフのエラーバーに使用した）及び％ＣＶを列Ａ〜Ｆに示している。列Ｃ〜Ｙは、グリカン数対、平均ＲＦＵのグラフを含有し、列Ｚ〜ＡＥは、最高の強度で結合したグリカンのリストを提供するために、ＲＦＵによって並べ替えられた（高い値から低い値）Ａ〜Ｆのデータである。６通りの複製からなる各セットから、最高値及び最低値が除外されているので、これらの平均は、６つの値ではなく、４つの値の平均である。これは、単一の非常に高いポイントを含有した誤ヒットの一部を排除する。したがって、高い％ＣＶを有するポイントは、疑わしいものと考えるべきである。これらの分析は、フィコエリトリンで標識された抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃを使用した検出を用いて行った。２ｍＭ Ｃａ及びＭｇ、１％ＢＳＡ並びに０．０５％Tween 20を含有するTris−食塩水結合緩衝液を用いて、ＤＣＩＲ．ＩｇＦｃをＰＢＳ中に２００μｇ／ｍｌに希釈した。
【０１２０】
このデータは、米国糖鎖コンソーシアムと協力して作成した。ＤＣＩＲ外部ドメインに最も強固に結合したグリカンは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｓｐ１２であった。このグリカンは、いくつかのヒト血漿タンパク質で見出される極めて複雑な糖質であるが、試験した他のｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質は、このグリカンへの選好を示さなかった。
【０１２１】
したがって、グリカン１４３又は関連構造のパネルからスクリーニングされた親和性がより高い誘導体で装飾された抗原は、ＤＣＩＲに対する抗原に磨きをかけるはずであり、ＤＣターゲッティングワクチン又は他のＤＣＩＲターゲッティング作用物質の抗ＤＣＩＲ成分の代用物として働く。これはワクチン製造及び貯蔵における費用便益を有しうるであろう。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
図２３Ａ〜２３Ｃは、ＤＣＩＲがすべての血液ＤＣサブセットの包括的な標的であることを示す。血液中では、ＣＤ１１ｃ＋ｍＤＣ及びＢＤＣＡ２＋ｐＤＣという、ＤＣの２つのサブセットが同定される。ＤＣＩＲは、両方のＤＣサブセットで見出される稀少なレクチン型受容体の１つである。ｍＤＣ及びｐＤＣを血球アフェレーシスから精製し、各ＤＣサブセットを、精製された自己ＣＤ８＋Ｔ細胞並びに漸減濃度のＦｌｕ−ＭＰの４種の組換え型、すなわちＦｌｕ−ＭＰ、ＩｇＧ４に融合したＦｌｕ−ＭＰ及び２種の異なった組換え抗ＤＣＩＲ抗体２４Ａ５及び９Ｅ８に融合したＦｌｕ−ＭＰと共に培養した。
【０１２４】
下記図２３Ａに示す結果は、両方の組換えＤＣＩＲ−Ｆｌｕ−ＭＰ融合タンパク質が、８０ｐＭという低い濃度で、１．７８％〜２．１８％の四量体陽性細胞を誘導できるので、これら２種のタンパク質は、Ｆｌｕ−ＭＰをｍＤＣに強力にターゲッティングできることを示している。この濃度は、Ｆｌｕ−ＭＰ自体及びＩｇＧ４−Ｆｌｕ−ＭＰが抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導できない濃度である。ｐＤＣは、８ｎＭで、４種の形態の組換えＦｌｕ−ＭＰのクロスプレゼンテーションを行うこともできた。０．８ｎＭ及び８０ｐＭでは、２種のＤＣＩＲ−Ｆｌｕ−ＭＰコンストラクトがクロスプレゼンテーションされたが、他の２種のＦｌｕ−ＭＰコンストラクトはクロスプレゼンテーションされなかった（下側の図Ｂ）。
【０１２５】
まとめると、これらのデータは、ＤＣＩＲは、血液ｍＤＣ及びｐＤＣの両方によって、タンパク質をクロスプレゼンテーション用に強力にターゲッティングすることを示す。ヒトでは、ＬＣ及びＩｎｔＤＣが、それぞれ細胞性免疫及び液性免疫を選択的にプライミングする能力を有する。抗原を、ＤＣＩＲのような、汎ＤＣ分子にターゲッティングすることによって、様々なＤＣサブセットをターゲッティングすることによる広範な液性免疫応答及び細胞性免疫応答が潜在的に誘導される。これは、抗ランゲリンなどの、サブセット特異的抗原送達媒体とは対照的である。
【０１２６】
図２３Ａは、ＣＤ４０Ｌで成熟し、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養された、ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得た血液由来のｍＤＣが、各８ｎＭ、０．８ｎＭ又は８０ｐＭのａＤＣＩＲ−Ｆｌｕ−ＭＰ（ａ＃２４Ａ５及びｂ＃９Ｅ８）、ＩｇＧ４−Ｆｌｕ−ＭＰ又はＦｌｕ−ＭＰでターゲッティングされることを示す。１０日後に、特異的なＨＬＡ−Ａ２−Ｍ１四量体染色によってＴ細胞増殖を評価した［垂直軸］。
【０１２７】
図２３Ｂは、ＣＤ４０Ｌで成熟し、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養された、ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得た血液由来のｐＤＣが、各８ｎＭ、０．８ｎＭ又は８０ｐＭのａＤＣＩＲ−Ｆｌｕ−ＭＰ（ａ＃２４Ａ５及びｂ＃９Ｅ８）、ＩｇＧ４−Ｆｌｕ−ＭＰ又はＦｌｕ−ＭＰでターゲッティングされることを示す。１０日後に、特異的なＨＬＡ−Ａ２−Ｍ１四量体染色によってＴ細胞増殖を評価した［垂直軸］。
【０１２８】
図２３Ｃは、ＬＣ及び真皮ＣＤ１４＋ＤＣによるタンパク質のクロスプレゼンテーションを、ＤＣＩＲが可能にすることを示す。ＣＤ４０Ｌで成熟し、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養された、ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得た皮膚由来のＤＣが、各８ｎＭの抗ＤＣＩＲ：Ｆｌｕ−ＭＰ、抗ランゲリン：Ｆｌｕ−ＭＰ又はＩｇＧ４：Ｆｌｕ−ＭＰでターゲッティングされる。１０日後に、特異的なＨＬＡ−Ａ２−Ｍ１四量体染色によってＴ細胞増殖を評価した［垂直軸］。
【０１２９】
図２４は、ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１でのワクチン接種が、ＦｌｕＭ１特異的なリコールＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の産生を可能にすることを示す。亜致死条件で照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ β２ｍ−／−免疫不全マウスにＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋健常ドナーから得た３×１０６ ＣＤ３４＋ＨＰＣを移植した結果を、移植の４〜８週後に、２０×１０６の自己Ｔ細胞を養子移入することによって再構成した。ＤＣを動員するために、５回用量のヒト組換えＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）でマウスを１０日間前処置した。アジュバントとして、５０ｍｃｇ／マウスのポリＩＣと共に、全量３０ｍｃｇのＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１ワクチンを、２通りの時点、すなわち１日目及び７日目に、２つの部位、すなわちｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．に送達した。