抗感染薬およびその使用
本発明は、新規な免疫刺激微粒子組成物、ならびに細菌およびウイルス感染の処置における抗感染薬としてのその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗感染薬組成物の使用、ならびに、特には、病原体に対する自然および／または特異的免疫反応を高めるための抗感染薬としての免疫刺激微粒子の使用に関する。
【０００２】
本発明は、主として、病原体によって引き起こされる疾患と闘うように免疫細胞上に作用することが可能な、広範囲に作用する抗感染薬としての使用のために開発されたものであり、以下においてはこの用途に関連して説明される。しかし、当然のことながら本発明はこの特定の使用分野に限定されるものではない。
【背景技術】
【０００３】
本明細書全体を通し、先行技術に関する考察はいずれも、当該先行技術が周知であることまたは本技術分野における共通の一般的知見の一部を形成することを認めるものとしてみなされるべきでは決してない。
【０００４】
免疫系は、自然（非特異的）免疫系および適応（特異的）免疫系と称される２つの主要な区分から成る。両系は協調して効果的な反応を産み出すが、多くの点で異なっている。適応免疫系は、病原生物と反応するのに時間を必要とし、抗原特異的であり、免疫記憶を示す。これとは対照的に、自然免疫系は、病原体へのより素早い反応を示し、抗原特異的ではなく、免疫記憶を示さない。
【０００５】
適応（特異的）免疫系には２つの種類があり、体液性免疫と細胞性免疫が含まれる。体液性免疫は、外来性の抗原に対する抗体の産生に関与する。抗体はＢ‐リンパ球によって産生される。細胞性免疫は、外来性の抗原を持つ感染細胞に作用するか、またはその他の細胞を刺激して感染細胞に作用させるＴ‐リンパ球の活性化に関与する。哺乳類免疫系の両方の種類共に疾患との闘いにおいて重要である。体液性免疫は、細菌性病原体およびトキシンに対する主たる防御ラインであるが、長期間作用する防御免疫にとっては、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔリンパ球の誘発が不可欠であると考えられる。
【０００６】
自然免疫は、感染に対する最初の防御ラインであり、多くの微生物に一般的に見られる病原体分子パターン認識受容体（ＰＲＲ）を利用して炎症促進性および抗ウイルス性サイトカインを迅速に誘発する。これらの経路の特異的な活性化因子は、健康なホストおよび免疫低下ホストのいずれにおいても、ウイルス感染に対する治療に有益である可能性がある。ＰＲＲに対するリガンドの識別、及びこれらのシグナル伝達カスケードに関する知見の増加の結果、所与の病原体に対する好ましい免疫反応の誘発薬として選択的ＰＲＲリガンドが開発されてきた。
【０００７】
非特異的免疫刺激薬、またはアジュバントを、非特異的免疫の向上／誘発のための手段として用いることに対する関心が急速に高まりつつある。「アジュバント」という用語は、固体への投与またはインビトロでの試験を行った場合に、免疫細胞特異的免疫活性の全体的な上方制御を誘発することで作用する化合物を表すものとして広く用いられる。
【０００８】
非常に様々な物質がアジュバント活性を有することが示されているが、一般的な医療への使用が認可されているアジュバントはミョウバンのみであり、これが最初に使用されたのは５０年以上前である。ミョウバンの次としては、鉱油および不活性化結核菌を含有するフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）が最初は広く用いられ、「代表的存在（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）」と見なされたが、肉芽腫を形成することから使用されなくなった（Ｓｔｉｌｌｓ ２００５）。
【０００９】
グラム陽性およびグラム陰性の分類の細菌ペプチドグリカンに一般的に見られるジペプチドであるムルミルジペプチド（ｍｕｒｕｍｙｌ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）（ＭＤＰ）の免疫刺激／調節特性の識別は（Ｉｎｏｈａｒａ，２００３；Ｋｕｆｅｒ，２００６）、化学的に明らかにされ、十分に活性である免疫アジュバントとしてのＭＤＰの臨床的な応用を目的とする免疫薬理学的研究へと繋がった。このような期待は、その毒性および不良な薬物動態プロファイル、すなわちＭＤＰの体内からの急速なクリアランス、を主たる理由としてＭＤＰ自体が臨床用途に適さないことが認識されたことにより、間もなく失望へと変わった（Ｌｉｄｇａｔｅ，１９９５；Ｔｒａｕｂ，２００６）。発熱性の低減または排除の試みは、その結果として誘導体の製剤化をもたらし、そのうちのいくつかは、ムラブチド（Ｍｕｒａｂｕｔｉｄｅ）を例とする可溶性の単量体の形態で臨床試験に用いられている（Ａｕｄｉｂｅｒｔ，１９８４；Ｂａｈｒ，１９９５；Ｖｉｄａｌ，２００１）。
【００１０】
上述のＭＤＰ製剤とは対照的に、ＭＤＰに帰する望ましくない副作用は持たないが、免疫刺激特性の向上は達成されるＭＤＰ類似体が開発された（オーストラリア特許第７３２８０９号）。このＭＤＰの無毒性の形態（ＮＴ‐ＭＤＰ）は、ほとんどのアジュバントがそうであるように、天然のタンパク質、遺伝子組換えタンパク質、合成ペプチド、およびその他の免疫性物質に対する特異的な免疫反応を高めるために元々は開発されたものであり、すなわち、適切な抗原と組み合わせることで従来からのアジュバント‐抗原複合体として用いられたものである。
【００１１】
従来から、感染と闘うために細菌アジュバント（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ）を単独で免疫療法に用いて非特異的免疫系をブーストすることは行われていない。これは部分的には、先行技術のアジュバントは、適切な免疫細胞を特異的に活性化することができず、従って適切な免疫反応を活性化することができないためである。先行技術のアジュバントは、適切ではない細胞種によるサイトカインの産生を誘発し、それにより様々な種類の大量のサイトカインが全身的に発現し、それによって重度の望ましくない副作用が引き起こされる。そのため、先行技術のアジュバントを独立した免疫治療薬として用いることはできない。
【００１２】
いくつかの自然免疫反応は、ウイルス感染の制御に寄与していると考えられている。このようなエフェクター機構は多面的であり、この機構には、直接の抗ウイルス活性、ならびに感染した宿主免疫細胞に対する、これらの細胞の排除に寄与する免疫調節効果が含まれる。直接の抗ウイルス活性は、ＣＤ８抗ウイルス因子（ＣＡＦ）およびＩＦＮ‐αなどの、ウイルスの転写に直接影響を与える能力を有する可溶性因子を含むことができる。マクロファージおよび樹状自然免疫細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）によって分泌された、ＴＮＦ（ＩＦＮ‐γと共に）などの免疫調節性／炎症促進性サイトカインは、ウイルス感染細胞に作用することができ、このことにより、ＴＮＦによって媒介される細胞溶解への感受性の高まりが見られる。さらに、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が媒介するウイルス感染細胞の殺傷などの細胞機構は、抗ウイルス自然免疫の別の重要な一面を構成している。
【００１３】
その他の広範囲にわたる自然サイトカイン（ｉｎｎａｔｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）が、抗ウイルス免疫の態様を制御する生物機能を媒介することができるが、高レベルのＩＦＮ‐α／βが、ウイルス感染に関しては支配的であり、その他の自然反応（ｉｎｎａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を制御するように作用していると考えられる。Ｂ／Ｃ型慢性肝炎などの種々のウイルス性障害、ならびに広範囲にわたるヒトの癌の治療におけるＩＦＮ‐αの臨床的な有用性は、ウイルスの複製を阻止する多面的なホスト防御経路を作動させる支配的な一連の抗ウイルス遺伝子（ｄｏｍｉｎａｎｔ ａｒｒａｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅｓ）を誘発するその能力に帰する。臨床用途のための現在のＩＦＮ‐α製品は、遺伝子組換えタンパク質または単一のアイソフォームの高純度のタンパク質であり、これらは単独療法として、または他の抗ウイルス薬と組み合わせて用いられる。しかし、このような治療法は耐容性が良くなく、低い応答効率を伴う。このことは、天然の複数のＩＦＮ‐αアイソフォームを生理的に適切なレベルで誘発することができるだけでなく、ＩＦＮ‐αと相乗効果的に作用する可能性が高い、抗ウイルス自然免疫の他の態様をも動員することができる新たな手法が必要であることを裏付けるものである。
【００１４】
ＮＫ細胞は、ウイルス感染に対する自然防御への、機能的に異なる重要な寄与体である。免疫刺激性化合物による内在性ＮＫ細胞活性の向上は、臨床的に適切である別の抗ウイルス治療手法である。さらに、ＮＫ細胞は、ＩＦＮ‐αとは異なる機構によって、ウイルスに感染した細胞を認識してこれを破壊することができることから、ＩＦＮ‐αの直接の効力に対する耐性を獲得したウイルスを標的とする能力を有する。ＩＦＮ‐αは、ＮＫによる殺傷（ＮＫ ｋｉｌｌｉｎｇ）の活性化に関して中心的な役割を担っており、さらに、ＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐１２などのその他の重要な自然免疫サイトカインと相乗効果を起こしてＮＫ細胞の機能を上方制御し、適応細胞性免疫を促進する。従って、ＮＫ抗ウイルス機構を十分に利用するためには、その他の自然免疫細胞（例えば形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍｏｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）（ｐＤＣ）および単球など）の免疫刺激が望ましい。
【００１５】
細菌感染については、その他の自然免疫機能、特に貪食細胞機能が重要であり、この場合、貪食された病原体は活性酸素または窒素種にさらされるか、またはリソソーム酵素によって破壊される。分解された抗原は、次に、マクロファージによってＴ細胞に提示されて、適応免疫反応が誘発され得る。細菌病原体は、貪食細胞内でのその末路に関して２つの群に分けられ：細胞外細菌は貪食の後すぐに殺傷されるが、通性細胞内細菌はマクロファージが免疫活性化されていない限り細胞内殺傷に対して耐性を有する。細胞外細菌は化膿性感染を引き起こし、通性細胞内細菌は、肉芽腫性感染である。体液性免疫機構（抗体、補体）は、主として細胞外細菌を処理し、一方、細胞性免疫機構（Ｔ細胞、マクロファージ）は、通性細胞内細菌を処理する。
【００１６】
現在利用可能である治療法での治療が依然として困難である細菌およびウイルス感染は数多く存在する。例えば、結核（ＴＢ）は最も古くから知られるヒト病原体であり、単一の細菌体によるヒトの死因の第一位である。全人類のほぼ３分の１が、その病因体であるマイコバクテリウムツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）に感染していると推計される。ＴＢは、１年間におよそ８００万人の新患が見られ、年間の死亡者数は約２００万人である。多剤耐性（ＭＤＲ）および異常薬剤耐性（ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｉｌｙ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（ＸＤＲ）結核は、死亡率および罹患率を制御する上で重大な問題を引き起こしている。
【００１７】
結核は、小集団で無期限に存続し、突発的に再活性化されて、薬物に対して感受性の高い細菌株であっても治療が困難である疾患を発症し得る。薬物治療が困難であることから、予防および治療のためのワクチン接種によってＭＤＲ‐Ｍｔｂを抑えることが、ますます有効な一連の戦略となりつつある。歴史的には、らい腫性ハンセン病における多大な細菌存在量（ｈｅａｖｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｕｒｄｅｎ）を、ＢＣＧワクチン接種によって低減することができており；ＭＤＲ結核における細菌存在量を低減するかまたはこれを除去するための同様の手法が緊急に求められている。
【００１８】
結核の効果的な制御は、２段階の介入治療を含むと考えられ：すなわち、一次曝露（一次ワクチン接種）の後の感染発症の予防、およびＢＣＧワクチン接種を行った個体の免疫活性化による疾患の再活性化の予防（ブースターワクチン接種）である。ＭＤＲ‐Ｍｔｂの制御における主たる欠陥は、このような免疫化の様式に対処することができる効果的なワクチンが存在しないことである。さらに、ＭＤＲ‐Ｍｔｂの治療に薬物は効果的ではなく、従って、治療ワクチン接種が求められている。野生型Ｍ．ツベルクローシス（M.tuberculosis）由来の弱毒生ワクチンは、ＢＣＧワクチンと同様の予防効果があるが、安全性の問題によって制限されている。より短期間の予防効果を有する数多くの遺伝子組換え抗原およびＤＮＡワクチンが同定されているが、ブースターを必要とする。
【００１９】
残念ながら、ＢＣＧワクチンは、小児結核に対しては不定的な効果があるが、成人結核または再感染に対しては効果がない。ＭＤＲ結核は、通常、再感染の結果であり、従って、ＢＣＧワクチン接種は、薬物に感受性を持つ細菌株、またはＭＤＲ‐Ｍｔｂ細菌株のこの態様の制御にはほとんど効果がない。さらに、Ｍｔｂは、マクロファージの内部に隠れており、免疫認識を妨害する。弱毒化ＢＣＧワクチンでさえマクロファージ（ＭΦ）および樹状細胞（ＤＣ）の特別の区画内に隠されてしまい、免疫認識が低下する。従って、ＢＣＧは少なくとも２つの重要な欠点を有する。１つ目は、防御抗原となる可能性のある抗原のすべてを含有しているわけではないことであり、２つ目は、能動的に免疫反応を妨害することである。
【００２０】
結核は、強力なＴｈ１免疫によって制御され、これは、逆説的なことに、抗体が支配的である（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｍｉｎａｎｔ）Ｔｈ２反応、およびＭｔｂ由来の産物に誘発される抑制性制御性Ｔ細胞（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｔ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）によって逆制御される。従って、ワクチンの媒介によるＭＤＲ結核の免疫制御は、他のＴ細胞反応を犠牲にしてＴｈ１免疫を選択的に誘発するワクチンの使用が必要であり、合理的なワクチン設計の重要な構成成分として、Ｔ細胞分化を歪めることができるアジュバントの役割が強調される。残念ながら、最小限のブースター用量で長期間持続する免疫を誘発することができるアジュバントの機構に関する理解に、大きな空白が存在する。
【００２１】
インフルエンザ感染は、小児および高齢者に著しい罹患率と死亡率を引き起こす。インフルエンザ感染に付随する重度の合併症としては、肺炎、呼吸不全、ショックおよび脳疾患などの非呼吸性の症状、ならびに基礎慢性疾患の悪化が挙げられる。インフルエンザに関連する死亡は、ウイルスの一次感染に直接関連する場合もあり、または、二次合併症に起因する場合もある。ある場合には、疾患の発症から死亡までが急速に起こりうる。ワクチン接種によってある程度の予防を行い得るが、毎年の遺伝的浮動の範囲は、ワクチンと流行するウイルス株とがミスマッチとなる可能性が高いことを意味する。好ましいワクチン製剤とは、毎年発生する急速なインフルエンザ株の変異に適合させるための毎年の再製剤化を必要としないものであろう。ワクチンはインフルエンザの制御に必須のツールであるが、ワクチンが有効でない場合、またはインフルエンザがワクチン接種を受けていない個体もしくはワクチン接種を受けていない集団に広がった場合（エピデミック）、自然免疫療法が特に有利となり得る。
【００２２】
ペストは、エルシニアペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）によって引き起こされ、これは、腸内病原体であるＹ．シュードツベルクロシス（Ｙ． ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から進化したものであり、こちらは、通常は慢性の比較的軽度の疾患を引き起こす。Ｙ．ペスチス（Y.pestis）は、自然にはノミに寄生しているが、げっ歯類およびヒトに対しても伝染性が強く、全身性で多くの場合致死的な疾患の流行を引き起こす。ペスト感染は、欧米社会では比較的稀であるが、発展途上国では依然として公衆衛生に対する脅威であり続けている。これはヒトからヒトへ空気感染することができ、従って、カテゴリーＡのバイオテロ病原体として指定されている。Ｙ．ペスチスが動物に疾患を引き起こすことができるのは、部分的には、感染に対する正常な非感染性免疫反応（ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を抑制するその内在的能力のためである。現行の予防ワクチン接種の戦略が存在しない場合、自然免疫反応を刺激することができる治療法によって肺ペストからの防御を行い得る。
【００２３】
このように、望ましい広範囲に作用する抗感染薬とは、複数の免疫細胞サブセットに特異的に作用し、複数のサイトカインの協調的放出を誘発するものであろう。この作用の方式は、ウイルスおよび／もしくは細菌感染（特に、治療が困難であるもの）の予防ならびに／または治療において望ましいものであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の一つの目的は、先行技術の欠点の少なくとも１つを克服もしくは改善すること、または有用な別の選択肢を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、架橋させて微粒子としたムラミルジペプチド（ＭＤＰ‐微粒子）が、免疫刺激性核酸モチーフを含有するという驚くべき観察に部分的に基づいており、このことは、本明細書で述べるように、広範囲にわたる抗細菌および抗ウイルス自然免疫反応を誘発する上で中心となる複数の異なる免疫細胞サブセットを活性化する能力をこのＭＤＰ‐微粒子が有することも観察された理由をも説明しうる。以降、この核酸モチーフを含むＭＤＰ‐微粒子を「ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子」と称する。
【００２６】
さらに、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、抗感染自然免疫反応を高める能力を有する１つもしくは２つ以上の追加のリガンド、および／または細菌もしくはウイルス抗原で官能化することで、免疫反応のさらなるブースト／集中を行なうことができる。
【００２７】
第一の態様によると、本発明は、ウイルスおよび／もしくは細菌によって引き起こされる感染の予防的または治療的処置の方法を提供し、その方法は、有効量のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
【００２８】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、自然免疫反応を活性化する。
【００２９】
より好ましくは、自然免疫反応は、ＮＫ細胞、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、または単球の活性化を含む。
【００３０】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、少なくとも１つのサイトカインの放出をさらに誘発および／または刺激する。
【００３１】
このサイトカインは、好ましくは、免疫性／炎症促進性、および／または調節性サイトカインである。
【００３２】
好ましくは、免疫性／炎症促進性、および／または調節性サイトカインは、インターフェロン‐アルファ（ＩＦＮ‐α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ‐γ）、インターロイキン１０（ＩＬ‐１０）、インターロイキン６（ＩＬ‐６）、インターロイキン１‐ベータ（ＩＬ‐１β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐α）、インターロイキン１２（ＩＬ‐１２）、およびＣＤ８抗ウイルス因子などである。
【００３３】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、抗ウイルスおよび／または抗細菌自然免疫の他の態様を動員する。
【００３４】
より好ましくは、抗ウイルスおよび／または抗細菌自然免疫の他の態様は、ＩＦＮ‐αと相乗効果的に作用することができる。
【００３５】
抗ウイルスおよび／または抗細菌自然免疫反応の効能を高めるために、微粒子と結合させるか微粒子内部に含有させることで、ウイルスおよび／もしくは細菌細胞の損傷ならびに／または破壊に効果的である特定の免疫細胞サブセットを刺激する能力を有する少なくとも１つの免疫刺激性リガンド（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇａｎｄ）をＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子に組み合わせることができる。好ましくは、このリガンドは、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ‐１、およびＮＯＤ‐２など、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３６】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、Ｔｈ１型またはＴｈ２型免疫の選択的な誘発が支援されるように設計することができる。さらに、さらなるアジュバントリガンドに加えて様々な免疫原を組み込むことができる能力により、１つもしくは複数の抗原および１つもしくは複数のアジュバントを同時に、ワクチン接種の細胞標的へと選択的に送達するよう働く単一薬剤の構築が可能となる。
【００３７】
１つの実施形態では、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、少なくとも１つのウイルスおよび／または細菌抗原を含む。適切な抗原の例としては、抗原‐８５Ａ、抗原‐８５Ｂ、ＥＳＡＴ、およびＣＦＰ‐１０などのマイコバクテリウムツベルクローシス抗原が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原の任意の組み合わせを用いることができる。好ましいインフルエンザ抗原は、蔓延している細菌株からのヘマグルチニンやノイラミニダーゼ遺伝子から誘導されるものである。ペスト抗原は、トキシン成分であるＦ１、Ｖ、またはこの２つの組み合わせであるいわゆるＦ１‐Ｖ融合抗原から誘導することができる。本発明の組成物と組み合わせて用いることができるその他のウイルスおよび細菌抗原は、当業者に公知であろう。