インフルエンザ特異的免疫応答の誘導は、マトリックスタンパク質１：ＦｌｕＭ１ ５８〜６６（GILGFVFTL）（配列番号６４）ペプチドを負荷した四量体で、血液及び組織を染色することによって評価した。図１に示す通り、ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１でワクチン接種されたマウスの５匹中４匹は、ワクチン接種後の１１日目に、ＦｌｕＭ１四量体に結合する循環ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞が、０．６３％、０．３４％、０．２１％及び０．６２％であることを示した。ＨＩＶｇａｇペプチドが負荷された対照四量体による染色はほぼ陰性であった。これらの予備的な結果は、独立したマウスコホートで確認され、ＦｌｕＭ１四量体に高親和性で結合するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、合計で１２匹中９匹のワクチン接種マウスで観察された。これらの結果は、ＤＣＩＲ−ＦｌｕＭ１でのワクチン接種が、ＦｌｕＭ１特異的なリコールＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の産生を可能にすることを実証する。
【０１３０】
本明細書に記載した特定の実施形態は、本発明の制限としてではなく、例として示したものであることが理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに、様々な実施形態で利用することができる。当業者ならば、本明細書に記載した本発明の特定の方法に対する多数の均等物を認識するか、常例的実験を用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲に包含されている。
【０１３１】
本明細書で参照したすべての出版物及び特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルを示すものである。すべての刊行物及び特許出願を、あたかも個々の刊行物又は特許出願を具体的かつ個別的に参照により組み込むと示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込む。
【０１３２】
「１つの（a）」又は「１つの（an）」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は本明細書中で「含む（comprising）」という用語と共に使用される場合、「１つ」であることを意味しうるが、それは、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１又は１超」という意味とも一貫性を有する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、一選択肢のみの選択を指すことが明示的に示されているか、選択肢が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するのに用いられる。但し、本開示は、一選択肢のみの選択並びに「及び／又は」を指すという定義を支持する。本出願全体にわたって、「約」という用語は、ある値に、その値を決定するのに用いられた装置若しくは方法に固有な誤差の変異又は研究対象間に存在する変異が含まれていることを示すのに使用される。
【０１３３】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」など、含む（comprising）のどんな形態も）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」など、有する（having）のどんな形態も）、「含む（including）」（並びに「含む（include）」及び「含む（includes）」など、含む（including）のどんな形態も）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contain）」及び「含有する（contains）」など、含有する（containing）のどんな形態も）という語は、包括的又は非制限的であって、追加の、記載されていない要素又は方法ステップを除外しない。
【０１３４】
「又はこれらの組合せ」という用語は、本明細書で使用される場合、その用語に先行して列挙されている項目のすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はこれらの組合せ」には、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣのうちの少なくとも１つが含まれ、特定の文脈で順序が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含まれると意図されている。この例示を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど、１又は複数の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せも、明示的に含まれる。当業者ならば、通常は、どんな組合せも、文脈から別段のことが明らかでない限り、それに含まれる項目又は用語の数に制限がないことを理解するであろう。
【０１３５】
本明細書で開示及び特許請求されている組成物及び／又は方法はすべて、本明細書の開示に照らして、過度の実験をすることなく作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して記述したが、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱せずに、上記の組成物及び／又は方法、並びに本明細書に記載の方法のステップ又はステップの順序に変異を適用しうることは、当業者には明らかであろう。当業者に明らかなそのようなすべての類似した置換及び改変は、添付されている特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念に包含されるものとする。
【０１３６】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＣＩＲ発現抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させる方法であって、抗体−作用物質複合体を形成する標的作用物質が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を単離及び精製するステップを含み、前記抗体−作用物質複合体と接触した抗原提示細胞によって、この分子が内部移行される方法。
【請求項２】
抗原提示細胞が樹状細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の一方の半分に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の一方の半分に結合し、標的作用物質がコヘリン／ドックリン対の他方の半分に結合して複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的作用物質が、ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、核酸及びこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的作用物質が１又は複数のサイトカインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的作用物質が、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、骨形成因子、並びにそのような成長因子の生理学的に活性な類似体、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、分裂促進サイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８等、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、並びにβトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合性成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来性成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えばＧＤＦ−１）及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含むトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）遺伝子スーパーファミリーから選択される１又は複数のサイトカインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的作用物質が、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性又は癌性のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
樹状細胞による抗原提示の有効性を増大させる方法であって、抗体−抗原複合体を、抗原が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を結合させるステップを含み、前記抗原が、前記抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によってプロセシング及び提示される方法。
【請求項１０】
防御的又は治療的免疫応答を誘発する目的で抗原を抗原提示細胞に送達するための、ＤＣＩＲに対する抗体又は他の特異的結合分子の使用。
【請求項１１】
皮膚を介したワクチン接種のための、ＤＣＩＲに特異的な抗原標的試薬の使用。
【請求項１２】
同時投与又は連結されたワクチン接種用アジュバントと併用した、ＤＣＩＲに特異的な抗原標的試薬の使用。
【請求項１３】
組換え抗原−抗体融合タンパク質として発現することができる特異的抗原の、抗原ターゲッティング（ワクチン接種）目的での使用。
【請求項１４】
樹状細胞の有効性を増大させる方法であって、
患者の樹状細胞を単離するステップと、
前記樹状細胞を活性化量の抗ＤＣＩＲ抗体又はその断片及び抗原に曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップと、
抗原が負荷されて活性化された前記樹状細胞を前記患者に再導入するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
抗原が、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性又は癌性のタンパク質を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物細胞から分泌された抗ＤＣＩＲ免疫グロブリン又はその一部分、及び前記免疫グロブリンに結合した抗原。
【請求項１７】
免疫グロブリンがコヒーシン／ドックリンドメインの一方の半分に結合している、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項１８】
モジュールｒＡｂ担体と複合体を、抗原に結合した、コヒーシン−ドックリン結合対の他方の半分をさらに含む、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項１９】
抗原との融合タンパク質である、コヒーシン−ドックリン結合対の他方の半分をさらに含む、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項２０】
抗原特異的なドメインが、完全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片、及び／又はＦｃドメインの部分を伴ったＦａｂ断片を含む、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項２１】
免疫グロブリンが、放射性同位元素、金属、酵素、ボツリヌス毒素、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、ウェルシュ菌毒素、マイコトキシン、志賀毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン、サキシトキシン、アブリン、シアノジノシン、α毒素、テトロドトキシン、アコノトキシン、ヘビ毒及びクモ毒からなる群から選択される毒素に結合している、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項２２】
抗原が免疫グロブリンとの融合タンパク質である、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項２３】
抗体−抗原複合体を、抗原が結合するＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を含むワクチンであって、前記抗原が抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によってプロセシング及び提示されるワクチン。
【請求項２４】
抗原がＤＣＩＲを含む、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｓｐ１２を含むグリカンの少なくとも一部に結合した、ＤＣＩＲに特異的に結合する抗原性Ｔ細胞エピトープペプチド
を含むＴ細胞抗原。
【請求項１】
ＤＣＩＲ発現抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させる方法であって、抗体−作用物質複合体を形成する標的作用物質が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を単離及び精製するステップを含み、前記抗体−作用物質複合体と接触した抗原提示細胞によって、この分子が内部移行される方法。
【請求項２】