【００３８】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、その直径が約０．０５から３．０ミクロンである。より好ましくは、その直径は、０．２から２．０ミクロンである。最も好ましくは、その直径は、０．２から１．０ミクロン、または０．５から１．０ミクロンである。
【００３９】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、１つもしくは２つ以上の医薬用または獣医学用の賦形剤、キャリア、または溶媒を含む組成物内に存在する。
【００４０】
好ましくは、ウイルスおよび／または細菌によって引き起こされる感染を予防または治療する方法は、ウイルスおよび／または細菌によって引き起こされる感染の予防および／または治療に効果的な別の治療薬を投与することをさらに含む。
【００４１】
好ましくは、別の治療薬は、同時にまたは逐次投与されるワクチンおよび／または抗生物質である。
【００４２】
対象は、好ましくは、哺乳類であり、より好ましくは、ヒトである。
【００４３】
好ましくは、治療されるべき感染は、インフルエンザ、ペスト、および結核から成る群より選択されるが、これらに限定されない。
【００４４】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＮＫ細胞の増強薬として作用することができる。
【００４５】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＮＫ細胞傷害性の増強薬として作用することができる。
【００４６】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ウイルスおよび／または細菌の複製を阻害する可溶性因子の増強薬としても作用することができる。
【００４７】
第二の態様によると、本発明は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含む抗感染活性を有する医薬組成物を提供し、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は核酸を含み、所望によっては薬理学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００４８】
第三の態様によると、本発明は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含む抗感染活性を有する医薬組成物を提供し、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、細菌および／またはウイルスを損傷および／または破壊および／または抑制するのに効果的である免疫細胞サブセットを刺激する能力を有する１つもしくは２つ以上のリガンドと組み合わせて核酸を含み、所望によっては薬理学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００４９】
第四の態様によると、本発明は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含む抗感染活性を有する医薬組成物を提供し、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、１つもしくは２つ以上の細菌および／またはウイルス抗原と組み合わせて核酸を含み、所望によっては薬理学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００５０】
適切な医薬用または獣医学用キャリアおよび製剤は、当業者に公知であろう。
【００５１】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の核酸成分は、好ましくは細菌ＤＮＡである。さらにより好ましくは、細菌のメチル化されていないＣｐＧに富むＤＮＡである。
【００５２】
第五の態様によると、本発明は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含む組成物を提供し、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＤＮＡを含む。
【００５３】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、Ｔｈ１型免疫反応を誘発する。
【００５４】
その他の治療薬および／または抗感染薬を、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と組み合わせて用いるか、またはＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と結合させてよいことが当然理解される。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子および／またはその他の抗感染薬の投与は、同時であっても逐次であってもよい。逐次投与は、分、時間、日、または週の任意の適切な時間枠で区切って行ってもよい。
【００５５】
従って、第六の態様によると、本発明は、有効量のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含むワクチン組成物を提供する。
【００５６】
本明細書で述べるＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物は、ヒトへの投与を意図する医薬製剤においても獣医学的用途を意図する製剤においても同様に効果的に用いることができることも当然理解される。好ましくは、製剤は、ヒトへの使用を意図するものである。
【００５７】
第七の態様によると、本発明は、細菌および／またはウイルス感染の予防的または治療的処置のための医薬の製造におけるＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の使用を提供する。
【００５８】
文脈から明らかに他の意味に解すべき場合でない限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの単語は、限定的または網羅的な意味ではなく、包括的な意味に解釈すべきであり；すなわち、「含むがこれらに限定されない」という意味に解釈すべきである。
【００５９】
本発明においては、「ムラミルジペプチド微粒子」への言及は、「微粒子」、「ＭＡ」、「ＭＤＰ‐微粒子」、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、「ＭＩＳ‐４１６」、および「ＭＩＳ」と互換的に用いることができる。図において、「ＭＩＳ」、「ＭＩＳ４１６」、および「ＭＤＰ」の用語は、互換的に用いられ、本発明のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を示すものである。
【００６０】
本出願で用いる「抗感染」という用語は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物の殺微生物活性（すなわち、細菌および／またはウイルスの殺傷）および静微生物（ｍｉｃｒｏｂｉｓｔａｔｉｃ）活性（すなわち、細菌および／またはウイルスの成長、増殖、および または複製の阻害／予防）の両方を包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒト末梢血液骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）、形質細胞様樹状細胞、および単球による蛍光標識ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳＡＦ４８８）のインターナリゼーション
【図２】１０μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）と共に培養後７２時間における、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、およびＴＮＦ‐αサイトカイン分泌
【図３】ｐＤＣは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ）による刺激後にＩＦＮ‐αを分泌するが、これはエンドソーム／リソソーム阻害薬によって抑止される
【図４】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ）による精製ヒトＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の直接免疫刺激
【図５】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による刺激後の単球ＴＮＦα分泌の誘発
【図６】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ）による刺激後のヒトＰＢＭＣの自発的ＮＫ殺傷活性（ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ＮＫ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の向上
【図７】１、５、または１０μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＡ）で刺激されたＰＢＭＣ培養物から４８時間で回収した培養上清によって媒介された、ＨＩＶ‐１クレードＡおよびＢのＰＢＭＣウイルスバイオバーデンの抑制
【図８】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による前処理は、エルシニアペスチスのエアロゾル接種からの防御を与える
【図９】感染前の第−１０日にＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＤＰ）によってマウスを前処理することは、エルシニアペスチスからの防御を与える
【図１０】エルシニアペスチスからの防御におけるＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＤＰ）の用量の比較
【図１１Ａ】感染発症後のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）での治療による、インフルエンザＡ型の罹患率および死亡率の抑制
【図１１Ｂ】感染発症後のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）での治療による、インフルエンザＡ型の罹患率および死亡率の抑制
【図１２】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＮＴ‐ＭＤＰ）による予防は、炭疽毒素接種に対する防御を与える
【図１３Ａ】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）アジュバント‐ＯＶＡ免疫原抱合体が、Ｔｈ１ワクチン接種モデルにおいて、細胞性防御免疫を誘発する
【図１３Ｂ】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）アジュバント‐ＯＶＡ免疫原抱合体が、Ｔｈ１ワクチン接種モデルにおいて、細胞性防御免疫を誘発する
【図１４Ａ】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）が、ＨＬＡ‐ＤＲの上方制御と共に、ヒトＰＢＭＣ ｍＤＣおよびｐＤＣによる免疫共刺激分子ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を上方制御することを示す図である。
【図１４Ｂ】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）が、ＨＬＡ‐ＤＲの上方制御と共に、ヒトＰＢＭＣ ｍＤＣおよびｐＤＣによる免疫共刺激分子ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を上方制御することを示す図である。
【図１５】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）が、未処理動物と比較した肺ＭＴｂコロニーの低減により測定した場合、ＭＴｂ ＥＳＴＡＴ抗原の免疫原性を向上させる
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明は、ウイルスおよび／または細菌感染に対する安全で有効な予防法または治療法が存在しないことに動機付けられたものであり、架橋させて微粒子としたムラミルジペプチド（ＭＤＰ‐微粒子）が自然免疫系を刺激する独特で有利な特性に部分的に基づくものである。驚くべきことに、ＭＤＰ‐微粒子が恐らくは細菌由来であるＤＮＡ断片を含有することが発見され、このことから、広範囲にわたる抗感染の自然および適応免疫反応の誘発の中心となる複数の異なる免疫細胞サブセットを選択的に標的とし、活性化するその能力を説明することができる。１つもしくは複数のＤＮＡ断片を含むこの新規なＭＤＰ‐微粒子を、本明細書では「ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子」と称する。
【００６３】
本発明のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物は、それ自体が、免疫系の適切な成分を標的としてこれを活性化し、細菌および／またはウイルスの破壊を補助するのに効果的であるが、この微粒子組成物の効能は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の表面にカップリングさせるかまたはその内部に含有させることができる特定のリガンドおよび免疫原／抗原によってさらに向上および集中（例：特異的免疫の向上）させることができる。
【００６４】
本発明の組成物は、細菌およびウイルスを殺傷することができるが（すなわち、殺微生物性）、細菌およびウイルスの成長／増殖／複製を阻止するように作用することもできる（すなわち、静微生物性）。両方の種類の活性共に、細菌および／またはウイルス感染の予防的または治療的処置において有利である。
【００６５】
本明細書で述べるＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、高レベルのＩＦＮ‐α、ならびに広範囲にわたる自然免疫（特に抗ウイルス免疫の誘発）に対して臨床的に適切であるその他の重要な炎症促進性サイトカインの両方を誘発するように設計されている。重要なこととして、ＩＬ‐１０などの調節性サイトカインが同時に産生されることは、この微粒子が調節された免疫反応を誘発することができることを意味しており、それによって、免疫に基づいた単独療法に付随し得る過免疫刺激（ｈｙｐｅｒ−ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が避けられる。このことはすべて、微粒子製剤中の所望される範囲および大きさの免疫反応を誘発する特定の病原体認識受容体（ＰＲＲ）リガンドの免疫刺激特性を利用することによって達成された。このことは、微粒子の取り込みを重要な自然免疫細胞サブセットに限定し、従って、不適切な種類の細胞によって媒介される臨床的に許容されない副作用が避けられる。
【００６６】
例えば、ＭＤＲ‐Ｍｔｂに対する免疫は、主要なサイトカインであるＩＦＮγ、ＩＬ‐１２、およびＴＮＦαが関与する強力なＣＤ４およびＣＤ８依存性Ｔｈ１免疫の誘発に依存する。これらのサイトカインは、感染したＭΦおよびＤＣをループ機構（ｌｏｏｐ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によって活性化し、一酸化窒素およびスーパーオキシドの合成を介して細胞内Ｍｔｂを標識（prime）し、除去する。興味深いことに、トール様受容体（ＴＬＲ）は、樹状細胞上でサイトカイン合成を調節し、それによって防御性Ｔｈ１反応の増幅に影響を与えることが知られている。新しい研究によると、ＴＬＲのシグナル伝達は、細胞内マイコバクテリアの末路にも影響を与えている可能性があることが示唆されている。
【００６７】
しかし、類似の免疫反応が、その他の細菌およびウイルス感染との闘いに有益であり、従って、本発明の組成物は、広範囲におよぶ細菌およびウイルス感染との闘いにおいて、自然または特異的免疫刺激薬として用いることができることが当然理解される。本発明の組成物の抗感染活性は、殺微生物活性（すなわち、細菌およびウイルスの殺傷）の形で現れてよく、または静微生物活性（すなわち、細菌およびウイルスの成長／複製の阻止）であってもよい。両方の種類の活性共に、対象における細菌もしくはウイルス感染の治療または予防に関して有益である。
【００６８】
抗ウイルスおよび／または抗細菌自然免疫反応の効能を高めるために、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、ウイルスおよび／もしくは細菌細胞の損傷ならびに／または破壊に効果的である特定の免疫細胞サブセットを刺激する能力を有する少なくとも１つの免疫刺激性リガンドと（微粒子と結合させるか微粒子内部に含有させて）組み合わせることができる。適切なリガンドは、記載された病原体分子パターン認識受容体の公知のリガンドから選択することができ、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ‐１、およびＮＯＤ‐２などが挙げられる。これらのリガンドの任意の組み合わせも用いることができる。その他の有用な受容体は、本技術分野で周知であり、当業者であれば容易に同定することができる。
【００６９】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子のバックボーン上に結合し、保持することができる官能基が利用可能であれば、公知の生物活性に基づいて合理的な方法で組み込むことが可能な追加のアジュバント／免疫刺激性リガンドを高密度でカップリングすることが可能となる。例えば、ＮＯＤ‐１ならびにＮＯＤ‐２リガンドは、ヒト樹状細胞のＩＬ‐１２ｐ７０産生およびＴ細胞に関連するＩＦＮ‐γの産生の誘発において、合成脂質Ａ（ＴＬＲ４リガンド）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３リガンド）、ならびにＣｐＧ ＯＤＮ（ＴＬＲ‐９リガンド）と共に相乗効果をもたらすことが示された。同様の方法で、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、Ｔｈ１型またはＴｈ２型免疫の選択的な誘発が支援されるように構築することができる。さらに、さらなるアジュバントリガンドに加えて様々な免疫原を組み込むことができる能力により、１つもしくは複数の抗原および１つもしくは複数のアジュバントを同時に、ワクチン接種の細胞標的へと選択的に送達するよう働く単一薬剤の構築が可能となる。
【００７０】
細胞内エンドソーム／リソソームの低下したｐＨなど特定の環境下にて迅速に開裂可能または復元可能である結合は、種々の生物活性化合物のための送達媒体の開発に有用である。本発明の製剤において、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、微粒子中に共有結合で組み込まれたＮＯＤ‐２リガンドおよびヌクレアーゼ耐性ＴＬＲ９リガンドの両方により、免疫原を抗原プロセッシング／提示細胞へ標的化送達するように作製される。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、免疫原およびＴＬＲリガンドの結合のための、アミノおよび酸化性炭水化物部分を含む追加の官能基を含有する。これらの官能基を利用して、所望される免疫原および またはリガンドを、スクシンアミド、マレイミド、およびアルデヒド結合などの二官能架橋試薬を用いて結合させることができる。さらに、免疫原およびＴＬＲリガンドの両方に組み込むことができる１級および２級アミノ基を直接結合する化学反応を提供する酸化性炭水化物部分が存在する。アセタール結合は、薬物送達において、薬物キャリアの構築、ならびに薬物のキャリアへの結合の両方において、酸不安定性結合として広く用いられてきた。ジアルデヒドを酸不安定性ビルディングブロックとして用いて、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子上に存在する遊離のアミノ基へ生物活性化合物を架橋させることができる。
【００７１】
１つの実施形態では、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、少なくとも１つのウイルスおよび または細菌抗原を含む。適切な抗原の例としては、抗原‐８５Ａ、抗原‐８５Ｂ、ＥＳＡＴ、およびＣＦＰ‐１０などのマイコバクテリウムツベルクローシス抗原が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原の任意の組み合わせも用いることができる。インフルエンザ抗原は、通常、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ遺伝子から、現在蔓延している細菌株に合致するように誘導されるものである。ペスト抗原は、トキシン成分であるＦ１、Ｖ、またはこの２つの組み合わせであるいわゆるＦ１‐Ｖ融合抗原から誘導することができる。
【００７２】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、分解に対して耐性を有することが好ましい。好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子製剤は、ペプシンによる処理、極端なｐＨ、および変性条件に対して耐性を有する。特に、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子製剤は、ａ）ｐＨ３．５でのペプシンによる処理、ｂ）１未満（１ｍＭのＨＣｌ）または１１超（１ｍＭのＮａＯＨ）であるｐＨ、およびｃ）６Ｍの尿素または６Ｍのグアニジン塩酸塩などの変性条件、に対して耐性を有する。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子のＤＮＡ成分は、ヌクレアーゼ（例えばＤＮＡｓｅ Ｉ）に対して耐性を有することが好ましい。
【００７３】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物は、適切ないかなる手段で投与してもよい。本発明による、疾患に対して対象を免疫する方法、または疾患を有する対象を治療する方法では、ワクチン組成物によって形成された溶液を数多くの方法を利用して投与することができる。投与方法の例としては、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、点眼、飲料水を介して、エアロゾル、または鼻内噴霧がある。動物に投与する場合、任意の適切な獣医学的製剤を用いてもよい。上述のものに加えて、製剤は、粉末またはペーストの形状であってよく、飼料に添加するか、または通常の方法で経口投与してよい。適切な製剤プロトコルおよび賦形剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ； Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９ｔｈ Ｅｄ，１９９５（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． ペンシルバニア州、米国）、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，２０００、などの標準的なテキストに見ることができる。
【００７４】
本発明の作用機構に関して特定のいかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子製剤が広範囲にわたる感染病原体を処理する能力は、特にＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の核酸成分により、複数のサイトカインの放出が誘発／刺激されると共に、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ならびに形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）および単球などのその他の自然免疫細胞、が活性化することに帰すると考えられる。
【００７５】
ここで、本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照して、単なる例として説明する。本発明を例を用いて説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、変形および変更を行うことができるものと理解すべきである。さらに、特定の特徴に対して公知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、本明細書に具体的に言及されているのと同様に取り込まれる。
【実施例】
【００７６】
実施例１ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の作製
プロピオニバクテリウムアシニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｎｉ）から単離されたムラミルジペプチド（ＭＤＰ）の複数の繰り返しが、本実施例のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子キャリア複合体のコア構造を形成した。好ましい単量体サブユニットの化学組成を以下に示す。
【００７７】
【化１】
【００７８】
ＭＤＰは、周知の免疫刺激特性を有し、その特性は、免疫機能を増加させるその効果を測定するように設計された研究において広く評価されている。現在のところ、自然源から単離されたＭＤＰと合成ＭＤＰは共に、哺乳類へ投与した場合に強い毒性を伴う。この毒性により、ＭＤＰのアジュバントとしての有効性が制限されてきた。
【００７９】
毒性成分を含まないＭＤＰおよび付随する細菌ＤＮＡ断片を単離する方法は本明細書中に提供される。プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）を中間定常成長期（ｍｉｄ−ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）まで成長させ、当業者に周知の技術を用いて細菌培養物由来の不純物を洗浄除去した。細胞壁および細胞質に含有される疎水性成分を、エタノール／イソプロパノール／水の濃度を上げながら（１０％：１０％：８０％、２５％：２５％：５０％。および４０％：４０％：２０％）高温で順に洗浄することで、段階的に抽出した。次に、イソプロピルアルコールを、エタノールの濃度を下げながら（８０％、５０％、４０％、および２０％）高温で順に洗浄することで除去する。得られたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、次に、６Ｍのグアニジン塩酸塩中に懸濁し、続いて、洗浄用の水中で洗浄し、その５４０ｎｍでの吸光度を濁度標準の吸光度と関係づけすることでその濃度を測定する。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の濃度は、保存して後で使用するために、１０ｍｇ／ｍｌに調節した。
【００８０】
この製剤の分析から、主に１〜３ミクロンの範囲の微粒子サイズで、細菌ＤＮＡと広範に架橋したムラミルジペプチドが明らかになった。このＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、アミノ結合したＬ‐アラニン‐Ｄ‐イソグルタミンジペプチドおよび生物活性成分としての細菌ＤＮＡ断片と共にムラミン酸を含有する。このような微粒子は、上記のように自然源から単離することができ、または、周知の合成手順を用いて合成することもできる（例えば、Ｌｉｕ Ｇ．； Ｚｈａｎｇ Ｓ．−Ｄ．； Ｘｉａ Ｓ．−Ｑ．； Ｄｉｎｇ Ｚ．−Ｋ． Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０（１２），２０００，ｐｐ．１３６１−１３６３（３）； Ｓｃｈｗａｒｔｚｍａｎ Ｓ．Ｍ．， Ｒｉｂｉ Ｅ．， Ｐｒｅｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８０；１０（３）；２５５−６７； Ｏｈｙａ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９９３；８；３５１−３６４）。本方法で作製されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、広い範囲のサイズを有することができるが（例えば、０．０１１〜３０ミクロン）、好ましいサイズは、０．５〜３ミクロンの範囲である。
【００８１】
実施例２ − リガンドおよび免疫原のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子への共有結合
リガンドおよび免疫原のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子への結合は、還元アミノ化を用いることで達成することができる。当業者であれば、安定なカルボニル基を、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる炭水化物の酸化により、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子上、リガンド／免疫原を含有する炭水化物上、またはデキストラン、ポリエチレングリコール、もしくはマンニンブリッジ（ｍａｎｎｉｎ ｂｒｉｄｇｅ）上に作製することができることは理解するであろう。この結果、安定なカルボニル基（アルデヒド）が形成され、次に、これが特定のＴＬＲリガンドおよび免疫原上に存在するアミノ基と自ら反応し、シッフ塩基中間体が形成される。シッフ塩基の形成を行った反応物へシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加することで、不安定なシッフ塩基中間体が完全に還元され、化学的に安定な結合が得られる（以下の図参照）。水素化ホウ素ナトリウムとは異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは十分に温和であり、アルデヒドが非反応性ヒドロキシルへと逆に還元されることが回避される。この方法論的手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ； Ｓｅｒｉｅｓ Ｅｄｉｔｏｒ： Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃｏｉｃｏ （Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、に記載されている。
【００８２】
用いた方法の例は以下の通りである：２０％エタノール中のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（２０ｍｇ）を遠心分離によってペレット化し、水中に再懸濁し、水でよく洗浄する。次に、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子をペレット化し、（ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子５０ｍｇ）／メタ過ヨウ素酸ナトリウム（０．０５〜０．５Ｍ）１ｍＬの濃度で再懸濁し、室温で酸化反応を１時間行う。メタ過ヨウ素酸ナトリウムでの活性化の後、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子懸濁液を遠心分離によってペレット化し、水中に再懸濁し、水でよく洗浄する。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの濃度および反応時間を変化させて、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、リガンド、免疫原などの内部に酸化反応中に作製される活性化部位の数を調節することができる。活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子１個あたり対象免疫原またはリガンド分子の少なくとも１個と、好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子１個あたり対象ペプチドまたはリガンド分子の１０〜１００個と、最も好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子１個あたり対象ペプチドまたはリガンドの１００から１０００個と反応し、これと共有結合する。高度に活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子製剤に関しては、最終濃度が０．５Ｍであるメタ過ヨウ素酸ナトリウムを用い、酸化反応は１時間行う。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの好ましい濃度は５〜３０ｍＭの間である。
【００８３】
メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化の後、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を次にペレット化し、よく洗浄してメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去する。活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、次に、炭酸水素ナトリウムバッファー中（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）の所望される免疫原またはリガンド（例えば、≧１ｍｇ／ｍＬのＴＬＲ９またはＮＯＤ２、重量／重量比２０：１）中に再懸濁し、１８〜２４時間インキュベートする（環境温度）。この反応物を遠心分離し、シッフ塩基中間体を介してＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子に結合した免疫原／リガンドをこの段階で含有するペレットを還元して、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と免疫原／リガンドとの間に安定な共有結合を形成する。数多くの還元剤を用いることができ、この目的のために通常用いられる還元剤の例としては水素化ホウ素ナトリウムがある。シッフ塩基の還元の後、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と免疫原／リガンドとの抱合体をペレット化し、所望されるワクチンバッファー中で洗浄し所望される免疫原／リガンド濃度で再懸濁させる。
【００８４】
免疫原またはリガンドを用いる場合、これとＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子との共有結合は、二官能架橋剤を介して作り出すこともできる。
【００８５】
ホモ二官能イミドエステル架橋剤を介するカップリング
ＤＭＡ、ＤＭＰ、およびＤＭＳ（以下に示す）は水溶性の膜透過性ホモ二官能イミドエステル架橋剤である。イミドエステル官能基は、１級アミンの修飾に利用可能である最も特異的なアシル化基の１つであり、タンパク質／リガンド中の他の求核基に対する交差反応性が極めて低い。さらに、イミドアミド反応生成物は、タンパク質全体の電荷を変化させることがなく、タンパク質／リガンドの自然のコンフォメーションおよび活性が保持される可能性がある。タンパク質／リガンドの結合は、２段階反応を介して達成され、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子をまず、立体障害を回避するために必要であるスペーサーアーム長に基づいて以下に示す３つから選択される所望のイミドエステル架橋剤と共にインキュベートする。
【００８６】
【化２】
【００８７】
まず、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子上に存在する遊離のアミノ基を、０．２Ｍのトリエタノールアミン、ｐＨ８．０（反応バッファー）に溶解した２０倍モル過剰量の架橋剤と共にインキュベートすることで飽和させる。この反応混合物を室温で３０分間インキュベートし、遠心分離および反応バッファーでの洗浄（３×）により、過剰の架橋剤を活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子から除去する。活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、所望のリガンドを含有する反応バッファーへ再懸濁させる。この反応混合物を室温で１〜２時間インキュベートし、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子‐リガンド抱合体をペレット化し、グリシン緩衝食塩水（０．０５Ｍ グリシン、ｐＨ６．５、ＮａＣｌ ０．９％）で洗浄し（×３）、サイトカイン誘導アッセイ（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）により生物活性を測定する。還元的アミノ化結合法について上記で概説したものと同様の割合の微粒子および免疫原／リガンドを用いる。
【００８８】
作用の機構を限定するものではないが、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子‐免疫原／リガンド組成物は、選択的な細胞の取り込み、タンパク質の半減期、およびＭＨＣの免疫学的現象による抗原提示に影響を与えることによって免疫原性に影響する可能性が高いことを述べておく。２つ以上の対象免疫原／リガンドによる免疫化が所望される場合、対象免疫原／リガンドとＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子との複数の抱合体のカクテルを、カクテルに導入された各対象のペプチドの免疫原性が最適化される比で個々の抱合体を混合することによって作製することができる。この構成では、単一の抗原提示細胞／応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｃｅｌｌ）による抗原提示を高めるのに十分な免疫原が各微粒子抱合体上に利用可能に存在する（微粒子あたり１００〜１０００個の免疫原‐リガンド）。対象免疫原／リガンドの免疫原性／活性を、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子キャリアあたりの対象ペプチドの数、および所望によっては、ワクチンカクテル中の免疫原の比率、の両方を調節して最適化し、所望の免疫反応を達成することができる。この構成では、抗原提示細胞による抗原プロセッシングにより、ＭＨＣ相互作用を通して、抗原提示細胞の細胞表面に高密度、通常は１００個超、最も多くの場合５００個超のペプチド、の提示がなされる。
【００８９】
結合のためのその他の方法としては、マレイミド結合の化学を利用することもできる。マレイミド結合は、スルホ修飾したスルホスクシンイミジル‐４‐シクロヘキサン‐１‐カルボキシレートを、スルホ‐ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いる標準プロトコルに従って用いるか、またはスルフヒドリル結合に適するその他のリンカーを用いて実施することができる。
【００９０】
実施例３ − ：末梢血液単球、形質細胞様（ｐＤＣ）、および骨髄（ｍＤＣ）樹状細胞による蛍光標識ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子のインターナリゼーション
全血を５０、２５、１０、または１μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８で標識したＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と共にインキュベートし、３７℃で３０分間インキュベートした。単球、形質細胞様、および骨髄ＤＣを、一群の蛍光抗体（ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて識別し、ＣＤ４５、ＢＤＣＡ‐１、ＢＤＣＡ‐２、細胞系マーカー、およびＣＤ１４発現に基づいてゲーティングした（ｇａｔｅｄ）。ＡＦ４８８‐微粒子をインターナライズした各サブセットの％を図１に示す。これらの細胞の免疫刺激は、広範囲におよぶ抗感染防御を開始させる中心となるものであり、従って、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の重要な細胞標的である。
【００９１】
実施例４ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子で刺激されたヒト全血によって媒介される全身自然炎症促進性反応（ｇｅｎｅｒａｌ ｉｎｎａｔｅ ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の特徴付け：
完全培地＋５％Ａｂ血清中の１／１０希釈ヒト全血を、２４ウェル組織培養プレート中にて、１０μｇ／ｍＬのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と共に培養した。このサンプルを７２時間インキュベートし、細胞を含まない上清を回収してサイトカイン含有量を分析した。上清は、フローサイトメトリービーズアレイ法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍ ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインマルチプレックスキット）を用いて分析した。図２で測定したサイトカインは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が免疫刺激性であり、自然免疫細胞の動員および成熟、ならびに自然免疫の誘発の中心となるサイトカインを誘発することを示している。
【００９２】
実施例５ − ｐＤＣは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による刺激後にエンドソーム／リソソームに依存する形でＩＦＮαを分泌する。
ヒトｐＤＣを、ＢＤＣＡ‐２＋細胞の磁気ビーズ選別を用いてＰＢＭＣから精製した。ソートした細胞（１０６／ｍｌ）を、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子またはＴＬＲ９ Ａ型イガンド（ｉｇａｎｄｓ）と共に、５μｍのクロロキンの非存在下または存在下にて１６時間培養した（完全培地＋５％Ａｂ血清）。フローサイトメトリーサイトカインビーズアレイ法を用いて、上清をＩＦＮα含有量について分析した。図３に示す結果は、強力な抗ウイルスサイトカインであるＩＦＮαがｐＤＣ用量に依存して誘発されたことを示している。これは、微粒子の核酸成分によって媒介されるが、該核酸成分は細胞のエンドソーム区画内に存在するＴＬＲ９リガンドを介して作用する可能性が最も高いと思われる。このことと一致して、微粒子によるＩＦＮαの誘発は、リソソーム／エンドソーム阻害薬であるクロロキンによって阻害可能である。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子がｐＤＣのＩＦＮ‐α産生を活性化することができるということは、これらの細胞がインビボでのＩＦＮ‐αの代表的な自然源であることから、非常に有利である。ＩＦＮ‐αの自然産生を標的とすることができる薬剤は、ウイルス感染の治療に対して、組換えＩＦＮ‐αよりも毒性の低い、代替的な治療レジメンを提供する。
【００９３】
実施例６ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による４０時間の刺激後の、精製ＮＫおよびＮＫＴ細胞によるＩＦＮγ、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＭＩＰ‐１α、およびＴＮＦαの産生
ヒトＣＤ５６＋細胞を、ＭＡＣＳポジティブ選別ビーズを用いて９９％の純度まで全血から精製し、これによって、ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）およびＮＫＴ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３＋）の両方が単離される。次に、精製した細胞を、無刺激で、ＩＬ‐２（５００Ｕ／ｍｌ）と、ＩＬ‐１２（５０ｎｇ／ｍｌ）と、またはＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（４０、２０、１０、および５、および１μｇ／ｍｌ）と共に４０時間培養した（７．５×１０５／ｍｌ）。 フローサイトメトリーサイトカインビーズアレイ法を用いて、上清をＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＧＭ‐ＣＳＦ、およびＭＩＰ‐１αの含有量について分析した。図４から分かるように、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦα、ならびにＭＩＰ‐１αおよびＧＭ‐ＣＳＦの産生を明らかに刺激している。ＮＫ細胞は、ウイルス感染した細胞の破壊において重要な役割を担っており、これらの因子は、ＮＫ細胞の免疫活性化の特徴である。ＮＫ細胞、およびＮＫ細胞由来の因子は、マクロファージおよびその他の貪食性細胞防御の動員ならびに促進を支援することもできる。