抗原提示細胞が樹状細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の一方の半分に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の一方の半分に結合し、標的作用物質がコヘリン／ドックリン対の他方の半分に結合して複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的作用物質が、ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、核酸及びこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的作用物質が１又は複数のサイトカインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的作用物質が、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、骨形成因子、並びにそのような成長因子の生理学的に活性な類似体、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、分裂促進サイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８等、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、並びにβトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合性成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来性成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えばＧＤＦ−１）及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含むトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）遺伝子スーパーファミリーから選択される１又は複数のサイトカインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的作用物質が、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性又は癌性のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
樹状細胞による抗原提示の有効性を増大させる方法であって、抗体−抗原複合体を、抗原が結合しているＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を結合させるステップを含み、前記抗原が、前記抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によってプロセシング及び提示される方法。
【請求項１０】
防御的又は治療的免疫応答を誘発する目的で抗原を抗原提示細胞に送達するための、ＤＣＩＲに対する抗体又は他の特異的結合分子の使用。
【請求項１１】
皮膚を介したワクチン接種のための、ＤＣＩＲに特異的な抗原標的試薬の使用。
【請求項１２】
同時投与又は連結されたワクチン接種用アジュバントと併用した、ＤＣＩＲに特異的な抗原標的試薬の使用。
【請求項１３】
組換え抗原−抗体融合タンパク質として発現することができる特異的抗原の、抗原ターゲッティング（ワクチン接種）目的での使用。
【請求項１４】
樹状細胞の有効性を増大させる方法であって、
患者の樹状細胞を単離するステップと、
前記樹状細胞を活性化量の抗ＤＣＩＲ抗体又はその断片及び抗原に曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップと、
抗原が負荷されて活性化された前記樹状細胞を前記患者に再導入するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
抗原が、細菌性、ウイルス性、真菌性、原生動物性又は癌性のタンパク質を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物細胞から分泌された抗ＤＣＩＲ免疫グロブリン又はその一部分、及び前記免疫グロブリンに結合した抗原。
【請求項１７】
免疫グロブリンがコヒーシン／ドックリンドメインの一方の半分に結合している、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項１８】
モジュールｒＡｂ担体と複合体を、抗原に結合した、コヒーシン−ドックリン結合対の他方の半分をさらに含む、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項１９】
抗原との融合タンパク質である、コヒーシン−ドックリン結合対の他方の半分をさらに含む、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項２０】
抗原特異的なドメインが、完全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片、及び／又はＦｃドメインの部分を伴ったＦａｂ断片を含む、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項２１】
免疫グロブリンが、放射性同位元素、金属、酵素、ボツリヌス毒素、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、ウェルシュ菌毒素、マイコトキシン、志賀毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン、サキシトキシン、アブリン、シアノジノシン、α毒素、テトロドトキシン、アコノトキシン、ヘビ毒及びクモ毒からなる群から選択される毒素に結合している、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項２２】
抗原が免疫グロブリンとの融合タンパク質である、請求項１６に記載の免疫グロブリン。
【請求項２３】
抗体−抗原複合体を、抗原が結合するＤＣＩＲ特異的抗体又はその断片を含むワクチンであって、前記抗原が抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によってプロセシング及び提示されるワクチン。
【請求項２４】
抗原がＤＣＩＲを含む、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｓｐ１２を含むグリカンの少なくとも一部に結合した、ＤＣＩＲに特異的に結合する抗原性Ｔ細胞エピトープペプチド
を含むＴ細胞抗原。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ−２０Ｂ】
【図２０Ｃ−２０Ｄ】
【図２１】
【図２２】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ−２０Ｂ】
【図２０Ｃ−２０Ｄ】
【図２１】
【図２２】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２４】
【公表番号】特表２０１０−５１７５３８（Ｐ２０１０−５１７５３８Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４８４８１（Ｐ２００９−５４８４８１）
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２８５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９７８６６
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２８５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９７８６６
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
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