【００９４】
実施例７ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による２２時間の刺激後の単球によるＴＮＦα産生の誘発
ヒトＰＢＭＣ（１０６／ｍｌ）を、２０、１０、５、および１μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と共に２２時間培養した。タンパク質輸送阻害薬（ブレフェルジンＡ）を培養の最後の６時間に渡り添加し、サイトカインの蓄積を可能にした。固定化可能バイオレットｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を標識し、洗浄し、続いてＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて固定／透過処理し、続いて、抗ＴＮＦα‐ＡＰＣ‐Ｃｙ７モノクローナル抗体で標識した。図５Ａに示すように、生存単球は、ＦＳＣ ｖｓ 高ＳＳＣゲーティングと組み合わせたｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素排除に基づいて識別した。図５Ｂでは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の全濃度において、ＴＮＦαを発現するゲーティングされた生存単球の割合を測定した。ＴＮＦα発現単球の割合が最大であるのは、２０μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子における７３．８％である。ＴＮＦαは、ＰＭＮ顆粒球の貪食および殺微生物活性を活性化する重要なサイトカインである。
【００９５】
実施例８ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による刺激後のヒトＰＢＭＣの自発的ＮＫ殺傷活性の向上
ＰＢＭＣを、４０、２０、１０、および５μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と共に培養した。既知のＮＫ細胞活性薬であるＩＬ‐２（５００Ｕ／ｍｌ）およびＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ／ｍｌ）をアッセイのポジティブコントロールとして用いた。１８時間の培養の後、ＰＢＭＣを新鮮な培地中で洗浄し、１００：１、１０：１、および１：１のエフェクター：標的比にて、蛍光標識したＮＫ感受性を有するＫ５６２腫瘍標的に対する細胞傷害性について試験した。腫瘍細胞の殺傷は、ゲーティングした蛍光Ｋ５６２標的のフローサイトメトリー生死判別を用いて４時間後に測定した。結果を図６に示す。これらのデータは、機能的ＮＫ活性がＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子によって誘発されることを示している。ＮＫの細胞殺傷の活性化は、ウイルス感染した細胞を殺傷することが知られていることから、望ましいものである。
【００９６】
実施例９ − １、５、または１０μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子で刺激されたＰＢＭＣ培養物から４８時間で回収した培養物ｓ／ｎ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｓ／ｎ）によって媒介される、ＨＩＶ‐１クレードＡおよびＢによるＰＢＭＣウイルスバイオバーデンの抑制
３３体積／体積％のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子刺激培養物ｓ／ｎ（０．２μｍでろ過）の添加の前に、ＰＢＭＣ培養物をＨＩＶ‐１ウイルスストックと共に２４時間予備インキュベートした。ＨＩＶ‐１複製の阻害のポジティブコントロールとして、組換えヒトＩＦＮａを１０、１００、または１０００Ｕ／ｍｌで添加した。ＨＩＶ‐１感染後の第５日にＰＢＭＣを回収し、ＨＩＶ‐１感染細胞の％を、生細胞の細胞内ｐ２４抗原発現のフローサイトメトリー分析を用いて測定した。感染の阻害パーセント（％）は、細胞＋ウイルス培養物単独の平均バイオバーデンに対する値として算出した。結果は、マイクロ培養物の３つの反復サンプルから得た＋／−ＳＥＭを示す（図７）。ＤＮＡアポトーシス／細胞周期分析（データ示さず）によって測定されたＰＢＭＣ培養物の全体の生存率に対して、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子活性化ｓ／ｎまたはＩＦＮａの影響はなかった。これらのデータは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、ウイルス複製を直接阻害することができる可溶性因子を誘発することを示している。
【００９７】
実施例１０ − 感染（ペスト）に対するＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の影響
示した計画に従ってＣ５７ＢＬ６マウスにＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（１００μｇ、腹腔内）を受けさせ、続いて第０日にエルシニアペスチスを接種した。
【００９８】
【表１】
【００９９】
Ｙ．ペスチス感染に関しては、１×１０５ＣＦＵの菌株ＫＩＭ Ｄ２７の鼻腔内投与でマウスを感染させた。これはおよそ１０ＬＤ５０に相当し、ＬＤ１００に近い。未処理のコントロール動物はすべて、第＋８日までに感染によって死亡した（図８）。処理動物の中には生存したものもあった。生存動物の数が最も多かったのは（５体中２体）、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を第−１０日に受けた２つのグループであった。最適な結果は、第−１０日の処理で得られると推定される。この最初の発見をさらに明らかにするために、さらなる実験を行った（図９、１０）。これらの実験では、感染前の第−１０日に、５０または５００μｇのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を投与した。５０μｇの用量の方が、５００μｇの用量よりも良好な防御をもたらすことが分かった。両用量共に、食塩水コントロールよりも良好な防御をもたらした。全体として、この実験は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が肺ペストに対する防御を提供することができることを示唆している。
【０１００】
実施例１２ − インフルエンザへの曝露後のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による処理により、生存率の増加および体重減少の改善によって測定される防御が得られる
マウス： 野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを最初はＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー，メイン州）より購入し、次にこれをＴｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙで飼育した。マウスはすべて、Ｔｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って飼育し、管理した。
【０１０１】
ウイルス感染． インフルエンザＡ型ウイルスのＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株を最初はＤ．Ｍｏｒｇａｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ラホヤ，カリフォルニア州）より入手した。卵齢１０日のニワトリ有胚卵の尿膜腔内でウイルスストックを作製し、−７０℃で保存した。マウスにイソフルランで軽く麻酔をかけ、０．３ＬＤ‐５０のインフルエンザを鼻腔内接種した。感染後、マウスの体重を毎日測定し、３０％を超える体重減少を示したマウスはすべて瀕死であると見なした。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を食塩水で希釈し（５０μｇまたは２５０μｇ）、これかまたは食塩水単独を、感染の翌日に尾静脈注射によって静脈内投与した。
【０１０２】
統計． 体重減少データはスチューデントｔ検定で解析した。生存率データはログランク検定で解析した。いずれのケース共に、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０１０３】
結果を図１１に示す。Ａ）ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の二つの用量はどちらも、体重減少に同様の影響を与えた。マーク（＊）で示したケースでは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子治療が、体重減少を大きく軽減した。Ｂ）初期体重の３０％超の減少を示した動物は、瀕死であると見なし、安楽死処理を行った。データは、２つの独立した実験から集められる（グループあたりのマウス総数ｎ＝１５）。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子によって処理した動物の罹患率の減少は、統計的に有意であった（ログランク検定によりｐ＝０．０３５）。これらの発見は、ウイルス感染が確立された場合でさえ、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の一回投与による治療が、インフルエンザ感染に関係する罹患率および死亡率の両因子を改善することができることを示している。このことは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が機能的に適切なレベルの抗ウイルス因子を誘発する能力を持つことをさらに示している。
【０１０４】
実施例１４ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子免疫抱合体は適応細胞性Ｔｈ１免疫を誘発する。
適応細胞性Ｔｈ１免疫は、結核およびウイルス感染などの特定の感染疾患の防御にとって重要である。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子免疫抱合体のＴｈ１アジュバント特性を測定するには、腫瘍ワクチン接種モデルが有用である。ＯＶＡ腫瘍抗原は、十分に特性決定された腫瘍抗原であり、スルフヒドリル結合を用いてこれをＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子へ共有結合させた。図１３Ａ、Ｂから分かるように、ＯＶＡ‐ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子免疫抱合体のワクチン接種により、養子移入されたＯＴ‐Ｉ ＣＤ８＋細胞の末梢増殖（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が誘発され、続いて、腫瘍予防ワクチンモデルにおける抗腫瘍免疫が誘発される。
【０１０５】
（Ａ）同系の精製ＣＤ８＋ＯＴ‐Ｉ細胞（１０３）を、静脈内送達によってマウスの複数のグループ（Ｃ５７／Ｂｌ６；ｎ＝１０）へ養子移入し、続いてＯｖａの２５μｇ、ＯＶＡ‐ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）免疫抱合体の２５μｇ、または２００ｎｇのα‐ガラクトセラミドと混合したＯＶＡの２５μｇ（Ｔｈ１反応に対する静脈内免疫化のポジティブコントロール）によって静脈内免疫化を行なった。免疫化後の第３５日まで、種々の時間点で末梢血液をサンプリングした。ＯＴ‐Ｉ細胞の増殖を、ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｖα２＋フェノタイプ（ＯＴ‐Ｉ特異的）を有するＴ細胞に対するフローサイトメトリー分析を用いて測定した。（Ｂ）免疫化後第３６日に、１０６のＢ１６‐ＯＶＡ腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍の成長をモニタリングした。
【０１０６】
これらの発見は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子をアジュバントとして用いたワクチンが、防御Ｔｈ１免疫反応を誘発することができることを示している。このことは、結核など、新規なＴｈ１ワクチンアジュバントの開発を必要とする特定の感染疾患に対する効果的なワクチンの作製において特に重要である。
【０１０７】
実施例１５ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＨＬＡ‐ＤＲの上方制御と共に、ヒトＰＢＭＣ ｍＤＣおよびｐＤＣによる共刺激分子ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を上方制御する
ヒトＰＢＭＣ（１０６／ｍｌ）をＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子で刺激した（完全培地＋５％Ａｂ血清）。アッセイポジティブコントロールとしてＣ型ＣｐＧおよびＨＫＳＡを用いた。刺激後２２時間にて、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ‐ＤＲの共発現を、ゲーティングした生存ｍＤＣおよびｐＤＣ上にてマルチパラメータフローサイトメトリーを用いて測定した。
【０１０８】
ＡＰＣの細胞レパートリーの中で、ｍＤＣおよびｐＤＣは共に、インビトロおよびインビボの両方において、自然免疫反応の誘発ならびに強固な一次および二次Ｔ細胞適応免疫反応の誘発に不可欠である。従って、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＣＤ８３およびＣＤ８６共刺激分子と共にＡｇ提示ＭＨＣクラスＩＩ分子が、加熱殺菌Ｓ．アウレウス（ｈｅａｔ ｋｉｌｌｅｄ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＨＫＳＡ）による場合と同程度に上方制御されることによって示されるように、インビトロにおけるＰＢＭＣ ｍＤＣの成熟の強力な誘発薬であることが示された。ｐＤＣ成熟の共分析からも、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、ＣＤ８６の上方制御と共に、ＨＬＡ‐ＤＲの著しい上方制御を誘発することができることが示されている。ＣＤ８３の発現は、対照的に、合成Ｃ型ＣｐＧなどその他のｐＤＣ成熟刺激薬で見られるよりも低い程度での上方制御である。ｐＤＣおよびｍＤＣに対するＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子活性の大きさが異なる理由の一部は、ｍＤＣがｐＤＣよりも貪食性が強く、従って微粒子を選択的にインターナライズすることにある。これらの発見は、図１４に示されており、自然免疫刺激薬としてのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の使用を支持するものである。
【０１０９】
実施例１６ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、マウスにおけるＥＳＡＴ‐６ Ｍｔｂ抗原の免疫原性、および薬物耐性Ｍ．ツベルクローシスのクリアランスを向上させる。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、マウス１体あたり１０５ＣＦＵの薬物耐性Ｍｔｂ株で静脈内感染させ、感染を１４日間進行させた。続いて、Ｔｉｔｅｒｍａｘアジュバント、もしくはＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子アジュバント中の、またはアジュバントなしの組換えＭｔｂ ＥＳＡＴ‐６タンパク質のマウス１体あたり２５μｇでマウスを処理し、この処理は第１４日、１８日、および２１日に行った（マウス１体あたり３回投与）。マウスを第２８日に屠殺し、臓器のホモジネートを７Ｈ１１寒天上に播種することで肺ＣＦＵをカウントした。１つの時間点あたり３体のマウスを分析した。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、未処理動物と比較して、ＭＴｂ肺コロニーの形成の著しい軽減を誘発した。対照的に、比較アジュバントであるＴｉｔｅｒｍａｘは、ＥＴＳＡＴの免疫原性を大きく向上させることはなかった（図１５参照、＊印は、ｔ検定による有意差を示す）。
【０１１０】
本発明を特定の好ましい実施形態および例を参照して説明したが、本発明の趣旨および本明細書で提供される開示事項に沿った変形例も意図されていることが当然理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗感染薬組成物の使用、ならびに、特には、病原体に対する自然および／または特異的免疫反応を高めるための抗感染薬としての免疫刺激微粒子の使用に関する。
【０００２】
本発明は、主として、病原体によって引き起こされる疾患と闘うように免疫細胞上に作用することが可能な、広範囲に作用する抗感染薬としての使用のために開発されたものであり、以下においてはこの用途に関連して説明される。しかし、当然のことながら本発明はこの特定の使用分野に限定されるものではない。
【背景技術】
【０００３】
本明細書全体を通し、先行技術に関する考察はいずれも、当該先行技術が周知であることまたは本技術分野における共通の一般的知見の一部を形成することを認めるものとしてみなされるべきでは決してない。
【０００４】
免疫系は、自然（非特異的）免疫系および適応（特異的）免疫系と称される２つの主要な区分から成る。両系は協調して効果的な反応を産み出すが、多くの点で異なっている。適応免疫系は、病原生物と反応するのに時間を必要とし、抗原特異的であり、免疫記憶を示す。これとは対照的に、自然免疫系は、病原体へのより素早い反応を示し、抗原特異的ではなく、免疫記憶を示さない。
【０００５】
適応（特異的）免疫系には２つの種類があり、体液性免疫と細胞性免疫が含まれる。体液性免疫は、外来性の抗原に対する抗体の産生に関与する。抗体はＢ‐リンパ球によって産生される。細胞性免疫は、外来性の抗原を持つ感染細胞に作用するか、またはその他の細胞を刺激して感染細胞に作用させるＴ‐リンパ球の活性化に関与する。哺乳類免疫系の両方の種類共に疾患との闘いにおいて重要である。体液性免疫は、細菌性病原体およびトキシンに対する主たる防御ラインであるが、長期間作用する防御免疫にとっては、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔリンパ球の誘発が不可欠であると考えられる。
【０００６】
自然免疫は、感染に対する最初の防御ラインであり、多くの微生物に一般的に見られる病原体分子パターン認識受容体（ＰＲＲ）を利用して炎症促進性および抗ウイルス性サイトカインを迅速に誘発する。これらの経路の特異的な活性化因子は、健康なホストおよび免疫低下ホストのいずれにおいても、ウイルス感染に対する治療に有益である可能性がある。ＰＲＲに対するリガンドの識別、及びこれらのシグナル伝達カスケードに関する知見の増加の結果、所与の病原体に対する好ましい免疫反応の誘発薬として選択的ＰＲＲリガンドが開発されてきた。
【０００７】
非特異的免疫刺激薬、またはアジュバントを、非特異的免疫の向上／誘発のための手段として用いることに対する関心が急速に高まりつつある。「アジュバント」という用語は、固体への投与またはインビトロでの試験を行った場合に、免疫細胞特異的免疫活性の全体的な上方制御を誘発することで作用する化合物を表すものとして広く用いられる。
【０００８】
非常に様々な物質がアジュバント活性を有することが示されているが、一般的な医療への使用が認可されているアジュバントはミョウバンのみであり、これが最初に使用されたのは５０年以上前である。ミョウバンの次としては、鉱油および不活性化結核菌を含有するフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）が最初は広く用いられ、「代表的存在（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）」と見なされたが、肉芽腫を形成することから使用されなくなった（Ｓｔｉｌｌｓ ２００５）。
【０００９】
グラム陽性およびグラム陰性の分類の細菌ペプチドグリカンに一般的に見られるジペプチドであるムルミルジペプチド（ｍｕｒｕｍｙｌ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）（ＭＤＰ）の免疫刺激／調節特性の識別は（Ｉｎｏｈａｒａ，２００３；Ｋｕｆｅｒ，２００６）、化学的に明らかにされ、十分に活性である免疫アジュバントとしてのＭＤＰの臨床的な応用を目的とする免疫薬理学的研究へと繋がった。このような期待は、その毒性および不良な薬物動態プロファイル、すなわちＭＤＰの体内からの急速なクリアランス、を主たる理由としてＭＤＰ自体が臨床用途に適さないことが認識されたことにより、間もなく失望へと変わった（Ｌｉｄｇａｔｅ，１９９５；Ｔｒａｕｂ，２００６）。発熱性の低減または排除の試みは、その結果として誘導体の製剤化をもたらし、そのうちのいくつかは、ムラブチド（Ｍｕｒａｂｕｔｉｄｅ）を例とする可溶性の単量体の形態で臨床試験に用いられている（Ａｕｄｉｂｅｒｔ，１９８４；Ｂａｈｒ，１９９５；Ｖｉｄａｌ，２００１）。
【００１０】
上述のＭＤＰ製剤とは対照的に、ＭＤＰに帰する望ましくない副作用は持たないが、免疫刺激特性の向上は達成されるＭＤＰ類似体が開発された（オーストラリア特許第７３２８０９号）。このＭＤＰの無毒性の形態（ＮＴ‐ＭＤＰ）は、ほとんどのアジュバントがそうであるように、天然のタンパク質、遺伝子組換えタンパク質、合成ペプチド、およびその他の免疫性物質に対する特異的な免疫反応を高めるために元々は開発されたものであり、すなわち、適切な抗原と組み合わせることで従来からのアジュバント‐抗原複合体として用いられたものである。
【００１１】
従来から、感染と闘うために細菌アジュバント（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ）を単独で免疫療法に用いて非特異的免疫系をブーストすることは行われていない。これは部分的には、先行技術のアジュバントは、適切な免疫細胞を特異的に活性化することができず、従って適切な免疫反応を活性化することができないためである。先行技術のアジュバントは、適切ではない細胞種によるサイトカインの産生を誘発し、それにより様々な種類の大量のサイトカインが全身的に発現し、それによって重度の望ましくない副作用が引き起こされる。そのため、先行技術のアジュバントを独立した免疫治療薬として用いることはできない。
【００１２】
いくつかの自然免疫反応は、ウイルス感染の制御に寄与していると考えられている。このようなエフェクター機構は多面的であり、この機構には、直接の抗ウイルス活性、ならびに感染した宿主免疫細胞に対する、これらの細胞の排除に寄与する免疫調節効果が含まれる。直接の抗ウイルス活性は、ＣＤ８抗ウイルス因子（ＣＡＦ）およびＩＦＮ‐αなどの、ウイルスの転写に直接影響を与える能力を有する可溶性因子を含むことができる。マクロファージおよび樹状自然免疫細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）によって分泌された、ＴＮＦ（ＩＦＮ‐γと共に）などの免疫調節性／炎症促進性サイトカインは、ウイルス感染細胞に作用することができ、このことにより、ＴＮＦによって媒介される細胞溶解への感受性の高まりが見られる。さらに、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が媒介するウイルス感染細胞の殺傷などの細胞機構は、抗ウイルス自然免疫の別の重要な一面を構成している。
【００１３】
その他の広範囲にわたる自然サイトカイン（ｉｎｎａｔｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）が、抗ウイルス免疫の態様を制御する生物機能を媒介することができるが、高レベルのＩＦＮ‐α／βが、ウイルス感染に関しては支配的であり、その他の自然反応（ｉｎｎａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を制御するように作用していると考えられる。Ｂ／Ｃ型慢性肝炎などの種々のウイルス性障害、ならびに広範囲にわたるヒトの癌の治療におけるＩＦＮ‐αの臨床的な有用性は、ウイルスの複製を阻止する多面的なホスト防御経路を作動させる支配的な一連の抗ウイルス遺伝子（ｄｏｍｉｎａｎｔ ａｒｒａｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅｓ）を誘発するその能力に帰する。臨床用途のための現在のＩＦＮ‐α製品は、遺伝子組換えタンパク質または単一のアイソフォームの高純度のタンパク質であり、これらは単独療法として、または他の抗ウイルス薬と組み合わせて用いられる。しかし、このような治療法は耐容性が良くなく、低い応答効率を伴う。このことは、天然の複数のＩＦＮ‐αアイソフォームを生理的に適切なレベルで誘発することができるだけでなく、ＩＦＮ‐αと相乗効果的に作用する可能性が高い、抗ウイルス自然免疫の他の態様をも動員することができる新たな手法が必要であることを裏付けるものである。
【００１４】
ＮＫ細胞は、ウイルス感染に対する自然防御への、機能的に異なる重要な寄与体である。免疫刺激性化合物による内在性ＮＫ細胞活性の向上は、臨床的に適切である別の抗ウイルス治療手法である。さらに、ＮＫ細胞は、ＩＦＮ‐αとは異なる機構によって、ウイルスに感染した細胞を認識してこれを破壊することができることから、ＩＦＮ‐αの直接の効力に対する耐性を獲得したウイルスを標的とする能力を有する。ＩＦＮ‐αは、ＮＫによる殺傷（ＮＫ ｋｉｌｌｉｎｇ）の活性化に関して中心的な役割を担っており、さらに、ＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐１２などのその他の重要な自然免疫サイトカインと相乗効果を起こしてＮＫ細胞の機能を上方制御し、適応細胞性免疫を促進する。従って、ＮＫ抗ウイルス機構を十分に利用するためには、その他の自然免疫細胞（例えば形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍｏｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）（ｐＤＣ）および単球など）の免疫刺激が望ましい。
【００１５】
細菌感染については、その他の自然免疫機能、特に貪食細胞機能が重要であり、この場合、貪食された病原体は活性酸素または窒素種にさらされるか、またはリソソーム酵素によって破壊される。分解された抗原は、次に、マクロファージによってＴ細胞に提示されて、適応免疫反応が誘発され得る。細菌病原体は、貪食細胞内でのその末路に関して２つの群に分けられ：細胞外細菌は貪食の後すぐに殺傷されるが、通性細胞内細菌はマクロファージが免疫活性化されていない限り細胞内殺傷に対して耐性を有する。細胞外細菌は化膿性感染を引き起こし、通性細胞内細菌は、肉芽腫性感染である。体液性免疫機構（抗体、補体）は、主として細胞外細菌を処理し、一方、細胞性免疫機構（Ｔ細胞、マクロファージ）は、通性細胞内細菌を処理する。
【００１６】
現在利用可能である治療法での治療が依然として困難である細菌およびウイルス感染は数多く存在する。例えば、結核（ＴＢ）は最も古くから知られるヒト病原体であり、単一の細菌体によるヒトの死因の第一位である。全人類のほぼ３分の１が、その病因体であるマイコバクテリウムツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）に感染していると推計される。ＴＢは、１年間におよそ８００万人の新患が見られ、年間の死亡者数は約２００万人である。多剤耐性（ＭＤＲ）および異常薬剤耐性（ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｉｌｙ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（ＸＤＲ）結核は、死亡率および罹患率を制御する上で重大な問題を引き起こしている。
【００１７】
結核は、小集団で無期限に存続し、突発的に再活性化されて、薬物に対して感受性の高い細菌株であっても治療が困難である疾患を発症し得る。薬物治療が困難であることから、予防および治療のためのワクチン接種によってＭＤＲ‐Ｍｔｂを抑えることが、ますます有効な一連の戦略となりつつある。歴史的には、らい腫性ハンセン病における多大な細菌存在量（ｈｅａｖｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｕｒｄｅｎ）を、ＢＣＧワクチン接種によって低減することができており；ＭＤＲ結核における細菌存在量を低減するかまたはこれを除去するための同様の手法が緊急に求められている。
【００１８】
結核の効果的な制御は、２段階の介入治療を含むと考えられ：すなわち、一次曝露（一次ワクチン接種）の後の感染発症の予防、およびＢＣＧワクチン接種を行った個体の免疫活性化による疾患の再活性化の予防（ブースターワクチン接種）である。ＭＤＲ‐Ｍｔｂの制御における主たる欠陥は、このような免疫化の様式に対処することができる効果的なワクチンが存在しないことである。さらに、ＭＤＲ‐Ｍｔｂの治療に薬物は効果的ではなく、従って、治療ワクチン接種が求められている。野生型Ｍ．ツベルクローシス（M.tuberculosis）由来の弱毒生ワクチンは、ＢＣＧワクチンと同様の予防効果があるが、安全性の問題によって制限されている。より短期間の予防効果を有する数多くの遺伝子組換え抗原およびＤＮＡワクチンが同定されているが、ブースターを必要とする。
【００１９】
残念ながら、ＢＣＧワクチンは、小児結核に対しては不定的な効果があるが、成人結核または再感染に対しては効果がない。ＭＤＲ結核は、通常、再感染の結果であり、従って、ＢＣＧワクチン接種は、薬物に感受性を持つ細菌株、またはＭＤＲ‐Ｍｔｂ細菌株のこの態様の制御にはほとんど効果がない。さらに、Ｍｔｂは、マクロファージの内部に隠れており、免疫認識を妨害する。弱毒化ＢＣＧワクチンでさえマクロファージ（ＭΦ）および樹状細胞（ＤＣ）の特別の区画内に隠されてしまい、免疫認識が低下する。従って、ＢＣＧは少なくとも２つの重要な欠点を有する。１つ目は、防御抗原となる可能性のある抗原のすべてを含有しているわけではないことであり、２つ目は、能動的に免疫反応を妨害することである。
【００２０】
結核は、強力なＴｈ１免疫によって制御され、これは、逆説的なことに、抗体が支配的である（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｍｉｎａｎｔ）Ｔｈ２反応、およびＭｔｂ由来の産物に誘発される抑制性制御性Ｔ細胞（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｔ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）によって逆制御される。従って、ワクチンの媒介によるＭＤＲ結核の免疫制御は、他のＴ細胞反応を犠牲にしてＴｈ１免疫を選択的に誘発するワクチンの使用が必要であり、合理的なワクチン設計の重要な構成成分として、Ｔ細胞分化を歪めることができるアジュバントの役割が強調される。残念ながら、最小限のブースター用量で長期間持続する免疫を誘発することができるアジュバントの機構に関する理解に、大きな空白が存在する。
【００２１】
インフルエンザ感染は、小児および高齢者に著しい罹患率と死亡率を引き起こす。インフルエンザ感染に付随する重度の合併症としては、肺炎、呼吸不全、ショックおよび脳疾患などの非呼吸性の症状、ならびに基礎慢性疾患の悪化が挙げられる。インフルエンザに関連する死亡は、ウイルスの一次感染に直接関連する場合もあり、または、二次合併症に起因する場合もある。ある場合には、疾患の発症から死亡までが急速に起こりうる。ワクチン接種によってある程度の予防を行い得るが、毎年の遺伝的浮動の範囲は、ワクチンと流行するウイルス株とがミスマッチとなる可能性が高いことを意味する。好ましいワクチン製剤とは、毎年発生する急速なインフルエンザ株の変異に適合させるための毎年の再製剤化を必要としないものであろう。ワクチンはインフルエンザの制御に必須のツールであるが、ワクチンが有効でない場合、またはインフルエンザがワクチン接種を受けていない個体もしくはワクチン接種を受けていない集団に広がった場合（エピデミック）、自然免疫療法が特に有利となり得る。
【００２２】
ペストは、エルシニアペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）によって引き起こされ、これは、腸内病原体であるＹ．シュードツベルクロシス（Ｙ． ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から進化したものであり、こちらは、通常は慢性の比較的軽度の疾患を引き起こす。Ｙ．ペスチス（Y.pestis）は、自然にはノミに寄生しているが、げっ歯類およびヒトに対しても伝染性が強く、全身性で多くの場合致死的な疾患の流行を引き起こす。ペスト感染は、欧米社会では比較的稀であるが、発展途上国では依然として公衆衛生に対する脅威であり続けている。これはヒトからヒトへ空気感染することができ、従って、カテゴリーＡのバイオテロ病原体として指定されている。Ｙ．ペスチスが動物に疾患を引き起こすことができるのは、部分的には、感染に対する正常な非感染性免疫反応（ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を抑制するその内在的能力のためである。現行の予防ワクチン接種の戦略が存在しない場合、自然免疫反応を刺激することができる治療法によって肺ペストからの防御を行い得る。
【００２３】
このように、望ましい広範囲に作用する抗感染薬とは、複数の免疫細胞サブセットに特異的に作用し、複数のサイトカインの協調的放出を誘発するものであろう。この作用の方式は、ウイルスおよび／もしくは細菌感染（特に、治療が困難であるもの）の予防ならびに／または治療において望ましいものであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の一つの目的は、先行技術の欠点の少なくとも１つを克服もしくは改善すること、または有用な別の選択肢を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、架橋させて微粒子としたムラミルジペプチド（ＭＤＰ‐微粒子）が、免疫刺激性核酸モチーフを含有するという驚くべき観察に部分的に基づいており、このことは、本明細書で述べるように、広範囲にわたる抗細菌および抗ウイルス自然免疫反応を誘発する上で中心となる複数の異なる免疫細胞サブセットを活性化する能力をこのＭＤＰ‐微粒子が有することも観察された理由をも説明しうる。以降、この核酸モチーフを含むＭＤＰ‐微粒子を「ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子」と称する。
【００２６】
さらに、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、抗感染自然免疫反応を高める能力を有する１つもしくは２つ以上の追加のリガンド、および／または細菌もしくはウイルス抗原で官能化することで、免疫反応のさらなるブースト／集中を行なうことができる。
【００２７】
第一の態様によると、本発明は、ウイルスおよび／もしくは細菌によって引き起こされる感染の予防的または治療的処置の方法を提供し、その方法は、有効量のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
【００２８】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、自然免疫反応を活性化する。
【００２９】
より好ましくは、自然免疫反応は、ＮＫ細胞、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、または単球の活性化を含む。
【００３０】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、少なくとも１つのサイトカインの放出をさらに誘発および／または刺激する。
【００３１】
このサイトカインは、好ましくは、免疫性／炎症促進性、および／または調節性サイトカインである。
【００３２】
好ましくは、免疫性／炎症促進性、および／または調節性サイトカインは、インターフェロン‐アルファ（ＩＦＮ‐α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ‐γ）、インターロイキン１０（ＩＬ‐１０）、インターロイキン６（ＩＬ‐６）、インターロイキン１‐ベータ（ＩＬ‐１β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐α）、インターロイキン１２（ＩＬ‐１２）、およびＣＤ８抗ウイルス因子などである。
【００３３】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、抗ウイルスおよび／または抗細菌自然免疫の他の態様を動員する。
【００３４】
より好ましくは、抗ウイルスおよび／または抗細菌自然免疫の他の態様は、ＩＦＮ‐αと相乗効果的に作用することができる。
【００３５】
抗ウイルスおよび／または抗細菌自然免疫反応の効能を高めるために、微粒子と結合させるか微粒子内部に含有させることで、ウイルスおよび／もしくは細菌細胞の損傷ならびに／または破壊に効果的である特定の免疫細胞サブセットを刺激する能力を有する少なくとも１つの免疫刺激性リガンド（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇａｎｄ）をＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子に組み合わせることができる。好ましくは、このリガンドは、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ‐１、およびＮＯＤ‐２など、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３６】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、Ｔｈ１型またはＴｈ２型免疫の選択的な誘発が支援されるように設計することができる。さらに、さらなるアジュバントリガンドに加えて様々な免疫原を組み込むことができる能力により、１つもしくは複数の抗原および１つもしくは複数のアジュバントを同時に、ワクチン接種の細胞標的へと選択的に送達するよう働く単一薬剤の構築が可能となる。
【００３７】
１つの実施形態では、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、少なくとも１つのウイルスおよび／または細菌抗原を含む。適切な抗原の例としては、抗原‐８５Ａ、抗原‐８５Ｂ、ＥＳＡＴ、およびＣＦＰ‐１０などのマイコバクテリウムツベルクローシス抗原が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原の任意の組み合わせを用いることができる。好ましいインフルエンザ抗原は、蔓延している細菌株からのヘマグルチニンやノイラミニダーゼ遺伝子から誘導されるものである。ペスト抗原は、トキシン成分であるＦ１、Ｖ、またはこの２つの組み合わせであるいわゆるＦ１‐Ｖ融合抗原から誘導することができる。本発明の組成物と組み合わせて用いることができるその他のウイルスおよび細菌抗原は、当業者に公知であろう。
【００３８】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、その直径が約０．０５から３．０ミクロンである。より好ましくは、その直径は、０．２から２．０ミクロンである。最も好ましくは、その直径は、０．２から１．０ミクロン、または０．５から１．０ミクロンである。
【００３９】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、１つもしくは２つ以上の医薬用または獣医学用の賦形剤、キャリア、または溶媒を含む組成物内に存在する。
【００４０】
好ましくは、ウイルスおよび／または細菌によって引き起こされる感染を予防または治療する方法は、ウイルスおよび／または細菌によって引き起こされる感染の予防および／または治療に効果的な別の治療薬を投与することをさらに含む。
【００４１】
好ましくは、別の治療薬は、同時にまたは逐次投与されるワクチンおよび／または抗生物質である。
【００４２】
対象は、好ましくは、哺乳類であり、より好ましくは、ヒトである。
【００４３】
好ましくは、治療されるべき感染は、インフルエンザ、ペスト、および結核から成る群より選択されるが、これらに限定されない。
【００４４】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＮＫ細胞の増強薬として作用することができる。
【００４５】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＮＫ細胞傷害性の増強薬として作用することができる。
【００４６】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ウイルスおよび／または細菌の複製を阻害する可溶性因子の増強薬としても作用することができる。
【００４７】
第二の態様によると、本発明は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含む抗感染活性を有する医薬組成物を提供し、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は核酸を含み、所望によっては薬理学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００４８】
第三の態様によると、本発明は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含む抗感染活性を有する医薬組成物を提供し、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、細菌および／またはウイルスを損傷および／または破壊および／または抑制するのに効果的である免疫細胞サブセットを刺激する能力を有する１つもしくは２つ以上のリガンドと組み合わせて核酸を含み、所望によっては薬理学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００４９】
第四の態様によると、本発明は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含む抗感染活性を有する医薬組成物を提供し、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、１つもしくは２つ以上の細菌および／またはウイルス抗原と組み合わせて核酸を含み、所望によっては薬理学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００５０】
適切な医薬用または獣医学用キャリアおよび製剤は、当業者に公知であろう。
【００５１】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の核酸成分は、好ましくは細菌ＤＮＡである。さらにより好ましくは、細菌のメチル化されていないＣｐＧに富むＤＮＡである。
【００５２】
第五の態様によると、本発明は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含む組成物を提供し、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＤＮＡを含む。
【００５３】
好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、Ｔｈ１型免疫反応を誘発する。
【００５４】
その他の治療薬および／または抗感染薬を、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と組み合わせて用いるか、またはＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と結合させてよいことが当然理解される。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子および／またはその他の抗感染薬の投与は、同時であっても逐次であってもよい。逐次投与は、分、時間、日、または週の任意の適切な時間枠で区切って行ってもよい。
【００５５】
従って、第六の態様によると、本発明は、有効量のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含むワクチン組成物を提供する。
【００５６】
本明細書で述べるＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物は、ヒトへの投与を意図する医薬製剤においても獣医学的用途を意図する製剤においても同様に効果的に用いることができることも当然理解される。好ましくは、製剤は、ヒトへの使用を意図するものである。
【００５７】
第七の態様によると、本発明は、細菌および／またはウイルス感染の予防的または治療的処置のための医薬の製造におけるＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の使用を提供する。
【００５８】
文脈から明らかに他の意味に解すべき場合でない限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの単語は、限定的または網羅的な意味ではなく、包括的な意味に解釈すべきであり；すなわち、「含むがこれらに限定されない」という意味に解釈すべきである。
【００５９】
本発明においては、「ムラミルジペプチド微粒子」への言及は、「微粒子」、「ＭＡ」、「ＭＤＰ‐微粒子」、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、「ＭＩＳ‐４１６」、および「ＭＩＳ」と互換的に用いることができる。図において、「ＭＩＳ」、「ＭＩＳ４１６」、および「ＭＤＰ」の用語は、互換的に用いられ、本発明のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を示すものである。
【００６０】
本出願で用いる「抗感染」という用語は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物の殺微生物活性（すなわち、細菌および／またはウイルスの殺傷）および静微生物（ｍｉｃｒｏｂｉｓｔａｔｉｃ）活性（すなわち、細菌および／またはウイルスの成長、増殖、および または複製の阻害／予防）の両方を包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒト末梢血液骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）、形質細胞様樹状細胞、および単球による蛍光標識ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳＡＦ４８８）のインターナリゼーション
【図２】１０μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）と共に培養後７２時間における、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、およびＴＮＦ‐αサイトカイン分泌
【図３】ｐＤＣは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ）による刺激後にＩＦＮ‐αを分泌するが、これはエンドソーム／リソソーム阻害薬によって抑止される
【図４】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ）による精製ヒトＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の直接免疫刺激
【図５】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による刺激後の単球ＴＮＦα分泌の誘発
【図６】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ）による刺激後のヒトＰＢＭＣの自発的ＮＫ殺傷活性（ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ＮＫ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の向上
【図７】１、５、または１０μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＡ）で刺激されたＰＢＭＣ培養物から４８時間で回収した培養上清によって媒介された、ＨＩＶ‐１クレードＡおよびＢのＰＢＭＣウイルスバイオバーデンの抑制
【図８】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による前処理は、エルシニアペスチスのエアロゾル接種からの防御を与える
【図９】感染前の第−１０日にＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＤＰ）によってマウスを前処理することは、エルシニアペスチスからの防御を与える
【図１０】エルシニアペスチスからの防御におけるＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＤＰ）の用量の比較
【図１１Ａ】感染発症後のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）での治療による、インフルエンザＡ型の罹患率および死亡率の抑制
【図１１Ｂ】感染発症後のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）での治療による、インフルエンザＡ型の罹患率および死亡率の抑制
【図１２】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＮＴ‐ＭＤＰ）による予防は、炭疽毒素接種に対する防御を与える
【図１３Ａ】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）アジュバント‐ＯＶＡ免疫原抱合体が、Ｔｈ１ワクチン接種モデルにおいて、細胞性防御免疫を誘発する
【図１３Ｂ】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）アジュバント‐ＯＶＡ免疫原抱合体が、Ｔｈ１ワクチン接種モデルにおいて、細胞性防御免疫を誘発する
【図１４Ａ】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）が、ＨＬＡ‐ＤＲの上方制御と共に、ヒトＰＢＭＣ ｍＤＣおよびｐＤＣによる免疫共刺激分子ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を上方制御することを示す図である。
【図１４Ｂ】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）が、ＨＬＡ‐ＤＲの上方制御と共に、ヒトＰＢＭＣ ｍＤＣおよびｐＤＣによる免疫共刺激分子ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を上方制御することを示す図である。
【図１５】ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）が、未処理動物と比較した肺ＭＴｂコロニーの低減により測定した場合、ＭＴｂ ＥＳＴＡＴ抗原の免疫原性を向上させる
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明は、ウイルスおよび／または細菌感染に対する安全で有効な予防法または治療法が存在しないことに動機付けられたものであり、架橋させて微粒子としたムラミルジペプチド（ＭＤＰ‐微粒子）が自然免疫系を刺激する独特で有利な特性に部分的に基づくものである。驚くべきことに、ＭＤＰ‐微粒子が恐らくは細菌由来であるＤＮＡ断片を含有することが発見され、このことから、広範囲にわたる抗感染の自然および適応免疫反応の誘発の中心となる複数の異なる免疫細胞サブセットを選択的に標的とし、活性化するその能力を説明することができる。１つもしくは複数のＤＮＡ断片を含むこの新規なＭＤＰ‐微粒子を、本明細書では「ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子」と称する。
【００６３】
本発明のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物は、それ自体が、免疫系の適切な成分を標的としてこれを活性化し、細菌および／またはウイルスの破壊を補助するのに効果的であるが、この微粒子組成物の効能は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の表面にカップリングさせるかまたはその内部に含有させることができる特定のリガンドおよび免疫原／抗原によってさらに向上および集中（例：特異的免疫の向上）させることができる。
【００６４】
本発明の組成物は、細菌およびウイルスを殺傷することができるが（すなわち、殺微生物性）、細菌およびウイルスの成長／増殖／複製を阻止するように作用することもできる（すなわち、静微生物性）。両方の種類の活性共に、細菌および／またはウイルス感染の予防的または治療的処置において有利である。
【００６５】
本明細書で述べるＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、高レベルのＩＦＮ‐α、ならびに広範囲にわたる自然免疫（特に抗ウイルス免疫の誘発）に対して臨床的に適切であるその他の重要な炎症促進性サイトカインの両方を誘発するように設計されている。重要なこととして、ＩＬ‐１０などの調節性サイトカインが同時に産生されることは、この微粒子が調節された免疫反応を誘発することができることを意味しており、それによって、免疫に基づいた単独療法に付随し得る過免疫刺激（ｈｙｐｅｒ−ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が避けられる。このことはすべて、微粒子製剤中の所望される範囲および大きさの免疫反応を誘発する特定の病原体認識受容体（ＰＲＲ）リガンドの免疫刺激特性を利用することによって達成された。このことは、微粒子の取り込みを重要な自然免疫細胞サブセットに限定し、従って、不適切な種類の細胞によって媒介される臨床的に許容されない副作用が避けられる。
【００６６】
例えば、ＭＤＲ‐Ｍｔｂに対する免疫は、主要なサイトカインであるＩＦＮγ、ＩＬ‐１２、およびＴＮＦαが関与する強力なＣＤ４およびＣＤ８依存性Ｔｈ１免疫の誘発に依存する。これらのサイトカインは、感染したＭΦおよびＤＣをループ機構（ｌｏｏｐ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によって活性化し、一酸化窒素およびスーパーオキシドの合成を介して細胞内Ｍｔｂを標識（prime）し、除去する。興味深いことに、トール様受容体（ＴＬＲ）は、樹状細胞上でサイトカイン合成を調節し、それによって防御性Ｔｈ１反応の増幅に影響を与えることが知られている。新しい研究によると、ＴＬＲのシグナル伝達は、細胞内マイコバクテリアの末路にも影響を与えている可能性があることが示唆されている。
【００６７】
しかし、類似の免疫反応が、その他の細菌およびウイルス感染との闘いに有益であり、従って、本発明の組成物は、広範囲におよぶ細菌およびウイルス感染との闘いにおいて、自然または特異的免疫刺激薬として用いることができることが当然理解される。本発明の組成物の抗感染活性は、殺微生物活性（すなわち、細菌およびウイルスの殺傷）の形で現れてよく、または静微生物活性（すなわち、細菌およびウイルスの成長／複製の阻止）であってもよい。両方の種類の活性共に、対象における細菌もしくはウイルス感染の治療または予防に関して有益である。
【００６８】
抗ウイルスおよび／または抗細菌自然免疫反応の効能を高めるために、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、ウイルスおよび／もしくは細菌細胞の損傷ならびに／または破壊に効果的である特定の免疫細胞サブセットを刺激する能力を有する少なくとも１つの免疫刺激性リガンドと（微粒子と結合させるか微粒子内部に含有させて）組み合わせることができる。適切なリガンドは、記載された病原体分子パターン認識受容体の公知のリガンドから選択することができ、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ‐１、およびＮＯＤ‐２などが挙げられる。これらのリガンドの任意の組み合わせも用いることができる。その他の有用な受容体は、本技術分野で周知であり、当業者であれば容易に同定することができる。
【００６９】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子のバックボーン上に結合し、保持することができる官能基が利用可能であれば、公知の生物活性に基づいて合理的な方法で組み込むことが可能な追加のアジュバント／免疫刺激性リガンドを高密度でカップリングすることが可能となる。例えば、ＮＯＤ‐１ならびにＮＯＤ‐２リガンドは、ヒト樹状細胞のＩＬ‐１２ｐ７０産生およびＴ細胞に関連するＩＦＮ‐γの産生の誘発において、合成脂質Ａ（ＴＬＲ４リガンド）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３リガンド）、ならびにＣｐＧ ＯＤＮ（ＴＬＲ‐９リガンド）と共に相乗効果をもたらすことが示された。同様の方法で、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、Ｔｈ１型またはＴｈ２型免疫の選択的な誘発が支援されるように構築することができる。さらに、さらなるアジュバントリガンドに加えて様々な免疫原を組み込むことができる能力により、１つもしくは複数の抗原および１つもしくは複数のアジュバントを同時に、ワクチン接種の細胞標的へと選択的に送達するよう働く単一薬剤の構築が可能となる。
【００７０】
細胞内エンドソーム／リソソームの低下したｐＨなど特定の環境下にて迅速に開裂可能または復元可能である結合は、種々の生物活性化合物のための送達媒体の開発に有用である。本発明の製剤において、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、微粒子中に共有結合で組み込まれたＮＯＤ‐２リガンドおよびヌクレアーゼ耐性ＴＬＲ９リガンドの両方により、免疫原を抗原プロセッシング／提示細胞へ標的化送達するように作製される。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、免疫原およびＴＬＲリガンドの結合のための、アミノおよび酸化性炭水化物部分を含む追加の官能基を含有する。これらの官能基を利用して、所望される免疫原および またはリガンドを、スクシンアミド、マレイミド、およびアルデヒド結合などの二官能架橋試薬を用いて結合させることができる。さらに、免疫原およびＴＬＲリガンドの両方に組み込むことができる１級および２級アミノ基を直接結合する化学反応を提供する酸化性炭水化物部分が存在する。アセタール結合は、薬物送達において、薬物キャリアの構築、ならびに薬物のキャリアへの結合の両方において、酸不安定性結合として広く用いられてきた。ジアルデヒドを酸不安定性ビルディングブロックとして用いて、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子上に存在する遊離のアミノ基へ生物活性化合物を架橋させることができる。
【００７１】
１つの実施形態では、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、少なくとも１つのウイルスおよび または細菌抗原を含む。適切な抗原の例としては、抗原‐８５Ａ、抗原‐８５Ｂ、ＥＳＡＴ、およびＣＦＰ‐１０などのマイコバクテリウムツベルクローシス抗原が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗原の任意の組み合わせも用いることができる。インフルエンザ抗原は、通常、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ遺伝子から、現在蔓延している細菌株に合致するように誘導されるものである。ペスト抗原は、トキシン成分であるＦ１、Ｖ、またはこの２つの組み合わせであるいわゆるＦ１‐Ｖ融合抗原から誘導することができる。
【００７２】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、分解に対して耐性を有することが好ましい。好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子製剤は、ペプシンによる処理、極端なｐＨ、および変性条件に対して耐性を有する。特に、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子製剤は、ａ）ｐＨ３．５でのペプシンによる処理、ｂ）１未満（１ｍＭのＨＣｌ）または１１超（１ｍＭのＮａＯＨ）であるｐＨ、およびｃ）６Ｍの尿素または６Ｍのグアニジン塩酸塩などの変性条件、に対して耐性を有する。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子のＤＮＡ成分は、ヌクレアーゼ（例えばＤＮＡｓｅ Ｉ）に対して耐性を有することが好ましい。
【００７３】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物は、適切ないかなる手段で投与してもよい。本発明による、疾患に対して対象を免疫する方法、または疾患を有する対象を治療する方法では、ワクチン組成物によって形成された溶液を数多くの方法を利用して投与することができる。投与方法の例としては、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、点眼、飲料水を介して、エアロゾル、または鼻内噴霧がある。動物に投与する場合、任意の適切な獣医学的製剤を用いてもよい。上述のものに加えて、製剤は、粉末またはペーストの形状であってよく、飼料に添加するか、または通常の方法で経口投与してよい。適切な製剤プロトコルおよび賦形剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ； Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９ｔｈ Ｅｄ，１９９５（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． ペンシルバニア州、米国）、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，２０００、などの標準的なテキストに見ることができる。
【００７４】
本発明の作用機構に関して特定のいかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子製剤が広範囲にわたる感染病原体を処理する能力は、特にＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の核酸成分により、複数のサイトカインの放出が誘発／刺激されると共に、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ならびに形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）および単球などのその他の自然免疫細胞、が活性化することに帰すると考えられる。
【００７５】
ここで、本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照して、単なる例として説明する。本発明を例を用いて説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、変形および変更を行うことができるものと理解すべきである。さらに、特定の特徴に対して公知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、本明細書に具体的に言及されているのと同様に取り込まれる。
【実施例】
【００７６】
実施例１ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の作製
プロピオニバクテリウムアシニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｎｉ）から単離されたムラミルジペプチド（ＭＤＰ）の複数の繰り返しが、本実施例のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子キャリア複合体のコア構造を形成した。好ましい単量体サブユニットの化学組成を以下に示す。
【００７７】
【化１】
【００７８】
ＭＤＰは、周知の免疫刺激特性を有し、その特性は、免疫機能を増加させるその効果を測定するように設計された研究において広く評価されている。現在のところ、自然源から単離されたＭＤＰと合成ＭＤＰは共に、哺乳類へ投与した場合に強い毒性を伴う。この毒性により、ＭＤＰのアジュバントとしての有効性が制限されてきた。
【００７９】
毒性成分を含まないＭＤＰおよび付随する細菌ＤＮＡ断片を単離する方法は本明細書中に提供される。プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）を中間定常成長期（ｍｉｄ−ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）まで成長させ、当業者に周知の技術を用いて細菌培養物由来の不純物を洗浄除去した。細胞壁および細胞質に含有される疎水性成分を、エタノール／イソプロパノール／水の濃度を上げながら（１０％：１０％：８０％、２５％：２５％：５０％。および４０％：４０％：２０％）高温で順に洗浄することで、段階的に抽出した。次に、イソプロピルアルコールを、エタノールの濃度を下げながら（８０％、５０％、４０％、および２０％）高温で順に洗浄することで除去する。得られたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、次に、６Ｍのグアニジン塩酸塩中に懸濁し、続いて、洗浄用の水中で洗浄し、その５４０ｎｍでの吸光度を濁度標準の吸光度と関係づけすることでその濃度を測定する。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の濃度は、保存して後で使用するために、１０ｍｇ／ｍｌに調節した。
【００８０】
この製剤の分析から、主に１〜３ミクロンの範囲の微粒子サイズで、細菌ＤＮＡと広範に架橋したムラミルジペプチドが明らかになった。このＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、アミノ結合したＬ‐アラニン‐Ｄ‐イソグルタミンジペプチドおよび生物活性成分としての細菌ＤＮＡ断片と共にムラミン酸を含有する。このような微粒子は、上記のように自然源から単離することができ、または、周知の合成手順を用いて合成することもできる（例えば、Ｌｉｕ Ｇ．； Ｚｈａｎｇ Ｓ．−Ｄ．； Ｘｉａ Ｓ．−Ｑ．； Ｄｉｎｇ Ｚ．−Ｋ． Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０（１２），２０００，ｐｐ．１３６１−１３６３（３）； Ｓｃｈｗａｒｔｚｍａｎ Ｓ．Ｍ．， Ｒｉｂｉ Ｅ．， Ｐｒｅｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８０；１０（３）；２５５−６７； Ｏｈｙａ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９９３；８；３５１−３６４）。本方法で作製されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、広い範囲のサイズを有することができるが（例えば、０．０１１〜３０ミクロン）、好ましいサイズは、０．５〜３ミクロンの範囲である。
【００８１】
実施例２ − リガンドおよび免疫原のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子への共有結合
リガンドおよび免疫原のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子への結合は、還元アミノ化を用いることで達成することができる。当業者であれば、安定なカルボニル基を、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる炭水化物の酸化により、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子上、リガンド／免疫原を含有する炭水化物上、またはデキストラン、ポリエチレングリコール、もしくはマンニンブリッジ（ｍａｎｎｉｎ ｂｒｉｄｇｅ）上に作製することができることは理解するであろう。この結果、安定なカルボニル基（アルデヒド）が形成され、次に、これが特定のＴＬＲリガンドおよび免疫原上に存在するアミノ基と自ら反応し、シッフ塩基中間体が形成される。シッフ塩基の形成を行った反応物へシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加することで、不安定なシッフ塩基中間体が完全に還元され、化学的に安定な結合が得られる（以下の図参照）。水素化ホウ素ナトリウムとは異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは十分に温和であり、アルデヒドが非反応性ヒドロキシルへと逆に還元されることが回避される。この方法論的手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ； Ｓｅｒｉｅｓ Ｅｄｉｔｏｒ： Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃｏｉｃｏ （Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、に記載されている。
【００８２】
用いた方法の例は以下の通りである：２０％エタノール中のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（２０ｍｇ）を遠心分離によってペレット化し、水中に再懸濁し、水でよく洗浄する。次に、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子をペレット化し、（ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子５０ｍｇ）／メタ過ヨウ素酸ナトリウム（０．０５〜０．５Ｍ）１ｍＬの濃度で再懸濁し、室温で酸化反応を１時間行う。メタ過ヨウ素酸ナトリウムでの活性化の後、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子懸濁液を遠心分離によってペレット化し、水中に再懸濁し、水でよく洗浄する。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの濃度および反応時間を変化させて、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、リガンド、免疫原などの内部に酸化反応中に作製される活性化部位の数を調節することができる。活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子１個あたり対象免疫原またはリガンド分子の少なくとも１個と、好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子１個あたり対象ペプチドまたはリガンド分子の１０〜１００個と、最も好ましくは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子１個あたり対象ペプチドまたはリガンドの１００から１０００個と反応し、これと共有結合する。高度に活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子製剤に関しては、最終濃度が０．５Ｍであるメタ過ヨウ素酸ナトリウムを用い、酸化反応は１時間行う。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの好ましい濃度は５〜３０ｍＭの間である。
【００８３】
メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化の後、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を次にペレット化し、よく洗浄してメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去する。活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、次に、炭酸水素ナトリウムバッファー中（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）の所望される免疫原またはリガンド（例えば、≧１ｍｇ／ｍＬのＴＬＲ９またはＮＯＤ２、重量／重量比２０：１）中に再懸濁し、１８〜２４時間インキュベートする（環境温度）。この反応物を遠心分離し、シッフ塩基中間体を介してＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子に結合した免疫原／リガンドをこの段階で含有するペレットを還元して、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と免疫原／リガンドとの間に安定な共有結合を形成する。数多くの還元剤を用いることができ、この目的のために通常用いられる還元剤の例としては水素化ホウ素ナトリウムがある。シッフ塩基の還元の後、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と免疫原／リガンドとの抱合体をペレット化し、所望されるワクチンバッファー中で洗浄し所望される免疫原／リガンド濃度で再懸濁させる。
【００８４】
免疫原またはリガンドを用いる場合、これとＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子との共有結合は、二官能架橋剤を介して作り出すこともできる。
【００８５】
ホモ二官能イミドエステル架橋剤を介するカップリング
ＤＭＡ、ＤＭＰ、およびＤＭＳ（以下に示す）は水溶性の膜透過性ホモ二官能イミドエステル架橋剤である。イミドエステル官能基は、１級アミンの修飾に利用可能である最も特異的なアシル化基の１つであり、タンパク質／リガンド中の他の求核基に対する交差反応性が極めて低い。さらに、イミドアミド反応生成物は、タンパク質全体の電荷を変化させることがなく、タンパク質／リガンドの自然のコンフォメーションおよび活性が保持される可能性がある。タンパク質／リガンドの結合は、２段階反応を介して達成され、ここで、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子をまず、立体障害を回避するために必要であるスペーサーアーム長に基づいて以下に示す３つから選択される所望のイミドエステル架橋剤と共にインキュベートする。
【００８６】
【化２】
【００８７】
まず、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子上に存在する遊離のアミノ基を、０．２Ｍのトリエタノールアミン、ｐＨ８．０（反応バッファー）に溶解した２０倍モル過剰量の架橋剤と共にインキュベートすることで飽和させる。この反応混合物を室温で３０分間インキュベートし、遠心分離および反応バッファーでの洗浄（３×）により、過剰の架橋剤を活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子から除去する。活性化されたＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、所望のリガンドを含有する反応バッファーへ再懸濁させる。この反応混合物を室温で１〜２時間インキュベートし、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子‐リガンド抱合体をペレット化し、グリシン緩衝食塩水（０．０５Ｍ グリシン、ｐＨ６．５、ＮａＣｌ ０．９％）で洗浄し（×３）、サイトカイン誘導アッセイ（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）により生物活性を測定する。還元的アミノ化結合法について上記で概説したものと同様の割合の微粒子および免疫原／リガンドを用いる。
【００８８】
作用の機構を限定するものではないが、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子‐免疫原／リガンド組成物は、選択的な細胞の取り込み、タンパク質の半減期、およびＭＨＣの免疫学的現象による抗原提示に影響を与えることによって免疫原性に影響する可能性が高いことを述べておく。２つ以上の対象免疫原／リガンドによる免疫化が所望される場合、対象免疫原／リガンドとＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子との複数の抱合体のカクテルを、カクテルに導入された各対象のペプチドの免疫原性が最適化される比で個々の抱合体を混合することによって作製することができる。この構成では、単一の抗原提示細胞／応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｃｅｌｌ）による抗原提示を高めるのに十分な免疫原が各微粒子抱合体上に利用可能に存在する（微粒子あたり１００〜１０００個の免疫原‐リガンド）。対象免疫原／リガンドの免疫原性／活性を、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子キャリアあたりの対象ペプチドの数、および所望によっては、ワクチンカクテル中の免疫原の比率、の両方を調節して最適化し、所望の免疫反応を達成することができる。この構成では、抗原提示細胞による抗原プロセッシングにより、ＭＨＣ相互作用を通して、抗原提示細胞の細胞表面に高密度、通常は１００個超、最も多くの場合５００個超のペプチド、の提示がなされる。
【００８９】
結合のためのその他の方法としては、マレイミド結合の化学を利用することもできる。マレイミド結合は、スルホ修飾したスルホスクシンイミジル‐４‐シクロヘキサン‐１‐カルボキシレートを、スルホ‐ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いる標準プロトコルに従って用いるか、またはスルフヒドリル結合に適するその他のリンカーを用いて実施することができる。
【００９０】
実施例３ − ：末梢血液単球、形質細胞様（ｐＤＣ）、および骨髄（ｍＤＣ）樹状細胞による蛍光標識ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子のインターナリゼーション
全血を５０、２５、１０、または１μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８で標識したＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と共にインキュベートし、３７℃で３０分間インキュベートした。単球、形質細胞様、および骨髄ＤＣを、一群の蛍光抗体（ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて識別し、ＣＤ４５、ＢＤＣＡ‐１、ＢＤＣＡ‐２、細胞系マーカー、およびＣＤ１４発現に基づいてゲーティングした（ｇａｔｅｄ）。ＡＦ４８８‐微粒子をインターナライズした各サブセットの％を図１に示す。これらの細胞の免疫刺激は、広範囲におよぶ抗感染防御を開始させる中心となるものであり、従って、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の重要な細胞標的である。
【００９１】
実施例４ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子で刺激されたヒト全血によって媒介される全身自然炎症促進性反応（ｇｅｎｅｒａｌ ｉｎｎａｔｅ ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の特徴付け：
完全培地＋５％Ａｂ血清中の１／１０希釈ヒト全血を、２４ウェル組織培養プレート中にて、１０μｇ／ｍＬのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と共に培養した。このサンプルを７２時間インキュベートし、細胞を含まない上清を回収してサイトカイン含有量を分析した。上清は、フローサイトメトリービーズアレイ法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍ ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインマルチプレックスキット）を用いて分析した。図２で測定したサイトカインは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が免疫刺激性であり、自然免疫細胞の動員および成熟、ならびに自然免疫の誘発の中心となるサイトカインを誘発することを示している。
【００９２】
実施例５ − ｐＤＣは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による刺激後にエンドソーム／リソソームに依存する形でＩＦＮαを分泌する。
ヒトｐＤＣを、ＢＤＣＡ‐２＋細胞の磁気ビーズ選別を用いてＰＢＭＣから精製した。ソートした細胞（１０６／ｍｌ）を、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子またはＴＬＲ９ Ａ型イガンド（ｉｇａｎｄｓ）と共に、５μｍのクロロキンの非存在下または存在下にて１６時間培養した（完全培地＋５％Ａｂ血清）。フローサイトメトリーサイトカインビーズアレイ法を用いて、上清をＩＦＮα含有量について分析した。図３に示す結果は、強力な抗ウイルスサイトカインであるＩＦＮαがｐＤＣ用量に依存して誘発されたことを示している。これは、微粒子の核酸成分によって媒介されるが、該核酸成分は細胞のエンドソーム区画内に存在するＴＬＲ９リガンドを介して作用する可能性が最も高いと思われる。このことと一致して、微粒子によるＩＦＮαの誘発は、リソソーム／エンドソーム阻害薬であるクロロキンによって阻害可能である。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子がｐＤＣのＩＦＮ‐α産生を活性化することができるということは、これらの細胞がインビボでのＩＦＮ‐αの代表的な自然源であることから、非常に有利である。ＩＦＮ‐αの自然産生を標的とすることができる薬剤は、ウイルス感染の治療に対して、組換えＩＦＮ‐αよりも毒性の低い、代替的な治療レジメンを提供する。
【００９３】
実施例６ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による４０時間の刺激後の、精製ＮＫおよびＮＫＴ細胞によるＩＦＮγ、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＭＩＰ‐１α、およびＴＮＦαの産生
ヒトＣＤ５６＋細胞を、ＭＡＣＳポジティブ選別ビーズを用いて９９％の純度まで全血から精製し、これによって、ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）およびＮＫＴ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３＋）の両方が単離される。次に、精製した細胞を、無刺激で、ＩＬ‐２（５００Ｕ／ｍｌ）と、ＩＬ‐１２（５０ｎｇ／ｍｌ）と、またはＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（４０、２０、１０、および５、および１μｇ／ｍｌ）と共に４０時間培養した（７．５×１０５／ｍｌ）。 フローサイトメトリーサイトカインビーズアレイ法を用いて、上清をＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＧＭ‐ＣＳＦ、およびＭＩＰ‐１αの含有量について分析した。図４から分かるように、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦα、ならびにＭＩＰ‐１αおよびＧＭ‐ＣＳＦの産生を明らかに刺激している。ＮＫ細胞は、ウイルス感染した細胞の破壊において重要な役割を担っており、これらの因子は、ＮＫ細胞の免疫活性化の特徴である。ＮＫ細胞、およびＮＫ細胞由来の因子は、マクロファージおよびその他の貪食性細胞防御の動員ならびに促進を支援することもできる。
【００９４】
実施例７ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による２２時間の刺激後の単球によるＴＮＦα産生の誘発
ヒトＰＢＭＣ（１０６／ｍｌ）を、２０、１０、５、および１μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と共に２２時間培養した。タンパク質輸送阻害薬（ブレフェルジンＡ）を培養の最後の６時間に渡り添加し、サイトカインの蓄積を可能にした。固定化可能バイオレットｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を標識し、洗浄し、続いてＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて固定／透過処理し、続いて、抗ＴＮＦα‐ＡＰＣ‐Ｃｙ７モノクローナル抗体で標識した。図５Ａに示すように、生存単球は、ＦＳＣ ｖｓ 高ＳＳＣゲーティングと組み合わせたｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素排除に基づいて識別した。図５Ｂでは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の全濃度において、ＴＮＦαを発現するゲーティングされた生存単球の割合を測定した。ＴＮＦα発現単球の割合が最大であるのは、２０μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子における７３．８％である。ＴＮＦαは、ＰＭＮ顆粒球の貪食および殺微生物活性を活性化する重要なサイトカインである。
【００９５】
実施例８ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による刺激後のヒトＰＢＭＣの自発的ＮＫ殺傷活性の向上
ＰＢＭＣを、４０、２０、１０、および５μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子と共に培養した。既知のＮＫ細胞活性薬であるＩＬ‐２（５００Ｕ／ｍｌ）およびＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ／ｍｌ）をアッセイのポジティブコントロールとして用いた。１８時間の培養の後、ＰＢＭＣを新鮮な培地中で洗浄し、１００：１、１０：１、および１：１のエフェクター：標的比にて、蛍光標識したＮＫ感受性を有するＫ５６２腫瘍標的に対する細胞傷害性について試験した。腫瘍細胞の殺傷は、ゲーティングした蛍光Ｋ５６２標的のフローサイトメトリー生死判別を用いて４時間後に測定した。結果を図６に示す。これらのデータは、機能的ＮＫ活性がＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子によって誘発されることを示している。ＮＫの細胞殺傷の活性化は、ウイルス感染した細胞を殺傷することが知られていることから、望ましいものである。
【００９６】
実施例９ − １、５、または１０μｇ／ｍｌのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子で刺激されたＰＢＭＣ培養物から４８時間で回収した培養物ｓ／ｎ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｓ／ｎ）によって媒介される、ＨＩＶ‐１クレードＡおよびＢによるＰＢＭＣウイルスバイオバーデンの抑制
３３体積／体積％のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子刺激培養物ｓ／ｎ（０．２μｍでろ過）の添加の前に、ＰＢＭＣ培養物をＨＩＶ‐１ウイルスストックと共に２４時間予備インキュベートした。ＨＩＶ‐１複製の阻害のポジティブコントロールとして、組換えヒトＩＦＮａを１０、１００、または１０００Ｕ／ｍｌで添加した。ＨＩＶ‐１感染後の第５日にＰＢＭＣを回収し、ＨＩＶ‐１感染細胞の％を、生細胞の細胞内ｐ２４抗原発現のフローサイトメトリー分析を用いて測定した。感染の阻害パーセント（％）は、細胞＋ウイルス培養物単独の平均バイオバーデンに対する値として算出した。結果は、マイクロ培養物の３つの反復サンプルから得た＋／−ＳＥＭを示す（図７）。ＤＮＡアポトーシス／細胞周期分析（データ示さず）によって測定されたＰＢＭＣ培養物の全体の生存率に対して、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子活性化ｓ／ｎまたはＩＦＮａの影響はなかった。これらのデータは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、ウイルス複製を直接阻害することができる可溶性因子を誘発することを示している。
【００９７】
実施例１０ − 感染（ペスト）に対するＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の影響
示した計画に従ってＣ５７ＢＬ６マウスにＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（１００μｇ、腹腔内）を受けさせ、続いて第０日にエルシニアペスチスを接種した。
【００９８】
【表１】
【００９９】
Ｙ．ペスチス感染に関しては、１×１０５ＣＦＵの菌株ＫＩＭ Ｄ２７の鼻腔内投与でマウスを感染させた。これはおよそ１０ＬＤ５０に相当し、ＬＤ１００に近い。未処理のコントロール動物はすべて、第＋８日までに感染によって死亡した（図８）。処理動物の中には生存したものもあった。生存動物の数が最も多かったのは（５体中２体）、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を第−１０日に受けた２つのグループであった。最適な結果は、第−１０日の処理で得られると推定される。この最初の発見をさらに明らかにするために、さらなる実験を行った（図９、１０）。これらの実験では、感染前の第−１０日に、５０または５００μｇのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を投与した。５０μｇの用量の方が、５００μｇの用量よりも良好な防御をもたらすことが分かった。両用量共に、食塩水コントロールよりも良好な防御をもたらした。全体として、この実験は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が肺ペストに対する防御を提供することができることを示唆している。
【０１００】
実施例１２ − インフルエンザへの曝露後のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子による処理により、生存率の増加および体重減少の改善によって測定される防御が得られる
マウス： 野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを最初はＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー，メイン州）より購入し、次にこれをＴｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙで飼育した。マウスはすべて、Ｔｒｕｄｅａｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って飼育し、管理した。
【０１０１】
ウイルス感染． インフルエンザＡ型ウイルスのＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株を最初はＤ．Ｍｏｒｇａｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ラホヤ，カリフォルニア州）より入手した。卵齢１０日のニワトリ有胚卵の尿膜腔内でウイルスストックを作製し、−７０℃で保存した。マウスにイソフルランで軽く麻酔をかけ、０．３ＬＤ‐５０のインフルエンザを鼻腔内接種した。感染後、マウスの体重を毎日測定し、３０％を超える体重減少を示したマウスはすべて瀕死であると見なした。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を食塩水で希釈し（５０μｇまたは２５０μｇ）、これかまたは食塩水単独を、感染の翌日に尾静脈注射によって静脈内投与した。
【０１０２】
統計． 体重減少データはスチューデントｔ検定で解析した。生存率データはログランク検定で解析した。いずれのケース共に、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０１０３】
結果を図１１に示す。Ａ）ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の二つの用量はどちらも、体重減少に同様の影響を与えた。マーク（＊）で示したケースでは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子治療が、体重減少を大きく軽減した。Ｂ）初期体重の３０％超の減少を示した動物は、瀕死であると見なし、安楽死処理を行った。データは、２つの独立した実験から集められる（グループあたりのマウス総数ｎ＝１５）。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子によって処理した動物の罹患率の減少は、統計的に有意であった（ログランク検定によりｐ＝０．０３５）。これらの発見は、ウイルス感染が確立された場合でさえ、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の一回投与による治療が、インフルエンザ感染に関係する罹患率および死亡率の両因子を改善することができることを示している。このことは、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が機能的に適切なレベルの抗ウイルス因子を誘発する能力を持つことをさらに示している。
【０１０４】
実施例１４ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子免疫抱合体は適応細胞性Ｔｈ１免疫を誘発する。
適応細胞性Ｔｈ１免疫は、結核およびウイルス感染などの特定の感染疾患の防御にとって重要である。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子免疫抱合体のＴｈ１アジュバント特性を測定するには、腫瘍ワクチン接種モデルが有用である。ＯＶＡ腫瘍抗原は、十分に特性決定された腫瘍抗原であり、スルフヒドリル結合を用いてこれをＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子へ共有結合させた。図１３Ａ、Ｂから分かるように、ＯＶＡ‐ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子免疫抱合体のワクチン接種により、養子移入されたＯＴ‐Ｉ ＣＤ８＋細胞の末梢増殖（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が誘発され、続いて、腫瘍予防ワクチンモデルにおける抗腫瘍免疫が誘発される。
【０１０５】
（Ａ）同系の精製ＣＤ８＋ＯＴ‐Ｉ細胞（１０３）を、静脈内送達によってマウスの複数のグループ（Ｃ５７／Ｂｌ６；ｎ＝１０）へ養子移入し、続いてＯｖａの２５μｇ、ＯＶＡ‐ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子（ＭＩＳ４１６）免疫抱合体の２５μｇ、または２００ｎｇのα‐ガラクトセラミドと混合したＯＶＡの２５μｇ（Ｔｈ１反応に対する静脈内免疫化のポジティブコントロール）によって静脈内免疫化を行なった。免疫化後の第３５日まで、種々の時間点で末梢血液をサンプリングした。ＯＴ‐Ｉ細胞の増殖を、ＣＤ８＋ＣＤ４５．１＋Ｖα２＋フェノタイプ（ＯＴ‐Ｉ特異的）を有するＴ細胞に対するフローサイトメトリー分析を用いて測定した。（Ｂ）免疫化後第３６日に、１０６のＢ１６‐ＯＶＡ腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍の成長をモニタリングした。
【０１０６】
これらの発見は、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子をアジュバントとして用いたワクチンが、防御Ｔｈ１免疫反応を誘発することができることを示している。このことは、結核など、新規なＴｈ１ワクチンアジュバントの開発を必要とする特定の感染疾患に対する効果的なワクチンの作製において特に重要である。
【０１０７】
実施例１５ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＨＬＡ‐ＤＲの上方制御と共に、ヒトＰＢＭＣ ｍＤＣおよびｐＤＣによる共刺激分子ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を上方制御する
ヒトＰＢＭＣ（１０６／ｍｌ）をＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子で刺激した（完全培地＋５％Ａｂ血清）。アッセイポジティブコントロールとしてＣ型ＣｐＧおよびＨＫＳＡを用いた。刺激後２２時間にて、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ‐ＤＲの共発現を、ゲーティングした生存ｍＤＣおよびｐＤＣ上にてマルチパラメータフローサイトメトリーを用いて測定した。
【０１０８】
ＡＰＣの細胞レパートリーの中で、ｍＤＣおよびｐＤＣは共に、インビトロおよびインビボの両方において、自然免疫反応の誘発ならびに強固な一次および二次Ｔ細胞適応免疫反応の誘発に不可欠である。従って、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、ＣＤ８３およびＣＤ８６共刺激分子と共にＡｇ提示ＭＨＣクラスＩＩ分子が、加熱殺菌Ｓ．アウレウス（ｈｅａｔ ｋｉｌｌｅｄ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＨＫＳＡ）による場合と同程度に上方制御されることによって示されるように、インビトロにおけるＰＢＭＣ ｍＤＣの成熟の強力な誘発薬であることが示された。ｐＤＣ成熟の共分析からも、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、ＣＤ８６の上方制御と共に、ＨＬＡ‐ＤＲの著しい上方制御を誘発することができることが示されている。ＣＤ８３の発現は、対照的に、合成Ｃ型ＣｐＧなどその他のｐＤＣ成熟刺激薬で見られるよりも低い程度での上方制御である。ｐＤＣおよびｍＤＣに対するＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子活性の大きさが異なる理由の一部は、ｍＤＣがｐＤＣよりも貪食性が強く、従って微粒子を選択的にインターナライズすることにある。これらの発見は、図１４に示されており、自然免疫刺激薬としてのＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の使用を支持するものである。
【０１０９】
実施例１６ − ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、マウスにおけるＥＳＡＴ‐６ Ｍｔｂ抗原の免疫原性、および薬物耐性Ｍ．ツベルクローシスのクリアランスを向上させる。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、マウス１体あたり１０５ＣＦＵの薬物耐性Ｍｔｂ株で静脈内感染させ、感染を１４日間進行させた。続いて、Ｔｉｔｅｒｍａｘアジュバント、もしくはＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子アジュバント中の、またはアジュバントなしの組換えＭｔｂ ＥＳＡＴ‐６タンパク質のマウス１体あたり２５μｇでマウスを処理し、この処理は第１４日、１８日、および２１日に行った（マウス１体あたり３回投与）。マウスを第２８日に屠殺し、臓器のホモジネートを７Ｈ１１寒天上に播種することで肺ＣＦＵをカウントした。１つの時間点あたり３体のマウスを分析した。ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子は、未処理動物と比較して、ＭＴｂ肺コロニーの形成の著しい軽減を誘発した。対照的に、比較アジュバントであるＴｉｔｅｒｍａｘは、ＥＴＳＡＴの免疫原性を大きく向上させることはなかった（図１５参照、＊印は、ｔ検定による有意差を示す）。
【０１１０】
本発明を特定の好ましい実施形態および例を参照して説明したが、本発明の趣旨および本明細書で提供される開示事項に沿った変形例も意図されていることが当然理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスおよび／または細菌によって引き起こされる感染の予防的または治療的処置の方法であって、有効量のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、それを必要とする対象へ投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、自然免疫反応を活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自然免疫反応が、ＮＫ細胞、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、および／または単球の活性化を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、少なくとも１つのサイトカインの放出をさらに誘発および／または刺激する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サイトカインが、インターフェロン‐アルファ（ＩＦＮ‐α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ‐γ）、インターロイキン１０（ＩＬ‐１０）、インターロイキン６（ＩＬ‐６）、インターロイキン１‐ベータ（ＩＬ‐１β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐α）、インターロイキン１２（ＩＬ‐１２）、および／またはＣＤ８抗ウイルス因子から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、少なくとも１つの免疫刺激性リガンドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ‐１、および／またはＮＯＤ‐２から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、少なくとも１つのウイルスおよび／または細菌抗原を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのウイルスおよび／または細菌抗原が、マイコバクテリア抗原‐８５Ａ、抗原‐８５Ｂ、ＥＳＡＴ、ＣＦＰ‐１０、インフルエンザ抗原である赤血球凝集素および／もしくはノイラミニダーゼ、ペスト抗原であるＦ１、Ｖ、Ｆ１‐Ｖ融合抗原、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスおよび／または細菌によって引き起こされる感染の予防および／または治療に効果的である別の治療薬を投与することをさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記別の治療薬が、同時にまたは逐次投与されるワクチンおよび／または抗生物質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が哺乳類である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療すべき感染が、インフルエンザ、ペスト、または結核から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、Ｔｈ１型免疫反応を誘発する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含み、および所望により医薬用もしくは獣医学用（ｖｅｔｅｒｎｉｎａｒｙ）の賦形剤、キャリア、または溶媒を含む、組成物。
【請求項１６】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、および少なくとも１つのその他の抗感染薬を含む、組成物。
【請求項１７】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、および少なくとも１つの免疫刺激性リガンドを含む、組成物。
【請求項１８】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、ならびに少なくとも１つのウイルスおよび／または細菌抗原を含む、組成物。
【請求項１９】
前記組成物が殺微生物性である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が静微生物性（ｍｉｃｒｏｂｉｓｔａｔｉｃ）である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１５から２０のいずれか１項に記載のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物を含む、細菌もしくはウイルス感染の治療的または予防的処置のためのワクチン。
【請求項２２】
前記細菌またはウイルス感染が、ペスト、インフルエンザ、および結核から選択される、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
細菌および／またはウイルス感染の予防的または治療的処置のための医薬の製造における、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の使用。
【請求項１】
ウイルスおよび／または細菌によって引き起こされる感染の予防的または治療的処置の方法であって、有効量のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を、それを必要とする対象へ投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、自然免疫反応を活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自然免疫反応が、ＮＫ細胞、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、および／または単球の活性化を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、少なくとも１つのサイトカインの放出をさらに誘発および／または刺激する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サイトカインが、インターフェロン‐アルファ（ＩＦＮ‐α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ‐γ）、インターロイキン１０（ＩＬ‐１０）、インターロイキン６（ＩＬ‐６）、インターロイキン１‐ベータ（ＩＬ‐１β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐α）、インターロイキン１２（ＩＬ‐１２）、および／またはＣＤ８抗ウイルス因子から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、少なくとも１つの免疫刺激性リガンドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、ＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ＮＯＤ‐１、および／またはＮＯＤ‐２から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、少なくとも１つのウイルスおよび／または細菌抗原を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのウイルスおよび／または細菌抗原が、マイコバクテリア抗原‐８５Ａ、抗原‐８５Ｂ、ＥＳＡＴ、ＣＦＰ‐１０、インフルエンザ抗原である赤血球凝集素および／もしくはノイラミニダーゼ、ペスト抗原であるＦ１、Ｖ、Ｆ１‐Ｖ融合抗原、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスおよび／または細菌によって引き起こされる感染の予防および／または治療に効果的である別の治療薬を投与することをさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記別の治療薬が、同時にまたは逐次投与されるワクチンおよび／または抗生物質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が哺乳類である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療すべき感染が、インフルエンザ、ペスト、または結核から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子が、Ｔｈ１型免疫反応を誘発する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子を含み、および所望により医薬用もしくは獣医学用（ｖｅｔｅｒｎｉｎａｒｙ）の賦形剤、キャリア、または溶媒を含む、組成物。
【請求項１６】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、および少なくとも１つのその他の抗感染薬を含む、組成物。
【請求項１７】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、および少なくとも１つの免疫刺激性リガンドを含む、組成物。
【請求項１８】
ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子、ならびに少なくとも１つのウイルスおよび／または細菌抗原を含む、組成物。
【請求項１９】
前記組成物が殺微生物性である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が静微生物性（ｍｉｃｒｏｂｉｓｔａｔｉｃ）である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１５から２０のいずれか１項に記載のＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子組成物を含む、細菌もしくはウイルス感染の治療的または予防的処置のためのワクチン。
【請求項２２】
前記細菌またはウイルス感染が、ペスト、インフルエンザ、および結核から選択される、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
細菌および／またはウイルス感染の予防的または治療的処置のための医薬の製造における、ＭＤＰ／ＤＮＡ‐微粒子の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【公表番号】特表２０１１−５１６４７０（Ｐ２０１１−５１６４７０Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２８８４（Ｐ２０１１−５０２８８４）
【出願日】平成２１年４月１日（２００９．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００９／００００４８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２３４８０
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１０２６１５１１）イネイト・セラピューティクス・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１日（２００９．４．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００９／００００４８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２３４８０
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１０２６１５１１）イネイト・セラピューティクス・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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